專利名稱：：包含ecm的網(wǎng)片的制作方法包含ECM的網(wǎng)片
背景技術(shù)：
：腹壁損傷可由外傷、腫塊切除或先前腹部手術(shù)的并發(fā)癥諸如疝氣和網(wǎng)片感染引起。腹壁包括若干肌肉和正面結(jié)構(gòu)，其允許腹壁起到保護(hù)腹內(nèi)器官的作用并允許腹壁彎曲和伸展軀干并支撐背面。疝氣是組織、結(jié)構(gòu)或一部分器官經(jīng)過其被正常包含的肌肉組織或膜的突出。大多數(shù)疝氣在腹部內(nèi)由于腹壁能力變?nèi)鯇?dǎo)致缺損，被腹膜覆蓋的脂肪組織或器官經(jīng)該缺損突出而發(fā)展。當(dāng)構(gòu)建人造口時(shí)，誘導(dǎo)腹壁的能力變差，并且產(chǎn)生人造口周圍疝氣的風(fēng)險(xiǎn)增加。在與回腸造口術(shù)和尿道造口術(shù)相比的結(jié)腸造口術(shù)中，所有人造口中有30。/。具有增加的發(fā)病率(Efron2003)。向后推(Pushingback)或降低患疝氣的組織可以手術(shù)方式修復(fù)大多數(shù)腹疝?，F(xiàn)代的增強(qiáng)技術(shù)包括合成材料(網(wǎng)片假體)，其避免了己經(jīng)變?nèi)醯?、將機(jī)械載荷散布在更大面積內(nèi)的組織的過度伸展。將網(wǎng)片放置在缺損上方，并且有時(shí)用網(wǎng)栓進(jìn)行固定。使用幾種假體移植物用于腹部筋膜修復(fù)，諸如由聚丙烯(Prolene,EthiconInc.)、聚乙烯(Dacron)、腈綸布(Orion)、聚乙烯海綿(Ivalon)、聚四氟乙烯(PTFE,特氟隆網(wǎng)片和布)、膨脹PTFE(Gore-tex)、聚酯(Mersilene)和聚乙烯布(Vinyon-N)制成的不能被吸收的網(wǎng)片?？晌盏木W(wǎng)片包括聚乳酸羥基乙酸(Vicryl,Dexon)和聚羥基乙酸(Dexon)。聚丙烯網(wǎng)片是被用于腹部修復(fù)的最常用的合成假體網(wǎng)片。女性骨盆區(qū)域內(nèi)組織的變?nèi)鯇?dǎo)致其中器官下落或從原位滑出的病況。人類的下垂有陰道下垂或直腸下垂。在陰道下垂中，一部分陰道腔從陰道開口伸出，因?yàn)榘螂?、小腸、直腸、尿道、子宮或陰道頂突出進(jìn)入陰道。在直腸下垂中，直腸壁伸出經(jīng)肛門并因此在體外變得可見。在壓力性尿失禁中，由妊娠、分娩和絕經(jīng)引起的物理變化導(dǎo)致骨盆底肌肉能力變?nèi)?。?dāng)咳嗽、大笑、打噴嚏、鍛煉或者當(dāng)其它運(yùn)動(dòng)增加腹內(nèi)壓力從而增加對(duì)膀胱的壓力時(shí)，這一能力變?nèi)鯇?dǎo)致尿道向下移動(dòng)。用于壓力性尿失禁的普通手術(shù)包括通過提升膀胱并用附著于肌肉、韌帶或骨的線將膀胱固定而將膀胱向上拉動(dòng)到更正常的部位。另一個(gè)可能性是用寬的懸吊索固定膀胱。這提起膀胱而且還壓縮膀胱底部和尿道上部，進(jìn)一步防止?jié)B漏。在一面上而非在對(duì)面上附著細(xì)胞的植入用網(wǎng)片是已知的。這通過用特氟龍薄膜層壓網(wǎng)片或通過用生物吸收性材料諸如膠原蛋白或膠質(zhì)涂覆網(wǎng)片來進(jìn)行。ECM產(chǎn)品或涂覆ECM的網(wǎng)片的使用是已知的。這些產(chǎn)品是料片形式或者是被ECM組分涂覆的網(wǎng)片形式。包括凍干豬ECM料片的ECM料片的實(shí)例是SurgisisHerniaMatrix(Surgisis痛氣基質(zhì))，SurgisisHerniaRepairGraft(Surgisis痛氣修復(fù)移植物)禾卩StratasisUrethralSling(Stratasis尿道懸吊索)，全部得自Cook。網(wǎng)片的涂層的實(shí)例是Parietex復(fù)合網(wǎng)片(具有膠原蛋白涂層的聚酯網(wǎng)片)和Sepramesh(Genzyme)(具有由透明質(zhì)酸鈉(HA)、羧甲纖維素(CMC)和聚乙二醇(PEG)組成的水凝膠涂層的聚丙烯網(wǎng)片)。發(fā)明概述本文公開了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的非連續(xù)區(qū)域在促進(jìn)細(xì)胞生長中的應(yīng)用。當(dāng)所述支架(scaffolds)被施用于惰性材料上面時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長并且適當(dāng)?shù)毓潭ňW(wǎng)片的附著。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含生物相容性惰性材料的網(wǎng)片，所述生物相容性惰性材料至少部分地被包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料所覆蓋。在一個(gè)實(shí)施方案中，網(wǎng)片是針織結(jié)構(gòu)，優(yōu)選是針織織物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，網(wǎng)片是非織造物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，網(wǎng)片是薄的多孔膜。通過對(duì)網(wǎng)片材料的涂層附加ECM的非連續(xù)區(qū)域，有可能將網(wǎng)片的可以提供的一定范圍的物理性質(zhì)(例如強(qiáng)度、柔軟度、靈活性、耐用性)與ECM的重構(gòu)性質(zhì)相組合。另外，這種涂層的價(jià)格比其它涂層的價(jià)格低，因?yàn)樗龇勰┦堑米陨a(chǎn)非細(xì)胞ECM料片的廢產(chǎn)物，而且還因?yàn)榭梢源_定離散的ECM材料對(duì)于每種應(yīng)用而言在涂層中的最佳量和等同分布，從而避免使用不必要的高濃度的ECM。除了ECM的效果之外，基體材料的多孔結(jié)構(gòu)為系統(tǒng)提供了向內(nèi)生長的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，非連續(xù)的ECM區(qū)域通過添加離散的ECM材料諸如粒子、薄片、纖維或粉末被獲得。用于植入的網(wǎng)片被充分地描述并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的。這些網(wǎng)片典型地是生物相容性的惰性材料。生物相容性是指材料在特定的應(yīng)用中引起適當(dāng)?shù)乃拗鲬?yīng)答的能力，在活組織內(nèi)不產(chǎn)生有毒的、有害的或免疫學(xué)不適當(dāng)?shù)膽?yīng)答。惰性是指其不被周圍的生物流體和酶所降解。在一個(gè)方面，生物相容性惰性材料選自PP、PE、由茂金屬催化獲得的聚合物、硅氧烷、特氟隆(氟烴)和聚氨酯。特別優(yōu)選的生物相容性的惰性材料是沿用已久被接受用于所述應(yīng)用的丙烯。惰性材料可進(jìn)行等離子體處理，以便增加在表面上的粗糙度和/或獲得在表面上的官能化，并由此增加細(xì)胞和/或生物可降解材料的粘附。典型地，網(wǎng)片是扁平的，為約0.5-1.5毫米厚。根據(jù)用途的不同，其可為圓形或細(xì)長形的。與形狀無關(guān)，網(wǎng)片具有兩個(gè)面。如果網(wǎng)片是細(xì)長形的(例如用作懸吊索)，其將具有兩個(gè)末端和在兩個(gè)末端之間的中段。形成用于懸吊、疝氣或POP修復(fù)的結(jié)構(gòu)的生物相容性的惰性材料(經(jīng)常被稱為網(wǎng)片)可以通過多種不同技術(shù)被制造。這類結(jié)構(gòu)包括針織織物，機(jī)織織物，非織造織物(包括氈合、紡粘、氣流+壓光)，流延/吹塑薄膜，和注射成型格網(wǎng)。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在表面上具有ECM粒子的生物相容性的惰性材料。這種材料將引起表面吸引細(xì)胞。在ECM粒子周圍的腔和在完成ECM粒子后所見的那些腔將用作與惰性材料的錨固點(diǎn)。因此，描述了錨固惰性材料的方法。在一個(gè)方面，所述網(wǎng)片具有減弱的細(xì)胞向內(nèi)生長的面和具有增強(qiáng)的細(xì)胞向內(nèi)生長的面。將惰性材料與細(xì)胞吸引性材料諸如ECM的組合可實(shí)現(xiàn)這一效果。將細(xì)胞吸引性ECM與惰性材料的組合可以不同的方法被獲得在主要面之一上用包含ECM粒子的生物可降解的合成/天然聚合物涂覆惰性網(wǎng)片諸如聚丙烯網(wǎng)片。在一個(gè)面上氈合具有大體上惰性的穩(wěn)定纖維的主要纖維材料和在另一個(gè)面上氈合包含ECM材料的纖維。以夾層結(jié)構(gòu)紡粘第一層和第二層。第一層含有ECM材料和第二層不含ECM材料。分兩步進(jìn)行薄膜流延包含ECM的第一生物可降解層，和惰性材料的第二層。注射成型格網(wǎng)的部分包覆。包含ECM粉末的泡沫與針織網(wǎng)片、非織造織物或薄膜的復(fù)合材料。包含ECM粒子的惰性材料在其它或類似惰性聚合物上的共擠出或涂覆形成在表面上具有離散ECM粒子的惰性聚合物的雙組分單絲。該單絲可被用于例如機(jī)制或針織。該單絲還可被切割成穩(wěn)定的纖維并用在非織造方法中。在纖維加工期間，ECM粒子還可與惰性的生物相容性聚合物混合，提供離散的粒子分布，然而，這將導(dǎo)致不能被細(xì)胞所獲得的ECM粒子的浪費(fèi)，因?yàn)橹挥性诒砻嫔系腅CM粒子才可接觸到細(xì)胞。另外，貫穿單絲被分布的ECM粒子引起纖維能力變?nèi)酢Ｔ诒景l(fā)明的一個(gè)方面，惰性材料在一面上用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料涂覆。這對(duì)于疝氣植入而言特別有利。這里，網(wǎng)片將僅附著于腹壁(在網(wǎng)片的一面上)，而不附著于腸。本發(fā)明的有關(guān)方面涉及包含在一面上用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料涂覆的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片用于制造疝氣治療用的醫(yī)療器件的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)有關(guān)方面涉及治療疝氣的方法，包括以下步驟將包含在一面上用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料涂覆的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片以被涂覆面朝向腹壁的方式放置在患者體內(nèi)覆蓋疝氣部位。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，惰性材料是細(xì)長形的并且在兩個(gè)末端被涂覆。這對(duì)于懸吊索而言特別有利。這里，網(wǎng)片將在懸吊索的末端附著于錨固點(diǎn)，但仍允許由膀胱排空引起的尿道重布置。本發(fā)明的有關(guān)方面涉及包含在兩個(gè)末端用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料涂覆、中央部分未被涂覆的生物相容性的惰性材料的細(xì)長形網(wǎng)片用于制造尿失禁治療用醫(yī)療器件的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)有關(guān)方面涉及治療尿的失禁方法，包括以下步驟將包含在兩個(gè)末端用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料涂覆、中央部分未被涂覆的生物相容性的惰性材料的細(xì)長形網(wǎng)片放置在尿道周圍，從而使得所述中央部分包圍尿道并且所述末端能夠發(fā)揮錨固功能。在一面上或?qū)μ囟ú考牟糠滞扛部梢酝ㄟ^浸涂技術(shù)、噴涂技術(shù)或刷涂技術(shù)獲得。在本發(fā)明的一個(gè)方面，惰性材料被包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料完全覆蓋。這對(duì)于其中需要粘附于兩個(gè)面的植入物特別有利。這尤其可用于治療骨盆下垂、膀胱壁重構(gòu)或陰道壁修復(fù)的網(wǎng)片。本發(fā)明的有關(guān)方面涉及包含用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料完全涂覆的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片用于制造骨盆下垂治療用醫(yī)療器件的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)有關(guān)方面涉及治療骨盆下垂的方法，包括以下步驟將包含用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料完全涂覆的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片放置在下垂部位。包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料優(yōu)選是生物可降解的。也就是說，該材料消失；被水解掉，被分解掉，被生物降解/可被生物再吸收/可被生物吸收/可被生物侵蝕，被溶解掉或者以其它方式從生物相容性的惰性材料消失。生物可降解區(qū)域被重新合成的宿主組織所代替，從而錨固惰性材料。典型地優(yōu)選該連續(xù)材料在1天到IO周內(nèi)被分解，根據(jù)應(yīng)用的不同而異。包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料可被理解為是第一材料是連續(xù)的。也就是說，其具有連續(xù)相。具有非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料得到復(fù)合材料。如同其它復(fù)合材料一樣，這是由具有顯著不同的物理或化學(xué)性質(zhì)的兩種以上的構(gòu)成材料制成并且在最終結(jié)構(gòu)中仍保持分離和不同的工程化材料。ECM材料的非連續(xù)相，其是ECM的非連續(xù)區(qū)域，是指在形式和密度方面與其被嵌入的周圍材料是不同的ECM材料。這可以通過實(shí)施例5所示的組織學(xué)切片或通過實(shí)施例6所示的掃描電子顯微鏡(SEM)被證明。通過附加ECM的非連續(xù)區(qū)域，可以控制ECM的濃度。ECM材料優(yōu)選在形成連續(xù)材料之前被加入到涂層中(例如冷凍干燥)。用這種方法，ECM材料被均勻分布在涂層中。也就是說，在涂層固化所需的時(shí)間內(nèi)(例如在冷凍期間)，ECM材料的密度在涂層的一端可能比在另一端稍微高一些。然而，在本發(fā)明的背景下，均勻分布涵蓋了在整個(gè)涂層中的這種密度梯度，條件是在涂層中央部分的密度大于0。因此，優(yōu)選方案涉及其中ECM的非連續(xù)區(qū)域被均勻分布的涂層。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是動(dòng)物或人組織的非細(xì)胞部分。因此ECM是包圍細(xì)胞的復(fù)合材料。因此，優(yōu)選ECM的非連續(xù)區(qū)域是無細(xì)胞區(qū)域。無細(xì)胞區(qū)域通過采用物理、酶和/或化學(xué)方法被獲得?？梢晕锢矸绞嚼缤ㄟ^破碎組織而除去細(xì)胞層?？墒褂孟礈靹┖兔竵硎菇M織內(nèi)的細(xì)胞彼此分離。還可使用水或其它低滲溶液，因?yàn)榈蜐B透性將引起組織內(nèi)的細(xì)胞破裂，并因此有利于去細(xì)胞過程。另一個(gè)獲得無細(xì)胞區(qū)域的方法是向涂覆基質(zhì)中加入ECM粉末(ECM的非連續(xù)區(qū)域)。無細(xì)胞產(chǎn)品使一旦植入就發(fā)生的任何免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)最小化，因?yàn)榧?xì)胞組分可引起免疫原性應(yīng)答。在廣義術(shù)語下，在ECM中存在三種主要組分纖維性組分(特別是膠原蛋白、彈性蛋白或網(wǎng)硬蛋白)，連接蛋白(例如粘連蛋白、層粘連蛋白)和空間填充分子(通常是氨基多糖》ECM已知吸引細(xì)胞并通過充當(dāng)生長因素和細(xì)胞因子的儲(chǔ)庫來促進(jìn)細(xì)胞增殖(Hodde，J.P.，Record,R.D.，Liang,H.A.,&Badylak，S.F.2001，"Vascularendothelialgrowthfactorinporcine-derivedextracellularmatrix",Endothelium2001;8.(1):11-24"vol.8,第11-24頁；Voytik-Harbin,S.L.，Brightman,A.O.，Kraine，M.R.,Waisner,B.，&Badylak,S.F.1997,"Identificationofextractablegrowthfactorsfromsmallintestinalsubmucosa"，J.CellBiochem.,vol.67,第478-491頁)。包含ECM粒子的涂層將被來自周圍組織的細(xì)胞和來自循環(huán)血液的細(xì)胞所集落繁殖。當(dāng)細(xì)胞侵入涂層時(shí)，形成新的組織。優(yōu)選的ECM材料包含來自該材料的組織來源的生物活性ECM組分。例如，它們可包含成纖維細(xì)胞生長因子-2(堿性FGF)、轉(zhuǎn)化生長因于-(5(TGF-(3)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)。還優(yōu)選本發(fā)明的ECM基體材料包含另外的生物活性組分，包括例如一種或多種膠原蛋白、氨基多糖、糖蛋白和/或蛋白多糖在內(nèi)。ECM可包括基底膜，其主要由IV膠原蛋白、層粘連蛋白和蛋白多糖組成。本發(fā)明的ECM材料優(yōu)選從被飼養(yǎng)用于肉品生產(chǎn)的動(dòng)物中收獲的組織制備，包括但不限于豬、牛和羊在內(nèi)。其它的溫血脊椎動(dòng)物也可用作組織來源，但是從用于肉品生產(chǎn)的動(dòng)物獲得這些組織的更大可用性使得這些組織是優(yōu)選的。經(jīng)過遺傳工程化以不含半乳糖基，a1，3半乳糖(GAL表位)的豬可用作用于生產(chǎn)ECM材料的組織來源。在優(yōu)選方案中，ECM得自豬來源。ECM材料可得自任何動(dòng)物。其可得自但不限于腸組織、膀胱、肝、脾、胃、淋巴結(jié)或皮膚。特別優(yōu)選得自人尸體皮膚、豬膀胱粘膜下層(UBS)、豬膀胱基質(zhì)(UBM)或豬小腸粘膜下層(SIS)的ECM。人組織優(yōu)選被避免使用，以使疾病的轉(zhuǎn)移最小化。因此，在優(yōu)選方案中，ECM的非連續(xù)區(qū)域得自動(dòng)物組織。由于物種的類似性，優(yōu)選使用得自溫血哺乳動(dòng)物的ECM。在特別優(yōu)選的方案中，ECM的非連續(xù)區(qū)域是UBM(膀胱基質(zhì))粒子。UBM材料包括ECM蛋白的獨(dú)特混合物(cocktail)，其中一些已經(jīng)過量化TGF-卩293±8pg/g，b國FGF3862±170pg/g和VEGF475±22pg/g(其是pgVEGF/gUBM)。在平均密度為3mg/cm2時(shí)，在EMC料片中，TGF-(3的濃度為0,9pg/cm2，b-FGF的濃度為ll,6pg/cm,VEGF的濃度為l,4pg/cm2。ECM的非連續(xù)區(qū)域的濃度優(yōu)選高于15M(w/w)，其高于20%(w/w)，諸如高于30%(w/w)。ECM的非連續(xù)區(qū)域的濃度優(yōu)選低于95%(w/w)，其低于90Q/q(w/w)，諸如低于80。/。(w/w)或低于70%(w/w)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方案中，該濃度為20。/。(w/w)到60%(w/w)，諸如20。/。(w/w)到40%(w/w)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料由包含諸如以下的物質(zhì)制成玉米蛋白、膠質(zhì)、膠原蛋白角蛋白、S-磺化角蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白或其它結(jié)構(gòu)蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)方面，包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料由包含諸如以下的物質(zhì)的多糖制成藻酸鹽、脫乙酰殼多糖/殼多糖、透明質(zhì)酸、CMC、HEC、HPC或其它官能化纖維素。在本發(fā)明的一個(gè)方面，包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料由包含諸如以下的物質(zhì)的合成聚合物制成a)以下物質(zhì)的均聚物或共聚物乙交酯，L-丙交酯，DL-丙交酯，內(nèi)消旋-丙交酯，s-己內(nèi)酯，1,4-二噁烷-2-酮，-戊內(nèi)酯，P-丁內(nèi)酯，，丁內(nèi)酯，Y-癸內(nèi)酯，1,4-二氧雜環(huán)庚垸-2-酮，1,5，8，12-四氧雜環(huán)十四烷陽7,14隱二酮，1，5-二氧雜環(huán)庚烷-2-酮，6,6-二甲基-1,4-二隨垸-2-酮，碳酸三亞甲基酯；b)單官能或二官能的聚乙二醇與a的聚合物的嵌段共聚物；c)單官能或二官能的聚垸撐二醇與a的聚合物的嵌段共聚物；d)上述聚合物的共混物；e)上述聚合物和PEG的共混物；或任何上述組合。MPEG-PLGA聚合物可如下合成在氮保護(hù)氣氛下，將在甲苯中的MPEG、DL-丙交酯、乙交酯和4。/。(w/v)辛酸亞錫加入到在手套箱中的小瓶中。將小瓶密封，加熱和振搖，直到內(nèi)容物澄清和均勻，然后將其置于120-20(TC的烘箱中達(dá)1分鐘-24小時(shí)。該合成還可以在適當(dāng)溶劑(例如二隨垸)中的溶液形式進(jìn)行，以便于隨后的純化。然后在氮保護(hù)氣氛中將MPEG、DL-丙交酯、乙交酯、4%2-乙基己酸亞錫和二噁垸加入到在手套箱中的小瓶中，并如上進(jìn)行處理。聚合物可以如下進(jìn)行純化將聚合物溶于適當(dāng)?shù)娜軇?例如二嚼烷、四氫呋喃、氯仿、丙酮)中，并在攪拌下在非溶劑(例如水、甲醇、乙醇、l-丙醇或2-丙醇)中在-4(TC到4(TC的溫度沉淀。使聚合物沉降，丟棄溶劑，將聚合物在4(TC-12(TC的真空烘箱中干燥過夜。至少部分地覆蓋生物相容性的惰性材料的涂層的一個(gè)功能是提供促進(jìn)細(xì)胞生長的基質(zhì)。促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長進(jìn)入涂層的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在室溫下為固體的涂層。也就是說，該涂層具有被固定的物理結(jié)構(gòu)，雙連續(xù)結(jié)構(gòu)。采用這種結(jié)構(gòu)，幫助細(xì)胞移動(dòng)經(jīng)過涂層并形成新組織。促進(jìn)細(xì)胞生長的另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是具有開放的孔或至少具有允許細(xì)胞遷移的多孔性的涂層。多孔性被定義為是P=l-p(V/M)，其中P是涂層的多孔性，p是所用聚合物系統(tǒng)的密度，M是所制涂層的重量，和V是所制涂層的體積。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及本文所述的至少部分地覆蓋生物相容性的惰性材料、包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的涂層。超過50%的多孔性能夠發(fā)生細(xì)胞生長。因此，在優(yōu)選方案中，所述涂層包括高于50%、諸如高于80%、甚至高于90%的多孔性或在95%的多孔性的涂層。優(yōu)選多孔涂層具有開放的連通孔。涂層厚度必須使得在提供細(xì)胞的足夠的向內(nèi)生長以錨固網(wǎng)片并同時(shí)體積不是很大并且不在體內(nèi)產(chǎn)生障礙物之間達(dá)到平衡。因此，涂層厚度優(yōu)選是0.05-1毫米。在許多的這些應(yīng)用中，必要條件是本發(fā)明的網(wǎng)片經(jīng)過殺菌處理。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及具有包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的涂層的經(jīng)過殺菌的網(wǎng)片。這典型地被表現(xiàn)為以不透細(xì)菌的方式進(jìn)行包裝的包含至少部分地用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料覆蓋的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片，在該包裝上表明該產(chǎn)品經(jīng)過殺菌處理。如實(shí)施例4所述，通過例如輻射進(jìn)行殺菌保持了ECM的生物效應(yīng)，根據(jù)涂層類型的不同而異。不透細(xì)菌的材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。實(shí)施例材料MPEG-PLGA支架形成試劑的純化乙酸乙酯在氮?dú)庀聫臍浠}蒸餾。二嗯垸在氮?dú)庀聫拟c/二苯甲酮蒸餾。甲苯在氮?dú)庀聫拟c/二苯甲酮蒸餾。DL-丙交酯和乙交酯在無水乙酸乙酯中在氮保護(hù)氣氛中進(jìn)行重結(jié)晶并進(jìn)行真空干燥。PEG/MPEG被溶于適當(dāng)?shù)娜荦RU(例如氯仿)中，在冷己垸中沉淀，過濾并干燥過夜。2-乙基己酸亞錫經(jīng)過真空蒸餾并保存在氮?dú)庀隆?-30的合成在氮保護(hù)氣氛下將在甲苯中的0.5gMPEG2000、4.15gDL-丙交酯、3.35g乙交酯和4。/。(w/v)辛酸亞錫加入到在手套箱中的小瓶中。將小瓶密封，加熱和振搖，直到內(nèi)容物澄清和均勻，然后將其置于120-20(TC的烘箱中達(dá)1分鐘到48小時(shí)，例如長達(dá)6小時(shí)。上述合成還可以在適當(dāng)溶劑(例如二嚼垸)中的溶液形式進(jìn)行，以促進(jìn)隨后的純化。然后，在氮保護(hù)氣氛下將0.5gMPEG2000、4.15gDL-丙交酯、3.35g乙交酯和101nL4。/。(w/v)的辛酸亞錫和8g二卩惡垸加入到在手套箱中的小瓶中，并如上進(jìn)行處理。聚合物的純化將聚合物溶于適當(dāng)?shù)娜軇?例如二嚼烷、四氫呋喃、氯仿、丙酮)中，并在攪拌下在非溶劑(例如水、甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇)中在-4(TC到4(TC的溫度沉淀。使聚合物沉降，丟棄溶劑，將聚合物在4(TC-12(TC的真空烘箱中干燥過夜。使用NMR-光譜學(xué)和GPC分析聚合物以確認(rèn)結(jié)構(gòu)、分子量和純度。實(shí)施例l:構(gòu)建具有被涂覆表面和未被涂覆的表面的網(wǎng)片將25gMPEG-PLGA(如上所述)轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中。將容量瓶的四分之三填充1，4-二嚼烷。將MPEG-PLGA在50。C下溶解過夜。將2.5g的PEG400加入到容量瓶中并將燒瓶填充達(dá)到100ml的水平標(biāo)記。將MPEG-PLGA溶液轉(zhuǎn)移到250ml燒杯中并使用磁性攪拌器將5gUBM粉末(例如ACell)懸浮在該溶液中。將UBM懸浮液輕輕刷涂到約1.5mm厚的用氧等離子體處理的聚丙烯網(wǎng)片的主要表面之一上。將丙烯網(wǎng)片保持在低于l(TC的溫度以冷凍MPEG-PLGA溶液并避免對(duì)聚丙烯網(wǎng)片的另一面造成滑痕。通過冷凍干燥除去1，4-二嗨烷，留下包含ECM粒子的多孔性MPEG-PLGA涂層。實(shí)施例2:構(gòu)建被完全涂覆的復(fù)合材料。將4gMPEG-PLGA(如上所述)轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，將容量瓶的四分之三填充1，4-二隨垸。將MPEG-PLGA在5(TC溶解過夜。將0.4g的PEG400加入到容量瓶中并將燒瓶填充達(dá)到100ml的水平標(biāo)記?？墒褂肞EG700來代替PEG400。將MPEG-PLGA溶液轉(zhuǎn)移到250ml燒杯中并使用磁性攪拌器將2gUBM粉末(例如ACell)懸浮在該溶液中。將7.5ml的懸浮液傾入到10X10cm的鋁模具中，得到高度為0.75mm的懸浮液。將具有1.5mm的近似高度的10X10cm聚丙烯網(wǎng)片放置在模具中。將模具淬火并置于冷凍干燥儀中過夜。實(shí)施例3:在有和沒有ECM粒子的合成支架中的原代人成纖維細(xì)胞的向內(nèi)生長將由包含40。/。(w/w)的UBM(ACell)粒子(平均直徑為約150微米)的生物可降解聚酯制成的支架與不含ECM粒子的支架在細(xì)胞形態(tài)和3D生長試驗(yàn)中進(jìn)行比較。將甲氧基-聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(Mn2.000-30.000,LG1:1)溶于1,4-二嗨垸得到1.5%的溶液。對(duì)于包含UBM的支架，將0.03gUBM加入到3ml聚合物溶液(40。/。w/w干物質(zhì))，高速混合并傾入到3X3cm的模具中。將溶液在-5。C冷凍并在-2(TC凍干5小時(shí)，在2(TC保持約60小時(shí)。隨后將樣品放置于干燥器中抽吸(液壓泵)5小時(shí)。評(píng)價(jià)了在兩個(gè)支架的表面上被接種的原代成纖維細(xì)胞的生長和形態(tài)學(xué)試驗(yàn)。從第l、3和7天得到的結(jié)果被分成l-5級(jí)，l級(jí)代表最壞情況，5級(jí)代表最好情況。在混有ECM粒子的支架中，細(xì)胞的分布和生長在所有天數(shù)內(nèi)被給出5級(jí)并且優(yōu)于對(duì)照支架(其在所有天數(shù)被給出2^級(jí))。結(jié)論粉狀ECM基質(zhì)的生物活性在被并入合成支架中后仍保持活性，當(dāng)與單獨(dú)的支架相比時(shí)，引起在支架上的顯著更好的生長。實(shí)施例4:支架中ECM+/-并入的殺菌對(duì)原代成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和3D生長的影響將甲氧基-聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(Mn2.000-30.000，LG1:1)溶于1,4-二噁烷得到1.5%的溶液。對(duì)于包含UBM的樣品，將0.045g的未經(jīng)殺菌的UBM加入到10ml聚合物溶液(23。/。w/w干物質(zhì))中，高速混合并傾入到7X7cm模具中。將溶液在-5'C冷凍并在-2(TC凍干5小時(shí)和在2(TC保持約18小時(shí)。隨后將樣品置于干燥器中抽吸(液壓泵)15小時(shí)。使有和沒有UBM的樣品經(jīng)歷0、1X25kGy和2X25kGy的(3輻射。以同樣方式制備另一個(gè)樣品(0.045g/5ml溶液)，但是使用預(yù)先經(jīng)過殺菌的UBM(2X25kGy的(3輻射并且在制備后不對(duì)樣品進(jìn)行殺菌處理。將得自豬皮膚的A型明膠175bloom(Sigma)溶于Milli-Q水和叔丁醇(95:5)中得到1%的溶液。在攪拌下將0.015g的未經(jīng)殺菌的UBM加入到5ml溶液(23。/。w/w干物質(zhì))中并頃入到模具(D:5cm)中。將含溶液的模具置于+5X:下持續(xù)2小時(shí)，然后在-2(TC冷凍并在-20'C凍干5小時(shí)和在20'C保持20小時(shí)。隨后將樣品在12(TC的真空烘箱中交聯(lián)15小時(shí)。使有和沒有UBM的樣品經(jīng)歷0禾B1X25kGy禾Q2X25kGy的(3輻射。以同樣方式制備了不含UBM的另一個(gè)樣品。在制備后使樣品經(jīng)歷0、1X25kGy禾卩2X25kGy的殺菌處理。將得自豬皮膚的A型明膠175bloom(Sigma)溶于Milli-Q水和叔丁醇(95:5)中得到1%的溶液。在攪拌下將0.015g的預(yù)先經(jīng)過殺菌的UBM(1X25kGy)加入到5ml溶液(23。/。w/w干物質(zhì))中并頃入到模具(D二5cm)中。將含溶液的模具置于+5t:下保持1小時(shí)，然后在-2(TC冷凍并在-2(TC凍干5小時(shí)和在20'C保持50小時(shí)。隨后將樣品在13(TC的真空烘箱中交聯(lián)15小時(shí)。細(xì)胞形態(tài)和3D生長研究表明，UBM料片的增加的輻射降低了在UBM料片上的細(xì)胞的數(shù)目，但不影響細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。在膠質(zhì)支架和含30%(w/w)UBM的膠質(zhì)中，在膠質(zhì)支架中觀察到細(xì)胞數(shù)降低以及形態(tài)學(xué)從典型的成纖維細(xì)胞向更圓形態(tài)的改變效果最大。在被并入膠質(zhì)支架之前進(jìn)行UBM粒子的殺菌，比在支架殺菌之前并入U(xiǎn)BM粒子，提供了更好的細(xì)胞形態(tài)和3D生長。在MPEG-PLGA中，增加的輻射由于支架增濕而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)增加以及成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)。包含30%(w/w)UBM的MPEG-PLGA的支架的輻射，與其中UBM粒子在被并入支架之前經(jīng)過輻射的支架相比，引起成纖維細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)甚至更高和更具3D形態(tài)學(xué)。該研究顯示了在未經(jīng)輻射的膠質(zhì)支架中實(shí)現(xiàn)最高的生物活性并且該輻射使活性降低。相比之下，當(dāng)UBM粒子被并入MPEG-PLGA支架并隨后進(jìn)行殺菌時(shí)發(fā)現(xiàn)了最高的生物活性。據(jù)信輻射降低UBM的生物活性。輻射根據(jù)與生物活性有關(guān)的材料的不同而異可以消極或積極的方式影響支架材料。有跡象表明支架材料(例如MPEG-PLGA)在殺菌期間具有保護(hù)UBM的效果。實(shí)施例5:在MPEG-PLGA中的離散的ECM粒子對(duì)包含41。/。(w/w)的UBM粒子的MPEG-PLGA支架接種原代成纖維細(xì)胞在支架的表面上以2.5Xl(^個(gè)細(xì)胞/cm2的密度在小體積的生長培養(yǎng)基(在DMEM中的10%的FCS，包含抗生素青霉素、和兩性霉素B)中進(jìn)行。該支架在37t:和5。/。C02中進(jìn)行培養(yǎng)，然后加入另外的生長培養(yǎng)基。在7天后，將支架置于Lillys定色劑中3天，然后將其包埋在石蠟中，被切割成8|im的切片并用Meyer蘇木精侵蝕(HE)進(jìn)行染色。使用裝有EvolutionMP冷卻彩色攝影機(jī)(MediaCybernetics)的BX-60Olympus顯微鏡收集數(shù)字圖象(4倍和20倍放大率)，并使用ImageProPlus5.1軟件獲得數(shù)字圖象。在MPEG-PLGA支架中ECM粒子分布的數(shù)字圖象顯示被HE染色并與支架材料相區(qū)別的離散的UBM粒子。在支架中生長的成纖維細(xì)胞被染成藍(lán)色(圖1)。實(shí)施例6:通過SEM顯示的在MPEG-PLGA中的離散的UBM粒子。如實(shí)施例1所述制備支架。SEM照片顯示了含UBM粒子的MPEG-PLGA支架(圖3)和不含UBM粒子的MPEG-PLGA支架(圖2)。照片在250倍放大率下在支架的上表面獲得。在Danishtechnologicalinstitute(2005-160)獲得SEM照片。實(shí)施例7:在包含ECM粒子的支架中的三維內(nèi)皮生長和分化。將甲氧基-聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(Mn2.000-30.000，LG1:1)溶于1，4-二嗯垸得到1.5%的溶液。對(duì)于包含UBM的樣品，將0.045g的未經(jīng)殺菌的UBM加入到10ml聚合物溶液(23y。w/w干物質(zhì))中，高速混合并傾入到7X7cm模具中。將溶液在-5'C冷凍并在-2(TC凍干5小時(shí)和在2(TC保持約16小時(shí)。隨后將樣品置于干燥器中抽吸(液壓泵)15小時(shí)。將得自臍帶的原代人內(nèi)皮細(xì)胞與原代人皮膚成纖維細(xì)胞在MPEG-PLGA支架上和在包含23%(w/w)UBM的支架上共同培養(yǎng)。將構(gòu)成物浸沒在規(guī)定的內(nèi)皮生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10天，然后將其懸空并培養(yǎng)另外9天。在最后一天，將培養(yǎng)構(gòu)成物用4%福爾馬林緩沖液固定，二等分并用石蠟包埋。通過CD31/PECAM(血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘著分子)的免疫組織化學(xué)古德帕斯徹氏染色，在5pm切片上可見內(nèi)皮細(xì)胞。鑒定成纖維細(xì)胞，平行切片用與蘇木精復(fù)染組合的PECAM過氧化物酶染色。因?yàn)閮?nèi)皮生長和分化受到成纖維細(xì)胞性能的影響時(shí)，因此所有的支架材料采用2個(gè)不同的成纖維細(xì)胞群進(jìn)行試驗(yàn)，但不引起不同的結(jié)果。所有的MPEG-PLGA支架支持成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮生長。成纖維細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)貫穿于所有MPEG-PLGA支架的整個(gè)體積內(nèi)。UBM粒子均勻分布并且支架在培養(yǎng)期間完整無損。然而，在MPEG-PLGA支架上培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞只引起內(nèi)皮表面生長，即在通過與支架上面的相鄰的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)內(nèi)進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞增殖。加入U(xiǎn)BM粒子促進(jìn)在支架更深層內(nèi)的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮生長，并且內(nèi)皮細(xì)胞采取毛細(xì)管樣形態(tài)學(xué)。內(nèi)皮細(xì)胞沿著UBM粒子的表面被引導(dǎo)，而非移動(dòng)進(jìn)入U(xiǎn)BM粒子內(nèi)。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在支架中包含UBM粒子導(dǎo)致內(nèi)皮生長和分化的非常明顯的改善。不同的成纖維細(xì)胞群不產(chǎn)生不同的結(jié)果。MPEG-PLGA支架(圖4)和在MPEG-PLGA中含23%(w/w)UBM(圖5)顯示了在MPEG-PLGA支架的表面內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長，其中生長向內(nèi)達(dá)到容納UBM粒子的深度(內(nèi)皮被染成紅色(以黑色顯示)-成纖維細(xì)胞不可見)。內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)管樣形態(tài)學(xué)在容納23%(w/w)UBM的MPEG-PLGA支架的更深層中被發(fā)現(xiàn)(圖6)。這些結(jié)構(gòu)在MPEG-PLGA支架中不可見。實(shí)施例8:在雙組分生物相容性的惰性纖維中的離散的ECM粒子。使用在15(TC-18(TC下操作的Dr.CoIMn擠出機(jī)將20gECM配合到得自Noveon的180gTecoflex⑧(EG-80A)中。使用串聯(lián)造粒機(jī)對(duì)該配合物進(jìn)行造粒，提供包含約10。/。的ECM粒子的200克氨基甲酸酯小球。將配合的Tecoflex⑧小球進(jìn)料到經(jīng)改進(jìn)的FET實(shí)驗(yàn)室纖維共擠出機(jī)中。將0.2mm直徑的用氧等離子體處理的PP纖維進(jìn)料到中心，將經(jīng)配合的Tecoflex⑧在PP纖維上進(jìn)行共擠出，得到0.3mm直徑的單絲。然后將雙組分單絲拉伸，以便降低單絲的最終直徑。該雙組分單絲包含在Tecoflex⑧表面上可觸及的ECM粒子。圖1:在MPEG-PLGA支架中ECM粒子的分布的數(shù)字圖象。圖2:MPEG-PLGA支架的SEM照片(放大率250倍)。圖3:包括40%的ECM粒子的MPEG-PLGA的SEM照片(放大率250倍)。圖4:在MPEG-PLGA支架中的內(nèi)皮生長的數(shù)字圖象。圖5:在包括23。/。ECM粒子的MPEG-PLGA中的內(nèi)皮生長的數(shù)字圖象。圖6:在包含23y。ECM粒子的MPEG-PLGA中的內(nèi)皮生長的數(shù)字圖象，顯示在支架的更深層中毛細(xì)管樣形態(tài)學(xué)的放大圖。2權(quán)利要求1.包含至少部分地被包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料覆蓋的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片。2.權(quán)利要求1的網(wǎng)片，其中生物相容性的惰性材料選自PP，PE，通過茂金屬催化獲得的聚合物，硅氧烷，特氟隆(氟烴)和聚氨酯。3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中生物相容性的惰性材料是聚丙烯。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中惰性材料在一面上用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的臨時(shí)性的連續(xù)材料涂覆。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中惰性材料完全被包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料覆蓋。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中連續(xù)材料是生物可降解的。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中ECM的非連續(xù)區(qū)域均勻分布。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中連續(xù)材料具有開放的連通孔。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中連續(xù)材料具有0.05-1毫米的厚度。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的網(wǎng)片，其中網(wǎng)片以不透細(xì)菌的方式被包裝，在包裝上具有該產(chǎn)品經(jīng)過殺菌的標(biāo)記。11.包含在表面上具有ECM粒子的非連續(xù)區(qū)域的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片。12.治療疝氣的方法，包括以下步驟將包含在一面上用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料涂覆的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片以被涂覆面朝向腹壁的方式放置在患者體內(nèi)覆蓋疝氣部位。13.治療尿失禁的方法，包括以下步驟將包含在兩個(gè)末端用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料涂覆、中央部分未被涂覆的生物相容性的惰性材料的細(xì)長形網(wǎng)片放置在尿道周圍，從而所述中央部分包圍尿道并且所述末端能夠進(jìn)行錨固。14.治療骨盆下垂的方法，包括以下步驟將包含用包含ECM的非連續(xù)區(qū)域的連續(xù)材料完全涂覆的生物相容性的惰性材料的網(wǎng)片放置在下垂部位。全文摘要本文公開了胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的非連續(xù)區(qū)域在促進(jìn)網(wǎng)片中的細(xì)胞生長中的應(yīng)用。當(dāng)所述支架被施用于惰性材料上面時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長并且適當(dāng)?shù)毓潭ňW(wǎng)片的附著。在一個(gè)方面，所述網(wǎng)片具有減弱的細(xì)胞向內(nèi)生長的面和具有增強(qiáng)的細(xì)胞向內(nèi)生長的面。將惰性材料與細(xì)胞吸引性材料諸如ECM的組合可實(shí)現(xiàn)這一效果。這對(duì)于疝氣植入而言特別有利。這里，網(wǎng)片將僅附著于腹壁(在網(wǎng)片的一面上)，而不附著于腸。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，惰性材料是細(xì)長形的并且在兩個(gè)末端被涂覆。這對(duì)于懸吊索而言特別有利。這里，網(wǎng)片將在懸吊索的末端附著于錨固點(diǎn)，當(dāng)仍允許由膀胱排空引起的尿道重分布。文檔編號(hào)A61L27/36GK101626791SQ200880007469公開日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日發(fā)明者延斯·赫格·特魯爾森,漢內(nèi)·埃韋爾蘭德,萊內(nèi)·費(fèi)爾德斯科夫·尼爾森申請(qǐng)人:科洛普拉斯特公司