專利名稱:對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用的改性羥基聚合物共軛物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及改性羥基聚合物共軛物,尤其具有胂瘤殺傷作用的胍-葡聚糖共軛物,和制造所述共軛物的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
胍化合物具有很多有意義而重要的生物醫(yī)藥作用并因此具有許多 用途。例如,它們被用作游離基清除劑、防止氧化氮形成的氧化氮合酶
(NOS)抑制劑。已知它們對細(xì)胞具有一定的抗增殖作用。胍類也^f皮用作
"抗老化"藥物,其中,實(shí)現(xiàn)該作用的機(jī)理是預(yù)防低密度脂蛋白氧化, 預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病變,通過抑制深度糖基化最終產(chǎn)物(AGE)的形成而 預(yù)防糖尿病的組織損傷作用,如心血管損傷作用,如下列科學(xué)出版物所 述(Yildiz等,Br J Pharmacol, 1998 7月;124(5):905-910; Scaccini等, J Lipid Res, 1994年,第35巻,1085-1092; Higashi等,J Biochem, 2004, 笫136巻,第4期,533-539; Szende等,Cancer Cell Int, 2001,1:3; Sell 等,J Gerontol Soc Am, 2001, 56: B405國B411; Wang等,World J Gastroenterol, 2005, 7月7日ll, (25)3830-3833; Zhang等,World J Gastroenterol, 2001,6月7日:3): 331-334; JP Beisswenger,Dartmouth Med, http〃dartmed. dartmouth.edu/summer 00/html/bench—to—bedside,shtml)。目 前,美國以非處方藥供應(yīng)氨基胍并在臨床研究中調(diào)查其在治療各種疾病 中的作用。胍丁胺靠調(diào)節(jié)多胺的新陳代謝而對癌細(xì)胞增殖的抑制作用已 描述在Wang等,Acata Pharmacologica Sinica 2005,5月;26(5):616-622 中。
50多年來,葡聚糖一直是用來預(yù)防低血容量性休克(原文chock似 應(yīng)為shock—譯注),預(yù)防栓塞和改進(jìn)微循環(huán)的已有藥物。文獻(xiàn)中已很好 地記載了葡聚糖及其非毒性和高耐受性(AS Segal, 1964 In:Modern medical monographs,Wright編,IS, Green & Stratton, NY,London, pp 5-17)。因此常被用作藥物學(xué)上可應(yīng)用的羥基聚合物的實(shí)例。
發(fā)明概述胍化合物和葡聚糖對腫瘤細(xì)胞幾乎無毒性作用,如
圖1所示。但已 意外地發(fā)現(xiàn),當(dāng)胍化合物與活化羥基聚合物,如活化葡聚糖,共價(jià)偶聯(lián)
時(shí),共軛物表現(xiàn)出與傳統(tǒng)抗癌藥物,如Adriamycin ,類似的或在某些 劑量下甚至更高的高抗腫瘤效力。
因此,本發(fā)明涉及具有肺瘤細(xì)胞殺傷作用的改性羥基聚合物共軛 物。該改性羥基聚合物共軛物是被胍化合物取代的羥基聚合物,如葡聚 糖,所述胍化合物具有至少 一個(gè)游離氨基并共價(jià)偶聯(lián)到羥基聚合物部分 的活化羥基上。
本發(fā)明中的優(yōu)選胍化合物是胍丁胺或氨基胍,羥基聚合物部分是葡 聚糖,所述葡聚糖的分子量為103~106道爾頓,并在被所述胍基化合 物取代之前進(jìn)行活化。
改性羥基聚合物共扼物還包含共價(jià)偶聯(lián)的官能團(tuán),包括放射性核 素、治療化合物、抗癌藥物、靶向制劑等。
改性羥基聚合物共輒物優(yōu)選是平均分子量為約70 kD±25 kD的胍-葡聚糖共軛物,其中葡聚糖中15~60%,優(yōu)選20~50%的葡萄糖部分#皮 含至少一個(gè)游離氨基側(cè)基的胍化合物所取代。所述胍化合物,優(yōu)選胍丁 胺或氨基胍,被共價(jià)偶聯(lián)到所述葡聚糖的活化羥基上。羥基聚合物共軛 物還可包含共價(jià)偶聯(lián)的官能團(tuán),包括放射性核素、治療化合物、抗癌藥 物、耙向制劑等。適用的靶向制劑是,例如,雙膦酸鹽,如阿侖膦酸鈉。
本發(fā)明還涉及所述羥基聚合物共軛物作為藥物的用途,尤其用于制 造治療肺瘤的藥物。這類藥物是腫瘤殺傷組合物,它包含改性羥基聚合 物共軛物和至少一種藥物學(xué)上可接受的佐劑。這類藥物或腫瘤殺傷組合 物可以局部地,在膀胱內(nèi),部分地(regiolocal),在腹腔(peritoneal), 在腫瘤內(nèi),全身性或靜脈內(nèi)給藥。這類藥物還可包含共價(jià)偶聯(lián)的官能團(tuán), 包括放射性核素、治療藥物、抗癌藥物、靶向制劑等。
本發(fā)明還提供制造改性羥基聚合物共軛物的方法。在本方法中,將 含至少 一個(gè)游離氨基的胍化合物與用凝膠過濾法純化活化羥基聚合物 時(shí)所得到的洗脫液相混合。羥基聚合物通過氧化反應(yīng)而被活化,其中將 高碘酸鹽加進(jìn)包含所述羥基聚合物的水溶液,然后加入濃硫酸,然后通 過加入乙二醇而終止反應(yīng)。然后,用凝膠過濾法純化如上所述已^皮活化 的羥基聚合物。附圖簡述
圖1示意用活性尿路上皮癌細(xì)胞(RT4, ATCC, Manassas,USA)對比 葡聚糖和氨基胍與蒽環(huán)類化合物(anthracycline )的毒性作用,蒽環(huán)類 化合物二Adriamycir^。百分存活率畫在y軸上,培養(yǎng)濃度畫在x軸上。
圖2示意胍-葡聚糖共軛物和蒽環(huán)類化合物對尿路上皮癌細(xì)胞(RT4, ATCC, Manassas,USA)的毒性作用的對比,其中amgdx二氨基胍-葡聚糖, agmdx二胍丁胺-葡聚糖,蒽環(huán)類化合物-Adriamycin 。百分存活率畫在y 軸上,培養(yǎng)濃度畫在x軸上。尿路上皮癌細(xì)胞的存活率是《1=0。下限 值代表100%細(xì)胞死亡。
圖3示意胍-葡聚糖共軛物和蒽環(huán)類化合物對尿路上皮癌細(xì)胞 (5637, ATCC, Manassas,USA)的毒性作用的對比,其中amgdx二氨基胍 -葡聚糖,agmcb^胍丁胺-葡聚糖,蒽環(huán)-Adriamycin 。百分存活率畫在 y軸上,培養(yǎng)濃度畫在x軸上。尿路上皮癌細(xì)胞的存活率是< 1=0。
圖4示意胍-葡聚糖共軛物和蒽環(huán)類化合物對前列腺癌細(xì)胞(PC3, ATCC, Manassas,USA)的毒性作用的對比,其中amgdx二氨基胍-葡聚糖, agmdx二胍丁胺-葡聚糖,蒽環(huán)類化合物-Adriamycin 。前列腺癌細(xì)胞的 存活率是《1=0。
圖5示意胍-葡聚糖共軛物和蒽環(huán)類化合物對乳癌細(xì)胞(MDA231, ATCC, Manassas, USA)的毒性作用的對比,其中amgdx二氨基胍-葡聚糖, agmdx二胍丁胺-葡聚糖,蒽環(huán)類化合物-Adriamycin 。乳癌細(xì)胞的存活 率是《1=0。
圖6示意胍-葡聚糖共軛物和蒽環(huán)類化合物對腎細(xì)胞癌(A498, ATCC, Manassas, USA)的毒性作用的對比,其中amgdx-氨基胍-葡聚糖, agmdx二胍丁胺-葡聚糖,蒽環(huán)類化合物-Adriamycin 。腎癌細(xì)胞的存活 率是《1=0。
發(fā)明詳述
本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn),某些具有很低固有毒性的胍化合物,當(dāng)與非毒性 羥基聚合物如葡聚糖共價(jià)共軛時(shí),具有高的腫瘤細(xì)胞殺傷效力。該腫瘤 細(xì)胞殺傷效力等于已有的蒽環(huán)類抗癌藥,如Farmorubicine 和 Adriamycir^或在某種濃度下高于已有的抗癌藥。似有可能因所述聚合物 -胍共軛物構(gòu)分的無害性質(zhì)而能預(yù)期,這類共軛物,即對于醫(yī)療人員的處理和病人在治療中的副作用而言,都優(yōu)于傳統(tǒng)的化療抗癌藥物。
相信靶向或癌細(xì)胞選擇性是通過快分割癌細(xì)胞所需的加快新陳代
謝而實(shí)現(xiàn)的,這需要氨基-5-胍基戊酸和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的胍化合物以及用來 形成多胺的其它構(gòu)分(D Scott Lind, Am Soc Nutr Sci, 2004,J Nutr, 134:2837-2841; E Wayne, Turk J Med Sci, 2003,33,195-205)。所述胍4匕合 物的細(xì)胞吸收原則上是通過Na+4蟲立的堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)y+傳遞的 (Cendan等,Ann Surg Oncol,l995,2:257-265)。
本發(fā)明的胍-聚合物-共軛物是作為含羥基聚合物的骨架化合物的化 合物,如葡聚糖。羥基聚合物或葡聚糖的分子量為103~106道爾頓。 一般,羥基聚合物或葡聚糖被15 ~ 60%,優(yōu)選20 ~ 50%的胍側(cè)基所取代, 即葡聚糖骨架中20~50%的葡萄糖部分被胍基所取代。
在一個(gè)被分析批次中,已證明,葡聚糖聚合物的平均分子量為70 kD 的100 mg氨基胍-葡聚糖-共軛物中,胍側(cè)基約占30 mg。換言之,273 iumol氨基胍偶聯(lián)到1.4 iLimol葡聚糖70上,這意味著約50%葡萄糖部分 被胍基所取代。在另一批次中,已發(fā)現(xiàn),葡聚糖聚合物的平均分子量為 70kD的100mg氨基胍-葡聚糖-共軛物中,胍側(cè)基約占10mg。換言之, 90 iumol氨基胍偶聯(lián)到1.3 )iimol葡聚糖70上,這意味著約18%葡萄糖部 分被胍基所取代。
該藥物優(yōu)選局部給藥,例如,膀胱內(nèi)給藥,部分地,例如,腹腔給 藥,腫瘤內(nèi),即直接注射進(jìn)實(shí)體腫瘤中,或全身性即通過靜脈內(nèi)給藥。 所有這些給藥途徑都是可能的而且依賴于具體的治療應(yīng)用。
羥基聚合物或葡聚糖聚合物用胍的側(cè)基進(jìn)行取代。胍基是通過胍化 合物的游離側(cè)氨基共價(jià)偶聯(lián)到所述葡聚糖聚合物上的。進(jìn)行取代的方法 是通過氧化來活化所述葡聚糖聚合物,由此能與所述游離氨側(cè)基發(fā)生反 應(yīng),形成胍化合物鍵,然后還原,獲得穩(wěn)定的胺鍵(Matsunaga等,Nucl MedBiol. 2005, 32,279-285)。
在示例中,氨基胍與羥基聚合物或葡聚糖聚合物形成腙鍵。腙鍵可 以被進(jìn)一步還原,生成胍基肼鍵。適用的胍化合物是胍丁胺和氨基胍。
在所述胍化羥基聚合物共軛物上還可偶聯(lián)其它官能團(tuán)。這些官能團(tuán) 包括治療藥物,放射性核素如Tc-99m、 1-131、 Y-90、 Re-188、 Sm-153, 激素,激素拮抗劑如它莫西芬,肽類如生長激素抑制素,毒素,單克隆 抗體或其碎片,自由基清除劑如氨磷汀或蛋白和其它靶向制劑。這類官能團(tuán)的偶聯(lián)用直接法或通過在引入官能團(tuán)之前已偶聯(lián)到羥基聚合物上的雙官能螯合劑來實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例1葡聚糖的活化
將藥物級葡聚糖PM70(150 mg)溶解在6ml水中。加進(jìn)120 mg高碘酸鈉,然后加進(jìn)25 iul濃硫酸。攪拌該混合溶液30 min。加進(jìn)75 |li1乙二醇以終止氧化,并通過再反應(yīng)15min而破壞過量的高石典酸鹽。在PD-10柱上,用0.1M的pH6.5的乙酸酯作為洗脫液,以凝膠過濾法,以1 ml部分,純化已活化葡聚糖,除去低分子量組分。在每次分離中,獲得2ml活化葡聚糖溶液。
共軛化
將1 ml由上述步驟所獲得的洗脫液與下列混合
A) l 10 mg石危酸胍丁胺和5 mg氰基硼氳化鈉,
B) 65 mg鹽酸氨基胍。
在室溫下攪拌該溶液過夜并在PD IO柱上用PBS作為洗脫液分離除去低分子量組分。從每次反應(yīng)獲得2ml純化共軛溶液。熒光細(xì)胞毒性鑒定(圖1~6)
焚光細(xì)月包毒性鑒定4安Larsson和Nygren所述進(jìn)4亍(Larson等,Anticancer Res, 1989,9:1111-1119).
扼要地,對約10,000個(gè)細(xì)胞/孔接種(96-孔微滴定板,F(xiàn)alcon. BectonDickinson, Meylan, France)。加入等摩爾濃度(O.l、 0.5、 1、 2和4 |nM)的蒽環(huán)和含氨基胍或胍丁胺基的胍-葡聚糖-共軛物。在對照孔中加入相同量的PBS。培養(yǎng)72h后,離心處理微滴定板(200 xg 3 min),并輕彈這些板以除去介質(zhì)。用PBS洗滌這些細(xì)胞。將熒光素二乙酸酯(FDA,Sigma, Stockholm, Sweden)溶解在DMSO中并在-20。C保持冷凍,作為貯液(IO mg/ml)。用PBS把FDA貯液稀釋到濃度為10 lug/ml,且在各孔內(nèi)加進(jìn)200iul。然后在37。C培育這些板30 min。用96-孔掃描熒光計(jì)計(jì)數(shù)發(fā)射自活細(xì)胞的熒光。把數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)并計(jì)算結(jié)果。結(jié)果示于圖1~5, y軸表示細(xì)胞的Q/。存活率,x軸表示試驗(yàn)物質(zhì)的摩爾濃度。
使用下列腫瘤細(xì)胞系(來自ATCC, Manassas,US):RT4、 5637(尿路上皮癌)、MDA231(乳癌)、PC3(前列腺癌)、A498(腎細(xì)胞癌)。
權(quán)利要求
1.具有腫瘤細(xì)胞殺傷作用的改性羥基聚合物共軛物,其特征在于該改性羥基聚合物共軛物是被胍化合物取代的羥基聚合物,所述胍化合物含至少一個(gè)游離氨基并共價(jià)偶聯(lián)到所述羥基聚合物部分的活化羥基上。
2. 按照權(quán)利要求1的改性羥基聚合物共軛物,其特征在于所述胍化合物是胍丁胺或氨基胍。
3. 按照權(quán)利要求1的改性羥基聚合物共軛物,其特征在于所述羥基聚合物的分子量為103~106道爾頓。
4. 按照權(quán)利要求1的改性羥基聚合物共軛物,其特征在于該羥基聚合物是葡聚糖。
5. 按照權(quán)利要求1的改性羥基聚合物共軛物,其特征在于該改性羥基聚合物共軛物還包含至少一個(gè)共價(jià)偶聯(lián)的官能團(tuán)。
6. 按照權(quán)利要求5的改性羥基聚合物,其特征在于所述官能團(tuán)是放射性核素。
7. 按照權(quán)利要求5的改性羥基聚合物,其特征在于所述官能團(tuán)是治療化合物。
8. 按照權(quán)利要求5的改性羥基聚合物,其特征在于所述官能團(tuán)是抗癌藥物。
9. 按照權(quán)利要求5的改性羥基聚合物,其特征在于所述官能團(tuán)是另一種耙向制劑。
10. 按照權(quán)利要求1的改性羥基聚合物共軛物,其特征在于該改性羥基聚合物共軛物是平均分子量為約70 kD±25 kD的胍-葡聚糖共軛物,其中,葡聚糖中15~60%,優(yōu)選20~50%的葡萄糖部分被含至少一個(gè)游離氨基側(cè)基的胍化合物所取代,所述胍化合物共價(jià)偶聯(lián)到所述葡聚糖的活化鞋基上。
11. 按照權(quán)利要求1 ~ 10中任何一項(xiàng)的改性羥基聚合物共軛物,其特征在于所述改性羥基聚合物共軛物可以局部地,在膀胱內(nèi),部分地(regiolocal),腹腔(peritoneal),在腫瘤內(nèi),全身性或靜脈內(nèi)給藥。
12. 腫瘤殺傷組合物,其特征在于所述腫瘤殺傷組合物包含按照權(quán)利要求1~ 10中任何一項(xiàng)的改性羥基聚合物共軛物和至少一種藥物學(xué)上可接受的佐劑。
13. 制造按照權(quán)利要求1的改性羥基聚合物共軛物的方法,其特征在于將含至少 一 個(gè)游離氨基的胍化合物與包含已用凝膠過濾法純化的 活化羥基聚合物的洗脫液進(jìn)行混合。
14.按照權(quán)利要求13的方法,其特征在于活化羥基聚合物是通過氧 化反應(yīng)得到的,其中將高碘酸鹽加進(jìn)包含羥基聚合物的水溶液,然后加 進(jìn)濃硫酸,以及其中氧化反應(yīng)靠加入乙二醇而終止,然后用凝膠過濾法 進(jìn)行純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及改性羥基聚合物共軛物,優(yōu)選具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性的胍-葡聚糖共軛物。該改性羥基聚合物共軛物被用作藥物,尤其用來制造藥物或治療腫瘤用的腫瘤殺傷組合物。還公開了制造所述羥基聚合物共軛物的方法。
文檔編號A61P35/00GK101678121SQ200880007038
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者A·霍爾姆伯格, L·穆爾林 申請人:德克斯特克醫(yī)療公司