作為治療劑的色酮的制作方法

文檔序號：1142679閱讀：1251來源：國知局

專利名稱：作為治療劑的色酮的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及色酮和新型色酮組合物的分離和鑒定，其可
有效增強脂肪細胞的脂連蛋白生產，并且調控參與脂肪酸生物合成、脂肪
酸的線粒體P-氧化、類固醇生物合成、糖異生作用、脂肪轉運、PPARo/RXRa 肝信號轉導和異生素(xenobiotic)代謝的基因。本發(fā)明包括用于預防和治療胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥的方法。
背景技術：
肥胖癥、糖尿病和代謝綜合征已迅速地成為全球性流行病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的公布，在2005年約有4億成年人肥胖，而預期到2015年將有7億以上的成年人肥胖。肥胖癥是很多慢性疾病，包括心血管疾病和糖尿病的主要致病因素。在 Third National Health and Nutrition ExaminationSurvey (1988-1994)中，對由年齡為20歲或以上的8814名男女獲得的數(shù)據(jù)
進行的分析表明未調整的代謝綜合征發(fā)病率和按年齡調整的代謝綜合征發(fā) 病率分別為21.8%和23.7%。使用2000年的人口普査數(shù)據(jù)，約有4700萬美國居民可能患有代謝綜合征(Ford等(2002) JAMA 16:359)。在肥胖的兒童和青少年中，代謝綜合征的發(fā)病率非常高，其隨著肥胖癥的嚴重程度而提高并且在重度肥胖的年輕人中的比例達到50% (Weiss等(2004) "Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents." N Eng J Med 350:2362-2374)。在這些年輕人中已經出現(xiàn)表明不良心血管事件風險提高的生物標記。發(fā)現(xiàn)代謝綜合征及其單個癥狀不僅存在于肥胖人群中，也存在于體重正常和略重的個體中。已有令人信服的證據(jù)指出胰島素抵抗是代謝疾病問題的根源 (Reaven GM.(1998) Diabetes 37:1595-1607)。在根據(jù)民族或種族以及肥胖度進行調整后，代謝綜合征的發(fā)病率隨著胰島素抵抗的增大而顯著提高(按趨勢計，P<0.001)， (Weiss等(2004) "Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents." N Eng J Med 350:2362—2374)。胰島素抵抗是對正常循環(huán)系統(tǒng)胰島素濃度的響應下降的狀態(tài)(Saltiel AR (2000) J Clin. Invest. 106:163-164)，并且是II型糖尿病的主要病因。胰島素抵抗與肥胖、生活方式以及遺傳因素相關(KadowakiT(2000)JClin. Invest 106:459-465; Stem M (2000) J Clin. Invest. 106:323-327)。動物實驗清楚地表明胰島素受體和胰島素信號轉導途徑的遺傳缺陷與n型糖尿病中胰島素抵抗的發(fā)病機理有關。例如，在胰島素受體敲除小鼠的肌肉、肝和脂肪組織中有明顯的胰島素作用缺陷。這些小鼠還顯示出高胰島素血癥和嚴重的糖尿病。PI3激酶 (PI3K，胰島素信號轉導級聯(lián)中的關鍵信號轉導酶)活性提高的小鼠由于骨骼肌和脂肪細胞中的葡萄糖轉運提高而顯示出胰島素敏感性升高和低血糖癥(KadowakiT (2000) J Clin. Invest. 106:459-465)。類似地，Akt2(PI3K下游的激酶)缺陷小鼠顯示出胰島素抵抗降低以及肌肉葡萄糖轉運提高(Cho 等2001 Science 292:1728)。對于人類，最近的研究集中于胰島素抵抗和糖尿病的遺傳基礎和生理學。在PPARy2-特異性B外顯子中帶有部分"失去功能"的Prol2Ala 突變的對象具有較低BMI、較高胰島素敏感性和改進的脂譜(lipid profile) 的組合(Deeb等(1998) Nat Genet 20:284-287; Alhuler等(2000) Nat Genet 26:76-80)。 Prol2Ala多態(tài)性的生理結果在很大程度上取決于混同的遺傳和環(huán)境因素。帶有Proll5Gln功能獲得性(gain-of-fUnction)突變的對象特別肥胖并對胰島素敏感(Ristow等(1998) N Engl J Med 339:953-959)，這與 PPARY在刺激脂肪細胞分化中的作用相符。另一方面，顯性負突變例如 Pro495Leu、 Val318Met、 Phe388Leu禾Q Arg425Cys與部分脂肪營養(yǎng)不良、嚴重胰島素抵抗糖尿病以及高血壓相關(Savage等(2003) Diabetes 52:910-917; Agawal和Garg (2002) J Clin Endocrinol Metab 87:408-411)。人類遺傳疾病——青少年發(fā)病的成年型糖尿病(MODY)的特征為在25歲前糖尿病的臨床發(fā)病、常染色體顯性模式遺傳以及胰腺卩細胞功能的原發(fā)性缺陷?，F(xiàn)已鑒定出6個MODY基因MODYl，肝細胞核因子-4a (HNF-4a); MODY2，葡糖激酶；MODY3， HNF-la; MODY4，胰島素促進因子-1 (IPF-1); MODY5， HNF-ip;和MODY6， P-細胞E盒反式激活因子或NeuroDl(Fajans等(2001) N Engl J Med 345:971) 。 MODY基因參與胰腺J3-細胞中的異?；虮磉_和葡萄糖代謝，從而導致(3-細胞功能紊亂。 II型糖尿病是復雜且異源性的多成因疾病。雖然能夠對糖尿病病理生理學提供一些知識，但MODY的罕見單基因形式并不能捕獲人類糖尿病的病因譜。很多基因組學研究組曾利用人基因組范圍掃描以在多個易感種族中使用遺傳性多態(tài)性來搜索糖尿病和胰島素抵抗位點(McIntyre 和Walker (2002) Clin Endocrinol 57:303) 。 15號染色體上的1^蛋白酶-10基因是對墨西哥-美洲裔種族的252個同胞對(sib-pairs)使用基因組范圍掃描而鑒定出的首個基因，其隨后使用對其他種族的研究而得到確認。臨床研究表明鈣蛋白酶-10是影響胰島素對肌肉組織的作用以及胰腺卩細胞分泌胰島素的因素之一。對鈣蛋白酶-10缺失小鼠的研究表明鈣蛋白酶-10在分泌胰島素的胰腺P細胞中介導脂肪酸誘導的凋亡(Horikawa等(2000) NatGenet 26:163; Weedon等(2003) Am J Hum Genet 73:1208)。對人類糖尿病基因的搜索遠未結束，在16號染色體上的FTO就是近期的發(fā)現(xiàn)。功能未知的FTO與BMI相關，并在人數(shù)總計39,000人的多個糖尿病研究中得到證實(Kaiser (2007) Science 316:185)。此外，通過對候選基因的相關研究，還發(fā)現(xiàn)KCNJ11 (p細胞ATP-敏感性鉀通道的內向整流亞基(inward-rectifier subunit))和HNF-4a基因為NIDDM基因(Taylor (2007) Diabetes 56:2844)。
游離脂肪酸(FFA)或許是胰島素抵抗的病理生理學中最重要的因素。耶魯大學的Shulman研究小組現(xiàn)己在臨床研究中使用同位素13C、 "P和^通過非侵入性磁共振波譜追蹤肌肉糖原合成、葡萄糖攝取以及葡萄糖-6-磷酸濃度。在高胰島素-正常葡萄糖鉗夾下的健康人類對象中，使用脂質輸注以維持高血FFA水平，胰島素抵抗逐步發(fā)展，在脂質輸注4-6小時后，受胰島素剌激的肌肉葡萄糖攝取下降達50%且肌肉糖原合成和葡萄糖氧化下降達50%，同時胰島素刺激的IRS-l-相關PI3K活性下降>90% (Roden等(1996) J Clin Invest 97:2859; Dresner等(1999) J Clin Invest 103:253)。過氧化物酶增殖體激活受體(PPAR)是核受體超家族的亞類。 PPAR是配體依賴性轉錄因子，其作為與維甲類X受體的異源二聚體與特異的DNA響應元件結合。該配體結合導致對染色質凝縮共活化復合物的優(yōu) 選募集并有利于共抑制復合物的解體(Glass (2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi: 10.1172/JCI129713)。此外，PPAR可通過與其他轉錄因子競爭而間接影響基因表達，其通常為負影響(Gervois等(2001). J. Biol. Chem. 276:33471-33477) 。PPAR家族有3個成員PPARa、PPARS(或PPAR|3) 和PPARY。大量實驗證據(jù)將3個核受體與脂質和糖類代謝的調控及協(xié)調相關連。很好地確立了這3種蛋白與多種疾病(包括糖尿病、肥胖癥、血脂異常和炎癥)的關聯(lián)。這3種PPAR在不同組織中的表達不同(Semple等. (2006)。 PPARa在肝、腎和心臟中的表達最高。PPARy優(yōu)選在脂肪組織和巨噬細胞中表達。PPAR5的表達廣泛存在，但在脂肪組織、皮膚和腦中的表達最高。這3種核受體參與多個細胞過程。PPARa或PPAR5的活化導致脂肪酸卩氧化提高。PPARa參與脂蛋白合成和氨基酸分解代謝。PPARy在脂肪細胞的分化中至關重要。這些蛋白具有不同的生理功能。PPARa協(xié)調組織對禁食的代謝響應，其中PPARy的表達在餐后增加，且其活化導致在脂肪組織中介導脂肪酸攝取的基因上調。PPARY是協(xié)調脂肪細胞分化的關鍵轉錄因子。PPARS的生理功能尚未被徹底了解。然而，最近的證據(jù)表明其可能是肌纖維型的調控因子，而該蛋白的活化導致對肥胖癥的抗性以及改進的代謝譜(Wang等(2004). PloS Biology 2:e294)。可能有多個途徑與胰島素抵抗相關。脂肪組織中的PPARy活化上調了參與脂肪酸捕獲的基因的轉錄(Semple等(2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi:10.1172/JCI128003) 。 PPARy活化內皮月旨蛋白月旨肪酶(LPL) 和脂肪酸轉運蛋白(FATP和CD36)，其分別促進脂蛋白甘油三酯的水解和脂肪細胞對FFA的攝取。該過程通過減少循環(huán)系統(tǒng)中的脂質并引導脂質進入對胰島素敏感的組織(例如肌肉和肝臟)來提高胰島素敏感性(Semple等 (2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi:l0,1172/JCI 128003) 。 PPARy現(xiàn)已被充分表征。PPARY的重要作用通過純合PPARy缺陷型小鼠的胚胎致死性得到證明(Tsuchida等(2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170)。在野生型小鼠中，也可通過高脂肪飲食誘導肥胖癥和胰島素抵抗。然而，高脂肪飲食誘導的肥胖癥或胰島素抵抗在雜合PPARy缺陷型小鼠中被阻止(Tsuchida等 (2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170)。例如，向雜合PPARy (+/-)小鼠飼喂高脂肪飲食后，此類小鼠的胰島素抵抗低于野生型小鼠，且具有較少的脂肪細胞。此類小鼠還具有較低的脂肪酸水平和提高的血漿瘦蛋白水平(Kubota 等(1999) Mol Cell 4:597-609; Tsuchida等(2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170)。然而，通過使用PPARy激動劑處理小鼠降低了雜合PPAR 缺陷的保護作用。噻唑烷二酮(TZD)類胰島素敏感化藥(Lehmann等 (1995). J. Biol. Chem. 270:12953-12956)反而降低了 PPARy (+/-)小鼠的胰島素敏感性。這些結果表明PPARY介導了高脂肪飲食誘導的肥胖癥和胰島素抵抗，且抑制PPARY可使動物或人對胰島素抵抗的內源和外源誘因的易感性減小。另一方面，TZD在飼喂高脂肪飲食的野生型小鼠中對PPARY的超生理活化同樣改進了胰島素敏感性，但同時也誘導了脂肪細胞分化。實驗
證據(jù)表明PPARy活性的下調和上調均改善了胰島素敏感性。 PPARa是內源脂肪酸及其衍生物的分子傳感器。其在肝臟和骨骼肌的葡萄糖平衡和脂質代謝中發(fā)揮關鍵作用。已證明PPARa激動劑(例如纖維酸鹽(fibrate))可有效減少脂質(Lefebvre等(2006). J. Clin. Invest. 116:571-580. doi:10.1172/JCI27989)。在嚙齒動物中，PPARa激動劑Wyl4643 改善了 KKAy小鼠的胰島素敏感性并增強了 PPARY激動劑羅格列酮的抗糖尿病作用(Tsuchida等(2005) Diabetes 54:3358-3370) 。 Wyl4643可預防脂肪細胞肥大(Tsuchida等(2005) Diabetes. 54:3358-3370)。最近發(fā)現(xiàn)PPAR5作為代謝調節(jié)因子存在于多種組織中，包括脂肪、骨骼肌和心臟(Barish等(2006) J. Clin. Invest. 116:590-597)。其增強脂肪酸分解和能量的解偶聯(lián)，從而導致甘油三酯貯存減少以及耐力提高。在小鼠骨骼肌中靶向表達活化形式的PPARS使其具有肥胖癥抗性及改進的代謝譜(Wang等(2004). PloS Biology 2:1532-1539)。體內PPAR活性的調控對維持正常的胰島素敏感性從而響應飲食和其他環(huán)境影響至關重要。小鼠遺傳研究為理解核受體與環(huán)境因素的復雜相互作用提供了極好的機會。PPAR活性可被不同的調節(jié)劑調控。 PPARs與不同的配體相互作用，導致不同靶基因集的活化。結果，由于不同的親和力以及調控劑對PPARs的作用而產生了不同的轉錄活性和藥理作用。PPARs的調節(jié)劑可被分成多個組，包括完全激動劑、部分激動劑、拮抗劑和共激動劑(Knouff和Auwerx (2004) Endocrine Review 25:899-918)。現(xiàn)已研發(fā)出多種PPAR完全激動劑。羅格列酮和吡格列酮是在臨床上用于治療II型糖尿病的兩類TZD(Lehmann等(1995) J Biol. Chem 270:12953-12956)。盡管這些PPARy激動劑減少胰島素抵抗并降低血漿葡萄糖水平，但完全激動劑具有嚴重的副作用，包括由于脂肪量增加而使體重增加和水腫、體液潴留、血液稀釋，并在多達15%的患者中導致心衰(Mudaliar等(2003). Endocr. Pract. 9:406-416)。一些TZD還與顯著的肝毒性相關。盡管已積極地追蹤到新的分子藥物靶，但是用于預防或治療代謝綜合征多個方面的藥物療法在選擇和成功率上仍受到限制。其他胰島素敏感化途徑包括脂肪細胞產生的改變的脂肪因子譜，包括TNFcu IL-6、 CRP、 PAI-1、血管緊張素原、抵抗素、瘦蛋白和脂連蛋白(Lau 等 (2004). Am. J. Physiol Heart Cir. Physiol 288:H2031-H2041)。這些脂肪因子對胰島素抵抗和血管內平衡有重要的作用。在這些蛋白中，脂連蛋白是來自脂肪細胞的介導胰島素敏感化激素中被表征最好的一個。TZD在肥胖小鼠和具有胰島素抵抗的肥胖人體內刺激脂連蛋白基因表達并提高循環(huán)系統(tǒng)中的脂連蛋白濃度(Maeda等(2001) Diabetes 50:2094-2099)。由于脂連蛋白通過提高胰島素敏感性而改進葡萄糖耐受，因此TZD對脂連蛋白分泌的影響可至少部分地解釋TZD在患有 II型糖尿病的患者體內的降血糖作用。還有其他途徑參與人體內的胰島素敏感化。例如，瘦蛋白也在嚙齒動物中顯示出改善胰島素敏感性。在脂肪缺乏性小鼠(lipoatmpic mice)中，施用生理劑量的脂連蛋白和瘦蛋白的組合導致胰島素敏感性的完全恢復，但在單獨使用脂連蛋白或瘦蛋白處理個體時，僅觀察到部分的胰島素敏感化(Yamauchi等(2001)。瘦蛋白降低脂肪生成酶的表達并由此活化肝臟、褐色脂肪組織和骨骼肌中的PPARa途徑，從而導致UCP-2以及參與P-氧化的酶表達增加。在人體中，體重下降并未使胰島素敏感性改善的個體中的血漿脂連蛋白濃度發(fā)生變化(Abbasi等(2004) Metabolism 53:280-283)。在另一研究中，證明通過運動訓練而使胰島素敏感性改善并不是人體內脂連蛋白水平變化的結果(Marcell等(2005), Metabolism 54:533-41)。該數(shù)據(jù)表明存在用于胰島素敏感化的其他途徑，并且有不同的機制參與了體重降低后以及用TZD化合物治療后胰島素敏感性的改善。色酮是如下通式結構所示的以苯并吡喃-4-酮作為其主要骨架結構的一類特定的芳香族化合物<formula>formula see original document page 21</formula>Ri\
其中
R卜R2、 R3、 R4、 R5和R6獨立地選自由以下組成的組-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羥基垸基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X_，選自由沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基酯和羥基-肉桂?；?、三羥基苯甲?；ズ涂Х弱；ソM 成的組的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自由戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物組成的組；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；
其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈，并在不同的位置具有禾B/或不具有雙鍵和選自由-OH、 =0和-OR組成的組的取代基團；
X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根等；和 R為具有1-20個碳原子的烷基基團。
迄今為止，僅有183種由天然源分離的色酮(The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall/CRC， Version 5:1 June 2001)。據(jù)報道，色酮具有單胺氧化酶抑制活性(Fujimoto等(2002) Chem. Pharm. Bull. 50:330-336)、酪氨酸酶抑制活性(Oiao等(2002) Chem. Pharm. Bull. 50:309-311)、抗血小板作用(Leoncini等(1991) Pharmacol. Res. 23:139-148)、對經口病原的生長抑制活性(Cai (1996) J. Nat. Prod. 59:987-990)、前列腺素H合成酶抑制活性(Jurenka等(1989) Comp. Biochem. 93:253-255)。色酮還具有抗大鼠體內II型膠原誘導的關節(jié)炎的治療效果(Inaba等(2000) Chem. Pharm. Bull. 48:131-139)以及降血脂活性 (Witiak等(1975) J. Med. Chem. 18:935-942; Tetko等(1995) Bioorg Khim.21:809-815)。已報道色酮能夠起選擇性ci受體配體的作用(Erickson等 (1992) J. Med. Chem. 35:1526-1535)。基于動物研究，色酮易于被吸收和代謝(Crew等(1976) Xenobiotica 6:89-100)，并且可通過人腸道細菌切割蘆薈苦素(aloesin)的c-葡糖基鍵。蘆薈是包含多種生物活性物質的復雜的植物(Dagne等 (2000) Current Org. Chem. 4:1055-1078; Cohen 等 in Wound Healing/Biochemical and Clinical Aspects, 1st ed. WB Saunders, Philadelphia (1992))。已知的蘆薈品種超過300種，其中大部分產自非洲。研究發(fā)現(xiàn)生物活性物質位于蘆薈葉的隔離部分(位于葉中部的澄清凝膠片(gel fillet)) 中、葉外皮(leafrind)或葉皮層中，以及葉外皮和內部凝膠片之間的維管束中柱鞘細胞中包含的被稱為蘆薈膠的黃色流體中(Dagne等(2000) Current Org. Chem. 4:1055-1078)。位于葉中部的澄清凝膠片包含水溶性多糖、有機酸、氨基酸和無機鹽。庫拉索蘆薈膠(Aloe vera gel)由該戸薈植物的部分產生。葉外皮或葉皮層以及維管束中柱鞘細胞中包含的黃色流體包含芳香族化合物，例如蒽醌、色酮、有機酸、酶、維生素、鹽和其他多種化合物。全葉蘆薈膠通過研磨整棵蘆薈植物產生，其包含所有水溶性組分的內含物，包括蒽醌、色酮、多糖和其他化合物。由于蒽醌的顏色和光毒性、GI刺激性、細胞毒性和其他副作用，因此要將全葉蘆薈膠進行加工以除去所有的芳香族組分，包括蒽醌和色酮(International J. Toxicology (2007)， 26 (suppl,2):l-50)。歷史上，蘆薈產物已在用于治療燒傷、疼痛和其他創(chuàng)傷的皮膚敷用物中使用。這些應用已激勵人們進行了大量研究以從蘆薈植物中鑒定具有臨床活性，特別是抗炎活性的化合物。(參見，例如Grindlay和 Reynolds (1986) J. of Ethnopharmacology 16:117-151; Hart等(1988) J. of Ethnopharmacology23:61-71)。作為這些研究的結果，現(xiàn)已有很多關于具有不同生物活性的蘆薈化合物的報道，包括抗癌活性、抗胃潰瘍活性、抗糖尿病活性、抗酪氨酸酶活性和抗氧化劑活性(International J. Toxicology (2007), 26 (suppl,2):l陽50)。
已報道從各種蘆薈品種分離的色酮具有不同的生物活性。據(jù) 報道蘆薈苦素抑制酪氨酸酶活性(Jones等Journal of Pigment Cell Research, Acceptance, Feb. 10th. 2002)并上調依賴細胞周期調節(jié)蛋白E的激酶活性 (Lee等(1997) Biochem.Mol. Biol. Int. 41:285-292)。從巴巴多斯戸薈U/oe 6GA^/ms/s)分離的c-糖基色酮顯示出抗炎活性(Hutter等(1996) J. Nat Prod. 59:541-543)，并且基于大鼠腦勻漿模型顯示出與a-生育酚相似的抗氧化劑活性(Lee等Free Radic Biol. Med. 28:261-265)。巴巴多斯蘆薈葉及其苦味成分顯示出對正常和阿脲糖尿病小鼠血糖水平的作用(Ajabnoor (19卯)J. Ethnopharmacol. 28:215-220)，而且多個蘆薈品種的干汁液在臨床研究中顯示出抗糖尿病活性(Ghannam, (1986) Horm Res. 24:288-294)。蘆薈膠或提取物的抗糖尿病作用已經在低劑量鏈脲霉素誘導的糖尿病動物模型中得到證實(Beppu (2006) J Ethnopharmacol. 103(3):468謹77; Rajasekaran (2006) Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(3):232陽7)。此類抗糖尿病作用被報道為通過酚類和其他分子量低于10KDa的化合物保護胰島B細胞免于受到鏈脲霉素誘導的選擇性毒性(Rajasekaran (2006) Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(3):232-7)。據(jù)報道來自庫拉索蘆薈膠的其他成分，例如無機物(Rajasekaran (2005) Biol. Trace Elem. Res. 108(1-3):185-195)和抗氧化劑(Rajasekaran (2005) Pharmacol. Rep. 57(l):90-96)也與抗糖尿病作用相關。最近，獲自蘆薈凝膠的5種植物甾醇被鑒定為抗糖尿病組分 (Tanaka (2006) Biol. Pharm. Bull. 29(7): 1418-1422)。在2007年，對好望角蘆薈U/oe/woc)葉凝膠的化學成分進行了徹底分析，并推測了其潛在的抗氧化性質以及在緩解癥狀和/或預防糖尿病中的潛在應用(Loots (2007) J Agric. Food Chem. 55(17):6891-6896)。美國專利第6,780,440號公開了用于糖尿病和體重控制的包含蘆薈的草藥組合物。然而并未鑒定出主要的活性成分及作用機理。在美國專利第5,88,984號中，要求保護將獲自蘆薈的復雜糖類作為用于糖尿病治療的組合物之一。在美國專利第4，598，069號中，也要求保護將蘆薈多糖用于治療低血糖癥。在美國專利第5,627,204號中公開了可以作為醛糖還原酶抑制劑而用于預防和治療糖尿病的具有不同取代模式的合成色酮衍生物。美國專利第6,133,305號要求保護用于治療蛋白激酶相關疾病(包括糖尿病) 的具有色酮骨架的合成化合物。 Yagi等人公開了從戸薈分離的一類化合物，特別是蘆薈苦素及其衍生物之一——2"-0-阿魏酰戸薈苦素，其是酪氨酸酶的有效抑制劑 (Yagi等(1987) Plant Medica 515-517)。戸薈苦素是C-糖基化的5-甲基色酮(Holdsworth (1972) Chromones in Aloe Species, Part I-Aloesin PM 19(4):322-325)。在體外，蘆薈苦素是酪氨酸酶活性的強抑制劑(Yagi等 (1987) Planta Medica 515-517)。標題為"Aqueous Composition Comprising Active Ingredients for the De-Pigmentation of the Skin "的美國專利第 6,123,959號描述了包含磷脂脂質體和用于黑色素合成的酶的至少一種競爭性抑制劑以及與用于黑色素合成的酶的至少一種非競爭性抑制劑的組合的水性組合物。美國專利第6,884,783號公開了 7-羥基色酮(包括蘆薈苦素和 aloesinol)作為強效抗氧化劑用于預防和治療與活性氧類別(ROS)損傷及其他氧化應激相關的疾病和病癥。迄今為止，用于純化蘆薈苦素以及其他色酮的已知方法包括使用色譜法。(參見，例如Ra廳ld和Beil (1993) J. of Chromatography 639:359-362;Rauwald和Beil (1993) Z. Naturforsch 48c:l-4; Conner等(1990) Phytochemistry 29:941; Holdsworth (1972) Chromones in Aloe Species, Part I畫Aloesin PM 19(4):322-325; Mebe (1987) Phytochemistry 26:2646; Haynes 等(1970) J. Chem. Soc. (C) 2581; McCarthy和Haynes (1967) The Distribution of Aloesin in Some South African Aloe Species; Heft 3 342》這些方法是為化學分析而研發(fā)的，并不適合應用于蘆薈苦素的制備級生產。在標題為"Method of Purification of Aloesin "的美國專利第6,451,357號中公開了使用結晶作用純化蘆薈苦素的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明描述了來自植物來源的色酮和新型色酮組合物的鑒定和分離，所述色酮和新型色酮組合物上調脂肪細胞的脂連蛋白生產并使與葡萄糖和脂肪酸代謝及信號轉導相關的上百個基因正?；ＩM合物可有效增強脂肪細胞的脂連蛋白生產并調控參與脂肪酸生物合成、脂肪酸的線粒體p-氧化、類固醇生物合成、糖異生作用、脂肪轉運、PPARa/RXRa 肝信號轉導和異生素代謝的基因。色酮組合物可被用于提高哺乳動物中的胰島素敏感性、改善葡萄糖耐受、降低甘油三酯水平以及平衡葡萄糖水平。本發(fā)明還包括用于預防和治療多種疾病和病癥的方法，所述疾病和病癥包括但不限于胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥。本發(fā)明包括用于預防和治療代謝綜合征以及由哺乳動物中的胰島素抵抗介導的疾病和病癥的方法。該方法包括向有此需要的對象給藥有效量的包含一種或多種色酮的藥物組合物或營養(yǎng)組合物。色酮或色酮混合物可分離自單個或多個來源，包括但不限于通過合成獲得、天然存在或其任意組合。在一個實施方案中，本發(fā)明描述了用于提高脂肪細胞的脂連蛋白生產的方法，其包
括向有此需要的對象給藥有效量的色酮或色酮的混合物；其中所述色酮或色酮的混合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明描述了用于使高脂肪飲食誘導的有關脂肪酸生物合成、脂肪酸的線粒體P-氧化、類固醇生物合成、糖
異生作用、脂肪轉運、PPARa/RXRa肝信號轉導和異生素代謝的基因表達變化正?；姆椒?，所述方法包括向有此需要的對象給藥有效量的包含色酮或色酮混合物的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括用于預防和治療胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥的方法，所述方法包括向有此需要的對象給藥有效量的包含色酮或色酮混合物的組合物?？砂凑障挛乃鍪褂玫纳ㄈ缫韵峦ㄊ浇Y構所示的化合
25物:<formula>formula see original document page 26</formula>
其中
RM R2、 R3、 R4、 R5和R6獨立地選自由以下組成的組-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羥基烷基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X'，選自包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂?；ズ土u基-肉桂酰基酯、三羥基苯甲酰基酯和咖啡?；サ慕M的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物的組；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；
其中所述垸基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自由-OHrO和-OR組成的組的取代基團；
X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根等；和 R為具有1-20個碳原子的垸基基團和藥學上可接受的載體。
在一個實施方案中，色酮為選自具有以下通式結構的化合物組的苯并吡喃-4-酮(7-羥基色酮)
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其中R,、 R2和R3的定義如上所述。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，色酮選自蘆薈苦素和/或 aloesinol，其結構如下所示。
戸薈苦素 Aloesinol本發(fā)明的色酮可以通過合成方法獲得或可以分離自眾多的植物科屬，包括但不限于金合歡屬C4cac7'a)、水團花屬G4&"力、蘆薈屬(j/oe)、鏈格孢屬G4/fer"an'a)、崖摩屬(Jwoora)、五月茶屬04""ofeswfl)、蒿屬 (j/"tow'w'a)、崗松屬(5aech'a)、決明屬(Cosw'a)、書帶木屬(C/w"a)、蛇床屬 (O Wm附)、方龍花屬(Co"vo/vw/iw)、淫羊藿屬(￡/ z>wWww)、雞頭暮屬 (￡n'owma)、艾里奧斯特門屬(五n'o^ewo")、番櫻桃屬(EMgew/a)、藤黃屬
(G"rc/"/")、金絲桃屬CftTj;;^r/CMW)、鐘萼草屬(丄/"fife"Z)^g/a)、全能花屬
(戶awcra^wm)、青霉菌屬(尸ew/c/〃/wm)、蓼屬(戶o/ygowwm)、 i^aero;qy/ow、大黃屬(及/^ww)、槐屬(5b; /K ra)、冠網蝽屬(5^/7/^"/&)、蒲桃屬(^^^'MW)、籃狀菌屬(ra/aramyce"和Zom^z'a。在優(yōu)選的實施方案中，植物選自包括但不限于兒茶(^c"c/" c她c/m)、金合歡(y4ca"'a 、木立戸薈(J/oe
ar6omsce—、巴巴多斯戸薈(J/oe 6ar6acfe腦》、爿/oe cre腦o/ Ma、好望角戸薈(」/oe/erax)、皂質戶薈(^/oe sapowan'a)、庫拉索戸薈G4/oe vera)、中華戸簽(J/oe vera var. c/w'ne"57's)、/wew6/-flwaceww、茵P東嵩(J/^^w/w'a cap/〃an'as)、崗豐公(5aecA:/a^Mfesce"s)、箭卩十垂羊藿(_￡尸// ￡(^'1/附sagz'"a w附)、爪卩圭鳳果(Garcz'w/a c w/c&)、土也耳草(/^;/ eWcwmyapow/cwm)、虎杖(尸o(ygowwm CM^spz,ctowm)、毛苦參(5bp/zora tomewtosa)禾口 iS e/ /zam'他r/zO(iocfe"(ir/的組。在一個實施方案中，色酮分離自好望角蘆薈G4/oe/era;c)、庫拉索蘆薈G4/oe vera) 或巴巴多斯蘆薈C4/oe 6arkKfe"&)的全葉。
色酮可以在植物的各個部位中找到，包括但不限于莖、莖皮、干、干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、幼芽、種子、根莖、花和其它生殖器官、葉和其它氣生部分。本發(fā)明描述了從包含這些化合物的植物中分離和純化色酮。本發(fā)明的方法包括a)提取包含色酮(特別是選自蘆薈苦素或aloesinol的色酮)的植物的地上生物量(groundbiomass); b)中和并濃縮所述提取物；和c)
使用色譜法純化所述經中和及濃縮的提取物，所述色譜法包括但不限于聚酰胺、LH-20、 XAD樹脂、CG-161樹脂、硅膠或反相色譜。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用選自由重結晶、沉淀、溶劑分配和/或色譜分離組成的組的方法純化提取物。本發(fā)明提供了用于分離和純化具有期望的生理活性的色酮的商業(yè)可行方法。用于在藥物制劑中給藥的產物可通過本領域技術人員熟知的多種方法進行制備。色酮可以以如下形式配制其天然存在形式的草藥粉末；不同濃度的溶劑和/或超臨界流體提取物；通過重結晶、柱分離、溶劑分配、沉淀和其他方式富集和純化的化合物；通過合成方法制備的純色酮和/或包含基本純的色酮的混合物。本發(fā)明人已使用可接受的動物模型證明給藥色酮或其混合物例如蘆薈苦素和/或aloesinol或分離自多種植物來源如好望角蘆薈葉滲出物的包含色酮混合物的提取物；以及庫拉索蘆薈膠或庫拉索蘆薈全葉膠粉和提取物可以降低胰島素抵抗，同時降低胰島素水平、維持低空腹血糖水平并顯著降低甘油三酯水平，同時不影響食物攝取和體重。分離自含色酮的植物例如庫拉索戸薈和好望角蘆薈以及其他植物品種的一種或多種色酮和 /或色酮標準化提取物在改善胰島素抵抗及降低空腹血糖水平中的新用途在此前尚未被描述過。所公開的色酮可被用作胰島素敏感化劑和預防劑以預防和治療哺乳動物(包括但不限于人)的代謝紊亂，包括但不限于胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、代謝綜合征、血脂異常、高甘油三酯血癥和高甘油三酉旨血癥?？赏ㄟ^本領域普通技術人員已知的任何方法給藥本發(fā)明的組
28合物。給藥模式包括但不限于經腸(口)給藥、胃腸外(靜脈內、皮下和肌肉
內)給藥和局部給藥。本發(fā)明的治療方法包括向有此需要的患者中給藥或局部給藥藥學上有效量的單獨的色酮和/或色酮混合物，其分離自單個來源或
多個來源，包括但不限于通過合成獲得、天然存在或其任意組合。單獨的
色酮和/或色酮混合物的純度在0.01%-100%的范圍內，這取決于用于獲得
該化合物的方法。在口服給藥、注射給藥、局部給藥、氣霧劑、栓劑、皮
內給藥中色酮組合物的濃度可以為適合的制劑的總重量的0.001重量 %-99.99重量％。可通過選自由口服給藥、局部給藥、氣霧劑、栓劑、皮內給藥、肌內給藥和靜脈內給藥組成的組的任何給藥途徑使用色酮，其每日劑量在0.01 mg/kg-500 mg/kg哺乳動物(特別是人)體重的范圍。

圖1是使用早先公布的方案(圖1A)和改進的方案(圖1B)時，吲哚美辛對分泌到培養(yǎng)基中的脂連蛋白水平的作用的示意圖。圖1A:將 3T3-L1細胞誘導分化7天并用吲哚美辛處理24小時。使用1 pM剛哚美辛得到的脂連蛋白水平的最大平均提高倍數(shù)為1.6倍。圖1B:將3T3-L1細胞誘導分化2天并用吲哚美辛處理2天。使用100 吲哚美辛得到的脂連蛋白水平的最大平均提高倍數(shù)為52倍，而使用10 吲哚美辛得到的最低提高倍數(shù)為7倍。圖2是好望角蘆薈植物提取物(P0017-OE)對分泌到分化 3T3-L1細胞培養(yǎng)基中的脂連蛋白水平的作用的示意圖。簡而言之，誘導 3T3-L1細胞分化，隨后使用濃度為0.5、 0.166和0.055 mg/mL的粗有機提取物P0017-OE處理48小時。將最初的粗提取物先后按1: 3和1: 9進行稀釋，以檢測劑量響應。圖3描述了 P0017-OE的HTP-UV譜和餾份組合。將全部96 個餾份組成8個細分餾份。在脂連蛋白試驗中，P0017-OE-NP-F3是這8個細分餾份中活性最高的細分餾分。圖4是說明P0017-OE-NP-F3的Cw柱分級的圖示。P0017-ACl和P0017-AC2在脂連蛋白試驗中顯示出活性，并且分別被鑒定為蘆薈苦素禾口 aloesinol。圖5描述了通過與可靠標準物的UV譜解析和HPLC保留時間進行比較來鑒定蘆薈苦素(UP394)。圖6描述了通過與可靠標準物的UV譜解析和HPLC保留時間進行比較來鑒定aloesinol (UP396)。圖7是UP394(盧薈苦素)和UP396 (aloesinol)對分泌到分化 3T3-L1細胞培養(yǎng)基中脂連蛋白水平的作用的示意圖。簡而言之，誘導 3T3-L1細胞分化，隨后使用濃度為30 pM的UP394(蘆薈苦素)和 UP396 (aloesinol)處理48小時。使用脂連蛋白ELISA試劑盒測定培養(yǎng)基中脂連蛋白的濃度。圖8A是在處理后18天以2 g/kg的劑量在C57BL/6J小鼠上進行腹膜內葡萄糖耐受試驗的結果的示意圖。簡而言之，在給藥葡萄糖前使動物禁食3小時。在腹膜內使用GW1929 (5 mg/kg) ("、UP394 (100 mg/kg) (▲)、 UP396(100mg/kg)(x)和運載體("處理小鼠。在0、 30、 60、 90和120 分鐘時測量血糖水平。向動物提供高脂肪飲食，持續(xù)12周。在第8周開始進行處理。所述數(shù)據(jù)為平均值士 SD，n- 6。與運載體相比，GW1929和UP396 在60、 90和120分鐘時觀察到顯著的葡萄糖利用，p<0.05(*)。與運載體相比，GW1929、 UP394和UP396在T0的P值分別為0.00、 0.87禾Q 0.43; 在T30分別為0.07、 0.16禾卩0.23。與運載體相比，UP394在T60的P值為 0.15，在T90為0.10，在T120為0,17。圖8B是在活性處理第24天以0.5單位/kg的劑量在C57BL/6J 小鼠上進行的腹膜內胰島素耐受試驗的結果的示意圖。簡而言之，在注射胰島素前使動物禁食3小時。使用GW1929(—、 UP394(iO、 UP396 (x)和運載體0)處理小鼠24天。在0、 30、 60、 90和120分鐘時測量血糖水平。向動物提供高脂肪飲食，持續(xù)12周。在第8周開始進行處理。所述數(shù)據(jù)為平均值士SD， n = 6。與運載體相比，UP394和UP396及GW192在時間點 T30、 T60和T90觀察到顯著的葡萄糖清除，p<0.05(*)。與運載體相比，GW1929、 UP394和UP396在TO的P值分別為0.00、 0.14和0.67;在T120 分別為0.08、 0.00和0.04。圖9是說明使用高脂肪飲食誘導的糖尿病模型時UP394和 UP396對胰島素水平的作用的示意圖。在使用高脂肪飲食誘導代謝疾病8 周后，在腹膜內用GW1929 (5 mg/kg)、UP394 (100 mg/kg)、UP396 (100 mg/kg) 和運載體處理動物2周。通過尾靜脈收集血液并離心收集血漿。使用胰島素ELISA試劑盒(Ciystal Chem - Chicago, IL)測量血漿胰島素水平。圖10是用GW1929 (■)、 N931 (A)和運載體(令)處理的雄性 db/db小鼠在IO周內每周的空腹血糖水平示意圖。除禁食期外，向動物提供T2018鼠糧，供其任意取食。在進行測量前使動物禁食過夜。將數(shù)值表示為平均值士SD， n = 8。與運載體相比，GW1929和N-931在第6、 7、 9 和IO周使空腹血糖水平顯著下降，P<0.05(*)。圖11A是在處理10周后以3g/kg的劑量在db/db小鼠上進行口服葡萄糖耐受試驗的結果的示意圖。在加入葡萄糖負荷前使動物禁食過夜。使用GW1929 (睡)、N931 (A)和運載體("處理小鼠10周。在0、 30、 60、卯和120分鐘時測量血糖水平。除禁食期外，向動物提供T2018鼠糧，供其任意取食。所述數(shù)據(jù)為平均值士SD， n = 8。與運載體相比，GW1929 和N-931兩者在0和120分鐘時都觀察到顯著的葡萄糖利用，尸< 0.05 (*)。與運載體相比，GW1929和N931在T30的P值分別為0.15和0.05;在T60 的P值分別為0.33和0.02;在T90的P值分別為0.002和0.083。圖11B是在處理6周后以0.5單位/kg的劑量在db/db小鼠上進行腹膜內胰島素耐受試驗的結果的示意圖。在注射胰島素前使動物禁食過夜。使用GW1929 0)、 N931(A)和運載體("處理小鼠10周。在0、 30、 60、 90和120分鐘時測量血糖水平。除禁食期外，向動物提供T2018鼠糧，供其任意取食。所述數(shù)據(jù)為平均值士SD， n = 8。與運載體相比，GW1929 和N-931兩者在0、30和60分鐘時都觀察到顯著的葡萄糖清除，尸〈0.05 (*)。與運載體相比，GW1929和N931在T90的P值分別為0.00和0.14;在T120 的P值分別為O.OO和0.09。
圖12是用GW1929、 N931和運載體處理的雄性db/db小鼠 IO周每周空腹甘油三酯水平的示意圖。除禁食期外，向動物提供T2018鼠糧，供其任意取食。在進行測量前使動物禁食過夜。該數(shù)值以運載體的甘油三酯水平的百分比表示，n = 8。在處理10周后，發(fā)現(xiàn)與運載體相比，在經GW1929和N-931處理的動物中甘油三酯水平顯著下降，P<0.05(*)。圖13A-13F顯示在處理后第3周進行的腹膜內葡萄糖耐受試驗的結果。在試驗當天，使動物禁食3小時并接受劑量為2mg/g的腹膜內葡萄糖給藥。在遞送葡萄糖后的O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120分鐘測定血糖水平。從尾靜脈取血。該數(shù)據(jù)為平均值iSD，n:7。 A.運載體 ( )對比400 mg/kg Qmatrix ; B.運載體("對比GW1929 (■); C.運載體O)對比UP780 (100 mg/kg) (■); D.運載體O)對比UP780 (200 mg/kg) (■); E.運載體O)對比UP780(400mg/kg)—)和F.運載體("對比詞喂常規(guī)飲食的動物，戶<0.05 (*)。在處理3周時檢測UP780的效力。每天口服處理3 周后，在用200 mg/kg UP780和GW1929處理的動物中發(fā)現(xiàn)加入腹膜內葡萄糖負荷后30、 60和90分鐘時出現(xiàn)統(tǒng)計學上顯著的葡萄糖清除。類似地，用400 mg/kgUP780處理的動物在30分鐘時顯示出顯著的葡萄糖利用，尸S 0.05 (*)。圖14A-13E顯示在處理后第9周進行的腹膜內葡萄糖耐受試驗的結果。在試驗當天，使動物禁食3小時并接受劑量為2mg/g的腹膜內葡萄糖給藥。在遞送葡萄糖后O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120分鐘測定血糖水平。從尾靜脈取血。該數(shù)據(jù)為平均值士SD,n-7。 A.運載體( ) 對比GW1929 —); B.運載體("對比Qmatrix (400 mg/kg)(醒);C.運載體0)對比UP780(100mg/kg)O);D.運載體("對比UP780 (200 mg/kg) (■) 和E.運載體("對比UP780(400mg/kg)(匿)，尸<0,05(*)。每日口服處理 9周后，與運載體對照相比，用400 mg/kg UP780和Qmatrix⑧處理的動物在經IP葡萄糖給藥30、 60、 90和120分鐘在葡萄糖利用中顯示出統(tǒng)計學上的顯著差別，戶S 0.05 (*)。用100 mg/kg UP780處理的動物僅在T30顯示出顯著差別。陽性對照GW1929在分析的各個時間點均具有小于0.05的P值。圖15A-15E顯示在處理后第3周進行的腹膜內胰島素耐受試驗的結果。在試驗當天，使動物禁食3小時并接受劑量為0.5單位/kg的腹膜內胰島素給藥。在遞送葡萄糖后O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120 分鐘測定血糖水平。從尾靜脈取血。該數(shù)據(jù)為平均值士SD,n-7。 A.運載體("對比Qmatrix (400 mg/kg) (■); B.運載體("對比UP780 (100 mg/kg) (■); C.運載體0)對比UP780(200mg/kg)O); D.運載體("對比UP780 (400 mg/kg)(麗)和E.運載體("對比GW1929，戶< 0.05 (*)。在每日口服處理10周后的胰島素耐受試驗中驗證UP780的胰島素敏感化作用。對于用400 mg/kg UP780處理的動物，在所有研究的時間點均觀察到統(tǒng)計學上顯著的胰島素敏感化，尸￡ 0.05 (*)。除胰島素注射1小時后的GW1929組之外，其他處理組并未觀察到其他的顯著差別，尸S0.05。圖16圖示說明以200mg/kg的劑量給藥UP780的穩(wěn)定的葡萄糖降低效果。使用從尾靜脈獲得的15-20nl血液在基線以及處理后第2、 5 和7周測量空腹血糖水平。使用GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780(100、 200和400mg/kg)和運載體對照處理動物。在處理后2周即發(fā) 現(xiàn)空腹血糖水平的統(tǒng)計學上的顯著下降，尸<0.05(*)(勺。該數(shù)據(jù)為平均值士 SD, n = 7。與未處理的運載體相比，用200 mg/kg UP780和GW1929處理的動物在兩周(第5和第7周)中均顯示出統(tǒng)計學上顯著下降的空腹血糖水平。用400 mg/kg Qmatrix⑧和UP780處理的小鼠在第5周顯示出相似的空腹血糖下降水平。另一方面，與未處理的運載體相比，在所有的測試周中， 100mg/kgUP780處理組均保持了相對較高的空腹血糖水平，戶^0.05 (*)。圖17圖示說明在處理后第2、 5和7周測量的空腹血糖水平與運載體對照相比下降的百分比。使用GW1929(5mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780(100、 200和400 mg/kg)和運載體對照處理動物。在第2周即可在200 mg/kg UP780處理組發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的低空腹血糖水平。該數(shù)據(jù)為平均值土SD,n-7。分別在第2、 5和7周測定用200mg/kgUP780處理的動物與運載體相比的空腹血糖水平下降百分比，其結果分別為18%、 20%和
3317%。圖18圖示說明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100， 200和 400 mg/kg)和運載體對雄性C57BL/6J小鼠空腹甘油三酯水平的作用。在處理后第2、 5和7周測定運載體對照的空腹甘油三酯的下降百分比。使用 GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780(100、 200和400 mg/kg) 和運載體對照處理動物u在第2周即在200 mg/kg UP780處理組發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的低空腹甘油三酯水平。該數(shù)據(jù)為平均值士SD,n-7。在連續(xù)7周的每日處理后，與運載體相比，400 mg/kg Qmatrix , 200、 400和100 mg/kg UP780 及GW1929的空腹甘油三酯水平下降百分比分別為2%、22.1%、22%、21.7% 和22.7%。圖19圖示說明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100、 200和 400 mg/kg)和運載體對膽固醇水平的作用。使用從尾靜脈獲得的15-20 )il 血液在基線以及處理后的第2、 5和7周測量空腹總膽固醇水平。使用 GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780 (100、 200和400 mg/kg) 和運載體對照處理動物。相對于運載體對照，在所有處理組中均未觀察到總膽固醇水平變化。該數(shù)據(jù)為平均值士SD,n-7。相對于運載體，所有的處理組均未發(fā)現(xiàn)膽固醇水平的顯著變化，PS0.05。圖20說明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100、 200和400 mg/kg)和運載體對雄性C57BL/6J小鼠體重的作用。在具有飼料和飲水部分的鼠籠中圈養(yǎng)3或4只雄性C57BL/6J小鼠。在誘導期和處理周的過程中測量體重，每周一次。使用GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780 (100、200和400 mg/kg)和運載體對照處理動物。在使用GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100、 200和400 mg/kg)和運載體處理的所有小鼠組之間均未觀察到在統(tǒng)計學上顯著的體重增量差異。該數(shù)據(jù)為平均值士SD,n-7。如圖20所示，在整個研究期內，各處理組(包括運載體和常規(guī)鼠糧組)的動物體重均持續(xù)增加。在組I(Qmatrix 400 mg/kg和200 mg/kg UP780)和組H(GW1929、運載體、100、 400mg/kgUP780)之間觀察到的體重增量差異在統(tǒng)計學上并不顯著，尸￡0.05。
圖21說明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100， 200和400 mg/kg)和運載體對雄性C57BL/6J小鼠飼料消耗的作用。在具有詞料和飲水部分的鼠籠中圈養(yǎng)3或4只雄性C57BL/6J小鼠。在誘導期和處理周的過程中測量詞料攝入量，每周一次。已顯示處理周中的詞料消耗數(shù)據(jù)。使用 GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780 (100、 200和400 mg/kg) 和運載體對照處理動物。各組之間的飼料攝入量在統(tǒng)計學上沒有顯著差異。該數(shù)據(jù)為平均值士SD，n-7。在所有組中均記錄了相似的飼料消耗方式，這與體重數(shù)據(jù)一致。圖22A和22B描述了測量雄性(圖22A)和雌性(圖22B)平均體重的急性毒性研究的結果。對照組和處理組間的體重增加率在整個試驗中保持恒定。使用2 g/kg UP780和運載體對照處理小鼠14天。對UP780 處理動物和運載體對照在尸檢當天和基線之間的體重增量差異的統(tǒng)計分析顯示雄性和雌性在體重增量上沒有顯著差異。類似地，在所比較的各數(shù)據(jù) 點處UP780處理動物和運載體對照動物中雄性和雌性的平均體重增量均沒有統(tǒng)計學上的顯著性。該數(shù)據(jù)為平均值土SD，n-5。圖23從視覺角度上圖示說明LV對比LC基因表達的普遍上調(圖23A)和LUP對比LC基因表達的下調(圖23B)。該圖由SigmaPlot 軟件生成。在標準化微陣列數(shù)據(jù)上使用ANOVA檢測處理組之間基因的差異表達(LV對比LC和LUP對比LC)。為了進行各比較，從ANOVA模型和多個比較修正的結果獲得顯著差異地表達的基因。圖中總結了用于通過 Holm的連續(xù)Bonferroni校正法進行比較的統(tǒng)計上顯著的探針組的數(shù)量，LV 對比LC (圖23A)和LUP對比LC (圖23B)。圖24描述了檢測ACC2轉錄物水平的微陣列分析的QPCR確認結果。圖24A為來自微陣列數(shù)據(jù)的量化結果。圖24B為根據(jù)GAPDH表達水平繪制的作為標準化表達水平的QPCR量化結果。將三份瘦型對照 (lean control)RNA樣品混合作為QPCR中的LC將高脂肪飲食(LV)和高脂肪飲食+ UP780(LUP)處理組的RNA樣品單獨用于QPCR。在微陣列和中均使用相同的RNA制備物。由于在微陣列數(shù)據(jù)分析中各自獨立地使用PM+MM和僅PM強度值(參見實施例20)，因此將二者分別繪圖以進行比較，并且在可行時用于動物與動物變種之間的比較。圖25A和25B描述了用于FASN轉錄物水平的微陣列分析的 QPCR確認結果，其與圖24中所述的形式相同。圖26A和26B描述了用于PEPCK1轉錄物水平的微陣列分析的QPCR確認結果，其與圖24中所述的形式相同。圖27A和27B描述了用于FABP5轉錄物水平的微陣列分析的QPCR確認結果，其與圖24中所述的形式相同。圖28A和28B描述了用于AMPKa2轉錄物水平的微陣列分析的QPCR確認結果，其與圖24中所述的形式相同。
具體實施例方式
本發(fā)明描述了來自植物來源的色酮和新型色酮組合物的鑒定和分離，所述色酮和新型色酮組合物上調脂肪細胞的脂連蛋白生產并使與葡萄糖和脂肪酸代謝及信號轉導相關的上百個基因正常化。所述色酮組合物可有效增強脂肪細胞的脂連蛋白生產，并且調控參與脂肪酸生物合成、脂肪酸的線粒體(3-氧化、類固醇生物合成、糖異生作用、脂肪運輸、 PPARa/RXRa肝信號轉導和異生素代謝的基因?？蓪⒃撋M合物用于提高哺乳動物中的胰島素敏感性、改善葡萄糖耐受、降低甘油三酯水平以及平衡葡萄糖水平。本發(fā)明還包括用于預防和治療多種疾病和病癥的方法，所述疾病和病癥包括但不限于胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥。本發(fā)明還包括包含一種或多種色酮和蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉的混合物的新型組合物。這些新型組合物對于降低葡萄糖水平及增強胰島素敏感性特別有效。該組合物通過將蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉與一種或多種色酮的基本純的混合物混合而制備，其中所述一種或多種色酮的混合物基本不含蒽醌(通常為戸薈素A和B)。所述"基本純"是指色酮混合物的純度為至少70%，優(yōu)選至少80%，且最優(yōu)選90%或以上。所述"基本不
36含蒽醌"是指色酮混合物中的蒽醌總量小于或等于100 ppm，更優(yōu)選小于或等于50ppm。可通過用于制備這些組合物的任何已知標準方法制備蘆薈膠粉或全葉膠粉(本文統(tǒng)稱為"蘆薈膠")。在一個實施方案中，從巴巴多斯蘆薈或庫拉索蘆薈制備蘆薈膠。這些組合物中蘆薈膠與總色酮的比例可以在0.1-99.9%的范圍內。在一些實施方案中，所述組合物包含90%-99%(以重量計)的蘆薈膠和1-10%(以重量計)的總色酮。在其他實施方案中，所述組合物包含95%-99%(以重量計)的蘆薈膠和1-5%(以重量計)的總色酮。在另外的實施方案中，所述組合物包含98%-99%(以重量計)的蘆薈膠和 1-2%(以重量計)的總色酮。按照以下的詳述分離色酮。在一些實施方案中，所述一種或多種色酮選自由以下組成的組蘆薈苦素、abesinol、蘆薈樹脂 (aloeresin)A、蘆薈樹脂C、蘆薈樹脂D、蘆薈樹脂E、蘆薈樹脂F(xiàn)和蘆薈苦素衍生物。本發(fā)明的色酮可通過通過化學方法改變天然色酮的結構而半合成獲得，或者可以從小的芳香族起始材料完全合成獲得。本文所用多種術語涉及到本發(fā)明的各個方面。為了有助于說明對本發(fā)明組分的描述，提供以下定義。除非另有限定，否則本文所用的所有科技術語均具有本發(fā)明所述技術領域普通技術人員通常所理解的含義。應注意本文所用術語"一 (個)"("a"或"an")實體是指一個或多個該實體，例如，一種色酮是指一種或多種色酮。因此，術語"一(個)"、 "一(個)或多(個)"和"至少一(個)"在本文中可相互置換。"色酮"是如下通式結構所示的以苯并吡喃-4-酮作為其主要結構骨架的一類特定的天然產物<formula>formula see original document page 37</formula>其中R,、 R2、 R3、 R4、 Rs和R6獨立地選自以下組中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代垸基、氧代烯基、羥基烷基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NRsI',選自包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基酯和羥基-肉桂?；?、三羥基苯甲酰基酯和咖啡?；?的組的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自包括但不限于戊醛糖、甲基戊酸糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物的組；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；
其中所述烷基和減烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和域支鏈，并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自由-OH、 =0和-OR組成的組的取代基團；
X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和
R為具有l(wèi)-20個碳原子的烷基基團，和藥學上可接受的載體。
在一個實施方案中，色酮為選自具有以下通式結構的化合物的組的苯并吡喃-4-酮(7-羥基色酮)
其中，R^、 R2和R3的定義如上所述。在本發(fā)明的另一個實施方案中，色酮選自蘆薈苦素或aloesinol。本發(fā)明的色酮可以通過合成方法獲得或可以分離自眾多的植物科屬，包括但不限于金合歡屬、水團花屬、蘆薈屬、鏈格孢屬、崖摩屬、五月茶屬、蒿屬、崗松屬、決明屬、書帶木屬、蛇床屬、旋花屬、淫羊藿屬、雞頭薯屬、艾里奧斯特門屬、番櫻桃屬、藤黃屬、金絲桃屬、鐘萼草屬、全能花屬、青霉菌屬、蓼屬、Ptoera;^/o"、大黃屬、槐屬、冠網蝽屬、蒲桃屬、籃狀菌屬和ZomWfl。在優(yōu)選的實施方案中，植物選自包括但不限于兒茶、金合歡、木立蘆薈、巴巴多斯蘆薈、」/oe crew朋p/w7"、好望角蘆荼、阜質盧荼、庫拉索戸荼、中華戸荼、^w"cfesma mem6na"accMm、茵P東蒿、崗松、箭葉淫羊藿、爪哇鳳果、地耳草、虎杖、毛苦參和^ep/zam'to A^fo&W^7'的組。在一個實施方案中，色酮分離自好望角蘆薈、庫拉索蘆薈或巴巴多斯蘆薈的全葉。色酮可以在植物的各個部位中找到，包括但不限于莖、莖皮、干、干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、幼芽、種子、根莖、花和其它生殖器官、葉和其它氣生部分。術語"蘆薈"是指百合科植物的南非植物的屬，其中庫拉索戸薈C4/oe vera) /巴巴多斯聲薈U/oe to6acfem7's)(注意爿/oe Z)arZjafifm^是 ^fee vera種的拉丁名)或好望角蘆薈是其種名。盧薈色酮主要存在于多種不同蘆薈種的葉外皮中。術語"蘆薈提取物"被定義為多種蘆薈植物全葉的干燥汁液。本發(fā)明實施例中使用的"蘆薈提取物"包括但不限于新鮮和濃縮的戸薈膠、全葉膠、葉滲出物和提取物，其通過多種蘆薈全葉的"全葉加工"而制備。在一個實施例中，將來自巴巴多斯蘆薈植物的全葉研磨、過濾、用纖維素酶(任選)和活性炭處理并凍干。在使用前，用色譜溶劑復溶凍干粉末。在另一個實施例中，將來自好望角蘆薈葉的滲出物懸浮在水中，隨后在使用前與適合的色譜溶劑相接觸。本文所用"治療"包括治療和/或預防。在使用時，治療是指人以及其他哺乳動物。"藥學上或治療上有效的劑量或量"是指足以誘導所需生物學結果的劑量水平。其結果可以為跡象、癥狀或病因的緩解，或生物系統(tǒng) 的任何其他所需變化。準確劑量將隨多種因素而改變，包括但不限于對象的年齡和大小、所患疾病和接受的治療。"主體"或"患者"或"對象"是期望治療的活體哺乳動物、人或動物。"主體"或"患者"或"對象"通常是指將按照本發(fā)明的方法接受治療的受者。應注意本文所述的發(fā)明可用于獸醫(yī)以及人類應用，且術語 "主體"不應以受限的方式進行解釋。在獸醫(yī)應用的情況下，可考慮動物的體重而按下述方式確定劑量范圍。本文所用的"藥學上可接受的載體"是指不影響活性成分的生物活性的效力，并且對被給藥該載體的主體沒有毒性的任何載體。"藥學上可接受的載體"的實例包括但不限于任何標準藥物載體，例如鹽水溶液 (即林格氏溶液)、緩沖鹽水溶液、水、右旋糖溶液、血清白蛋白和用于壓片和膠囊化制劑的其他賦形劑和防腐劑。注意本申請中提供了多個引用引文。各引文均通過引用以其全文具體地并入本文中。本發(fā)明包括用于預防和治療哺乳動物中的代謝綜合征和由胰島素抵抗介導的疾病和病癥的方法。該方法包括向有此需要的對象給藥有效量的包含一種或多種色酮的藥物或營養(yǎng)組合物?？蓮膯蝹€或多個來源分離色酮或色酮混合物，包括但不限于通過合成獲得、天然存在或其任意組合。本發(fā)明的一個實施方案描述了用于提高脂肪細胞的脂連蛋白生產的方法，其包括向有此需要的對象給藥有效量的色酮或色酮混合物；其中所述色酮或色酮混合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明描述了用于使高脂肪飲食誘導的有關脂肪酸生物合成、脂肪酸的線粒體|3-氧化、類固醇生物合成、糖異生作用、脂肪轉運、PPARa/RXRa肝信號轉導和異生素代謝的基因表達變化正?；姆椒ǎ龇椒òㄏ蛴写诵枰膶ο蠼o藥有效量的包含色酮或色酮混合物的組合物。本發(fā)明的另一個實施方案包括用于預防和治療胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥的方法，所述方法包括向有此需要的對象給藥有效量的包含色酮或色酮混合物的組合物。可按照下文使用的色酮包括以下通式結構所示的化合物
40其中
R,、 R2、 R3、 R4、 Rs和R6獨立地選自以下組中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羥基垸基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X'，選自包括但不限于沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂?；ズ土u基-肉桂?；ァ⑷u基苯甲?；ズ涂Х弱；?的組的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物的組；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；
其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自由-OH、 =0和-OR組成的組的取代基團；
X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括但不限于羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和
R為具有1-20個碳原子的烷基基團，和藥學上可接受的載體。
在一個實施方案中，色酮為選自具有以下通式結構的一組化合物的苯并吡喃-4-酮(7-羥基色酮)
其中，R,、 R2和R3的定義如上所述。在本發(fā)明的另一個實施方案中，色酮選自具有如下所示結構的蘆薈苦素和/或aloesinol。
41戸薈苦素 Aloesinol 本發(fā)明的色酮可以通過合成方法獲得或可以分離自眾多的植物科屬，包括但不限于金合歡屬、水團花屬、蘆薈屬、鏈格孢屬Ute/77^Z'a)、崖摩屬、五月茶屬、蒿屬、崗松屬、決明屬、書帶木屬、蛇床屬、旋花屬、淫羊藿屬、雞頭薯屬、艾里奧斯特門屬、番櫻桃屬、藤黃屬、金絲桃屬、鐘萼草屬、全能花屬、青霉菌屬、蓼屬、/^wo";/o"、大黃屬、槐屬、冠網蝽屬、蒲桃屬、籃狀菌屬和Zo加n'"。在優(yōu)選的實施方案中，植物選自包括但不限于兒茶、金合歡、木立聲薈、巴巴多斯戸薈、X/oe cwm"o; /zz7a、好望角聲薈、阜質戸薈、庫拉索戶薈、中華聲薈、爿""Gfeswa wem6ra"aceww、茵陳蒿、崗松、箭葉淫羊藿、爪哇鳳果、地耳草、虎杖、毛苦參和Ste; /zam'fe ;^^fo^w^7'的組。在一個實施方案中，色酮分離自好望角蘆薈、庫拉索蘆薈或巴巴多斯蘆薈的全葉。色酮可以在植物的各個部位中找到，包括但不限于莖、莖皮、干、干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、幼芽、種子、根莖、花和其它生殖器官、葉和其它氣生部分。本發(fā)明的色酮化合物和組合物以及其生化和生物活性是通過對下述2059種植物提取物的隨機篩選而鑒定的。基于植物提取物或化合物增強所培養(yǎng)脂肪細胞的脂連蛋白生產的能力來設計初步篩選。脂肪細胞從小鼠纖維原細胞(3T3 Ll)分化而來。人們認為測量脂肪細胞培養(yǎng)基中的關鍵脂肪因子(adipokin)標記蛋白——脂連蛋白的水平能夠鑒定出可充當 PPAR泛調控劑(pan regulator)的天然存在的化合物，或調節(jié)葡萄糖和脂肪酸的其他關鍵代謝途徑以用于預防和治療代謝疾病，包括但不限于哺乳動物(特別是人)的胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥。為了創(chuàng)建植物提取物文庫，將干燥的植物材料研磨成細粉并按照實施例1的描述使用ASE 300自動提取器用甲醇二氯甲烷(l: l)進行提取。通過旋轉蒸發(fā)和真空離心干燥提取物。將各植物提取物(約75 mg) 溶解于1.5ml DMSO (1.5 ml)從而制備濃度為50mg/ml的溶液。已發(fā)現(xiàn)3T3-L1細胞響應PPARy活化劑產生脂連蛋白并將其分泌到培養(yǎng)基中。然而，在文獻中響應PPARy活化劑治療僅使脂連蛋白分泌提高2倍。在重復此試驗時，在所公開的試驗條件下使用濃度為0.1-300 ^M吲哚美辛所達到最好的試驗信號背景比為1.6。如實施例2和3所示，通過改變誘導和培養(yǎng)條件使信噪比得到了極大的改進。將3T3-L1細胞誘導分化2天，隨后用吲哚美辛處理2天。使用100pM吲哚美辛，脂連蛋白的最大平均提高倍數(shù)為52倍(圖1B)。使用該試驗系統(tǒng)篩選2059種有機提取物。初次篩選使用與參考化合物10 nM n引哚美辛的脂連蛋白誘導效果等價的截止閾值獲得了 139種陽性物。根據(jù)隨后驗證試驗和二次篩選的結果，來自好望角戸薈葉滲出物的一個活性提取物(記為P0017)顯示出對培養(yǎng)基中脂連蛋白水平的穩(wěn)定上調(圖2)。隨后，對該活性植物提取物(P0017-OE)進行以活性為導向的 HTP分級和化合物純化。如實施例5所示，使用正向快速柱對P0017的有機提取物進行分級。將具有相似UV吸收和保留時間的餾份組合成細分餾份，并在低真空下干燥并離心，將其命名為P0017-OE-HTPFl-8(圖3)。使用DMSO溶解各細分餾份(50 !ig^l)并將其部分(2 pl)用于脂連蛋白分析。在生物分析中，在8個細分餾份中P0017-OE-HTPF3顯示出最高的活性。實施例7和圖4中說明了活性餾分和化合物的重復的大規(guī)模提取以及分離。具有生物活性的餾分被鑒定為P0017-AC1和P0017-AC2。使用LC-MS/PDA進行活性細分餾分的去冗余(de-replication) 。經鑒定，獨特的化合物峰與最強的脂連蛋白增強活性相對應。如實施例8所述，P0017-OE-HTPF3和P0017AC1/2中活性最高的化合物 aloesinol (mv^396)和蘆薈苦素(m^394)被分別鑒定為編號為UP394(蘆薈苦素，圖5)和UP396(aloesino1，圖6)的色酮類化合物。特別地，蘆薈苦素和aloesinol被分離并鑒定為增強脂肪細胞的脂連蛋白分泌的活性色酮化合物。按照實施例10的描述試驗純化的UP394和UP396，并且如圖7所示，這兩種色酮化合物在體外分析中均具有增強脂肪細胞的脂連蛋白生產的活性。實施例9描述了通過制備性柱色譜分離和重結晶從粗蘆薈滲出物中純化色酮，從而除去蒽醌污染物(特別是蘆薈素A和B)的方法。蒽醌的缺點在于其導致顯著的不良副反應例如引起腹瀉和遺傳毒性，因此防礙了直接使用粗色酮提取物。按照本方法純化分離的色酮的純度高達70重量％,優(yōu)選80重量％，且最優(yōu)選90重量％或以上，且通過HPLC定量分析，其"基本不含蒽醌"。所述的基本不含蒽醌，是指純化組合物中的蒽醌總量小于100 ppm，優(yōu)選小于50 ppm(蘆薈素A和B)。在好望角蘆薈的粗滲出物中，蘆薈苦素(UP394)的量為約25重量Q/。，而蒽醌的量為約22。/。(Zahn, (2007) Phytochem. Anal. H0):: 1002-1024)。因此，好望角盧薈是用于分離色酮組合物的優(yōu)秀且優(yōu)選的植物來源。如實施例9所述，分離自好望角戸薈葉滲出物的經分離和純化的戸薈苦素(UP39)(Lot弁A-2705和Lot#I1506AW) 的純度分別為93%和100.6°/。，且總蒽醌小于50 ppm。如實施例11和18 所述，使用不含蒽醌(總蒽醌<50 ppm)的蘆薈苦素(UP394)生產富含色酮的組合物N931和UP780。然而，據(jù)報道在其他蘆薈品種如巴巴多斯蘆薈(其為戸薈膠的優(yōu)選來源)中，色酮的量要少得多(0.32mg/g; 0.032%，總色酮為0.10%)，而蒽醌(蘆薈素A和B)的量幾乎高四倍(1.14 mg/g或0.114%) (Park (1998) Phytochem. Anal. 2:186-191)。此外，色酮僅貯存在蘆薈植物葉的外皮或外層中。在獲得蘆薈膠產物的標準方法中，通常從蘆薈植物如庫拉索蘆薈/巴巴多斯蘆薈除去蘆薈葉的外皮，并僅過濾并濃縮澄清的凝膠。即便是在戸薈全葉膠粉的生產中(其中將蘆薈植物的全葉粉碎且收集凝膠并過濾)，使用活性炭的脫色加工和其他加工步驟也會除去幾乎所有的色酮以及蒽醌。
因此，通過HPLC驗證，在標準蘆薈膠產物中沒有發(fā)現(xiàn)顯著量的色酮或蒽醌(Dell'Agli (2007) J. Agric. Food Che. 55(9):3363-3367: Zonta (7卯" /owma/ o/C7zro附fltograp/;y ^ 718(1): 99-106)。本發(fā)明人設想在標準植物提取物中富集色酮可使組合物在增
強胰島素敏感性、改善葡萄糖耐受和降低甘油三酯水平方面具有改善的且更持久的活性。為了試驗上述假設，如實施例ll所示，通過將分離自好望
角蘆薈葉滲出物的色酮蘆薈苦素(UP394)與由庫拉索蘆薈制備的全葉膠粉組合，從而生產出獨特的色酮組合物。來自這兩種蘆薈的標準色酮組合物包含小于1.4%的色酮——即蘆薈苦素(UP394)，且未受蒽醌污染(蘆薈素A 禾口B〈50ppm)。按照標題為"Method of Purification of Aloesin"的美國專利第6,451,357號的描述，通過制備性色譜柱，其后通過重結晶進一步純化，從而從好望角蘆薈葉滲出物提取分離出蘆薈苦素(UP394)，該文獻通過引用全文并入本文。將此獨特的標準色酮組合物編號為N931，并在不同的胰島素抵抗模型db/db小鼠模型中試驗其對血糖水平、胰島素抵抗和脂肪代謝的作用。由于據(jù)報道脂連蛋白可改善胰島素抵抗，而胰島素抵抗被認為是代謝綜合征的根本原因，因此設想通過色酮UP394和UP396降低胰島素抵抗應該導致多種代謝疾病的改善。如實施例12所示，為了驗證這一理論，通過連續(xù)8周向C57BL/6J小鼠飼喂高脂肪飲食，在其中誘導胰島素敏感性受損、葡萄糖耐受和代謝疾病(Surwit等(1988) Diabetes 22:1163-1167; Laakso等(2004). Diabetes Care互:2253-2259; Kahn等(2004) Diabetes 11:3274-3285; Scheurink等(1998) European J Endo. 139:461-467)。隨后，使用色酮UP394、 UP396和參考化合物GW1929(N-(2-苯甲?；?基)-0-[2-(甲基-2-吡啶基氨基)乙基]-L-酪氨酸)處理(注射或口月艮)小鼠4周。使用以下兩個實驗證明本文公開的色酮對高脂肪飲食小鼠中胰島素抵抗的治療作用葡萄糖耐受試驗(實施例13)和胰島素耐受試驗(實施例14)。在使用本文公開的色酮蘆薈苦素(UP394)和aloesinol(UP396)處
45理的第18天進行腹膜內葡萄糖耐受試驗。在給藥葡萄糖(2 g/kg)前使動物禁食3小時。在給藥葡萄糖后的0、 30、 60、 90和120分鐘測量血糖水平。如實施例13和圖8A所示，與運載體處理的動物相比，用UP396處理的動物顯示出對自循環(huán)系統(tǒng)中的葡萄糖清除的顯著改善。與運載體處理的動物相比，UP394處理的動物顯示出明顯的改善趨勢(圖8A)。如實施例14所示，在處理第24天進行腹膜內胰島素耐受試驗。在胰島素注射前使動物禁食3小時。在給藥胰島素(0.5單位/kg)后的0、 30、 60、 90和120分鐘測量血糖水平。如圖8B和實施例14所示，與運載體處理的動物相比，在用UP394和UP396兩者處理的動物中觀察到顯著的葡萄糖清除，p〈0.05(圖8B)。通過該化合物降低所處理動物血漿胰島素水平的能力進一步證明了所公開色酮的胰島素敏感化活性。使用ELISA試劑盒測定小鼠中的血漿胰島素水平(圖9)。參照化合物GW1929(選擇性PPARy激動劑)如期地使胰島素水平顯著下降。與此類似，相對于運載體處理的小鼠，UP394 和UP396也使胰島素水平顯著下降(圖9)，說明本發(fā)明公開的色酮化合物提高了高脂肪飲食誘導的代謝疾病小鼠的胰島素敏感性。自發(fā)糖尿病突變(丄^/"純系小鼠在大約3-4周齡時明顯變肥胖。血漿胰島素在10-14天時開始升高，而血糖在4-8周開始升高。純合突變小鼠多食、多飲且多尿。該疾病的病因明顯受遺傳背景影響。在db/db 小鼠中觀察到多種特征，包括血糖不受限制地升高、胰島中產生胰島素的卩-細胞的嚴重損耗，及在10月齡死亡。如實施例15所示，用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和運載體處理(注射或口服)雄性必/必小鼠(每組 8只)IO周，并且每周測量小鼠的空腹葡萄糖水平。結果，N931對于降低 ^v^6小鼠的血糖水平非常有效。如圖10所示，在10周的處理期內，運載體處理小鼠的葡萄糖水平隨時間而增加。參考化合物GW1929能夠如期地將葡萄糖保持在基線水平。與GW1929相似，N931從處理第5周開始使葡萄糖水平充分降低。與運載體處理組相比，在第6、 7、 9和10周時N931 處理組的空腹血糖水平顯著下降，P<0.05。處理10周后，用N931處理的動物的葡萄糖水平為用運載體處理的動物的54%。如實施例16所述，N931對胰島素抵抗的作用在口服葡萄糖耐受試驗中得到證實。用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和運載體處理必/必小鼠(每組8只)10周。在加入葡萄糖負荷前使動物禁食過夜。在給藥葡萄糖后的O、 30、 60、 90和120分鐘測量血糖水平。與運載體組相比，用GW1929或N-931處理的組在0和120分鐘時觀察到自循環(huán)系統(tǒng)中的顯著的葡萄糖清除，戶<0.05(圖IIA)。該結果證明N931具有提高葡萄糖耐受的能力，由此改善了"6A^小鼠的胰島素敏感性。在腹膜內胰島素耐受試驗中進一步證明了 N931對胰島素抵抗的作用。用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和運載體處理必/必小鼠(每組8只)6周。在注射胰島素后的O、 30、 60、 90和120分鐘測量血糖水平。同樣，在用GW1929和N931處理的小鼠中胰島素敏感性的改善十分明顯。與運載體相比，GW1929和N931兩者在O、 30和60分鐘時均觀察到顯著的葡萄糖清除，P〈0.05(圖IIB)。此外，與運載體組相比，處理10周后，N931使甘油三酯水平顯著降低(P0.05)。如實施例17所示，每周測量GW1929、 N931和運載體處理的雄性必/W小鼠的空腹甘油三酯水平。除禁食期間之外，向動物提供T2018鼠糧，供其隨意取食。在處理10周后，在用N931處理的動物中觀察到甘油三酯下降34%(P < 0.05);而在參照化合物組中觀察到下降 430碌<0.05)(圖12)。為了證明富含色酮的組合物的優(yōu)異且出人意料的功效，通過將分離自好望角蘆薈葉滲出物的色酮蘆薈苦素(UP394)與從庫拉索蘆薈制備的葉膠粉(編號為QM400的Qmatrix)組合生產另一種獨特的組合物。通過HPLC定量分析，來自這兩種蘆薈的標準化的色酮組合物(UP780)包含不小于2%的色酮——即蘆薈苦素(UP394)，且總蒽醌不大于50ppm。按照實施例9的描述，以及標題為"Method of Purification of Aloesin"的美國專利第6,451,357號的進一步描述，通過制備性色譜柱，其后通過重結晶進一步純化，從而從好望角蘆薈葉滲出物提取分離出蘆薈苦素(UP394)，上述文獻通過引用全文并入本文。將該新型標準化的色酮組合物編號為UP7S0，并在劑量范圍選擇研究中口服給藥至高脂肪飲食飼喂的C57BL/6J小鼠。在此研究中，將UP780的胰島素敏感化活性與藥物GW1929及原庫拉索蘆薈膠粉(Qmatrix QM400)進行比較，其中如實施例9中的HPLC定量分析所示，所述Qmatrix QM400不包含顯著量的色酮。在實施例19中，每天口服處理3周后，在用200 mg/kg UF780 (圖13D)和GW1929 (圖13B)處理的動物中發(fā)現(xiàn)加入腹膜內葡萄糖負荷后30、 60和90分鐘時出現(xiàn)在統(tǒng)計學上顯著的葡萄糖清除。類似地，用 400 mg/kg UP780處理的動物在30分鐘時顯示出顯著的葡萄糖利用，P ^ 0.05(*)(圖13E)。同樣，每日口服處理9周后，與運載體對照相比，用400 mg/kg UP780處理的動物在經IP葡萄糖給藥30、 60、 90和120分鐘后在葡萄糖利用上顯示出統(tǒng)計學上顯著的差別，戶^0.05(*)(圖14E)。 100mg/kg UP780處理的動物在T30顯示出顯著差別(圖14C)。陽性對照GW1929在所分析的各個時間點均具有小于0.05的P值。而不含顯著量色酮的原戸薈膠粉(QmatrixQM400)在口服3周后沒有顯示出功效(圖13A)。該試驗清楚地顯示出與不含色酮的組合物相比，富含色酮的組合物的出人意料的優(yōu)異的胰島素敏感化功效。此外，在每日口服處理10周后的胰島素耐受試驗中驗證了 UP780的胰島素敏感化作用(圖15A-15E)。對于用400 mg/kg UP780處理的動物，在所述的所有時間點均觀察到在統(tǒng)計學上顯著的胰島素敏感化，/> (*)(圖15D)，這與葡萄糖耐受的數(shù)據(jù)相符。與之相比，不含色酮的庫拉索蘆薈膠粉(Qmatrix QM400)在口服10周后僅顯示出中等程度的改善，且僅在單個點具有顯著性(圖15A)。富含蘆薈苦素的庫拉索蘆薈膠粉同樣穩(wěn)定地保持了低水平的空腹血糖水平。在處理的第2、 5和7周分別監(jiān)測空腹葡萄糖水平。如圖16 所示，與未處理的運載體相比，用200 mg/kg UP780和GW1929處理的動物在兩周中(第5和第7周)均顯示出空腹血糖水平在統(tǒng)計上的顯著下降。用Qmatrix⑧和400 mg/kg UP780處理的小鼠在第5周顯示出相似的空腹血糖下降水平。另一方面，在所有的測試周中，100mg/kgUP780處理組保持了比未處理的運載體更高的空腹血糖水平，尸S0.05 (*)。類似的數(shù)據(jù)分析顯示，與運載體相比，在用200 mg/kg UP780處理的動物中空腹葡萄糖水平下降的百分比在第2、 5、 7周分別為18%、 20%和17%(圖17)。在實施例19的劑量范圍研究試驗中，在用UP780和GW1929 處理的動物中觀察到空腹甘油三酯水平的相繼下降。在每日口服處理7周后，200、 400和100mg/kgUP780及GW1929相對運載體的空腹甘油三酯水平下降百分比分別為22.1%、 22%、 21.7%禾卩22.7%(圖18)。然而，不含顯著量色酮的庫拉索蘆薈膠粉(Qmatrix QM400)在處理2周后僅顯示出2% 的甘油三酯水平改善，此外，該作用在隨后的兩次測量中消失。通過這一試驗清楚地證明了富含色酮的植物提取物在降低甘油三酯水平中的出人意料的優(yōu)異功效。如圖19所示，相對于運載體，對所有的處理組均未發(fā)現(xiàn)膽固醇水平的顯著變化，戶^0.05。此夕卜，在用GW1929、 Qmatrix 、UP780(100、 200和400 mg/kg)和運載體處理的所有小鼠組間均未觀察到在統(tǒng)計學上顯著的體重增量差異或飼料消耗差異。盡管各處理組(包括運載體組和正常鼠糧組)中的動物在整個研究期間體重持續(xù)增加，但在處理組之間觀察到的體重增量差異在統(tǒng)計學上不顯著，尸S0.05(圖20)。在所有組中都記錄到相似的飼料消耗方式，這與體重數(shù)據(jù)相符(圖21)。根據(jù)定義，基因組研究是指基因組范圍內的研究，通常使用包含覆蓋所有表達基因的探針組的DNA微陣列芯片。對于哺乳動物系統(tǒng)，普遍認為具有功能且被表達的基因有25,000個。在使微陣列芯片與cRNA/ 由mRNA制備的cDNA雜交后，從該微陣列芯片檢測到的數(shù)據(jù)應該反映出 mRNA的組織/細胞源的基因表達譜。通過基因組數(shù)據(jù)庫分析通常為幾千個的具有表達差異的基因對生物途徑的參與活動。如實施例20所述，對UP780進行了微陣列研究。所使用的微陣列芯片為來自Affymetrix的小鼠基因組430 2.0，包含45,000個探針組。通過ANOVA的強效統(tǒng)計法分析基因表達差異的微陣列數(shù)據(jù)，以驗證基因表達差異的有效性。如實施例21所述，通過定量逆轉錄PCR(QPCR)進一步驗證具有表達差異的關鍵基因。通過影響代謝和信號轉導途徑的基因表達差異檢測處理的作用，并通過智能途徑分析軟件和數(shù)據(jù)庫(IPA5)對其進行分析。在高血糖水平下，胰腺P細胞分泌胰島素，其導致肝臟和肌肉中的葡萄糖轉運體轉移到質膜，以進行葡萄糖攝取并將葡萄糖以糖原的形式貯存。胰島素還提高肝臟和脂肪細胞中的脂肪酸和甘油三酯合成及脂肪在脂肪組織中的貯存。由胰島素受體信號級聯(lián)缺陷引起的胰島素抵抗導致葡萄糖轉運體向質膜的轉移減少、脂肪貯存減少以及血糖和游離脂肪酸增加。血中游離脂肪酸高使胰島素受體底物(IRS)失活，并且是誘導胰島素抵抗的因素。用于UP780功效試驗的C57BL6前期糖尿病小鼠模型是用于微陣列的小鼠組織的來源。從瘦型對照、高脂肪飲食(也稱為運載體)以及高脂肪飲食+ 200 mg/Kg UP780處理的小鼠獲取小鼠組織以用于RNA提取，各樣品都為一式三份。對于能量攝取、代謝、胰島素抵抗、肥胖癥和糖尿病而言重要的組織為肝臟、肌肉和脂肪。完成了肝臟微陣列的一套數(shù) 據(jù)。大體而言，相對于瘦型對照(LC)，高脂肪飲食(LV)使基因表達提高，但高脂肪飲食+ UP780(LUP，圖23)使很多基因的表達水平下降。如實施例20和21所示，微陣列和QPCR研究中最顯著的發(fā) 現(xiàn)是UP780使脂肪酸生物合成減少。與高脂肪飲食相比，UP780使限速酶乙酰-CoA羧激酶(ACC2)和脂肪酸合酶(FASN)的轉錄物分別減少了 3倍和 3.5倍(表1和圖24和25)。在高脂肪飲食中，來自葡萄糖的過量能量被轉化成脂肪，其必然后果是使血漿游離脂肪酸增加，從而導致肌肉中的胰島素抵抗。根據(jù)對動物模型的觀察，UP780使脂肪酸生物合成減少的直接后果應該是使胰島素敏感性和葡萄糖耐受提高。此外，硬脂酰-CoA去飽和酶(SCDl，多不飽和脂肪酸合成的限速酶)缺陷型小鼠在高脂肪飲食下仍保持消瘦。與高脂肪飲食相比， UP780使SCD1轉錄物減少4.44倍。
50
微陣列分析還顯示出與瘦型對照和高脂肪飲食相比，UP780 使參與線粒體脂肪酸P-氧化的酶的轉錄物水平降低(表1) 。p-氧化下降可使高能量攝取下的線粒體氧化總水平正?；⑶铱赡塬@得使線粒體游離氧自由基的產生正?；慕Y果。已知高類固醇水平可反饋并降低類固醇生物合成，這在高脂肪飲食和UP780處理中均可觀察到，特別是對于限速酶HMG-CoA還原酶而言(表l)。與高脂肪飲食相比，UP780使CYP7A1升高，并且可能獲得使膽酸生物合成提高的有益結果。糖酵解/葡糖異生途徑中的全局性基因表達差異表明幾乎沒有全局性變化，因為所涉及的大部分酶是雙向的。肝臟糖異生的限速酶是丙酮酸代謝途徑中的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)(表1)。微陣列和 QPCR顯示了 UP780使PEPCK轉錄物相比瘦型對照增加的趨勢，但其與高脂肪飲食相等(圖26)。這會使血糖增加，因此在抗肥胖抗糖尿病治療中應避免。然而，如果UP780使肌肉顯示出葡萄糖攝取和利用提高，如上述動物研究所示，其凈作用可處于總體平衡狀態(tài)。根據(jù)微陣列和QPCR的觀察，與高脂肪飲食相比，UP780使肝臟中脂肪酸結合蛋白FABP5的轉錄物提高了 1.74倍(表1和圖27)。 FABP5增加有利于脂肪轉轉運并使導致胰島素抵抗的血漿游離脂肪酸減少。UP780使質膜LDL受體減少，其可減少從血中攝取的LDL，并降低肝臟中的甘油三酯含量。此外，與高脂肪飲食相比，UP780還降低了用于質膜HDL、氧化態(tài)LDL和脂肪酸攝取的CD36，其可進一步減少肝臟脂肪含量(表l)。高脂肪飲食使參與PPARa/RXRa肝信號轉導途徑的基因轉錄物增加，而UP780則可使其下降，特別是對于PPARa、 CD36和c-Jun而言。肝臟中的PPARa活化通過增加HDL并減少LDL使血漿脂肪譜正常化。然而，高脂肪飲食或UP780均未使HDL脂蛋白ApoAl和ApoA2的轉錄物水平產生可觀的變化。UP780對PPARa的作用值得進一步關注。 UP780使很多參與藥物代謝和解毒的酶的轉錄減少，所述酶包括CYP7B1、 CYP2B9、 CYP2C18、谷胱甘肽-S-轉移酶和SOD3，該作用也值得進一步研究(表l)。 AMPK被視為是能量平衡的細胞傳感器。健康細胞在所有時間內均維持高ATP濃度。AMPK在細胞AMP/ATP比例增大(能量應激標志) 時被激活(Hardie (2004) J Cell Sci i/Z:5479) 。 AMPK的活化抑制葡萄糖和脂肪酸合成、提高葡萄糖和脂肪攝取、提高醣酵解和脂肪酸P-氧化、并減少蛋白質合成和細胞生長(Hardie (2004) Rev Endocrine & Metabolic Disorders ^ 119) 。 UP780逆轉了高脂肪飲食造成的AMPK轉錄物水平下降 (圖28)。在CD-I小鼠中進行了富含色酮的植物提取物UP780的藥物安全性試驗，經檢測，該組合物具有良好的耐受性。如實施例22所示，對 CD-1小鼠連續(xù)14天每天給藥2.0 g/kg UP780，在整個研究過程中沒有發(fā)病或致死的跡象。小鼠身體狀況和保持良好狀態(tài)的每日系統(tǒng)檢查顯示在整個研究過程中沒有表明測試化合物相關毒性或異常的標志。在該急性毒性研究中，所有小鼠的體重均在研究過程中持續(xù)增加(圖22A和B)。除了觀察到電解質的讀數(shù)與參考范圍略有偏差之外，在該14天毒性研究中所有的主要血液生物化學讀數(shù)均在正常的范圍內。與運載體對照相比，經UP780處理的雌性的天門冬氨酸轉氨酶(AST)、鈉、鉀和平均紅細胞血紅蛋白濃度 (MCHC)以及雄性的總蛋白和血尿氮在統(tǒng)計學上有顯著差異，戶S0.05(數(shù)據(jù) 未顯示)。MCHC、總蛋白和BUN的觀測平均值仍在正常參考范圍內；然而，AST、鈉和鉀的平均值在正常范圍之外。在運載體對照和UP780處理動物中，所有小鼠尸檢的一般檢査結果都基本正常(數(shù)據(jù)未顯示)。對給藥UP780 14天的小鼠，沒有在其用于微觀檢查的任何組織中觀察到與測試物相關的微觀變化。在所檢查的器官和組織中觀察到少量的各種微觀變化是在該年齡和應激下的實驗小鼠中常觀察到的自發(fā)變化類型。所觀察到的電解質失衡可由很多條件引起，包括腎和腎上腺病變以及導致嘔吐和/或腹瀉的任何疾病。低AST值沒有臨床顯著性。因為缺少相應的臨床觀察、血液學數(shù)值和組織病理學結果證據(jù)，
52我們認為這些與正常值之間的偏差可能是由于飼養(yǎng)和實驗室條件造成的。因此，因心理壓力產生的溶血和脾收縮而造成的影響如細胞流失等可能導致分析物讀數(shù)的假提高或降低。因此，基于臨床發(fā)現(xiàn)以及血液學、血液化學和組織病理學的試驗報告，推斷沒有證據(jù)表明此劑量對任何研究的小鼠產生任何系統(tǒng)毒性。運載體或試驗物對這些偶發(fā)事件的類型、發(fā)生或嚴重性沒有影響。本發(fā)明的化合物以及包含該化合物的植物可作為飲食添加劑遞送，其可被配制成片劑、膠囊劑、軟凝膠劑，也可用于基本飲食和/或功能性食品、能量條、果汁飲料和碳酸或常規(guī)飲料中，以用于預防和治療哺乳動物(包括但不限于人)中由胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高甘油三酯水平和葡萄糖水平失衡介導的疾病和病癥。可通過本領域技術人員熟知的多種方法制備用于在藥物組合物中給藥的化合物。色酮可以以如下形式配制其天然存在形式的草藥粉末；不同濃度的溶劑和/或超臨界流體提取物；通過重結晶、柱分離、溶劑分配、沉淀和其他方式富集和純化的化合物；通過合成方法制備的純色酮和/或包含基本純的色酮的混合物。多種給藥系統(tǒng)是本領域已知的，且可用于給藥本發(fā)明的治療組合物，包括粉劑、膠囊、片劑、酊劑、舌下給藥系統(tǒng)、食物條和多種溶液劑包括水、果汁和碳酸軟飲料、軟膏劑和用于口服的乳劑?？蓪⒃摻M合物以水溶液劑的形式，包裝于脂質體、微粒和微膠囊中而進行遞送。盡管其他的有效的給藥形式例如關節(jié)內注射、吸入噴霧、口服和局部活性的制劑、透皮離子電滲療法或栓劑也是預期的，但本發(fā)明的治療組合物可通過注射經腸胃外給藥。一種優(yōu)選的載體是生理鹽水溶液，但預期也可以使用其他藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，預期載體和色酮構成生理相容的緩釋制劑。此種載體中的主要溶劑的性質可以是水性或非水性的。此外，該載體可包含其他藥理上可接受的用于改變或維持制劑的pH、滲透壓、粘度、澄清度、色澤、無菌性、穩(wěn)定性、溶解速率或氣味的賦形劑。類似地，該載體仍可包含其他藥理上可接受的用于改變或維持配體的穩(wěn)定性、溶解速率、釋放或吸收的賦形劑。此類賦形劑為通常且常規(guī)用于配制以單劑量或多劑量的形式用于胃腸外給藥的劑型的那些物質。
—旦配制治療組合物，就可將其以溶液劑、混懸劑、軟膏劑、凝膠劑、固體或脫水或凍干粉的形式貯存在無菌瓶中。此類制劑可以即用型或需要在給藥前進行復溶的形式貯存。將包含該組合物的制劑用于系統(tǒng) 給藥的給藥方式可通過口服給藥、皮下給藥、肌肉內給藥、靜脈內給藥、局部給藥、鼻內給藥或通過陰道或直腸栓劑給藥。對具體疾病或病癥而言對治療有效的組合物的量將取決于疾病或癥狀的性質，其可通過標準的臨床技術確定。此外，可任選地采用體內或體外試驗以有助于確定最佳的劑量范圍。制劑中所采用的準確劑量還將取決于給藥途徑，以及疾病或病癥的嚴重性或進展，并且應根據(jù)醫(yī)生和各個患者的狀況決定。可根據(jù)體外或動物模型試驗系統(tǒng)獲得的劑量-響應曲線外推出有效的劑量。例如，可通過給藥梯度劑量的組合物并觀察所需的作用從而簡單地確定本發(fā)明組合物的有效量。本發(fā)明的治療方法包括向有此需要的哺乳動物(包括但不限于人)體內或局部給藥治療有效量的來自一個或多個來源的一種或多種色酮。色酮或其混合物的純度可在0.01%-100%的范圍內，這取決于用于獲得該化合物的方法?？诜o藥、注射給藥、局部給藥、氣霧劑、栓劑、皮內給藥的色酮組合物的濃度可占適當制劑的總量的0.001重量％-99.99重量 %?？赏ㄟ^標準給藥途徑使用色酮，所述給藥途徑選自由口服給藥、局部給藥、氣霧劑、栓劑、皮內給藥、肌肉內給藥和靜脈內給藥組成的組，其每日劑量在0.01 mg/kg-500 mg/kg哺乳動物(特別是人)體重的范圍內。
實施例以下提供的實施例僅用于說明的目的，而非用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1.從干植物制備有機和水性提取物將干燥的植物材料研磨至粒徑不大于2 mm，使用ASE 300實施例2.小鼠3T3-L1細胞系和培養(yǎng)條件胚鼠細胞系3T3-LI (American Type Culture Collection, Manassas, VA)是可由前脂肪細胞分化成脂肪細胞態(tài)的瑞士白化細胞系 3T3 (3T3 swiss albino line)的亞株。將這些前脂肪細胞在包含10%胎牛血清 (FBS)的Dulbecco's改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM， Mediatech， Inc., Herndon, VA)中培養(yǎng)。
實施例3.脂連蛋白ELISA分析為了建立分化程序，將3T3-L1細胞平鋪到96孔板中并培養(yǎng) 過夜至匯合。在匯合后2天誘導匯合細胞分化。向培養(yǎng)基中補充0.5mM異丁基甲基黃嘌呤、1.0 pM地塞米松和1.7 jiM胰島素(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)進行誘導。在第7天，使用對照化合物或植物提取物處理脂肪細胞24小時。所有對照和植物提取物均溶于DMSO，并以總體積的1%加入到培養(yǎng)基中。收集細胞培養(yǎng)基以測量脂連蛋白水平，并根據(jù)制造商的方法(R&D Systems, Minneapolis, MN)通過酶聯(lián)免疫分析(ELISA)進行分析。該分析的敏感度范圍為31.25-2000 pg/mL。陽性對照的檢測范圍為0.01-300 pM(圖1)。吲哚美辛和曲格列酮均在l pM觀察到脂連蛋白水平的最大增長倍數(shù)，其脂連蛋白水平的增長分別為1.6和1.7倍。由于該分析的信號背景比差(小于2)，因此需要對上述方法進行改進。如上所述平鋪脂肪細胞并使其分化。使細胞在添加或不添加胰島素的分化培養(yǎng)基中分化48小時。隨后，使用對照化合物或植物提取物在分化后處理細胞僅48小時。所有其他參數(shù)都與上述的參數(shù)相同。分別在10-100 ^M和3-30nM檢測吲哚美辛(圖l)和曲格列酮(數(shù)據(jù)未顯示)對照。脂連蛋白水平的最大增加為高于基線信號52倍，其通過用100 mM吲哚美辛處理而達到，而最小增加為用10pM吲哚美辛時的增加7倍(圖1B)。通過曲格列酮處理而達到的脂連蛋白最大增加為30 pM時的增加49倍，而3 pM時觀察到脂連蛋白水平的最小增加倍數(shù)，為24倍(數(shù)據(jù)未顯示)。這兩種化合物顯示的脂連蛋白水平增加均顯著高于公開的數(shù)據(jù)。
實施例4.篩選增強脂肪細胞中脂連蛋白生產的植物提取物使用實施例3中描述的脂連蛋白ELISA分析篩選植物提取物庫。使用吲哚美辛和曲格列酮作為對照，篩選按實施例1的描述分離的有機提取物，一式三份。在2059種粗提取物中，有14.9%(139種提取物)誘導了高于對照水平的脂連蛋白生產。在這些陽性提取物中，37種提取物(總數(shù)的1.8%)的活性高于最低濃度(3 MM)的曲格列酮對照。通過連續(xù)稀釋對這37種提取物再次進行試驗。來自好望角戸薈葉滲出物的有機提取物 P0017-OE顯示出對脂連蛋白誘導的良好的劑量效應曲線(圖2)，并選擇其用于進一步的評價。
實施例5.獲自好望角蘆薈的活性有機提取物的高通量純化(HTP)選擇P0017-OE用于生物分析引導的活性化合物分級。將 P0017-OE (400 mg)裝載到預裝填的正向快速柱(2 cm ID x 8.2 cm， 10g硅膠) 上。使用Hitachi高通量純化(HTP)系統(tǒng)，以(A) 50:50 EtOAc:己烷和(B)甲醇為梯度流動相(由100% A到100% B)在30分鐘內以5 mL/分鐘的流速對柱進行洗脫。使用寬帶波長UV檢測器監(jiān)測分離，并使用Gilson餾分收集器將餾分以1.9 mL/孔收集到96深孔板中。將具有相似UV吸收和保留時間的餾份組合成8個細分餾份，并在低真空下干燥并離心，將其命名為 P0017-OE-HTPF1-F1、 F2、 F3、 F4、 F6、 F6、 F7禾口F8(圖3)。使用畫SO 溶解各個細分餾份(50 pg&l)并將其部分(2 pl)用于脂連蛋白分析。 P0017-OE-NP-F3是8個細分餾份中活性最高的一個。實施例6. P0017-OE-NP細分餾分的LC-MS/PDA去冗余因為在脂連蛋白分析中證明P0017-OE-NP-F3是活性最高的細分餾分，因此利用LC-MS/PDA分析從HTP分級獲得的各個P0017-OE-NP 細分餾分，并相互比較以發(fā)現(xiàn)P0017-OE-NP-F3中的獨特化合物峰?；诜?子量和文獻檢索，認為P0017-OE-NP-F3中最可能的活性活化物的分子量為 394 (蘆薈苦素)和396 (aloesinol)。
實施例7.從好望角蘆薈中提取并純化蘆薈苦素和Aloesinol用甲醇(3x)提取好望角蘆薈葉滲出物(P0017)(200g)。在低真空下蒸發(fā)組合的甲醇溶液，從而獲得甲醇提取物。使用實施例6 P0017-OE-NP-F3中描述的方法從P0017分出甲醇提取物(5 g)。將活性餾分 (等價于實施例6的P0017-OE-NP-F3餾分)裝載到Phenomenex Luna 。18柱 (250 x 30 mm 10 p)上，并在Hitachi高通量純化(HTP)系統(tǒng)上使用水(A)和甲醇(B)的梯度流動相(從90% A到100% B)以5 mL/分鐘的流速進行洗脫，隨后用100%甲醇清洗10分鐘。使用寬帶波長UV檢測器監(jiān)測分離，并使用 Gilson餾分收集器將餾分收集到管中。從4個ds柱洗脫中手工收集10個主要的化合物峰。將10個餾分干燥并通過重結晶純化，并命名為 P0017國AC 1 、 P0017-AC2 、 P0017-AC3 、 P0017-AC4 、 P0017垂AC5 、 P0017-AC6 、 P0017-AC7、 P0017-AC8、 P0017-AC9和P0017隱AC10(圖4)。 P0017-AC1和 P0017-AC2在脂連蛋白分析中顯示出活性并且分別被鑒定為蘆薈苦素和 aloesinol。其他8個化合物無活性或活性較小。
實施例8.蘆薈苦素和Aloesinol的詳細鑒定聲薈苦素(UP394):產量由P0017-OE-NP-F3的產量為 2.4% (純度> 98%， HPLC); UV(Max): 248.4和295.9 nm; MS(ESI，負離子檢測)m/z 393 (M-1,100%)。該樣品的峰與戸薈苦素標準品相同，其在 HPLC色譜圖上的保留時間相同(圖5)。
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Aloesinol(UP396):產量由P0017-OE-NP-F3的產量為 1.4%(純度> 97%， HPLC); UV(Max): 248.4禾卩295.9 nm; MS(ESI,負離子檢測)m/z 395 (M - 1， 100%)。該樣品峰與aloesinol標準品相同，其在 HPLC色譜圖上的保留時間相同(圖6)。
實施例9.從好望角蘆薈提取物制備和定量蘆薈苦素按照標題為"Method of Purification of Aloesin"的美國專利第 6,451,357號的描述，通過制備性色譜柱，其后通過重結晶進一步純化，從好望角蘆薈全葉提取物分離提取出蘆薈苦素(UP394)，該文獻通過引用全文并入本文。簡而言之，得自于好望角蘆薈全葉的干提取物曾溶于熱水并過濾以除去不溶性顆粒。隨后，將提取物裝載到裝填有CG-161樹脂的反相柱上，并在用DI水清洗柱后，用20-30。/。甲醇將戶薈苦素(UP394)從柱中洗脫。將20-30%甲醇洗脫液組合并蒸發(fā)。使固體在醇/水溶劑中重結晶直到根據(jù)以下HPLC法測定的其純度〉90。/。，且沒有蒽醌污染物(蘆薈素A & B 的含量不超過100 ppm)為止。使用公開的HPLC法(Zahn (2007) Phytochem. Anally: 1002-1024) ，對色酮例如盧薈苦素(UP394)， aloesinol (UP396)和戸薈樹脂A進行相對于蒽醌污染物(即蘆薈素A& B)的定量。在帶有L-7100泵、 L國7200自動取樣器和L7300柱式加熱爐的Hitachi L-7000 HPLC系統(tǒng)上進行分析。該方法使用與C18保護柱偶聯(lián)的Phenomenex IB SIL C18柱(250 mm x 4.6 mm， 5 p粒徑)。在最初的5分鐘內，流動相由起始比例為66%:34%的水/甲醇梯度組成。該比例在15分鐘內變?yōu)?4體積％水76體積％甲醇，隨后在此比例下再保持2分鐘。在下次的樣品注射前，用66%水和34%甲醇使柱平衡5分鐘。流速為1.0ml/分鐘。使用L-7400UV檢測器在297nm 波長下檢測色酮和蒽醌。基于HPLC保留時間鑒定色酮和蒽醌，并基于相對于單獨的色酮和蒽醌標準物的峰面積進行定量。據(jù)報道，在好望角戸薈的粗提取物中戸薈苦素(UP394)的含量為24.8重量％，而蒽醌為22重量。/o(Zahn, (2007) Phytochem. Anal.1^:1002-1024)。據(jù)報道，在不同的巴巴多斯蘆薈葉中，蘆薈苦素的含為0.32 mg/g(即0.032%)，而總色酮含量為0.1037%。另一方面，蒽醌(蘆薈素八& B)的含量比蘆薈苦素的含量高幾乎4倍(1.14 mg/g或0.114%) (Park (1998) Phytochem. Anal. 2:186-191)。使用脫色法和其他生產方法，從庫拉索蘆薈全葉噴霧干燥膠粉(Lo說RM040805-02 & RM040805-05)和庫拉索戸薈膠粉——Qmatrix脫水物(Lo說RM120806-01)中完全除去蘆薈苦素和蒽醌(根據(jù)HPLC分析，兩者均低于50 ppm)。分離自好望角蘆薈葉提取物的經分離和純化的蘆薈苦素(UP39)(Lot弁A-2705和Lot弁I1506AW)的純度分別為93。/o和100.6%,且總蒽醌小于50ppm。如以下實施例所述，使用不含蒽醌(總蒽醌——戸薈素A & B<50 ppm)的戸薈苦素(UP394)生產富含色酮的組合物N931和UP780。
實施例10.通過蘆薈素(UP394)和Aloesinol(UP396)增強脂連蛋白生產如實施例3所述，檢測兩種純色酮UP394(蘆薈苦素)和 UP396(aloesinol)在30 pM時使脂肪細胞的脂連蛋白生產的提高。蘆薈苦素和aloesinol分別使脂肪細胞的脂連蛋白生產提高2倍和3.2倍(圖7)。
實施例11.N93KLo說D1205-01)的詳細制備通過將分離自好望角蘆薈葉滲出物的純色酮蘆薈苦素 (UP394)與由庫拉索蘆薈制備的全葉膠粉組合來生產該獨特的組合物 (N931)。來自兩種蘆薈的標準色酮組合物包含不少于1.4%的色酮——即戸薈苦素(UP394)。按照實施例9所示，以及標題為"Method of Purification of Aloesin"的美國專利第6,451,357號的進一步描述，通過制備性色譜柱分離，其后通過重結晶進一步純化，從好望角蘆薈全葉滲出物分離提取出蘆薈苦素(UP394)，所述文獻通過引用全文并入本文。將該獨特的標準色酮組合物確定為N931。隨后，將0.811 kg蘆薈苦素(純度93%，含水量5%的Lot# A-2705)加入到50 kg的庫拉索蘆薈全葉噴霧干燥膠粉(Aloecorp分裝號5020; LotttRM-040805-02和RM-040805-05)，并使用V-攪拌機將混合物混和。啟動加強棒(intensifierbar)并同時運行加強棒和殼(shell),混合時間不少于5分鐘且不多于7分鐘。僅關閉加強棒，并繼續(xù)混合不少于5分鐘且不多于10分鐘。再次啟動加強棒，并混合不少于5分鐘且不多于7分鐘。停止混合，收集混合的物質，并通過HPLC法將UP780中的蘆薈苦素含量定量，為1.5%，并通過如實施例9所述的HPLC法將總蒽醌含量定量，為小于50 ppm。
實施例12.高脂肪飲食誘導的前糖尿病模型開發(fā)出高脂肪飲食誘導的動物模型并將其用于評價色酮提取物的潛在治療作用。C57BL/6J是可用于研究代謝疾病、葡萄糖耐量受損的病理生理學以及開發(fā)新型治療劑的臨床上相關的動物模型(Ahren等(2004) Diabetes 53 (Supplement 3):S215-S219: Laakso等(2004) Diabetes Care 22:2253-2259; Kahn等(2004) Diabetes 2:3274-3285; Scheurink等(1998) European J Endo. ，:461-467; Yuan等(2002) Diabetes il:1851-1858; Reitman等 (2005) Endocrinology遞:3258-3264; Vlassara等(2005) Diabetes M:2314-2319 ; Cawthome等 (2002) Molecular and Cellular Proteomics j_:509-516)。 Surwit等人在1988年首先解釋了模型的誘導方法 (Diabetes, 22:1163-1167)。簡而言之，飼喂高脂肪飲食8周時，在C57BL/6J 小鼠中成功造成了葡萄糖耐量受損以及代謝疾病樣的癥狀。6周齡的雄性 C57BL/6J小鼠購自Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)。在適應期后1周，將動物分組(11=5或6)，并提供高脂肪(45% kcal)鼠糧(Research diets, Inc., New Brunswick, NJ)和水，供其隨意取食12周，但在葡萄糖和胰島素耐受試驗時禁食3小時。以12小時的光照一黑暗循環(huán)將動物飼養(yǎng)在溫度受控的空間(22,2T:沖。如上文所述，每周監(jiān)測血糖、膽固醇和甘油三酯，持續(xù)12 周。每周測量一次體重，持續(xù)12周。 —旦代謝疾病的誘導通過所選參數(shù)(葡萄糖、甘油三酯和膽固醇)的每周監(jiān)測而得到確認，例如在第8周確認，則開始進行每日腹膜內治
60療，并持續(xù)4周。在研究中每天將測試化合物和陽性對照GW1929(Tocris Bioscience, Ellisville MO，批次弁2A/58705)溶于0.5。/。甲基纖維素(Sigma， St. Louise MO， Lot# 116H0857)并分別以100和5 mg/kg的腹膜內劑量遞送。由于GW1929不能在甲基纖維素中完全溶解，因此首先將其溶于 DMSO(Sigma, St Louise MO，批號# 064K0067)中。隨后，在給藥前將各化合物(包括運載體)的終濃度調節(jié)至包含5% DMSO。運載體處理的動物僅接受0.5%的甲基纖維素。在給藥各化合物或運載體后沒有觀察到可檢測的刺激標記。所使用的陽性對照gw1929——n-(2-苯甲酰苯基)-0-[2-(甲基墨2-吡啶基氨基)乙基]-L-酪氨酸——是批分子量為504.59的黃色固體粉末 (Tocris Bioscience, Ellisville MO,批號# 2A/58705)。該化合物是具有口服活
性的選擇性PPARy激動劑。其在口服給藥后降低糖尿病動物模型中的葡萄糖、脂肪酸和甘油三酯水平(Brown等(1999) Diabetes趄:1415; Way等 (2001) J. Biol. Chem. 22^:25651-25653)。向動物提供高脂肪飲食，持續(xù)12 周。在第8周開始進行治療并持續(xù)4周。
實施例13. UP394和UP396對胰島素抵抗的作用如實施例12所述，在通過腹膜內給藥GW1929 (5 mg/kg)、 UP394(100mg/kg)、 UP396 (100 mg/kg)和運載體進行處理的第18天，以2 g/kg的劑量使用C57BL/6J小鼠進行腹膜內葡萄糖耐受試驗。在給藥葡萄糖前使動物禁食3小時。在0、 30、 60、 90和120分鐘時測量血糖水平。所述數(shù)據(jù)為平均值土SD， n = 6。與運載體相比，GW1929和UP396在60、 90 和120分鐘時觀察到顯著的葡萄糖利用，p〈0.05。與運載體相比，GW1929、 UP394和UP396在T0的P值分別為0.00、0.87和0.43;在T30分別為0.07、 0.16和0.23。與運載體相比，UP394在T60的P值為0.15，在T90為0.10，在T120為0.17(圖8A)。在胰島素耐受試驗中UP394和UP396均顯示出胰島素敏感化的作用。如實施例13所述，在通過口服給藥GW1929 (5 mg/kg)、UP394 (100mg/kg)、 UP396 (100 mg/kg)和運載體進行處理的第24天，以0.5單位/kg 的劑量使用C57BL/6J小鼠進行腹膜內胰島素耐受試驗。在注射胰島素前使動物禁食3小時。在0、 30、 60、 90和120分鐘時測量血糖水平。所述數(shù) 據(jù)為平均值士SD， n=6。與運載體相比，UP394和UP396及GW192在時間點T30、 T60和T90觀察到顯著的葡萄糖清除，p<0.05。與運載體相比， GW1929、 UP394和UP396在TO的P值分別為0.00、 0,14和0.67;在T120 分別為0.08、 0.00和0.04(圖8B)。
實施例14. UP394和UP396在高脂肪飲食誘導的胰島素抵抗模型中對胰島素敏感性的作用在用化合物UP394和UP396處理的動物中進一步證明了口服給藥UP394 (100 mg/kg)和UP396 (100 mg/kg)對胰島素抵抗的作用。這些動物中的胰島素水平顯著降低。使用胰島素ELISA試劑盒(Crystal Chem -Chicago, IL)測量血漿胰島素水平。在詞喂高脂肪飲食8周后，用GW1929、 UP394和UP396及運載體處理動物2周(圖9)。通過尾靜脈收集血液并離心收集血漿。與運載體組相比，第14天在GW1929、 UP394和UP396處理組觀察到血漿胰島素水平顯著下降，尸<0.05。
實施例15.N931對db/db小鼠中空腹葡萄糖水平的作用每周測量GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和運載體處理的雄性必AZ6小鼠(每組8只)的空腹葡萄糖水平。除禁食期外，向動物提供 T2018鼠糧，供其任意取食。在進行測量前使動物禁食過夜。如圖IO所示，在10周的處理期內，運載體處理小鼠的葡萄糖水平隨時間增加。參考化合物GW1929能夠如預期地將葡萄糖水平保持在基線水平。與GW1929相似， N931從處理第5周開始使葡萄糖水平充分降低。與運載體相比，N-931在第6、 7、 9和IO周使空腹血糖水平顯著降低，P<0.05。在處理的第10周，在N931處理組中觀察到葡萄糖水平下降46%。實施例16.N931對db/db小鼠模型中胰島素抵抗的作用在處理10周后，以3g/kg的劑量在db/db小鼠上進行口服葡萄糖耐受試驗。除禁食期外，向動物提供T2018鼠糧，供其任意取食。在給藥葡萄糖負荷前使動物禁食過夜。用GW1929 (5 mg/kg)、N931 (375 mg/kg) 和運載體處理小鼠(每組8只)10周。在給藥葡萄糖負荷后的O、 30、 60、 90 和120分鐘測量血糖水平。與運載體相比，用GW1929或N-931處理的小鼠中在0和120分鐘時觀察到葡萄糖從循環(huán)系統(tǒng)的顯著清除，P < 0.05(圖 IIA)。該結果證明N931具有提高葡萄糖耐受的能力，由此改善必/必小鼠的胰島素敏感性。在處理6周后，以0.5單位/kg的劑量在db/db小鼠上進行腹膜內胰島素耐受試驗。在注射胰島素前使動物禁食過夜。用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和運載體處理必/必小鼠(每組8只)6周。在注射胰島素后的O、 30、 60、 90和120分鐘時測量血糖水平。在用GW1929 和N931處理的小鼠中同樣證實了胰島素敏感性的改善。與運載體相比， GW1929和N-931在0、 30和60分鐘時均觀察到顯著的葡萄糖清除，P< 0.05(圖IIB)。
實施例17.N931對db/db小鼠模型中甘油三酯的影響每周檢測GW1929 (5 mg/kg)、 N-931 (375 mg/kg)和運載體處理的雄性db/db小鼠的空腹甘油三酯水平，持續(xù)10周。除禁食期外，向動物提供T2018鼠糧，供其任意取食。在進行測量前使動物禁食過夜。該數(shù) 值以運載體的甘油三酯水平的百分比表示，n = 8。在處理10周后，與運載體相比，在經GW1929和N-931處理的動物中發(fā)現(xiàn)甘油三酯水平顯著下降， P〈0.05(圖12)。
實施例18.富含色酮的組合物(UP780)的制備和給藥通過將分離自好望角蘆薈葉滲出物的純色酮蘆薈苦素 (UP394)與由庫拉索蘆薈制備的葉膠粉組合來生產該獨特的組合物(UP780)。來自兩種戸薈的標準化的色酮組合物包含不少于2%的色酮—— 即蘆薈苦素(UP394)以及小于50 ppm的總蒽醌。按照實施例9的描述，以及標題為"Method of Purification of Aloesin"的美國專利第6,451,357號的描述，通過制備性色譜柱分離，其后通過重結晶進一步純化，從好望角蘆薈全葉滲出物提取分離出色酮蘆薈苦素(UP394)，上述文獻通過引用全文并入本文。將該獨特的標準化的色酮組合物確定為UP780。下述方法用于制備一批5 kg的富含蘆薈色酮的庫拉索蘆薈膠粉UP780。這是包含不少于2%的庫拉索蘆薈膠粉中的蘆薈苦素的標準蘆薈膠組合物。將從好望角蘆薈全葉滲出物純化的0.11 g蘆薈苦素(Lo說 11506AW，純度100.6%)添加到4.90 kg庫拉索蘆薈膠(Qmatrix⑧脫水)粉 (Aloecorp分裝號AA8010XQ80， Lot# RM-120806-01)中。將該混合物混合以獲得蘆薈色酮標準化組合物UP780(Lot弁L1806QMAW-01)。通過HPLC 確認該組合物(UP780)中蘆薈苦素(UP394)的含量為2.2%，沒有蒽醌污染物。在動物接受8周高脂肪飲食后，一旦代謝疾病的誘導通過對所選參數(shù)的每周監(jiān)測得到確認，則開始進行每日口服處理。每天將測試物和陽性對照GW1929 (Tocris Bioscience, Ellisville MO，批號弁2A/58705)溶于 0.5。/o甲基纖維素(Sigma， St. Louise MO, Lot# 116H0857)并分別以100、 200 和400 mg/kg的口服劑量遞送UP780 (Lot # L1806QMAW-01); 400mg/kg Qmatrix⑧庫拉索戸薈膠粉(QM400， Lot# G6319103-L3)以及5 mg/kg GW1929。由于GW1929不能在甲基纖維素中完全溶解，因此首先將其溶于DMSO (Sigma, St. Louise MO，批號# 064K0067)中。隨后，在給藥前將測試化合物(包括運載體)的終濃度調節(jié)至包含5% DMSO。載體運載體處理的動物僅接受0.5%的甲基纖維素。在給藥藥物或運載體后沒有觀察到可檢測的刺激標記。實施例19. UP780對高脂肪飲食誘導的C57BL/6J小鼠的效力和劑量范圍研究如實施例12所述，由Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 購得6周齡的雄性C57BL/6J小鼠。在適應期后1周，將動物分成6組(n-7)，并提供高脂肪(45% kcal)鼠糧(Research Diets, Inc.， New Brunswick, NJ) 和水，供其隨意取食12周，但在葡萄糖和胰島素耐受試驗時禁食3小時。以12小時的光照一黑暗循環(huán)將動物飼養(yǎng)在溫度受控的空間(22.2°C)中。在具有飼料和飲水部分的鼠籠中圈養(yǎng)3或4只雄性C57BL/6J 小鼠。通過測量預稱重的高脂肪粒數(shù)值與當天剩余量間的差別確定每日的飼料攝取量。在整個研究過程中每周測量體重一次。使用得自于尾靜脈的15-20 pl血液測量空腹血糖、總膽固醇和甘油三酯水平。使用帶有Prestige試紙帶(Walgreen, Home Diagnostics, Incv Ft. Lauderdale, FL)的IQ血糖監(jiān)測系統(tǒng)測定血糖，用帶有PTS Panels試紙帶 (Polymer Technology System, Inc, Indianapolis, IN)的CardioChek分豐斤儀觀!l 定膽固醇和甘油三酯，從而測定膽固醇和甘油三酯的全血值。在處理開始后的第0天(基線)、第3周和第9周進行腹膜內葡萄糖耐受試驗。在試驗當天，使動物禁食3小時并接受劑量為2 mg/g的腹膜內給藥。在遞送葡萄糖后O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120分鐘測定血糖水平。從尾靜脈取血。在第10周進行腹膜內胰島素耐受試驗。使動物禁食3小時，接受劑量為0.5IU/kg的腹膜內胰島素給藥(酵母中表達的人重組蛋白，Sigma，St,Louis，MO， Lot# 055K1321)。在給藥胰島素后O分鐘(胰島素注射前)、30、 60、 90和120分鐘測定血糖水平。從尾靜脈取血。
實施例20. DNA微陣列的材料和方法將小鼠分成7個處理組，每組選擇3只動物用于組織收集。在處理10周后，用C02氣體麻醉小鼠，在安樂死后5分鐘內收集肝臟、體壁肌肉和脂肪。將組織切成小于5 mm的塊，并在組織收集期間浸入RNALater溶液(Ambion)中貯存，隨后轉移到-8(TC冰箱中長期貯存。在分離RNA時，將小鼠組織解凍并從RNALater貯存溶液中取出。使用RNEasy 總RNA分離試劑盒進行肝臟總RNA提取，并使用RNEasy纖維組織試劑盒(Qiagen)進行肌肉總RNA提取。在RNEasy試劑盒中附帶的含異硫氰酸胍和P-巰基乙醇的RLT溶液中用Dunce玻璃均質器將組織均質化。通過 260/280 nm波長下的UV吸收定量所提取的RNA。使用變性乙二醛瓊脂糖凝膠(1%)電泳，根據(jù)28S和18S rRNA帶的完整性以及基因組DNA的缺乏確定RNA的質量。當從凝膠中觀察到基因組DNA時，使用RNEasy試劑盒對具體的RNA樣品進行第二輪提取。選擇Affymetrix小鼠基因組430 2.0陣列用于DNA微陣列研究。每個陣列包含34，000個小鼠基因的45,000個探針組，以及用于雜交的對照序列、poly-A、 100個標準化探針組和管家基因。從12家Affymetrix 授權的服務提供商列表中選擇CoGenics進行cRNA合成、雜交/清洗、掃描程序，并使用Affymetrix GCOS軟件進行數(shù)據(jù)分析。CoGenics使用 NanoDrop分光光度計和Agilent 2100生物分析儀對所接收的RNA樣品進行其本身的內部RNA質量控制。在微陣列加工期間，Cogenics還對cRNA 以及微陣列數(shù)據(jù)集進行質量控制。對于小鼠肝臟，選擇瘦型對照(LC)、高脂肪飲食(LV)和高脂肪飲食+ 200 mg/Kg UP780 (LUP)進行微陣列分析試驗，共計9個陣列。所有的RNA、 cRNA和最后的微陣列數(shù)據(jù)集均通過了質量控制。 Affymetrix小鼠基因組430 2.0陣列按標準Affymetrix陣列設計每個探針組11對探針，每對探針包含一個完全匹配(PM)和一個錯配 (MM)的25-mer寡核苷酸。通過GCOS的數(shù)據(jù)分析使用了經背景扣除的PM 和MM 二者的強度值。對于每個探針組，將所有的11個PM值和11個 MM值相加成一個強度值。隨后，基于平均強度值以及用于陣列間比較的目標強度值對陣列數(shù)據(jù)集進行全面掃描。還使用Affymetrix軟件"Expression Console"進行獨立的微陣列數(shù)據(jù)分析。除了將GOCS中的MAS5算法用于強度加和之外，還將Expression Console中使用的RMA和PLIER算法用于
66強度加和。 MM探針的實用性現(xiàn)已成為爭論的對象。因此，我們用 Bioconductor軟件進行了僅使用PM值、校正背景的額外微陣列數(shù)據(jù)分析。每個處理組有3個陣列。使用MA繪圖判斷處理組內的陣列一致性。使用 R編程語言中的Bioconductor微陣列包的Loess函數(shù)對不一致性進行標準化。對于處理組的每個探針組，將33個PM值集合成一個強度值，進行l(wèi)og2 轉化。此外，在處理組之間，使用33對比33 PM值對每個探針組進行 ANOVA的統(tǒng)計試驗。在LUP對比LV、 LUP對比LC和LV對比LC處理組之間共進行了 3 x 45,000個ANOVA試驗。通過假陽性率(FDR)和Holm 的連續(xù)Boriferroni校正法檢測基因表達差異的顯著性，顯著性水平a = 0.05。微陣列數(shù)據(jù)集通常為數(shù)千個表達差異的基因，需要來自路徑分析軟件的協(xié)助以理解生物顯著性的意義。使用Ingenuity Pathway Analysis 軟件IPA5和相關的基因組數(shù)據(jù)庫分析從PM值總結得到的LC、 LV和LUP 陣列每組3份的小鼠肝臟數(shù)據(jù)集。應用了 ANOVAp￡0.0001， log2強度2 2.5，以及l(fā)og2比2 0.9三個截止標準。IPA5產生出40種規(guī)范途徑和70種功能，每種至少在三個數(shù)據(jù)集中有一個具有超過0.05的P閾值。(規(guī)范途徑來自常見的信號轉導和代謝途徑數(shù)據(jù)庫，例如Science STKE和KEGG。功能以Gene Ontology (GO)數(shù)據(jù)庫為基礎)。對成熟的規(guī)范途徑進行詳細分析，特別是顯示出UP780對營養(yǎng)代謝的清楚影響的上層代謝途徑(t叩 metabolic pathway) 。 IPA5產生的途徑分析數(shù)據(jù)列于表1中。
實施例21. UP780調控的基因表達的OPCR分析從小鼠組織中提取的總RNA通常超出微陣列試驗的需要。因此，將用于微陣列的相同的總RNA樣品保藏，以用于對微陣列結果的QPCR 確認，其通常在數(shù)月后進行。通常將總RNA貯存在-8(TC的冰箱中，且在長期貯存后未發(fā)現(xiàn)降解。為了使用總RNA進行cDNA合成的逆轉錄反應，使用了改進的逆轉錄酶SuperscriptIII，以及緩沖液、核苷酸、寡(dT》引物以及無RNAse的DNAseI，以上為Invitrogen為Superscript III提供的試劑。對于每個反應，在50 的反應體積中使用5嗎的總RNA。用水將第一鏈 cDNA稀釋至2.5倍體積，且每50^il的QPCR反應使用2W的cDNA。在使用前通過DNA測序分析確認用于各個基因的TagMan Gene Expression Assay的ABI引物和探針組。所有的探針均為FAM染料標記的MGB探針。在QPCR反應中使用來自ABI的2X TagMan Universal PCR Master Mix。使用ABI 7700測序檢測器進行熱循環(huán)和檢測，且通過ABI SDS軟件進行設備控制并獲取QPCR數(shù)據(jù)。使用AADt的相對定量法，且每個QPCR96孔板包含對照cDNA(LC)和對照引物，以及管家基因GAPDH的探針組。
實施例22. UP780的安全性評價從USDA授權的實驗室動物供應商Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA)購買專門培養(yǎng)的CD-I小鼠。在收到動物后使其適應環(huán)境1周，并在8周齡時用于研究。以12小時的光照一黑暗循環(huán)將動物飼養(yǎng)在溫度受控的空間(22.2'0中，并提供飼料和水，供其隨意取食。在處理第1天，在給藥前測量基線體重，此后至尸檢日前每周測量體重兩次。使用注射器和18號球頂喂食針，連續(xù)14天向處理組 (n=10， 5雄5雌)中的所有小鼠口服給藥含2.0g/kg UP780(Lo估 L1806QMAW-01)劑量的200 pl水運載體。對照組(11=10， 5雄5雌)僅接受 200 jal7乂。在試驗前以及試驗期間的每一天進行系統(tǒng)性的臨床觀察。監(jiān) 測動物的毒性體征，包括被毛、皮毛、眼睛、粘膜、運動力、呼吸、體態(tài) 的變化以及其他的異常體征。對所有藥物毒性體征進行臨床觀察，例如顫抖、痙攣、腹瀉、嗜睡、發(fā)病、肌束抽搐、脫毛、流涎、出膿和脫水。在試驗的最后一天，以2 L/分鐘的氧氣流速通過2%的異氟烷麻醉所有動物，收集血液并送至Antech Diagnostics, Inc (Portland, OR)進行全面的哺乳動物檢測。將全血樣品(淡紫色蓋的Microtainer中)用于血液學評價，將血漿(帶分離凝膠的綠色蓋Microtainer中)用于臨床化學評估。給所有動物抽血，并檢查大體病理情況。打開體腔后，立即對器官進行大體檢查，并收集食道、
68胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、肝臟、直腸、腦(多個切片)、
垂體、末梢神經和肌肉(髖部)、脊髓(3個水平)、眼睛、腎上腺、甲狀腺/ 副甲狀腺、胰腺、肺和氣管、喉、大動脈(胸部)、心臟、淋巴結(頸&腸系膜)、脾、胸腺、腎臟、膀胱、睪丸、附睪、精囊、前列腺、子宮頸、卵巢、子宮、膽囊、腿骨關節(jié)、皮膚、唾腺和舌的組織樣品，用10%的中性緩沖福爾馬林固定，并送往Research Pathology Services Inc (New Britain, PA)以進行用于顯微評估的組織病理制備。來自臨床化學、血液學、體重和食物消耗的所有非離散數(shù)據(jù) 均以平均值和標準差的形式列出。基于所發(fā)現(xiàn)的病理學、異常體征和數(shù)據(jù) 的統(tǒng)計評估對結果進行解釋。將pO.OOOl的肝臟基因表達差異標記為上調(T)和下調U)_
基因描述 -肝臟(基因表達差異倍數(shù)) LUP/LVLUP/LC LV/LC脂肪酸生物合成
ACC2Acetyl-CoA羧化酶2丄3.01丄2.54
FASN脂肪酸合成酶丄3.50丄2.33".5
ASCL3Acyl-CoA合成酶，長鏈3丄2.07丄1.49T 1.39
ACSS2Acyl-CoA合成酶，短鏈2i 1.63丄2.63i 1.62
SCD1硬脂酰-CoA去飽和酶丄4.44丄3.94
FADS2脂肪酸去飽和酶2丄3.24丄1.39".34
ME1蘋果酸酶1丄2.27丄2.03
ACYLATP擰檬酸裂解酶丄1.85丄1.57
脂肪酸的線粒體B-氧化
ALDH1B1醛脫氫酶1B1丄2.82丄1.75T 1.61
CPT1A肉毒堿棕櫚酰轉移酶1A丄1,86T 1.98
LCHAD用于P-氧化的三功能蛋白質，a丄1.57T 1.49
亞基
ACOT1ACYL-COA硫酯酶1丄5.87丄3.04卞1.93
類固醇生物和成
SREBF1固醇調節(jié)元件結合轉錄因子1丄2.38丄1.60T 1.49
畫GCR3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原丄1.54i2.37丄1.54
MVD甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶丄2.36丄2.06
CYP26A1細胞色素P450，、視黃酸，藥物代丄2.88丄6.53丄2.27
CYP7B1細胞色素P450，膽汁合成"T 1.94T 1.91
糖異生作用
PEPCK1磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1T 1.89" 06
脂肪轉運
CD36凝血栓蛋白受體，長鏈脂肪酸轉丄2.67i 1.25".14
運體
FABP5脂肪酸結合蛋白5丫 1.74丄1.67丄2.89
FABP4脂肪酸結合蛋白4個2.19卞2.43
LDLRLDL受體丄2.89i 1.60T 1.80
PPARa過氧化物酶體增殖物激活受體-a丄2.48".11
異生素的代謝
CYP2B9細胞色素P450丄20.83丄1.68T 11.88
CYP2C18細胞色素P450丄2.98丄2.60
GSTA5谷胱甘肽-S-轉移酶A5]_ 1.67丄4.08丄2.10
SOD3超氧化物歧化酶3，細胞外丄2.05丄1.37T 1.50
權利要求
1.用于提高脂肪細胞的脂連蛋白生產的方法，其包括向有此需要的對象給藥有效量的色酮或色酮的混合物；其中所述色酮或色酮的混合物選自具有以下結構的化合物組其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立地選自以下組中-H、-OH、-CH3、-SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羥基烷基、羥基烯基、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，選自沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂?；ズ土u基-肉桂酰基酯、三羥基苯甲酰基酯和咖啡?；ブ械孽?；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、己酮醣及其化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈，并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自-OH、＝O和-OR的取代基；X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和R為具有1-20個碳原子的烷基基團，和藥學上可接受的載體。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述色酮或所述色酮的混合物選自具有以下通式結構的化合物組<formula>formula see original document page 3</formula>其中，R。 R2和R3的定義如上所述。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述色酮選自蘆薈苦素或aloesinol。
4. 如權利要求1所述的方法，其中所述色酮從植物部分分離或通過合成方法獲得。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述植物選自由以下屬組成的組金合歡屬、水團花屬、蘆薈屬、鏈格孢屬、崖摩屬、五月茶屬、蒿屬、崗松屬、決明屬、書帶木屬、蛇床屬、旋花屬、淫羊藿屬、雞頭薯屬、艾里奧斯特門屬、番櫻桃屬、藤黃屬、金絲桃屬、鐘萼草屬、全能花屬、青霉菌屬、蓼屬、尸toera矽/o"、大黃屬、槐屬、冠網蝽屬、蒲桃屬、籃狀菌屬禾口 Zo"an'a。
6.如權利要求4所述的方法，其中所述植物選自以下組中兒茶、金合歡、木立蘆薈、巴巴多斯蘆薈、J/oe C,^W2印/H7fl、好望角戸薈、皂質戸薈、庫拉索聲薈、中華聲薈、JW/cfesma mew6ra"acew附、茵陳蒿、崗松、箭葉淫羊藿、爪哇鳳果、地耳草、虎杖、毛苦參和5^p/wm'他Ao^^ew^/。
7. 如權利要求4所述的方法，其中所述植物部分選自由以下組成的組莖、莖皮、干、干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、幼芽、種子、根莖、花和其它生殖器官、葉和其它氣生部分。
8. 如權利要求1所述的方法，其中所述色酮組合物包含0.01%至100% 的色酮。
9. 如權利要求1所述的方法，其中所述組合物以選自0.01-500 mg/kg 體重的劑量給藥。
10. 如權利要求1所述的方法，其中給藥途徑選自以下組中在適合的藥物制劑中口服給藥、局部給藥、栓劑、靜脈內給藥、皮內給藥、胃內給藥、肌肉內給藥、腹膜內給藥和靜脈內給藥。
11. 使高脂肪飲食誘導的有關脂肪酸生物合成、脂肪酸的線粒體卩-氧化、類固醇生物合成、糖異生作用、脂肪轉運、PPARa/RXRa肝信號轉導和異生素代謝的基因表達變化正?；姆椒?，所述方法包括向有此需要的對象給藥有效量的包含色酮或色酮混合物的組合物。
12. 如權利要求11所述的方法，其中所述色酮或色酮的混合選自具有以下結構的化合物組R" R2、 R3、 R4、 R5和Re獨立地選自以下組中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羥基烷基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X-，選自沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂?；ズ土u基-肉桂?；?、三羥基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯中的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈，并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自-OH、 K)和-OR中的取代基；X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和R為具有l(wèi)-20個碳原子的烷基基團，和藥學上可接受的載體。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述色酮或所述色酮的混合選自具有以下通式結構的化合物組<formula>formula see original document page 5</formula>其中，Rp R2和R3的定義如上所述。
14.如權利要求11所述的方法，其中所述色酮選自蘆薈苦素或 aloesinol。
15.如權利要求11所述的方法，其中所述色酮從植物部分分離或通過合成方法獲得。
16. 如權利要求15所述的方法，其中所述植物選自由以下屬組成的組金合歡屬、水團花屬、蘆薈屬、鏈格孢屬、崖摩屬、五月茶屬、蒿屬、崗松屬、決明屬、書帶木屬、蛇床屬、旋花屬、淫羊藿屬、雞頭薯屬、艾里奧斯特門屬、番櫻桃屬、藤黃屬、金絲桃屬、鐘萼草屬、全能花屬、青霉菌屬、蓼屬、Ptoera:^/o"、大黃屬、槐屬、冠網蝽屬、蒲桃屬、籃狀菌屬和Zo""n》。
17. 如權利要求15所述的方法，其中所述植物選自以下組中兒茶、金合歡、木立盧薈、巴巴多斯盧薈、X/oe crem"o; /H7a、好望角戸薈、皂質盧薈、庫拉索戸薈、中華盧薈、爿w"cferma we/w6rawacew/w、茵陳蒿、崗松、箭葉淫羊藿、爪哇鳳果、地耳草、虎杖、毛苦參和5^p/za"zto Aodoafew士/。
18. 如權利要求15所述的方法，其中所述植物部分選自以下組中莖、莖皮、干、干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、幼芽、種子、根莖、花和其它生殖器官、葉和其它氣生部分。
19. 如權利要求11所述的方法，其中所述色酮組合物包含0.01%至 100%的色酮。
20. 如權利要求11所述的方法，其中所述組合物以選自0.01-500 mg/kg體重的劑量給藥。
21. 如權利要求11所述的方法，其中給藥途徑選自以下組中在適合的藥物制劑中口服給藥、局部給藥、栓劑、靜脈內給藥、皮內給藥、胃內給藥、肌肉內給藥、腹膜內給藥和靜脈內給藥。
22. 用于預防和治療胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥的方法，所述方法包括向有此需要的對象給藥有效量的包含色酮或色酮混合物的組合物。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述色酮或色酮的混合物選自具有以下結構的化合物組<formula>formula see original document page 7</formula>Ri、 R2、 R3、 R4、 Rs和R6獨立地選自以下組中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代垸基、氧代烯基、羥基垸基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X'，選自沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂?；ズ土u基-肉桂?；?、三羥基苯甲?；ズ涂Х弱；ブ械孽?；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈，并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自-OH、 =0和-OR中的取代基；X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和R為具有l(wèi)-20個碳原子的烷基基團，和藥學上可接受的載體。
24.如權利要求22所述的方法，其中所述色酮或所述色酮的混合物選自具有以下通式結構的化合物組<formula>formula see original document page 8</formula>其中，Rp R2和R3的定義如上所述,
25.如權利要求22所述的方法，其中所述色酮選自蘆薈苦素或 aloesinol。
26. 如權利要求22所述的方法，其中所述色酮從植物部分分離，或通過合成方法獲得。
27. 如權利要求26所述的方法，其中所述植物選自由以下屬組成的組金合歡屬、水團花屬、蘆薈屬、鏈格孢屬、崖摩屬、五月茶屬、蒿屬、崗松屬、決明屬、書帶木屬、蛇床屬、旋花屬、淫羊藿屬、雞頭薯屬、艾里奧斯特門屬、番櫻桃屬、藤黃屬、金絲桃屬、鐘萼草屬、全能花屬、青霉菌屬、蓼屬、戶&erax;;/o"、大黃屬、槐屬、冠網蝽屬、蒲桃屬、籃狀菌屬禾卩Zowor/ao
28. 如權利要求26所述的方法，其中所述植物選自以下組中兒茶、金合歡、木立戸薈、巴巴多斯戸薈、J/oe cwmm^Ma、好望角蘆薈、皂質戸蔡、庫拉索盧簽、中華聲荼、Jw^5fes附a附e附6rawacew附、茵P東嵩、崗松、箭葉淫羊藿、爪哇鳳果、地耳草、虎杖、毛苦參和5fep/2a"/to T^ocfocfe^H。
29. 如權利要求26所述的方法，其中所述植物部分選自由以下組成的組莖、莖皮、干、干皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、幼芽、種子、根莖、花和其它生殖器官、葉和其它氣生部分。
30. 如權利要求22所述的方法，其中所述色酮組合物包含0.01%至 100%的色酮。
31. 如權利要求22所述的方法，其中所述組合物以選自0.01-500 mg/kg體重的劑量給藥。
32. 如權利要求22所述的方法，其中給藥途徑選自以下組中在適合的藥物制劑中口服給藥、局部給藥、栓劑、靜脈內給藥、皮內給藥、胃內給藥、肌肉內給藥、腹膜內給藥和靜脈內給藥。
33. 通過混合以下成分形成的組合物a) 90-99重量％的蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉；和b) l-10重量％的一種或多種色酮的混合物；其中所述色酮的混合物為基本上純的，且所述色酮的混合物基本不含蒽醌。
34 如權利要求33所述的組合物，其中所述蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉分離自巴巴多斯蘆薈或庫拉索蘆薈，且所述色酮的混合物分離自好望角蘆薈。
35. 如權利要求33所述的組合物，其中所述色酮或所述色酮的混合物選自具有以下通式結構的化合物組<formula>formula see original document page 10</formula>其中R!、 R2和R3獨立地選自以下組中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、垸基、烯基、氧代垸基、氧代烯基、羥基垸基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X-，選自沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂?；?酯和羥基-肉桂?；ァ⑷u基苯甲?；ズ涂Х弱；ブ械孽?；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈，并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自"OH、 K)和-OR中的取代基；X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和R為具有l(wèi)-20個碳原子的垸基基團，和藥學上可接受的載體。
36.如權利要求35所述的組合物，其中所述色酮選自蘆薈苦素或 aloesinol 。
37.通過混合以下成分形成的組合物a) 95-99重量％的蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉；和b) l-5重量％的一種或多種色酮的混合物；其中所述色酮的混合物為基本上純的，且所述色酮的混合物基本不含蒽醌。
38. 如權利要求37所述的組合物，其中所述蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉分離自巴巴多斯戸薈或庫拉索蘆薈，且所述色酮的混合物分離自好望角蘆薈。
39. 如權利要求37所述的組合物，其中所述色酮或所述色酮的混合物選自具有以下通式結構的化合物組<formula>formula see original document page 11</formula>其中R。 R2和R3獨立地選自以下組中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羥基垸基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -N^l—,選自沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂?；?酯和羥基-肉桂?；?、三羥基苯甲?；ズ涂Х弱；ブ械孽ィ灰约凹禾?或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物；包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈，并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自-OH、 =0和-011中的取代基；X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和R為具有l(wèi)-20個碳原子的烷基基團，和藥學上可接受的載體。
40.如權利要求39所述的組合物，其中所述色酮選自蘆薈苦素或 aloesinol 。
41.通過混合以下成分形成的組合物<formula>formula see original document page 12</formula>a) 98-99重量。/。的蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉；和b) 1-2重量％的一種或多種色酮的混合物；其中所述色酮的混合物為基本上純的，且所述色酮的混合物基本不含蒽醌。
42 如權利要求41所述的組合物，其中所述蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉分離自巴巴多斯蘆薈或庫拉索蘆薈，且所述色酮的混合物分離自好望角蘆薈。
43.如權利要求41所述的組合物，其中所述色酮或所述色酮的混合物選自具有以下通式結構的化合物組其中Ri、 R2和R3獨立地選自以下組中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羥基烷基、羥基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X-，選自沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基酯和羥基-肉桂酰基酯、三羥基苯甲?；ズ涂Х弱；ブ械孽?；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通過碳、氮、硫或氧與色酮相連，且其中所述己糖或戊糖選自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化學衍生物; 包括二聚體、三聚體及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基團為具有1-20個碳原子的直鏈和/或支鏈，并在不同的位置具有和/或不具有雙鍵和選自-OH、 =0和-OR中的取代基；X選自藥學上可接受的一組反荷陰離子，包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根；和R為具有l(wèi)-20個碳原子的烷基基團，和藥學上可接受的載體。
44. 如權利要求43所述的組合物，其中所述色酮選自戸薈苦素或 alocsinol o
45. 包含蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉和1-10重量％的一種或多種色酮的組合物；其中所述組合物基本不含蒽醌，且其中所述蘆薈膠分離自選自巴巴多斯蘆薈或庫拉索蘆薈的植物；且其中所述一種或多種色酮分離自好望角蘆薈。
46. 包含蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉和一種或多種色酮的混合物的組合物的制備方法，所述方法包括a. 制備包含一種或多種色酮的混合物的組合物；其中所述一種或多種色酮的組合物為基本上純的，且基本不含蒽醌；和b. 將步驟a)所述的組合物與蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉以1-10重量％的所述色酮混合物和90-99重量％的蘆薈膠粉或蘆薈全葉膠粉的比例組合。
全文摘要
本發(fā)明描述了來自植物來源的色酮和新型色酮組合物的鑒定和分離，所述色酮和新型色酮組合物上調脂肪細胞的脂連蛋白生產，并使與葡萄糖和脂肪酸代謝及信號轉導相關的上百個基因正常化。所述色酮組合物可有效增強脂肪細胞的脂連蛋白生產，并且調控參與脂肪酸生物合成、脂肪酸的線粒體β-氧化、類固醇生物合成、糖異生作用、脂肪運輸、PPARα/RXRα肝信號轉導和異生素代謝的基因。該色酮組合物可用于提高哺乳動物中的胰島素敏感性、改善葡萄糖耐受、降低甘油三酯水平以及平衡葡萄糖水平。本發(fā)明還包括用于預防和治療多種疾病和病癥的方法，所述疾病和病癥包括但不限于胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、代謝綜合征、血脂異常和高甘油三酯血癥。
文檔編號A61K31/35GK101631544SQ200880007809
公開日2010年1月20日申請日期2008年1月9日優(yōu)先權日2007年1月9日
發(fā)明者J·鄭-克蘭克, M·伊瑪姆, 琦賈, 趙吉福申請人:尤尼根制藥公司

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