專利名稱：：特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種能特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。在全球范圍內(nèi)，HBV感染者超過3億人[1]，每年約100萬人死于急慢性乙型肝炎[2]。乙肝感染人群的肝癌發(fā)病風(fēng)險約為正常人群的100倍，約60-80%的原發(fā)性肝癌患者伴有乙肝病史[3]。同時，持續(xù)的HBV感染還會引起慢性肝功能不全、肝硬化等疾病[1-4]。最新的流行病學(xué)調(diào)査表明，我國人群的乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率為7.18%，HBV感染總?cè)藬?shù)達(dá)9300萬(根據(jù)2008年4月21日公布的全國人群乙肝血清流行病學(xué)調(diào)査結(jié)果)。因此，通過研究HBV感染機(jī)體的病理生理過程，尋找新的抗病毒作用耙位，以期對HBV慢性感染患者進(jìn)行更有效的抗病毒治療，已成為臨床治療的迫切需要。目前，臨床上用于治療HBV感染患者的一線藥物，主要有干擾素類和拉米夫定等抗病毒核苷類似物。a干擾素的作用機(jī)理為非特異性抗病毒效應(yīng)，但僅對20%-40%的病人有效，且不良反應(yīng)發(fā)生率較高[5];而拉米夫定等核苷類抗HBV藥物，則通過與HBVDNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶競爭性結(jié)合、特異性阻止HBVDNA鏈延長而抑制病毒的復(fù)制。后者短期療效好，HBVDNA轉(zhuǎn)陰率可達(dá)80。/。以上；然而，長期使用易導(dǎo)致病毒變異、產(chǎn)生耐藥性(如YMDD變異)。拉米夫定治療隨用藥時間的延長，耐藥性發(fā)生率逐漸增高(year1，10-27%;year2，37-48%;year4，60-65%)，若停藥還可能發(fā)生病毒反跳。其他核苷類藥物如阿德福韋、替比弗定等，長期使用也可產(chǎn)生不同程度的耐藥性[5]。因此，開發(fā)治療效果更佳的藥物，特別是根據(jù)病毒復(fù)制、增生的不同階段，設(shè)計與核苷類藥物作用機(jī)理不重疊的新型藥物，對于降低耐藥株產(chǎn)生的幾率，達(dá)到對HBV慢性感染患者的長期、有效治療，有十分重要的意義。生物制藥領(lǐng)域近年來發(fā)展迅速，肽類藥物的研發(fā)則是生物制藥的一個重要發(fā)展方向。與傳統(tǒng)藥物相比較，肽/蛋白質(zhì)類藥物有其獨特的優(yōu)勢，它能與目標(biāo)蛋白高特異性結(jié)合而不與其他結(jié)構(gòu)域類似的蛋白結(jié)合(或僅有較低的親和力)，因而可以避免產(chǎn)生廣泛的副反應(yīng)或較強(qiáng)的毒性作用。同時，肽類藥物也不易與其他藥物相互作用，能較安全地用于人體，國外現(xiàn)已有數(shù)種針對HIV感染的抗病毒肽/蛋白質(zhì)類藥物進(jìn)入臨床試驗。目前，國內(nèi)針對HBV感染的肽/蛋白質(zhì)類藥物有十余種已申請發(fā)明專利，其中有數(shù)種進(jìn)入臨床試驗階段，但其均為治療性乙肝疫苗，其主要成分多為乙肝病毒表面抗原的一部分氨基酸序列，依靠添加細(xì)胞因子或佐劑等加強(qiáng)其誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的能力。疫苗本身并無抑制病毒或殺傷病毒的作用，其作用機(jī)理為刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，通過機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)或體液免疫反應(yīng)來抑制病毒復(fù)制或殺傷病毒感染細(xì)胞。研究證實，在HBV慢性感染過程中，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，能脫去病毒衣殼進(jìn)入胞核內(nèi)，形成共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，并以之為原始模板，轉(zhuǎn)錄為前基因組RNA(pgRNA);位于胞漿的pgRNA可與病毒的特異性多聚酶一起被由核心蛋白二聚體構(gòu)成的約180到240個核心蛋白亞基形成的內(nèi)殼蛋白所包裹，此時病毒再以pgRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為新的非共價閉合的雙鏈環(huán)狀HBVDNA基因組[6]。隨后此種含病毒DNA的內(nèi)殼蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或鄰近的高爾基體，再與表面蛋白形成的糖蛋白外殼組裝，最終以小囊泡的形式分泌到胞外[7]。病毒還會把部分新合成的胞漿內(nèi)衣殼包裹的核酸再次轉(zhuǎn)移至核內(nèi)、并將部分雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為cccDNA，以維持HBV的慢性持續(xù)感染[8]。在上述過程中，不論是以pgRNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，還是組裝完整的HBV病毒顆粒，都需要完整的病毒內(nèi)殼蛋白，而核心蛋白則是組裝病毒內(nèi)殼蛋白的關(guān)鍵蛋白。因此，特異性結(jié)合核心蛋白以阻斷核心蛋白亞基的形成，是一種新穎有效的治療策略既可通過阻斷pgRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)抑制病毒的復(fù)制，又可阻止完整病毒顆粒的產(chǎn)生，從而中斷病毒的分泌和再感染過程。針對核心蛋白亞基來設(shè)計抗HBV藥物是一條新的思路。由于藥物作用于病毒蛋白的組裝階段，不直接干擾HBVDNA的合成，理論上可能會減少因DNA突變導(dǎo)致耐藥株產(chǎn)生的幾率。同時，由于與現(xiàn)有的核苷類藥物作用機(jī)理并不重疊，若與該類藥物進(jìn)行聯(lián)用，還可增加抗病毒治療的靶位，通過協(xié)同作用減少病毒基因突變及耐藥的機(jī)會，從而提高抗病毒效果，達(dá)到長期、有效治療的目的。為此，我們需尋找能夠與HBV核心蛋白特異性結(jié)合的化合物或生物大分子，作為進(jìn)行藥物開發(fā)的基礎(chǔ)。但到目前為止，尚未見特異性作用于HBV核心蛋白的肽/蛋白質(zhì)藥物。肽適配體系統(tǒng)是近年來發(fā)展的一種新型酵母雙雜交技術(shù)，用于篩選能與靶蛋白特異性結(jié)合的肽適配體[9，10]。我們根據(jù)近年來的文獻(xiàn)報道和本實驗室的研究結(jié)果，獲得了數(shù)條候選序列，并利用本實驗室自主構(gòu)建的人源化肽適配體篩選系統(tǒng)和Westernblot等方法，證實與HBV核心蛋白結(jié)合能力最強(qiáng)的一條由20個AA組成的多肽序列；我們將之命名為C20，作為開發(fā)抗HBV藥物的基礎(chǔ)。但其具有空間穩(wěn)定性差，膜穿透能力低，體內(nèi)易降解，可能誘發(fā)一定的免疫反應(yīng)等缺陷，無法進(jìn)行實際應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1.LiangX，LiuY，ZhangQ，etal.HepatitisBvirussensitizesh印atocytestoTRAIL-inducedapoptosisthroughBax.JImmunol.2007Jan1;178(1):503-10.2.DongQ，ChanHL，LiuZ，etal.A1762T/G1764Amutationsofh印atitisBvirus,associatedwiththeincreasedriskofhepatocellularcarcinoma,reducebasalcorepromoteractivities.BiochemBiophysResCommun.2008Oct3;374(4):773-6.3.PisaniP，ParkinDM，MuN，etal.Cancerandinfection:estimatesoftheattributablefractionin1990.CancerEpidemiolBiomarkersPrev.1997Jun;6(6):387-概4.LauJT，WrightTL.MolecularvirologyandpathogenesisofhepatitisB.Lancet.1993Nov27;342(8883):1335—40.5.PapatheodoridisGV，ManolakopoulosS，DusheikoG，ArchimandritisAJ".TherapeuticstrategiesinthemanagementofpatientswithchronichepatitisBvirusinfection.LancetInfectDis.2008Mar;8③167-78.6.ConwayJ"F，ChengN，ZlotnickA，etal.Visualizationofa4-helixbundleinthehepatitisBviruscapsidbycryo-electronmicroscopy.Nature.1997Mar6;386(6620):91-4.7.RoingeardP，LuSL，SureauC，etal.ImmunocytochemicalandelectronmicroscopicstudyofhepatitisBvirusantigenandcompleteparticleproductioninhepatitisBvirusDNAtransfectedH印G2cells.H印atology.1990Feb;11(2):277-85.8.WuTT，CoatesL，AldrichCE，etal.Inh印atocytesinfectedwithduckhepatitisBvirus,thetemplateforviralRNAsynthesisisamplifiedbyanintracellularpathway.Virology.1990Mar;175①255-61.9.ColasP，CohenB，J"essenT，etal.Geneticselectionofpeptide鄰tamersthatrecognizeandinhibitcyclin-d印endentkinase2.Nature.1996Apr11;380(6574):548-50.10.ButzK，DenkC，F(xiàn)itscherB，etal.PeptideaptamerstargetingthehepatitisBviruscoreprotein:anewclassofmoleculeswithantiviralactivity.Oncogene.2001Oct4;20(45):6579-86.11.RuttekolkIR，DuchardtF，F(xiàn)ischerR，etal.HPMAasaScaffoldfortheModularAssemblyofFunctionalPeptidePolymersbyNativeChemicalLigation.BioconjugChem.2008Sep9.[Epubaheadofprint]12.ParkYJ，ChangIX，LiangJF，etal.Nontoxicmembranetranslocationpeptidefromprotamine,lowmolecularweightprotamine(X麗P)，forenhancedintracellularproteindelivery:invitroandinvivostudy.FASEBJ.2005S印；19(11):1555-7.Epub2005Jul20.13.BhoradeR，WeisslederR，Nakakoshi.MacrocyclicchelatorswithparamagneticcationsareinternalizedintomammaliancellsviaaHIV-tatderivedmembranetranslocationpeptide.BioconjugChem.2000May-Jun;11(3):301-5.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供了一種特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽。該特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽的結(jié)構(gòu)為將具HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽序列插入硫氧還蛋白序列中，并在硫氧還蛋白序列的C末端連接膜轉(zhuǎn)位序列。其中，上述具HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽的氨基酸序列為SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。其中，上述硫氧還蛋白的氨基酸序列為PTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVKL。其中，上述具HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽序列插在了硫氧還蛋白序列的第34個氨基酸與第35個氨基酸之間。其中，上述膜轉(zhuǎn)位序列為AAVLLPVLLAA。其中，上述重組蛋白是具有SEQIDNO.l所示氨基酸序列的重組蛋白或其保守性變異體本發(fā)明所解決的第二個技術(shù)問題是提供了一種編碼上述特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽的編碼基因。其中，上述編碼基因具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。SEQIDNO.2:AtggtgaagcagatcgagagcaagactgcttttcaggaagccttggacgctgcaggtgataaacttgtagtagttgacttctcagccacgtggagcgGtccgagcttctacagcgttctgttcctgtggggcacctgcggcggcttcagccacagctggtaccgtccgagcaaaatgatcaagcctttctttcattccctctctgaaaagtattccaacgtgatattccttgaagtagatgtggatgactctcaggatgttgcttcagagtctgaagtcaaatccatgccaacattccagttttttaagaagggacaaaaggtgGgtgaattttctggagccaataaggaaaagctcgaagccaccattaatgaattagtcAAGCTTGCAGCCGTTCTTCTCCCTGTTCTTCTTGCCGCACCC。本發(fā)明所解決的第三個技術(shù)問題是提供了含有上述基因序列的基因載體。本發(fā)明所解決的第四個技術(shù)問題是提供了含有上述基因載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明所解決的第五個技術(shù)問題是提供了上述特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽、其編碼基因、基因載體及宿主細(xì)胞在制備防治由乙肝病毒引發(fā)的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明所解決的第六個技術(shù)問題是提供了一種防治由乙肝病毒引發(fā)的疾病的藥物。該藥物是由上述特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽、編碼基因、基因載體及宿主細(xì)胞添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分的載體制備而成的。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，篩選出具HBV核心蛋白強(qiáng)結(jié)合能力的多肽的序列為SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。并從增加多肽空間穩(wěn)定性、減少多肽在人體內(nèi)的免疫原性、使多肽獲得高效的膜穿透能力、以及優(yōu)化藥物包封方式等方面，對之進(jìn)行了一系列改造，以使其能有效治療乙肝病毒感染，并達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。由于體外合成的短肽分子構(gòu)像易變，難以與耙蛋白穩(wěn)定結(jié)合；因此，將短肽插入合適的骨架蛋白，使其在體內(nèi)進(jìn)行正確折疊并獲得穩(wěn)定的空間構(gòu)像，是保持目的肽段與靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合的有效手段[ll]。在本發(fā)明中，將目的序列C20插入到優(yōu)選的骨架蛋白TrxA的第34和35位氨基酸之間，以維持肽適配體的空間構(gòu)像，使之能與HBV核心蛋白有效結(jié)合。為了適應(yīng)臨床應(yīng)用的要求，還將通常所用的骨架蛋白更換為人源化的TrxA，以避免或減少異源蛋白產(chǎn)生的免疫原性。同時，由于C20是在體外由酵母雙雜交技術(shù)篩選出的肽適配體，并非機(jī)體內(nèi)自然存在的多肽，缺乏必要的胞膜受體結(jié)合位點或信號肽等結(jié)構(gòu)，因此難以通過由磷脂雙分子構(gòu)成的脂質(zhì)胞膜[12，13]。為此，本發(fā)明在C末端添加了一段優(yōu)選的由12個氨基酸組成的膜轉(zhuǎn)位序列(MTS)，該序列可將C20高效轉(zhuǎn)入細(xì)胞膜內(nèi)而發(fā)揮作用。目前，臨床上用于治療HBV感染的抗病毒藥物，是通過作用于不同的特定靶位(如核苷類藥物)、或通過非特異性效應(yīng)(如干擾素)而產(chǎn)生的病毒抑制效果。由于HBV在體內(nèi)的感染和病毒復(fù)制過程已被逐步闡明，從理論上說，無論對HBV的病毒DNA復(fù)制、病毒蛋白合成和病毒顆粒組裝的任何一個關(guān)鍵過程進(jìn)行干涉，均有可能達(dá)到抗HBV的治療目的。本發(fā)明重組蛋白是在蛋白質(zhì)水平上直接阻斷HBV核心蛋白亞基的形成、從而中止內(nèi)殼蛋白的組裝和完整病毒顆粒的裝配，這不同于目前臨床上應(yīng)用的抗HBV藥物。由于完整的HBV內(nèi)殼蛋白，在以pgRNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄階段、以及感染性病毒顆粒的組裝過程中均起關(guān)鍵作用，而核心蛋白亞基則是組裝病毒內(nèi)殼蛋白的關(guān)鍵蛋白，因此，本發(fā)明重組蛋白不僅可通過阻斷核心蛋白亞基形成、使PgRNA無法被內(nèi)殼蛋白包裹而啟動逆轉(zhuǎn)錄、從而中斷病毒復(fù)制，還可通過阻斷內(nèi)殼蛋白的形成、使其無法與表面蛋白裝配成完整的病毒顆粒、從而中止病毒的分泌和再感染過程。本發(fā)明有益效果在于目前進(jìn)入臨床的治療抗乙肝病毒引發(fā)的疾病的新藥主要是核苷類藥物，如拉米夫定、恩替卡韋、阿德福韋等，其作用機(jī)理多為抑制DNA聚合酶或RNA逆轉(zhuǎn)錄酶，作用發(fā)生在DNA復(fù)制水平。本發(fā)明特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽，作用在蛋白組裝階段，不會摻入到病毒DNA鏈內(nèi)，不直接干擾HBVDNA的合成，會減少因DNA突變導(dǎo)致耐藥株產(chǎn)生的幾率。另外，由于與現(xiàn)有的核苷類藥物作用靶位不同，在臨床應(yīng)用中還可與該類藥物進(jìn)行聯(lián)用，從而提高抗病毒效果，達(dá)到長期、有效治療的目的。已有試驗，本發(fā)明特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽在HBV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株和動物模型體內(nèi)不僅可與HBV核心蛋白特性結(jié)合并降低核心蛋白亞基水平，還能有效抑制病毒的復(fù)制和分泌；而未添加MTS序列的C20由于無法有效透過細(xì)胞膜，其作用效果很弱、與對照組相比無明顯差異圖l多肽藥物C20-MTS結(jié)構(gòu)示意圖將C20插入人源化的骨架蛋白TrxA的34位和35位氨基酸之間，在TrxA的C末端連接MTS序列；圖2表達(dá)載體pET3d-(TrxA-C20-TrxA)-MTS的體外誘導(dǎo)表達(dá)和純化(A)M:marker;0:重組載體誘導(dǎo)表達(dá)過夜；Cl4:對照組空載體(pET-3d)在IPTG誘導(dǎo)1，2，3，4小時后的蛋白表達(dá)情況；Vl4:重組載體在IPGT誘導(dǎo)1，2，3，4小時后的蛋白表達(dá)情況；由圖可知，蛋白在IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)量隨時間增高，誘導(dǎo)過夜后表達(dá)量達(dá)峰值，光密度分析外源蛋白含量占菌體蛋白的65%以上。(B)M:marker;L:細(xì)菌裂解液；Sl3:勻漿液上清；Pl2:勻漿液沉淀；由圖可知，外源蛋白以可溶蛋白和不溶蛋白兩種方式表達(dá)。(C)M:marker;F:流穿液；El6:離子交換柱洗脫液；E46為最后收集的蛋白樣品。圖3對照蛋白口￡13(1-(1^八-C20-TrxA)的體外誘導(dǎo)表達(dá)和純化(無MTS):(A)M:marker;C:對照組空載體(pET-3d)誘導(dǎo)過夜；Vl3:重組載體的重組載體在IPGT誘導(dǎo)1，2，4小時后的蛋白表達(dá)情況；由圖可知，蛋白在IPTG誘導(dǎo)后2h，表達(dá)量即達(dá)峰值，光密度分析外源蛋白含量占菌體蛋白的40%左右。(B)M:marker;S:勻漿液上清；P:勻漿液沉淀；由圖可知，外源蛋白主要以不溶蛋白形式表達(dá)。(CandD)M:marker;F:流穿液；El9:離子交換柱洗脫液；E69為最后收集的蛋白樣品。圖4ELISA檢測HBV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中HBsAg含量在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入未用脂質(zhì)體包裹的藥物(A)以及用脂質(zhì)體包裹的藥物(B)，ELISA檢測HBsAg含量:H印G2.215細(xì)胞以0.8X105個細(xì)胞接種于12孔板中，加入實驗組藥物C20-MTS(令)和對照組C20(0)，空白組孔內(nèi)僅加入1.5mL含10。/。小牛血清DMEM培養(yǎng)液用作陰性對照(參)，每組設(shè)3個復(fù)孔。貼壁培養(yǎng)24h后棄上清，加入不同濃度的藥物，終體積1.5mL。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，換藥至每孔1.5mL。總共加藥培養(yǎng)8d后，取培養(yǎng)液上清檢測HBsAg。圖5Westernblot檢測給予不同劑量的C20-MTS后核心蛋白水平可見給藥劑量至lU/ml開始生效，至10y/ml時核心蛋白水平下降70X左右。圖6分別給予10yg/mlC20-MTS或C20后，探針法檢測HBVDNA的復(fù)制水平可見給予C20后，未見明顯的病毒抑制效應(yīng)，而添加了MTS序列的藥物C20-MTS則有較明顯的抑制效應(yīng)，與C20相比，HBVDNA復(fù)制水平下降約65。/o;圖7HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBsAg檢測分別給予5mg/kgC20-MTS，C20，10。/。NCS(小牛血清，用作陰性對照)，第8天檢測小鼠外周血HBsAg含量，觀察藥效；可見與對照組相比，給予C20無病毒抑制效果，而給予C20-MTS則可見明顯的病毒抑制效應(yīng)，HBsAg水平下降約70X;圖8HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞HBV核心蛋白水平檢測給予不同劑量的C20-MTS和C20，殺死小鼠、切除小鼠肝臟，Westernblot檢測病毒的核心蛋白水平；可見C20劑量增加至10yg/ml時也未見病毒抑制效應(yīng)，而C20-MTS在0.1yg/ml時即顯示出抑制效果，至10yg/ml時抑制效率最高，與C20相比，核心蛋白含量減少約70%左右。具體實施例方式以下結(jié)合附圖通過具體實施方式的描述以詳細(xì)說明但不限制本發(fā)明。研究證實，完整的HBV內(nèi)殼蛋白，在以pgRNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄階段、以及感染性病毒顆粒的組裝過程中均起關(guān)鍵作用，而核心蛋白(coreprotein)則是組裝病毒內(nèi)殼蛋白的關(guān)鍵蛋白。因此，設(shè)計可特異性地抑制核心蛋白亞基形成的藥物，是一種新穎有效的治療策略既可通過阻斷pgRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從而抑制病毒復(fù)制，又可阻止完整病毒顆粒的產(chǎn)生、中斷病毒的分泌和再感染過程。肽適配體系統(tǒng)(P印tideAptamerSystem)是近年來發(fā)展的一種新型酵母雙雜交技術(shù)，可用于篩選與目的蛋白特異性結(jié)合的肽適配體。根據(jù)近年來的文獻(xiàn)報道和本發(fā)明的研究結(jié)果，獲得了數(shù)條候選序列，并利用人源化肽適配體篩選系統(tǒng)和Westernblot等方法，鑒定出與HBV核心蛋白結(jié)合能力最強(qiáng)的一條由20個AA組成的多肽序列，命名為C20，作為本發(fā)明開發(fā)抗HBV藥物的基礎(chǔ)。為增加藥物療效、并達(dá)到未來臨床應(yīng)用的要求，本發(fā)明對C20進(jìn)行了重要的分子改造(1)將C20裝入骨架蛋白(proteinscaffold)中，以維持肽適配體的空間構(gòu)像，使之能與HBV核心蛋白有效結(jié)合。經(jīng)過ll前期試驗的篩選，確定的骨架蛋白為人源化的TrxA，能在充分維持肽適配體的前提下還能避免或減少異源蛋白產(chǎn)生的免疫原性。(2)在骨架蛋白的C末端添力口了一段膜轉(zhuǎn)位序歹[J(membranetranslocationsequence,MTS)，該序歹[J可將整條多肽高效轉(zhuǎn)入細(xì)胞膜內(nèi)，解決了基因工程肽由于缺乏必要生理活性位點難以穿過脂質(zhì)胞膜的問題。(圖l)實施例一本發(fā)明重組蛋白的制備根據(jù)HBV病毒特性，設(shè)計以HBV核心蛋白為作用耙位的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽藥物C20-MTS。首先篩選能與HBV核心蛋白特異性強(qiáng)結(jié)合的多肽序列作為藥物開發(fā)的基礎(chǔ)；根據(jù)文獻(xiàn)報道，并利用人源化肽適配體篩選系統(tǒng)，鑒定出與HBV核心蛋白結(jié)合能力最強(qiáng)的一條20由個AA組成的多肽序列，命名為C20，其氨基酸序列為SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。為達(dá)到臨床應(yīng)用的要求，對該序列(C20)進(jìn)行分子改造1、選取人源化的骨架蛋白TrxA以減少異源蛋白的免疫源性；將C20插入骨架蛋白TrxA內(nèi)以穩(wěn)定小分子肽的空間構(gòu)像。2、在肽鏈C末端加入膜轉(zhuǎn)位序列MTS:AAVLLPVLLAAP，以使肽分子獲得膜穿透能力。脂質(zhì)體包裹以增加多肽藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用度，利用脂質(zhì)體對肝臟的被動靶向性達(dá)到定向給藥的目的。經(jīng)分子改造后的得到的多肽藥物C20-MTS的氨基酸序列如下(共計141個氨基酸殘基)1、通過基因工程技術(shù)構(gòu)建可表達(dá)完整藥物分子的載體;1)選取pET3d原核表達(dá)載體；2)在人工合成的MTS序列，N端添加NcoI、Hindin酶切位點，C端添加EcoRI、Bgll頂每切位點；3)3d用NcoI和BamHI雙酶切，MTS用NcoI和BglII雙酶切，再將兩條片斷連接，形成pET-MTS重組子；4)pET-MTS和人源化的TrxA骨架蛋白(hTrxA)分別用NcoI和HindIII雙酶切，連接，形成pET-hTrxA-MTS重組子；5)將pET-hTrxA-MTS和人工合成的C20分別用RsrlI單酶切，連接，形成最終的重組表達(dá)載體pET-hTrxAhead-C20-hTrxA-MTS。2、原核表達(dá)系統(tǒng)和離子交換技術(shù)進(jìn)行體外蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化；(見附圖2、3)1)普通LB培養(yǎng)基，選取大腸桿菌BL21(DE)3作為工程菌；搖菌至OD值O.50.7時，加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(圖2.A);2)在lh，2h，3h，4h，過夜5個時段吸取10y1菌液，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)量；可見誘導(dǎo)4h后外源蛋白表達(dá)量已達(dá)峰值，誘導(dǎo)過夜表達(dá)量也未見增加；光密度掃描分析，外源蛋白含量占菌體蛋白總量的65%左右(圖2.A);3)用含脫氧膽酸鈉的緩沖液處理大腸桿菌沉淀，勻漿器反復(fù)勻漿并離心沉淀后，檢測沉淀(為包涵體蛋白)和上清(為可溶性蛋白)中目的蛋白的含量；可見目的蛋白約一半以包涵體形式表達(dá)，一半以可溶蛋白形式表達(dá)；包涵體蛋白經(jīng)過8M尿素溶解后復(fù)性，再與可溶性蛋白一起進(jìn)行離子交換純化；(圖2.B)4)我們使用離子交換法對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化；經(jīng)過2輪過柱，可得到較純的目的蛋白(圖3.C);5)為了與本發(fā)明藥物C20-MTS進(jìn)行藥效對照，專門對未添加MTS序列的C20進(jìn)行了表達(dá)和純化，以在后續(xù)實驗中用作對照；C20與C20-MTS的表達(dá)和純化過程均相同，但從(圖3.B)中可見，C20基本存在于包涵體中，以不溶蛋白的形式表達(dá)，因此收集的全部菌沉淀均需用8M尿素溶解處理后復(fù)性，再用離子交換純化得到。實施例二體外藥效研究獲得HBV轉(zhuǎn)基因H印G2.215細(xì)胞株進(jìn)行體外模型藥效驗證，并以C20為對照(未添加MTS序列)，檢驗C20-MTS膜穿透能力。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清HBsAg含量，細(xì)胞培養(yǎng)液和血漿表面HBsAg抗原水平，可以提示分泌性病毒顆粒含量。Westernblot檢測細(xì)胞裂解液中HBV核心蛋白亞基含量；確定胞內(nèi)HBV核心蛋白亞基DNA含量，以提示HBV核心蛋白亞基形成情況探針法檢測細(xì)胞裂解液HBVDNA含量，確定胞內(nèi)HBVDNA含量，以提示病毒DNA的復(fù)制情況。結(jié)果如下在體外實驗中，每2天給藥一次C20-MTS(帶有MTS序列的多肽藥物)，第8天進(jìn)行檢測，當(dāng)給藥濃度增至lyg/ml以上時，可見HBsAg水平顯著降低，抑制效率約78.5%(見圖4A)。Westernblot檢測，當(dāng)藥物濃度增至lug/ml時HBV核心蛋白水平開始降低，至10yg/ml核心蛋白水平最低，光密度掃描分析抑制率約71.5%(圖5);分析胞內(nèi)HBVDNA含量，10yg/ml時DNA水平降低約650/0(圖6)。結(jié)論體外藥效學(xué)實驗證實，本發(fā)明設(shè)計制備的多肽藥物C20-MTS可降低HBV核心蛋白水平約70%，有效抑制了病毒顆粒的包裝；同時HBsAg分泌水平和HBVDNA含量也分別降低了78.5%和65%，提示藥物可有效抑制病毒顆粒的分泌和病毒復(fù)制。本發(fā)明用未添加MTS序列的C20用于對照觀察，未發(fā)現(xiàn)有明顯的病毒抑制效應(yīng)。探討了藥效差異產(chǎn)生的原因可能是由于C20為一段由酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出的肽適配體，并非機(jī)體內(nèi)自然存在的生理性肽段，缺乏必要的胞膜受體結(jié)合位點或信號肽序列，因此難以穿過由磷脂雙分子構(gòu)成的脂質(zhì)胞膜；而添加了膜轉(zhuǎn)位序列MTS的藥物C20-MTS，則可高效透過胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，發(fā)揮其抗病毒作用。實施例三體內(nèi)藥效學(xué)研究使用HBV轉(zhuǎn)基因Balb/c小鼠模型(小鼠來源廣州軍區(qū)醫(yī)院。)檢測本發(fā)明蛋白的體內(nèi)藥效，并以C20為對照(未添加MTS序列)，檢驗C20-MTS膜穿透能力。ELISA檢測小鼠外周血HBsAg含量。Westernblot檢測小鼠肝細(xì)胞HBV核心蛋白亞基含量。探針法檢測小鼠肝細(xì)胞HBVDNA含量。在體內(nèi)實驗中，我們使用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行藥效驗證。根據(jù)體外實驗結(jié)果，我們選擇每2天給藥1次，結(jié)果示在給藥劑量為2.5mg/kg以上時可檢測到HBsAg分泌水平降低；劑量為5mg/kg時，第8天檢測HBsAg水平降低70。/。左右(附圖7);處死小鼠后收集肝細(xì)胞、Westernblot分析證實，核心蛋白水平降低約70%(附圖8)。以上實驗均可觀察到明顯的量效關(guān)系。并且可以看見同劑量的C20-MTS和C20的效果之間有明顯差異。表明本發(fā)明多肽能高效透過胞膜，直接作用于乙肝病毒本身。由上可見，本發(fā)明多肽能高效透過胞膜，直接作用于乙肝病毒本身，通過與HBV核心蛋白特異性結(jié)合，阻斷內(nèi)殼蛋白的形成、抑制依賴內(nèi)殼蛋白的PgRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而抑制病毒復(fù)制；同時由于內(nèi)殼蛋白無法與殼蛋白結(jié)合形成完整的病毒顆粒，從而中斷了病毒的分泌和再感染。而未添加MTS的C20由于難以透過胞膜，因而作用微弱，未觀察到明顯的抗病毒效應(yīng)。SEQUENCELISTING〈110>四川大學(xué)華西醫(yī)院〈120>特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽〈130>A080370k〈160>2〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211>141〈212>PRT〈213>Artificial〈220>〈223>artificial〈400>1MetValLys1AlaAlaGlyGlyProSer35PheSerHis50HisSerLeu65ValAspAspGinlieGluSerLysThrAlaPheGinGluAlaAsp20Phe5LysSerGin85LeuValValTyrSerValSerTrpTyrSerGluLys70AspArg55TyrLeu40ProVal25Phe10AspValAlaSerGlu90PheSerLeuTrpGlySerLysMetSerAsnVallie75Serlie60PheAlaThr30ThrCys45LysProLeuGluGluValLysProThrPheGliiPhePheLysLysGlyGliiLysValGlyGluLeuAsp15TrpSerGlyGlyPhePheValAsp80SerMet95PheSer100105110GlyAlaAsnLysGluLysLeuGluAlaThrlieAsnGluLeuValLys115120125LeuAlaAlaValLeuLeuProValLeuLeuAlaAlaPro130135140〈210>2〈211>423〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400〉2atggtg肌gc卿tcg卿gcaagactgcttttcaggaagccttggacgctgcaggtgat60tagttgacttctcagccacgtggagcggtccgagcttctacagcgttctg120ttcctgtggggcacctgcggcggcttcagccacagctggtaccgtccgag180aagcctttctttcattcccttattccaacgtgatattccttgaagtagat240gtggatgactctcaggatgttgcttcagagtctgaagtcaaatccatgcc肌cattccag300ttttttaagaggtgggtg肌ttttctggagcc肌t肌ggaa肌gctcg肌360gccaccattacaagcttgcagccgttcttctccctgttcttcttgccgca420ccc42權(quán)利要求權(quán)利要求1特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽，其特征在于其結(jié)構(gòu)為將具HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽序列插入硫氧還蛋白序列中，并在硫氧還蛋白序列的C末端連接膜轉(zhuǎn)位序列，所述的具HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽序列為SFYSVLFLWGTCGGFSHSWY。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽，其特征在于所述的硫氧還蛋白的序列為MPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVKL。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽，其特征在于所述具HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽序列插在了硫氧還蛋白序列的第34個氨基酸與第35個氨基酸之間。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽，其特征在于所述的膜轉(zhuǎn)位序列為AAVLLPVLLAA。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽，其特征在于具有SEQIDNO.l所示氨基酸序列。6.編碼權(quán)利要求15任一項所述的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽的核苷酸序列。7.含有權(quán)利要求6所述核苷酸序列的基因載體。8.含有權(quán)利要求7所述基因載體的宿主細(xì)胞。9.權(quán)利要求15任一項所述的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽、權(quán)利要求6所述核苷酸序列、權(quán)利要求7所述的基因載體或權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞在制備防治由乙肝病毒引發(fā)的疾病的藥物中的用途。10.防治由乙肝病毒引發(fā)的疾病的藥物，其特征在于是由權(quán)利要求l5任一項所述的特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的膜穿透性多肽、權(quán)利要求7所述的基因載體或權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種能特異性阻斷乙肝病毒組裝和復(fù)制的新型膜穿透性多肽及其制備方法。本發(fā)明的重組蛋白結(jié)構(gòu)為將HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽序列插入硫氧還蛋白序列中，并在硫氧還蛋白序列的C末端連接膜轉(zhuǎn)位序列。其中，具HBV核心蛋白結(jié)合能力的多肽序列插在了硫氧還蛋白序列的第34個氨基酸與第35個氨基酸之間。本發(fā)明重組蛋白在HBV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株和動物模型體內(nèi)不僅可與HBV核心蛋白特性結(jié)合并降低核心蛋白亞基水平，還能有效抑制病毒的復(fù)制和分泌，具有很好的應(yīng)用前景。文檔編號A61K48/00GK101423555SQ20081030554公開日2009年5月6日申請日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者吳思思,巍張,辛洪波申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院