專利名稱：生長激素分泌促進劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及以乳源堿性蛋白級分作為有效成分的生長激素分泌促進劑。本發(fā)明還涉及以乳源堿性蛋白級分作為有效成分的生長激素分泌促進劑，其中所述生長激素分泌促進由生長激素釋放激素的分泌促進介導(dǎo)。另外，本發(fā)明還涉及利用乳源堿性蛋白級分促進生長激素釋放激素分泌的方法。

背景技術(shù)：

生長激素具有生長相關(guān)作用和代謝控制作用。生長相關(guān)作用包括增強靶器官的細胞分裂，伸長骨骼，通過用骨組織替換骨端的軟骨組織來伸長骨骼，促進特定氨基酸的攝取，從而參與促進蛋白質(zhì)合成的肌肉發(fā)育。代謝控制作用包括促進碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類代謝的代謝促進作用；由于促進肝臟的糖原分解，且具有抗胰島素作用(抑制胰島素，升高血糖值)，從而可保持一定的血糖值的血糖升高作用；保持一定的鈣濃度等，從而維持體內(nèi)穩(wěn)定性的穩(wěn)定性維持作用；以及在能量不足時促進由脂肪組織釋放的游離脂肪酸形式的機體脂肪募集的作用。

生長激素釋放激素(ghrelin)是1999年從大鼠胃部分離的新的生長激素分泌促進肽，主要由消化道分泌，且是促進生長激素經(jīng)過血液或傳入迷走神經(jīng)由垂體分泌的生理性激素。生長激素釋放激素由28個氨基酸構(gòu)成，是具有第3個絲氨酸殘基被脂肪酸(n-辛酸)?；奶卣餍越Y(jié)構(gòu)的肽(參照非專利文獻1)。此新肽除具有強力的生長激素分泌促進活性外，還已知具有具有下列作用促進攝食(參照非專利文獻2)，調(diào)節(jié)消化道運動或胃酸分泌等的功能調(diào)節(jié)，如脂肪蓄積等對能量代謝系統(tǒng)的作用，及如血管擴張和心臟功能亢進等對循環(huán)系統(tǒng)的作用。已知生長激素釋放激素的分泌受絕食，低氨基酸攝食，生長激素分泌低下，對交感/副交感神經(jīng)或其受體的刺激，及膽囊收縮素或胃泌素的促進。近來報道了利用生長激素釋放激素或其衍生物的施用的糖尿病治療劑(參照專利文獻1)、充血性心力衰竭(參照專利文獻2和3)，生長激素分泌促進劑(參照專利文獻4)。這些報道僅為施用生長激素釋放激素或其衍生物本身，并非促進生長激素釋放激素的分泌。另外，由于生長激素或生長激素釋放激素是蛋白質(zhì)，會被消化道酶分解，所以認為，即便將其直接經(jīng)口攝取也不會發(fā)揮效果。

若要如上所述促進生長激素的分泌，與其攝取含生長激素或生長激素釋放激素的藥物，不如開發(fā)促進具有促進生長激素分泌的作用的生長激素釋放激素的分泌的分泌促進劑。而且優(yōu)選開發(fā)可日常攝取，且經(jīng)長期攝取也具有高安全性的生長激素分泌促進劑。
專利文獻1WO 2004/004772 專利文獻2特許公表2005-507949號公報 專利文獻3特許公表2005-535707號公報 專利文獻4特開2005-82489號公報 非專利文獻1Nature 1999，402656-660 非專利文獻2Nature 2001，409194-198

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)課題
本發(fā)明旨在提供可日常攝取，且經(jīng)長期攝取也具有高安全性的具有生長激素分泌促進作用的物質(zhì)。本發(fā)明還以得到生長激素分泌促進由生長激素釋放激素的分泌促進介導(dǎo)的生長激素分泌促進劑為課題。
解決課題的技術(shù)方案
發(fā)明人為得到具有生長激素分泌促進作用的物質(zhì)而持續(xù)研究了乳中存在的生長激素分泌促進因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳中僅微量存在的堿性蛋白具有促進具有促進生長激素分泌的作用的生長激素釋放激素的分泌的效果。從而發(fā)現(xiàn)可將所述乳源堿性蛋白級分用作生長激素分泌促進劑的有效成分，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明是以乳源堿性蛋白級分作為有效成分的生長激素分泌促進劑，且是生長激素分泌促進由生長激素釋放激素的分泌促進介導(dǎo)的生長激素分泌促進劑。另外還涉及利用乳源堿性蛋白級分促進生長激素釋放激素分泌的方法。
發(fā)明效果
由于可通過施用本發(fā)明的以乳源堿性蛋白級分作為有效成分的生長激素分泌促進劑來促進生長激素釋放激素的分泌，從而可用于促進攝食，如調(diào)節(jié)消化道運動和胃酸分泌等的功能調(diào)節(jié)，以及治療和預(yù)防如脂肪蓄積等能量代謝系統(tǒng)的疾病及如血管擴張和心臟功能亢進等循環(huán)系統(tǒng)的疾病。
另外，由于可通過施用以乳源堿性蛋白級分作為有效成分的生長激素分泌促進劑來經(jīng)過生長激素釋放激素的分泌促進生長激素的分泌，從而可用于骨骼伸長、肌肉生長及血糖升高。
附圖簡述


圖1示堿性蛋白級分施用組與對照組中各大鼠血清中的生長激素釋放激素濃度。
圖2示堿性蛋白級分施用組與對照組中各實驗組大鼠血清中的生長激素釋放激素濃度。
圖3示堿性蛋白級分施用組與對照組中各大鼠血漿中的生長激素濃度。
實施方式
本發(fā)明的生長激素分泌促進劑的特征在于以乳源堿性蛋白級分作為有效成分。所述乳源堿性蛋白級分可從牛乳、人乳、山羊乳、綿羊乳等哺乳類的乳中得到。
已知如下得到所述乳源堿性蛋白級分的方法 使乳或乳源原料與陽離子交換體接觸而吸附堿性蛋白后，用大于pH5、離子強度大于0.5的洗脫液洗脫所述吸附于陽離子交換體的堿性蛋白的方法(特開平5-202098號公報)； 用藻酸鹽凝膠得到的方法(特開昭61-246198號公報)； 利用無機多孔顆粒從乳清得到的方法(特開平1-86839號公報)； 利用硫酸酯化合物從乳清得到的方法(特開昭63-255300號公報)， 本發(fā)明可通過利用上述這些方法得到的乳源堿性蛋白級分。

本發(fā)明的乳源堿性蛋白具有下列性質(zhì)。
(1)根據(jù)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，由分子量3,000～80,000的數(shù)種蛋白質(zhì)構(gòu)成。
(2)95重量％以上是蛋白質(zhì)，其余含少量脂肪、灰等。
(3)蛋白質(zhì)主要由乳鐵蛋白和乳過氧化物酶組成。
(4)蛋白質(zhì)的氨基酸組成含15重量％以上的賴氨酸、組氨酸、精氨酸等堿性氨基酸。

施用本發(fā)明的生長激素分泌促進劑時，可使用作為有效成分的乳源堿性蛋白級分本身，也可根據(jù)常規(guī)方法將其制成粉劑、粒劑、錠劑、膠囊劑、飲劑等制劑而使用。另外，也可將所述堿性蛋白級分直接、或制成制劑后，將其加入營養(yǎng)劑或飲食品等而用于促進生長激素分泌。此外，由于乳源堿性蛋白級分熱穩(wěn)定性較高，還可在常規(guī)條件下對含乳源堿性蛋白級分的原料進行加熱殺菌。
實施例 實施例1
用去離子水充分洗凈填充了400g陽離子交換樹脂-磺化CHITO PEARL(富士紡織公司制造)的柱(直徑5cm×高度30cm)后，使40L脫脂乳(pH6.7)以25ml/分鐘的流速通過所述柱。過液后，將所述柱用去離子水充分洗凈，并用含0.98M氯化鈉的0.02M碳酸緩沖液(pH7.0)洗脫吸附于樹脂上的堿性蛋白級分。用反滲透(RO)膜對所述洗脫液進行脫鹽，經(jīng)濃縮后進行冷凍干燥而得到21g作為本發(fā)明的生長激素分泌促進劑的有效成分的乳源堿性蛋白級分粉末。

[實驗例1] 通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定了實施例1中得到的堿性蛋白級分，其分子量分布于3,000～80,000的范圍。

[實驗例2] 分析了實施例1中得到的乳源堿性蛋白級分的成分組成。
結(jié)果示于表1。如表所示，所述級分基本上為蛋白質(zhì)。

[表1]

[實驗例3] 于110℃下用6N的鹽酸水解實施例1中得到的乳源堿性蛋白級分24小時后，用氨基酸分析裝置(L-8500型，日立制作所制造)分析了其氨基酸組成。結(jié)果示于表2。所述乳源堿性蛋白級分在氨基酸組成中含15重量％以上的堿性氨基酸。

[表2]
實施例2
用去離子水充分洗凈填充了30kg陽離子交換樹脂-SP-TOYOPEARL(TOSOH公司制造)的柱(直徑100cm×高度10cm)后，使于121℃加熱殺菌30秒鐘的干酪乳清3t(pH6.2)以10L/分鐘的流速通過所述柱。過液后，將所述柱用去離子水充分洗凈，并用含0.9M氯化鈉的0.1M檸檬酸緩沖液(pH5.7)洗脫吸附于樹脂上的堿性蛋白級分。通過電透析(ED)法使所述洗脫液脫鹽，經(jīng)濃縮后進行冷凍干燥而得到183g作為本發(fā)明的激素分泌促進劑的有效成分的乳源堿性蛋白級分粉末。

[實驗例4] 通過動物實驗分析了實施例1中得到的乳源堿性蛋白級分粉末對生長激素釋放激素的分泌促進作用。動物實驗中使用了3周齡的Fisher系雌性大鼠。將所述大鼠以每組10只分成兩組對照組(A組)和施用1重量％堿性蛋白級分的組(B組)，各以表3所示實驗飼料飼養(yǎng)了2周。

[表3]

飼養(yǎng)2周后，從各實驗組的大鼠的腹部大靜脈采血，立即分離血清，于-80℃冷凍保存。此后，用生長激素釋放激素ELISA試劑盒(SCETI#97752)測定血清中的生長激素釋放激素濃度。各實驗組大鼠血清中的生長激素釋放激素濃度示于圖1和圖2。如圖所示，與對照組(A組)相比，施用了本發(fā)明的乳源堿性蛋白級分的組(B組)血清中的生長激素釋放激素濃度呈顯著高值。
由此可知，乳源堿性蛋白級分具有升高血清中的生長激素釋放激素濃度的作用，可促進具有促進生長激素分泌的作用的生長激素釋放激素的分泌。而且，當(dāng)以每1kg大鼠體重最多施用900mg堿性蛋白級分時，即可觀察到所述對生長激素釋放激素的分泌促進作用。
實施例3
用去離子水充分洗凈填充了400g陽離子交換樹脂-Macro-Prep high S(BioRad公司制造)的柱(直徑10cm×高度7.5cm)后，使于80℃殺菌15秒鐘的40L脫脂乳(pH6.7)以250ml/分鐘的流速通過所述柱。過液后，將所述柱用去離子水充分洗凈，并用含1.48M氯化鈉的0.02M碳酸緩沖液(pH7.0)洗脫吸附于樹脂上的堿性蛋白級分。用反滲透(RO)膜對所述洗脫液進行脫鹽，經(jīng)濃縮后進行冷凍干燥而得到25g作為本發(fā)明的生長激素分泌促進劑的有效成分的乳源堿性蛋白級分粉末。

[實驗例5] 研究了實施例3中得到的乳源堿性蛋白級分粉末的生長激素分泌促進作用。用表4所示低蛋白飼料飼養(yǎng)10周齡雄性SD系大鼠16只7天后，在乙醚麻醉下，由頸靜脈插入導(dǎo)管，將所述導(dǎo)管推到心房附近留置。隨后將大鼠分成4組A組(對照組)與B、C、D組(堿性蛋白施用組)，分別給予對照飼料及混合了0.1、1、5％實施例3中得到的堿性蛋白級分粉末的飼料(表4)。

[表4]

換飼料4天后，每15分鐘由導(dǎo)管采血，并分離血清。用生長激素ELISA試劑盒(大鼠/小鼠生長激素ELISA試劑盒，LincoResearch，Inc)測定所得血清樣品中生長激素的濃度。

各實驗組的血漿中的生長激素濃度變化示于圖3。相比A組，混合了堿性蛋白的B組、C組、D組的生長激素濃度值顯示出更高，從而表明堿性蛋白級分具有促進生長激素分泌的作用。
實施例4
將實施例1中得到的乳源堿性蛋白級分粉末根據(jù)常規(guī)方法制成表5所示組成的生長激素分泌促進用錠劑。

[表5]
實施例5
將實施例1中得到的乳源堿性蛋白級分粉末根據(jù)常規(guī)方法制成表6所示組成的具有促進激素分泌的作用的飲料。

[表6]

權(quán)利要求
1.以乳源堿性蛋白級分作為有效成分的生長激素分泌促進劑。
2.權(quán)利要求1的生長激素分泌促進劑，其中所述生長激素分泌促進由生長激素釋放激素的分泌促進介導(dǎo)。
3.用乳源堿性蛋白級分促進生長激素釋放激素分泌的方法。
全文摘要
以乳源堿性蛋白級分作為有效成分的、由具有促進生長激素分泌的作用的生長激素釋放激素的分泌促進介導(dǎo)的生長激素分泌促進劑，及用乳源堿性蛋白級分促進生長激素釋放激素分泌的方法。本生長激素分泌促進劑可日常攝取，且經(jīng)長期攝取也具有高安全性。
文檔編號A61K38/00GK101646448SQ20088000800
公開日2010年2月10日 申請日期2008年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月12日
發(fā)明者小野愛子, 松山博昭, 森田如一, 芹澤篤, 日暮聰志 申請人:雪印乳業(yè)株式會社