專利名稱：炎癥和/或內(nèi)毒素休克的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及炎癥和/或內(nèi)毒素休克的治療和/或炎性趨化因子的水平的降〗氐，并涉及用于炎癥和/或內(nèi)毒素休克的治療，或用于炎性介質(zhì)的水平降^f氐的纟且合物。
背景技術(shù)：
炎癥是許多人類和動(dòng)物疾病的致病才幾理的組成部分，而且也作為人類或動(dòng)物身體組織的物理、化學(xué)或外傷性損傷的結(jié)果而發(fā)生。通常，免疫應(yīng)答導(dǎo)致內(nèi)源性化學(xué)介質(zhì)的全身釋i文，這會(huì)導(dǎo)致血管舒張、中性白細(xì)胞遷移、趨化作用、及脈管的滲透性增加。無(wú)論免疫應(yīng)答發(fā)生在何處以及是由什么引起的，其原因基本上是相同的。應(yīng)答可以為急性的(短暫的)或者可以是慢性的(持續(xù)的)。
內(nèi)毒素休克，有時(shí)也被稱為感染性休克，被認(rèn)為是由于血管內(nèi)暴露于由炎癥樣應(yīng)答導(dǎo)致的大量?jī)?nèi)毒素而發(fā)生的。暴露于內(nèi)毒素導(dǎo)
致產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，包括TNFcx和IL-1。補(bǔ)體系統(tǒng)和凝結(jié)級(jí)聯(lián)(coagulation cascade),包括因子VII也受到刺激。這種反應(yīng)的結(jié)果可以是組織損傷、發(fā)熱、血管舒張、心動(dòng)過(guò)速和血管內(nèi)凝固。
炎性應(yīng)答通常是有益的，使得炎癥部位進(jìn)入的營(yíng)養(yǎng)素、氧、抗體和治療性藥物增加，以及纖維蛋白的形成增加和毒素稀釋。然而，如果炎癥是不希望的或延長(zhǎng)的，則會(huì)造成組織的損傷。在這樣的情況下，通常使用抗炎性藥物。存在兩種主要類型的抗炎性藥物，皮
7質(zhì)激素類和非甾體抗炎藥(NSAIDs)。這些藥物中的大多凄史具有不希望的副作用。延長(zhǎng)的皮質(zhì)激素給予通常與擬態(tài)的庫(kù)欣病(Cushing's disease )的嚴(yán)重副作用相關(guān)，庫(kù)欣病是一種由皮質(zhì)醇產(chǎn)生過(guò)剩而導(dǎo)致的腎上腺;t幾能障礙。其他可能的副作用包括體重增加、胸部、面部、頸部和上背部脂肪沉積、水肺、高血壓、沖唐尿病、傷口愈合不良、容易發(fā)生感染、皮膚變薄、情緒不穩(wěn)定和抑郁。NSAIDS的最嚴(yán)重的副作用是腎衰竭、肝功能衰竭、潰瘍以及損傷或手術(shù)后的持續(xù)出血。 一些個(gè)體對(duì)NSAIDs過(guò)敏，而患有哮喘的人對(duì)阿司匹林的嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)存在較高風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要鑒定具有抗炎性作用的可選藥劑。
凱莫瑞(Chemerin， 一種脂肪細(xì)胞因子，是孤獨(dú)G蛋白偶聯(lián)素受體chemerin R的內(nèi)源性配體)是一種存在于人類炎性'滲出物(包括腹水和滑液)中的豐富蛋白(Wittamer V " a/. J Exp Med. 2003年10月6日；198(7) :977-985; Meder Wet d a/. FEBS Lett. 2003年12月18日；555 (3) : 495-499)。人類凱莫瑞(Chemerin)是作為稱為前體凱莫瑞(ProChemerin )的163個(gè)氨基酸(aa )前體(小鼠(Musmusculus),鼠類等同物為162aa)而分泌的，其經(jīng)歷N-和C-末端截短以產(chǎn)生13 7aa的趨化蛋白(小鼠中為140aa) ( Wittamer V W a/.J Exp Med. 2003年10月6曰；198(7) :977-985; Zabel BA " a/. J BiolChem. 2005年10月14日；280(41):34661-34666; Wittamer V " a/. JImmunol. 2005年7月1曰；175(1) :487-493; Samson M a/. Eur JImmunol. 1998年5月；28(5) : 1689-1700)。凱莫瑞的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)表明了與趨化因子的結(jié)構(gòu)類似性，它已經(jīng)被描述為"相反的"趨化因子，潛在地具有無(wú)序的羧基-末端、a-折疊片和|3-螺旋氨基-末端結(jié)構(gòu)域(Zabel BA d a/. Exp Hematol. 2006年8月;34(8) :1021-1032 )。該結(jié)構(gòu)使人聯(lián)想到存在于組織蛋白酶和激肽原中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)折疊，其也經(jīng)歷蛋白水解過(guò)程以實(shí)現(xiàn)活化(Zabel BA"A Exp Hematol. 2006年8月；34(8) :1106國(guó)1114; Colman RW， BiolChem. 2001年1月；382(1) :65-70; Yamasaki K W FASEB J. 2006年10月1曰2006;20(12) :2068-2080 )。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了衍生自凱莫瑞(Chemerin)蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似物或衍生物在制備用于治療炎癥的藥物中的應(yīng)用。
才艮據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似物或衍生物在制備用于制備內(nèi)毒素休克的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)另 一方面，本發(fā)明提供了衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似物或衍生物在制備用于降低一種或多種炎性介質(zhì)水平的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似物或衍生物，以用于治療炎癥、和/或治療內(nèi)毒素休克、和/或降低一種或多種炎性介質(zhì)的水平。
該一種或多種炎性介質(zhì)可以包括介導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子、趨化因
種或多種趨化因子TNFa、 IL-la、 IL-1J3、 IL-6、 IL-12、 G-CSF、MCP-2(CCL8 )、 GROa( CXCL1 )、 GRO卩(CXCL2 )、 IL-8( CXCL8 )、TECK ( CCL25 )、 MCP-1 ( CCL2 )、干4尤素y和RANTES ( CCL5 )。優(yōu)選地，該藥物能夠降<氐TNFa的水平。
出人意料的是，衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽具有抗炎特性，可以用于治療、預(yù)防或改善炎癥和/或內(nèi)毒素〗水克。該藥物可以具有治療和/或予貞防應(yīng)用。
優(yōu)選地，該肽在約5到約30個(gè)氨基酸之間。更優(yōu)選地，所述肽在約5到約25個(gè)氨基酸之間，優(yōu)選地，所述肽在約5到約20個(gè)氨基酸之間。
優(yōu)選地，該肽包含約5到約30個(gè)書f生自Chemierin蛋白的C-末端的氨基酸，或它們的類似物或衍生物。更優(yōu)選地，所述肽在約5到約25個(gè)氨基酸之間，優(yōu)選地，所述肽在約5到約20個(gè)氨基酸之間。
凱莫瑞(Chemerin)蛋白是指凱莫瑞的處理形式，其中前體凱莫瑞的前體(PreProChemerin )中存在的N-末端氨基酸已經(jīng)^皮蛋白水解去除，前體凱莫瑞(ProChemerin )前體中存在的C-末端氨基酸已經(jīng);故蛋白水解去除，從而產(chǎn)生稱為凱莫瑞的蛋白的活性截短形式。
優(yōu)選地，該肽來(lái)生自人類形式或非人形式的凱莫瑞。優(yōu)選地，該肽來(lái)自人類或哺乳動(dòng)物形式的凱莫瑞。哺乳動(dòng)物非人凱莫瑞可以來(lái)自嚙齒動(dòng)物，如大鼠或小鼠、馬、狗、貓、牛、羊或豬。
優(yōu)選地，衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽與天然存在于凱莫瑞蛋白C-末端中的肽具有至少30%或更高的同一性。優(yōu)選地，所述肽與天然存在的凱莫瑞蛋白的C-末端肽序列具有至少40%、 50%、60%、 70%、 80%、 90%或更高的同一性。
優(yōu)選地，該肽與天然存在于凱莫瑞蛋白C-末端中的約最后5個(gè)到約最后30個(gè)，優(yōu)選約最后10個(gè)到約最后25個(gè)氨基酸具有至少30%或更高的序列同一性。優(yōu)選地，該肽與天然存在于凱莫瑞蛋白C-末端中的約最后5個(gè)到約最后30個(gè)，優(yōu)選約最后IO個(gè)到約最后25個(gè)氨基酸具有至少約40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或 更高的序列同一性。
優(yōu)選地，該肽與天然存在于凱莫瑞蛋白C-末端中的最后30個(gè) 氨基酸中的5到25個(gè)氨基酸具有至少30%或更高的序列同一性。 優(yōu)選地，該肽與天然存在于凱莫瑞蛋白C-末端的最后30個(gè)氨基酸 中的5到25個(gè)氨基酸具有至少約40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高的序列同 一性。
關(guān)于凱莫瑞蛋白中的"最后的氨基酸"是指該蛋白C-末端的氨基酸。
圖2A中給出了人類和鼠凱莫瑞、前體凱莫瑞(ProChemerin ) 和前體凱莫瑞前體(PreProChemerin )的全長(zhǎng)序歹'J, Seq ID no: 31 、 32、 33中分別反映了對(duì)于人類蛋白質(zhì)，而Seq ID no: 34、 35、 36 中分別反映了小鼠蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，凱莫瑞肽具有S叫ID No: 31 或34的序列。來(lái)自其他物種，如牛和大鼠的凱莫瑞蛋白的序列可 以容易i也乂人GenBank獲得并且本領(lǐng)域才支術(shù)人員可以容易地獲4尋。
^尤選:l也，i亥月太與Seq ID no: 31 (l人類序歹'J )和Seq ID no: 34 (小 鼠序列)的凱莫瑞的最后5到最后30個(gè)氨基酸具有至少30%或更 高，更優(yōu)選40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高的序列同一性。
百分比氨基酸序列同 一 性被定義為在比對(duì)序列以及在必要時(shí) 引入空位(gap)以獲得最大的百分比序列同一性之后，序列中的 與天然存在的凱莫瑞蛋白中的氨基酸相同的氨基酸殘基的百分比。 用于確定百分比序列同一'l"生的比對(duì)(Alignment)可以以本領(lǐng)域^支術(shù) 人員/>知的許多方式實(shí)現(xiàn)，包括，例如，利用BLAST和ALIGN算 法。該肽可以包含相對(duì)于凱莫瑞蛋白c-末端的天然序列的添加、插
入、缺失、倒位或易位，以使得該肽與具有天然序列的肽相比，具
有至少50%的抗炎活性，和/或至少50%的抗內(nèi)毒素休克活性，和/ 或?qū)⒁环N或多種炎性介質(zhì)水平降低至少50%的能力。
術(shù)語(yǔ)"類似物"或"衍生物"是指這樣的肽，其具有與天然存 在的序列不同的序列，4旦是與具有天然存在序列的肽一起^L察時(shí)， 其包含基本上相同或更多，以及至少約50%、優(yōu)選約60%、 70%、 80%或90%的抗炎活性、和/或抗內(nèi)毒素^木克活性、炎性介質(zhì)減少活性。
肽類似物或衍生物可以具有任何氨基酸殘基，包括N或C-末 端殘基的一個(gè)或多個(gè)缺失、插入、或^f奮飾。該肽可以-故乙?；?、酰 化、烷基化、糖基化等。該肽還可以在C或N末端或C和N末端 包含另外的氨基酸。
該肽、類似物或衍生物可以為融合蛋白的部分。
與天然存在的氨基酸序列相比，該肽可以包4舌一個(gè)或多個(gè)〗呆守 的氨基酸置換。
優(yōu)選地， 一種或多種所述肽包含選自包含以下的序列組的序
列
PHGYFLPGQFA ( Chemerinll-小鼠；Cllm; Seq ID No:l); PHGYFLPGQFAF ( Chemerinl2畫小鼠；C12m; S叫ID No:2 ); PHGYFLPGQFAFS ( Chemerinl3-小鼠；C13m;; Seq ID No:3 ); AGEDPHGYFLPGQFA ( Chemerinl5畫小鼠；C15m; Seq ID No:4 ); AGEDPHGYFLPGQFAF (Chemerinl6國(guó)小鼠；C16m; SeqlDNo:5); AGEDPHGYFLPGQFAFS(Chemerinl7-小鼠；C17m; S叫ID No:6 ); DPHGYFLPGQFA (Chemerinl2A-小鼠；C12Am; Seq ID No:7 );EDPHGYFLPGQFA ( Chemerinl3A-小鼠；C13Am; Seq ID No:8 ); GEDPHGYFLPGQFA ( Chemerinl4A-小鼠；C14Am; SeqlDNo:9); DPHGYFLPGQFAF ( Chemerinl3B畫小鼠；C13Bm; SeqlDNo:10); EDPHGYFLPGQFAF( Chemerinl4B-小鼠；C14Bm; SeqIDNo: 11); GEDPHGYFLPGQFAF( Chemerinl5A-小鼠；C15Am; S叫ID No: 12);
DPHGYFLPGQFAFS(Chemerinl4C-小鼠；C14Cm; SeqIDNo: 13); EDPHGYFLPGQFAFS( Chemerinl5B-小鼠；C15Bm; S叫ID No: 14 ); GEDPHGYFLPGQFAFS ( Chemerinl6A-小鼠；C16Am; S叫ID No:15 );
PHSFYFPGQFA ( Chemerinll-人類；Cllh; Seq ID No: 16); PHSFYFPGQFAF ( Chemerinl2-人類；C12h; Seq ID No: 17); PHSFYFPGQFAFS ( Chemerinl3-人類；C13h; S叫ID No: 18); AGEDPHSFYFPGQFA ( Chemerinl5陽(yáng)人類；C15h; Seq ID No: 19); AGEDPHSFYFPGQFAF (Chemerinl6-人類；C16h; SeqlDNo:20); AGEDPHSFYFPGQFAFS( Chemerinl7-人類；C17h; SeqlDNo:21); DPHSFYFPGQFA ( Chemerinl2A-人類；C12Ah; Seq ID No:22 ); EDPHSFYFPGQFA (Chemerinl3A-人類；C13Ah; SeqlDNo:23); GEDPHSFYFPGQFA ( Chemerinl4A-人類；C14Ah; S叫ID No:24 ); DPHSFYFPGQFAF (Chemerinl3B-人類；C13Bh; SeqlDNo:25); EDPHSFYFPGQFAF ( Chemerinl4B-人類；C14Bh; S叫ID No:26 ); GEDPHSFYFPGQFAF( Chemerinl5A國(guó)人類；C15Ah; SeqlDNo:27); DPHSFYFPGQFAFS (Chemerinl4C畫人類；C14Ch; SeqlDNo:28); EDPHSFYFPGQFAFS ( Chemerinl5B-人類；C15Bh; S叫ID No:29 ); 以及
GEDPHSFYFPGQFAFS(Chemerinl6A-人類；C16Ah; Seq ID No:30 )
或它們的類〗以物或4汙生物。
優(yōu)選地， 一種或多種該肽包含選自包括以下序列的組的序列AQAGEDPHGYFLPGQFAFS( Chemerinl9國(guó)小鼠；C19m; S叫ID No:37);以及
QRAGEDPHSFYFPGQFAFS ( Chemerinl9扁人類；C19h; Seq ID No:38);或它們的類々乂物或書亍生物。
優(yōu)選地，該肽與上文中^皮稱為SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的一種或多種肽具有至少 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高的序列同一'l"生。
優(yōu)選地，該肽與上文中^皮稱為SeqIDNo: 37或38的一種或多 種肽具有至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高 的序列同一性。
優(yōu)選地，書f生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽的類似物或書f生物包 括肽的小分子^t擬物。
該肽、類似物或衍生物，可以乂人天然系統(tǒng)分離，或者可以合成 ;也或重組地產(chǎn)生。合成的肽可以由標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法產(chǎn)生，包4舌由自 動(dòng)程序合成。
重組肽可以以純化形式使用?？商鎿Q地，可以使用來(lái)自表達(dá)重 組肽的細(xì)胞的上清液。
該肽、類似物或書f生物可以形成凈交大的蛋白或分子復(fù)合物的部分。
該肽可以為直鏈或環(huán)爿犬的。 該肽可以包4舌耐蛋白酶的主鏈。該肽可以包4舌在C和/或N末端的》務(wù)飾。
該月太可以通過(guò)本4頁(yè)i或已^口的方法4皮才示i己，^口方文射寸生才示i己、熒光 標(biāo)"i己、質(zhì)i普標(biāo)簽、生物素等。
所述藥物可以包含其他活性成分，包括其他已知的抗炎藥劑、 和/或其他已知的抗內(nèi)毒素休克藥劑、和/或其4也已知的降4氐趨4匕因 子水平的藥劑。
所述藥物還可以包含藥用f武形劑。該J3武形劑可以包含大的大分 子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共 聚物、海藻糖、脂質(zhì)聚集體和非活性病毒顆粒。這樣的賦形劑是本 ^頁(yè)i或才支術(shù)人員熟^口的。
所述藥物還可以包含緩沖劑、增粘劑、溶劑、穩(wěn)定劑和防腐劑 中的一種或多種。
所述藥物的^合藥途徑可以為通過(guò)腸胃外、皮下、靜月永內(nèi)、月幾肉 內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、損傷內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、局部、經(jīng)口、直腸、經(jīng)鼻、 吸入、或任何其他合適的途徑注射或輸注。
所用的肽的劑量取決于肽、耙標(biāo)和處理。纟會(huì)藥劑量和途徑確定 是在普通醫(yī)師的技術(shù)范圍內(nèi)。正常劑量的給藥方案可以在約1 pg/kg 到約100 mg/kg的范圍內(nèi)變化，更優(yōu)選地，該劑量在約10 pg/kg到 約1 mg/kg,更優(yōu)選i也在約10 pg/kg到約100 ng/kg的范圍內(nèi)變4匕。 優(yōu)選地，這些劑量是每日劑量。
出人意料的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的肽的低至0.32 ng/kg的 劑量在對(duì)小鼠體內(nèi)的無(wú)菌性腹膜炎具有效能，而需要使用1.2mg/kg 的地塞米松才能觀察到類似程度的效能。優(yōu)選地，才艮據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用的藥物可以意圖以約10 pg/kg到約 1 mg/kg的劑量給藥，更優(yōu)選地，以約10 pg/kg到約100 ng/kg或者 約10pg/kg到約10ng/kg的劑量給藥。這些劑量比所需要的地塞米 松的劑量低至少三個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)(log)。
才艮據(jù)本發(fā)明的另一方面，才是供了治療/處理、預(yù)防或改善受試者 體內(nèi)炎癥的方法，包括給予受試者一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白的 C-末端的肽、或它們的類似物或衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療/處理、預(yù)防或改善受試者 體內(nèi)內(nèi)毒素休克的方法，包括給予受試者一種或多種衍生自凱莫瑞 蛋白的C-末端的肽、或它們的類似物或衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了降低受試者體內(nèi)的 一種或多種 炎性介質(zhì)水平的方法，包括給予受試者一種或多種衍生自凱莫瑞蛋 白的C-末端的肽、或它們的類似物或書f生物。
所述治療(處理)可以是治療性的、預(yù)防性的或美容用的。
優(yōu)選地，該肽以有效量纟皮給予，有效量即為，足以(i)誘導(dǎo)或 導(dǎo)致炎癥減少，或防止或減少炎癥；(ii)誘導(dǎo)或?qū)е聝?nèi)毒素休克的 減少，或防止或減少內(nèi)毒素休克；和/或(Ui)降^f氐一種或多種炎性 介質(zhì)水平的量。
可替4戈地，本發(fā)明的藥物可以;波直4妄施用于醫(yī)學(xué)裝置以減少炎 癥相關(guān)的裝置的風(fēng)險(xiǎn)。這可以通過(guò)將藥物施用于該裝置的表面或通 過(guò)用 一種或多種4汙生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它們的類似物 或衍生物浸漬所述裝置的表面來(lái)實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)另 一方面，本發(fā)明提供了用 一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白 的C-末端的肽、或它們的類似物或4汙生物浸漬的醫(yī)學(xué)裝置。該醫(yī)學(xué)裝置可以為支架或?qū)Ч堋?br> 根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了用 一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白
的C-末端的肽、或它們的類似物或4汙生物浸漬的傷口lt扦或繃帶。
本發(fā)明的〗壬zf可方面所涉及的炎癥可與以下病癥相關(guān)，例如青少 年慢性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化癥(硬皮病)、原發(fā)性炎
性月幾病(皮月幾炎、多月幾炎)、干燥綜合4i ( Sjogren's syndrome )、系 統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減 少癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少癥(原發(fā) 性血小板減少性紫癜、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥)、曱狀腺炎(格 雷夫斯氏病、橋本氏甲狀腺炎、青少年淋巴細(xì)胞甲狀腺炎、萎縮性 甲狀腺炎)、自身免疫性炎性疾病(如變應(yīng)性腦脊髓炎、多發(fā)性硬 化癥、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性視網(wǎng)膜炎、甲狀腺毒癥、 硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病(如克羅恩 病、潰癡性結(jié)腸炎、局限性腸炎、回腸末端炎、肉芽腫性腸炎、局 限性回腸炎、末端回腸炎)、自身免疫性曱狀A(yù)泉疾病、惡性貧血、 同種異體移植物排斥、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎、腎 d、管間質(zhì)性腎炎)、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病如多發(fā)性硬化 癥、原發(fā)性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病或格林-巴利綜合征、和慢性炎性 脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、肝膽病如傳染性肝炎(曱、乙、丙、丁、 戊型肝炎和其他非嗜肝病毒)、自身免疫性慢性活動(dòng)型肝炎、原發(fā) 性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、硬化性膽管炎、谷蛋白敏感性腸 病、惠普爾氏病、自身免疫性或免疫介導(dǎo)的皮膚疾病包括大皰性皮 月夫病、多形性紅斑和4妻觸性皮炎、4艮屑病、變態(tài)反應(yīng)病如哞喘、變 應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物超敏反應(yīng)和蕁麻疹、肺部免疫性疾病 如嗜酸細(xì)月包性月申炎、先天性力申纖維癥和過(guò)壽丈性肺炎(hypersensitivity pneumonitis )、移才直相關(guān)疾病包4舌移才直4非斥和移才直物抗宿主病、感 染性疾病包括病毒性疾病如AIDS(HIV感染)、皰滲等、細(xì)菌感染、真菌感染、原生動(dòng)物感染、寄生蟲感染、及呼吸道合胞病毒、人類 免疫缺陷病毒等、濕滲和內(nèi)毒素休克。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了能夠治療、預(yù)防或改善炎癥的肽，
該肽選自包4舌具有S叫ID No: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、
26、 27、 28、 29、 30的序列的肽牙口它們的類A乂物或書亍生物纟且成的纟且。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了能夠治療、預(yù)防或改善炎癥的肽， 該肽選自包括具有S叫ID No: 37、 38的序列的肽和它們的類似物或 書f生物纟且成的纟且。
^4居另一方面，本發(fā)明提供了能夠治療、預(yù)防或改善內(nèi)毒素4木 克的肽，該肽選自包4舌具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30的序歹'J的狀禾口它耵]的類^f以4勿或書亍生沖勿 組成的組。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了能夠治療、預(yù)防或改善內(nèi)毒素休 克的肽，該肽選自包括具有SeqIDNo: 37、 38的序列的肽和它們的 類似物或書亍生物組成的組。
根據(jù)另 一方面，本發(fā)明提供了能夠降低一種或多種炎性介質(zhì)水 平的肽，該肽選自包括具有S叫IDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30的序歹寸的狀禾口它力']的類^f以凈勿或書亍生4勿 組成的組。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了能夠降低一種或多種炎性介質(zhì)水 平的肽，該肽選自包4舌具有Seq ID No: 37、 38的序列的肽和它們 的類似物或書亍生物組成的組。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種肽的藥物組合
4勿，該肽選自包4舌具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、和30的序歹'J的狀和它力1的類4以凈勿或書亍生凈勿 組成的組。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多個(gè)種的藥物組合 凈勿，i亥狀選自包才舌具有SeqIDNo: 37和38的序歹寸的欣禾口它々]的類 4以物或書亍生物《且成的纟且。
該藥物組合物可以用于治療和/或預(yù)防炎癥、和/或治療和/或預(yù) 防內(nèi)毒素休克、和/或用于降低一種或多種炎性介質(zhì)(如細(xì)胞因子和 趨化因子)的水平。
才艮據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序歹寸的月太或它Cl的類々乂 物或々t生物。
才艮據(jù)另一方面，本發(fā)明^是供了具有S叫IDNo: 37或38的序列 的肽或它們的類似物或書f生物。
根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了與具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序歹'J的肽具有至少 50%序列同一'l"生的肽。優(yōu)選地，該肽與具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序歹'J的狀具有至少 60%、 70%、 80%、 90%或95。/o的序歹'J同一'l"生。才艮據(jù)又一方面，本發(fā)明才是供了與具有SeqIDNo: 37或38的序 列的肽具有至少50%的序列同 一性的肽。優(yōu)選地，該肽與具有S叫ID No: 37或38的序列的肽具有至少60%、 70%、 80%、 90%或95% 的序列同一性。
根據(jù)另 一方面，本發(fā)明提供了衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一 種或多種肽，或它們的類似物或衍生物在制備用于處理傷口的藥物 中的應(yīng)用。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或改善受試者的傷口 的方法，包括給予受試者一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的 肽，或它們的類似物或書于生物。
根據(jù)另 一方面，本發(fā)明提供了用于處理傷口的包含一種或多種 肽的藥物組合物，該肽選自包括具有SeqIDNo'. 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 37或38的序歹寸的月大或它 們的類似物或書于生物組成的組。
才艮據(jù)另 一方面，本發(fā)明提供了衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一 種或多種肽，或它們的類似物或衍生物，以用于炎癥的治療和/或預(yù) 防、和/或內(nèi)毒素<木克的治療和/或預(yù)防、和/或用于降^氐一種或多種 炎性介質(zhì)(如細(xì)胞因子和趨化因子)的水平。
根據(jù)另 一方面，本發(fā)明提供了 一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白的 C-末端的肽，或它們的類似物或衍生物，以用于傷口的處理。
本領(lǐng)域寺支術(shù)人員將iU只到上文4皮露的任何優(yōu)選的特征能夠應(yīng) 用于本發(fā)明的任何方面。


以下將僅以舉例的方式參照以下附圖和實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明 的^尤選實(shí)施方式。
圖1a至圖1f-圖1a和圖ib示出了 Chemerin140以蛋白水解 依賴性的方式抑制通過(guò)巨噬細(xì)胞的炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。利用Luminex 和ELISA試-驗(yàn)分析來(lái)自巨噬細(xì)胞或活化的巨噬細(xì)胞(用100 ng/ml
LPS和20 ng/ml干擾素y處理)的上清液的細(xì)胞因子表達(dá)。在所示 劑量的重組體鼠凱莫瑞(Chemerin)或地塞米^^存在或在夾乏的情況 下以及蛋白酶抑制劑亮抑酶肽(leupeptin ) ( 15 mg/ml)存在或缺乏 的情況下將育細(xì)胞。圖lC-通過(guò)qRT-PCR(IL-10，TGF卩)將巨噬細(xì)胞 細(xì)月包因子mRNA 7K平定量化和標(biāo)準(zhǔn)化為HPRT。圖1d-在LPS/IFNy-激發(fā)前用凱莫瑞(0.1-1 pM )±百日咳毒素(PTX; 200 ng/ml )對(duì)PMO 進(jìn)行預(yù)處理。圖1e-用凱莫瑞(1 pM )對(duì)PMO預(yù)處理1小時(shí)士PTX， 隨后用LPS/IFNy刺激4小時(shí)、8小時(shí)或15小時(shí)。相對(duì)于LPS/IFNy 處玉里的才羊品，***， p< 0.001; **, p<0.01; *， p<0.05。才目只于于f幾 莫瑞處J里的才羊品，###， p< 0.001; ##， p<0.01; #， p < 0.05。圖 1f-用凱莫瑞(1 pM)、凱莫瑞(1 pM) +蛋白酶#卩制劑(亮抑酶肽 [Leu] 、 E-64、 Pefabloc [Pef]、胃酶抑素A[Pep A] 、 4丐蛋白酶抑制劑
(Calp印tin) [Cal]、 組織蛋白酶S抑制劑[Cath S]、組織蛋白酶L 抑制劑[CathL])對(duì)腹膜巨噬細(xì)胞(PMO)預(yù)處理lh，隨后用LPS
(100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml)刺5敫15小時(shí)。圖表示出了來(lái)自 3陽(yáng)8次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。 nd:低于該試驗(yàn)的4全測(cè)限，ns，不 顯著；
圖2a-示出了人類(上方序列)和小鼠(下方序列)凱莫瑞(Tig2) 的氨基酸序歹'J比對(duì)。
利用 PeptideCutter (http:〃www.expasy.org/tools/peptidecutter/)對(duì)人類(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) 登錄號(hào)為NP—002880)和鼠(NP_082128)凱莫瑞的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析以產(chǎn)生預(yù)測(cè)的胰蛋白酶裂解位點(diǎn)(黑色垂直線)。粗
體和灰色的全長(zhǎng)序列為前體凱莫瑞的前體(PreProChemerin的序歹ll ) (人類序列為SeqIDNo: 33,小鼠序列為Seq ID No: 36 )。灰色N 末端氨基酸^皮去除的序列為前體凱莫瑞(ProChemerin)序列(人類 序列為Seq ID No: 32,小鼠序列為Seq ID No: 35 )?；疑玁末端和 C-末端氨基酸被去除的粗體序列為凱莫瑞的序列(人類序列為S叫 ID No: 31,小鼠序列為SeqIDNo: 34)。
還《會(huì)出了 C-末端肽Cllm( SeqIDNo: 1 )、C13m( SeqIDNo: 2 )、 C15m ( Seq ID No: 3 )和C17m ( Seq ID No: 4 )的序列；
圖2B-示出了抑制通過(guò)活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的前-炎性介質(zhì)的衍 生自凱莫瑞的C-末端部分的肽。在該幅圖中，標(biāo)號(hào)肽C13、 C15和 C17分別指的是前文中描述為C13m、 C15m和C17m的肽；
能的歲幾莫瑞肽。在該幅圖中，標(biāo)號(hào)月太Cll、 C13、 C15和C17分別 指的是前文中描述為Cllm、 C13m、 C15m和C17m的肽；
圖4A至圖4H-示出了由凱莫瑞(Chemerin )、凱莫瑞月太和凱莫 瑞處理的上清介導(dǎo)的趨化性。^f吏經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)百日咳毒素預(yù)處理 (PTX;200 ng/ml) 30分4中的PMO (0.4x106),月向？支良的Boyden 室的底部孔中的化學(xué)引-秀物遷移超過(guò)4小時(shí)(圖4A; rmChemerin， 圖4B; C15,圖4C; Cll，圖4D; C13,圖4E; C19,圖4F; C6, 圖4G; C8 )。圖4H」使PM①(7.5x105)朝向改良的Boyden室的底 部孑L中的來(lái)自未處理的巨嗟細(xì)胞和用LPS/IFNY士凱莫瑞或C15處理 的巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基遷移超過(guò)4小時(shí)。圖表示出了每個(gè)處理組 的平均遷移指凄史士SEM ( n = 4次獨(dú)立的實(shí)-瞼)。相對(duì)于PMO + PTX， ***, p<o.001; **,P<0.01; *, P < 0.05 (學(xué)生氏t才全馬全)。該圖中的參考符號(hào)肽C11、C13、C15和C19分別是指前文中描述為Cllm、 C13m、 C15m和C19m的肽；
圖5-示出了巨噬細(xì)月包顯示出朝向來(lái)自凱莫瑞-處理的巨噬細(xì)月包 的條件培養(yǎng)基的趨化性降低。在該圖中，參考符號(hào)肽C15和C17 分別是指前文中描述為C15m和C17m的肽；
圖6-示出了 Chemerinl5-小鼠抑制酵母聚糖-誘導(dǎo)的腹膜炎。該 圖中的參考符號(hào)肽C15是指前文中描述為C15m的肽。Z是指酵母 聚糖；
圖7A至圖7G-示出了 chemerin15改善了小鼠中酵母聚糖-誘導(dǎo) 的腹膜炎。圖7A和圖7B-C57B16/J小鼠被i.p.給藥PBS或 chemerin15 ( 0.32 ng/kg )， 1小時(shí)后再注射PBS或酵母聚并唐(10 ]^ig， 每個(gè)腔 2><106個(gè)顆粒)。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(圖7A和圖7B; 5-6只小鼠 /處理)或4小時(shí)后(圖7C-圖7E; 6-15只小鼠/組)通過(guò)腹月莫灌洗 收集腹膜滲出物細(xì)胞。圖7C至圖7E-將灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)定量 化，并利用FACS分析確定細(xì)胞組成(中性白細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞)。 細(xì)月包用2.4G2抗-FcyRII/III阻斷，并用Ly-6G-PE和7/4-FITC染色。 在兩個(gè)群周圍構(gòu)建門(gate),這兩個(gè)群是中性白細(xì)月包(N; 7/4高, Ly-6G高)和炎性單核細(xì)胞(Mo; 7/4高，Ly-6G 4氐)。圖7E-示出 了每個(gè)處理組在酵母聚糖后4小時(shí)的典型FACS圖。圖7F-通過(guò) ELISA分^f腹月莫灌洗液的TNFa和KC，并通過(guò)Luminex試-瞼分才斤 IL-6、 IL-ip和MCP-1。 C15; Chemerin15， Z;酵母聚泮唐。對(duì)于酵 母聚4唐-處多里的動(dòng)物，***, P〈0.001; **, P<0.01 ** (學(xué)生氏t才企 驗(yàn))。圖7G-提前1小時(shí)(C15預(yù)處理)或2小時(shí)后(C15后處理) 對(duì)小鼠(6-8/處理)i.p.給予酵母聚糖(10嗎)和C15 ( 8 pg )或PBS。 腹膜灌洗在酵母聚糖激發(fā)后4h進(jìn)行。該圖中的參考符號(hào)肽C15是 指前文中描述為C15m的肽；圖8A-圖8D-示出了抗-凱莫瑞抗體中和凱莫瑞物質(zhì)并使腹膜炎 惡化。圖8A-PMO用于巨噬細(xì)胞趨化性試驗(yàn)(詳見(jiàn)圖7中來(lái)進(jìn)行)， 并使得其存在或不存在抗-rmChemerin抗體或?qū)φ誌gG的情況下朝 向RANTES、凱莫瑞或C15遷移。圖表示出了對(duì)于每個(gè)處理組的平 均遷移指數(shù)士SEM (n-4次獨(dú)立的實(shí)-瞼)。相對(duì)于4匕學(xué)引i秀物，***, P < 0.001; **, P < 0.01; *， P < 0.05。圖8B-在存在或不存在抗 -rmChemerin 4元體或乂于照IgG的'清況下，PMO用1 pM C 15或1 pM 凱莫瑞預(yù)處理達(dá)1小時(shí)，隨后用LPS( 100 ng/ml )和IFNy( 20 ng/ml) 刺激15小時(shí)。16小時(shí)后通過(guò)ELISA (n-4個(gè)獨(dú)立的實(shí)-驗(yàn))測(cè)定巨 噬細(xì)月包上清液中的RANTES的平均表達(dá)士SEM。相對(duì)于LPS/IFNy-處J里的才羊品，**, P〈0.01; *， P<0.05。圖8C和圖8D-C57B16/J 小鼠i.p j會(huì)予PBS、抗-rmChemerin抗體(100 ng/小鼠)或?qū)φ誌gG (100 ng/小鼠)，1小時(shí)后注射PBS或酵母聚糖(10 itig/腔)。在酵 母聚糖注射后4小時(shí)和24小時(shí)通過(guò)腹膜灌洗收集腹膜滲出物細(xì)胞， 并如圖7中所示進(jìn)4亍處理。Z;酵母聚泮唐，ChAB;抗-rmChemerin 抗體。相對(duì)于酵母聚糖-激發(fā)的小鼠**， P<0.01。該圖中的參考符 號(hào)肽C15是指前文中描述為C15m的肽；
圖9-示出了^又注射0.32 ng/kg C15m不會(huì)"i秀導(dǎo)中')"生白細(xì)月包或巨 噬細(xì)胞募集，但是會(huì)降低腹膜TNFa水平。該圖中的參考符號(hào)肽C15 是指前文中描述為C15m的肽；
圖10-示出了<務(wù)飾的Chemerinl3-人類肽抑制鼠巨噬細(xì)胞中 RANTES和TNFa轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。該圖中的參考符號(hào)肽hC13是指修 飾的C13h肽；
圖11-示出了 C17m不影響C140-誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞趨化性。該圖 中的參考符號(hào)肽C17是指前文中描述為C17m的肽；圖12-示出了 Chemerinl5-小鼠和Chemerinl7-小鼠抑制由酵母 聚糖刺激的鼠巨噬細(xì)胞的TNFa分泌。該圖中的參考符號(hào)肽C15和 C17分別是指前文中描述為C15m和C17m的肽。Dexa是指;也塞米 松；
圖13-為棋盤分析，示出了 Chemerin140和Chemerinl5-小鼠誘
導(dǎo)真正的巨噬細(xì)胞趨化性而不是化學(xué)運(yùn)動(dòng)性。該圖中的參考符號(hào)肽 C15是指前文中描述為C15m的肽；
圖14A-圖14B-示出了 chemerin15在酵母聚糖腹膜炎中抑制單 核細(xì)月包和中性白細(xì)月包募集超過(guò)C15和酵母聚^t劑量的范圍。圖 14A-C57B16/J小鼠(5-6只動(dòng)物/處理)被i.p給予PBS或C15 ( 0.32 ng/kg), 1小時(shí)后注射PBS或酵母聚沖唐劑量范圍(10pg-lmg; A )。 圖14B-小鼠(5-6只動(dòng)物/處理)i.p給予PBS或C15劑量范圍(4-40 pg/小鼠)，lh后注射PBS或酵母聚糖(10 ng; 2xl(^個(gè)顆粒/腔)。 酵母聚糖激發(fā)后4小時(shí)通過(guò)腹膜灌洗收集腹膜滲出物細(xì)胞。如圖7 中所描述的，將灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)定量化，并利用FACS分析確 定細(xì)月包組成(中性白細(xì)月包與單核吞卩笪細(xì)月包)。C15; Chemerin15， Z; 酵母聚糖。相對(duì)于酵母聚糖處理的動(dòng)物，***， P< 0.001; **， P<0.01 **; P < 0.05 * (學(xué)生氏t才企馬全)。該圖中的參考才尋號(hào)肽C15或 chemerin15是指前文中描述為C15m的肽；以及
圖15-示出了由巨噬細(xì)胞的酵母聚糖識(shí)別的焚光測(cè)定，其被表 達(dá)為相對(duì)識(shí)別指H實(shí)驗(yàn)在各種濃度的存在或缺乏C15的情況下進(jìn) 行。數(shù)據(jù)代表四次集合的、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)(士s.e.m.)。
具體實(shí)施例方式
本文中的參考符號(hào)Chemerin140或C140是指序列ID No: 34的 140個(gè)氨基酸的小鼠凱莫瑞(Chemerin )蛋白(Chemerin-140-小鼠)。實(shí)施例
Chemerin140對(duì)^皮蛋白S^押制劑消除(abrogated)的活4匕巨 嗟細(xì)j!^^抗炎作用
先前的研究已經(jīng)表明由多形核細(xì)胞(PMN)在脫粒后釋放的絲 氨酸蛋白酶裂解前體凱莫瑞(ProChemerin)的C-末端并釋放其趨 ;昝能(Wittamer V " a/, J Immunol. 2005年7月 1日； 175(1) :487-493 )。然而，通過(guò)凱莫瑞的進(jìn)一步蛋白水解處理所產(chǎn)生 的肽的抗炎作用是具備新穎性和創(chuàng)造性的。
在多種條件下培養(yǎng)鼠腹膜巨噬細(xì)胞(PM9,本文中也稱為 PM①)未處5里；LPS ( 100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml), 15小時(shí)； 凱莫瑞(1 pM)預(yù)處理1小時(shí)，隨后LPS/IFNy, 15小時(shí)；亮抑酶 肽(蛋白酶抑制劑；15 mg/ml)和凱莫瑞(1 pM )， 1小時(shí)，隨后 LPS/IFNy， 15小時(shí)；或》也塞米+> (陽(yáng)性只于照；1 ^M,預(yù)處理1小 時(shí)，隨后LPS/IFNy, 15小時(shí)。
分析來(lái)自凱莫瑞+月旨多糖/干擾素-y ( LPS/IFNy )-處理的巨噬細(xì) 胞的上清液的趨化因子含量，結(jié)果表明，與LPS/IFN，處理的樣品 相比，凱莫瑞處理的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著低水平的TNFa (70%)、 IL-12 p40 ( 54% )、 RANTES ( CCL5; 40% )、 IL-6 ( 42% )和IL-lp ( 60% )
(n=5; p<0.001，圖1A和圖1B)。這種抗炎作用受到廣"i普蛋白酶 抑制劑(亮抑酶肽)的抑制(其在被加入到巨噬細(xì)胞時(shí)防止任何抗 炎作用)，表明在這些抗炎肽的產(chǎn)生中另外的凱莫瑞裂解的重要性
(圖1A禾口圖1F)。
通過(guò)利用抗-凱莫瑞中和抗體，進(jìn)一步表明的是這些作用是凱莫 瑞特異性的；所述抗體去除了凱莫瑞的抗炎作用(圖8B)。圖1A中的柱狀圖示出了如通過(guò)Luminex試-驗(yàn)士SEM確定的細(xì) 胞因子的平均表達(dá)。對(duì)于每個(gè)處理，實(shí)驗(yàn)用一式三份的測(cè)定進(jìn)行。 示出了采用來(lái)自C57B16/J小鼠的不同組的細(xì)l包的三次獨(dú)立實(shí)-瞼的 代表性數(shù)據(jù)。除非另外陳述，相對(duì)于LPS/IFN 處理的樣品，p < 0.001 ***; p<0.01**。 Dexa是才旨;也塞米爭(zhēng)〉(1 mM )。
圖IB示出了與上文中關(guān)于圖1A中討論的類似的結(jié)果，還有 另外的邀:據(jù)表明0.1 pM、 0.5 pM和1.0 pM的不同濃度的凱莫瑞的 作用。
此外，圖1C表明凱莫瑞誘導(dǎo)用于抗炎細(xì)胞因子TGFP(54。/。)和 IL-10 (89%)的mRNA的表達(dá)。
凱莫瑞的作用是劑量依賴性的，在1 pM觀察到最大應(yīng)答(圖 1B和圖1C ),并且對(duì)百日咳毒素敏感，表明這與Gai-偶聯(lián)的GPCR 有關(guān)(圖1D)。
此夕卜，在給予LPS/IFNy后4h、 8h和15h 7見(jiàn)察到抗炎作用，而 在所有的時(shí)間點(diǎn)抗炎作用均4皮PTX消除(圖1E)。
先前的研究已經(jīng)表明，粒細(xì)胞在脫粒后釋放的絲氨酸蛋白酶裂 解前體凱莫瑞(prochemerin )的C-末端并釋力丈其趨化潛能(Wittamer, V.， W /， (2005) ， J/wwimo/ 175:487-493 )。研究了鼠0l莫瑞可經(jīng)歷 由鼠M①活化后釋放的酶進(jìn)行的進(jìn)一步蛋白水解處理的可能性。如 上文中關(guān)于圖1A所討:論的，凱莫瑞與亮抑酶肽(一種絲氨酸和半 胱氨酸蛋白酶抑制劑)的同時(shí)給藥消除了其抗炎效果(圖1A和圖 1F)。 E-64 (—種半胱氨酸蛋白酶抑制劑)也表現(xiàn)出這種效果，同 時(shí)酸性蛋白酶抑制劑胃酶抑素A (Pepstatin A)和絲氨酸蛋白酶抑 制劑Pefabloc對(duì)于MO活化的凱莫瑞-介導(dǎo)的抑制不起作用(圖IF )。 這些數(shù)據(jù)表明凱莫瑞以半胱氨酸蛋白酶依賴的方式對(duì)MO活化起 抑制作用。組織蛋白酶L抑制劑(Z-FF-FMK)、組織蛋白酶S抑制劑(Z-FL-COCHO)和鉤蛋白酶I和II抑制劑、鈣蛋白酶抑制劑 (calpeptin )被用于進(jìn)一步探測(cè)凱莫瑞裂解中涉及的特異性半胱氨 酸蛋白酶(圖1F)。發(fā)現(xiàn)凱莫瑞的抗炎作用依賴于鈣蛋白酶和組織 蛋白酶S卻獨(dú)立于組織蛋白酶L。總之，結(jié)果首次表明經(jīng)典地活化 的鼠MO能夠通過(guò)母體分子的特異性半胱氨酸蛋白酶-介導(dǎo)的裂解 將凱莫瑞轉(zhuǎn)化為M(D活化的有效的肽抑制劑，最可能包括鈣蛋白酶 II牙口纟且織蛋白酶S。
具有抗炎活性的C-末端凱莫瑞肽
利用Ensembl中的序列比對(duì)功能設(shè)計(jì)一系列11-20aa肽作為重 要的保守殘基的指示物(指征，indicator )并命名為Cllm( P144-A154; PHGYFLPGQFA Seq ID No: 1 ) 、 C13m ( P144-S156; PHGYFLPGQFAFS Seq ID No: 3 ) 、 C15m ( A140-A154; AGEDPHGYFLPGQFA S叫ID No: 4 )和C17m ( A140-S156; AGEDPHGYFLPGQFAFS Seq ID No: 6 ) 、 C19 ( A138-S156; AQAGEDPHGYFLPGQFAFS Seq ID No: 37)、 N19 ( E23畫K41; ELSETQRRSLQVALEEFHK Seq ID No: 44)和M20 (K86-K105; KPECTIKPNGRRRKCLACIK S叫ID No: 45 )。圖2A示出了對(duì)于這 些肽中的一些的序列比對(duì)。凱莫瑞肽(1 pM-100nM)在才艮才居所述 的試驗(yàn)方案的巨噬細(xì)胞活化試驗(yàn)中被表征。
鼠PM0在多種條件下被培養(yǎng)未處理的、LPS ( 100ng/ml)和 IFNy ( 20 ng/ml), 15小時(shí)；凱莫瑞肽(濃度為1 pM-100 nM )預(yù)處 理1 h,隨后LPS/IFNy， 15小時(shí)。顯示的濃度^表在兩個(gè)實(shí)-驗(yàn)中對(duì) 于每一種肽的最佳有效劑量。圖2B中的柱狀圖表示RANTES的平 均表達(dá)和TNFa蛋白士SEM。對(duì)于每個(gè)處理，實(shí)-驗(yàn)用一式三4分的測(cè) 定進(jìn)行。示出了采用來(lái)自C57B16/J小鼠的不同組的細(xì)胞的五次獨(dú) 立實(shí)-瞼的代表性數(shù)據(jù)。相對(duì)于LPS/IFNY處理的樣品。p<0.01**; p < 0.001 ***。C-末端肽C13m ( 100 pM )、 C15m ( 1 pM )和C17m ( 1 pM ) 抑制LPS/IFNy國(guó)i秀導(dǎo)的RANTES分泌(CI 3m-32%; C15m-41%; C17m-49%)和TNFa表達(dá)(C13m-10%; C15m-56%; C17m-66%, 圖2B )。 C15m和C17m抑制巨噬細(xì)胞活化達(dá)到類似于在使用相同 濃度的C130時(shí)的程度。
表1中示出了類似的結(jié)果，其中C-末端肽C13和C19中度抑 制LPS/IFNy-豫導(dǎo)的RANTES和TNFa表達(dá)，最佳劑量為100 pM(表 1)。然而，Chemerin15 ( C15 )以與凱莫瑞具有類似的效能和潛能 (最佳劑量1 pM )保持了由蛋白水解的凱莫瑞示出的抗炎活性并抑 制細(xì)胞因子表達(dá)。此夕卜，Cll、 N-末端肽(N19)、中流肽(中段肽， midstream peptide) ( M20 )和只于照肽(舌L序的C15; C15-S , GLFHDQAGPPAGYEF; Seq ID No: 39，和突變型CI5; C15-M， AGEDPHGYALPGQAA; Seq ID No: 40 )在M<D活化試'驗(yàn)中缺乏抗 炎活性。還發(fā)現(xiàn)在通過(guò)凝固和纖維蛋白溶解級(jí)聯(lián)的蛋白酶的前體凱 莫瑞(prochemerin )裂解期間去除的6 aa( RALRTK; Seq ID No: 41 ) 和8 aa ( FSRALRTK; S叫ID No: 42 )肽，分別稱為C6和C8在M0> 活化試驗(yàn)中未檢出抗炎活性。
表1
LPS/lFNy-談導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)的百分比抑制 細(xì)月* 如皇拔
:， 、C6 C8 Cll C13 C15 C15-S C15-M C19 N19 M20
因子 (Chemerm)
TNFa 70
RANTES 40
IL-1J3 60 IL-12 P40
IL-6 42
0 0 0 10 61 0 0 21 0 0
0 0 0 32 47 0 0 41 0 0
- - _ _ 54 - _ _ — 一
_ — — _ 47 - _ 一 _ _
_ _ _ _ 43 - _ _ _ _
參照表1,如圖IB所述培養(yǎng)凱莫瑞-來(lái)源的肽的抗炎活性-鼠 PM。，并用LPS ( 100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml)激發(fā)(challenge ) 15h,使用/不用肽(0.1 pM-100nM)預(yù)處理lh。當(dāng)肽表現(xiàn)出抗炎特性時(shí)，LPS/lFNy-誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化的百分比抑制代表用最佳劑量 的效果(1 pM凱莫瑞和C15或100 pM C13和C19)。肽序列為 Cll ( P144-A154 ; PHGYFLPGQFA ) 、 C13 ( P144-S156 ; PHGYFLPGQFAFS )、 C15 ( A140-A154; AGEDPHGYFLPGQFA )、 C19 (A138畫S156; AQAGEDPHGYFLPGQFAFS; Seq ID: No. 37)、 N19 ( E23-K41; ELSETQRRSLQVALEEFHK Seq ID No: 44 )和M20
(K86畫K105; KPECTIKPNGRRRKCLACIK S叫ID No. 45 )。對(duì)照 肽亂序的C15 (C15-S; GLFHDQAGPPAGYEF)和突變型C15
(C15畫M; AGEDPHGYALPGQAA; F148A & F153A )。凄t據(jù)代表通 過(guò)ELISA和Luminex試—驗(yàn)測(cè)定的4-8次獨(dú)立的實(shí)-驗(yàn)的由經(jīng)典地活4匕 的巨噬細(xì)月包產(chǎn)生的細(xì)月包因子的平均百分比抑制。
Chemerin140，而不是其C-末端^f生的抗炎肽，是_有效的巨謹(jǐn) 細(xì)胞化學(xué)引誘物
改良的博j尹登室(Boyden-chamber )試—驗(yàn)用于展示C140的巨 噬細(xì)胞化學(xué)引誘物特性。觀察到小鼠Chemerin140在10 nM時(shí)具有 最佳趨化性的典型鐘形曲線，其后下降，推測(cè)接著會(huì)發(fā)生受體脫敏 或化學(xué)引誘物梯度的破壞(breakdown)(圖3 )。這也在圖4A中示 出，還有其他的數(shù)據(jù)表明百日咳毒素預(yù)處理(PTX: 200 ng/ml)的 作用。
PMe (0.5xl06)朝向改良的博伊登室底部的孔中的化學(xué)引誘物 (Chemerin140或凱莫瑞肽)遷移超過(guò)4h。將過(guò)濾器固定在4%甲 醛中，隨后用DAPI對(duì)遷移的細(xì)胞核實(shí)施染色并<吏其可#見(jiàn)化。無(wú)血 清培養(yǎng)基(SFM)用作陰性對(duì)照，巨噬細(xì)胞化學(xué)引誘物RANTES(25 ng/ml; 3 nM )用作陽(yáng)性對(duì)照。圖表示出了對(duì)于每個(gè)處理組(n = 5-6 ) 的平均遷移指數(shù)(化學(xué)引誘物％閾值區(qū)/SFM。/。閾值區(qū))士SEM。 對(duì)于SFM處理的孑L， p < 0.001 ***; p < 0.01 ** ; p < 0.05 *。
30與C140( 1 pM-50nM)或陽(yáng)性對(duì)照CC趨化因子RANTES( 25 ng/ml; 3nM)相比，7見(jiàn)察到Cllm、 C13m和C15m ( 1 pM-lOO nM ) 具有4艮小的趨化活性。在100pMC15m以及10nMC13m和Cllm 處觀察到最大的巨噬細(xì)胞遷移。然而，C17m在所有的測(cè)試濃度都 沒(méi)有表現(xiàn)出趨化活性(0.1 pM-500nM;n = 5獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)；(圖3)。 結(jié)果還在圖4B-圖4D中示出，還有其他的凄t據(jù)示出了百日咳毒素 預(yù)處理(PTX: 200 ng/ml)的作用。參照?qǐng)D4E， C19在所有的測(cè)試 濃度也都沒(méi)有表現(xiàn)出趨化活性(0.1 pM-500 nM;圖4E )。因此，已 經(jīng)確定衍生自凱莫瑞的肽保留了抗炎活性但卻不表現(xiàn)出對(duì)M①的趨 化活性，這表明存在能夠被治療性開(kāi)發(fā)的凱莫瑞的不同的功能-特異 性成分。人們發(fā)現(xiàn)4汙生自前體凱莫瑞(prochemerin )的肽，C6和 C8,缺乏MO抗炎活性，在所有的測(cè)試濃度也均不能誘導(dǎo)M①遷 移(0.1 pM-500nM;圖4F-G )。因此，數(shù)據(jù)似乎表明主要的趨化物 質(zhì)是裂解的凱莫瑞分子本身，或還沒(méi)有鑒別出的肽。
表明凱莫瑞和chemerin15誘導(dǎo)由巨噬細(xì)胞的化學(xué)引誘物產(chǎn)生 的嗜HE4抑制的其他實(shí)施例
考慮到M O -來(lái)源的化學(xué)引誘物在炎癥期間的免疫細(xì)胞募集中 的既定作用(Glabinski， A. R.， " W. ， (1998) .Neuroimmunomodulation 5:166-171; Huang, D. J. W a/., (2001) ,M^/. 193:713-726 )，條 件培養(yǎng)基4吏用來(lái)自趨化性試-瞼中的未處理的M①和由凱莫瑞 +LPS/IFNy、 C15+LPS/IFNy處理和4叉由LPS/IFNy處理的M0>，以 評(píng)估通過(guò)凱莫瑞和合成的C-末端肽對(duì)M<D活性的抑制程度，C15 會(huì)進(jìn)一步影響M0>募集(參見(jiàn)圖4H )。未處理的M①-條件培養(yǎng)基本 身并不表現(xiàn)出對(duì)于M①的趨化活性(遷移指凄t 1.0 ±0.15);然而， LPS/IFN^處理的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)M0>趨化性的顯著提高(遷 移指數(shù)9.3士0.4;圖4H)。此夕卜，MO表現(xiàn)出/人凱莫瑞+LPS/IFNy和 C15+LPS/IFNY-處理的巨噬細(xì)胞朝向條件培養(yǎng)基的趨化性分別降低 49%和55% (圖4H )。這表明凱莫瑞和C15 i秀導(dǎo)M①-來(lái)源的MO化學(xué)引誘物的大范圍的普遍抑制以達(dá)到影響條件培養(yǎng)基的趨化活性 的程度。
進(jìn)一步的第二趨化性試驗(yàn)顯示出受到抑制的朝向來(lái)自
Chemerinl40-小鼠、Chemerinl5-小鼠和Chemerinl7-小鼠-處理的巨 噬細(xì)胞的上清的巨噬細(xì)胞趨化性。這些結(jié)果表明用C15m和C17m
或生物活性降〗氐，因此這些肽可以顯著地減少向炎癥部位的持續(xù)的 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞募集。
在第二趨化性試一險(xiǎn)中使用來(lái)自用C140 + LPS/IFNy、 C15m + LPS/IFNy、 C17m + LPS/IFNy和Y又用LPS/IFNy處理的巨噬細(xì)月包的 條件培養(yǎng)基以評(píng)估與通過(guò)C140及其C-末端肽的巨噬細(xì)胞活化的抑 制對(duì)目關(guān)的潛在的病J里生理反應(yīng)(repercussions )。
使細(xì)胞(0.5xl06)朝向改良的博伊登室的底部孔中的化學(xué)引誘 物(凱莫瑞肽)或條件培養(yǎng)基遷移超過(guò)4小時(shí)。無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM) 用作陰性對(duì)照。將過(guò)濾器固定在4%甲醛中，隨后用DAPI將細(xì)胞 核染色并使其可視化。柱狀圖表明對(duì)于每個(gè)處理組的平均遷移指數(shù) (化學(xué)引誘物o/o闊值區(qū)/SFMo/o閾值區(qū))土SEM。每個(gè)柱代表至少三 個(gè)孑L，每個(gè)處5里取6巾l)圖。除非另夕卜才旨明，p< 0.001 ***; p<0.01 ** 顯著性是相對(duì)于LPS/IFNy條件培養(yǎng)基。AB是指抗-鼠凱莫瑞抗體。
從圖5中表示的結(jié)果可以看出，巨噬細(xì)胞-條件培養(yǎng)基本身并不 表現(xiàn)出對(duì)于巨噬細(xì)月包的趨化活性，然而，LPS/IFNy-處理的巨噬細(xì)月包 培養(yǎng)基誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化性的顯著提高。此外，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出朝 向來(lái)自C140+LPS/IFNy、 C15m+LPS/IFNy和C17m+LPS/IFNY國(guó)處理 的巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的趨化性降低，表明C140、C15m和C17m 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞化學(xué)引誘 的大范圍普遍抑制的能力。為了排除凱莫瑞-處理的上清液包含凱莫瑞-衍生的趨化蛋白/ 肽的可能性，在評(píng)估巨噬的細(xì)胞遷移之前將上清液與中和凱莫瑞抗 體一起孵育。凱莫瑞沒(méi)有表現(xiàn)有助于在凱莫瑞-處理的上清液中的遷移。
Chemerinl5-小鼠抑制酵母^t3秀導(dǎo)的^M炎
腹膜炎可以通過(guò)引起急性炎性反應(yīng)的酵母聚糖顆粒(酵母細(xì)胞 壁成分)的腹膜內(nèi)注射而被誘導(dǎo)。酵母聚糖-誘導(dǎo)的腹膜炎遵循小鼠 腹膜腔中中性白細(xì)胞然后是單核細(xì)胞的已知的時(shí)間依賴性聚集(綜 述參見(jiàn) Lawrence T e/1 a/. Nat Rev Immunol. 2002 年 10 月；2(10) :787-795 )。這個(gè)模型已經(jīng)被用于證明確定的介質(zhì)(mediator ) 月旨氧素A4 (Lipoxin A4)和膜聯(lián)蛋白-l的前-溶解(pro-resolving ) 特性，該特性通常伴隨著較早的組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)以及中性白 細(xì)胞和單核細(xì)胞的滲出的抑制而縮短炎癥的時(shí)程。文獻(xiàn)中才艮道的先 前的實(shí)驗(yàn)使用了一定劑量范圍的酵母聚糖A顆粒(10昭-l mg) (Taylor PR " a/. Eur J Immunol. 2005年7月；35(7) :2163-2174; Arita Ma/. J. Biol. Chem. 2006年8月11日；281(32) :22847-22854 )。
考慮到凱莫瑞的高趨化潛能和對(duì)于蛋白水解的固有需求，使用 C-末端合成肽chemerin15對(duì)無(wú)菌腹力莫炎才莫型中的抗炎作用進(jìn)行體 內(nèi)表征，這是因?yàn)镃15在很大程度上缺乏趨化活性(圖3和圖4B ), 而且還起到相當(dāng)于蛋白水解的凱莫瑞的抗炎作用(表1 )。
參照?qǐng)D6中示出的結(jié)果，這一研究4吏用10 pg/小鼠(每個(gè)定居 巨嗟細(xì)胞1-2個(gè)顆粒)，因?yàn)檫@被認(rèn)為更接近地代表病理生理劑量。
更具體地，雄性C57B16/J小鼠(8-12周)被腹膜內(nèi)注射0.5 ml PBS或0.5 ml Chemerinl5國(guó)小鼠(0.32 ng/kg ),接著在1小時(shí)后注射 0.5mlPBS或酵母聚糖(2xl(^個(gè)顆粒/腔)。4小時(shí)后，將動(dòng)物處死， 用5ml PBS-3 mM EDTA沖洗腹膜腔。利用臺(tái)盼藍(lán)4非除測(cè)i式獲4尋總細(xì)胞計(jì)數(shù)。為了測(cè)定細(xì)胞組成(中性白細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞)，用
2.4G2抗-FcgRII/III mAB對(duì)細(xì)月包阻斷(block) 5分鐘并用PE-共專厄 的抗-小鼠Ly-6G和FITC-共扼的抗-小鼠7/4 mAB染色10分鐘。在 用CellQuest軟件進(jìn)行FACS分析前將細(xì)胞固定在1%曱搭中。在兩 個(gè)群的周圍構(gòu)建門(gate),這兩個(gè)群為中性白細(xì)胞(N; 7/4*, Ly-6G 高)和炎性單核細(xì)月包(Mo; 7/4*)。 C15是指Chemerinl5-小鼠。相 只于于酵母聚4唐-處理，Z是指酵母聚4唐，p<0.01** ; p<0.05*。
中性白細(xì)胞(7/4高，Ly-6G * )、單核細(xì)胞(7/4高，Ly-6G低)和 定居巨嗟細(xì)胞群(7/4低，Ly-6G低)才艮據(jù)Gordon S and Taylor PR Nat Rev Immunol. 2005;5(12) :953; Taylor PR " a/. Eur J Immunol. 2003 年8月；33(8) :2090-2097;和Taylor PR d a/. Eur J Immunol. 2005年 7月；35(7) :2163-2174來(lái)確定。
這一研究結(jié)果表明用0.32 ng/kg (8 pg/小鼠)劑量的C15m處 理的小鼠表現(xiàn)出酵母聚糖-引發(fā)的單核細(xì)胞和中性白細(xì)胞募集分別 降低42%和52% (圖6 )。在用C 15m處理的小鼠中TNFa的水平 也降低。
上述結(jié)果纟皮進(jìn)一步研究。為了確定C15肽在體內(nèi)的抗炎特性， 持續(xù)超過(guò)48小時(shí)進(jìn)行時(shí)程實(shí)驗(yàn)。通過(guò)FACS分析根據(jù)公開(kāi)的試驗(yàn) 方案(Taylor, P. R. " a/. ， ( 2005 J/附畫wo/ 35:2163-2174; Taylor, P.R.,(2003).￡wr J/wmimo/ 33:2090-2097 )來(lái)確定腹月莫灌洗液中的中 性白細(xì)月包(7/4高，Ly-6G*)和單核細(xì)胞(7/4*， Ly畫6G低)群。酵 母聚糖給予到小鼠腹膜腔內(nèi)產(chǎn)生炎性細(xì)胞外滲入腹膜腔中的時(shí)間 依賴，其遵循急性炎性應(yīng)答的典型特征(圖7A-圖B,實(shí)線)。中性 白細(xì)胞是滲透至腔內(nèi)的第一白細(xì)胞，可在給予酵母聚糖后2小時(shí)檢 測(cè)到，白細(xì)月包在4小時(shí)達(dá)到峰^直(1.95xl06個(gè)細(xì)月包)。單核細(xì)月包流入 發(fā)炎的腹膜腔在4小時(shí)后可首次檢測(cè)到(0.69><106個(gè)細(xì)胞)，在注射 酵母聚糖后24小時(shí)達(dá)到峰值(1.25xl()S個(gè)細(xì)胞)，其后下降。在酵
34母聚4唐激發(fā)前1小時(shí)用8pg/小鼠(-0.32ng/kg)劑量的C15預(yù)處理， 使得中性白細(xì)胞提前到2小時(shí)達(dá)到峰值，約為酵母聚糖激發(fā)的小鼠 的峰^直大小的50% (,人1.25xl0"條到0.62><106個(gè)細(xì)月包；圖7A，點(diǎn) 線)。可在2小時(shí)(50% )、 4小時(shí)(66% )和4小時(shí)(50% )觀察到 C15對(duì)中性白細(xì)胞浸潤(rùn)的顯著抑制。8 pg的單一劑量的C15肽在減 少所有時(shí)間點(diǎn)的發(fā)炎的腔中的腹膜單核細(xì)胞的數(shù)量方面也是有效 的，在4小時(shí)(63°/。)、 8小時(shí)(61%)、和48小時(shí)(64%;圖7B, 點(diǎn)線)可觀察到超過(guò)60%的抑制。單核細(xì)胞浸潤(rùn)比率在酵母聚糖注 射后2-4小時(shí)最高(0.51xl06/h), C15的給予降低了流入發(fā)炎的腔 中的比率(0.18xl06/h)。因此，酵母聚糖-激發(fā)前的單一劑量的C15 肽提供了針對(duì)酵母聚糖-誘導(dǎo)的腹膜炎癥的顯著保護(hù)，超過(guò)實(shí)驗(yàn)的 48小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。
時(shí)程實(shí)-驗(yàn)鑒定酵母聚糖后4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)為C15的抗炎活性生效 的合適的時(shí)間點(diǎn)。在該研究中，單一劑量的C15產(chǎn)生酵母聚糖-引 發(fā)的中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞募集的劑量依賴性的下降，該募集在8 pg/小鼠C15 (-0.32ng/kg;圖7C-圖7E和圖16A-圖16B )時(shí)最大。 當(dāng)C15在酵母聚糖-激發(fā)前1小時(shí)被給予時(shí)，中性白細(xì)胞數(shù)量從 1.9x106減少到0.78xio6 (減少63%;圖7C )，單核細(xì)胞水平從 0.69><106減少到0.30x106 (減少62%;圖7D,圖7E中示出了4戈表 性的在4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的FACS圖)。給予C15還顯著地減少了在4h 時(shí)腹膜灌洗液中前-炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，包括TNFa(5"/。)、 L-l卩 (67%)、 IL-6 (67%)、 MCP-1 (59%)、和KC (38%;圖7F )。還 發(fā)現(xiàn)在以與C15的相同劑量和時(shí)間體內(nèi)給予時(shí)，缺乏體外抗炎活性 的對(duì)照肽C15-S和C15-M (表1 )不是保護(hù)性的，這是通過(guò)單核細(xì) 胞和中性白細(xì)胞水平來(lái)判斷的(圖7C-圖7D)。當(dāng)在酵母聚糖注射 后2小時(shí)給予相同劑量的C15時(shí)，給予酵母聚糖后4小時(shí)仍然可觀 察至U單牙亥i田月包(0.69x 106至'J 0.42x 106個(gè)纟田月包；)咸少、420/0 )牙口中斗生白 細(xì)胞募集(1.9xl()6到0.83xl()6個(gè)細(xì)胞；減少60%)的顯著抑制(圖7G)。這表明C15能夠在已經(jīng)建立的炎性情況(setting)下減少中 性白細(xì)胞和單核細(xì)胞募集，并提供了 C15/C15-衍生物可以代表靶向 炎性病狀的引人注目的藥效團(tuán)的另 一指征。
內(nèi)源性凱莫瑞物質(zhì)的阻斷^J^炎癥惡化
通過(guò)在酵母聚糖激發(fā)前4小時(shí)或24小時(shí)對(duì)小鼠i.p注射中和單 克隆抗-rmChemerin抗體(ChAb )或?qū)φ誌gG 1 h來(lái)研究凱莫瑞和 凱莫瑞-衍生的肽的潛在內(nèi)在作用。先前發(fā)現(xiàn)ChAb能夠體外抑制 C15和凱莫瑞-i秀導(dǎo)的M(D趨化性和抗炎作用，而對(duì)照IgG不具備 該作用(圖8A-圖8B)。在體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照IgG-處理的小鼠， 內(nèi)源性凱莫瑞物質(zhì)的中和導(dǎo)致在4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)腹膜中性白細(xì)胞的數(shù) 量增加63%而單核細(xì)胞水平提高45%,以及在酵母聚糖注射后24 小時(shí)腹膜中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞的水平提高170%和86% (圖8C-圖8D)。在24小時(shí)內(nèi)腹膜炎癥的加重表明凱莫瑞物質(zhì)在體內(nèi)重要 的內(nèi)源性4元炎作用。
^SU吏用Chemerinl5-小鼠不i秀導(dǎo)中'性白細(xì)胞或巨嗟細(xì)胞募集但 是降低TNFa水平
雄性C57B16/J小鼠(8-12周)經(jīng)腹膜內(nèi)注射0.5 ml PBS或0.5 mlChemerinl5-小鼠l (0.32ng/kg)。 4小時(shí)后，^!尋每個(gè)處J里纟且的三只 動(dòng)物處死，用5ml PBS-3 mM EDTA沖洗腹膜腔。利用臺(tái)盼藍(lán)排除 試驗(yàn)獲得總細(xì)胞計(jì)數(shù)。為了確定細(xì)胞組成(中性白細(xì)胞與單核吞噬 細(xì)月包)，用2.4G2抗-FcgRII/III mAB將細(xì)月包阻斷(block) 5分鐘并 用PE-共軛的抗-小鼠Ly-6G和FITC-共軛的抗-小鼠7/4 mAB染色 10分鐘。在用CellQuest軟件進(jìn)行FACS分析前將細(xì)胞固定在1%曱 醛中。在兩個(gè)群周圍構(gòu)建門(gate),這兩個(gè)群為中性白細(xì)胞(N;7/4 高，Ly畫6G高)和炎性單核細(xì)胞(Mo; 7/4高，Ly國(guó)6G低)。C15是指 Chemerinl5-小鼠。相對(duì)于PBS-處理，p < 0.01 **。 Ns是指沒(méi)有統(tǒng) 計(jì)學(xué)上的顯著差異p > 0.05。從圖9中的結(jié)果可以看出，0.32 ng/kg的C15m不會(huì)造成單才亥 細(xì)胞或中性白細(xì)胞遷移。然而，觀察到TNFa的顯著減少。
研究小鼠無(wú)菌腹膜炎的這個(gè)模型廣泛用于實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)， 代表由中度組織創(chuàng)傷或感染造成的輕孩i炎癥。所述結(jié)果顯示C15m 能過(guò)實(shí)現(xiàn)治療性抗炎作用。
H^沖的Chemerinl3-人類4中制鼠巨逸細(xì)胞中Rantes和TNFa 轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)
在各種條件下培養(yǎng)鼠腹膜巨噬細(xì)胞(PM0):未處理的、LPS (100 ng/ml)和IFNy (20 ng/ml), 15小時(shí)，{奮飾的Chemerinl3-人類(1 nM)預(yù)處理1小時(shí)，隨后LPS/IFNy 15小時(shí)。柱狀圖顯示 由qRT-PCR確定的并祐:才示準(zhǔn)4匕為管家基因(看家基因， housekeeper),次黃噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT )的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄 物的平均表達(dá)。對(duì)于每個(gè)處理，實(shí)驗(yàn)以一式三份的測(cè)定進(jìn)行，n=l 獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于LPS/IFNY-t處理的樣品，除非另外指出，p<0.01 ** ; p < 0.05 * 。 <奮飾的 C13h 肽的序歹'j 為 NH2-FHSFYFPGQFAFS-COOH ( Seq ID No: 43)國(guó)在這個(gè)序列中， C13h中的N末端P被氨基酸F取代，該肽因此被稱為修飾的C13h。
乂人圖10中的結(jié)果可以看出，》務(wù)飾的C13h <吏TNFa和RANTES 的表達(dá)顯著減少。
Chemerin 17-小鼠不影響C140 i秀導(dǎo)的巨虔細(xì)^^4匕'性
在用BioGEL J朱刺激腹月莫4天后，募集PMe。用5 ml PBS-2 mM EDTA灌洗雄性C57B16/J小鼠的腹膜腔。細(xì)胞經(jīng)離心并重懸浮在補(bǔ) 充有0.5% BSA和25 mM Hepes的RPMI中。4吏細(xì)月包(0.5x106 )朝 向底部孔中的化學(xué)引"i秀物(C140、 C17m或C17m+C140)遷移超過(guò) 4小時(shí)。將過(guò)濾器固定在4%甲醛中，隨后用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色并4吏其可3見(jiàn)化。無(wú)血清;咅養(yǎng)基用作陰性對(duì)照(-/-)。細(xì)月包在趨4匕
性試-驗(yàn)前與百日咳毒素(PTX) —起預(yù)孵育30分鐘。圖11中的柱 狀圖示出了每個(gè)處理組的平均遷移指凄t士SEM。每個(gè)4主代表至少三 個(gè)孔并且每個(gè)處理至少取3幅圖。除非另外指出，對(duì)于SFM處理 的孑L， p< 0.001***; p<0.01**; p<0.05*。
圖11中的結(jié)果表明C17m與C140的共同給予不顯示影響巨噬 細(xì)月包向C140遷移。
Chemerinl5-小鼠和Chemerinl7-小鼠抑制通過(guò)用酵母聚糖刺 激鼠巨逸細(xì)胞的TNFa分泌
在多種條件下培養(yǎng)PM0:未處理的；酵母聚辟唐15h;凱莫瑞(1 pM)預(yù)處理1小時(shí)+酵母聚糖15小時(shí)。柱狀圖顯示通過(guò)ELISA士SEM 測(cè)定的TNFa的平均表達(dá)。對(duì)于每個(gè)處理，實(shí)驗(yàn)用一式三^f分的測(cè)定 進(jìn)行。圖12中示出了采用來(lái)自不同供體細(xì)胞的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代 表性凄t據(jù)。對(duì)于酵母聚糖-處理的樣品，p<0.001***; p<0.01**。 Dexa是指地塞米松(1 mM )， nd是指低于檢測(cè)下限(0.25 ng/ml )。
可以看出，用C15m (1 pM)和C17m ( 1 pM )處理可抑制酵 母聚糖-誘導(dǎo)的TNF表達(dá)(C15m; 21%， C17m; 30% )。因此，C15m 和C17m抑制由細(xì)菌(LPS )和酵母(酵母聚糖A )誘導(dǎo)的巨噬細(xì) 胞活化。
棋盤(Checkerboard ) ^^f斤表明Chemerin140和Chemerinl5誦
小鼠資導(dǎo)巨噬細(xì)J!fe^化性而非化學(xué)運(yùn)動(dòng)性
棋盤分析允許區(qū)分趨化性和化學(xué)運(yùn)動(dòng)性。趨4b性是通過(guò)在專交4氐 的孔中向較高濃度的化學(xué)引誘物遷移而示出的?；瘜W(xué)運(yùn)動(dòng)性是指無(wú) 方向性細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增加，并且其發(fā)生與存在的濃度梯度無(wú)關(guān)。棋盤分
析是這才羊進(jìn)4亍的將細(xì)月包與C140 ( 10-500 pM)或C15m ( 10-1000
38pM) —起預(yù)孵育，并使它們?cè)谳^低的孔中分別朝向C140 ( 10-1000 pM)或C15m ( 10-1000 pM)遷移以形成;農(nóng)度的才其盤。
更具體地，在用BioGEL珠刺激腹膜4天后募集PM0。用5 ml PBS-2 mM EDTA灌洗雄性C57B16/J小鼠的腹膜腔。細(xì)胞經(jīng)離心并 重懸浮在補(bǔ)充有C57B16/J的RPMI中。在趨4匕性試-驗(yàn)前將細(xì)月包
(0.5x106 )與C140或C15m —起孵育30分鐘，隨后使其在底部孔 中朝向化學(xué)引誘物遷移超過(guò)4小時(shí)。將過(guò)濾器固定在4%曱醛中， 隨后用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色并使其可視化。無(wú)血清培養(yǎng)基
(SFM)用作陰性對(duì)照(-/-), CC趨化因子RANTES用作陽(yáng)性對(duì) 照(25 ng/ml)。圖13中的柱狀圖示出了對(duì)于每個(gè)處理組的平均遷 移指數(shù)士SEM。每個(gè)柱代表至少三個(gè)孔并且每個(gè)處理至少取3幅圖。 ^目只于于SFM-處玉里的孑L， p< 0.001 ***。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)C140和C15m在遷移入博伊登室的下部孔時(shí)引發(fā)真 正的趨化性而不是化學(xué)活動(dòng)性，這種遷移僅在其中具有較高濃度的 化學(xué)引誘物時(shí)發(fā)生，而在過(guò)濾器的上側(cè)具有較高濃度的化學(xué)引誘物 時(shí)則不發(fā)生。
C15m被顯示為比C140弱得多的巨噬細(xì)胞趨化性的31誘物。 C15 i秀導(dǎo)酵母彩瞎的巨噬細(xì)^^喧作用
為了通過(guò)巨噬細(xì)胞在體外識(shí)別酵母聚津唐，通過(guò)用PBS中的水冷 2 mM EDTA灌洗從在用Biogel珠(2%w/v )處理前4天已經(jīng)腹膜 內(nèi)處理的小鼠分離出腹膜滲出物細(xì)胞。以2.5xl()S個(gè)細(xì)胞/孔的密度 將巨噬細(xì)月包平4甫在Optimen J告養(yǎng)基中的24孔4反中。在O.lpM、 1 pM、 10 pM、 100pM或lnM Chemerin15的存在下，在識(shí)別試-驗(yàn)中，細(xì) 胞在加入添加有異石克氰酸熒光素(FITC )-標(biāo)記的酵母聚糖 (Invitrogen)之前用培養(yǎng)基沖洗細(xì)月包三次，巨嗜細(xì)月包/顆沖立比率為 10:1。載體=沒(méi)有Chemerin15的對(duì)照樣品。FITC-酵母聚糖攝取之后進(jìn)行FACS分析，F(xiàn)ITC-酵母聚糖攝取被表達(dá)為相對(duì)識(shí)別指數(shù)，即， 攝取酵母聚糖的。/。細(xì)胞的比率xC15處理的巨p筮細(xì)胞的幾何平均數(shù)/ 用載體處理的巨嗟細(xì)月包的幾4可平均#:的比。
圖15中示出的結(jié)果表明，Chemerin15誘導(dǎo)酵母聚糖的巨噬細(xì) 胞吞噬。巨嗟細(xì)胞吞謹(jǐn)作用的誘導(dǎo)在Chemerin15濃度為10 pM時(shí) 最大。這些結(jié)果表明凱莫瑞肽可以通過(guò)增加巨噬細(xì)月包對(duì)凋亡細(xì)胞 (apoptotic cell )、細(xì)月包石卒片、病原體和病原體產(chǎn)物的吞p笪而力口速傷 口修復(fù)。
討論
多種介質(zhì)協(xié)同急性炎癥的初始事件是已知的。例如，脂質(zhì)-來(lái)源 的類花生酸(eicosanoids )、細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)血管變化和炎 性細(xì)胞募集。前-炎性細(xì)胞因子，包括TNFa和IL-lY活化內(nèi)皮細(xì)胞 中的信號(hào)傳遞途徑，導(dǎo)致粘附分子表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)循環(huán)白細(xì)胞的 捕獲。上文指出的結(jié)果顯示書f生自Chemerin140的C-末端肽能夠抑 制炎性應(yīng)答的所有成分。結(jié)果還顯示杏t生自Chemerin140的C-末端 肽能夠降低趨化因子水平并能夠用作用于內(nèi)毒素^^克的治療劑。
在該研究中4吏用的所有肽均為凱莫瑞-4汙生的，并顯示出難以置 信的高效能(1(T12M)，這種高效能確保這些介質(zhì)加入到補(bǔ)體-來(lái)源 的化學(xué)吸引素、C5ades-arg ( l(r12M)、曱酰-曱二磺?；?亮氨酰-苯 丙氨酸(fMLP; IO-UM)、白三烯B4(LTB4; 1(T"M)、 TNFa( lO^M )、 LPS ( 1(T15M )和IL-1 ( 1(T14M )的行列中。申請(qǐng)人知道還沒(méi)有藥物 制劑被證明在10-UM-10-"M表現(xiàn)出藥理作用。實(shí)際上，地塞米松通 常以微摩爾范圍的濃度體外給予，并且在酵母聚糖-誘導(dǎo)的腹膜炎模 型中在30 鼠(1.2 mg/kg )處實(shí)現(xiàn)單核細(xì)月包和中性白細(xì)胞流入
的50%下調(diào)。Chemerinl5-小鼠將單核細(xì)胞和中性白細(xì)胞的募集下調(diào)到與30嗎地塞米松類似的程度。在該鼠炎癥才莫型中，Chemerinl5-小鼠以僅8 pg/小鼠(0.32 ng/kg )的劑量就能產(chǎn)生相當(dāng)?shù)目寡鬃饔谩?br> 第二趨化性試驗(yàn)使得來(lái)自巨噬細(xì)胞活化試驗(yàn)的上清液的趨化 潛能被定量化，并確定了凱莫瑞-介導(dǎo)的趨化因子抑制對(duì)介質(zhì)趨化特 性的影響。這些結(jié)果的分析揭示了與單獨(dú)的LPS/IFNy相比，巨噬 細(xì)胞向來(lái)自凱莫瑞+LPS/IFNy-處理的巨謹(jǐn)細(xì)胞的上清液的遷移下 降，這表明了巨噬細(xì)胞化學(xué)引誘物的大范圍普遍抑制。給出的實(shí)施 例表明，與C140相比，凱莫瑞-來(lái)源的抗炎肽的化學(xué)引誘物特性是 有限的或不具備化學(xué)？ 1誘物特性。
總之，結(jié)果顯示凱莫瑞的C-末端肽在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出非常 強(qiáng)的抗炎性能。
材料和方法 動(dòng)物
所有的動(dòng)物研究都得到了地方倫理認(rèn)可并按照英國(guó)內(nèi)政部規(guī) 則(動(dòng)凈勿、;套， 一牛學(xué)牙呈序y去案(Guidance on the Operation of Animals, Scientific Procedures Act) ,1986)進(jìn)行。
抗體和試劑
4元人01莫瑞、4元鼠Chemerin AB、hChemerin 137(序歹'J ID no: 31, 可以作為重組體011121- Serl57乂人RandD獲4尋)、mChemerin 140 (Seq ID no: 34) 、 4元-mRANTES Capture AB 、 4元-mRANTES Detection AB 、 mRANTES 、 mTNFa、抗-mTNFa Capture AB 、抗扁mTNFa Detection AB均購(gòu)自R&DSystems。 g幾莫瑞肽(ClIm、 C13m、 C13h、 C15m、 C17m)通過(guò)生物合成凈皮合成(www.biosyn.com)。；也塞米木>、月旨多 糖(大腸桿菌(E.coli))、亮抑酶肽從Sigma Aldrich獲得。干擾素 Y (IFNy)購(gòu)自Peprotech。 OPD片乂人Dakocytomata獲4f ，凌元生蛋白鏈菌素(Streptavidin ) -HRP和Str印Av-HRP稀釋緩沖劑購(gòu)自 Endogen。 Luminex 6隱plex^式劑盒(IL-12 p40， IL-ip， IL一6， MCP隱l, TNFa, IL-IO )由Bio-rad提供，并利用Bio-rad分沖斤4義和X軟件分析。
巨噬細(xì)胞活化的抑制-巨噬細(xì)胞活化試驗(yàn)
將無(wú)菌石粦酸鹽-緩沖鹽水(PBS )中的1 ml 2% BioGEL聚丙烯 酰胺i朱腹膜內(nèi)注射(ip )入C57B1/6J小鼠。ip BioGEL主合予后四天， 才艮才居英國(guó)內(nèi)iE文部準(zhǔn)則通過(guò)C02方法處死小鼠。用10ml無(wú)菌PBS-2 mMEDTA沖洗腹膜腔以獲得BioGEL-引起/引發(fā)的細(xì)胞滲透物。獲 得的細(xì)胞的懸浮液在4。C在1000xg離心5分鐘。棄上清，將細(xì)胞 沉淀重懸浮在補(bǔ)充有2 mM谷氨酰胺、50單位/ml青霉素和50 pg/ml 鏈霉素的6mls OptiMEM ;咅養(yǎng)基中。巨噬細(xì)l包在冰上與特克(Turk's ) 溶液一起孵育5-10分鐘后利用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器定量化。將細(xì)胞懸浮 液(2mls; 1.5><106/孔)平鋪在六孔組織培養(yǎng)板(直徑為35 mm: Costar， UK)中，并使其在37。C在包含5%C02的濕潤(rùn)氣氛中附著 2小時(shí)以通過(guò)附著來(lái)分離巨噬細(xì)胞群。通過(guò)細(xì)胞離心涂片 (cytospinning )、用亞甲藍(lán)和曙紅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并基于細(xì)胞形態(tài) 學(xué)計(jì)數(shù)，這得到了大于95%的純度。未粘附的細(xì)胞(主要為粒細(xì)胞) 被丟棄，孔用無(wú)菌PBS沖洗三次以去除^^散附著的細(xì)胞或死細(xì)胞。 為了評(píng)估巨噬細(xì)胞活化的潛在抑制和由此帶來(lái)的前-炎性介質(zhì)的表 達(dá)減少，^l務(wù)巨p藍(lán)細(xì)月包(1.5xl()6細(xì)月包/孑L)與凱莫瑞月大(Cllm，C13m, C15m, C17m; 1(T12-10-8M)或陽(yáng)性對(duì)照(地塞米+>; 1 |iM ) —起預(yù) 《浮育1小時(shí)，卩逭后用LPS ( 100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml) S敫發(fā)15 小時(shí)。為了確定其對(duì)PTX的敏感性和對(duì)蛋白水解的依賴性，將細(xì)胞 與PTX (200ng/ml)或亮抑酶肽(15嗎/ml) —起預(yù)孵育。其他的 細(xì)胞僅用肽處理。收集上清液，儲(chǔ)存在-20。C以用于酶聯(lián)免疫吸附 試馬全(ELISA )和Luminex實(shí)-瞼。將細(xì)月包裂解以通過(guò)TRIZOL方法提取總RNA。將裂解物儲(chǔ)存在-80。C,按照制造商的指導(dǎo)手冊(cè) (Qiagen， RNeasy Mini Prep Kit)來(lái)提取RNA。
通過(guò)ELISAs和Luminex檢領(lǐng)'J分泌、的蛋白
通過(guò)ELISA評(píng)估細(xì)月包上清液中RANTES、肺瘤壞死因子 (TNFa)和CCL9的;農(nóng)度。通過(guò)Luminex ;危式《效J朱法(Luminex multiplex bead assay) ( Bio-rad 6 多孩史主朱陣歹l)法(Bio-rad 6 plex assay))確定IL-12p40、 IL國(guó)IO、 IL-1|3、 TNFa、 MCP-1 (單沖亥纟田月包 化學(xué)引談物蛋白-1 )和IL-6水平。ELISA的檢測(cè)下限為0.1-0.5 ng/ml， Luminex法的4全測(cè)下限為10-50 pg/ml。
RNA制備和RT-PCR
利用Qiagen RNeasy試劑盒才是取總RNA,利用Sybr-Green方法 使其^皮反轉(zhuǎn)錄并經(jīng)受qRT-PCR。利用2-AACT方法分析數(shù)據(jù)(Livak, KJ. & Schmittgen T. D. (2001) , Me/Zzc^ 25:402-408 )。
通過(guò)利用透孔膜(ChemoTX， 6-mm直徑，8卞m孔徑)來(lái)評(píng)估細(xì) 胞遷移。簡(jiǎn)言之，收集BioGEL-引發(fā)的細(xì)胞并將其置于補(bǔ)充有25 mM Hepes和0.1%牛血清白蛋白的RPMI中的透孑L膜上(250000個(gè)細(xì)月包 /膜)。 -使細(xì)月包朝向凱莫瑞肽(lpM-100nM)遷移4小時(shí)。通過(guò)在 將細(xì)胞置于透孔膜上之前30分鐘將細(xì)胞與百日咳毒素(PTX， 200ng/ml, Sigma- Aldrich ) —起予貞孵育30分4中來(lái)阻斷經(jīng)由G蛋白4禺 聯(lián)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在膜的下側(cè)遷移的細(xì)胞被固定(3%甲醛)并用 DAPI染色。遷移^皮定量為共焦顯獨(dú)H竟下DAPI染色的細(xì)月包沖亥中的 像素?cái)?shù)(2幅照片/膜，每個(gè)處玉里至少3個(gè)平4亍的孑L )。利用Metamorph Offline軟件分析圖像以確定被遷移的細(xì)胞占據(jù)的百分比閾值區(qū)域 (TA)。通過(guò)劃分處理TA無(wú)血清培養(yǎng)基TA獲得遷移指示物(migration indices )。對(duì)于第二趨化性試-瞼，以50000個(gè)細(xì)胞/膜嫂_ 用ChemoTx 3-mm直徑，8卞m孑L月莫。
鼠,炎
C57BL6/J小鼠在i.p.給予500nl 10昭酵母聚糖A前1小時(shí)i.p. 主會(huì)予500nl Chemerinl5-小鼠(0.32 ng/kg )或僅主會(huì)予載體(無(wú)菌PBS )。 4小時(shí)后將其人道處死后，通過(guò)用5 ml無(wú)菌PBS-3mM EDTA進(jìn)行 腹腔灌洗來(lái)收集腹膜滲出物。獲得無(wú)細(xì)胞灌洗液以用于ELISA,制 備'滲出物細(xì)月包以用于下述分才斤。
差別白細(xì)胞計(jì)數(shù)和FACS ^^斤
C57BL6/J小鼠在i.p.給予500 jal 10嗎酵母聚糖A前1小時(shí)i.p. 纟會(huì)予500 pi Chemerin15 ( 0.32 ng/kg )或載體(PBS )。 2小時(shí)、4小 時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后，將其人道處死。制備 灌洗細(xì)胞的等分試樣以用于總的和差別的白細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定。為了確 定細(xì)月包纟且成(PMN與單4亥細(xì)月包)，用4元-小鼠2.42G FcnII/III (0.5 pg/0.1x106個(gè)細(xì)月包)阻斷細(xì)月包10分鐘，并用FITC-共扼的抗-小鼠 7/4和PE-共軛的抗-小鼠Ly-6G( 0.5 jug/0.5x106個(gè)細(xì)胞；克隆rmC5-3 和RB6-8C5,分別來(lái)自BD Pharmingen )染色(10分鐘)。在 FACSCalibur流式細(xì)胞儀上用CellQuest軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。對(duì)于 每個(gè)樣品，最少獲得10,000個(gè)事件。在三個(gè)群周圍構(gòu)建門，這三個(gè) 群是中性白細(xì)胞(7/4高，Ly-6G * )、單核細(xì)胞(7M高，Ly_6G低)和定 居巨噬細(xì)胞(7/4、 Ly-6Gte)。測(cè)量每個(gè)群中的總事件百分比。此 外，J]文集無(wú)細(xì)月包灌;先液以用于ELISA和Luminex i式馬全。
統(tǒng)計(jì)
利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行學(xué)生氏t 4全驗(yàn)和一元ANOVA。
權(quán)利要求
1.衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似物或衍生物在制備用于治療炎癥的藥物中的應(yīng)用。
2. 書f生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似 物或^f汙生物在制備用于治療內(nèi)毒素^f木克的藥物中的應(yīng)用。
3. 書于生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似 物或衍生物在制備用于降低一種或多種炎性介質(zhì)水平的藥物 中的應(yīng)用。
4. 一種治療、預(yù)防或改善受試者體內(nèi)的炎癥的方法，包括^會(huì)予所 述受試者一種或多種4汙生自凱莫瑞蛋白的C-末端的^^、或它 們的類々乂4勿或書f生物。
5. —種治療、預(yù)防或改善受試者體內(nèi)的內(nèi)毒素4木克的方法，包括 給予所述受試者一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的 肽、或它們的類似物或書f生物。
6. —種降^f氐受試者體內(nèi)的一種或多種炎性介質(zhì)的水平的方法，包 括給予所述受試者一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的 肽、或它們的類4以物或書于生物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用或權(quán)利要求6所述的方法，其中， 所述一種或多種炎性介質(zhì)選自包4舌TNFou IL-la、 IL-1(3、 IL-6、 IL畫12、 G-CSF、 MCP-2 ( CCL8 )、 GROa ( CXCL1 )、 GRO|3(CXCL2 )、 IL-8( CXCL8 )、 TECK( CCL25 )、 MCP-1 ( CCL2 )、 干4尤素y和Rantes ( CCL5 )的組。
8. 衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似 物或4汙生物在制備用于處理傷口的藥物中的應(yīng)用。
9. 一種治療、預(yù)防或改善受試者的傷口的方法，包括給予所述受 試者一種或多種書于生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它們的 類4以物或書1"生物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2、 3、 7或8所述的應(yīng)用，其中，所迷藥物 用于治療和/或預(yù)防和/或美容應(yīng)用，或者根據(jù)權(quán)利要求4、 5、 6、 7或8所述的方法，其中，所述治療/處理為治療性的和/ 或預(yù)防性的和/或美容用的。
11. 才艮據(jù)前述^又利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽 在約5到約30個(gè)氨基酸之間。
12. 才艮據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽 包含衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的約5到約30個(gè)氨基酸，或 它們的類似、物或書f生物。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所述衍 生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽與所述凱莫瑞蛋白的天然存在 的C-末端具有至少30%或更高的同一性。
14. 才艮據(jù)前述斥又利要求中4壬一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽 與才艮才居Seq ID no: 31 (人類序歹'j )和Seq ID no: 34 (小鼠序歹'J ) 的凱莫瑞蛋白的最后5個(gè)至最后30個(gè)氨基酸具有至少30%的 序列同一性。
15. 4艮據(jù)前述4又利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所述類所述抗炎活性、和/或所述抗內(nèi)毒素<木克活性、和/或所述炎性 介質(zhì)水平降低活性。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽 中的一種或多種具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29和30的序歹'J或者為它力']的類合乂4勿或 書亍生物；或根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中， 所述肽中的一種或多種具有Seq ID No: 37和38的序列或者 為它們的類4以物或書f生物。
17. 才艮l居4又利要求16所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽與SeqID No: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 ,16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30中的一種或多種肽具有至少30%的序列同一'l"生；或才艮據(jù)4又利要求16所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽與S叫 ID No: 37或38中的一種或多種肽具有至少30%的序列同一 性。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所 迷肽類似物或衍生物包含衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽的 小分子模擬物。
19. 才艮據(jù)前述4又利要求中4壬一項(xiàng)所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽、 或它們的類似物或書f生物，旨在以約10pg/kg到約Img/kg的劑量給藥。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用或方法，其中，所述肽、或它們 的類似物或書f生物，旨在以約10 pg/kg到約100 ng/kg的劑量給藥。
21. 用一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它們的類 似物或書f生物浸漬的醫(yī)學(xué)裝置。
22. 用一種或多種衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它們的類 似物或書f生物浸漬的傷口敷沖?；蚩噹А?br> 23. —種藥物組合物，包含一種或多種選自包括具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 的用稀釋劑、載體或賦形劑；或一種藥物組合物，包含一種或多種選自包括具有Seq ID No: 37和38的序列的肽及它們的類似物或書1"生物組成的組中 的肽、以及藥用的《希釋劑、載體或l武形劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物在炎癥的治療和/或預(yù)防、和/ 或內(nèi)毒素休克的治療和/或預(yù)防、和/或用于降低一種或多種炎 性介質(zhì)的水平中的應(yīng)用。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物在處理傷口中的應(yīng)用。
26. 具有S叫IDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 或30的序列的肽或它們的類如乂物或書f生物；或者 具有序歹'J SeqIDNo: 37或38的肽或它們的類似物或書亍生物。
27. —種肽，與具有S叫IDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序列的肽具有至少50%的序列同 一性；或一種肽，與具有SeqIDNo: 37或38的序列的肽具有至 少50%的序列同一寸生。
28. —種或多種書于生自凱莫瑞蛋白的C-末端的肽，或它們的類似 物或衍生物，在炎癥的治療和/或預(yù)防、和/或內(nèi)毒素休克的治 療和/或預(yù)防、和/或用于降^f氐一種或多種炎性介質(zhì)如細(xì)月包因子 和趨化因子的水平；或用于傷口的處理中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似物或衍生物用于治療受試者體內(nèi)炎癥和/或內(nèi)毒素休克和/或處理受試者體內(nèi)傷口和/或降低受試者體內(nèi)炎性趨化因子水平的應(yīng)用，以及衍生自凱莫瑞蛋白的C-末端的一種或多種肽，或它們的類似物或衍生物用于炎癥和/或內(nèi)毒素休克的治療，和/或傷口處理，或用于降低炎性介質(zhì)的水平的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/04GK101641114SQ200880009305
公開(kāi)日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者安德烈亞斯·魯斯, 戴維·R·格里夫斯, 詹納·L·卡什 申請(qǐng)人:Isis創(chuàng)新有限公司