專利名稱：間充質(zhì)細胞的制造方法、牙的制造方法及牙形成用間充質(zhì)細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于形成牙的間充質(zhì)細胞的制造方法、牙的制造方法及牙形成用間充 質(zhì)細胞(mesenchymal cell)。
背景技術(shù)：
牙是具有最外層為牙釉質(zhì)、其內(nèi)層為象牙質(zhì)的硬組織，進而在象牙質(zhì)的內(nèi)側(cè)具有 產(chǎn)生象牙質(zhì)的牙本質(zhì)細胞、進一步在中心部具有牙髓的器官，有時因齲齒或牙周病等而失 去。通常，認為牙損失對性命的威脅少，所以現(xiàn)在主要通過義齒或種植牙來修補。但是，牙 的有無嚴重影響外觀和對食物的味覺，并且從維持健康和維持高品質(zhì)生活的觀點來看，對 開發(fā)牙的再生技術(shù)的關(guān)注越來越高。認為牙因胎兒期的產(chǎn)生過程的誘導而形成，是根據(jù)多種細胞種類構(gòu)筑的功能單 元，與器官和臟器相同。因此，牙并不是由成體內(nèi)的造血干細胞或間充質(zhì)干細胞之類干細胞 產(chǎn)生細胞種的干細胞體系產(chǎn)生的。由此可知，現(xiàn)在，僅因再生醫(yī)療進步而移入干細胞(干細 胞移入療法)不能再生牙。為此，近年，使用分離的牙胚細胞再構(gòu)筑牙胚，通過移植該再構(gòu)成牙胚進行牙再 生，正以這為中心進行研究。例如，J.Dent.Res.，2002，Vol. 81 (10)，pp. 695-700 中公開了下述內(nèi)容，將從牙胚 分離的上皮系細胞或間充質(zhì)的牙囊細胞等細胞與生物體吸收性的載體一起移植到大鼠的 腹腔內(nèi)，由此再生牙樣組織。作為牙胚的再生方法，例如日本特開2004-331557號公報中記載了在纖維芽細 胞增殖因子等生理活性物質(zhì)的存在下培養(yǎng)由生物體分離的牙胚細胞。另外，日本特開 2004-357567號公報中提出了將從生物體中分離的牙胚細胞與能分化上述細胞的細胞中的 至少一種與含有纖維蛋白的載體一起培養(yǎng)的方案，此處，含有纖維蛋白的載體使用牙胚的 目標形狀的載體，形成具有特定形態(tài)的“牙”。美國專利申請公開第2002/0119180號公報及美國專利申請公開第2004/0219489 號公報中公開了下述方法從6個月的豬的下顎骨中，將來自形成象牙質(zhì)的牙髓的間充質(zhì) 細胞與含有利于形成釉質(zhì)的上皮系細胞的牙胚的細胞混合物接種在使由聚乙醇酸-聚乙 酸共聚物構(gòu)成的生物分解性聚合物固化的載體(Scaffold)中，移植到動物體內(nèi)，形成牙。 此處，還記載了作為載體，使用牙胚的目標形狀的載體，形成具有特有形態(tài)的“牙”。另一方面，國際公開第2005/014070號小冊子中公開了用于治療具有骨缺損或損 傷的患者的牙的再生方法。根據(jù)該方法，在聚乙醇酸絲網(wǎng)載體上接種例如來自牙胚的間充 質(zhì)細胞后，將上皮系細胞與膠原一起重疊或用上皮細胞片包裹，由此形成骨。需要說明的 是，國際公開第2005/014070號小冊子中，為了構(gòu)筑骨的形狀而使用載體。另外，國際公開第2006/129672號小冊子中公開了下述技術(shù)將來自牙胚的上皮系細胞與間充質(zhì)細胞分別制成細胞集合體后，使細胞集合體密接在膠原膠內(nèi)部，邊保持該狀態(tài)邊培養(yǎng)，由此制造具備牙特有的細胞配置的牙。但是，上述技術(shù)中，為了再生牙或牙胚，從生物體中獲得牙胚細胞或能分化成該細 胞的細胞。由此，在使用從生物體中采集的細胞的技術(shù)中，有時能獲得的細胞數(shù)不充分。另 夕卜，有時細胞的獲得源有限。
另外，發(fā)揮作為組織的功能時，必須將構(gòu)成組織的多種細胞配置(細胞配置)在適 當?shù)南鄬ξ恢?，具有作為組織的方向性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述情況而得到的，提供牙形成用間充質(zhì)細胞的制造方法、牙的制 造方法及牙形成用間充質(zhì)細胞。本發(fā)明的第一方案提供一種間充質(zhì)細胞的制造方法，其是用于形成牙的間充質(zhì)細 胞的制造方法，該方法包括下述步驟在分化誘導劑的存在下培養(yǎng)全能性干細胞，生成含有 ⑶44陽性且⑶29陽性細胞、或⑶44陽性且⑶106陽性細胞的分化誘導處理后的細胞集 團；從所述分化誘導處理后的細胞集團中篩選CD44陽性且CD29陽性細胞、或CD44陽性且 CD106陽性細胞作為牙形成用間充質(zhì)細胞。本發(fā)明的第二方案在于提供一種牙的制造方法，所述方法包括下述步驟使實質(zhì) 上僅由間充質(zhì)細胞與上皮系細胞中的任一種構(gòu)成的第1細胞集合體、和實質(zhì)上僅由任意其 它一種細胞構(gòu)成的第2細胞集合體在不混合的情況下密接地配置在支持載體的內(nèi)部；在所 述支持載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第1與第2細胞集合體，其中所述間充質(zhì)細胞含有上述牙形成 用間充質(zhì)細胞。本發(fā)明的第三方案是提供由全能性干細胞誘導的⑶44陽性且⑶29陽性、或⑶44 陽性且CD106陽性的牙形成用間充質(zhì)細胞。根據(jù)本發(fā)明，可以提供能有效且大量制作目標牙的間充質(zhì)細胞的制造方法、及有 效且大量制造牙的牙的制造方法，所述牙保持有由牙釉質(zhì)及象牙質(zhì)得到的特有的細胞配置。


[圖1]是示意地表示牙胚形成的概念圖。[圖2A]是表示本發(fā)明實施例1的EC細胞的⑶44及⑶29雙重染色的狀況的圖。[圖2B]是表示本發(fā)明實施例1的DMSO處理后第6天的細胞的⑶44及⑶29雙重 染色的狀況的圖。[圖2C]是本發(fā)明實施例1中的篩選得到的⑶44陽性且⑶29陽性細胞的⑶44及 ⑶29雙重染色的狀況的圖。[圖3A]是概念地表示本發(fā)明實施例的、使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞與上皮系細 胞的牙胚再構(gòu)筑順序的圖，是表示細胞配置前的凝膠包裝(gelpack)的狀況的圖。[圖3B]是概念地表示本發(fā)明實施例的、使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞與上皮系細 胞的牙胚再構(gòu)筑順序的圖，是表示將第一細胞集合體配置在凝膠包裝內(nèi)的狀況的圖。[圖3C]是概念地表示本發(fā)明的實施例的、使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞與上皮系 細胞的牙胚再構(gòu)筑的順序的圖，是表示將第二細胞集合體配置在凝膠包裝內(nèi)的狀況的圖。
[圖3D]是概念地表示本發(fā)明實施例的、使用來自牙胚的間充質(zhì)細胞與上皮系細胞的牙胚再構(gòu)筑的順序的圖，是表示將配置有第一細胞集合體與第二細胞集合體的凝膠包 裝固化的狀況的圖。[圖4A]是本發(fā)明實施例4的由牙胚上皮組織與牙胚間葉細胞制作而成的牙胚的 HE染色像(倍率100倍)。[圖4B]是由本發(fā)明實施例4的由牙胚上皮組織與DMSO-EC細胞制作而成的牙胚 的HE染色像(倍率100倍)。[圖4C]是本發(fā)明實施例4的由牙胚上皮組織與DMSO-EC克隆化細胞制作而成的 牙胚的HE染色像(倍率100倍)。[圖5A]是表示本發(fā)明實施例5的、EC細胞的⑶44及⑶29的雙重染色的狀況的 圖。[圖5B]是表示本發(fā)明實施例5的、RA處理后第7天的細胞的⑶44及⑶29的雙 重染色的狀況的圖。[圖5C]是表示本發(fā)明的實施例5的、篩選得到的⑶44陽性且⑶29陽性細胞的 ⑶44及⑶29雙重染色的狀況的圖。[圖6]是本發(fā)明實施例5中由通過RA處理得到的⑶44陽性且⑶106陽性細胞與 牙胚上皮組織制作而成的牙胚的HE染色像(倍率200倍、bar為50 μ m)。[圖7A]是表示本發(fā)明實施例6的、EC細胞的⑶44及⑶106的雙重染色狀況的圖。[圖7B]是本發(fā)明實施例6中的RA處理后第7天的細胞的⑶44及⑶106的雙重 染色的狀況的圖。[圖7C]本發(fā)明實施例6中篩選得到的⑶44陽性且⑶106陽性細胞的⑶44及 ⑶106的雙重染色的狀況的圖。
具體實施例方式[間充質(zhì)細胞的制造方法]本發(fā)明的間充質(zhì)細胞的制造方法是制造用于形成牙的間充質(zhì)細胞的方法，其包括 下述步驟在分化誘導劑的存在下培養(yǎng)全能性干細胞，生成含有CD44陽性且CD29陽性細 胞、或CD44陽性且CD106陽性細胞的分化誘導處理后的細胞集團；從所述分化誘導處理后 的細胞集團中篩選⑶44陽性且⑶29陽性細胞、或⑶44陽性且⑶106陽性細胞作為牙形成 用間充質(zhì)細胞。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，分化誘導全能性干細胞而得到的⑶44陽性且⑶29陽性細胞、或⑶44 陽性且⑶106陽性細胞可以用作牙形成用間充質(zhì)細胞。由此，也可以從來自生物體的牙或 牙胚以外的物質(zhì)中得到用于制作牙所需的間充質(zhì)細胞，得到用于形成牙的間充質(zhì)細胞，因 此可以排除使用來自生物體的牙等的必要性。結(jié)果，不需要考慮從牙胚直接采集的細胞數(shù) 不充分的情況或獲得場所有無限制的情況就可以容易地根據(jù)情況大量得到所需量的間充 質(zhì)細胞。本發(fā)明中，所謂“牙”，是指在內(nèi)側(cè)連續(xù)地具有象牙質(zhì)及在外側(cè)連續(xù)地具有牙釉質(zhì) 層的組織，特別是指具有牙冠或牙根的具備方向性的組織。牙的方向性可以由牙冠或牙根的配置來特定。牙冠或牙根可以基于形狀或組織染色等通過肉眼觀察來確認。所謂牙冠， 是指具有牙釉質(zhì)與象牙質(zhì)的層結(jié)構(gòu)的部分，牙根不存在牙釉質(zhì)層。象牙質(zhì)及牙釉質(zhì)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過組織染色等形象且容易地特定。另 夕卜，牙釉質(zhì)可以通過釉質(zhì)芽細胞的存在來特定，釉質(zhì)芽細胞的存在可以通過有無牙釉質(zhì)蛋 白來確認。另一方面，象牙質(zhì)可以通過牙本質(zhì)細胞的存在來特定，牙本質(zhì)細胞的存在可以通 過有無牙本質(zhì)涎蛋白來確認。牙釉質(zhì)蛋白與牙本質(zhì)涎蛋白的確認可以通過該領(lǐng)域中周知的 方法容易地實施，例如可以舉出原位雜交、抗體染色等。另外，為了形成牙，首先為了形成牙胚，可以使用本發(fā)明的間充質(zhì)細胞。本發(fā)明中，“牙胚”及“牙芽”是根據(jù)后述的發(fā)生階段而區(qū)別得到的物質(zhì)中在沒有特 別說明時使用的表現(xiàn)。所謂此時的“牙胚”，是指決定將來成為牙的牙的初始胚，是在牙的產(chǎn) 生階段中從通常所用的蕾狀期(Bud stage)至鐘狀期(Bell stage)的階段，特別是未確認 作為牙的硬組織的特征即象牙質(zhì)、牙釉質(zhì)蓄積的組織。另外，所謂“牙芽”，是指由本發(fā)明中 所用的“牙胚”的階段過渡而來的、從開始蓄積作為牙的硬組織特征即象牙質(zhì)、牙釉質(zhì)的階 段開始到牙從牙肉開始萌芽發(fā)揮通常作為牙的功能前的階段的組織。
由牙胚向牙的產(chǎn)生通過如圖1所示的個體產(chǎn)生的過程中，經(jīng)由蕾狀期、帽狀期、鐘 狀前期及后期的各個階段來進行。此處，在蕾狀期，處于上皮系細胞包裹間充質(zhì)細胞的狀 態(tài)，至鐘狀前期及鐘狀后期時，上皮系細胞部分形成外側(cè)的牙釉質(zhì)，間充質(zhì)細胞部分在內(nèi)部 形成象牙質(zhì)。因此，通過上皮系細胞與間充質(zhì)細胞的細胞間相互作用，由牙胚形成牙。需要說明的是，本發(fā)明中，所謂“間充質(zhì)細胞”，是指來自間葉組織的細胞，所謂“上 皮系細胞”，是指來自上皮組織的細胞。另外，本發(fā)明中，所謂“牙周組織”，是指牙的主要形成外層的牙槽骨及牙根膜。牙 槽骨及牙根膜可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過組織染色等形象且容易地特定。以下，說明本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞。用于得到本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞的全能性干細胞是指具有能分化為至少2 種以上細胞的多分化能力的細胞，可以優(yōu)選使用選自由胚性癌細胞、胚性干細胞、胚性生殖 干細胞構(gòu)成的組中的細胞。其中，從獲得容易性的觀點考慮，較優(yōu)選為胚性癌細胞(以下稱 為“EC細胞”)。能應用于本發(fā)明的EC細胞可以為來自神經(jīng)、睪丸、卵巢等任一種組織的細 胞。作為上述EC細胞，例如，作為來自人的EC細胞，可以舉出NCR-G3細胞以及NTERA-2細 胞，作為來自小鼠的EC細胞，可以舉出c-1300細胞或F9細胞、LT-2細胞、0TT6050細胞、 PCC4細胞、P19細胞、METT-I細胞、STT-3細胞等細胞株。上述細胞可以適當根據(jù)使用目的 從來自哺乳動物的靈長類(例如人、猴等)、有蹄類(例如豬、牛、馬等)、小型哺乳類的嚙齒 類(例如小鼠、大鼠、兔等)各種動物的細胞中選擇。例如，作為來自小鼠的胚性癌細胞株， 可以舉出上面記載的細胞株或這些細胞株的派生克隆。全能性干細胞的培養(yǎng)中可以使用通常使用的培養(yǎng)基。作為用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可 以使用通常用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基、例如Dulbcco，sModifed Eagle Medium(DMEM)等。 上述培養(yǎng)基中可以添加用于促進細胞增殖的血清或添加例如FGF、EGF、PDGF等細胞增殖因 子或轉(zhuǎn)鐵蛋白等已知的血清成分來代替血清。另外，添加血清時的濃度可以根據(jù)此時的培 養(yǎng)狀態(tài)適當變更，但通?？梢詾?0%。細胞的培養(yǎng)可使用通常的培養(yǎng)條件，例如在37°C的 溫度下、在濃度為5%的CO2的恒溫箱內(nèi)的培養(yǎng)。另外，可以適當添加鏈霉素等抗生素。
本發(fā)明中，通過在分化誘導劑的存在下培養(yǎng)全能性干細胞來進行分化誘導處理。 通過該分化誘導處理，由全能性干細胞生成含有⑶44陽性且⑶29陽性細胞、或⑶44陽性 且⑶106陽性細胞的細胞集團。通過誘導處理而得到的細胞集團中含有上述⑶44陽性且 ⑶29陽性細胞、或⑶44陽性且⑶106陽性細胞即可，也可以含有上述兩種細胞。 作為上述分化誘導劑，只要是至少能由全能性干細胞分化誘導為⑶44表達細胞 的CD44陽性細胞誘導因子，就可以使用。作為上述CD44陽性細胞誘導因子，可以舉出神經(jīng) 嵴細胞系誘導因子、神經(jīng)嵴細胞產(chǎn)生相關(guān)因子、神經(jīng)嵴細胞增殖促進因子。神經(jīng)嵴細胞系 誘導因子是可以將全能性干細胞誘導為神經(jīng)嵴細胞或其派生細胞(平滑肌細胞、心肌細胞 等)的因子，可以舉出例如二甲基亞砜(DMSO)、Dex、cAMP、六亞甲基二乙酰胺、5，-氮雜胞 苷、TGF β、Noggin等。作為神經(jīng)嵴細胞產(chǎn)生相關(guān)因子，可以舉出視黃酸(RA)、BMP-4、BMP-7、 Shh、Wnt、FGF2、內(nèi)皮素_1、內(nèi)皮素_3、活化素β A、PDGF, VEGF等。作為神經(jīng)嵴細胞增殖促 進因子，可以舉出FGF2、FGF8、FGFlO、BMP-2、SCF、活性型維生素D3等。神經(jīng)嵴細胞系誘導 因子、神經(jīng)嵴細胞產(chǎn)生相關(guān)因子及神經(jīng)嵴細胞增殖促進因子沒有分別明確地區(qū)別，并且可 以單獨使用上述分化誘導劑或組合1種以上進行使用。其中，優(yōu)選能有效生成下述本發(fā)明 的目標細胞集團的DMSO及RA，上述分化誘導劑可以單獨或組合使用。上述分化誘導劑可以按照能分化誘導的濃度添加在全能性干細胞的培養(yǎng)基中。此 處所謂能分化誘導的濃度，根據(jù)所用的分化誘導劑的種類和全能性干細胞的種類等不同而 不同。例如，為DMSO時，通常相對于培養(yǎng)基的容量，為0. 5容量％ 10容量％，從對處理 的細胞的生存率及通過培養(yǎng)得到的目標細胞的獲得效率的觀點來看，優(yōu)選為2.5容量％ 5容量％、更優(yōu)選為4容量％ 5容量％的濃度。為2. 5容量％以上的濃度時，可以充分誘 導全能性干細胞分化，另一方面，如果為5容量％以下的濃度，則不會顯著損害獲得目標細 胞的效率。另外，為RA的情況下，通常在培養(yǎng)基中為0. 1 μ M 10 μ M，從對處理的細胞的生存 率及通過培養(yǎng)得到的目標細胞的獲得效率的觀點來看，可以優(yōu)選為0. 5 μ M 5 μ Μ、更優(yōu)選 為0. 5 μ M 2 μ M的濃度。如果為0. 1 μ M以上的濃度，則可以充分誘導全能性干細胞的分 化，另一方面，如果為10 μ M以下的濃度，則不會顯著損害獲得目標細胞的效率。對于全能性干細胞的分化誘導處理可以通過在上述分化誘導劑的存在下培養(yǎng)全 能性干細胞來進行。分化誘導處理(培養(yǎng))期間根據(jù)分化誘導劑的濃度與細胞的生長活性 而不同，但通常為2小時 3天，從細胞的存活率以及目標細胞的獲得效率的觀點來看，可 以優(yōu)選為6小時 24小時。設定為6小時以上可以效率良好地得到被充分分化誘導的細 胞，設定為24小時以下不會顯著損害效率。另外，為了有效引發(fā)對全能性干細胞的分化誘導，在分化誘導處理的期間與分化 誘導劑的濃度之間有一定的關(guān)系。即，通常在分化誘導劑存在下的培養(yǎng)期間(處理時間) 因分化誘導劑的濃度與分化誘導劑的種類而不同，但在特定的分化誘導劑的情況下，固定 培養(yǎng)天數(shù)時，通常存在最適合其濃度的濃度區(qū)域。另外，縮短培養(yǎng)天數(shù)時，最佳濃度區(qū)域移 動到高濃度側(cè)，相反，延長培養(yǎng)天數(shù)時，最佳濃度區(qū)域移動到低濃度側(cè)?？紤]到上述因素，能 通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)天數(shù)來得到在幅度較寬的濃度區(qū)域中的分化誘導效果，同時本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以容易地設定能得到誘導效果的最佳濃度區(qū)域。
由上述分化誘導處理而得到的分化誘導處理后的細胞集團中生成含有⑶44陽性 且⑶29陽性細胞、或⑶44陽性且⑶106陽性細胞的細胞集團。也可以含有上述兩種細胞。 然后，該分化誘導處理后的細胞集團被供給到篩選CD44陽性且CD29陽性細胞、或CD44陽 性且CD106陽性細胞作為牙形成用間充質(zhì)細胞的篩選處理中。細胞的篩選只要是可以篩選上述本發(fā)明的間充質(zhì)細胞的方法即可，可以使用任意 方法。作為上述篩選方法，可以舉出以基因表達蛋白、細胞表面抗原、形態(tài)等為基準的篩選， 可以使用上述的一種或二種以上來篩選全能性干細胞。從篩選細胞的效率的觀點來看，篩 選方法優(yōu)選使用以細胞表面表達為基礎(chǔ)的細胞分選儀，為了確實地篩選間充質(zhì)細胞，優(yōu)選 使用多個組合、特別是組合基因表達譜與細胞表達抗原的表達來使用。本發(fā)明中篩選得到的牙形成用間充質(zhì)細胞除顯示⑶44陽性之外，還顯示⑶29陽 性或CD106陽性的細胞性狀。已知CD44是作為透明質(zhì)酸受體在細胞表面表達的膜蛋白質(zhì)。 另一方面，已知⑶29是作為整連蛋白β 1分子在細胞表面表達的膜蛋白質(zhì)，分別報道有在 EC細胞中表達為弱陽性，在間充質(zhì)細胞中以mRNA水平來表達的情況。另外，已知⑶106是 作為粘連分子而已知的VCAM-I分子，通常主要作為上皮系細胞的標記使用。如果是顯示上 述性狀的細胞，則可以在下述牙的形成中作間充質(zhì)細胞使用。本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞只要是除了⑶44陽性之外，⑶29及⑶106中的至 少一種抗原也表現(xiàn)為陽性的集團即可，也可以含有⑶44、⑶29、⑶106這3種抗原均為陽性 的三重陽性細胞。
本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞除了基于上述⑶44、⑶29及⑶106的細胞表面抗原 篩選之外，還可以基于其他細胞性狀進行篩選。作為其他細胞性狀，可以舉出其他細胞表面抗原譜或基因表達譜。作為細胞表面 抗原譜，可以舉出例如CD14陰性、CD34陰性、CD45陰性等，上述細胞表達抗原譜可以單獨使 用或組合進行使用。另外，作為基因表達譜，可以舉出例如Slug表達、Wnt5a表達、LhxS表 達、BMP4表達、Pax3表達、Pax9表達、Msxl表達、0ct3/4不表達、nanog不表達、Sox9不表 達、Sox5不表達等，可以單獨或組合上述基因表達譜進行使用，但并不限定于此。本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞優(yōu)選除表達上述⑶44、⑶29、⑶106之外，從牙形成 性能高低出發(fā)，優(yōu)選表達選自Slug基因、Pax3基因、Msxl基因及Pax9基因的組中的至少一 個基因，更優(yōu)選均表達Slug基因及Pax3基因，特別優(yōu)選全部表達上述4個基因。上述細胞表面抗原或基因表達譜的確認及基于此的篩選中使用識別表面抗原的 各種抗體或能確認基因表達的核酸序列等。上述抗體及核酸序列均是公知的，能容易獲得。 另外，基于上述表面抗原或基因表達的確認與篩選可以使用通常用于該用途的方法、例如 利用各種抗體進行的免疫染色、流式細胞儀、細胞分選儀、RT-PCR等。另外，本發(fā)明的制造方法中，可以與上述篩選方法組合，使用用于制成單一的間充 質(zhì)細胞的克隆。作為克隆的方法，可以使用通常用于該目的的方法，例如極限稀釋法、細胞 分選儀、克隆等?？寺】梢栽谟蒙鲜龊Y選方法進行的篩選前后的任一階段進行，但為了效率 良好地得到目標間充質(zhì)細胞，優(yōu)選在篩選后進行。篩選工序中，為了效率良好地得到目標細胞數(shù)，可以在篩選工序前設置增殖工序。 上述增殖工序中，使用不含有分化誘導劑的通常用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基進行分化誘導后的細胞 集團的培養(yǎng)。由此，可以使分化誘導得到的目標細胞增殖到規(guī)定的細胞數(shù)。結(jié)果，可以通過充分的細胞數(shù)容易地實施篩選。上述增殖工序的期間可以基于分化誘導處理后的細胞數(shù)及細胞的狀態(tài)來適當設 定，但從目標細胞的濃縮效率的觀點考慮，通常為3 30天，可以優(yōu)選為5 10天。結(jié)果， 通過在作為篩選工序?qū)ο蟮募毎瘓F中含有目標牙形成用間充質(zhì)細胞，并將上述細胞集團 供給到篩選工序中，從而可以有效且大量地得到本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞。由本發(fā)明的方法得到的間充質(zhì)細胞可用于形成牙。牙的形成只要使用本發(fā)明的間充質(zhì)細胞即可，可以為任一種方法，最優(yōu)選用于以下的本發(fā)明的牙制造方法中。以下，說明本發(fā)明的牙的制造方法。[牙的制造方法]使用本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞的優(yōu)選的牙制造方法包括下述工序在使實質(zhì) 上僅由間充質(zhì)細胞與上皮系細胞中的任一種細胞構(gòu)成的第1細胞集合體、和實質(zhì)上由任意 另一種細胞構(gòu)成的第2細胞集合體在不混合的情況下密接地配置在支持載體的內(nèi)部(配置 工序)；在所述支持載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第1及第2細胞集合體(培養(yǎng)工序)，其中所述間 充質(zhì)細胞含有上述牙形成用間充質(zhì)細胞。本制造方法中，由于不使間充質(zhì)細胞與上皮系細胞作為細胞集合體而混合在支持 載體的內(nèi)部，而是使其以密接的狀態(tài)生長，所以可以通過緊密的接觸狀態(tài)，有效地重現(xiàn)細胞 間相互作用，并且可以得到內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、外側(cè)為牙釉質(zhì)的具有牙所特有的細胞配置的牙。 此時，由于實質(zhì)上由間充質(zhì)細胞構(gòu)成的細胞集合體含有本發(fā)明的牙形成用間充質(zhì)細胞，所 以可以有效且大量地制造具有特有的細胞配置的牙。 配置工序中，使第1細胞集合體與第2細胞集合體接觸地配置在支持載體的內(nèi)部。此處，第1細胞集合體及第2細胞集合體分別實質(zhì)上僅由間充質(zhì)細胞或僅由上皮 系細胞構(gòu)成。此處，實質(zhì)上僅由間充質(zhì)細胞構(gòu)成的細胞集合體含有上述牙形成用間充質(zhì)細 胞。該含有牙形成用間充質(zhì)細胞的細胞集合體可以根據(jù)上述制造方法的調(diào)制工序來調(diào)制， 另一方面，實質(zhì)上僅由上皮系細胞構(gòu)成的細胞集合體可以與實質(zhì)上由間充質(zhì)細胞得到的細 胞集合體獨立地調(diào)制(第1細胞調(diào)制工序及第2細胞調(diào)制工序)。另外，所謂“細胞集合體”是指細胞密集的狀態(tài)，可以為組織的狀態(tài)，也可以為由單 一細胞的狀態(tài)調(diào)制得到的細胞集合體(細胞凝集體)。另外，所謂“實質(zhì)”，是指盡量不含有 作為對象的細胞以外的細胞。因此，由上皮系細胞構(gòu)成的細胞集合體可以為一部分組織或 單一細胞的集合體。另外，上皮系細胞及間充質(zhì)細胞可以為均由單一細胞構(gòu)成的細胞集合 體。第1細胞集合體與第2細胞集合體可以均為上皮系細胞及間充質(zhì)細胞，構(gòu)成該細 胞集合體的細胞的數(shù)量根據(jù)動物的種類、支持載體的種類、硬度及大小而不同，相對于1個 細胞集合體，通常為IO1 IO8個，可以優(yōu)選為IO3 IO8個。實質(zhì)上由間充質(zhì)細胞構(gòu)成的細胞集團只要含有牙形成用間充質(zhì)細胞即可，也可以 含有其他間充質(zhì)細胞。作為上述間充質(zhì)細胞以外的其他間充質(zhì)細胞，可以舉出來自于牙胚及牙胚以外的 間充質(zhì)細胞。作為來自于牙胚以外的間充質(zhì)細胞，是來自生物體內(nèi)的其他間充質(zhì)組織的細 胞，可以優(yōu)選舉出不含有血液細胞的骨髓細胞或間充質(zhì)干細胞，更優(yōu)選舉出來自于口腔內(nèi) 間充質(zhì)細胞或顎骨內(nèi)部的骨髓細胞、頭部神經(jīng)嵴細胞的間充質(zhì)細胞、能產(chǎn)生所述間充質(zhì)細胞的間充質(zhì)前體細胞或其干細胞等。為了重現(xiàn)在生物體內(nèi)的細胞配置、有效形成具有特有的結(jié)構(gòu)及方向性的牙，用于本制造方法的上皮系細胞優(yōu)選為來自牙胚，從細胞的分化階段的不成熟性和均質(zhì)性的觀點 考慮，優(yōu)選來自蕾狀期至帽狀期的細胞。另外，可以為來自牙胚以外的上皮系細胞，這可以舉出來自生物體內(nèi)的其他上皮 系組織的細胞?？梢詢?yōu)選舉出皮膚或口腔內(nèi)粘膜或牙肉的上皮系細胞，更優(yōu)選皮膚或粘膜 等分化的例如能生出角化或角化不全的上皮系細胞的不成熟的上皮系前體細胞、例如未角 化的上皮系細胞或其干細胞等。為了調(diào)制細胞集合體而從組織中分離各細胞時，牙胚及其他組織可以從下述各種 動物的顎骨等中采集哺乳動物的靈長類，例如人、猴等；有蹄類，例如豬、牛、馬等；小型哺 乳類的嚙齒類，例如小鼠、大鼠、兔等。牙胚及組織的采集通?？梢灾苯討猛ǔＳ糜诓杉?組織的條件，可以在無菌狀態(tài)下取出，保存在適當?shù)谋４嬉褐?。需要說明的是，作為人的牙 胚，除可以舉出第3白齒，即所謂的智齒的牙胚之外，還可以舉出胎兒牙胚，但從利用自身 組織的觀點來看，優(yōu)選使用智齒牙胚。由組織、例如牙胚調(diào)制上述細胞時，首先，將從周圍組織分離的牙胚根據(jù)形狀分為 牙胚間葉組織與牙胚上皮組織。此時，由于牙胚組織能在顯微鏡下從結(jié)構(gòu)上區(qū)分，所以可以 用解剖用剪刀或鑷子等切斷、或通過剝下等容易地分離。另外，從牙胚組織分離牙胚間葉組 織及牙胚上皮組織可以根據(jù)其形狀用注射針、鎢針、鑷子等切斷，或通過剝下容易地進行。為了從周圍組織容易地分離牙胚細胞及/或從牙胚組織分離上皮組織及間葉組 織，可以優(yōu)選使用酶。作為用于上述用途的酶，可以舉出分散酶、膠原酶、胰蛋白酶等。構(gòu)成細胞集合體的細胞可以由采集的組織中調(diào)制為單一細胞的狀態(tài)。調(diào)制工序 中，為了能容易地分離單一細胞，可以使用酶。作為上述酶，可以舉出分散酶、膠原酶、胰 蛋白酶等。此時，由上皮組織分離上皮系細胞時，優(yōu)選膠原酶處理后進行胰蛋白酶處理與 DNase處理。另一方面，由間葉組織分離間充質(zhì)細胞時，優(yōu)選同時用膠原酶與胰蛋白酶處理， 最終進行DNase處理。此時進行DNase處理的原因在于，防止因酶處理導致一部分細胞受 到破壞，因細胞膜溶解時釋放到溶液中的DNA而發(fā)生細胞凝集，從而細胞回收量降低。另外，為了分別得到充分的細胞數(shù)，構(gòu)成細胞集合體的細胞可以在配置工序前經(jīng) 過預培養(yǎng)。細胞的培養(yǎng)可以直接使用通常用于培養(yǎng)動物細胞的溫度等條件。作為用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用通常用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基、例如 Dulbcco' s Modifed Eagle Medium(DMEM)等，可以添加用于促進細胞增殖的血清，或者可 以添加例如FGF、EGF、PDGF等細胞增殖因子或轉(zhuǎn)鐵蛋白等已知血清成分來代替血清。另外， 添加血清時的濃度可以根據(jù)此時的培養(yǎng)狀態(tài)進行適當變更，但通?？梢詾?0容量％。細胞 的培養(yǎng)中應用通常的培養(yǎng)條件，例如在37°C的溫度下、在濃度為5%的CO2的恒溫箱內(nèi)的培 養(yǎng)。另外，可以適當添加鏈霉素等抗生素。將預培養(yǎng)應用于間充質(zhì)細胞中時，可以為兼具用于將上述牙形成用間充質(zhì)細胞增 殖的培養(yǎng)，也可以為篩選工序后進行的培養(yǎng)，或這兩種培養(yǎng)。另外，從不改變細胞性質(zhì)的觀點考慮，在間充質(zhì)細胞的預培養(yǎng)或用于上述牙形成 用間充質(zhì)細胞的簡單增殖的培養(yǎng)中，可以在不含有上述分化誘導劑的培養(yǎng)基中進行。配置工序中的細胞集合體的配置是將上述第1及第2細胞集合體配置在能保持細胞的接觸狀態(tài)的支持載體的內(nèi)部。此時，各細胞集合體不會彼此混合。由于如上所述不混 合各細胞集合體地進行配置，所以在細胞集合體間形成邊界線。在本說明書中，將該配置形 態(tài)適當表達為“間隔化”。作為此處所用的支持載體，只要是能在內(nèi)部培養(yǎng)細胞的支持載體即可，優(yōu)選為與 上述培養(yǎng)基的混合物。作為上述支持載體，可以舉出膠原、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明 膠、瓊脂、水凝膠、Cellmatrix (商品名)、乂匕’才一> 欠 > (商品名),Matrigel (商品名)、 彈力蛋白、纖維蛋白、層粘蛋白、細胞外基質(zhì)混合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/ 乙醇酸共聚物(PLGA)等。上述支持載體具有將細胞配置在內(nèi)部時能基本維持配置位置的 硬度即可，可以舉出凝膠狀、纖維狀、固體狀的支持載體。其中，從細胞外基質(zhì)混合物等凝膠 容易提供適當?shù)挠捕群捅３至Φ挠^點考慮，較優(yōu)選膠原、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明膠、 瓊脂、水凝膠、Cellmatrix、> 才一義7 >、Matrigel、細胞外基質(zhì)混合物、彈力蛋白、纖維 蛋白、層粘蛋白。此處，所謂能維持細胞位置的硬度，通常為用作三維培養(yǎng)的硬度、即在保持 細胞配置的同時不阻礙由增殖導致肥大化的硬度即可，可以容易地確定。需要說明的是，此處，支持載體具有第1及第2細胞集合體可以在載體內(nèi)部生長的 程度的厚度即可，可以根據(jù)目標組織的大小等適當設定。另外，支持載體具備使細胞不分散、能保持細胞的接觸狀態(tài)的保持力即可。此處所 說的“接觸狀態(tài)”，優(yōu)選在各細胞集合體中、或細胞集合體間，確實地使細胞相互作用的緊密 (高密度)的狀態(tài)，上述高密度的狀態(tài)是指在細胞凝集體的情況下，例如，可以用能維持比 簡單彼此接觸更強的密接狀態(tài)的保持力來培養(yǎng)細胞。例如，在膠原的情況下，提供最終濃度 為2 3mg/ml的濃度，即基于JIS-K6503-1996 的方法(作為用直徑為12. 7mm的沖頭擠壓 4mm所需的負荷進行測定)達到凝膠強度為120g 250g的濃度下適合使用的硬度。另外， 該凝膠強度沒有限定，對于其他種類的支持載體只要根據(jù)同樣的評價方法可測得同樣的強 度，就可以優(yōu)選用作本發(fā)明的支持載體。另外，通過混合1種或多種支持載體，可以得到相 當于目標凝膠強度的硬度的支持載體。所謂高密度的狀態(tài)，是指與構(gòu)成組織時的密度同等程度的狀態(tài)，例如，為細胞集合 體的情況下，在細胞配置時為5X IO7 1 X IO9個/ml，為了在無損細胞活性的情況下確實 地使細胞相互作用，優(yōu)選為1 X IO8 1 X IO9個/ml，最優(yōu)選為2 X IO8 8 X IO8個/ml的密 度。以上述細胞密度調(diào)制細胞集合體時，通過離心使細胞凝集并沉淀化，可以在無損細胞 存活的情況下簡便地高密度化，所以優(yōu)選。上述離心可以在無損細胞存活的相當于300 1200Xg、優(yōu)選為500 IOOOXg的離心力的旋轉(zhuǎn)數(shù)下進行3 10分鐘。在低于300X9進 行離心時，細胞沉淀不充分，有時細胞密度降低，另一方面，在高于1200Xg下離心時，有時 細胞受到損傷，所以均不優(yōu)選。通過離心分離來調(diào)制高密度的細胞時，通常在用于離心分離細胞的管等容器中調(diào) 制單一細胞的混懸液后進行離心分離，將沉淀物即細胞殘留，盡可能除去上清液即可。從完 全除去上清液的觀點來看，此時所用的管等容器優(yōu)選為進行過硅涂布的容器。使用離心分離得到沉淀物時，可以將沉淀物直接配置到支持載體的內(nèi)部。此時，優(yōu) 選目標細胞以外的成分(例如，培養(yǎng)液、緩沖液、支持載體等)的量在與細胞容量相等的量 以下，最優(yōu)選不含有目標細胞以外的成分。上述高密度的細胞集合體中，細胞緊密接觸，有 效地發(fā)揮細胞間相互作用。特別是將目標細胞以外的成分極少的細胞集合體配置在支持載體的內(nèi)部時，通過支持載體的固化等進一步凝集，成為更緊密的狀態(tài)。以組織的狀態(tài)使用時，優(yōu)選進行酶處理等以除去對象細胞以外的結(jié)合組織等。目 標細胞以外的成分較多時，例如，它們的量在與細胞容量相等的量以上時，不能充分發(fā)揮細 胞間相互作用，所以不優(yōu)選。另外，第1細胞集合體與第2細胞集合體的接觸優(yōu)選第1細胞集合體與第2細胞 集合體的接觸為 密接，特別優(yōu)選將第2細胞集合體擠壓于第1細胞集合體來進行配置。另 夕卜，用培養(yǎng)液、不阻礙氧透過的固態(tài)物包裹第1細胞集合體與第2細胞集合體的周圍對于使 細胞集合體之間的接觸密接是有效的。在粘度不同的溶液中加入高密度的細胞混懸液進行 配置，直接將溶液固化的方式也可達成容易地保持細胞的接觸，故而優(yōu)選。此時，以第1細 胞集合體為牙胚間充質(zhì)細胞的單一細胞集合物、以第2細胞集合體為牙胚上皮組織時，優(yōu) 選以牙胚上皮組織的釉質(zhì)結(jié)節(jié)與第1細胞集合體接觸的方式進行配置，但并不限定于此。支持載體為凝膠狀或溶液狀等時，可以在配置工序后設置固化支持載體的固化工 序。通過固化工序，配置在支持載體內(nèi)部的細胞被固定在支持載體內(nèi)部。支持載體的固化 中可以直接應用通常使用的支持載體的固化條件。例如，在支持載體中使用膠原等能固化 的化合物時，在通常使用的條件下，例如，在培養(yǎng)溫度下使其靜置數(shù)分鐘 數(shù)十分鐘，由此 可以固化。由此，可以使支持載體內(nèi)部的細胞間的結(jié)合固化，同時可以使該結(jié)合牢固。本發(fā)明的制造方法的培養(yǎng)工序中，在支持載體內(nèi)部培養(yǎng)第1細胞集合體及第2細 胞集合體。該培養(yǎng)工序中，通過彼此緊密接觸的第1細胞集合體及第2細胞集合體，可有效 地進行細胞間相互作用，從而可再構(gòu)成組織，即牙?？梢酝ㄟ^支持載體維持第1細胞集合體與第2細胞集合體的接觸狀態(tài)進行培養(yǎng)工 序，該培養(yǎng)工序可以是用具有第1及第2細胞集合體的支持載體單獨進行的培養(yǎng)，也可以是 在其他動物細胞的存在下的培養(yǎng)。作為培養(yǎng)期間，因配置在支持載體內(nèi)部的細胞數(shù)與細胞集合體的狀態(tài)、以及培養(yǎng) 工序的實施條件而不同，但通常為1 300天，為了形成外側(cè)具有牙釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì) 的牙，優(yōu)選為1 120天，從能迅速提供的觀點考慮，可以優(yōu)選為1 60天。進而為了制成 具備牙周組織的牙，通常為1 300天，可以優(yōu)選為1 60天。僅用支持載體進行培養(yǎng)時，可以采用在用于培養(yǎng)動物細胞的通常條件下的培養(yǎng)。 此處的培養(yǎng)通?？梢灾苯硬捎迷趧游锛毎碌呐囵B(yǎng)條件，也可以直接采用上述條件。另外， 培養(yǎng)中可以添加來自哺乳動物的血清，還可以添加對于上述細胞增殖或分化有效的已知的 各種細胞因子。作為上述細胞因子，可以舉出FGF、BMP等。另外，從組織或細胞集合體的換氣或供給營養(yǎng)的觀點考慮，優(yōu)選使用器官培養(yǎng)。器 官培養(yǎng)中，通常在適合動物細胞增殖的培養(yǎng)基上平鋪多孔性膜，在該膜上放置被支持載體 包埋的細胞集合體，由此進行培養(yǎng)。此處所用的多孔性膜中，優(yōu)選為具有大量0. 3 5μπι 左右的孔的膜，具體而言，可以舉出Cell Culture Insert (商品名)、r 4 / # 7 7〗義夕 一(商品名)。在其他動物細胞的存在下進行培養(yǎng)時，由于受到來自動物細胞的各種細胞因子等 的作用，可以盡快形成具有特定細胞配置的牙，所以優(yōu)選。上述其他動物細胞的存在下的培 養(yǎng)可以使用分離細胞或培養(yǎng)細胞而通過生物體外的培養(yǎng)來進行。另外，可以將具有第1與第2細胞集合體的支持載體移植到生物體中，在生物體內(nèi)進行培養(yǎng)。上述在生物體內(nèi)的培養(yǎng)由于可以盡快形成牙、以及牙周組織，所以特別優(yōu)選。此 時，將第1和第2細胞集合體與支持載體一起移植到生物體內(nèi)。能用于該用途的動物可以優(yōu)選舉出哺乳動物，例如人、豬、小鼠等，更優(yōu)選來自與 牙胚組織相同種類的動物。移植人牙胚組織時，優(yōu)選使用人、或變成免疫功能不全的人以外 的其他哺乳動物。為了盡可能地正常產(chǎn)生動物細胞的器官或組織，作為適合上述生物體內(nèi) 生長的生物體部位，優(yōu)選腎臟皮膜下、腸間膜、皮下移植、口腔內(nèi)等。作為移植的生長期間，根據(jù)移植時的大小與產(chǎn)生的牙的大小而不同，通?？梢詾?3 400天。例如，移植到腎臟皮膜下的移植期間也根據(jù)移植的培養(yǎng)物的大小與再生牙的大 小而不同，但從牙的再生與在移植部位產(chǎn)生的牙大小的觀點考慮，優(yōu)選為7 60天。向生物體內(nèi)移植前，可以在生物體外進行培養(yǎng)(前培養(yǎng))。通過該前培養(yǎng)，使細胞 間的結(jié)合和第1與第2細胞集合體之間的結(jié)合牢固，從而可以使細胞間相互作用更牢固，所 以優(yōu)選。結(jié)果可以縮短總體生長期。前培養(yǎng)的期間可以為短期，也可以為長期。在長期例如3天以上、優(yōu)選為7天以上 的情況下，可以由牙胚產(chǎn)生牙芽，所以可以縮短移植后形成牙的時間，所以優(yōu)選。作為前培 養(yǎng)期，例如，作為在腎臟皮膜下進行移植時的器官培養(yǎng)，由于1 7天能有效 再生牙，所以優(yōu) 選。由本發(fā)明的制造方法制造的牙具有內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、外側(cè)為牙釉質(zhì)的牙所特有的細 胞配置(結(jié)構(gòu))，并且優(yōu)選還具備牙的前端(牙冠)與牙根的方向性。通過至少除上述特有 的細胞配置、優(yōu)選細胞配置之外，還具有方向性，也可以發(fā)揮作為牙的機能。因此，能廣泛用 作牙的代替物。特別是，使用來自本身的牙胚的間充質(zhì)細胞與上皮系細胞時，可以在避免排 斥反應導致的問題的情況下進行使用。另外，使用來自通常適合移植抗原的他人的牙胚的 細胞時，也能避免因排斥反應導致的問題。另外，通過本發(fā)明的制造方法制造的牙可以為具有牙特有的細胞配置的牙的集合 體。由于上述牙的集合體由具有牙特有的細胞配置的多顆牙構(gòu)成，所以可以從聚合體 中分離各個牙，按照以下所述的方式用作一個牙的移植片。結(jié)果，可以有效制作作為移植片 的牙。為了得到由多顆牙構(gòu)成的牙的集合體，并為了容易再誘導用于產(chǎn)生多顆牙的牙 胚，優(yōu)選第1與第2細胞集合體均由單一細胞構(gòu)成。需要說明的是，與上述相同，培養(yǎng)工序可以為器官培養(yǎng)，也可以為在腎臟皮膜下的 培養(yǎng)，但將所得的牙用作移植片時，優(yōu)選為不與其他動物細胞接觸、并且全部過程在體外調(diào) 制的器官培養(yǎng)。進而，本發(fā)明的制造方法中，可以將培養(yǎng)期間繼續(xù)到形成牙周組織為止。由此，除 牙本身之外，將牙支持在顎骨上，也可以形成固定化的牙槽骨和牙根膜等牙周組織。結(jié)果可 提供一種移植后能實用的牙。需要說明的是，為了制造牙周組織，可以在上述培養(yǎng)工序后設置分離由上述培養(yǎng) 得到的牙周組織的工序，僅得到牙周組織。分離牙周組織只要可以分離在培養(yǎng)工序的過程 中所形成的牙周組織與牙即可，可以用任意的方法進行，可以舉出用鑷子等進行分離或用 酶進行部分消化等。
根據(jù)本發(fā)明得到的牙與牙周組織除可以用作移植片之外，還可以優(yōu)選用于研究闡 明牙的發(fā)生過程，也可以用作今后的對于產(chǎn)生與牙相關(guān)的組織有效的研究工具。需要說明的是，將所得的牙或牙周組織用作移植片時，優(yōu)選制造方法的培養(yǎng)工序 為不與其他動物細胞接觸并且全部過程可以在體外調(diào)制的器官培養(yǎng)。另外，本發(fā)明包括牙的移植方法。該移植方法中，包括得到上述牙的集合體的工 序；由牙的復合體分離各個牙的工序；調(diào)整分離的牙進行移植，使其具有與在移植部位的 其他牙相同的方向性。由此，可以同時得到具備特有的細胞配置與方向性的多顆牙，有效實施牙的移植。本發(fā)明的牙可以適用于治療或處置伴有牙欠缺與損傷的各種癥狀、例如齲齒、邊 緣性牙周炎(牙槽膿腫)、牙周病導致的牙欠缺、事故等導致的折損或脫落等。即，本發(fā)明的治療方法包括將由本發(fā)明的制造方法得到的牙及/或牙周組織移植 到欠缺及/或損傷部位的步驟。由此，可以治療及/或緩和欠缺及/或損傷部位的上述癥 狀。本發(fā)明的其他治療方法包括在欠缺及/或損傷部位僅實施本發(fā)明的培養(yǎng)工序或 配置工序與培養(yǎng)工序。此時，作為支持載體，除上述載體之外，還可以將欠缺及/或損傷部 位的周圍組織本身作為支持載體。由此，利用來自生物體內(nèi)的周邊組織的細胞因子等，可以 更迅速地治療欠缺及/或損傷部位等。實施例以下，說明本發(fā)明的實施例，但并不限定于此。另外，只要沒有特別說明，實施例中 的％均為重量(質(zhì)量)基準。[實施例1]1. EC細胞的培養(yǎng)方法EC細胞使用AT805細胞(作為129系EC細胞的0TT6050的派生克隆，由理化學 研究所生物資源中心細胞材料開發(fā)室得到)。AT805細胞的培養(yǎng)使用添加了 10容量％牛 胎血清(FCS =JRH或JBS、Hyclone公司制)以及55 μ M 2-巰基乙醇(GIBC0公司制)的 Dulbcco's Modifed EagleMedium(DMEM :SIGMA 公司或 Kohjin-Bio 公司制)來進行。通常 以每IOOmm皿為5 8 X IO5個濃度來接種EC細胞，隔一天交換全部量的培養(yǎng)基進行反復 繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)中，將細胞用HCMF緩沖液(pH7. 4、IOmMH印es、136. 9mM NaCl,0. 34mM Na2HPO3^ 13. 9mM葡萄糖、5. 37mM 23KC1)洗滌1次后，添加5ml最終濃度為0. 025%的溶解 有胰蛋白酶-EDTA · 2Na(GIBC0公司制)的酶溶液，在37°C下進行1分鐘酶處理。然后，力口 入等量的添加有10% FCS的DMEM，使細胞分散后，通過離心分離，回收沉淀，將沉淀回收得 到的細胞再次混懸，接種在新的培養(yǎng)皿中，進行繼代培養(yǎng)。2. EC細胞的分化誘導與細胞的回收將用胰蛋白酶處理回收后的EC細胞用最終濃度為0. 5 5容量％的添加有二甲 基亞砜(DMSO :SIGMA公司制)的添加10容量％ FCS的DMEM混懸，以1. O X IO6個/IOOmm皿 的濃度進行接種。在CO2濃度為5%的條件下，于37°C下培養(yǎng)，14小時后，用HCMF緩沖液將 細胞洗滌1次，將培養(yǎng)液換成添加有10容量％ FCS的DMEM。對于用DMSO處理后的EC細胞，每3天將培養(yǎng)液的一半量換成添加10容量％ FCS 的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)6天(僅5容量％ DMS0,為19天)，進行適當觀察。在含有未分化細胞的細胞集團增殖的時刻，用HCMF緩沖液洗滌1次后，添加3mM EDTA以及含有0. 5% BSA且 不含Ca2+、Mg2+的PBS (-) (EDTA/BSA-PBS)，將細胞分散，通過離心操作以沉淀的形式回收細 胞。將細胞再次混懸在EDTA/BSA-PBS中，通過FITC標記的抗CD44抗體(CD44-FITC =BD Pharmingen公司制)與PE標記的抗CD29抗體(CD29-PE =BD Pharmingen公司制)進行雙 重染色，使用細胞分選儀、EpicsALTRA (Beckman Coulter公司制)分離獲得CD44陽性且 CD29陽性的細胞成分，由此得到除去了未分化EC細胞的用DMSO處理進行了分化誘導的EC 細胞成分(參見圖2)。將該細胞命名為DMSO-EC細胞。另外，關(guān)于以各DMSO濃度處理時的DMSO-EC細胞的比例，示于表1。如表1所示， 明確了⑶44陽性 且⑶29陽性的細胞依賴于DMSO處理濃度而增加。需要說明的是，用5容 量％ DMSO處理得到的EC細胞由于大部分細胞在剛處理后就死亡，所以處理后的培養(yǎng)天數(shù) 必須比其他處理濃度長，另一方面，培養(yǎng)后所得的⑶44陽性且⑶29陽性的細胞比例較高。在以下的實驗中，使用由使用5容量％ WDMSO而得到的細胞。[表1] DMSO-EC細胞的克隆化DMSO-EC細胞的克隆化通過利用克隆環(huán)的菌落的分離、或者極限稀釋法來進行。利用克隆環(huán)獲得細胞時，以低濃度(約100個)在培養(yǎng)皿中接種DMSO-EC細胞并 通過增殖而能夠得到的菌落的細胞數(shù)為10個以上，此時將滅菌后的硅脂涂布在克隆環(huán)的 一端，以包圍細胞的菌落的方式粘附在除去培養(yǎng)基的皿底面。然后，在克隆環(huán)內(nèi)進行胰蛋白 酶處理，回收細胞，由增殖的細胞依次進行放大培養(yǎng)，獲得克隆。用極限稀釋法得到克隆如下進行將通過上述方法得到的DMSO-EC細胞用HCMF緩 沖液洗滌1次后，通過胰蛋白酶處理回收細胞。計測回收得到的細胞數(shù)，接種在96孔培養(yǎng) 板中，使其達到1細胞/200 μ 1/孔(說明)。3 5天后確認單一菌落。然后，每5天，邊 交換一半量的培養(yǎng)基邊繼續(xù)培養(yǎng)，從增殖的細胞依次進行放大培養(yǎng)，獲得克隆。由此，得到來自DMSO-EC細胞的克隆1 (DMS0-EC克隆1 :Clone#l)與克隆 2 (DMS0-EC 克隆 2 :Clone#2)。[實施例2]DMSO-EC細胞的性狀
(1)相位差顯微鏡像用相位差顯微鏡分別觀察上述得到的克隆1與2的形態(tài)與EC細胞、DMSO-EC細胞、 以及作為來自EC細胞的軟骨系前體細胞的ATDC5細胞(從理化學研究所生物資源中心細 胞材料開發(fā)室得到)的形態(tài)。結(jié)果，觀察到EC細胞中，菌落內(nèi)的細胞小，以高密度增殖，此外，菌落周邊突起，是 典型的全能性干細胞樣的形態(tài)。與此相對，DMSO-EC或DMSO-EC克隆1與2、ATDC5細胞中， 構(gòu)成菌落的每個細胞面積較大，形成作為粘附性細胞的特征即單一層，顯示與特征EC細胞 的形態(tài)明顯不同的形態(tài)。相較于EC細胞，上述粘附性的細胞形態(tài)類似于間充質(zhì)細胞。(2)各種基因表達通過實時(Realtime) PCR (RT-PCR)解析 EC 細胞、DMSO-EC、DMSO-EC 克隆 1 與 2、 ATDC5細胞中的各種基因表達，研究各種標識基因的表達。使用TRIzol Reagent (Invitrogen 公司制)從 EC 細胞以及 DMSO-EC、DMSO-E C 克 隆1與2、ATDC5細胞中提取全RNA。除去解析的細胞培養(yǎng)液，在IOOmm培養(yǎng)皿中直接滴入 2ml TRIzol Reagent，用Cell Scraper (Falcon公司制)充分混合后，回收到離心管中，用 Polytron Homogenizer (Polytron公司制)進行勻漿。然后至提取RNA為止的操作根據(jù)后 附的使用說明書來進行。將從細胞 組織中提取的全RNA溶解于DEPC處理水中，用分光光 度計進行濃度計算后，保存在-30°C。為了進行實時PCR(RT-PCR)解析，以從細胞提取的全RNA為模板，合成形成模板的 cDNA。cDNA合成使用ReverTra Ace (TOYOBO)來進行，根據(jù)后附的使用說明書進行操作。PCR與解析使用ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems公司制)來進行。聚合酶 使用SYBR Premix Ex Taq(TAKARA公司制)，內(nèi)部對照使用β -肌動蛋白。在RT-PCR專用 96孔板中以每個試樣分別添加13 μ 1 SYBR Premix ExTaq (TAKARA公司制)、2 μ 1稀釋20倍 得到的cDNA反應溶液、5 μ 1濃度為1 μ M的引物，添加5 μ 1滅菌水，調(diào)制最終容量為25 μ 1 的反應體系，根據(jù)常規(guī)方法進行PCR反應。另外，對各個基因進行對照反應，制作標準曲線， 分別進行定量化。將用于解析的引物序列示于表2與表3?；虮磉_通過各個細胞中的β-肌動蛋白的表達量進行標準化，與β-肌動蛋白 表達量為一定時的相對表達量進行比較。結(jié)果示于表4。[表 2] 如表4所示，僅在EC細胞中檢測出作為未分化干細胞標識基因的0ct3/4與Nanog 的表達，在用DMSO處理而得到的EC細胞或其克隆細胞、ATDC5細胞中未確認到。在EC細 胞中未確認作為神經(jīng)嵴細胞標識基因的Slug、Pax3、Wntl的表達，而在EC細胞以外的所有 細胞組中確認到Slug，雖然有表達量的差異，但在EC細胞與ATDC5細胞以外的DMSO-EC細 胞組中確認到Pax3與Wntl。由此提示了 DMSO-EC細胞與其克隆化細胞是因為添加了 DMSO而由未分化干細胞 分化誘導為神經(jīng)嵴細胞的細胞，由基因表達的特性可知，是0ct3/4陰性、Nanog陰性、Slug 陽性、Pax3陽性、Wntl陽性的細胞。另一方面，在牙間葉細胞的標識組中，除在EC細胞中表達Msxl與BMP-7之外， 其他任意基因均未表達，而在DMSO-EC細胞、以及其克隆化細胞中，特異性地高度表達了 Msxl、Pax9、Wnt5a、Lhx8。雖然表達量有少許差異，但在DMSO-EC細胞以及其克隆化細胞和 ATDC5細胞中確認到BMP4、Runx2、Dlxl的表達。另外，判斷如下作為軟骨細胞的特異性標識基因即SOX9、SOX5的表達僅在ATDC5 細胞中高度表達，DMSO-EC細胞和其克隆化細胞為不分化為軟骨系的細胞。因此，明確了通過DMSO，EC細胞向神經(jīng)嵴細胞樣或間充質(zhì)細胞樣的細胞分化誘導。[實施例3]評價由EC細胞分化誘導的細胞的牙形成性能然后，按照以下所述的方式，確認由本發(fā)明得到的DMSO-EC細胞、其克隆化細胞具 有向牙本質(zhì)細胞分化的性能、以及牙的象牙質(zhì)形成性能。(1)牙胚上皮組織的調(diào)制在顯微鏡下通過常規(guī)方法從C57BL/6小鼠(由SLC購得)的胎齡14. 5天的胚仔 中摘出下顎切牙牙胚組織。用PBS (-)洗滌摘出的下顎切牙牙胚組織，在室溫下用在PBS (-)中添加最終濃度為1. 2U/ml的分散酶II (Roche，Mannheim, Germany)而得到的酶液，處理 12.5 分鐘后，用添加有 10% FCS(JRH Biosciences,Lenexa,KS)的 DMEM(Sigma, St. Louis, MO)洗滌3次。進而，添加DNaseI溶液(Takara，Siga, Japan)使其達到最終濃度為70U/ ml，使牙胚組織分散，使用25G注射針(Terumo，Tokyo, Japan)，外科上分離牙胚上皮組織。(2)再構(gòu)成牙胚的制作再構(gòu)成牙胚的制作中使用上述調(diào)制得到的牙胚上皮組織，以及作為間充質(zhì)細胞的 EC細胞、DMSO-EC細胞、DMSO-EC克隆1和2中的任一個評價對象細胞。分別通過胰蛋白酶處理從皿中回收用于牙胚再構(gòu)筑的評價對象細胞組。在涂布 有硅脂的 1. 5ml 微管(Eppendorf，Hamburg, Germany)中加入用添加有 10% FcS(JRH)的 DMEM(Sigma)混懸而得到的評價對象細胞，利用離心分離(580Xg)將細胞以沉淀的形式回 收。盡可能除去離心后的培養(yǎng)液的上清液，再次進行離心操作，邊用實體顯微鏡觀察邊使用 GELoaderTipO. 5-20 μ L(Eppendorf公司制)完全除去殘留在細胞沉淀周圍的培養(yǎng)液，準備 用于制作再構(gòu)成牙胚的各個評價對象細胞。在涂布有硅脂的皮氏培養(yǎng)皿中滴入30 μ 1 2. 4mg/ml的Cellmatrix typel-A(新 田明膠公司制)，制作膠原凝膠微滴。使用0. 1-10 μ 1的吸頭(Eppendorf公司制)，向該溶 液中供給0. 2μ 1 10. 3μ 1上述評價對象細胞，制成細胞凝集體作為高密度的細胞集合體 (細胞密度2Χ108個/ml)。然后，使用10μ 1吸頭，將牙胚上皮組織或牙胚間葉組織供給 到相同的凝膠液滴內(nèi)，使用鎢針，使來自分離到的牙胚的上皮組織原本與間葉組織接觸的 面密接于評價對象細胞的細胞凝集體。然后，通過使凝膠液滴固化，使牙胚組織與評價對象 細胞間的結(jié)合更牢固，從而制作高密度的再構(gòu)成牙胚。參見圖3說明這點。利用吸頭16預先配置于凝膠液滴10 (參見圖3Α)內(nèi)的細胞凝集體12在凝膠液滴 10內(nèi)構(gòu)成球體(參見圖3Β)。然后通過擠入另一種細胞凝集體14，從而球體的細胞凝集體 12被破壞，包裹另一種細胞凝集體14的情況較多(參見圖3C)。然后，將凝膠液滴10固化， 由此細胞間的結(jié)合變牢固(參見圖3D)。(3)再構(gòu)成的牙胚的器官培養(yǎng)將在凝膠中制作的高密度再構(gòu)成牙胚在CO2培養(yǎng)箱中靜置10分鐘，將Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)固化。準備培養(yǎng)容器，使 Cell CultureInsert (孔徑尺寸為 0. 4 微米的PET膜；BD公司制)接觸添加有10容量％ FCS (JRH公司制)、0. lmg/ml的L-抗壞血 酸(Sigma公司制)、2mM的L-谷氨酰胺(GIBC0公司制)的DMEM(Sigma公司制)。將再構(gòu) 成牙胚與作為支持載體的周圍凝膠一起轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器的Cell Culture Insert的膜上， 進行器官培養(yǎng)。對利用器官培養(yǎng)而產(chǎn)生牙的現(xiàn)象進行解析時，通常進行14天間的培養(yǎng)。器官培養(yǎng) 時，在移植后第10 30天摘出再構(gòu)成牙胚，用4%仲甲醛-磷酸緩沖液固定6小時后，使用 4. 5% EDTA溶液(pH7. 4)進行24小時的中性脫灰。然后，通過常規(guī)方法進行石蠟包埋，制 作10 μ m的切片。為了進行組織學解析，根據(jù)常規(guī)方法進行蘇木素_伊紅染色染色(HE染 色)。用器官培養(yǎng)進行評價在14. 5日齡、下顎切牙牙胚上皮組織與EC細胞的高密度再構(gòu)成牙胚中，因EC細胞的異常增殖而再構(gòu)成牙胚肥大化，在HE染色中也未觀察到來自牙間葉細胞的牙本質(zhì)細 胞和象牙質(zhì)。與此相對，在DMSO-EC細胞、DMS0-EC克隆1與2中，與上皮組織的相互作用被誘 導，并且在相位差顯微鏡像中也觀察到與牙胚的器官培養(yǎng)同樣地組織誘導。進而，DMSO-EC 細胞、DMSO-EC克隆1與2均可以由HE染色像確認可以形成外側(cè)具有牙釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)具有象牙質(zhì)的再構(gòu)成牙胚的HE染色像，能形成牙特有的組織結(jié)構(gòu)。由上述內(nèi)容可知，DMSO-EC細胞、DMSO-EC克隆1與2通過與牙胚上皮細胞的相互 作用，分化為作為牙的間葉組織的牙本質(zhì)細胞，可以產(chǎn)生牙特有的象牙質(zhì)。另外，通過高密 度再構(gòu)成牙胚法，在器官培養(yǎng)中，也可以形成外側(cè)為牙釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、內(nèi)部為牙髓細 胞、具有牙前端與牙根的牙所特有的組織結(jié)構(gòu)的牙。[實施例4]腎皮膜下移植方法下面，由DMSO-EC細胞、DMS0-EC克隆1和2的細胞與14. 5日齡胎兒下顎切牙牙 胚上皮細胞制作高密度再構(gòu)成牙胚，將所得的再構(gòu)成牙胚移植到C57BL6小鼠(從日本Clea 公司購得)腎皮膜下，評價牙形成性能。將與實施例3相同地制作的再構(gòu)成牙胚進行器官培養(yǎng)48小時至96小時后，將周 圍的每份凝膠移植到8周齡NOD-SCID小鼠(從Charles River公司購得)的腎皮膜下，使 其進行不同場所的牙的產(chǎn)生，并進行解析。移植到腎皮膜下時，在移植后第10 30天，對于周圍的每個腎組織，摘出再構(gòu) 成牙胚。將摘出組織在4%仲甲醛-磷酸緩沖液中固定6小時后，使用4. 5 % EDTA溶液 (PH7. 4)，進行24小時的中性脫灰。然后，根據(jù)常規(guī)方法進行石蠟包埋，制作IOym的切片。 為了進行組織學解析，根據(jù)常規(guī)方法進行HE染色。(1)用腎皮膜下移植的評價在腎皮膜下移植中，移植14. 5日齡胎兒切牙牙胚時，在16天的期間內(nèi)因腎皮膜下 移植而產(chǎn)生具有內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)與外側(cè)和牙釉質(zhì)的特征結(jié)構(gòu)的牙(參見圖4)。用來自14.5 日齡胎兒切牙牙胚的牙胚上皮組織和牙胚間葉細胞(參見圖4Α)、牙胚上皮組織和DMSO-EC 細胞(參見圖4Β)、牙胚上皮組織和DMSO-EC克隆(克隆#1、參見圖4C)的再構(gòu)成牙胚中， 通過腎皮膜下移植進行移植后第14天，與直接將正常牙胚移植到腎皮膜的情況相同，容易 確認外側(cè)為釉質(zhì)芽細胞、牙釉質(zhì)，其內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、牙本質(zhì)細胞。所形成的牙具有前端與牙 根，具有與正常產(chǎn)生的牙相同的結(jié)構(gòu)。關(guān)于形成牙的頻率，在EC細胞與ATDC細胞中為0%，而在DMSO-EC細胞中為 51. 3士8. 8%，在 DMSO-EC 克隆 1 中為 23. 3% 士 16. 7%，在克隆 2 中為 33. 3% 士47. 1%。由上述內(nèi)容可知，DMSO-EC細胞、DMSO-EC克隆1與2中，能分化為作為來自牙間葉 的組織的牙本質(zhì)細胞，并能產(chǎn)生作為牙的硬組織的象牙質(zhì)。進而可知，通過高密度再構(gòu)成牙 胚法，即使在腎皮膜下移植中，也可以通過DMSO-EC細胞、DMSO-EC克隆1與2形成具有特 有的組織結(jié)構(gòu)的牙。(2)原位雜交將來自14.5日齡胎兒切牙牙胚的牙胚上皮組織與DMSO-EC細胞移植到皮膜下，對14天后摘出的組織，通過原位雜交解析作為牙釉質(zhì)的構(gòu)成分子的牙釉質(zhì)蛋白、作為象牙質(zhì)的構(gòu)成要素的牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)的mRNA表達、以及作為牙根膜特異性基因的 Periostin mRNA 表達。摘出腎皮膜下移植后第14天的再構(gòu)成牙胚，用4%仲甲醛-磷酸緩沖液固定6小 時后，使用4. 5% EDTA溶液(pH7. 4)，進行24小時的中性脫灰。然后，依次浸漬12. 5%蔗糖 溶液、25%蔗糖溶液后，包埋在OCT compound(SAKURA Finetechnica公司制)中。包埋后 在低溫恒溫器(Leica公司制)中制作10 μ m的切片。 將上述切片用含有最終濃度為2 μ g/ml的蛋白酶!((Nacalaitesque，kyoto, Japan)的PBS(-)處理10分鐘，用含有最終濃度為4 %的仲甲醛(Nacalai tesque)的 PBS(-)固定10分鐘。分別用含有最終濃度為1.325%三乙醇胺、0.0175N的HCl (Wako)、 0. 25%乙酸酐的丙酸二乙酯處理(DEPC)水處理10分鐘后，用PBS (-)在5分鐘內(nèi)洗滌3次。 用含有 1. 5% (ν/ν)三乙醇胺(Nacalai tesque) ,0. 33N 的 HCl (Wako)、0. 25% (ν/ν)的乙酸 酐(Nacalai tesque)的DEPC水溶液處理10分鐘后，用2 X SSC在10分鐘內(nèi)洗滌2次。作 為牙根膜特異性基因的Periostin(Genbank accession no. ΝΜ_015784)探針，將使用正義 弓丨物("7 ；ggctgaagatggttcctctc 序歹丨J號 35)與反義弓丨物(573 ；gtacattgaaggaataacca 序列號36)并通過PCR而獲得的cDNA片段作為DIG標識。根據(jù)常規(guī)方法進行原位雜交，用抗DIG-堿性磷酸酯酶(AP)Fab片段(Roche) 和 NBT/BCIPStock Solution (Roche)使其顯色，用 Axio ImagerA. I(Zeiss)與 AxioCam MRc5 (Zeiss)進行解析。由該結(jié)果可知，在HE染色像的釉質(zhì)芽細胞中，確認到牙釉質(zhì)蛋白mRNA的表達，在 牙本質(zhì)細胞中確認到DSPPmRNA的表達。另外，確認到Periostin mRNA的表達。由此可知， 與形成硬組織相關(guān)的分子的mRNA分別適當?shù)卦谄洚a(chǎn)生細胞中明顯表達。另外，由于檢測到 在牙根膜中表達的Periostin，提示形成有牙周組織。[實施例5]用視黃酸進行誘導(1)用于獲得⑶44陽性且⑶29陽性細胞的EC細胞分化誘導方法與實施例1相同地操作，以1. OX IO6個/IOOmm皿的濃度接種用胰蛋白酶處理回收 得到的AT805細胞，第二天，置換成添加有終濃度為O 10. O μ M的視黃酸(RA) (SIGMA公 司制)的10容量％ FCS DMEM，施加刺激。培養(yǎng)72小時后，用HCMF緩沖液洗滌2次，用全部 量的10容量％ FCS DMEM進行培養(yǎng)基交換。(2)獲得RA處理后的⑶44陽性且⑶29陽性細胞每3天使用10容量％ FCSD MEM進行一半量的培養(yǎng)基交換，同時繼續(xù)培養(yǎng)7天， 進行適當觀察。將RA處理后增殖的含有未分化細胞的細胞集團用HCMF洗滌1次后，添 加3mM的EDTA-0. 5 % BSA-PBS(-)，在37°C下進行培育，回收?；厥蘸蟮募毎ㄟ^CD44 FITC (BD Pharmingen)與 CD29 (BDPharmingen) PE進行雙重染色，使用 Epics ALTRA (Beckman Coulter)分離獲得CD44陽性且CD29陽性的細胞，由此僅得到除去了未分化細胞的細胞集 團。將該細胞命名為RA-EC細胞。結(jié)果示于圖5。另外，用各RA濃度處理時的RA-EC細胞的比例示于表5。由表5明確，⑶44陽性 且⑶29陽性細胞依賴于RA濃度而發(fā)生變化。另外，對于RA處理后的⑶44陽性且⑶29陽性細胞，與實施例2 (2)相同地確認基因表達時，判定與DMSO-EC細胞相同，為0ct3/4陰性、Nanog陰性、Slug陽性、Pax3陽性、 Wntl陽性的細胞。[表 5] (3) RA處理后的⑶44陽性且⑶29陽性細胞的牙形成性能評價使用如上所述得到的⑶44陽性且⑶29陽性細胞(RA濃度2 μ Μ)，與實施例3相同 地操作，進行牙胚再構(gòu)筑及器官培養(yǎng)，并進行評價。在器官培養(yǎng)14天后，通過與牙胚上皮細 胞的相互作用，分化為作為牙間葉組織的牙本質(zhì)細胞。另外，通過高密度再構(gòu)成牙胚法，形 成具有外側(cè)為牙釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、內(nèi)部為牙髓細胞的牙所特有的組織結(jié)構(gòu)的牙(參見 圖6)。并且對RA處理后的⑶44陽性且⑶29陽性細胞，與實施例4 (2)相同地操作，確認 牙釉質(zhì)蛋白與DSPP、Periostin表達時，確認與DMSO-EC相同地表達各mRNA。這提示了形 成含有硬組織、牙根膜的牙周組織。[實施例6](1)用于獲得⑶44陽性且⑶106陽性細胞的EC細胞分化誘導方法與實施例1相同地操作，以1. OX IO6個/IOOmm皿的濃度接種通過胰蛋白酶處理回 收得到的AT805細胞，第二天置換成終濃度為2 μ M的RA (SIGMA公司制)的10容量％ FCS DMEM，施加刺激。培養(yǎng)72小時后，用HCMF緩沖液洗滌2次，用全部量的10容量％ FCS DMEM 進行培養(yǎng)基交換。第二天，用HCMF緩沖液洗滌2次，除去死細胞后，進而用10容量％ FCS DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。以后每隔1天進行培養(yǎng)基交換，培養(yǎng)7天。(2)獲得⑶44陽性且⑶106陽性的細胞用HCMF將含有通過上述處理獲得的未分化細胞的細胞集團洗滌1次后，添加 3mM EDTA-0. 5%85々^^5(-)，在371培育，回收。將回收后的細胞通過CD44 FITC(BD Pharmingen)與抗 CD106 抗體(CD106 (BDPharmingen) PE)進行雙重染色，使用 Epics ALTRA(Beckman Coulter)分離獲得⑶44陽性且⑶106陽性成分，由此僅得到除去了未分化 細胞的細胞集團。結(jié)果示于圖7。(3) RA處理后的⑶44陽性且⑶106陽性細胞的牙形成性能評價
使用如上所述得到的⑶44陽性且⑶106陽性細胞，與實施例3相同地操作，進行 牙胚再構(gòu)筑與器官培養(yǎng)，并進行評價。器官培養(yǎng)14天后，通過與牙胚上皮細胞的相互作用， 分化為作為牙的間葉組織的牙本質(zhì)細胞。另外，通過高密度再構(gòu)成牙胚法，形成具有外側(cè)為 牙釉質(zhì)、內(nèi)側(cè)為象牙質(zhì)、內(nèi)部為牙髓細胞的牙特有的組織結(jié)構(gòu)的牙。另外，對于上述⑶44陽性且⑶106陽性的DMSO-EC細胞，與實施例2⑵相同地確 認基因表達。結(jié)果，顯示與⑶44陽性且⑶29陽性DMSO-EC細胞相同，為0ct3/4陰性、Nanog 陰性、Slug陽性、Pax3陽性、Wntl陽性的細胞。 進而，與實施例4(2)相同地操作，確認牙釉質(zhì)蛋白與DSPP、Periostin表達時，確 認與DMSO-EC相同地表達各mRNA。這提示了形成含有硬組織、牙根膜的牙周組織。[實施例7]與實施例6(2)和(3)相同地操作，使用CD44 FITC與CD106 PE對DMSO-EC細胞進 行雙重染色，顯示存在⑶44陽性且⑶106陽性細胞。對于上述⑶44陽性且⑶106陽性的 DMSO-EC細胞，與實施例2相同地確認基因表達時，判定與⑶44陽性且⑶29陽性DMSO-EC 細胞相同，為0ct3/4陰性、Nanog陰性、Slug陽性、Pax3陽性、Wntl陽性的細胞。使用此處所得的⑶44陽性且⑶106陽性細胞的細胞集團，與實施例3和實施例 4(2)相同地進行牙胚再構(gòu)筑、器官培養(yǎng)與mRNA表達，并進行評價。結(jié)果通過與牙胚上皮細 胞的相互作用形成具有特有的組織結(jié)構(gòu)的牙。另外，與實施例4(2)相同地操作，確認牙釉 質(zhì)蛋白與DSPP、Periostin表達。這提示了能形成含有硬組織、牙根膜的牙周組織。如上所述，可以由全能性干細胞分化誘導⑶44陽性且⑶29陽性細胞或⑶44陽性 且⑶106陽性細胞，通過將上述細胞與上皮系細胞一起間隔化進行培養(yǎng)，由此再構(gòu)成牙胚， 從而可以提供具有牙釉質(zhì)與象牙質(zhì)的特有結(jié)構(gòu)的牙。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以由全能性干細胞得到牙形成用間充質(zhì)細胞，并可以有效大 量地制作牙。通過參考將日本專利申請第2007-011805號的公開內(nèi)容全部引用到本說明書中。通過參考將記載于本說明書中的所有文獻、專利申請以及技術(shù)規(guī)格引用到本說明 書中，引用程度與具體且分別記載通過參考引用各個文獻、專利申請和技術(shù)規(guī)格的情況相 同。
權(quán)利要求
一種制造用于形成牙的間充質(zhì)細胞的方法，包括下述步驟在分化誘導劑的存在下培養(yǎng)全能性干細胞，生成含有CD44陽性且CD29陽性細胞、或CD44陽性且CD106陽性細胞的分化誘導處理后的細胞集團；從所述分化誘導處理后的細胞集團篩選CD44陽性且CD29陽性細胞、或CD44陽性且CD106陽性細胞作為牙形成用間充質(zhì)細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述牙形成用間充質(zhì)細胞進一步表達選自由Slug基因、Pax3基因、Msxl基因與Pax9 基因構(gòu)成的組中的至少一種。
3.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述牙形成用間充質(zhì)細胞還同時表達Slug基因與Pax3基因。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的制造方法，其中，所述全能性干細胞選自由胚性干細胞、胚性癌細胞、胚性生殖干細胞構(gòu)成的組中的至 少一種。
5.如權(quán)利要求4所述的制造方法，其中， 所述全能性干細胞是胚性癌細胞。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項所述的制造方法，其中， 所述分化誘導劑選自二甲基亞砜與視黃酸中的至少一種。
7.—種制造牙的方法，其包括下述步驟使實質(zhì)上僅由間充質(zhì)細胞與上皮系細胞中的任一種構(gòu)成的第1細胞集合體、和實質(zhì)上 僅由任意其它一種細胞構(gòu)成的第2細胞集合體在不混合的情況下密接地配置在支持載體 的內(nèi)部；在所述支持載體的內(nèi)部培養(yǎng)所述第1和第2細胞集合體，其中所述間充質(zhì)細胞含有權(quán)利要求1 6中任一項所述的上述牙形成用間充質(zhì)細胞。
8.如權(quán)利要求7所述的牙制造方法，其中， 繼續(xù)所述培養(yǎng)直至形成牙周組織。
9.如權(quán)利要求7或8所述的牙制造方法，其中， 所述上皮系細胞來自牙胚。
10.一種⑶44陽性且⑶29陽性或⑶44陽性且⑶106陽性的牙形成用間充質(zhì)細胞， 其是由全能性干細胞誘導的。
11.如權(quán)利要求10所述的牙形成用間充質(zhì)細胞，其中，所述牙形成用間充質(zhì)細胞還表達選自由Slug基因、Pax3基因、Msxl基因和Pax9基因 構(gòu)成的組中的至少一種。
12.如權(quán)利要求10所述的牙形成用間充質(zhì)細胞，其中，所述牙形成用間充質(zhì)細胞還同時表達Slug基因與Pax3基因。
13.如權(quán)利要求10 12中任一項所述的牙形成用間充質(zhì)細胞，其中，所述全能性干細胞是選自由胚性干細胞、胚性癌細胞、胚性生殖干細胞構(gòu)成的組中的 至少一種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種間充質(zhì)細胞的制造方法，是制造用于形成牙的間充質(zhì)細胞的間充質(zhì)細胞的制造方法，其包括下述步驟在分化誘導劑的存在下培養(yǎng)全能性干細胞，生成含有CD44陽性且CD29陽性細胞、或CD44陽性且CD106陽性細胞的分化誘導處理后的細胞集團；從所述分化誘導處理后的細胞集團中篩選CD44陽性且CD29陽性細胞、或CD44陽性且CD106陽性細胞作為牙形成用間充質(zhì)細胞。另外，提供一種牙的制造方法，其包括下述步驟使實質(zhì)上僅由間充質(zhì)細胞與上皮系細胞中的任一種細胞構(gòu)成的第1細胞集合體、與實質(zhì)上僅由任意另一種細胞構(gòu)成的第2細胞集合體在不混合的情況下密接地配置在能保持細胞的接觸狀態(tài)的支持載體的內(nèi)部，并且上述間充質(zhì)細胞含有上述牙形成用間充質(zhì)細胞。
文檔編號A61P1/02GK101842477SQ200880002860
公開日2010年9月22日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者森田梨津子, 辻孝 申請人:株式會社器官再生工學