專利名稱：針對(duì)癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的靶向劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF， cancer-associated fibroblast或carcinoma- associated fibroblast)中的細(xì)胞的革巴
向劑，含有該靶向劑的上述細(xì)胞用的物質(zhì)遞送載體，以及利用了該物質(zhì)遞 送載體的抗癌組合物、抗CAF組合物和用來處置癌的方法。
背景技術(shù)：
癌是人類所面對(duì)的最重要的疾病之一，為了治療癌，正在進(jìn)行大量的 研究努力。在癌治療、特別是癌的內(nèi)科治療中，開發(fā)了各種抑制癌細(xì)胞增 殖的抗癌劑，并取得了某種程度的成果，但由于這樣的藥劑不僅抑制癌細(xì) 胞而且還會(huì)抑制正常細(xì)胞的增殖，因此惡心嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、腎損 害、神經(jīng)損害等各種各樣的副作用已成為問題。作為減少這樣的副作用的 方法，近年來進(jìn)行著將抗癌劑特異性地向癌細(xì)胞或癌組織遞送的嘗試。通 過抗癌劑的特異性遞送，不僅能夠防止抗癌劑到達(dá)正常細(xì)胞，減輕副作用， 而且還能夠獲得減少抗癌劑的給藥量這樣的經(jīng)濟(jì)方面的好處。
作為具體的遞送方法，例如正在開發(fā)利用EPR (提高滲透及潴留， enhanced permeability and retention)效應(yīng)的被動(dòng)耙向或使用在癌細(xì)胞特異性 地表達(dá)的表面分子的配體等對(duì)藥物進(jìn)行修飾的主動(dòng)靶向等方法。作為可用 于主動(dòng)靶向的分子，已報(bào)道有通過配體的結(jié)合能夠被吞噬到細(xì)胞內(nèi)的分子， 例如CD19、 HER2、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、葉酸受體、VIP受體、EGFR (非專利 文獻(xiàn)1)、 RAAG10 (專利文獻(xiàn)1)、 PIPA (專利文獻(xiàn)2)、 KID3 (專利文獻(xiàn)3) 等。但是，這些遞送方法都尚未滿足要求，仍需要進(jìn)一步地開發(fā)癌細(xì)胞特 異性的遞送方法。
另外，在癌的內(nèi)科治療中，由于認(rèn)為若使癌細(xì)胞本身死亡，即能夠治 愈癌，因此到目前為止以癌細(xì)胞為靶的各種抗癌劑一直在被開發(fā)和使用中。 但是，這樣的嘗試受到如上所述的副作用的問題、由微小殘留病變所引起
4的復(fù)發(fā)或腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌劑的耐受性等附加現(xiàn)象的發(fā)生等的阻礙，因此不 一定能夠舉出幾個(gè)滿足要求的成果。
另一方面，癌的周圍環(huán)境例如包括血管、ECM、成纖維細(xì)胞等的間質(zhì) 在癌的發(fā)病和發(fā)展中擔(dān)任重要的作用，這已由最近的研究逐漸地弄清楚。 例如Camps等(參照非專利文獻(xiàn)2)報(bào)道將在單獨(dú)情況下不形成腫瘤或腫 瘤形成速度緩慢的腫瘤細(xì)胞與腫瘤形成性成纖維細(xì)胞一起接種給無(wú)胸腺裸 鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤快速且顯著地形成；此外，Olumi等(參照非專利文獻(xiàn)3) 報(bào)道將前列腺腫瘤患者腫瘤周圍的成纖維細(xì)胞(即CAF)與人前列腺細(xì)胞 一起移植給無(wú)胸腺動(dòng)物，結(jié)果顯著地促進(jìn)了其腫瘤性增殖。另外，也已清 楚這樣的腫瘤增殖與在間質(zhì)產(chǎn)生的PDGF (血小板衍生生長(zhǎng)因子， platelet-derived growth factor)、 TGF卩(卩轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，transforming growth factor-P)、 HGF (肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，hepatocyte growth factor)、 SDF-1 (基質(zhì) 細(xì)胞衍生因子，stromal cell-derived factor-1)等生理活性物質(zhì)相關(guān)(參照非 專利文獻(xiàn)4)。
基于這些認(rèn)識(shí)，癌的周圍環(huán)境的重要性開始受到關(guān)注，不是以癌細(xì)胞 本身，而是以其周圍環(huán)境為靶的新的治療方法開始進(jìn)入研究。其中，分泌 各種生理活性物質(zhì)并與癌的發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)的CAF逐漸成為近來關(guān)注 的焦點(diǎn)，但其正式研究的歷史還比較短，僅十幾年，雖然在以CAF分泌的 生理活性物質(zhì)為靶的癌治療方法中已被確認(rèn)具有某種程度的效果，但是現(xiàn) 狀是作為以CAF本身為靶的癌的治療方法，還沒有任何被認(rèn)可的成果(非 專利文獻(xiàn)4參照)。
參考文獻(xiàn)列表
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供能夠癌細(xì)胞特異性地遞送藥物等物質(zhì)的載體、
利用了該載體的癌治療藥和癌治療方法，并提供能夠CAF特異性地遞送藥物的載體、利用了該載體的癌治療藥和癌治療方法。
本發(fā)明的發(fā)明人在探求新型的癌治療方法中，注意到還沒有能夠CAF特異性地遞送藥物的載體，為了開發(fā)這樣的載體，發(fā)明人繼續(xù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有類視黃醇作為靶向劑的載體特異性地促進(jìn)向CAF的藥物遞送。進(jìn)而，對(duì)上述載體進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該載體也特異性地促進(jìn)向癌細(xì)胞的物質(zhì)遞送，從而完成了本發(fā)明。
雖然已知含有視黃醇的載體能夠向儲(chǔ)存視黃醇的星狀細(xì)胞遞送藥物(參照專利文獻(xiàn)4)，但是其特異性地促進(jìn)針對(duì)癌細(xì)胞或CAF的藥物遞送尚未為人所知。
艮口，本發(fā)明涉及下述技術(shù)方案
(1) 一種針對(duì)細(xì)胞的耙向劑，其含有類視黃醇，所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。
(2) 根據(jù)(1)的靶向劑，其中，類視黃醇包括視黃醇。
(3) —種細(xì)胞用的物質(zhì)遞送載體，其含有(1)或(2)的靶向齊U，所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。
(4) 根據(jù)(3)的載體，其中，靶向劑的含量為載體整體的0,2 20重
、(5)根據(jù)(3)或(4)的載體，其中，靶向劑與載體的除靶向劑以外的構(gòu)成成分之間的摩爾比為8: 1 1: 4。
(6) —種抗癌組合物，其含有(1)或(2)的靶向劑或(3) (5)任一項(xiàng)所述的載體，和控制癌細(xì)胞和/或癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活性或增殖的藥物。
(7) —種抗癌相關(guān)成纖維細(xì)胞組合物，其含有(1)或(2)的靶向劑或(3) (5)任一項(xiàng)的載體，和控制癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活性或增殖的藥物。
(8) 根據(jù)(6)的組合物，其中，控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物為抗癌劑。
(9) 根據(jù)(6) (8)的組合物，其中，控制癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活性或增殖的藥物選自選自TGFP、 HGF、 PDGF、 VEGF (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，vascular endothelial growth factor)、IGF(胰島素樣生長(zhǎng)因子，insulin-likegrowth factor)、 MMP (基質(zhì)金屬蛋白酶，matrix metalloproteinase)、 FGF (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，fibroblast growth factor)、 uPA (尿激酶型纖溶酶原激活物，urokinase-type plasminogen activator )、組織蛋白酶和SDF-1中的生理活性物質(zhì)的活性或產(chǎn)生抑制劑，細(xì)胞活性抑制劑，增殖抑制劑，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，以及以由癌相關(guān)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子或者參與該細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或者分泌的分子中的1個(gè)或1個(gè)以上為耙的siRNA、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸和表達(dá)它們的載體。
(10) 根據(jù)(9)的組合物，其中，參與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或者分泌的分子為HSP47 (熱休克蛋白47)。
(11) 根據(jù)(6) (10)的組合物，其中，所述組合物為將藥物、和靶向劑或載體在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)或其附近混合而成的。
(12) (6) (11)任一項(xiàng)的組合物的制備試劑盒，其包括1個(gè)或1個(gè)以上的容器，所述容器單獨(dú)或組合地包含藥物、靶向劑、以及根據(jù)需要使用的除靶向劑以外的載體構(gòu)成物質(zhì)。
本發(fā)明的載體是以癌細(xì)胞和CAF為特異性的靶的載體，通過將所希望的物質(zhì)或物體，例如控制癌細(xì)胞或CAF的活性或增殖的藥物等，高效地搬送到癌細(xì)胞和/或CAF，從而以最大的效率和最小的副作用實(shí)現(xiàn)所希望的效果，例如抑制癌細(xì)胞或CAF的活性和增殖，從而治愈癌、抑制癌的發(fā)展或預(yù)防癌的發(fā)病。
本發(fā)明的抗癌組合物由于是基于不僅針對(duì)癌細(xì)胞本身，而且針對(duì)CAF來處置癌的全新的方法的抗癌組合物，因此可期待即使在用以往的治療方法無(wú)法獲得滿意結(jié)果的癌中也具有有效性，并且還可以預(yù)見其與以往的抗癌劑或新生血管抑制劑等并用具有協(xié)同效果。
另外，本發(fā)明的載體由于能夠癌細(xì)胞和CAF特異性地遞送物質(zhì)，因此能夠用于癌細(xì)胞和CAF特異性的標(biāo)記或基因?qū)氲戎小?br>

圖1為對(duì)癌組織來源的細(xì)胞針對(duì)a-SMA、波形蛋白和結(jié)蛋白進(jìn)行免疫 染色而得到的照片圖。
圖2為表示將CAF或正常成纖維細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的癌細(xì)胞的細(xì) 胞數(shù)的變化情況的曲線圖。
圖3為比較隨著時(shí)間推移的利用各種脂質(zhì)體向CAF或正常成纖維細(xì)胞 遞送siRNA時(shí)的導(dǎo)入率的曲線圖。
圖4為表示與VA-lip-siRNA或lip-siRNA反應(yīng)的CAF中的siRNA的局 部存在情況的照片圖。
圖5為表示與VA-lip-siRNA、 lip-siRNA或VA-lip反應(yīng)的CAF或正常 成纖維細(xì)胞中的siRNA的局部存在情況的照片圖。
圖6為表示與VA-lip-DNR或lip-DNR反應(yīng)的CAF中的DNR的局部存 在情況的照片圖。圖中的數(shù)字表示從反應(yīng)開始計(jì)的經(jīng)過時(shí)間(分鐘)。倍率 為200倍(放大圖像為400倍)。
圖7為表示與VA-lip-DNR或lip-DNR反應(yīng)的正常成纖維細(xì)胞中的DNR 的局部存在情況的照片圖。圖中的數(shù)字表示從反應(yīng)開始計(jì)的經(jīng)過時(shí)間(分 鐘)。倍率為200倍。
圖8為表示與VA-lip-DNR或lip-DNR反應(yīng)的皮膚成纖維細(xì)胞(skin fibroblast)中的DNR的局部存在情況的照片圖。圖中的數(shù)字表示從反應(yīng)開 始計(jì)的經(jīng)過時(shí)間(分鐘)。倍率為200倍。
圖9為表示與VA-lip-DNR (左)或lip-DNR (右)反應(yīng)的CAF中的 DNR的局部存在情況的照片圖。倍率為400倍(放大圖像為800倍)。
圖10為表示在綠色的激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光的柔紅霉素(左上)、在 UV激發(fā)光下發(fā)出藍(lán)色熒光的DAPI (4',6-二氨基-2-苯基剛哚)(右上)、和 呈現(xiàn)紫色的融合圖像(下)的照片圖。
圖11為表示無(wú)處理(左上)、或者與DaunoXome (VA-:右上)、 DaunoXome⑧+視黃醇(VA+:左下)或DaunoXome +視黃酸(視黃酸 + :右下)反應(yīng)的CAF中的DNR的局部存在情況的照片圖。倍率為400 倍。
圖12為表示無(wú)處理(左上)、或者與DaunoXome (VA-:右上)、DaunoXome⑧+視黃醇(VA+:左下)或DaunoXome⑧+視黃酸(視黃酸 + :右下)反應(yīng)的HT-1080中的DNR的局部存在情況的照片圖。倍率為 400倍。
圖13為無(wú)處理(左上)、或者與DaunoXome⑧(VA-:右上)、DaunoXome⑧ +視黃醇(VA+:左下)或DaunoXome⑧+視黃酸(視黃酸+:右下)反 應(yīng)的HepG2中的DNR的局部存在情況的照片圖。倍率為400倍。
圖14為表示評(píng)價(jià)VA-lip-siRNA對(duì)CAF或正常成纖維細(xì)胞的增殖抑制 活性的結(jié)果的曲線圖?？v軸表示以處置前的活細(xì)胞數(shù)為100計(jì)時(shí)的處置后 的活細(xì)胞數(shù)的比率。
圖15為表示評(píng)價(jià)VA-lip-DNR對(duì)CAF或正常成纖維細(xì)胞的增殖抑制活 性的曲線圖?？v軸表示以處置前的活細(xì)胞數(shù)為100計(jì)時(shí)的處置后的活細(xì)胞 數(shù)的比率。
圖16為表示人纖維肉瘤來源的細(xì)胞株HT-1080中的脂化DNR (VA-) 或VA結(jié)合脂化DNR (VA+)在細(xì)胞內(nèi)局部存在情況的照片圖。上行表示 DNR的局部存在情況，下行表示用DAPI進(jìn)行了核染色的細(xì)胞，數(shù)字表示 添加后的時(shí)間。
圖17為表示人纖維肉瘤來源的細(xì)胞株HS913T中的脂化DNR (VA-) 或VA結(jié)合脂化DNR (VA+)在細(xì)胞內(nèi)局部存在的情況的照片圖。上行表 示DNR的局部存在情況，下行表示用DAPI進(jìn)行了核染色的細(xì)胞，數(shù)字表 示添加后的時(shí)間。
圖18為表示人纖維肉瘤來源的細(xì)胞株Sw684中的脂化DNR (VA-)或 VA結(jié)合脂化DNR (VA+)在細(xì)胞內(nèi)局部存在的情況的照片圖。上行表示 DNR的局部存在情況，下行表示用DAPI進(jìn)行了核染色的細(xì)胞，數(shù)字表示 添加后的時(shí)間。
圖19為表示HT-1080、 HS913T、 Sw684、 Huh7、 MCF7和Saos2細(xì)胞 中的脂化DNR (VA (-))或VA結(jié)合脂化DNR (VA ( + ))在細(xì)胞內(nèi)局部 存在的情況的照片圖(添加后15分鐘)。其中，空白為未添加脂化DNR和 VA結(jié)合脂化DNR中的任一個(gè)時(shí)的鏡檢圖像。
圖20為評(píng)價(jià)脂化DNR或VA結(jié)合脂化DNR對(duì)人纖維肉瘤來源的細(xì)胞 株HT-1080、 HS913T或Sw684的增殖抑制活性的曲線圖。
9圖21為表示靜脈內(nèi)給藥了 VA-lip-siRNA或lip-siRNA的患癌小鼠的腫 瘤組織中的siRNA的局部存在情況的照片圖。右側(cè)為VA-lip-siRNA給藥個(gè) 體、左側(cè)為lip-siRNA給藥個(gè)體、上側(cè)為FAM圖像、下側(cè)為FAM與Cy3 的融合圖像。其中，倍率為200倍。
圖22為靜脈內(nèi)給藥了 VA-lip-siRNA的患癌小鼠的腫瘤組織中的siRNA 的局部存在情況的照片圖。左上為FAM圖像，右上為Cy3圖像，左下為 FAM與Cy3的融合圖像，右下為FAM、 Cy3與DAPI的融合圖像。其中， 倍率為200倍。
圖23為表示評(píng)價(jià)VA-lip-DNR (1周2次給藥)在體內(nèi)(in vivo)的抗
腫瘤活性的結(jié)果的曲線圖?？v軸表示腫瘤塊的體積(mm3)，橫軸表示處置 開始后的天數(shù)。
具體實(shí)施例方式
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
在本發(fā)明中，癌細(xì)胞沒有特殊限定，可列舉出例如纖維肉瘤、惡性纖 維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、kaposi 肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等肉瘤，腦腫瘤、頭頸 部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、大腸癌、直 腸癌、肝癌、胰腺癌、膽嚢癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱 癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、皮 膚癌等癌，以及白血病或惡性淋巴瘤等的癌細(xì)胞。其中，在本發(fā)明中，"癌" 包括上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤。因此，本發(fā)明中的癌細(xì)胞可以 存在于任何部位，例如腦、頭頸部、胸部、四肢、肺、心臟、胸腺、食道、 胃、小腸(十二指腸、空腸、回腸)、大腸(結(jié)腸、盲腸、闌尾、直腸)、 肝臟、胰臟、膽嚢、肛門、腎、輸尿管、膀胱、前列腺、陰莖、睪丸、子 宮、卵巢、外陰、陰道、皮膚、橫紋肌、平滑肌、滑膜、軟骨、骨、甲狀 腺、腎上腺、腹膜、腸系膜、骨髓、血液、血管系統(tǒng)、淋巴結(jié)等淋巴系統(tǒng)、 淋巴液等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，癌細(xì)胞優(yōu)選存在于除肝臟和胰臟以外的 部位。因此，該實(shí)施方式中的癌細(xì)胞優(yōu)選存在于例如腦、頭頸部、胸部、
10小腸(十二指腸、空腸、回腸)、大腸(結(jié)腸、盲腸、闌尾、直腸)、膽嚢、肛門、腎、輸尿管、膀胱、前列腺、 陰莖、睪丸、子宮、卵巢、外陰、陰道、皮膚、橫紋肌、平滑肌、滑膜、軟骨、骨、甲狀腺、腎上腺、腹膜、腸系膜、骨髓、血液、血管系統(tǒng)、淋 巴結(jié)等淋巴系統(tǒng)、淋巴液等。另外，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，癌細(xì)胞 優(yōu)選為除肝癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞以外的細(xì)胞。在本發(fā)明中，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)是指在癌病變的內(nèi)部和/或周 圍存在的a-SMA (平滑肌肌動(dòng)蛋白)陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞。已確認(rèn)CAF存在 于大腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、膽管癌、基底細(xì)胞癌等各種 癌中。在本發(fā)明中，某種細(xì)胞是否為CAF用下面的方法進(jìn)行判定將在癌病 變的內(nèi)部和/或周圍存在的細(xì)胞用針對(duì)CAF標(biāo)記物a-SMA的標(biāo)記抗體、例 如FITC標(biāo)記抗a-SMA抗體或Cy3標(biāo)記抗a-SMA抗體進(jìn)行免疫染色，可檢 出a-SMA的細(xì)胞判定為CAF。本發(fā)明中的伴有CAF的癌并無(wú)特別限定，可列舉出例如腦腫瘤、頭頸 部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、大腸癌、直 腸癌、肝癌、胰腺癌、膽嚢癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱 癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、皮 膚癌等實(shí)體癌。另外，CAF典型地是與癌相關(guān)的細(xì)胞，但只要具有同樣的 性質(zhì)，則也可以是與除癌以外的惡性實(shí)體腫瘤例如纖維肉瘤、惡性纖維組 織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、kaposi肉瘤、 淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等肉瘤相關(guān)的CAF，這些也包 含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，CAF存在于除肝臟和胰臟以外的部位。 因此，該實(shí)施方式中的CAF為存在于例如腦、頭頸部、胸部、四肢、肺、 心臟、胸腺、食道、胃、小腸(十二指腸、空腸、回腸)、大腸(結(jié)腸、盲 腸、闌尾、直腸)、膽嚢、肛門、腎、輸尿管、膀胱、前列腺、陰莖、睪丸、 子宮、卵巢、外陰、陰道、皮膚、橫紋肌、平滑肌、滑膜、軟骨、骨、甲 狀腺、腎上腺、腹膜、腸系膜等中的CAF。類視黃醇為具有4個(gè)類異戊二烯單元頭對(duì)尾式地連接而成的骨架的化合物的組中的一員?？蓞⒄誈. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents," 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)。維生素A為
定性地表示視黃醇的生物學(xué)活性的類視黃醇的一般性描述因子。本發(fā)明中 的類視黃醇為促進(jìn)向癌細(xì)胞和CAF的特異性的物質(zhì)遞送(即將物質(zhì)靶向于 這些細(xì)胞)的物質(zhì)。作為這樣的類視黃醇，并無(wú)特殊限定，可以使用例如 視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃醇與脂肪酸的酯、脂肪族醇與視黃酸的酯、 依曲替酯、維甲酸(tretinoin)、異維甲酸、阿達(dá)帕林、阿維a (acitretin)、 他扎羅汀(tazamtene)、棕櫚酸視黃醇等類視黃醇衍生物，以及芬維A胺 (4-HPR)、蓓薩羅丁等維生素A類似物。
另外，本發(fā)明中的類視黃醇與類視黃醇衍生物和/或維生素A類似物的 意義相同。類視黃醇促進(jìn)向癌細(xì)胞和CAF的特異性的物質(zhì)遞送的機(jī)理尚未 完全清楚，但認(rèn)為與借助癌細(xì)胞和CAF表面上的某種受體而進(jìn)行的攝入相 關(guān)。
其中，從向癌細(xì)胞和CAF的特異性的物質(zhì)遞送的效率的角度出發(fā)，優(yōu) 選視黃醇、視黃醛、視黃酸、視黃醇與脂肪酸的酯(例如乙酸視黃酯、棕 櫚酸視黃酯、硬脂酸視黃酯和月桂酸視黃酯)和脂肪族醇與視黃酸的酯(例 如視黃酸乙酯)。
類視黃醇的包括順-反式的全部異構(gòu)體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。類視黃 醇也可以被1個(gè)或2個(gè)以上的取代基取代。本發(fā)明中的類視黃醇當(dāng)然包括 分離狀態(tài)的類視黃醇，也包括將類視黃醇溶解或混入到能夠溶解或保持其 的介質(zhì)中的狀態(tài)的類視黃醇。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種針對(duì)細(xì)胞的靶向劑，其含有類視黃醇、且 所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。這里，靶向是指能夠?qū)⑽镔|(zhì)例 如藥物或藥物載體等向著特定的靶、例如特定的細(xì)胞或組織(在本發(fā)明中 為選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞)遞送，其比不作為靶的細(xì)胞或 組織、且與未靶向的上述物質(zhì)相比，更迅速、高效和/或大量地遞送，即能 夠特異性地遞送到靶。靶向劑是指在與物質(zhì)結(jié)合或反應(yīng)的情況下，使該物 質(zhì)能夠這樣地靶向的物質(zhì)。因此，在本說明書中，例如癌細(xì)胞特異性的載 體或組合物與癌細(xì)胞耙向載體或組合物可以以相同的意義使用。其中，當(dāng) 靶向劑為分子形態(tài)時(shí)，其與靶向分子同義。
12本發(fā)明的靶向劑可以由上述類視黃醇本身構(gòu)成，也可以含有類視黃醇 以外的構(gòu)成要素，例如促進(jìn)或穩(wěn)定靶向劑與載體或藥物的結(jié)合的要素，或 保存時(shí)、在制劑制造中使用時(shí)或制劑保存時(shí)保護(hù)類視黃醇的要素，將類視 黃醇與載體或藥物在空間上隔開的間隔劑等。本發(fā)明的靶向劑與任意載體 或藥物結(jié)合，能夠使這些載體或藥物靶向于選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì) 胞的細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞用的物質(zhì)遞送載體，其含有上述靶向劑、且所 述細(xì)胞選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。本發(fā)明的載體可以僅由上述耙向 劑構(gòu)成，也可以通過使靶向劑與和其不同的、載體的除靶向劑以外的構(gòu)成 成分結(jié)合或含有在其中而構(gòu)成。因此，本發(fā)明的載體可以含有除靶向劑以 外的構(gòu)成成分。作為這樣的成分，并無(wú)特殊限定，可以使用在醫(yī)藥和藥學(xué) 領(lǐng)域中已知的任何成分，但優(yōu)選能夠含有靶向劑、特別是類視黃醇的成分， 或能夠與其結(jié)合的成分。
作為這樣的成分，可列舉出脂質(zhì)，例如甘油磷脂等磷脂，鞘磷脂等鞘 脂，膽固醇等甾醇，大豆油、罌粟油等植物油，礦物油，卵黃卵磷脂等卵 磷脂類等，但并不限定于這些。其中，優(yōu)選能夠構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)，例如
卵磷脂等天然磷脂，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、 二棕櫚酰磷脂酰膽 堿(DPPC)、 二硬酯酰磷脂酰膽堿(DSPC)等半合成磷脂，二油酰磷脂酰 膽堿(DOPE)， 二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)，膽固醇等。
作為特別優(yōu)選的成分，可列舉出能夠避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲的成分， 例如N- (a-三甲基胺基乙?；?-二 (十二烷基)-D-谷氨酰氯(TMAG)、 N,N，,N",N，"-四甲基-N,N，,N",N"，-四棕櫚基精胺(TMTPS)、 2，3-二油 烯氧基-N- [2 (精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烯胺三氟乙酸酯
(DOSPA)、 N- [1- (2,3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨
(DOTMA)、 二 (十八垸基)二甲基氯化銨(DODAC)、 二 (十二烷基) 溴化銨(DDAB)、 1，2-二油烯氧基-3-三甲基胺基丙烷(DOTAP)、 3|3- [N-
(N，，N，-二甲基胺基乙烷)胺基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)、 1,2-二肉豆 蔻酰氧基丙基-3-二甲基羥基乙基銨(DMRIE)、 O，O，-二 (十四垸基)-N-
(a-三甲基胺基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)等陽(yáng)離子性脂質(zhì)。 本發(fā)明的靶向劑向載體的結(jié)合或包含也可以通過下述方法實(shí)現(xiàn)利用化學(xué)和/或物理方法將靶向劑結(jié)合或包含在載體的除靶向劑以外的構(gòu)成成分 上?；蛘?，本發(fā)明的靶向劑向載體的結(jié)合或包含也可以通過下述方法實(shí)現(xiàn): 在該載體的制作時(shí)，將靶向劑與載體的除靶向劑以外的構(gòu)成成分混合。本 發(fā)明結(jié)合或包含在載體上的靶向劑的量可以為以重量比計(jì)在含有靶向劑
的載體的構(gòu)成成分中占0.01% 100%、優(yōu)選占0.2% 20%、更優(yōu)選占l 5%。耙向劑向載體的結(jié)合或包含也可以在使藥物等載持于該載體之前進(jìn)
行，也可以通過將載體、靶向劑和藥物等同時(shí)混合等來進(jìn)行，或者通過將 處于已載持有藥物等的狀態(tài)的載體與靶向劑混合等來進(jìn)行。因此，本發(fā)明
還涉及一種靶向于選自癌細(xì)胞和CAF的細(xì)胞的制劑的制造方法，其包括將 耙向劑與已知的任意的藥物結(jié)合載體或藥物封入載體，例如DaunoXome⑧、 Doxil、 Caelyx 、 Myocet⑧等脂質(zhì)體制劑結(jié)合的工序。
本發(fā)明的載體的形態(tài)只要能夠?qū)⑺Ｍ奈镔|(zhì)或物體搬運(yùn)到作為靶的 癌細(xì)胞或CAF，則任何形態(tài)均可以，例如可以采用高分子膠束、脂質(zhì)體、 乳膠、微球、毫微球等中的任一形態(tài)，這并非是進(jìn)行限定。本發(fā)明的載體 的大小可以根據(jù)藥物的種類等進(jìn)行變化。所述大小并無(wú)特別限定，優(yōu)選直 徑為例如50 200pm、更優(yōu)選為75 150pm。這是因?yàn)檫@樣的大小適于發(fā) 揮促進(jìn)向癌組織的聚集的EPR效應(yīng)，適于遞送控制后述的癌細(xì)胞和/或CAF 的活性或增殖的藥物。所述直徑是采用動(dòng)態(tài)光散射法(dynamic light scattering method )湖!j定的值。
在本發(fā)明的載體中，靶向劑與載體的除靶向劑以外的構(gòu)成成分之間的 摩爾比(存在比)為在給藥時(shí)，優(yōu)選為8: 1 1: 4、更優(yōu)選為4: 1 1: 2、進(jìn)一步優(yōu)選為3: 1 1: 1、特別優(yōu)選為2: 1。不受任何理論的限制， 所述摩爾比據(jù)信在下述方面是有效的靶向劑向載體的有效的(即不損害 耙向劑的耙向功能)結(jié)合或包含，和物質(zhì)向癌細(xì)胞或CAF的特異性的遞送。
在本發(fā)明中，從遞送效率高低、能夠遞送的物質(zhì)的選擇范圍寬窄和制 劑的容易性等觀點(diǎn)出發(fā)，這些載體中優(yōu)選脂質(zhì)體形態(tài)，其中特別優(yōu)選含有 陽(yáng)離子性脂質(zhì)的陽(yáng)離子性脂質(zhì)體。
本發(fā)明的載體只要其所含的靶向劑以發(fā)揮靶向功能的狀態(tài)存在，則可 以在內(nèi)部含有搬運(yùn)物，也可以附著存在于搬運(yùn)物的外部，還可以與搬運(yùn)物 混合。這里，發(fā)揮靶向功能是指含有靶向劑的載體比不含靶向劑的載體更迅速、高效和/或大量地到達(dá)和/或被攝入到耙細(xì)胞即癌細(xì)胞和/或CAF，這 可以通過例如將帶有標(biāo)記或含有標(biāo)記的載體添加到癌細(xì)胞和/或CAF培養(yǎng) 物中，然后在規(guī)定時(shí)間后分析標(biāo)記的存在部位來容易地確認(rèn)。本發(fā)明的發(fā) 明人意外地發(fā)現(xiàn)通過使靶向劑最遲在到達(dá)癌細(xì)胞和/或CAF之前，至少部 分地露出到含有載體的制劑的外部，能夠高效地實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞和/或CAF特異
性的物質(zhì)遞送。發(fā)明人研究認(rèn)為這是由下述現(xiàn)象引起的露出到含有載體
的制劑的外部的靶向劑借助癌細(xì)胞和/或CAF表面上的某種受體，能夠比通 常的擴(kuò)散更高效地被癌細(xì)胞和/或CAF攝入。作為使耙向劑露出到含有載體 的制劑的外部的方法，并無(wú)特別限定，例如可列舉出在制備載體時(shí)，使靶 向劑與載體的除靶向劑以外的構(gòu)成成分相比過量地配合的方法。更具體而 言，為了使靶向劑高效地露出到含有載體的制劑的外部，耙向劑與載體的
除靶向劑以外的構(gòu)成成分之間的摩爾比(配合比)為在配合時(shí)優(yōu)選為8: 1 1: 4、更優(yōu)選為4: 1 1: 2、進(jìn)一步優(yōu)選為3: 1 1: 1、特別優(yōu)選為2: 1。
本載體遞送的物質(zhì)或物體并無(wú)特殊限制，優(yōu)選為能夠從給藥部位向著
癌細(xì)胞和/或CAF存在的病變部位在生物體內(nèi)物理移動(dòng)的大小。因此，本發(fā) 明的載體除了原子、分子、化合物、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)外，還可以搬運(yùn) 載體、病毒顆粒、細(xì)胞、由1個(gè)以上要素構(gòu)成的藥物釋放系統(tǒng)、微型設(shè)備 (micromachine)等物體。上述物質(zhì)或物體優(yōu)選具有對(duì)癌細(xì)胞和/或CAF產(chǎn) 生某些影響的性質(zhì)，包括例如對(duì)癌細(xì)胞和/或CAF進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì)或物體， 或控制癌細(xì)胞和/或CAF的活性或增殖(例如增強(qiáng)或抑制其活性或增殖)的 物質(zhì)或物體。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，載體遞送的物質(zhì)是"控制癌細(xì)胞 和/或CAF的活性或增殖的藥物"。這里，癌細(xì)胞的活性是指癌細(xì)胞所表現(xiàn) 出的分泌、攝入、游走等各種活性，在本發(fā)明中，典型地，其中特別是指 與癌的發(fā)病、發(fā)展、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移、惡液質(zhì)等癥狀的發(fā)生和惡化等相關(guān)的 活性。作為所述活性，可列舉出例如甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(PTHrP)或免疫 抑制酸性蛋白(IAP)等的產(chǎn)生和分泌，這并非是進(jìn)行限定。
另外，CAF的活性是指CAF所表現(xiàn)出的分泌、攝入、游走等各種活性， 在本發(fā)明中，典型地，其中特別是指與癌的發(fā)病和/或發(fā)展相關(guān)的活性。作
15為所述活性，可列舉出例如TGF卩、HGF、 PDGF、 VEGF、 IGF (IFG1、 IGF2 等)、MMP (MMP1、 2、 3、 9、 11、 13、 14等)、FGF (FGF7、 bFGF等)、 uPA、組織蛋白酶、SDF-1等生理活性物質(zhì)，或膠原、蛋白聚糖、細(xì)胞粘合 素、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、骨橋蛋白、骨粘連蛋白、彈性蛋白等細(xì) 胞外基質(zhì)成分等的產(chǎn)生和分泌。
因此，控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物可以是直接或間接地抑制與癌 的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)相關(guān)的癌細(xì)胞的物理、化學(xué)和/或生理作用等的任何 藥物，沒有限定，包括抑制癌的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)的抗癌劑，例如異 環(huán)磷酰胺、鹽酸尼莫司汀、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、美法侖、雷莫司汀等烷 化劑，鹽酸吉西他濱、依諾他濱、阿糖胞苷 十八烷基磷酸鈉、阿糖胞苷 制劑、替加氟，尿嘧啶、替加氟 吉莫斯特 氧嗪酸鉀配合劑、去氧氟尿 苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巰基嘌呤等抗代謝劑，鹽酸依達(dá)比星、 鹽酸表柔比星、鹽酸柔紅霉素、檸檬酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、鹽酸吡柔 比星、鹽酸博來霉素、硫酸培洛霉素、鹽酸米托蒽醌、絲裂霉素C等抗腫 瘤性抗生素，依托泊甙、鹽酸伊立替康、酒石酸長(zhǎng)春瑞濱、多西他賽水合 物、紫杉醇、硫酸長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)舂地辛、硫酸長(zhǎng)春堿等生物堿，阿那 曲唑、擰檬酸他莫昔芬、檸檬酸托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、磷酸雌莫 司汀等激素療法劑，鉑爾定、順鉑、奈達(dá)鉑等鉑絡(luò)合物，沙利度胺、新伐
司他、貝伐單抗等新生血管抑制劑，L-門冬酰胺酶等，并非是進(jìn)行限定；
抑制上述生理活性物質(zhì)的活性或者產(chǎn)生的藥物，例如中和上述生理活性物
質(zhì)的抗體和抗體片段；抑制上述生理活性物質(zhì)的表達(dá)的siRNA、核酶、反 義核酸(包括RNA、 DNA、 PNA或它們的復(fù)合物)等物質(zhì)；或者顯性失活 突變體等具有顯性失活效果的物質(zhì)或表達(dá)它們的載體；鈉通道抑制劑等細(xì) 胞活性抑制劑；細(xì)胞增殖抑制劑；以及compound 861、膠霉毒素(gliotoxin) 等細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。另外，本發(fā)明中的"控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物" 也可以是直接或間接地促進(jìn)與癌的發(fā)病、發(fā)展和/或復(fù)發(fā)的抑制直接或間接 地相關(guān)的癌細(xì)胞的物理、化學(xué)和/或生理作用等的任何藥物。上述藥物中， 從治療效果等觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選抗癌劑。
另外，控制CAF的活性或增殖的藥物可以是直接或間接地抑制與癌的 發(fā)病和/或發(fā)展相關(guān)的CAF的物理、化學(xué)和/或生理作用等的任何藥物，沒有限定，包括抑制上述生理活性物質(zhì)的活性或產(chǎn)生的藥物，例如拮抗TGF卩 的TGFP II型受體(切斷型TGFp II型受體、可溶性TGF(3 II型受體等)、 巴馬司他等MMP抑制劑，和中和上述生理活性物質(zhì)的抗體和抗體片段、抑 制上述生理活性物質(zhì)的表達(dá)的siRNA、核酶、反義核酸(包括RNA、 DNA、 PNA或它們的復(fù)合物)等物質(zhì)、或者顯性失活突變體等具有顯性失活效果 的物質(zhì)、或表達(dá)它們的載體、鈉通道抑制劑等細(xì)胞活性抑制劑，烷化劑(例 如異環(huán)磷酰胺、鹽酸尼莫司汀、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、美法侖、雷莫司汀 等)，抗腫瘤性抗生素(例如鹽酸依達(dá)比星、鹽酸表柔比星、鹽酸柔紅霉素、 檸檬酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、鹽酸吡柔比星、鹽酸博來霉素、硫酸培洛 霉素、鹽酸米托蒽醌、絲裂霉素C等)，抗代謝劑(例如鹽酸吉西他濱、依 諾他濱、阿糖胞苷，十八垸基磷酸鈉、阿糖胞苷制劑、替加氟，尿嘧啶、替 加氟，吉莫斯特，氧嗪酸鉀配合劑、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氨甲 喋呤、巰基嘌呤等)，依托泊甙、鹽酸伊立替康、酒石酸長(zhǎng)春瑞濱、多西他 賽水合物、紫杉醇、硫酸長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)春地辛、硫酸長(zhǎng)春堿等生物堿， 鉑爾定、順鉑、奈達(dá)鉑等鉑絡(luò)合物等細(xì)胞增殖抑制劑、以及compound 861、 膠霉毒素等細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。另外，本發(fā)明中的"控制CAF的活性或增殖
的藥物"也可以是直接或間接地促進(jìn)與癌的發(fā)病和/或發(fā)展的抑制直接或間 接地相關(guān)的CAF的物理、化學(xué)和/或生理作用等的任何藥物。
作為本發(fā)明中的"控制CAF的活性或增殖的藥物"的其他例子，可列 舉出細(xì)胞外基質(zhì)，例如控制膠原代謝的藥物，其中包含具有抑制例如以CAF 產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子作為靶的、或以參與該細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的 產(chǎn)生或者分泌的分子中的1個(gè)或1個(gè)以上作為靶的siRNA、核酶、反義核 酸(包括RNA、 DNA、 PNA或它們的復(fù)合物)等耙分子的表達(dá)的效果的物 質(zhì)，或者顯性失活突變體等具有顯性失活效果的物質(zhì)、或者表達(dá)這些物質(zhì) 的載體等。
siRNA為具有mRNA等耙分子特異性的序列的雙鏈RNA，通過促進(jìn)耙 分子的分解，從而抑制通過靶分子形成的物質(zhì)例如蛋白質(zhì)的表達(dá)(RNA干 擾)。從Fire等發(fā)表了該原理以來(Nature, 391:806-811,1998)，已經(jīng)進(jìn)行了 有關(guān)siRNA最優(yōu)化的廣泛研究，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員精通這樣的技術(shù)。另 外，對(duì)于除siRNA以外的導(dǎo)致RNA干擾或其他的基因表達(dá)抑制反應(yīng)的物質(zhì)也進(jìn)行了大力研究，目前也出現(xiàn)了很多這樣的物質(zhì)。
例如，日本特開2003-219893號(hào)公報(bào)中記載了由抑制靶基因表達(dá)的DNA 和RNA構(gòu)成的雙鏈多核苷酸。該多核苷酸可以是雙鏈中的一個(gè)為DNA、 另一個(gè)為RNA的DNA/RNA雜交體，也可以為同一鏈的一部分為DNA、 其他部分為RNA的DNA/RNA嵌合體。所述多核苷酸優(yōu)選由19 25、更 優(yōu)選由19 23、進(jìn)一步優(yōu)選由19 21個(gè)核苷酸構(gòu)成，在DNA/RNA雜交體 的情況下，優(yōu)選正義鏈為DNA、反義鏈為RNA的雜交體，另外，在DNA/RNA 嵌合體的情況下，優(yōu)選雙鏈多核苷酸的上游側(cè)的一部分為RNA的嵌合體。 所述多核苷酸可以按照利用本身公知的化學(xué)合成法的常規(guī)方法來制作具有 任意序列的多核苷酸。
作為上述耙分子，例如優(yōu)選能夠完全抑制細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生 和/或分泌的分子，作為這樣的分子的例子包括HSP47，這并非是進(jìn)行限定。 公開的HSP47或其同源的基因序列例如有GenBank accession No.AB010273 (人)、X60676 (小鼠)、M69246 (大鼠、gp46)。
因此，作為本發(fā)明的控制CAF的活性或增殖的藥物，優(yōu)選例如以HSP47 為靶的siRNA、 DNA/RNA雜交體或者嵌合多核苷酸、反義核酸等。
本發(fā)明的載體遞送的物質(zhì)或物體也可以未被標(biāo)記。通過進(jìn)行標(biāo)記，能 夠監(jiān)測(cè)搬運(yùn)是否成功、癌細(xì)胞或CAF的增減等，在試驗(yàn)研究水平特別有用。 標(biāo)記可以選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意標(biāo)記，例如任意的放射性同位素、 磁性體、與標(biāo)記化物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)(例如抗體)、熒光物質(zhì)、熒光團(tuán)、化學(xué) 發(fā)光物質(zhì)和酶等。
在本發(fā)明中，"癌細(xì)胞用"或"癌相關(guān)成纖維細(xì)胞用"是指適用于以癌 細(xì)胞或癌相關(guān)成纖維細(xì)胞為靶，其包括例如能夠向靶細(xì)胞即癌細(xì)胞或癌相 關(guān)成纖維細(xì)胞，比向其他細(xì)胞(非靶細(xì)胞)例如未發(fā)生癌變的細(xì)胞或正常 的成纖維細(xì)胞，更迅速、高效和/或大量地遞送物質(zhì)。例如，本發(fā)明的載體 能夠向癌細(xì)胞或癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，與向其他的細(xì)胞相比，以l.l倍以上、 1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、進(jìn)而3倍以上的速度和/或 效率遞送物質(zhì)。其中，這里"效率"是指在作為評(píng)價(jià)對(duì)象的細(xì)胞整體中被 遞送了物質(zhì)的細(xì)胞的比例。
本發(fā)明還涉及用于控制癌細(xì)胞的活性或增殖或者用于處置癌的組合物(抗癌組合物)、和用于控制CAF的活性或增殖的組合物(抗CAF組合物)以及用于處置有CAF參與的癌的組合物，這些組合物含有上述靶向劑或載體、和控制上述癌細(xì)胞和/或CAF的活性或增殖的1種或2種以上的藥物；以及涉及上述靶向劑或載體在制備這些組合物中的用途。
在本發(fā)明中，癌包括任意的惡性腫瘤，例如纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、kaposi肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤，進(jìn)而也包括腦腫瘤、頭頸部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽嚢癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、皮膚癌、白血病、惡性淋巴瘤等。上述癌也可以不伴有CAF。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，癌優(yōu)選為除肝癌和胰腺癌以外的癌。另外，在另一實(shí)施方式中，癌的處置優(yōu)選為除肝癌和胰腺癌的預(yù)防以外的處置。
另外，在本發(fā)明中，有CAF參與的癌不僅包括CAF存在于癌的內(nèi)部或周圍的"伴有CAF的癌"，也包括與CAF在空間上分開，但CAF通過釋放上述生理活性物質(zhì)來促進(jìn)癌的增殖和活性的癌。因此，有CAF參與的癌是指廣義的惡性腫瘤，包括屬于上皮性的惡性腫瘤的任意癌，例如腦腫瘤、頭頸部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、闌尾癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽嚢癌、膽管癌、肛門癌、腎癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌和皮膚癌，進(jìn)而也包括屬于非上皮性的惡性腫瘤的上述以外的任意惡性實(shí)體腫瘤，例如纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、kaposi肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤等。從有助于CAF的增殖的程度的高低等出發(fā)，在本發(fā)明中，有利的是能夠處置選自結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、膽管癌、基底細(xì)胞癌等皮膚癌中的有CAF參與的癌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，有CAF參與的癌不包括肝癌和胰腺癌。另外，在另一實(shí)施方式中，有CAF參與的癌的處置不包括肝癌和胰腺癌的預(yù)防。
本發(fā)明的抗癌組合物的一個(gè)實(shí)施方式為通過含有上述耙向劑或載體和控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物，并將它們直接遞送到癌細(xì)胞，從而發(fā)
19揮抗癌作用。本發(fā)明的抗癌組合物的另一實(shí)施方式為通過含有上述耙向
劑或載體和控制CAF的活性或增殖的藥物，并將它們遞送到CAF，控制CAF的活性或增殖，從而間接地發(fā)揮抗癌作用。本發(fā)明的抗癌組合物的再
一實(shí)施方式為通過含有上述靶向劑或載體，以及控制癌細(xì)胞的活性或增
殖的藥物和控制CAF的活性或增殖的藥物中的任一個(gè)或二者，使控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物針對(duì)癌細(xì)胞、控制CAF的活性或增殖的藥物針對(duì)CAF地分別發(fā)揮作用，從而發(fā)揮雙重抗癌作用。在該實(shí)施方式中，控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物與控制CAF的活性或增殖的藥物可以是相同的藥物，也可以是分別不同的物質(zhì)。
在本發(fā)明的組合物中，靶向劑只要以發(fā)揮靶向功能的狀態(tài)存在，則載體可以在其內(nèi)部含有遞送物，也可以附著存在于遞送物的外部，或者也可以與遞送物混合。因此，根據(jù)給藥途徑和藥物釋放模式等，可以將上述組合物用適當(dāng)?shù)牟牧侠缒c溶性包衣劑或定時(shí)崩解性材料包覆，也可以組合到適當(dāng)?shù)乃幬镝尫畔到y(tǒng)中。
本發(fā)明的組合物可以通過包括經(jīng)口和非經(jīng)口這二者的各種途徑，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、直腸、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肺內(nèi)和子宮內(nèi)等途徑給藥，這并非是進(jìn)行限定，也可以制成適于各給藥途徑的劑型。所述劑型和制劑方法可以適當(dāng)采用任意公知的劑型和制劑方法(例如參照標(biāo)準(zhǔn)薬剤學(xué)、渡辺喜照b編、南江堂、2003年等)。
例如，作為適于經(jīng)口給藥的劑型，可列舉出散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、液體制劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、糖漿劑等，這并非是進(jìn)行限定，另外，作為適于非經(jīng)口給藥的劑型，可列舉出溶液性注射劑、懸浮性注射齊廿、乳液性注射劑、用時(shí)制備型注射劑等注射劑。非經(jīng)口給藥用制劑可以為水性或非水性的等滲性無(wú)菌溶液或懸浮液的形態(tài)。
本發(fā)明的靶向劑、載體或組合物可以以任何形態(tài)供給，但從保存穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為能夠用時(shí)制備的形態(tài)，例如以在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)或其附近，能夠由醫(yī)生和/或藥劑師、護(hù)士或者其他輔助醫(yī)務(wù)人員等制備的形態(tài)提供。在此情況下，本發(fā)明的靶向劑、載體或組合物以包括這些必需的構(gòu)成要素中的至少1個(gè)的1個(gè)或2個(gè)以上的容器的形式提供，在使用前，例如使用
20前24小時(shí)以內(nèi)、優(yōu)選為使用前3小時(shí)以內(nèi)，更優(yōu)選在即將使用前制備。制備時(shí)，在進(jìn)行制備的場(chǎng)所，可以適當(dāng)使用通常能夠獲得的試劑、溶劑、調(diào)劑器具等。
因此，本發(fā)明還涉及載體或者組合物的制備試劑盒，其包括1個(gè)或2個(gè)以上的容器，所述容器單獨(dú)或組合地含有耙向劑、和/或遞送物、和/或除靶向劑以外的載體構(gòu)成物質(zhì)；以及以這種試劑盒的形式提供的載體或組合物的必要構(gòu)成要素。本發(fā)明的試劑盒，除上述以外，還可以包括有關(guān)本發(fā)明的耙向劑、載體和組合物的制備方法和給藥方法等的說明書或CD、 DVD等電子記錄介質(zhì)等。另外，本發(fā)明的試劑盒可以包括用于完成本發(fā)明的耙向劑、載體或組合物的全部構(gòu)成要素，也可以不一定包括全部的構(gòu)成要素。因此，本發(fā)明的試劑盒可以不包括在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)、實(shí)驗(yàn)設(shè)施等通常能夠獲得的試劑或溶劑，例如無(wú)菌水、生理鹽水或葡萄糖溶液等。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于控制癌細(xì)胞的活性或增殖或用于處置癌的方法，和用于控制CAF的活性或增殖或用于處置有CAF參與的癌的方法，其包括將有效量的上述組合物對(duì)需要該組合物的對(duì)象進(jìn)行給藥。這里有效量，例如對(duì)于用于處置癌的方法，是指減少癌的發(fā)病、減輕癥狀或者延遲或停止癥狀發(fā)展的量，優(yōu)選是能夠預(yù)防癌的發(fā)病或治愈癌的量。另外，優(yōu)選為不會(huì)產(chǎn)生超過給藥所帶來的好處的不良影響的量。所述量可以通過使用了培養(yǎng)細(xì)胞等的體外(in vitro)試驗(yàn)或通過小鼠、大鼠、狗或豬等模型動(dòng)物中的試驗(yàn)來適當(dāng)確定，這樣的試驗(yàn)方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。另外，載體中所含的靶向劑、和本發(fā)明的方法中使用的藥物的用量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，或者可以通過上述試驗(yàn)等來適當(dāng)確定。
本發(fā)明的癌處置方法的一個(gè)實(shí)施方式為通過將含有上述耙向劑或載體、和控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物的抗癌組合物進(jìn)行給藥，將藥物直接遞送到癌細(xì)胞，從而對(duì)癌進(jìn)行處置。本發(fā)明的癌處置方法的另一實(shí)施方式為通過將含有上述靶向劑或載體、和控制CAF的活性或增殖的藥物的抗癌組合物進(jìn)行給藥，將藥物遞送到CAF以控制其活性或增殖，從而間接地對(duì)癌進(jìn)行處置。本發(fā)明的癌處置方法的再一實(shí)施方式為將含有上述靶向劑或載體、以及控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物和控制CAF的活性或增殖的藥物中的任一個(gè)或二者的抗癌組合物進(jìn)行給藥，將控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物遞送到癌細(xì)胞、將控制CAF的活性或增殖的藥物遞送到CAF，從而從2個(gè)途徑對(duì)癌進(jìn)行處置。在該實(shí)施方式中，控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物和控制CAF的活性或增殖的藥物可以是相同的藥物，也可以是分別不同的物質(zhì)。
在本發(fā)明的方法中，進(jìn)行給藥的組合物的具體用量可以考慮與需要處置的對(duì)象相關(guān)的各種條件，例如癥狀的嚴(yán)重程度、對(duì)象的一般健康狀態(tài)、年齡、體重、對(duì)象的性別、飲食、給藥的時(shí)期和頻率、并用藥物、對(duì)治療的反應(yīng)性以及對(duì)治療的依從性等來確定。
作為給藥途徑，包括經(jīng)口和非經(jīng)口這二者的各種途徑，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、局部、直腸、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肺內(nèi)和子宮內(nèi)等途徑。
給藥頻率根據(jù)所用組合物的性狀和上述那些對(duì)象的條件的不同而不同，例如可以1日多次(即1日2、 3、 4次或5次以上)、1日1次、每幾日(即每2、 3、 4、 5、 6、 7日等)、1周幾次(例如1周2、 3、 4次等)、每周、每幾周(即每2、 3、 4周等)。
在本發(fā)明的方法中，詞語(yǔ)"對(duì)象"是指任意的生物個(gè)體，優(yōu)選為動(dòng)物、更優(yōu)選為哺乳動(dòng)物、進(jìn)一步優(yōu)選為人的個(gè)體。在本發(fā)明中，對(duì)象可以是健康的，也可以患有某種疾病，但在希望處置癌的情況下，典型地是指患有癌或具有患癌危險(xiǎn)的對(duì)象。
另外，詞語(yǔ)"處置"定義為包括以疾病的治愈、暫時(shí)緩解或預(yù)防等為目的的醫(yī)學(xué)上能夠容許的所有種類的預(yù)防性和/或治療性干預(yù)。例如，詞語(yǔ)"處置"的含義包括癌發(fā)展的延緩或停止、病變的萎縮或消失、癌發(fā)病的預(yù)防或復(fù)發(fā)的防止等各種目的的醫(yī)學(xué)上能夠容許的干預(yù)。
本發(fā)明還涉及利用了上述載體的向癌細(xì)胞和/或CAF遞送藥物的方法。該方法非限定地包括例如使遞送物載持到上述載體上的工序、和將載持有遞送物的載體給藥或添加到含有癌細(xì)胞和/或CAF的生物或介質(zhì)例如培養(yǎng)培養(yǎng)基等的工序。這些工序可以按照公知的任意方法或本說明書中記載的方法等來適當(dāng)?shù)剡_(dá)成。上述遞送方法也可以組合其他遞送方法，例如與以癌細(xì)胞和/或CAF存在的臟器為靶的其他遞送方法等組合。另外，上述方法也包括在體外進(jìn)行的方式、以體內(nèi)的癌細(xì)胞和/或CAF為耙的方式。使用以下的實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施例。
<實(shí)施例1〉CAF的分離
將從大腸癌患者中取出的癌組織或周圍正常組織(從距癌組織2cm以上的部位分離的正常組織)細(xì)切為lxlxlmm后，用PBS離心洗滌2次，將組織粒用培養(yǎng)液(I型膠原酵(225U/ ml)、透明質(zhì)酸酶(125U/ml)、 10%FBS (胎牛血清)、含有鏈霉素和青霉素的DMEM (Dulbecco's ModifiedEagle Medium))培養(yǎng)24小時(shí)。其后，吸引除去上清，將培養(yǎng)液換為10%FBS/DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞用針對(duì)CAF的標(biāo)記物a-SMA和間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物波形蛋白的FITC標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫染色，結(jié)果僅在癌組織來源的細(xì)胞中檢出a-SMA，并確認(rèn)該細(xì)胞為CAF (參照?qǐng)D1)。其中，波形蛋白在任一組織來源的細(xì)胞中均為陽(yáng)性、上皮細(xì)胞的標(biāo)記物結(jié)蛋白為陰性。
<實(shí)施例2>CAF的腫瘤增殖活性
將實(shí)施例1中得到的CAF或正常成纖維細(xì)胞以^105個(gè)/孔的密度分別接種到6孔平板中，用10XFBS/DMEM培養(yǎng)，第3天在匯合狀態(tài)下將培養(yǎng)液換為0.5%FBS/DMEM，將大腸癌細(xì)胞系M7609細(xì)胞(2xl()5個(gè))接種到培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)7天。在第0、 3和5天用Coulter計(jì)數(shù)器(Beckman公司)測(cè)算M7609細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖2所示。由此可知，CAF促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖。
<實(shí)施例3〉siRNA的制作
從北海道System Science購(gòu)得以與人HSP47同源的大鼠gp46(GenBankAccession No. M69246)為耙的3種siRNA和對(duì)照隨機(jī)siRNA。各siRNA由在3'側(cè)具有突出端的27個(gè)堿基構(gòu)成，其序列如下。
序列A: 5，-GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG-3，(正義，序
列編號(hào)1)
5，-GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU-3，(反義，序列編號(hào)
2)
23序列B: 5，-CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGCAG-3，(正義，序 列編號(hào)3)
5，-GCUAGAUUGGAUAUAAAACUUGUGGAU-3，(反義，序列編號(hào)
4)
序列C: 5，-CUAGAGCCAUUACAUUACAUUGACAAG-3，(正義，序 列編號(hào)5)
5，-UGUCAAUGUAAUGUAAUGGCUCUAGAU-3，(反義，序列編號(hào)
6)
隨機(jī)siRNA: 5，畫CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG畫3，(正義，
序列編號(hào)7)
5，-GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU-3，(反義，序列編號(hào)
8)
另外，還制作用熒光色素6'-羧基熒光素(6-FAM)在5'側(cè)標(biāo)記的siRNA。 <實(shí)施例4>含siRNA的VA結(jié)合脂質(zhì)體的制作
作為脂質(zhì)體，使用以4: 3: 3的摩爾比含有DC-6-14、膽固醇和DOPE 的陽(yáng)離子性脂質(zhì)體(Lipotrust，北海道System Science)。用1.5ml試管將 lOnmol的脂質(zhì)體與20nrno1的全反式視黃醇(以下記作"VA")在DMSO 中混合后，用氯仿溶解， 一次蒸發(fā)后懸浮到PBS中。其后，將實(shí)施例3中 得到的siRNA (10|ag/ml)與脂質(zhì)體懸浮液以h 1 (w/w)的比例混合。 用micro-partition system (Sartorion VIVASPIN 5000MWCO PES)將得到 的脂質(zhì)體懸浮液中所含的游離的VA和siRNA除去，得到含siRNA的VA 結(jié)合脂質(zhì)體(VA-lip-siRNA)。用HPLC法測(cè)定添加的VA量和精制脂質(zhì)體 內(nèi)所含的VA量，對(duì)結(jié)合于脂質(zhì)體的VA的比例進(jìn)行研究，結(jié)果可知VA的 大部分(95.6±0.42% )與脂質(zhì)體結(jié)合。另夕卜，用RiboGreen assay (Molecular Probes)測(cè)定siRNA的攝入到脂質(zhì)體中的效率，結(jié)果較高，為94.4±3.0%。 另外，VA的一部露出到脂質(zhì)體表面。
與上述同樣地也制作含siRNA的脂質(zhì)體(lip-siRNA)和VA結(jié)合脂質(zhì) 體(VA-lip)。<實(shí)施例5>VA-lip-siRNA的攝入
將CAF或正常成纖維細(xì)胞分別以5x 105個(gè)/孔的密度接種到6孔平板上， 用10XFBS/DMEM培養(yǎng)后，2天后在亞匯合(subconfluent)狀態(tài)下用無(wú)血 清培養(yǎng)基洗滌1次，將培養(yǎng)基替換為血清添加OPTI-MEM。接著，將含有 實(shí)施例4中得到的siRNA (終濃度為50pmol/ml)的脂質(zhì)體懸浮液加入到培 養(yǎng)基中，在37'C下使其反應(yīng)24小時(shí)。其中，在添加VA結(jié)合脂質(zhì)體的情況 下，VA的終濃度為40nmol/ml。另外，siRNA使用用6-FAM標(biāo)記的隨機(jī) siRNA。在反應(yīng)開始后第O、 0.5、 1、 3、 6、 12、 18和24小時(shí)，用流式細(xì) 胞法評(píng)價(jià)siRNA在各細(xì)胞種類中的攝入(圖3)。在反應(yīng)結(jié)束后，將細(xì)胞用 DAPI (分子探針)和Cy3標(biāo)記抗a-SMA抗體染色，分析siRNA的局部存 在情況(圖4 5)。
從圖3清楚可知，在使用含有VA的載體的情況下，siRNA向CAF的 導(dǎo)入速度為向正常成纖維細(xì)胞的導(dǎo)入速度的3倍以上，即使在經(jīng)過24小時(shí) 后向CAF的攝入也基本維持在100%,特異性和導(dǎo)入效率極高。另外，圖 4表示在評(píng)價(jià)siRNA的局部存在情況時(shí)所使用的代表性視野，由該視野可 見，在使用了 VA結(jié)合脂質(zhì)體(VA-lip-siRNA-FAM)的情況下，視野中的 全部CAF導(dǎo)入有siRNA，與此相對(duì)，在不含VA的脂質(zhì)體(lip-siRNA-FAM) 的情況下，視野中的5個(gè)CAF中，僅僅1個(gè)導(dǎo)入有siRNA。此外，圖5顯 示，在不含VA的脂質(zhì)體(lip-siRNA-FAM)中，siRNA幾乎不局部存在于 CAF的細(xì)胞內(nèi)，與此相對(duì)，在VA結(jié)合脂質(zhì)體(VA-lip-siRNA-FAM)中， 幾乎所有的siRNA局部存在于細(xì)胞內(nèi)，即siRNA向CAF內(nèi)的高效率的導(dǎo) 入是VA依賴性的。從以上結(jié)果可知，含有VA的載體能夠特異性且顯著地 促進(jìn)針對(duì)CAF的物質(zhì)的攝入。
<實(shí)施例6> VA-lip-DNR的攝入
使用含有柔紅霉素(DNR)的VA結(jié)合脂質(zhì)體代替siRNA來研究針對(duì) CAF的攝入。
將DNR封入脂質(zhì)體(lip-DNR， DaunoXome ,以下也稱為脂化DNR) 和VA按照脂質(zhì)體VA=1: 2的摩爾比在DMSO中混合后，在氯仿中溶解， 一次蒸發(fā)后，懸浮到PBS中。將得到的脂質(zhì)體懸浮液中所含的游離VA用
25micro-partition system (Sartorion VIVASPIN 5000MWCO PES)除去，得到 含有DNR的VA結(jié)合脂質(zhì)體(VA-lip-DNR，以下也稱為VA結(jié)合脂化DNR)。 用HPLC法測(cè)定添加的VA量和精制脂質(zhì)體內(nèi)所含的VA量，研究結(jié)合于脂 質(zhì)體的VA的比例，結(jié)果VA中的大部分(98%)結(jié)合于脂質(zhì)體。另夕卜，VA 的一部分露出到脂質(zhì)體表面。其中，由于DaunoXome⑧為將檸檬酸柔紅霉 素封入由二硬酯酰磷脂酰膽堿(DSPC)和膽固醇(Choi)構(gòu)成的脂質(zhì)體中
而得到的，因此DSPC: Choi:檸檬酸柔紅霉素的摩爾比為10: 5: 1。
將實(shí)施例1中得到的CAF、正常成纖維細(xì)胞或市售的成纖維細(xì)胞(皮 膚成纖維細(xì)胞，Cells System公司，制品編號(hào)CS-2FO-101)分別以2xl04 個(gè)/腔室的密度接種于腔室載玻片上，用10。/^FBS/DMEM培養(yǎng)一個(gè)晚上后， 在亞匯合狀態(tài)下用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌1次，將培養(yǎng)基替換為血清添加 OPTI-MEM。接著，將含有以DaunoXome⑧濃度計(jì)為5pg/ml的lip-DNR或 上述得到的VA-lip-DNR的脂質(zhì)體懸浮液加入到培養(yǎng)基中，使其在37'C下 反應(yīng)。另外，核用DAPI染色。在反應(yīng)開始前(0分鐘)、反應(yīng)開始5分鐘 后、15分鐘后和30分鐘后在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)出紅色的DNR的局部 存在情況。結(jié)果示于圖6 9。
在添加有VA-lip-DNR的CAF中，在添加后15分鐘的時(shí)間點(diǎn)，已經(jīng)可 見細(xì)胞內(nèi)的DNR的紅色，在lip-DNR添加組中未見細(xì)胞內(nèi)的DNR的局部 存在情況(圖6和9)。另外，在正常成纖維細(xì)胞(圖7)和皮膚成纖維細(xì) 胞(圖8)中，VA-lip-DNR添加組、lip-DNR添加組均未見DNR的局部存 在情況。以上的結(jié)果顯示VA結(jié)合載體具有CAF特異性的藥物遞送功能。
〈實(shí)施例7〉VA衍生物視黃酸(RA)的針對(duì)癌細(xì)胞和CAF的耙向 (1)培養(yǎng)細(xì)胞
CAF細(xì)胞為從人癌患者的臨床樣品中克隆而建立的。人纖維肉瘤細(xì)胞 HT-1080 (纖維肉瘤)和人肝癌來源的細(xì)胞HepG2細(xì)胞為從American Type Culture Collection購(gòu)得的。任一細(xì)胞均采用加有10%胎牛血清(FBS)的 DMEM培養(yǎng)基(Sigma Aldrich)進(jìn)行了培養(yǎng)。將其用胰蛋白酶處理后，接 種到4-孔培養(yǎng)玻片(BD Falcon #354114)中使其為2xl()5細(xì)胞/ml，在37。C、 5 %C02條件下培養(yǎng)一個(gè)晚上。(2) VA添加脂質(zhì)體制劑的制備
作用模型藥物，使用將柔紅霉素封入脂質(zhì)體而得到的制劑 DaunoXome (Gilead Sciences, Inc.)。 DaunoXome㊣中以2mg/ml的濃度含 有藥物柔紅霉素。將添加有10%FBS的DMEM 990pl加入DaunoXome 10^1 中，制備20iig/ml的溶液。向其中加入7.14^1溶解在二甲基亞砜(DMSO) 中并為100mM的全反式視黃醇(VA)或全反式視黃酸(Retinoicacid,RA) 并混合，分別得到VA添加脂質(zhì)體制劑(VA+)和RA添加脂質(zhì)體制劑(視 黃酸+ )。其中，VA或RA中的至少一部分露出到脂質(zhì)體表面。除了這些 脂質(zhì)體制劑以外，作為對(duì)照組，還制備不含VA和RA的DaunoXome(g)溶液 即制劑(VA-)。
(3) VA或RA脂質(zhì)體制劑的給藥 利用培養(yǎng)玻片除去培養(yǎng)基，重新加入750|il新鮮的添加有10%FBS的
DMEM。除了無(wú)處理培養(yǎng)玻片以外，向其中分別加入250|il的不含VA和 RA的DaunoXome⑧溶液即制劑(VA-)、 VA添加脂質(zhì)體制劑(VA+)或 RA添加脂質(zhì)體制劑(視黃酸+)，在37E、 5XC02條件下孵育15分鐘。 從各自的培養(yǎng)玻片中除去培養(yǎng)基，用lml的PBS洗滌2次后，加入lml的 4%多聚甲醛溶液(和光純藥)，在室溫下固定細(xì)胞5分鐘。然后去除固定 液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。然后從各自的培養(yǎng)玻片中取出載玻片，滴入 Prolong Gold (Invitrogen)后蓋上蓋玻片進(jìn)行封入。
(4) 顯微鏡觀察
用熒光顯微鏡(KEYENCE BZ8000)觀察上述載玻片?？芍峒t霉素 被細(xì)胞核攝入，在綠色激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光(圖10左上)。另外，封入 時(shí)使用的Prolong Gold含有熒光色素DAPI。 DAPI也結(jié)合于細(xì)胞核，在UV 激發(fā)光下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光(圖10右上)。因此，在顯微鏡觀察中，若發(fā)生脂 質(zhì)體制劑的攝入則可觀察到紅色和藍(lán)色兩種熒光，其結(jié)果兩圖像重合呈現(xiàn) 紫色(圖10下)。另一方面，在脂質(zhì)體制劑未被攝入細(xì)胞內(nèi)的情況下，僅 可檢出DAPI來源的藍(lán)色熒光。
用相位差顯微鏡和上述熒光顯微鏡觀察上述載玻片。將利用相位差顯 微鏡在亮視野下對(duì)上述載玻片進(jìn)行拍照獲得的圖像、利用所述熒光顯微鏡 在綠色激發(fā)光下對(duì)上述載玻片進(jìn)行拍照獲得的圖像、和在UV激發(fā)光下對(duì)上述載玻片進(jìn)行拍照獲得的圖像進(jìn)行電子信息融合(merge)。融合的圖像 示于圖11 13,觀察結(jié)果示于表1 3。其中，在表中，十表示可觀察到熒 光，-表示未觀察到熒光。
表1 CAF中的脂質(zhì)體制劑的攝入(圖11)
DAPI (藍(lán)色熒光)柔紅霉素 (紅色熒光)
無(wú)處理+—
DaunoXome (VA_)+—
DaunoXome⑧+視黃醇(VA+)++
DaunoXome +視黃酸(視黃酸+)++
表2 HT-1080中的脂質(zhì)體制劑的攝入(圖12)
DAPI (藍(lán)色熒光)柔紅霉素 (紅色熒光)
無(wú)處理+—
DaunoXome (VA-)+-
DaunoXome +視黃醇(VA+)++
DaunoXome +視黃酸(視黃酸+)++
表3 HepG2中的脂質(zhì)體制劑的攝入(圖13)
DAPI (藍(lán)色熒光)柔紅霉素 (紅色熒光)
無(wú)處理+—
DaunoXome (VA-)+—
DaunoXome +視黃醇(VA+)++
DaunoXome +視黃酸(視黃酸+)++
從結(jié)果根據(jù)DAPI的藍(lán)色熒光，可清楚地確認(rèn)在任一載玻片中均有細(xì)胞 核的存在。根據(jù)柔紅霉素的紅色熒光的存在，在使用了 VA或RA的載玻片 中，盡管15分鐘這樣短的孵育，柔紅霉素局部存在于細(xì)胞核中。與此相對(duì)， 在未使用VA和RA的載玻片中，柔紅霉素未局部存在于細(xì)胞核中。該現(xiàn)象 顯示類視黃醇可以作為針對(duì)CAF或癌細(xì)胞的靶向劑使用。
<實(shí)施例8〉VA結(jié)合脂質(zhì)體封入藥劑所引起的CAF特異性的增殖抑制 對(duì)含有針對(duì)gp46的siRNA或DNR的VA結(jié)合脂質(zhì)體的CAF增殖抑制 活性進(jìn)行研究。(1) VA-lip-siRNA所引起的增殖抑制
作為siRNA，使用實(shí)施例3中記載的序列A的siRNA。在24孔盤中分 別接種lxl0"個(gè)CAF或正常成纖維細(xì)胞，用10。XFBS/DMEM培養(yǎng)24小時(shí) 后，以終濃度為50pmol/ml添加VA-lip-siRNA，孵育1小時(shí)后，洗滌細(xì)胞。 用10XFBS/DMEM培養(yǎng)48小時(shí)后，用WST-1法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。其中，作 為對(duì)照，使用含有l(wèi)ip-siRNA和隨機(jī)siRNA的VA結(jié)合或非結(jié)合脂質(zhì)體 (VA-lip-siRNA (ran)或lip-siRNA (ran))，用U檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異的 評(píng)價(jià)。結(jié)果示于圖14。根據(jù)該圖可知，在添加有VA-lip-siRNA的CAF中， 活細(xì)胞數(shù)顯著地減少到低于處置前的50%，另一方面，在其他處理組中， 活細(xì)胞數(shù)幾乎未見變化。
(2) VA-lip-DNR所引起的增殖抑制
在96孔盤中分別接種2><103個(gè)CAF或正常成纖維細(xì)胞，用10% FBS/DMEM培養(yǎng)24小時(shí)后，添加以DaunoXome⑧的終濃度計(jì)為5昭/ml的 實(shí)施例6中得到的VA-lip-DNR或lip-DNR，暴露15分鐘后，洗滌細(xì)胞。 用10XFBS/DMEM培養(yǎng)24小時(shí)后，用WST-1法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。用U檢驗(yàn) 進(jìn)行顯著性差異的評(píng)價(jià)。結(jié)果示于圖15。根據(jù)該圖可知，在添加有 VA-lip-DNR的CAF中，活細(xì)胞數(shù)顯著地減少到處置前的約40%，另一方 面，在添加有l(wèi)ip-DNR的CAF或正常成纖維細(xì)胞中，活細(xì)胞數(shù)幾乎未見變 化。
以上結(jié)果顯示載持在VA結(jié)合載體上的藥劑能夠發(fā)揮CAF特異性的增 殖抑制活性作用。
<實(shí)施例9>VA-lip-DNR的癌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入效率的研究 將人纖維肉瘤來源的細(xì)胞株HT-1080、 HS913T或者Sw684、人乳腺癌 來源的細(xì)胞株MCF7、人骨肉瘤來源的細(xì)胞株Saos2 (均從ATCC購(gòu)得)或 人肝癌來源的細(xì)胞株Huh7 (從JCRB細(xì)胞Bank購(gòu)得)以1"04個(gè)/孔的細(xì) 胞密度撒于腔室載玻片(Falcon公司)，培養(yǎng)一個(gè)晚上后，用含有10%FBS 的DMEM洗滌。接著，添加lip-DNR (DaunoXome ) 5嗎/ml (以柔紅霉 素計(jì)為8.85pM、以脂質(zhì)體計(jì)為89.25mM)或?qū)嵤├?中得到的va-lip-DNR 5pg/ml (含有視黃醇178.5pM)，從添加開始15分鐘后和/或30分鐘后洗滌
29細(xì)胞，用4%甲醛固定。用PBS洗滌后，用Prolong Gold (Invitrogen公司) 封入，在熒光顯微鏡下觀察DNR的局部存在情況。
從圖16 18所示的結(jié)果可知，在任一細(xì)胞中，在VA-lip-DNR添加組 中，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色的DNR在剛添加15分鐘后即局部存在于大 部分細(xì)胞的內(nèi)部，與此相對(duì)，lip-DNR即使經(jīng)過30分鐘也幾乎不被攝入。 該現(xiàn)象顯示利用VA的結(jié)合顯著地促進(jìn)了向脂化DNR的細(xì)胞的攝入。另外， 從圖19所示的結(jié)果可知，上述促進(jìn)效果在包括肉瘤和癌的各種癌細(xì)胞中可 見。
<實(shí)施例10〉VA結(jié)合脂化柔紅霉素的抗腫瘤效果的研究 將人纖維肉瘤來源的細(xì)胞株HT-1080、 HS913T或Sw684以2xl(^個(gè)/ 孔的細(xì)胞密度撒于96孔平板，培養(yǎng)一個(gè)晚上后，添加實(shí)施例6中使用的 lip-DNR 5jig/ml或VA-lip-DNR 5pig/ml，培養(yǎng)15分鐘。其后，洗滌細(xì)胞， 除去細(xì)胞外的藥劑，然后用添加有10XFBS的DMEM培養(yǎng)22小時(shí)。在添 加WST-1 Cell Proliferation Assay Kit (Cayman Chemical公司)2小時(shí)后， 測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)于未處理時(shí)的細(xì)胞數(shù)的比例。從圖20所示的結(jié)果可 知，通過VA的結(jié)合，脂化DNR的抗腫瘤活性顯著地增大。
<實(shí)施例11〉體內(nèi)的CAF特異性遞送
將胃癌細(xì)胞株KATO-III 2xl(^個(gè)皮下接種于NOD-scid小鼠(6周齡， 雌性，n=8，從Sankyo Labo Service購(gòu)得)，得到患癌小鼠。在接種后第 28天，將實(shí)施例5中使用的VA結(jié)合脂質(zhì)體(VA-lip-siRNA-FAM)或不含 VA的脂質(zhì)體(lip-siRNA-FAM)以VA 200nmol、 lip lOOnmol、 siRNA 100嗎的用量尾靜脈給藥。其中，該VA結(jié)合脂質(zhì)體在給藥時(shí)VA的一部分 已經(jīng)露出到脂質(zhì)體表面。從給藥開始24小時(shí)后取腫瘤組織制作組織標(biāo)本， 將其用DAPI (分子探針)和Cy3標(biāo)記抗a-SMA抗體染色，分析siRNA的 局部存在情況。結(jié)果示于圖21和22。
從圖21可知，在不含VA的脂質(zhì)體中，無(wú)論組織中以Cy3的紅色顯示 的示的CAF是否存在，幾乎未見以FAM的綠色顯示的siRNA，與此相對(duì)， 在VA結(jié)合脂質(zhì)體中，可見CAF與siRNA共同局部存在。<實(shí)施例12>體內(nèi)的VA-lip-DNR的抗腫瘤活性
將大腸癌細(xì)胞系M7609細(xì)胞2xl(^個(gè)皮下接種于裸鼠(6周齡、雌性、 n二10、從Sankyo Labo Service購(gòu)得)，得到患癌小鼠。從接種后第14天 起，將VA-lip-DNR或lip-DNR以DaunoXome⑧的通常抗癌給藥量的1/40 的用量(每lg小鼠體重用0.05昭)1周2次地尾靜脈給藥。其中，該 VA-lip-DNR在給藥時(shí)VA的一部分已經(jīng)露出到脂質(zhì)體表面。圖23表示給藥 開始后的腫瘤體積的變化情況。從該圖可知，載持于VA結(jié)合載體的藥劑顯 著地抑制腫瘤的增殖。
以上結(jié)果顯示本發(fā)明的組合物在癌的處置中是極其有效的。
權(quán)利要求
1、一種針對(duì)細(xì)胞的靶向劑，其含有類視黃醇，所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向劑，其中，類視黃醇包括視黃醇。
3、 一種細(xì)胞用的物質(zhì)遞送載體，其含有權(quán)利要求1或2所述的靶向劑，所述細(xì)胞選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其中，靶向劑的含量為載體整體的0.2 20重量％。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的載體，其中，靶向劑與載體的除靶向劑以外的構(gòu)成成分之間的摩爾比為8: 1 1: 4。
6、 一種抗癌組合物，其含有權(quán)利要求1或2所述的靶向劑或權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的載體，和控制癌細(xì)胞和/或癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活性或增殖的藥物。
7、 一種抗癌相關(guān)成纖維細(xì)胞組合物，其含有權(quán)利要求1或2所述的靶向劑或權(quán)利要求3 5任一項(xiàng)所述的載體，和控制癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活性或增殖的藥物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，控制癌細(xì)胞的活性或增殖的藥物為抗癌劑。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6 8任一項(xiàng)所述的組合物，其中，控制癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的活性或增殖的藥物選自選自TGFJ3、 HGF、 PDGF、 VEGF、 IGF、MMP、 FGF、 uPA、組織蛋白酶和SDF-1中的生理活性物質(zhì)的活性或產(chǎn)生抑制劑，細(xì)胞活性抑制劑，增殖抑制劑，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，以及以由癌相關(guān)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子或者參與該細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或者分泌的分子中的1種或1種以上為靶的siRNA、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸和表達(dá)它們的載體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述參與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成分子的產(chǎn)生或者分泌的分子為HSP47。
11、 根據(jù)權(quán)利要求6 10任一項(xiàng)所述的組合物，其是將藥物和耙向劑或載體在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)或其附近混合而成的。
12、 權(quán)利要求6 11任一項(xiàng)所述的組合物的制備試劑盒，其包括1個(gè)或1個(gè)以上的容器，所述容器單獨(dú)或組合地包含藥物、靶向劑、以及根據(jù)需要使用的除靶向劑以外的載體構(gòu)成物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供一種新型的癌治療劑和癌治療方法。上述課題是通過以下技術(shù)方案解決的含有類視黃醇、且針對(duì)選自癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞的靶向劑，含有該靶向劑的所述細(xì)胞用的物質(zhì)遞送載體，利用了該靶向劑或載體的抗癌組合物和抗癌相關(guān)成纖維細(xì)胞組合物以及癌處置方法。
文檔編號(hào)A61K9/51GK101674810SQ20088001091
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者新津洋司郎, 瀧本理修 申請(qǐng)人:日東電工株式會(huì)社