專利名稱：：乳頭瘤病毒疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及預(yù)防人乳頭瘤病毒(HPV)感染。更具體地說，本發(fā)明涉及藥物組合物和制劑，其包含HPV的病毒樣顆粒(VLPs),所述VLPs吸附到鋁佐劑上，和第二個佐劑，第二個佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂。本發(fā)明還涉及包含HPVVLPs和抗菌防腐劑的藥物組合物和制劑。進一步提供了使用本公開的藥物組合物和制劑的方法。
背景技術(shù)：
：有80個以上類型的人乳頭瘤病毒(HPV),它們中的許多與病變相關(guān)，這種病變范圍從宮頸的良性增生疣至惡性癌瘤(綜述參見McMurray等人，/"f.丄￡平尸a組82(1):15-33(2001》。HPV類型6和11稱為"低危險，，的，并且是通常與生殖器或呼吸粘膜的良性疣、非惡性的尖銳濕疣和/或輕度發(fā)育異常最相關(guān)的HPV類型。大約90%的生殖器疣由這兩種HPV類型引起。相反，HPV16和HPV18稱為"高危險"的HPV類型，因為它們常常與宮頸、陰道、外陰和膽管的原位和浸潤癌最相關(guān)。70%以上的宮頸癌由HPV16和HPV18的感染所引起。與較不普通的致癌類型HPV31、-33、-45、-52和-58—起，這些類型占子宮頸癌的90%以上(Schiffman等人，丄Ato/.Ca"ce〃"W.85(12):958-64(1993))。在在世界范圍內(nèi)的女性中，子宮頸癌是癌死亡的第二個最普遍的原因。乳頭瘤病毒是小的(50-60nm)、未包膜的、二十面體的DNA病毒，其編碼高達八個早期(E1-E7)和兩個晚期(L1-L2)基因。Ll蛋白是主要衣殼蛋白，并且具有55-60kDa的分子量。Ll蛋白或Ll和L2蛋白組合在酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或細菌中的表達可以導(dǎo)致病毒樣顆粒(VLPs)的自組裝(綜述參見Schiller和Roden,尸fl^〃omflwn^Wewews:CurrentResearchonPapillomaviruses;Lacey,ed.Leeds,UK:LeedsMedicalInformation,pp101-12(1996))。VLPs形式上與真實的病毒體相似，并且一旦給予動物或人類，能夠引起中和抗體的高滴度。因為VLPs不包含潛在致癌的病毒基因組，因此它們在HPV疫苗研制中可以給使用活病毒提供安全的替代品(綜述參見Schiller和Hidesheim,JC/m.Wra/.19:67-74(2000))。為此，已經(jīng)將LI和L2基因確定為HPV感染和疾病的預(yù)防性和治療性疫苗的免疫靶向。已經(jīng)證明，基于VLP的疫苗在接種二價HPV16和18(Harper等人丄a"c"364(9447):1757隱65(2004))和四價HPV6、11、16和18基于VLP的疫苗(Villa等人F"ccz脫24:5571-5583(2006))的人患者中引起免疫應(yīng)答方面是有效的。然而，疫苗開發(fā)的普通目標是增加對目標抗原的免疫應(yīng)答，以引起長效的保護性免疫。與可針對使人感興趣的抗原增加免疫應(yīng)答的化合物(稱為佐劑)一起共同給予疫苗已經(jīng)得到了廣泛的研究。除了可針對使人感興趣的抗原J的^;、的量,、或降低臨床方案(所需要的注射數(shù)目，以^起持久的2疫應(yīng)答，提供免于疾病的保護。在60年前，確定基于鋁的化合物具有佐劑活性(綜述參見Lmdblad，E.B./附mw朋/,Ce〃82:497-505(2004);Baylor等人Kac""e20:S18-S23(2002))。當(dāng)以合適的劑量4吏用時，通常i人為鋁佐劑是安全的。在世界范圍內(nèi)，管理機構(gòu)已經(jīng)批準了許多用于給予人類的鋁佐劑。盡管沒有完全理解鋁佐劑的作用機理，但通常認為，在疫苗制劑中，為了最佳免疫促進效果，靶向抗原應(yīng)該吸附在鋁上(參見Lmdblad,上文)。當(dāng)用這樣的方式配制時，鋁佐劑能夠引起針對許多抗原的有效抗體(TH2)應(yīng)答；但很少促進細胞(THl)免疫應(yīng)答。對于HPV，已經(jīng)表明，與相應(yīng)的無鋁LlVLP疫苗所引起的響應(yīng)相比，基于HPV6、11、16和18LlVLP的疫苗(其中VLPs吸附到鋁佐劑上)在恒河猴中可以產(chǎn)生顯著增強的免疫應(yīng)答(Ruiz等人JcwW(3/q/7wmz/"e5a化(i77^ra/^a"JFaccz."e53(1):2(2005))。重要的是，應(yīng)該指出，盡管鋁佐劑疫苗引起顯著增高的抗體滴度(相對于單獨的VLPs),但由于佐劑和非佐劑疫苗產(chǎn)生類似的同型特性，免疫應(yīng)答沒有本質(zhì)上的不同。為了形成具有長期效果的預(yù)防性的HPV疫苗，有利的是，獲得包括強烈的體液以及細胞免疫應(yīng)答的更高幅度的免疫應(yīng)答。還有利的是，形成可針對HPVL1產(chǎn)生充分增強的免疫應(yīng)答的基于VLP的疫苗，以降低疫苗注射數(shù)量(相對于現(xiàn)行的預(yù)防性臨床計劃)。本發(fā)明概述本發(fā)明提供了藥物組合物和制劑，其可以在患者中引起對HPV的免疫應(yīng)答，并且可以防止患者的HPV感染，其是消除與HPV有關(guān)的發(fā)病率和致死率的最有效的方法。本發(fā)明還提供了本文所提供的組合物和制劑的使用方法。在一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含HPV的至少一種類型的VLPs、鋁佐劑、ISCOM型佐劑和設(shè)計成可便于以目標數(shù)量給予患者組合物的可藥用載體，例如賦形劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、緩沖液或替代性物質(zhì)；其中所述VLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1十L2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于所述鋁佐劑上。本文提供的組合物還可以包含其它生理學(xué)可接受的組分，例如緩沖液、生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水、蔗糖、其它鹽和/或聚山梨酸酯。本發(fā)明進一步提供了HPV疫苗制劑，其包含(a)大約10Mg至大約100jug至少一種HPV類型的HPVVLPs,其中HPV類型選自HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV31，HPV33,HPV35,HPV39，HPV45，HPV51,HPV52，HPV53，HPV55,HPV56,HPV58,HPV59，HPV66，HPV68,HPV73和HPV82;所述HPVVLPs包括HPV的重組體L1或重組體L1十L2蛋白；(b)大約150ng至大約600ng的鋁佐劑；和(c)大約10jug至大約200jug的ISCOM型佐劑，所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂；其中所述HPVVLPs吸附到所述鋁佐劑上。在本發(fā)明該方面的具體實施方案中，HPV疫苗制劑包含(a)大約20jug至大約60jug至少一種HPV類型的VLPs;(b)大約200jug至大約300jug的鋁佐劑；和(c)大約15jug至大約120jug的ISCOM型佐劑。在另外其它具體實施方案中，本發(fā)明提供了HPV疫苗制劑，其包含(a)大約20jug至大約60jugHPV類型6、11、16、18、31、45、52和58中每一種的VLPs,所述HPVVLPs由HPV的重組體Ll或重組體Ll+L2蛋白組成；(b)大約200jug至大約300jug的鋁佐劑；和(c)大約30jag至大約120iag的ISCOM型佐劑，所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和石舞脂；其中所述HPVVLPs吸附在所述鋁佐劑上。在本發(fā)明的進一步方面，提供了藥物組合物，其包含HPVVLPs,選自間甲酚、苯酚和苯曱醇的抗菌防腐劑，和可藥用載體。包含抗菌防腐劑的HPV疫苗組合物可以任選包含上文所描述的鋁佐劑和ISCOM型佐劑；然而，還要包括的是沒有佐劑的包含抗菌防腐劑的HPVVLP組合物。本發(fā)明還提供了在人類患者中引起對于HPV的免疫應(yīng)答的方法，其包括給予患者藥物組合物，所述藥物組合物包含HPVVLPs、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂；其中所述HPVVLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+1>2蛋白組成，其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上。本發(fā)明進一步涉及預(yù)防人類患者被HPV感染的方法，其包括給予患者藥物組合物，所述藥物組合物包含重組體HPVVLPs、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，其中所述ISCOM型佐劑，其中HPVVLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+1>2蛋白組成，其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上。說明書和附加權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"這個，，包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外清楚地規(guī)定。說明書和附加權(quán)利要求中所使用的下列定義和縮寫適用于術(shù)語"HPV"和"PV"分別指的是人乳頭瘤病毒和乳頭瘤病毒。術(shù)語"有效量，，是指將足夠的VLP疫苗組合物引入到患者中，產(chǎn)生預(yù)期效果，例如，針對患者中的HPV引起免疫應(yīng)答或預(yù)防HPV感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認識到，這種水平可以變化。術(shù)語"患者"是指接受本文所描述的HPV疫苗或藥物組合物的任何人。本文定義的"患者"包括已經(jīng)感染上HPV的那些患者，以及需要預(yù)防HPV感染的那些患者。"病癥"是受益于本發(fā)明組合物治療的任何癥狀。術(shù)語"病癥"包括與HPV感染有關(guān)的任何病癥或病變。本發(fā)明的組合物意欲用作治療或預(yù)防以HPV感染為特征的病癥或癥狀，包括但不限于生殖器或呼吸粘膜的良性疣、非惡性的尖銳濕疣和/或輕度的發(fā)育異常，和宮頸、陰道、外陰和肛管的原位和浸潤癌。"制劑"是指單一劑量的疫苗，其可以包含在任何適合于注射的體積中，在具體實施方案中，將制劑制備為0.5mL總體積。除非另有說明，術(shù)語"制劑，，的使用可以適用于單一劑量的疫苗，可以將其給予需要其的單個患者。術(shù)語"多劑量，，是指包含一個劑量以上疫苗的HPV制劑，可以將其給予一個以上患者。"VLP"或"VLPs"是指病毒樣顆?；蚨喾N病毒樣顆粒。"MAA"是指Merck鋁佐劑。MAA是非晶形的鋁的羥基磷酸鹽硫酸鹽佐劑。本文中，術(shù)語"MAA"可與術(shù)語"AAHS"互換使用。"cLIA"是指竟爭性的Luminex(LuminexCorp.,AustinTX)免疫測定技術(shù)，其例子描述在美國專利US7,067,258和Opalka等人C7z力D&g"/wwwwo/.10(1):108-15(2003)中。"GMT"是指幾何平均滴度。"ISCOM型佐劑"是包含免疫促進復(fù)合物(ISCOM)的佐劑，其由皂草苷、膽固醇和磷脂組成，它們一起形成有特色的籠狀顆粒，具有有助于其功能的獨特的球形、籠狀結(jié)構(gòu)(綜述參見BarrandMitchell,ImmunologyandCellBiology74:8-25(1996))。該術(shù)語包括兩種ISCOM佐劑，它們是用抗原制備的，其包含在ISCOM顆粒中的抗原和ISCOM基質(zhì)佐劑，它們是不用抗原制備的空心ISCOM型佐劑。在本文提供的組合物和方法的優(yōu)選實施方案中，ISCOM型佐劑是ISCOM基質(zhì)顆粒佐劑，例如ISCOMATRIX,其不用抗原就可以制備(ISCOM和ISCOMATRIX⑧是CSLLimited,Parkville,Australia的注冊商標)。附圖的簡要說明圖1顯示了在用實驗性八價HPVVLP疫苗免疫的恒河猴之中接種組抗HPV16幾何平均滴度(GMT)隨時間的變化。按照注明的免疫接種程序表，疫苗用MAA或MAA+IMX進行佐劑化，如實施例1中描述的內(nèi)容。圖2顯示了在用實驗性的八價HPVVLP疫苗免疫的恒河猴之中接種組的抗HPV31幾何平均滴度(GMT)隨時間的變化。按照注明的免疫接種程序表，疫苗用MAA或MAA+IMX進行佐劑化，如實施例1中描述的內(nèi)容。圖3顯示了在人患者(在第l天，其對于有關(guān)的HPV類型是血清陰性的)之中接種組的抗HPV6、11、16或18cUA幾何平均滴度(GMT)的概述(階段A結(jié)果)。臨床方案的簡要說明列在實施例3中。圖4顯示了在人患者(在第1天，其對于有關(guān)的HPV類型是血清陰性的)之中接種組的抗HPV6、11、16或18cLIA幾何平均滴度(GMT)的概述(階段B結(jié)果)。臨床方案的簡要說明列在實施例3中。圖5顯示了在37。C存儲的八價HPVVLP疫苗樣品的完整單體隨著時間推移的百分數(shù)。顯示的是八價疫苗制劑土ISCOMATRIX和土MAA佐劑的SDS-PAGE分析結(jié)果(參見實施例4和5)。數(shù)據(jù)是在時間=0(有點的條)、l個月(斑紋條)、3個月(實心條)和6個月(帶有口形的條)時提供的圖6顯示了IVRP分析測定的八價HPV溶液和MAA樣品(有和沒有IMX)的體外抗原性(單位/mL)(參見實施例4和6)。圖7顯示了在沒有IMX的情況下防腐劑對八價HPV疫苗制劑的穩(wěn)定性的影響(參見實施例12)。圖8顯示了在IMX存在下防腐劑對八價HPV疫苗制劑的穩(wěn)定性的影響(參見實施例12)。圖9(區(qū)域A)顯示了在沒有IMX的情況下HPV疫苗制劑中的防腐劑穩(wěn)定性。區(qū)域B顯示包含IMX的HPV疫苗制劑中的防腐劑穩(wěn)定性(參見實施例l3)。本發(fā)明的i羊細i兌明按照本發(fā)明，已經(jīng)表明，在動物模型和人患者中，與包含單獨的鋁佐劑的VLP疫苗相比，包含至少一種HPV類型的HPVVLPs、ISCOM型佐劑和鋁佐劑的HPV疫苗制劑能夠?qū)Π邢虻腍PV類型引起更高的Ab滴度。為此，本文提供了HPVVLP疫苗制劑和藥物組合物，其包含HPVVLPs,HPVVLPs吸附在鋁佐劑(與ISCOM型佐劑組合)上，如下面所詳述o按照本文描述的本發(fā)明的另一個方面，已經(jīng)表明，在2-8°C,向包含HPVVLPs的藥物組合物和制劑中加入選自下列的抗菌防腐劑可有效降低或消除微生物，并且不會消極影響VLPs的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性間甲酚、苯酚和苯曱醇。由此，本發(fā)明還涉及包含HPVVLPs和抗菌防腐劑的HPV疫苗制劑和藥物組合物，抗菌防腐劑選自間曱酚、苯酚和苯甲醇。按照本發(fā)明該方面的疫苗組合物還可以包括如上所述的ISCOM型佐劑和鋁佐劑。已經(jīng)證明，基于病毒樣顆粒的疫苗在人患者中針對許多類型的HPV可引起有效的免疫應(yīng)答。當(dāng)L1(人和動物乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白)在酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或細菌中表達時，VLPs可以自我纟且裝(纟宗述參見Schiller禾口Roden,尸"http://〃cwzav/n^^evz'eviAs1:CurrentResearchonPapillomaviruses;Lacey,ed.Leeds,UK:LeedsMedicalInformation,pp101-12(1996))。形式不確定的HPVVLPs還可以通過表達LI和L2衣殼蛋白的組合來產(chǎn)生。在T=7的二十面體結(jié)構(gòu)中，VLPs由LI的72個五聚體組成(Baker等人，說o;/z".丄60(6):1445-56(1991))。VLPs形式上與真實的病毒體相似，并且一旦給予動物，能夠引起中和抗體的高滴度。用VLPs給兔子(Breitburd等人，JK,>o/.69(6):3959-63(1995))和狗(Suzich等人，尸roc.Ato/.爿c^/.USA92(25):11553-57(1995))免疫，顯示二者可誘導(dǎo)中和抗體并防止實-瞼性的乳頭瘤病毒感染。另外，用HPV16VLPs給成年女性免疫，顯示可防止HPV16感染和HPV16宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(Koutsky等人，五"g/.J.Met/.347:1645-51(2002))。因為VLPs不包含潛在致癌的病毒基因組，并且當(dāng)用單個基因表達時，可以自我組裝，因此它們在HPV疫苗研制中可以給使用活病毒提供安全的替代品(綜述參見Schiller和Hidesheim,</Kzra/.19:67-74(2000))。如上所述，已經(jīng)證明，基于VLP的疫苗在許多動物模型和人患者中可有效引起免疫應(yīng)答。然而，疫苗開發(fā)的目標常常是引起更高的抗體滴度，以引起長效的保護性免疫。為此，已經(jīng)開發(fā)了包含至少一種HPV類型的HPVVLPs、ISCOM型佐劑和鋁佐劑的藥物組合物和疫苗，如本文所公開。與包含單獨鋁佐劑的VLP疫苗相比較，所述藥物組合物和疫苗能夠?qū)τ诎邢虻腍PV類型引起更高的IgGAb滴度。該組合物可以導(dǎo)致針對HPV感染誘導(dǎo)持久有效的免疫預(yù)防、降低抗原劑量和包括隨著時間推移而降低注射數(shù)量的免疫程序。由此，本發(fā)明涉及藥物組合物和制劑，其包含HPV病毒樣顆粒、鋁佐劑、ISCOM型佐劑和可藥用載體，其中所述VLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1十L2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于所述鋁佐劑上。任何基于HPVVLP的疫苗適合于在本發(fā)明的藥物組合物和方法中使用?？梢詫⒁阎腍PVVLP疫苗進行修飾，以包含鋁佐劑和ISCOM型佐劑。另外，新疫苗可以按照本發(fā)明所描述的進行開發(fā)，使其包含HPVVLP形式的至少一種HPV類型，HPVVLP吸附于與ISCOM型佐劑組合的鋁佐劑上。示范性的HPVVLP疫苗是四價人乳頭瘤病毒(類型6、11、16、18)重組體疫苗，本文通過它的專用商標名GARDASIL⑧來引用(參見Bryan,J.T.Facc&e25(16):3001-6(2007》Shi等人C"m'ca/尸/z"，aco/ogyT7^ra/e她^81(2):259-64(2007))。GARDASIL⑧是非感染性的重組體四價疫苗，用HPV類型6、11、16和18的主要衣殼(L1)蛋白的高度純化的VLPs制備。L1蛋白是通過在重組體釀酒酵母中進行獨立發(fā)酵產(chǎn)生的，并且自我組裝到VLPs中。除了VLPs之夕卜，每個GARDASIL⑧疫苗劑量還包含鋁佐劑(例如非晶形的羥基磷酸鋁硫酸鹽)、氯化鈉、L-組氨酸、聚山梨酸酯80、硼酸鈉和水。因此，本發(fā)明包括GARDASIL⑧與ISCOM型佐劑例如ISCOMATRIX⑧(CSLLtd.,Parkville,Australia)的組合。在本發(fā)明的替代性實施方案中，藥物組合物和制劑包含基于HPVVLP的疫苗，該疫苗是單價、二價或三價體。例如，包含HPV16和/或HPV18的VLPs的藥物組合物(不包含其它HPVVLP類型)包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。包含與GARDASIL⑧所包含HPV類型不同的HPVVLPs的四價疫苗也包括在本文中。例如，包含HPV類型31、45、52和58的VLPs的藥物組合物在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在其它實施方案中，藥物組合物包含基于VLP的疫苗，該疫苗具有四個以上不同類型的VLPs。在一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含八個不同的HPVVLP類型。特別優(yōu)選的八價疫苗描述在實施例1和2中，并且包含HPV類型6、11、16、18、31、45、52和58。本發(fā)明的替代品/V^介組合物包含HPV類型6、11、16、18、31、35、45和58。其它八價HPVVLP疫苗也包括在本文中；例如HPV33可以代替HPV31。其它HPVVLPs也可以加入到本文描述的疫苗制劑中，產(chǎn)生9價、IO價等等的HPV疫苗。如上所述，本發(fā)明的藥物組合物和制劑包含至少一種HPVVLP類型，例如HPV16或18。在本文公開組合物的優(yōu)選實施方案中，疫苗進一步包含至少一種其它HPV類型的VLPs。在特別優(yōu)選實施方案中，至少一種其它的HPV類型選自HPV6,HPV11,HPV16,HPV18，HPV26,HPV31,HPV33,HPV35,HPV39,HPV45,HPV51，HPV52,HPV53,HPV55，HPV56,HPV58,HPV59，HPV66,HPV68，HPV73和HPV82。本發(fā)明的藥物組合物包含由HPV的重組體L1或重組體L1+L2蛋白組成的HPVVLPs。HPVL1或L1+L2蛋白可以通過如下方式進4亍重組表達Ll或Ll+L2DNA分子克隆到包括合適啟動子及其它合適轉(zhuǎn)錄調(diào)控要素的表達載體中，并轉(zhuǎn)移到原核生物或真核宿主細胞中，產(chǎn)生重組蛋白。這種操作技術(shù)由Sambrook等人進行了充分描述(MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,(1989)),將其結(jié)合到本文中作為參考。當(dāng)Ll蛋白在宿主細胞中重組表達時，VLPs可以自我組裝。本發(fā)明的重組體HPVLl蛋白可以是任何全長Ll蛋白序列，該序列可以在能夠自我組裝到VLPs中的自然或任何突變或截斷的Ll蛋白中找到。通過從一或多種包含所選擇HPV類型的臨床樣品中分離DNA、測序列中，可以測定用于本發(fā)明的Ll蛋白序列。適合用于本發(fā)明中的許多示范性的Ll序列可以在文獻中找到。參見，例如，美國專利Nos.5,820,870;7,250,170;7,276,243;和5,437,951;Kirii等人(W油gy185(1):424-427(1991))。用于本發(fā)明組合物和制劑中的其它Ll蛋白包括HPVLl序列的生物學(xué)活性片段和/或突變抹，包括但不一定局限于氨基酸取代、消除、加入、氨基末端缺失和羧基端部缺失，以使這些突變提供能夠形成VLP的Ll蛋白或蛋白片段。參見例如，國際公開WO2006/114312和美國專利No.6,599,508。表達重組體HPVLl或重組體Ll+L2并且隨后自組裝VLPs的合適的宿主細胞包括但不局限于酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或細菌。在本發(fā)明的示范性實施方案中，VLPs是在酵母細胞中產(chǎn)生的，例如選自下列的酵母釀酒酵母，漢遜酵母，巴斯德畢赤氏酵母，脆壁克魯維酵母，乳酸克魯維酵母和粟酒裂殖酵母。HPVVLPs在酵母細胞中的表達提供了下列優(yōu)點有成本效益，在發(fā)酵罐中容易大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明還包括包含HPVVLPs的突變抹形式的藥物組合物，例如由HPVLl或L2蛋白的生物學(xué)活性片段和/或突變抹組成的HPVVLPs,包括但不一定局限于氨基酸取代、消除、加入、氨基末端缺失和羧基端部缺失，以使這些突變提供能夠治療或預(yù)防性使用的Ll蛋白或蛋白片段，并且可用于HPVVLP疫苗開發(fā)。HPVL1蛋白的任何這種突變林形式應(yīng)該能夠形成VLPs,而且當(dāng)給予人時能夠針對目標HPV類型引起免疫應(yīng)答。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認識到，用于自我組裝VLPs(用于包含在本文公開的組合物中)的Ll或LI+L2蛋白可以通過全長野生型HPVLl或L2多核苷酸進行編碼，或可以通過已知的野生型序列的片賴二或突變4朱進4亍編碼。編碼可表達HPVLl或L2蛋白的mRNA的野生型多核苦酸序列在本領(lǐng)域是可獲得的。任何突變抹多核苷酸可以編碼蛋白或蛋白片段(其至少基本上模擬HPVLl或L2蛋白的藥理學(xué)特性，包括當(dāng)給予人時能夠形成有能力針對使人感興趣的HPV類型引起免疫應(yīng)答的VLPs)。任何這種多核苦酸包括但不一定局限于核普酸取代、消除、加入、氨基端部缺失和羧基端部纟夾失。包含在本發(fā)明制劑和組合物中的每個HPV類型的病毒樣顆粒的量取決于所表達基因產(chǎn)物的免疫原性。通常，免疫或預(yù)防有效劑量包括大約10jug至大約lOOjug的VLPs,優(yōu)選大約20jug至80|ug。鋁已經(jīng)長久顯示其可促進針對共同給予的抗原的免疫應(yīng)答，主要通過促進Tu2響應(yīng)。除了HPVVLPs和ISCOM型佐劑之外，本發(fā)明該方面的制劑還吸附于鋁佐劑上。優(yōu)選，本文所提供組合物的鋁佐劑不是鋁沉淀形式。鋁沉淀的疫苗可以提高對靶向抗原的免疫應(yīng)答，但顯示了高度非均質(zhì)制劑，并且具有不一致的結(jié)果(參見LmdbladE.B./mmw"o/ogy朋JCe〃Pzo/ogy82:497-505(2004))。相反，鋁吸附的疫苗可以用標準化方式預(yù)先形成，這是給予人的疫苗制劑的基本特征。此外，人們認為，通過從注射部位較慢地清除，或使抗原通過抗原遞呈細胞得到更有效的吸收，目標抗原物理吸附在鋁佐劑上在佐劑功能方面(或許部分地)具有重要的作用。本發(fā)明的鋁佐劑可以是下列形式氫氧化鋁(Al(OH)3),磷酸鋁(A1P04),羥基磷酸鋁，非晶形的羥基磷酸鋁硫酸鹽(AAHS)或所謂的"明礬，，(KA1(S04)-12H20)(參見Klein等人，Analysisofaluminumhydroxyphosphatevaccineadjuvantsby(27)AlMASNMR.,/尸/z"削.5""..89(3):311-21(2000))。在本文提供的本發(fā)明的示范性實施方案中，鋁佐劑是羥基磷酸鋁或AAHS。在鋁佐劑中，磷酸^f艮與鋁的比例可以在0至1.3的范圍。在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，磷酸根與鋁的比例在實施方案中，磷酸根與鋁的比例在0.2至0.50范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的一些實施方案中，鋁佐劑是AAHS形式(本文可與Merck鋁佐劑(MAA)互換地引用)。在中性pH值下，MAA帶有零電荷，而在中性pH值下，A10H帶有凈正電荷，而A1P04典型地帶有凈負電荷。與A10H相比較，MAA具有結(jié)合HPVVLPs的更高容量。另夕卜，在小鼠中，與吸附于A10H上的VLPs相比較，吸附于MAA上的VLPs可以引起更大的體液免疫應(yīng)答。Caulfield等人，//ww,Kac"."^3:139-146(2007)。盡管不希望被理論束縛，鋁佐劑的凈電荷有可能影響其結(jié)合VLP抗原的能力，具有強帶電的佐劑不能與中性帶電佐劑那樣強地結(jié)合抗原。為此，優(yōu)選，本發(fā)明藥物組合物的鋁佐劑在中性pH值下具有零點表面電荷。本領(lǐng)域技術(shù)人員能改變緩沖液、游離磷酸鹽的鹽濃度和/或百分數(shù)，以便在中性pH值下具有零點表面電荷。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定在提高對粑向HPV類型的免疫應(yīng)答方面既安全又有效的鋁佐劑的最佳劑量。對于鋁的安全特性以及包含在FDA特許疫苗中的鋁數(shù)量的討論，參見Baylor等人，&ccwe20:S18-S23(2002)。通常，鋁佐劑的有效和安全劑量在150至600jug/劑量(300至1200jug/mL濃度)之間。在本發(fā)明制劑和組合物的具體實施方案中，每劑量疫苗的鋁佐劑在200和300|ug之間。在本發(fā)明制劑和組合物的替代性實施方案中，每劑量疫苗的鋁佐劑在300和500jug之間。如上所述，本發(fā)明的一個方面才是供了疫苗和制劑，其包含HPVVLPs與鋁佐劑和ISCOM型佐劑的組合。在本文提供的制劑和方法中，ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂，并且形成促進免疫的復(fù)合物或ISCOM。在80多年前，首先證明了皂草苷(其典型地從皂樹的莖皮中分離)的有歲支的佐劑活性(綜述參見Barr和Mitchell,/www"o/ogya"<iCe〃Ao/ogy74:8-25(1996);以及Skene和Sutton,M"/w^40:53-59(2006))。與鋁佐劑相比，ISCOM型佐劑或ISCOMs能夠?qū)餐o予的抗原引起廣泛的免疫應(yīng)答，包括T細胞和抗體應(yīng)答二者。然而，在那時，發(fā)現(xiàn)了毒性和溶血活性的可能性，限制了皂草苷用于人或動物的希望。從那以后，人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與膽固醇和磷脂組合時，皂草苷可以形成有特色的顆粒，其具有由二十或更多亞單位組成的籠狀結(jié)構(gòu)。該獨特結(jié)苷與膽固醇和磷脂一起引入到ISCOMs中，可以消除皂草苷的溶血活性。還顯示，與游離皂草苷相比，當(dāng)ISCOMs用作佐劑時，需要較少的佐劑就可以引起免疫應(yīng)答(參見Skene和Sutton,上文)。為此，已經(jīng)將ISCOMs作為有潛力的疫苗佐劑進行了積極的研究。按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在基于VLP的疫苗中，與用單獨鋁佐劑配制的相同疫苗相比較，鋁佐劑和ISCOM型佐劑的組合可以引起更強的抗體滴度。另夕卜，人們發(fā)現(xiàn)，在存在或不存在ISCOMATRIX⑧的條件下，與不用鋁佐劑配制的VLP疫苗相比較，包含鋁和IMX兩者的HPVVLP疫苗制劑更穩(wěn)定。為此，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含至少一種類型HPV的VLPs、鋁佐劑、ISCOM型佐劑和可藥用載體，所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂，其中所述VLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+L2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于所述鋁佐劑上。在本發(fā)明該方面的具體實施方案中，至少一種類型HPV的VLPs包括選自下列的HPV類型HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV31,HPV33,HPV35,HPV39,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV55,HPV56,HPV58,HPV59,HPV66,HPV68,HPV73和HPV82。然而，與病理癥狀或病癥有關(guān)的任何HPV類型都適合于包含在本文提供的藥物組合物中。在本發(fā)明的一些實施方案中，藥物組合物包含HPV類型6、11、16和18的VLPs。在替代性實施方案中，組合物包含HPV類型6、11、16、18、31、45、52和58的VLPs。在其它實施方案中，組合物包含HPV類型6、11、16、18、31、35、45和58的VLPs。在更進一步實施方案中，本發(fā)明的組合物，包括上文描述的四價和八價組合物，進一步包含至少一個其它HPV類型的VLPs,其中至少一個其它HPV類型選自HPV26,HPV33,HPV35,HPV39,HPV51,HPV53,HPV55,HPV56,HPV59,HPV66,HPV68,HPV73和HPV82。本發(fā)明該方面的藥物組合物包含鋁佐劑，當(dāng)VLPs吸附于鋁佐劑上并給予患者時，其可有效地增強對使人感興趣的HPV類型的體液免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的具體實施方案中，鋁佐劑是羥基磷酸鋁(AH)或非晶形的羥基磷酸鋁硫酸鹽(AAHS)。優(yōu)選，在這些具體實施方案中，鋁佐劑包括磷酸根和鋁，以大約0.1至大約1.1的磷酸根(P04)與鋁(A1)的摩爾比存在。更優(yōu)選，鋁佐劑包括磷酸根和鋁，以大約0.2至大約0.5的PCVA1的摩爾比存在。在本文該方面的替代性實施方案中，鋁佐劑是氫氧化鋁。本文所4是供組合物的ISCOM型佐劑可以利用本領(lǐng)域已知的任意一種制備ISCOMs的一些已知方法來制備(綜述參見Barr和Mitchell,/mww"o/ogyCe〃說o/ogy74:8-25(1996))。眾所周知的制備方法包招「離心方法和滲析方法，如上文Barr所述。ISCOM佐劑還可以從商業(yè)渠道獲得。ISCOM型疫苗與皂草普、膽固醇和磷脂(例如卵磷脂)一起配制，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，幾乎任何磷脂可有效用于ISCOM顆粒的形成(參見上文的Barr和Mitchell)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，ISCOM型佐劑是所謂的ISCOM基質(zhì)佐劑，例如ISCOMATRIX(CSLLtd.,Parkville，Australia),其包括ISCOPREP⑧皂草芬(CSLLtd.,Parkville,Australia)膽固醇和二棕櫚酰磷酯酰膽堿。本發(fā)明的組合物最好每0.5mL劑量的VLP疫苗包含10和200jug之間的ISCOM基質(zhì)佐劑(20-400pg/mL)。在本發(fā)明該方面的示范性實施方案中，ISCOM型佐劑是ISCOMATRIX⑧。本發(fā)明還涉及HPV疫苗制劑，其包括人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗制劑，其包含(a)至少一種HPV類型的HPV病毒樣顆粒(VLPs),其中HPV類型選自HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26，HPV31,HPV33,HPV35，HPV39,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53，HPV55,HPV56，HPV58,HPV59,HPV66，HPV68,HPV73和HPV82;所述HPVVUPs由HPV的重組體L1或重組體L1十L2蛋白組成；其中任何一種HPV類型的VLPs以大約10jLig至大約100jug的濃度存在，且其中總VLP濃度在lOiug和600iug之間；(b)大約150jug至大約600jug的鋁佐劑；和(c)大約lOjug至大約200iug的ISCOM型佐劑；其中所述HPVVLPs吸附在所述鋁佐劑上。在本發(fā)明該方面的具體實施方案中，HPV疫苗制劑包含(a)大約20jug至大約80jug的至少一種HPV類型的VLPs;(b)大約200jug至大約300jug的鋁佐劑；和(c)大約15Mg至大約120jug的ISCOM型佐劑。在其它實施方案中，制劑進一步包含大約20jug至大約60jug的至少一種其它HPV類型的VLPs。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含HPV類型6、11、16和18的VLPs的HPV疫苗制劑。本發(fā)明還提供了HPV疫苗制劑，其進一步包含HPV類型31、45、52和58的VLPs。本發(fā)明進一步提供了HPV疫苗制劑，如上所述，其進一步包含HPV類型31、35、45和58。在本文提供的本發(fā)明的某些方面，提供了包含ISCOM型佐劑的HPV疫苗制劑，其中ISCOM型佐劑是ISCOMATRIX⑧。本文還提供了HPV疫苗制劑，其包含(a)大約20pg至大約40jugHPV類型6、11、16、18、31、45、52和58中每一種的VLPs,所述HPVVLPs由HPV的重組體Ll或重組體L1+L2蛋白組成；(b)大約200jug至大約300jig的鋁佐劑；和(c)大約30jug至大約120jug的ISCOM型佐劑，所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂；其中所述HPVVLPs吸附在所述鋁佐劑上。用于上面疫苗制劑中的HPV類型可以用其它HPV類型或其組合代替，例如包含HPV類型6、11、16、18、31、35、45和58的八價疫苗制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可以在患者中用來引起對HPV的持久和有效的免疫應(yīng)答，和預(yù)防HPV感染。為此，本發(fā)明提供了在人類患者中引起對于HPV的免疫應(yīng)答的方法，其包括給予患者藥物組合物，所述藥物組合物包含HPVVLPs、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂；其中所述HPVVLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+1^2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上。本發(fā)明還提供了預(yù)防人類患者被HPV感染的方法，其包括給予患者藥物組合物，所述藥物組合物包含重組體HPVVLPs、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，其中所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、甾醇和^^脂，其中HPVVLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+L2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上。在本文所提供方法的具體實施方案中，給予患者的藥物組合物包含HPV類型6、11、16和18的VLPs。在其它實施方案中，組合物進一步包含HPV類型31、45、52和58的VLPs。在進一步實施方案中，組合物進一步包含HPV類型31、35、45和58的VLPs。在其它實施方案中，組合物進一步包含至少一種選自下列的其它HPV類型的VLPs:HPV26,HPV33，HPV35,HPV39，HPV51,HPV53,HPV55,HPV56,HPV59,HPV66,HPV68,HPV73和HPV82。本發(fā)明的疫苗組合物可以以最佳抑制HPV感染、同時具有最小潛在毒性的合適的劑量單獨使用。另外，可能希望共同給予或順序給予其它藥劑。本發(fā)明的制劑和組合物可以通過肌肉注射、皮下注射、真皮內(nèi)引入或通過皮膚壓印來給予患者。還包括其它給予模式，例如腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入遞送。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過肌肉注射給予疫苗和藥物組合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，使本文公開的HPV藥物組合物和制劑在各種引發(fā)/力口強組合物中給予患者，以便引起增強的、持久的免疫應(yīng)答。在這種情況下，用"引發(fā)和加強"方案給予兩種藥物組合物。例如，給予一或多次第一個組合物，然后，在預(yù)定時間之后，例如2周、l個月、2個月、6個月或其它合適的間隔，給予一或多次第二個組合物。優(yōu)選，臨床方案中使用的兩種或多種HPV藥物組合物包含相同HPV類型或HPV類型組合的VLPs。然而，還合乎需要的是，按照臨床方案，給予患者兩種不同的HPV藥物組合物，具有分開給予兩種疫苗的合適的時間間隔。例如，可以在一個時間點給予包含HPV16和18VLPs的疫苗組合物，而后在已經(jīng)通過預(yù)先確定的時間長度之后，在第二個時間點給予包含HPV31、45、52和58VLPs的HPV疫苗組合物。在此情況下，兩種不同HPV疫苗組合物中的每一種可以應(yīng)會予患者一次或一次以上(通過合適的時間長度分開)。:t姿照本發(fā)明的一個方面，可以表明，〗吏用HPVVLP疫苗(用AAHS和ISCOMATRIX⑧佐劑化)的雙劑量臨床方案，可以引起與使用VLP疫苗(用單獨的AAHS佐劑化)的三劑量方案類似幅度的免疫應(yīng)答(參見實施例1)。在這方面，本發(fā)明提供了預(yù)防人患者HPV感染的方法，包括(a)給予患者第一個藥物組合物，第一個藥物組合物包含重組體HPVVLPs、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，其中所述ISCOM型佐劑包括急草苷、甾醇和磷脂，其中HPVVLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+L2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上；(b)經(jīng)過預(yù)定量的時間；和(c)給予患者第二個藥物組合物，第二個藥物組合物包含重組體HPVVLPs、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，其中所述ISCOM型佐劑包括皂草苷、甾醇和磷脂，其中HPVVLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+L2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上。在如上所述方法的具體實施方案中，第一和第二個組合物是相同的，且臨床方案包括至少一次注射組合物，以"引發(fā)"對HPV的免疫應(yīng)答，和至少一次注射，以"加強"免疫應(yīng)答。然而，本文所描述的本發(fā)明還包括其它方法，在這些方法中進行多次注射，以引發(fā)和/或加強免疫應(yīng)答。在一些情況下，合乎需要的是，提供多劑量HPV疫苗制劑，在相同管瓶中，其包含一個劑量以上的疫苗。如果需要多劑量制劑，應(yīng)該使用抗微生物的防腐劑，以便殺死或防止微生物例如細菌和真菌的生長。與單劑量制劑相比，包含抗菌防腐劑的多劑量疫苗制劑提供了一些優(yōu)點，包括在一段時期內(nèi)從管瓶中取出多劑量疫苗，不用考慮第一次取出時無意中引入的微生物污染(Meyer等人，丄尸/2w附.96(12):3155-3167(2007))。許多銷售的疫苗產(chǎn)品(其與HPV無關(guān))包含苯氧乙醇(DAPTACEL(SanofiPasteur，Lyon,France),PEDIARIX,INFANRIX,HAVRIX⑧和TWINRIX⑧(GlaxoSm池Klme(GSK),Brentford,Middlesex,UnitedKingdom)或硫汞撒(PEDIARIX⑧和ENGERIX-B⑧(GSK))作為抗菌防腐劑(參見上文的Meyer等人)。另外，PNEUMOVAX23(Merck&Co.,Inc.，WhitehouseStation,NJ)制劑包含酚作為抗菌防腐劑。然而，過去沒有致力于包含HPVVLP的疫苗制劑與抗微生物防腐劑的相容性的工作。由此，按照本發(fā)明的一個方面，可以表明，在2-8。C,向包含HPVVLPs的疫苗制劑中加入選自下列的抗菌防腐劑可有效降低或消除微生物，并且不會消極影響VLPs的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性間曱酚、苯酚和苯甲醇。本文還說明，在包含HPVVLPs與ISCOM型佐劑組合的HPV疫苗制劑中，選自間甲酚、苯酚和苯甲醇的抗微生物防腐劑是有效的防腐劑。由此，本發(fā)明還涉及包含HPVVLPs和抗菌防腐劑的HPV疫苗制劑，抗菌防腐劑選自間曱酚、苯酚和苯甲醇。按照本發(fā)明該方面的疫苗制劑還可以包括如上所述的ISCOM型佐劑和鋁佐劑。在本發(fā)明該方面的一些優(yōu)選實施方案中，間甲酚包含在多劑量HPV疫苗制劑中，其濃度為大約0.15至大約0.31%。在更優(yōu)選實施方案中，多劑量疫苗制劑包含大約0.25至大約0.31%濃度的間甲酚。在一個優(yōu)選實施方案中，間甲酚以大約0.3%的濃度包含在多劑量制劑中。在本發(fā)明的替代性實施方案中，苯酚包含在多劑量HPVVLP疫苗制劑中，其濃度為大約0.25至大約0.55%。在更優(yōu)選實施方案中，包含苯酚，其濃度為大約0.4至大約0.55%。在一個特別優(yōu)選實施方案中，提供了包含大約0.5。/。濃度苯酚的多劑量HPVVLP疫苗制劑。在更進一步實施方案中，多劑量HPV疫苗制劑包含大約0.75至大約1.2%濃度的苯曱醇。在更優(yōu)選實施方案中，苯甲醇包含在多劑量疫苗制劑中，其濃度為大約0.8%至大約1.0%。在本發(fā)明該方面的特別優(yōu)選實施方案中，苯曱醇的濃度是0.9%。相應(yīng)地，本發(fā)明的一個方面涉及多劑量HPV疫苗制劑，其包含(a)至少一種HPV類型的HPV病毒樣顆粒(VLPs),其中HPV類型選自HPV6,HPV11,HPV16，HPV18,HPV26，HPV31,HPV33,HPV35,HPV39,HPV45，HPV51，HPV52,HPV53,HPV55,HPV56,HPV58,HPV59，HPV66,HPV68,HPV73和HPV82;所述HPVVLPs由HPV的重組體L1或重組體L1+!^2蛋白組成；(b)鋁佐劑；和(c)選自間曱盼、苯酚和苯曱醇的抗;微生物的防腐劑；其中所述HPVVLPs吸附在所述鋁佐劑上。如上所述的多劑量HPV疫苗制劑可以任選包含ISCOM型佐劑。為了描述和公開方法和物質(zhì)，本文引入本文提及的所有出版物作為參考，其可以與本發(fā)明結(jié)合使用。本文中的任何記載均不被理解為承認本發(fā)明由于在前發(fā)明而不具有早于這樣的公開的權(quán)利。參考附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但應(yīng)該理解，本發(fā)明不局限于那些明確的實施方案，在不背離附加權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍或精神的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對其進行各種改變和修飾。下列實施例舉例說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。包含佐劑的HPV制劑的形成實施例1給予恒河猴HPV八價疫苗(含有Iscomatrix佐劑)為了測定針對HPVVLP基疫苗的免疫應(yīng)答是否可以增加到高于單獨鋁佐劑所獲得的滴度，將八價HPVVLP疫苗(與非晶形的羥基磷酸鋁硫酸鹽(AAHS)加上ISCOMATRIX⑧佐劑組合)給予恒河猴。該疫苗由八種不同的HPVLl病毒樣顆粒組成。使VLPs吸附在磷酸氫氧化鋁佐劑(MAA)上，以450mcg/mL濃度存在。在進一步加入ISCOMATRIX⑧(CSLLimitedABN，Parkville,Australia)(以200mcg/mL存在)或沒有加入其的條件下，試驗MAA吸附的疫苗。使疫苗在由0.32MNaCl、10mM組氨酸(pH6.2)和0.01%聚山梨酸酯-80組成的緩沖液中。將0.5mL體積疫苗單一注射到每個印度恒河猴的右側(cè)三角肌處。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>試-驗下列免疫程序(對于每個組，n=4):在第0和8周，用MAA佐劑化的八價疫苗使I組接受免疫；在笫0和8周，用MAA/IMX佐劑化的疫苗使II組接受免疫；在第0、8和24周，用MAA/IMX佐劑化的疫苗使III組接受免疫；在第0和24周，用MAA/IMX佐劑化的疫苗使IV組接受免疫。以4周間隔從每個動物處收集血清樣品。結(jié)果表明，對于八個HPV類型的每一個，用MAA佐劑化的或MAA/IMX佐劑化的疫苗免疫的所有動物出現(xiàn)了血清轉(zhuǎn)化。當(dāng)比4支I和II組時，與MAA佐劑化的疫苗接受者(I組)相比，在MAA/IMX佐劑化的疫苗接受者(II組)中，針對每一HPV類型的幾何平均滴度一致地提高。在第52周，提高保持很明顯，表示效果是長久的。當(dāng)比較I和IV組時，結(jié)果表明，在單一劑量之后，MAA/IMX佐劑化的疫苗組(IV組)的峰滴度不但比單一劑量MAA疫苗(I組)所引起的峰滴度高，而且比得上雙劑量的MAA疫苗所引起的峰滴度(HPV16和31的代表性的結(jié)果，參見圖l和2)。0、24劑量方案的第52周的滴度(用MAA-IMX佐劑化的疫苗(IV組))，僅僅比0、8、24-劑量方案(用相同疫苗(m組))的滴度稍微低一些。這說明，與使用MAA佐劑化疫苗的3劑量方案相比，使用MAA/IMX佐劑化疫苗的雙劑量方案具有引起類似水平的免疫應(yīng)答的潛力。實施例2HPV竟爭性的Lummex試-瞼為了表明免疫應(yīng)答，利用竟爭性的Luminex免疫測定法(cLIA)來分析從免疫猴子中提取的血清。HPVcUA使用八個特定類型的構(gòu)型依賴的mAbs,以監(jiān)控對于使用HPV八價疫苗的免疫的免疫應(yīng)答。竟爭性Luminex免疫測定法的更詳細說明(其使用基于顆粒的流動細胞分析，以在試-驗樣品中同時測定針對許多HPV類型的抗體的存在)在下列中列出美國專利No.7,067,258,和Opalka等人，C/z"Z^agw丄W/www"o/.10(1):108-15(2003)。在包含抗體枯竭的人血清(ADHS)的預(yù)篩選試驗基質(zhì)中，制備每個HPV類型的八價參考標準溶液。參考標準是源于恒河猴的血清樣品庫，恒河猴是用HPV單價L1VLP類型6、11、16、18、31、45、52、58高免疫的。所有的標準樣品、對照物和樣品以一式兩個分的形式試驗。用1:4、1:40、1:400或1:4000稀釋物進行血清樣品的試^^。讀出熒光單位，并將雙份孔進行平均。基于每個試驗平皿的標準曲線的四參數(shù)邏輯擬合法，計算稀釋校正的mMU/mL血清值。將超出標準曲線定量范圍的樣品以更高稀釋物形式進行再試驗。沒有報道額外變化性不合格的復(fù)制物，然后將樣品重復(fù)試驗，直到它們復(fù)制物參數(shù)通過為止。形成試驗的對照物說明，建立每個HPV類型的定量限制。實施例3HPVVLP疫苗與MAA和Iscomatrix⑧佐劑組合的免疫原性在臨床試驗中，評價ISCOMATRIX⑧(IMX)在人患者中增強對于HPV的免疫應(yīng)答的能力。開始兩個階段的、隨^L化的、雙盲的、多中心的、IMX劑量逐步上升的控制研究，其試驗用非晶形的羥基磷酸鋁硫酸鹽(MAA)佐劑化的八價HPVVLP疫苗。在兩個獨立的研究階段，使患者隨機化。在包含固定濃度HPVVLPs(用MAA(281mcg)配制)的實驗性八價疫苗的背景下，評價每0.5mL劑量的15或30mcg(階段A)和60或120mcg(階段B)的IMX濃度，并和GARDASIL⑧對比。八價疫苗包含類型6(20mcg)、11(40mcg)、16(40mcg)、18(20mcg)、31(20mcg)、45(20mcg)、5(20mcg)和58(20mcg)的HPVVLPs。GARDASIL⑧是用高度純化的LlVLPs制備的四價HPV(類型6、11、16、18)重組體疫苗.除了VLPs之外，每個疫苗劑量包含MAA(225mcg)、氯化鈉、L-組氨酸、聚山梨酸酯80、硼酸鈉和7K。在研究的每個胳臂上，在第1天、2個月和6個月以0.5mL月幾肉注射(八〗介L1VLP(含有如上所述的MAA/IMX)的四個制劑中的一個或GARDASIL)的形式給予疫苗。該研究包括~150個健康女性，在登記的時候，年齡在18和24歲之間。使用實施例2所述的竟爭性Luminex免疫測定法(cLIA),將第1天、2個月、3個月(劑量2之后1個月)、6個月、7個月(劑量3之后1個月)和12個月獲取的血樣用于對相關(guān)HPV類型的免疫應(yīng)答的評價。進行對疫苗制劑的免疫應(yīng)答(相對于GARDASIL的免疫應(yīng)答)的分析，其中145個受試者在階段A和階段B(97%)具有3個月(Postdose2)的免疫原性可用數(shù)據(jù)，73個受試者在階段A(97%)還具有7個月(Postdose3)的免疫原性可用數(shù)據(jù)。分析包括階段A中的受試者，條件是他們(i)在合適的天數(shù)范圍內(nèi)，接受所有3個接種，(ii)具有在合適的天數(shù)范圍內(nèi)收集的血清樣品，(iii)在第1天對于相關(guān)的HPV類型是血清陰性的，和(iv)具有在合適的天數(shù)范圍內(nèi)收集的有效的7個月血清學(xué)結(jié)果。分析包括階段B中的受試者，條件是他們(i)在合適的天數(shù)范圍內(nèi)，接受頭2個接種，(ii)具有在合適的天數(shù)范圍內(nèi)收集的血清樣品，和(iii)在第1天對于相關(guān)的HPV類型是血清陰性的。在3個月(劑量2后)和7個月(劑量3后)時間點(階段A(15和30mcgIMX,+MAA)中受試者的治療組)和3個月時間點(階段B(60和120mcgIMX,+MAA)中受試者)的結(jié)果分別展現(xiàn)在圖3和4中。結(jié)果表明，與單獨用MAA佐劑化的GARDASIL⑧的結(jié)果相比，IMX劑量相關(guān)性地提高了對相關(guān)HPV類型的免疫應(yīng)答。實施例4在存在和不存在ISCOMATRIX⑧(IMX)條件下的八價HPVMAA和溶液制劑的穩(wěn)定性配制四個不同的八1"介HPV樣品(土MAA和土IMX)。所有的制劑包含下面數(shù)量的HPVVLPs:40yg/mLHPV6,80|ug/mLHPV11,80jug/mLHPV16和40mg/mLHPV18、31、45、52和58VLPs中的每一個。在每一制劑中還包含0.32MNaCl、10mM組氨酸(pH6.2)和0.01%聚山梨酸酯80(PS80)。第一個制劑不包含IMX或MAA佐劑。第二個制劑包含240jug/mLIMX,不包含MAA。試驗的第三個制劑不包含IMX,包含562.5|ag/mL(1.25X)MAA。試驗的第四個制劑包含240ing/mLIMX和562.5jug/mL(1.25X)MAA。在4。C和37。C存儲6個月之后，利用SDS-PAGE分析這四個制劑的HPVVLP完整性，利用體外相對功效試驗(IVRP)分析其體外抗原性。由SDS-PAGE分析(實施例5)以及IVRP試驗(實施例6)得到的結(jié)果表明，在沒有MAA的條件下，HPVVLPs不穩(wěn)定，并且在MAA的存在下，IMX對HPVVLP穩(wěn)定性沒有影響。結(jié)果表明，MAA應(yīng)該包含在含有IMX的HPV疫苗制劑中。實施例5利用SDS-PAGE評價HPVVLP完整性通過SDS-PAGE分析樣品(用Invitrogen4-20%或14%,1.5mm,10孔Tns-甘氨酸凝膠)。在還原樣品緩沖液(0.25MTris，PH6.8,8%SDS,40%丙三醇，0.008%溴酚藍，二硫蘇糖醇，在70。C加熱IO分鐘)中制備樣品。在制備樣品之前，將含有鋁佐劑的樣品濃縮至762ng/mL,并包括0.5MEDTA(pH8.0),以溶解鋁。將高負荷加入到1X還原樣品緩沖液(一份4X還原樣品緩沖液三份MilliQ水)中，制備低負荷(2.5ng)。對于每個樣品，操作12mcg(高)和2.5mcg(低)負荷。電泳之后，使用12%(w/v)三氯乙酸溶液固定凝膠，用Pro-Blue膠體考馬斯藍進行染色。使用光密度計獲得譜圖，使用ImageQuant軟件(GEHealthcareBiosciences;Piscataway,NJ)進4亍分析。高負荷用于測定降解物的相對量，^氐負荷用于測定完整HPV的相對量。結(jié)果表明，在37。C存儲6個月之后，兩個加上-MAA樣品(±IMX)的％完整單體有小的降低(小于10%)(圖5)。然而，在相同時點和貯存條件下，兩個減去MAA樣品的％完整單體有非常大的降低，對于減去IMX的樣品，降低達69%,對于加上IMX的樣品，降低達39%。數(shù)據(jù)表明，在IMX的存在下，HPVVLPs在MAA制劑中比在溶液制劑中更穩(wěn)定。實施例6通過IVRP試-驗評〗介HPVVLPs的體外抗原性相對于參考標準，利用體外相對效能(IVRP)試驗來定量HPV類型6、11、16、18、31、45和52VLP樣品的效能。IVRP試驗是夾層式免疫測定法，其使用獨立的單克隆抗體用于捕獲和檢測。利用StrategicBioSolutions(Newark,DE)，制備在八個血清型特異性試驗的每一個中所使用的抗體。在IVRP試驗中，使用下列血清型-特異性捕獲抗體H6.M48mAb(IgG0用于HPV6，K11.B2mAb(IgGO用于HPV11,H16.J4mAb(IgG2a)用于HPV16,H18.J4mAb(IgG2a)用于HPV18,H31.5F12.D4mAb(IgG0用于HPV31,H45.6G6.A8mAb(IgG2b)用于HPV45,H52.8D11.C4mAb(IgG2b)用于HPV52，H58.2C3.F7mAb(IgGO用于HPV58。在試驗中使用下列血清型-特異性檢測抗體H6.B10.5mAb(IgG2b)用于HPV6,H11.B2mAb(IgG2b)用于HPV11,H16.V5mAb(IgG2b)用于HPV16,H18.R5mAb(IgG2b)用于HPV18,M31.5D10.E4mAb(IgG2b)用于HPV31,H45.10B4.H4mAb(IgG!)用于HPV45,H52.9F7.E10mAb(IgG2a)用于HPV52,H58.6E11.F4mAb(IgG2b)用于HPV58。<吏用白色FluoroNuncMaxiSorp96孑L4設(shè)孑L4反(FisherScientific;Pittsburgh,PA)，在TecanFreedomEVO工作站(TecanUSA;ResearchTriangle,NC)上進行試驗。在用10mMTris(pH8)緩沖的1M硫酸銨中，首先用捕獲抗體涂漬試驗平皿(100juL/孔)，而后在2-8。C培養(yǎng)16-24小時。培養(yǎng)之后，用Tris-緩沖鹽水(TBS)(含有0.05%Tween20)洗滌平皿，而后用200juL/孔的試驗稀釋劑(TBS,含有0.05%Tween20和1%牛血清白蛋白)封閉一,J、時。在加入樣品之前，將佐劑吸附的樣品和標準樣品在6。/。檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(pH6.7-6.8)(含有1MNaCl和0.04%Tween80)中稀釋5倍，在章動器上、在環(huán)境溫度下培養(yǎng)2±0.5小時，使佐劑溶解。將沒有吸附于佐劑上的樣品也在溶解緩沖液中稀釋，但不培養(yǎng)。然后在Nunc96孔聚丙烯微孔板(源于FisherScientific(Pittsburgh,PA))中，用試驗稀釋劑將每個樣品和參考標準稀釋至血清型-特異性靶向濃度。用該初始稀釋物，在試驗平皿中制備每個樣品和參考標準的十一個兩倍系列稀釋物。在室溫下培養(yǎng)12-20小時之后(搖動)，洗滌平i,隨后將100juL檢測抗體加入到每個孔中。在室溫下培養(yǎng)平皿一'J、時，再次洗滌。然后，將100pL與堿性磷酸酶共軛的大鼠抗小鼠單克隆抗體(IgGhIgG2a或IgG2b)(S0uthernBiotechnology(Birmingham,AL)或BDPharmingen(BDBiosciences;SanJose,CA)提供)力。入到每個孔中。在室溫下培養(yǎng)一個小時之后，洗滌平皿，除去任何未結(jié)合的共軛物。然后，加入100juL4-甲基傘形基(umbelliferyl)磷酸鹽(4-MUP)基質(zhì)溶液(得自于ViroLabs(SuperPhos;Chantilly,VA)),反應(yīng)一'J、時。如下測定每個孔的熒光在360nm的激發(fā)波長處和450nm的發(fā)射波長處，在TecanUltraEvolution384平皿讀數(shù)器(TecanUSA;ResearchTriangle,NC)上將平皿讀數(shù)。將得到的熒光強度相對于稀釋因數(shù)作圖，使用四參數(shù)邏輯斯諦;溪型分析數(shù)據(jù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>其中X是樣品稀釋度，y是測定的熒光響應(yīng)，A是漸近最大值，B是斜率，C是ED50(即產(chǎn)生等于50%最大響應(yīng)的響應(yīng)時的理論稀釋度)，D是漸近最小值。將相同的漸近最大值和最小值用于標準和樣品，反復(fù)調(diào)節(jié)每個樣品和標準的ED50和斜率，直到均方根誤差減到最小為止。一旦確定了每個獨立樣品和標準的最佳ED50和斜率，對樣品進行平行試驗。如果樣品斜率在參考標準斜率的20%范圍之內(nèi)，認為試驗樣品與標準平行，使用普通斜率模型重新分析數(shù)據(jù)。將普通斜率、漸近最大值和漸近最小值用于樣品和標準，并將樣品和標準的ED50獨立地最佳化，使均方根誤差減到最小。使用下列方程式計算最終IVRP:IVRP=(ED50樣。。。/ED50標準)x參考標準效能隨后通過除以蛋白濃度將結(jié)果歸一化，由此產(chǎn)生IVRP與蛋白的比率。IVRP與蛋白的比率提供了每單位質(zhì)量的功能性抗原決定部位(epitopes)的測定方法。結(jié)果表明，在40。C存儲6個月之后，在加上和減去MAA的兩個樣品中，所有八個類型的HPV抗原保持了100%抗原性，與存在和不存在IMX無關(guān)(參見圖6)。在兩個減去MAA制劑(土IMX)中，在37°C6個月之后，所有HPV類型的抗原性僅僅保持10%。然而，在兩個加上MAA的制劑(土IMX)中，每個HPV類型還高于75%活性，表明HPVVLPs在沒有MAA的情況下是不穩(wěn)定的。IVRP結(jié)果比得上SDS-PAGE數(shù)據(jù)(date),表明在基于IMX的HPV制劑中需要MAA。包含防腐劑的HPV制劑的形成實施例7抗微生物的防腐劑的效果評價使用抗菌試-驗(抗微生物的效果(AME)試-瞼)，評價各種防腐劑在候選HPV疫苗制劑中的效果。AME試驗用于測定防腐劑降低或消除可能在產(chǎn)品取出之后引入管瓶中的微生物的能力。對于試^r的說明，參見UnitedStatesPharmacopoeia(USP)<51>,EuropeanPharmacopoeia5.1.3,和Meyer等人J.Pharm.Sci.96(12):3155畫3167(2007)，將其結(jié)合到本文中作為參考。簡要地說，AME試驗包括EPA、EPB和USP標準，其包括在時間零點，每個容器接種105106CFU/mL微生物(例如細菌和真菌)，并且評價隨著時間推移的對數(shù)減少(Meyer等人，上文)。使用下列七個防腐劑進行初始防腐劑篩選苯曱醇，氯丁醇(加上EtOH)，間甲酚，對輕基苯曱酸曱酯，對羥苯曱酸丙酯，苯酚和2-苯氧乙醇，以各種劑量和組合形式。這些防腐劑已經(jīng)在商品化的腸胃外產(chǎn)品中用作抗微生物的防腐劑。也包括硫汞撒作為參考?；谙惹暗墓ぷ骱涂衫玫奈墨I，選擇防腐劑的初始劑量和組合。更具體地-說，在下列范圍內(nèi)來試-瞼濃度；0.5-1.2%苯曱醇；0.25-0.5%氯丁醇(0.5。/oEtOH或3.0。/oEtOH);0.15-0.3%間甲酚；0.045-0.18%對羥基苯曱酸曱酯;0.005-0.02%對羥苯甲酸丙酯;0.25-0.5%苯酚;0.25-0.5%2-苯氧乙醇；和0.002-0.01%硫汞撒。所有的樣品含有562.5mcg/mLMAA、0.32MNaCl、10mMHis、0.01%聚山梨酸酯-80(PS-80),pH6.2。在加入和未加入120mcg/mLISCOMATRIX⑧的條件下，試-險含有氯丁醇和對羥苯曱酸丙酯的制劑。以溶液形式提供苯甲醇、苯酚、2-苯氧乙醇和間曱酚，并且直接加入到HPV制劑中。以粉末形式提供氯丁醇，并且溶于100%乙醇中，制備儲備溶液。將硫汞撒溶于USP水中，制備儲備溶液。通過稱出每個粉末，并且在100%乙醇中制備儲備溶液，來制備對羥基苯曱酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯的組合。用6.2的粑向pH值來調(diào)節(jié)溶液的pH值。將防腐劑加入到八價HPV制劑中，制劑包含8個類型的HPVVLPs,如實施例1所述，并且在AME試驗之前在2-8。C存儲一周。使含有1.2%苯曱醇、0.5%氯丁醇和0.3%間甲酚的制劑通過AME試驗的USP、EP-B和EP-A標準(參見Meyer等人，上文)。使含有0.4%和0.5%苯酚的制劑通過USP和EP-B試驗，而不通過EP-A試驗。試驗含有其它防腐劑的制劑，使其只通過USP試驗。因此，選擇含有1.2%苯甲醇、0.5%氯丁醇、0.3%間甲酚和苯酚(在0.4%或0.5%的濃度下)的制劑，用于更進一步的評價。實施例8評價防腐劑對HPVVLP抗原的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響差示掃描量熱法(DSC)用于評價防腐劑對蛋白結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性的影響。使用VP-CapillaryDSC平臺(MicroCal,LLC,Northampton,MA),測定抗原熱穩(wěn)定性的分析。所使用的條件的詳細說明公開在下列中Ionescu等人(2007)(丄尸/ar肌5"d97(4):1414-1426(2008》。選擇HPV18VLPs作為模型HPV抗原，用于DSC分析，因為與其它試驗類型相比，這類VLP產(chǎn)生最實用的DSC信號，并且代表不太穩(wěn)定的VLP類型。在各種防腐劑(濃度有所變化)的存在下，進行DSC評價。結(jié)果表明，0.5%氯丁醇、0.15%間甲盼、0.25%苯酚、0.5%乙醇(氯丁醇的溶劑)和0.25%2-苯氧乙醇對HPV類型18的熱穩(wěn)定性具有最小的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。對于硫汞撒、1.2%苯曱醇和0.045/0.005對羥基苯曱酸曱酯，觀察到對熱穩(wěn)定性的最大影響。然而，因為1.2%苯甲醇制劑通過了EP-A(實施例7),并且還具有高biacore響應(yīng)(實施例9),因此仍然選擇它用于更進一步的穩(wěn)定性試驗(實施例11-12)。同樣，當(dāng)與較低濃度的這些防腐劑相比時，雖然高濃度的間甲酚(0.3%)和苯酚(0.5%)對熱穩(wěn)定性具有相對更大的影響，但還是選擇更高濃度用于更進一步評價，這是由于通過了EP-A(0.3。/。間甲盼)和EP-B(0.5o/。苯酚)(參見實施例7)。不考慮防腐劑2-苯氧乙醇用于更進一步的評價，因為它沒有通過EP-B或EP-A(參見實施例7)。實施例9防腐劑對HPVVLP抗原活性的影響4吏用中和抗體結(jié)合試馬全(Biacore,SurfacePlasmonResonance),評{介包含HPV18VLPs和各種防腐劑的HPV疫苗制劑的體外抗原性。使用Biacore2000(VPR332)和Biacore3000(VPR696)(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)，測定抗原生物活性的分一斤。使用的條件描述在Mach等人(J.尸/z鍾.5"cz'.95:2195-2206(2006))中，對其做了修改。在通過鋁溶解進行樣品處理之前，在2-8。C培養(yǎng)樣品2個月，而后進行最終的Biacore分析。Biacore結(jié)果表明，試驗的防腐劑對HPV類型18VLPs的生物活性沒有顯著的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。除對羥基苯曱酸曱酯/對羥苯甲酸丙酯(相對體外抗原性，平均值77%,n-2)和^L汞撒(thim畫al)(相對體外抗原性，平均值80%,n-2)之外，所有結(jié)果在試驗的變化范圍之內(nèi)(+/-15%最大值)。實施例10防腐劑與鋁和IMX、小玻璃管和塞子的相互作用使用反相(RP)-高壓液相色譜(HPLC),進行防腐劑穩(wěn)定性的分析，如下列所述Dunn等人(丄P/wmSc/72:277-80(1983》。該方法用于評價防腐劑與鋁佐劑、玻璃容器和塞子的可能的相互作用。結(jié)果表明，接觸鋁佐劑之后，沒有檢測到防腐劑的損失(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果與我們先前的研究一致，這表明試-驗的防腐劑沒有與MAA結(jié)合。這些研究還表明，IMX不影響防腐劑濃度或HPV穩(wěn)定性。用小玻璃管(數(shù)據(jù)未顯示)和塞子進行類似的研究。用四個不同的防腐劑(在HPV制劑緩沖液中)，評價防腐劑與Teflon涂漬的塞子(FluroTec,WestPharmaceuticalServices,Inc.,Lionville,PA)的相容性。試驗的制劑包含1.2%苯曱醇、0.5%苯酚、0.5%氯丁醇或0.3%間曱酚的最后濃度。將每個樣品以0.75mL的體積填充到兩個3mL小玻璃管(帶有FluroTec⑧涂漬的塞子)中。將管瓶在室溫下存儲6個月，其中一個管瓶倒置，另一個正置。使用如上所述的RP-HPLC方法，測定防腐劑的濃度。結(jié)果表明，對于與塞子接觸的那些樣品，在室溫下貯存6個月之后，沒有檢測到防腐劑喪失。這些結(jié)果表明，在HPV制劑緩沖液中，防腐劑不會與FluorTec涂漬的塞子相互作用或吸附到其上面。RP-HPLC方法還用于評價防腐劑在HPV疫苗制劑中的穩(wěn)定性。短期的初步研究表明，當(dāng)HPV疫苗在2-8。C存儲時，所選才奪的防腐劑相當(dāng)穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未顯示)。對于長期穩(wěn)定性研究的更詳細評價描述在實施例11-12中。實施例11HPV疫苗制劑的穩(wěn)定性評價物質(zhì)和方法基于從AME、DSC和Biacore分析(實施例7-9)獲得的原始數(shù)據(jù)，選擇五個含有防腐劑的制劑(1.2%和0.9%苯曱醇、0.5%氯丁醇、0.3%間曱酚和0.5%苯酚)，用于更進一步的在長期穩(wěn)定性研究中的分析。在存在或不存在IMX佐劑的條件下，試驗一些HPV疫苗制劑(具有防腐劑的不同劑量和組合)。4吏每個類型的HPVVLP含水團塊吸收在MAA上(獨立地具有0.71的蛋白與佐劑比例)，在0.32MNaCl、10mM組氨酸(pH6.2)、0.01%(w/v)PS-80中形成單價疫苗。然后將八個獨立的單價疫苗摻合在一起，獲得40、80、80、40、40、40、40和40mcg/mL的蛋白濃度，分別用于HPV類型6、11、16、18、31、45、52和58。這種組合形成八價疫苗。另夕卜，一些制劑含有Isocomatrix⑧(IMX,CSLLtd.,Parkville，Australia)佐劑。在HPV疫苗緩沖液中制備原料IMX(如上所述)。然后將IMX加入到八價疫苗中，至240mcg/mL的最后濃度，使用沉降-傾析工藝，形成含有IMX佐劑的八價HPV疫苗。將制劑平緩混合，在40。C存儲過夜。初始防腐劑篩選(實施例7)使用120mcg/mLIMX(在氯丁醇制劑中)，因為當(dāng)這些實驗進行時，最終IMX濃度沒有確定。將制劑以0.75mL的體積填充在3mL小玻璃管(帶有Teflon涂漬的塞子(FluroTec⑧，WestPharmaceuticals,Lionville,PA))中，在試l全之前，在2-8、25、30和37。C保存在受控的熱單元中。在無菌條件下進行制劑和填充工藝。對于在2-8。C保存的制劑，計劃在第0、8、12、24和36個月進行測定，用于防腐劑、HPVVLP和IMX佐劑試驗。實施例12HPV疫苗制劑的穩(wěn)定性評價利用AME試驗評價防腐效果使用AME試驗，首先評價制劑(得自于實時研究(2-8。C))在0時間點的防腐效果。在存在或不存在IMX的條件下下，使含有0.5%氯丁醇和0.3%間甲酚的制劑通過USP、EP-B和EP-A試驗。使含有1.2%苯甲醇(沒有IMX)的制劑通過USP、EP-B和EP-A,但含有IMX的制劑不通過EP-A.在存在或不存在IMX的條件下，使沒有通過EP-A的制劑也包含0.9%苯曱醇和0.5%苯酚。3.3.3.在2-8°CJi&存8個月和在30和37°C貯存3個月的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)對于HPVVLPs,使用體外抗原性(Biacore)來評價多劑量的、含有防腐劑的樣品的穩(wěn)定性，RP-HPLC用于評價防腐劑和IMX穩(wěn)定性。源于促進的穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)(圖7和8)表明，在30和/或37°C,所有的防腐劑對八價HPV疫苗的穩(wěn)定性具有負面影響。然而，當(dāng)在2-8。C保存制劑時，防腐劑顯示沒有顯著地影響HPV疫苗穩(wěn)定性，甚至貯存8個月之后(圖7和8)。該數(shù)據(jù)還表明，對HPV疫苗的防腐效果隨著防腐劑類型而變化。促進的穩(wěn)定性研究的結(jié)果(在30。C)表明，比較所有試驗的防腐劑，0.3%間甲酚是最佳防腐劑，對多劑量HPV疫苗的穩(wěn)定性具有最小影響，而1.2y。苯甲醇和0.5。/c)氯丁醇防腐劑對HPV疫苗穩(wěn)定性具有最大的影響。總的說來，僅僅三個防腐劑(0.9%苯甲醇、0.5%苯酚和0.3%間曱酚)對HPV疫苗穩(wěn)定性具有相對較小的影響。實施例13利用RP-HPLC試-驗來評價防腐劑在HPV疫苗制劑中的穩(wěn)定性利用先前描述的RP-HPLC分析(實施例10),檢測防腐劑在多劑量HPV疫苗中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在存在或不存在IMX的條件下，所有五個防腐劑在多劑量疫苗制劑中是穩(wěn)定的(圖9)。與貯存溫度或持續(xù)時間沒有關(guān)系，在該研究期間，對于所有的試驗用制劑，沒有觀察到防腐劑損失。權(quán)利要求1.藥物組合物，其包含至少一種類型的人乳頭瘤病毒(HPV)的病毒樣顆粒(VLPs)、鋁佐劑、ISCOM型佐劑和可藥用載體，其中所述VLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+L2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于所述鋁佐劑上。2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中HPVVLPs的至少一種類型選自HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV31,HPV33,HPV35,HPV39,HPV45,HPV51,HPV52,HPV53,HPV55,HPV56，HPV58,HPV59,HPV66,HPV68,HPV73和HPV82。3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，包含HPV類型6、11、16和18的VLPs。4.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，包含HPV類型31、45、52和58的VLPs。5.權(quán)利要求2-4的任一項的藥物組合物，進一步包含選自下列的其它HPV類型的VLPs:HPV26,HPV33,HPV35，HPV39，HPV51，HPV53,HPV55,HPV56,HPV59,HPV66,HPV68,HPV73和HPV82。6.權(quán)利要求1-5的任一項的藥物組合物，其中鋁佐劑選自羥基磷酸鋁(A1P04)、非晶形的羥基磷酸鋁硫酸鹽(AAHS)和氬氧化鋁(Al(OH)3)。7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中鋁佐劑包括A1P04或AAHS,該佐劑包含以大約0.1至大約1.1的磷酸根(P04)與鋁(A1)的摩爾比存在的^岸酸一艮和鋁。8.權(quán)利要求6或7的藥物組合物，其中鋁佐劑包括以大約0.2至大約0.5的PCVA1摩爾比存在的磷酸根和鋁。9.3又利要求1-8的4壬一項的藥物組合物，其中ISCOM型佐劑是ISCOMATRIX⑧。10.人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗制劑，其包含(a)至少一種HPV類型的HPV病毒樣顆粒(VLPs),其中HPV類型選白HPV6,HPV11,HPV16,HPV18,HPV26,HPV31,HPV33,HPV35,HPV39,HPV45，HPV51,HPV52,HPV53,HPV55,HPV56,HPV58,HPV59,HPV66,HPV68,HPV73和HPV82;所述HPVVLPs由HPV的重組體L1或重組體L1+L2蛋白組成；其中任何一種HPV類型的VLPs以大約10jug至大約100jug的濃度存在，且其中總VLP濃度在10|ug和600jLig之間；(b)大約150jug至大約600jug的鋁佐劑；和(c)大約10iug至大約200jug的ISCOM型佐劑；其中所述HPVVLPs吸附在所述鋁佐劑上。11.權(quán)利要求10的HPV疫苗制劑，進一步包含抗菌防腐劑，抗菌防腐劑選自間甲酚、苯酚和苯曱醇。12.權(quán)利要求11的HPV疫苗制劑，其中抗菌防腐劑包括大約0.15至大約0.31%濃度的間曱盼、大約0.25至大約0.55%濃度的苯紛、或大約0.75至大約1.2%濃度的苯甲醇。13.權(quán)利要求10的HPV疫苗制劑，包含(a)大約20jug至大約80jug的^f壬何一種HPV類型的VLPs;(b)大約200jug至大約300jug的鋁佐劑；和(c)大約15jug至大約120jug的ISCOM型佐劑。14.4又利要求10的HPV疫苗制劑，包含(a)大約20jug至大約80jug的任何一種HPV類型的VLPs;(b)大約300jug至大約500jug的鋁佐劑；和(c)大約15jig至大約120|ug的ISCOM型佐劑。15.權(quán)利要求10的HPV疫苗制劑，包含HPV類型6、11、16和18的VLPs。16.權(quán)利要求15的HPV疫苗制劑，進一步包含HPV類型31、45、52和58的VLPs。17.權(quán)利要求10的HPV疫苗制劑，包含HPV類型31、45、52和58的VLPs。18.權(quán)利要求16或17的HPV疫苗制劑，進一步包含選自下列的其它HPV類型的VLPs:HPV26,HPV33，HPV35，HPV39,HPV51，HPV53，HPV55，HPV56，HPV59,HPV66,HPV68,HPV73和HPV82。19.權(quán)利要求10的HPV疫苗制劑，其中ISCOM型佐劑是ISCOMATRIX⑧。20.權(quán)利要求10的HPV疫苗制劑，包含(a)大約20lug至大約80jugHPV類型6、11、16、18、31、45、52和58中每一種的VLPs，所述HPVVLPs由HPV的重組體Ll或重組體Ll+L2蛋白組成；(b)大約200jug至大約500jug的鋁佐劑；和(c)大約30jug至大約120iug的ISCOM型佐劑；其中所述HPVVLPs吸附在所述鋁佐劑上。21.在人患者中對人乳頭瘤病毒(HPV)引起免疫應(yīng)答的方法，包括給予患者權(quán)利要求1-9的任一項的藥物組合物。22.防止人患者感染人乳頭瘤病毒(HPV)的方法，包括:給予患者權(quán)利要求1-9的任一項的藥物組合物。23.防止人患者感染人乳頭瘤病毒(HPV)的方法，包括(a)給予患者第一個藥物組合物，第一個藥物組合物包含重組體HPV病毒樣顆粒(VLPs)、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，其中HPVVLPs由HPV的重組體L1蛋白或重組體L1+1>2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上；(b)經(jīng)過預(yù)定量的時間；和(c)給予患者第二個藥物組合物，第二個藥物組合物包含重組體HPVVLPs、鋁佐劑和ISCOM型佐劑，其中HPVVLPs由HPV的重組體Ll蛋白或重組體L1+!^2蛋白組成，且其中所述VLPs吸附于鋁佐劑上。24.權(quán)利要求23的方法，其中第二個藥物組合物包含在第一個藥物組合物中不存在的HPV類型的HPVVLPs。25.多劑量HPV疫苗制劑，包含(a)至少一個HPV類型的HPV病毒樣顆粒(VLPs);所述HPVVLPs由HPV的重組體L1或重組體L1十L2蛋白組成；(b)鋁佐劑；和(c)抗菌防腐劑，選自間曱酚、苯酚和苯甲醇，其中所述HPVVLPs吸附在所述鋁佐劑上。26.權(quán)利要求25的多劑量HPV疫苗制劑，其中抗菌防腐劑包括大約0.15至大約0.31%濃度的間甲酚、大約0.25至大約0.55%濃度的苯酚、或大約0.75至大約1.2%濃度的苯甲醇。27.權(quán)利要求26的多劑量疫苗制劑，其中抗菌防腐劑包括大約0.3%濃度的間曱酚、大約0.5%濃度的苯酚、或大約0.9%濃度的苯曱醇。全文摘要本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含HPV的病毒樣顆粒(VLPs)，所述VLPs吸附到鋁佐劑上，和ISCOM型佐劑，ISCOM型佐劑包括皂草苷、膽固醇和磷脂。在優(yōu)選實施方案中，鋁佐劑包括非晶形的羥基磷酸鋁硫酸鹽。本發(fā)明的另一個方面提供了多劑量的HPV疫苗制劑，其包含HPVVLPs和選自間甲酚、苯酚和苯甲醇的抗菌防腐劑。還提供了在人類患者中使用本公開藥物組合物和制劑來針對HPV引起免疫應(yīng)答至預(yù)防HPV感染的方法。文檔編號A61K39/12GK101622008SQ200880006855公開日2010年1月6日申請日期2008年3月6日優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日發(fā)明者B·K·邁爾,B·胡,D·凱西米羅,J·T·布賴恩,L·施,M·K·布朗羅,W·L·麥克萊門茨申請人:默克公司