專利名稱：抑制清道夫受體-a和增強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫療法的普通領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明提供增強(qiáng)對抗原的 免疫應(yīng)答的方法。
相關(guān)領(lǐng)域
A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)主要由巨噬細(xì)胞(M(fO表達(dá)，它們是抗微生 物的第一防線(l)。 SR-A是結(jié)構(gòu)各異的膜受體的大家族的原型成員，統(tǒng)稱為清 道夫受體(2，3)。該組受體識別許多配體，包括化學(xué)修飾或改變的分子，內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER)駐留陪伴分子，以及與血管疾病的發(fā)生有關(guān)的改性脂蛋白(3-5)。 SR-A最 初鑒定為乙?；兔芏戎鞍?acLDL)的清除受體(3，6)，因其與動脈粥樣硬化 有關(guān)，對其的研究主要涉及該疾病。然而，現(xiàn)在還證明革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多 糖(LPS)和革蘭氏陽性細(xì)菌的脂磷壁酸競爭結(jié)合其它已知的SR-A配體，表明 SR-A起到模式識別受體的作用(2)。在這點(diǎn)上，Suzuki等首先報(bào)道Si -^r,一小 鼠對單核細(xì)胞增生利斯特菌(1/WeWa mo"oc^ogene"和單純皰疹病毒感染的 保護(hù)作用受損(7)。其他人進(jìn)行的獨(dú)立研究也表明SR-A的表達(dá)可能對于針 對細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)至關(guān)重要(8-10)。然而。雖然有關(guān)于SR-A在 動脈粥樣硬化和病原體識別中的信息可用，但其在獲得性免疫中的作用知 之甚少，因此，需要開發(fā)能調(diào)節(jié)SR-A的技術(shù)以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
發(fā)明概述本發(fā)明提供增強(qiáng)個(gè)體對所需抗原的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括給予該個(gè)
體所需抗原和能抑制A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)的藥物。將該藥物和抗原
給予該個(gè)體后，該個(gè)體對該抗原的免疫應(yīng)答得到增強(qiáng)。
另一實(shí)施方式提供增強(qiáng)個(gè)體對腫瘤的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括給予該
個(gè)體能抑制A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)的藥物，其用量足以增強(qiáng)對腫瘤的 免疫應(yīng)答，其中給予該藥物后該腫瘤的生長受到抑制。該方法還可包括給予該 個(gè)體該腫瘤表達(dá)的抗原。
所述藥物可以是能特異性抑制SR-A的任何組合物。這種藥物的例子包括 但不限于干擾SR-AmRNA轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的多核苷酸。所述藥物還可以是結(jié)合 并拮抗SR-A的抗體。所述藥物還可以是能用作SR-A拮抗劑的任何已知的亞 磺酰氨基苯甲酰苯胺(sulfonamidobenzanilide)化合物。
還提供了增強(qiáng)對所需抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括給予個(gè)體包含樹突細(xì)胞 的組合物，其中所述樹突細(xì)胞的特征在于其SR-A受到特異性抑制。該方法還 包括先將所述樹突細(xì)胞與所需抗原在體外接觸再給予該個(gè)體。
本發(fā)明還提供包含基本上純的哺乳動物樹突細(xì)胞群的組合物，其中所述樹 突細(xì)胞的特征在于其SR-A活性受到特異性抑制。
附圖簡述


圖1圖示了用電離射線(IR)處理的D121 Lewis肺腫瘤細(xì)胞免疫接種導(dǎo)致 Si -,A小鼠排斥免疫原性不佳的腫瘤所獲得的數(shù)據(jù)。用137Cs照射D121細(xì)胞 免疫小鼠(11 = 5)， 一周后用活的D121腫瘤細(xì)胞(4"05個(gè)細(xì)胞)攻擊。各曲 線表示各小鼠中的腫瘤生長情況QtK0.05，免疫的Si "—'—與未免疫的Si J—z— 或免疫的野生型(WT)小鼠)。所示的結(jié)果來自進(jìn)行的3次代表性實(shí)驗(yàn)。
圖2圖示的數(shù)據(jù)證明UV-照射的B16黑色素瘤細(xì)胞在SiM〃小鼠中提供 腫瘤保護(hù)作用。用UV-照射的B16細(xì)胞、源自B16細(xì)胞的細(xì)胞裂解液免疫小 鼠(n = 5)，或不處理。 一周后，用活的B16腫瘤細(xì)胞(2"05個(gè)細(xì)胞)攻擊小 鼠，隨后檢測腫瘤生長&<0.05，免疫的SiM^與未免疫的Si -X"或免疫的 WT小鼠)。所示結(jié)果表示進(jìn)行的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖3圖示的數(shù)據(jù)顯示CD8+T細(xì)胞對于S/ -^々'小鼠的保護(hù)性抗腫瘤免疫力至關(guān)重要。免疫接種前通過體內(nèi)注射抗體以耗盡T細(xì)胞的諸亞組。然后用照射 的D121細(xì)胞免疫小鼠(11=10)，隨后用活的D121細(xì)胞進(jìn)行腫瘤攻擊。隔天監(jiān)測 腫瘤發(fā)病率(log秩檢驗(yàn)尸-0.002， CD8+T-細(xì)胞耗盡組與IgG組；？ = 0.002， 角叉聚糖組與IgG組；尸>0.05， CD4+耗盡組與IgG組)。
圖4圖示的數(shù)據(jù)顯示用經(jīng)照射腫瘤細(xì)胞免疫接種在S7M^小鼠中引發(fā)抗 原-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。用經(jīng)照射的B16細(xì)胞免疫一周后， 在20 U/ml IL-2存在下用或不用5嗎/ml CTL表位gpl00關(guān)、TRP2!詣刺 激WT或SiM"-小鼠(11=3)分離的脾細(xì)胞(^106個(gè)細(xì)胞)過夜，或用經(jīng)照射 c丄o 2w肥現(xiàn)iJizi 2W肥^lN眾。術(shù)州tiL丄sru丄"V式驗(yàn)粒柳J IFN陽y嚴(yán)里。顯不/ 二 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。
圖5圖示的數(shù)據(jù)證明WT和Si -J;小鼠的M小有效吞噬凋亡細(xì)胞。用 CFSE標(biāo)記UV處理的U121腫瘤細(xì)胞。用等體積的胎牛血清溫育來猝滅未 結(jié)合的染料。洗滌細(xì)胞，用巰基醋酸鹽(或酯)-引發(fā)的M小以2:l比例共同培 養(yǎng)4小時(shí)。收集附著的M々，用CDllb-PE抗體染色。利用B-D FACScaliber 儀，通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)將Mc()的吞噬作用定量測定為雙陽性染 色細(xì)胞的百分比&> 0.05， SAd;的M小與WT的M小)。所示結(jié)果代表了 3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖6圖示的數(shù)據(jù)證明用經(jīng)照射腫瘤細(xì)胞治療消除了 Si -^;小鼠中己有的 腫瘤細(xì)胞。在第0天，小鼠(『8)已有D121路易斯(Lewis)肺腫瘤細(xì)胞或B16 黑色素瘤細(xì)胞(2xl()S個(gè)細(xì)胞)。在第2、 4、 6和8天給予經(jīng)照射的D121細(xì)胞或 B16細(xì)胞。各曲線表示各小鼠中的腫瘤生長情況(/K 0.05，免疫的S7 -^;與 未免疫的Si -力々-)。所示結(jié)果來自進(jìn)行的3次代表性實(shí)驗(yàn)。
圖7A和7B圖示的數(shù)據(jù)證明SR-A缺陷型DC更有效地刺激抗原特異性腫 瘤免疫力。圖7A:第7天用OVA蛋白質(zhì)(IO fig/ml)脈沖WT或5T -^— C57BL/6 小鼠的骨髓衍生樹突細(xì)胞(BM-DQ6小時(shí)，然后用LPS (10 ng/ml)刺激過夜。 每隔一周，用抗原加載的WT或Si -」々—DC(lxl(^個(gè)細(xì)胞/小鼠)免疫接種WT C57BL/6小鼠(11=6)兩次，然后用lxl()S個(gè)B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行腫 瘤攻擊。圖7B:每隔一周，用OVA蛋白質(zhì)-脈沖的WT或Si -^—BM-DC免 疫WT C57BL/6小鼠兩次。第二次免疫接種1周后，收集脾細(xì)胞并在有IL-2存在下用OVA-特異性MHC I-限制性CTL表位OVA257-264 (1 pg/ml)刺激。 采用ELISPOT試驗(yàn)檢測產(chǎn)生IFN-Y的細(xì)胞的數(shù)量。
圖8A和8B圖示的數(shù)據(jù)證明SR-A沉默的DC高度有效地刺激抗原-特異 性抗腫瘤免疫力。圖8A:用LV-SW-shRNA， LV-擾亂性(Scramble)-shRNA 以MOI為10轉(zhuǎn)染DC1.2細(xì)胞("106個(gè)細(xì)胞/孔)，或不處理。2天后收集 細(xì)胞，并經(jīng)免疫印跡。(3-肌動蛋白用作對照。圖8B:感染2天后收集DC 細(xì)胞，用OVA蛋白質(zhì)(IO嗎/ml)脈沖3小時(shí)。用LPS (10 ng/ml)刺激過夜后， 徹底洗滌細(xì)胞，皮下注射入小鼠。 一周后重復(fù)免疫接種。第二次免疫一周 后用B16-OVA攻擊小鼠。
圖9A和9B圖示的數(shù)據(jù)證明SR-A沉默DC高度有效地引發(fā)抗原-特異性 CTL應(yīng)答。圖9A:用LV-擾亂性(Scramble)-shRNA或LV-57L4-shRNA感染 的DC1.2細(xì)胞免疫C57BL/6小鼠。然后收集脾細(xì)胞，用OVA特異性MHC I-限制性CTL表位OVA257.264刺激。采用ELISPOT試驗(yàn)檢測IFNj產(chǎn)量。
圖9B:在有IL-2存在下用OVA257.264刺激免疫動物的脾細(xì)胞5天，用不同
比例的"Cr-標(biāo)記B16-OVA腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)。采用鉻釋放試驗(yàn)檢測T-效 應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供增強(qiáng)個(gè)體對所需抗原的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括給予該個(gè) 體能特異性抑制A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)的藥物。該藥物的給予量足能 有效增強(qiáng)該個(gè)體對該抗原的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明方法在個(gè)體中引發(fā)的對所 需抗原的免疫應(yīng)答強(qiáng)于未給予該藥物時(shí)。在某些實(shí)施方式中，還可包括將所需 抗原給予該個(gè)體。
"所需抗原"是個(gè)體對其的增強(qiáng)免疫應(yīng)答預(yù)期能提供治療益處的抗原。增 強(qiáng)的免疫應(yīng)答可以是對抗原的增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，對抗原的增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答 或它們的組合。
能特異性抑制SR-A的藥物是通過與SR-A蛋白質(zhì)結(jié)合或與編碼SR-A的 DNA和/或RNA雜交而干擾SR-A表達(dá)和/或功能的那些藥物。結(jié)合SR-A的藥 物通過降低或阻斷配體結(jié)合而特異性抑制SR-A。與編碼SR-A的DNA和/或
7RNA雜交的藥物通過阻礙SR-A mRNA轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，和/或通過導(dǎo)致SR-A mRNA降解而特異性抑制SR-A。
本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)SR-A在對抗原的免疫應(yīng)答中有出乎意料的作用。具體 地說，我們觀察到用經(jīng)照射的腫瘤細(xì)胞免疫接種野生型小鼠(S卩，未經(jīng)實(shí)驗(yàn)改 變SR-A表達(dá)的小鼠)不能引發(fā)對該腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，但在SR-A缺陷型 (SR-A -/-)小鼠中這種免疫接種能對隨后的攻擊提供持久的免疫力。用免疫原 性不佳的腫瘤D121 Lewis肺癌和B16黑色素瘤證明了該作用。此外，給予經(jīng) 照射腫瘤細(xì)胞能減少SR-A缺陷型小鼠中已有的腫瘤，但在其相應(yīng)的野生型小 鼠中不行。重要的是，我們還證明通過特異性抑制野生型小鼠中的SR-A能復(fù) 制在811-八-/-小鼠中觀察到的對抗原的增強(qiáng)免疫應(yīng)答。為證明這點(diǎn)，我們分離 了野生型(SR-A +/+)小鼠的樹突細(xì)胞(DC)，采用RNAi方案抑制DC中的SR-A， 用模型抗原卵白蛋白(OVA)加載所述DC，將所述DC輸回該小鼠，并用表達(dá) OVA的B16黑色素瘤細(xì)胞攻擊該小鼠。采用該技術(shù)，腫瘤攻擊后36天時(shí)在經(jīng) 治療小鼠中未檢測到腫瘤，而陰性對照組中100%的小鼠在攻擊后18天內(nèi)有腫 瘤。我們還證明與陰性對照相比，DC中的SR-A下調(diào)更有效地促進(jìn)抗原-特異 性CTL應(yīng)答。因此，我們發(fā)現(xiàn)特異性抑制抗原呈遞細(xì)胞(例如，樹突細(xì)胞)中的 SR-A能逆轉(zhuǎn)對免疫原性不佳抗原的無反應(yīng)性或弱反應(yīng)性免疫反應(yīng)，我們的數(shù) 據(jù)表明就先天和獲得性免疫而言，小鼠中增強(qiáng)的抗原-特異性CTL反應(yīng)對于 SR-A受體的相互作用至關(guān)重要。因此，據(jù)認(rèn)為本發(fā)明提供的方法能增強(qiáng)對任 何所需抗原的免疫力。
能抑制SR-A的任何藥物可用于本發(fā)明方法中。例如，所述藥物可以是干 擾SR-A mRNA轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的多核苷酸，結(jié)合SR-A并抑制與其配體結(jié)合或 拮抗該受體的抗體，或能特異性抑制SR-A的任何其它化合物。
本領(lǐng)域已知不同物種的SR-A的核苷酸序列和氨基酸序列。例如，生物技 術(shù)信息國家中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫條目NM 031195 (2006年1月28日錄入)提供 了小家鼠(小鼠)SR-A的mRNA和氨基酸序列。NCBI數(shù)據(jù)庫條目BC063878 (2006年8月11日錄入)提供了智人(人)SR-A的mRNA和氨基酸序列。這些 小鼠和人SR-A序列共有46%的核苷酸同源性和70°/。的氨基酸同源性。
本領(lǐng)域已知有三種SR-A同種型。同種型1和2衍生自mRNA剪接，而同種型3據(jù)信是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無功能SR-A。本發(fā)明所用的SR-A抑制劑優(yōu) 選能特異性抑制各同種型。在這點(diǎn)上，本文所述SR-A缺陷型小鼠中不存在所 有三種SR-A同種型，證明本發(fā)明一種實(shí)施方式所用的RNAi方案抑制所有三 種同種型。
當(dāng)所述藥物是多核苷酸時(shí)，所述藥物可以是RNA多核苷酸、DNA多核苷 酸或DNA/RNA雜交體。所述多核苷酸可以是核酶，例如錘頭核酶、反義RNA、 siRNA、 DNA酶、發(fā)夾核酶或是通過包括與SR-A mRNA或DNA雜交的過程 而能抑制SR-A的任何修飾或未修飾多核苷酸。設(shè)計(jì)核酶、反義RNA、 siRNA 和DNA酶的方法是本領(lǐng)域熟知的。應(yīng)該知道任何這樣的藥物至少部分通過與 編碼SR-A的RNA或DNA序列雜交而起作用。因此，本發(fā)明的多核苷酸藥物 應(yīng)具有足夠的長度并與編碼SR-A的RNA或DNA互補(bǔ)，從而能在生理?xiàng)l件下 與該RNA或DNA雜交。通常所述多核苷酸藥物的至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸應(yīng) 與SR-A的編碼DNA或RNA互補(bǔ)或相同。
所述多核苷酸藥物可包含修飾的核苷酸和/或修飾的核苷酸連接鍵，從而 能增加該多核苷酸的穩(wěn)定性。合適的修飾和作出這些修飾的方法是本領(lǐng)域熟知 的。用于本發(fā)明的修飾多核苷酸藥物的一些例子包括但不限于包含修飾的核糖 核苷酸或脫氧核糖核苷酸的多核苷酸。例如，修飾的核糖核苷酸可在核糖部分 的2'位被含1-6個(gè)飽和或不飽和碳原子的-0-低級垸基，或具有2-6個(gè)碳原 子的--O-芳基取代，其中所述烷基或芳基可以是未取代的或可以是取代的， 例如被鹵素、羥基、三氟甲基、氰基、硝基、?；ⅤＱ趸③趸?、羧 基、烷氧羰基(carbalkoxyl)或氨基；或者被羥基、氨基或鹵素基團(tuán)取代。核 苷酸可由磷酸二酯連接鍵或合成的連接鍵，即除磷酸二酯連接鍵以外的連 接鍵相連。可用于本發(fā)明的多核苷酸藥物中核苷酸間連接鍵的例子包括但 不限于磷酸二酯鍵、膦酸垸酯鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、磷酸 酯鍵、硫代膦酸烷酯(alkylphosphonothioate)鍵、氨基磷酸酯鍵、氨基甲酸 酯鍵、碳酸酯鍵、嗎啉基、磷酸三酯鍵、乙酰胺(acetamidate)鍵、羧甲基酯 鍵或它們的組合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物是用于RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)沉默或下調(diào) SR-A mRNA的siRNA。 RNAi藥物通常在細(xì)胞中表達(dá)為短發(fā)夾RNA(shRNA)。shRNA是含有正義鏈、反義鏈和在正義和反義片段之間的短環(huán)序列的RNA分 子。shRNA輸入細(xì)胞質(zhì)，在該處由切酶加工成短干擾RNA(siRNA)。 siRNA是 21-23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子，其由RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)識別。一 旦摻入RISC， siRNA有助于耙向mRNA的切割與降解。因此，為用于RNAi 介導(dǎo)的沉默或下調(diào)SR-A表達(dá)，所述多核苷酸藥物可以是siRNA或shRNA。
本發(fā)明的shRNA可從重組病毒載體表達(dá)為兩個(gè)分開的互補(bǔ)RNA分子，或 表達(dá)為具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的一個(gè)RNA分子。在這點(diǎn)上，可利用能接受待表達(dá) shRNA分子的編碼序列的任何病毒載體。合適載體的例子包括但不限于衍生自 以下病毒的載體腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如， 慢病毒(LV)、桿狀病毒、鼠白血病病毒、皰疹病毒等。優(yōu)選的病毒是慢病 毒。還可通過用其它病毒的被膜蛋白或其它表面抗原假型化該病毒來修飾 病毒載體的嗜性。適用于本發(fā)明的shRNA序列的一個(gè)例子見SEQ ID NO: 1。 除了在細(xì)胞中從重組載體表達(dá)shRNA，還可利用化學(xué)穩(wěn)定的shRNA或 siRNA作為本發(fā)明的藥物。
在另一實(shí)施方式中，所述藥物可以是識別SR-A的抗體。因此，本發(fā)明所 用的抗體結(jié)合SR-A，從而該抗體的結(jié)合干擾SR-A受體的活性和/或干擾SR-A 配體結(jié)合。該抗體優(yōu)選結(jié)合已知存在于受體C-末端部分的SR-A胞外區(qū)，氨基 酸125-458位。
本發(fā)明所用的識別SR-A的抗體可以是多克隆或單克隆的。所述抗體優(yōu)選 單克隆的。制備多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。此外，抗-SR-A 抗體可商品化購得，例如購自英國牛津賽羅泰克公司(Serotec， Oxford， UK) 的2F8單克隆抗體。
預(yù)計(jì)抗體的抗原結(jié)合片段可用于本發(fā)明方法。合適抗體片段的例子包括 Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段?，F(xiàn)已開發(fā)了各種技術(shù)制備抗體片段，這些技 術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
還預(yù)計(jì)抗體或其抗原結(jié)合片段可以是人源化的。人源化非人抗體的方法是 本領(lǐng)域熟知的(參見，例如Jones等，淑wre, 321:522-525 (1986); Riechmann 等，A^a化"，332:323-327 (1988); Verhoeyen等，239:1534-1536 (1988))。能抑制SR-A的其它藥物也是已知的。例如，美國專利號6,458,845描述 了可用作SR-A拮抗劑的各種亞磺酰氨基苯甲酰苯胺化合物，還描述了檢測 SR-A拮抗劑的方法。對這些化合物和方法的描述通過引用納入本文。
可將能抑制SR-A的藥物與任何合適的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑和 /或穩(wěn)定劑混合來制備用于治療目的的包含該藥物的組合物。適合與藥物混合的 組合物的一些例子可見《雷明頓藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》CRem/"gM": T7ze Sc/e"ce a"d尸rac"ce 0/尸Aarmflc力(2005)第21版，費(fèi)城，賓夕法尼州，LWW公司 (Lippincott Williams & Wilkins)。
如果所述藥物的多核苷酸，可將其作為裸多核苷酸與遞送試劑一起，或作 為包含或表達(dá)該多核苷酸藥物的重組質(zhì)粒或病毒載體給予個(gè)體。用于給藥的合 適遞送試劑包括Minis Transit TKO親脂性試劑；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染 胺試劑；細(xì)胞感染素(cellfectin);或聚陽離子(例如，聚賴氨酸)，或脂質(zhì)體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述多核苷酸通過包含該多核苷酸藥物的抗原呈遞 細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞給予個(gè)體。
本發(fā)明方法的治療用制劑通常包含增強(qiáng)個(gè)體對所需抗原的免疫應(yīng)答有效 量的藥物。對于本發(fā)明藥物，本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到諸如藥物的分子構(gòu)成、待 治療個(gè)體的體形和年齡和疾病的類型及階段等因素，而知道如何制定給藥方 案。如果還將所需抗原給予個(gè)體，可以在給予藥物之前、同時(shí)或之后通過任何 上述途徑給予所需抗原。
可采用任何現(xiàn)有的方法和適合于藥物遞送的途徑將包含抑制SR-A的藥物 并任選包含抗原的組合物給予個(gè)體，以增強(qiáng)對該抗原的免疫應(yīng)答，所述途徑包 括胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動 脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下給藥。
可將含或不含抗原的藥物與用于治療與所述抗原相關(guān)疾病或病癥的常規(guī) 治療劑一起給予。例如，如果所述方法用于增強(qiáng)對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，可在 常規(guī)抗癌癥治療方法之前、同時(shí)或之后給予所述藥物。這些治療方法包括但不 限于化療、外科手術(shù)干預(yù)和放療。
預(yù)計(jì)采用本發(fā)明方法可獲得針對任何所需抗原的增強(qiáng)免疫應(yīng)答。所述抗原
的例子包括但不限于存在于感染性生物上的抗原和由癌細(xì)胞表達(dá)的抗原。所需抗原可以經(jīng)良好表征，但也可以是未知的，除了已知其存在于，例如特定細(xì) 胞類型，如腫瘤或細(xì)菌的裂解液中。本發(fā)明可用的抗原可以商品化購得或由標(biāo) 準(zhǔn)方法制備。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原是腫瘤抗原?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)獲得腫瘤抗原， 例如通過在含亮肽素和抑肽酶的磷酸緩沖鹽水中反復(fù)凍融腫瘤細(xì)胞/組織來制 備腫瘤細(xì)胞裂解液(從新鮮的腫瘤活檢組織或從組織培養(yǎng)而在體外產(chǎn)生的腫瘤 細(xì)胞獲得)。這種凍融導(dǎo)致細(xì)胞裂解?？赏ㄟ^離心并收集上清液獲得腫瘤裂解 液。腫瘤細(xì)胞裂解液可立即使用或在-7(TC冷凍并保存待用?？墒褂眉兓问?br> 或部分純化或未純化形式(例如細(xì)胞裂解液)的抗原?；蛘撸赏ㄟ^重組DNA 技術(shù)在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)抗原。
對于增強(qiáng)針對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供增強(qiáng) 診斷有腫瘤的個(gè)體對該腫瘤所表達(dá)抗原的免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括給予 該個(gè)體能抑制SR-A的藥物，其用量能有效增強(qiáng)針對該抗原的免疫應(yīng)答，其中 所述腫瘤的生長在給予該藥物后受抑制。還任選給予該個(gè)體所述腫瘤表達(dá)的抗 原。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供增強(qiáng)個(gè)體對所需抗原的免疫應(yīng)答的方法， 包括給予該個(gè)體已接觸所需抗原并且SR-A被特異性抑制的抗原呈遞細(xì)胞 (APC)，例如樹突細(xì)胞。與只接觸過引發(fā)更廣泛抑制細(xì)胞過程，例如細(xì)胞分裂、 轉(zhuǎn)錄或翻譯的藥物相比，SR-A被特異性抑制的樹突細(xì)胞表示該樹突細(xì)胞包含 和/或已接觸能特異性抑制SR-A的藥物。在該實(shí)施方式的實(shí)施中，可首先采用 常規(guī)技術(shù)從個(gè)體分離樹突細(xì)胞。可從需要對所需抗原的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的個(gè)體分 離樹突細(xì)胞?？蓪⑺幬锝o予分離的樹突細(xì)胞，以特異性抑制分離的樹突細(xì)胞中 的SR-A。分離的樹突細(xì)胞還可接觸所需抗原，例如用該抗原蛋白預(yù)先加載所 述樹突細(xì)胞或者用抗原的編碼DNA轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。可將分離的樹突細(xì)胞給予 個(gè)體，以引發(fā)針對所需抗原的增強(qiáng)免疫應(yīng)答。因此，給予個(gè)體后，給予個(gè)體的 樹突細(xì)胞可包含藥物和/或抗原。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供增強(qiáng)個(gè)體對腫瘤的免疫應(yīng)答的方法，包括 給予個(gè)體有效量的含樹突細(xì)胞的組合物，其中所述樹突細(xì)胞的特征在于其
SR-A被特異性抑制，其中給予該組合物增強(qiáng)了針對腫瘤的免疫應(yīng)答，從而該腫瘤的生長在給予組合物后受到抑制。所述方法還包括先使得所述樹突細(xì)胞接 觸該腫瘤表達(dá)的抗原，再給予個(gè)體，還可包括采用任何常規(guī)抗癌療法。優(yōu)選的 抗癌療法是照射癌細(xì)胞。
可采用不同方式以不同方法(例如，抗體、shRNA沉默或抑制性分子)抑制 SR-A功能來促進(jìn)對腫瘤的免疫介導(dǎo)排斥或控制。例如，可用抗原加載或者用 抗原編碼cDNA或mRNA轉(zhuǎn)染其中SR-A已被抑制的分離DC。可將修飾的 DC作為疫苗給予宿主以產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答。該方法還可用于提高對感 染性疾病相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答。
可用其它常規(guī)療法，例如放療或化療治療攜帶腫瘤的患者，然后將其中 SR-A己被抑制的DC原位給予至腫瘤部位。預(yù)計(jì)DC會捕獲從破壞的腫瘤釋 放出的抗原，并將這些抗原呈遞至宿主免疫系統(tǒng)以誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答。
在另一實(shí)施方式中，可用抗原或腫瘤特異性疫苗免疫宿主，實(shí)現(xiàn)全身性或 DC中局部SR-A抑制的方案可應(yīng)用于經(jīng)免疫的宿主以改善疫苗效力。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含基本上純化的樹突細(xì)胞的組合物，其 中所述樹突細(xì)胞的特征在于SR-A表達(dá)和/或功能被特異性抑制?？赏ㄟ^，例如 從宿主分離細(xì)胞并采用常規(guī)技術(shù)基本純化樹突細(xì)胞與其它細(xì)胞類型，使該樹突 細(xì)胞接觸能特異性抑制SR-A的藥物來制備這種樹突細(xì)胞。這種細(xì)胞可接觸抗 原并輸回宿主，以在宿主中產(chǎn)生對該抗原的增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
以下實(shí)施例給出了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，這些實(shí)施例是為了說明而不是 限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
本實(shí)施例描述了制備SR-A (-/-)小鼠和敲除小鼠的SR-A對特定抗原免 疫應(yīng)答的影響。
采用以下材料和方法以獲得本實(shí)施例所示的結(jié)果。 V、嚴(yán)微應(yīng)系
SR-A缺乏小鼠(7)與C57BL/6J小鼠(ll)回交，由哈佛醫(yī)學(xué)院(Harvard Medical School)的M. Freeman禾P達(dá)特茅斯醫(yī)學(xué)院(Dartmouth Medical School)的B. Berwin饋贈(5,11)。野生型(WT) C57BL/6小鼠購自緬因州巴, Bar Harbor, ME)。將小鼠飼養(yǎng)在 羅斯威爾癌癥研究院(Roswdl Park Cancer Institute)的無特定病原體設(shè)施中。 按照國立衛(wèi)生研究院(NIH)指南進(jìn)行動物照料和實(shí)驗(yàn)，得到動物照料和使用 研究學(xué)會委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)的批準(zhǔn)。B16 (F10)細(xì)胞(H-2b)是來自ATCC的自發(fā)鼠黑色素瘤細(xì)胞，D121細(xì)胞系(H-2b) 是我們研究院的S.Ferrone提供的Lewis肺癌亞系，二者培養(yǎng)在補(bǔ)加了 10% 熱滅活胎牛血清(生命技術(shù)公司(Life Technologies),格蘭德島(Grand Island),紐約)、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100叫/ml鏈霉素的 DMEM中。
劍吝舒麥辨縱鄉(xiāng)應(yīng)
在137&-照射器中用100 Gy的電離射線(IR)處理腫瘤細(xì)胞，或使之與 UV光(加利福尼亞州拉霍亞斯特拉特基因公司(Stratagen, Inc., La Jolla， CA) 的Stratalinker 1800)接觸，5分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞并以1 x 107個(gè)細(xì) 胞/ml懸浮。為制備細(xì)胞裂解液，將腫瘤細(xì)胞懸浮在PBS中，進(jìn)行4輪快 速凍/融，4°c， 12,000 rpm離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片。
#艦究
對于腫瘤攻擊研究，用"106個(gè)經(jīng)照射腫瘤細(xì)胞在左側(cè)腹皮下免疫小鼠(5 只小鼠/組)。在一些情況中，l周后給予第二次加強(qiáng)。免疫7天后，將活的B16 (2"05個(gè)細(xì)胞/小鼠)或D121腫瘤細(xì)胞(4"05細(xì)胞/小鼠)皮下注射入右側(cè)腹 來攻擊小鼠。對于治療研究，在第0天用2xl()S個(gè)D121腫瘤細(xì)胞或B16腫 瘤細(xì)胞接種小鼠，然后在第2、 4、 6和8天用經(jīng)照射的腫瘤細(xì)胞治療。隔天監(jiān) 測腫瘤生長。利用公式V^最短直徑、最長直徑)/2計(jì)算腫瘤體積。
麟被級微顛丄/，"試邀
分離免疫小鼠和無腫瘤小鼠的脾細(xì)胞，采用以前所述的ELISPOT試驗(yàn)(12) 測定腫瘤特異性或抗原特異性IFN-y分泌T細(xì)胞。簡言之，4°c，用10 Kig/ml 大鼠抗-小鼠IFN-y抗體(克隆R4-6A2，加利福尼亞州圣迭戈法瑪金公司 (Pharmingen， San Diego ， CA))包被馬薩諸塞州貝德福德米粒波公司 (Millipore, Bedford, MA)的過濾板過夜。然后洗滌平板并用含10%FBS的培 養(yǎng)液封閉。37°C ，在有10 U/ml IL-2存在下用5 ^g/ml H-2Kb限制性CTL表位TRP218(M88 (SVYDFFVWL) (13)或H-2Db限制性CTL表位gpl0025.32 (EGSRNQDWL)(14)溫育脾細(xì)胞(lxl()6/孔)24小時(shí)。在一些情況中，經(jīng)照射 的B16或D121細(xì)胞(脾細(xì)胞:腫瘤細(xì)胞=20:1)用作刺激物。然后徹底洗 滌平板，4。C用5 |ag/ml生物素化IFN-y抗體(克隆XMG1.2，加利福尼亞州 圣迭戈法瑪金公司)溫育過夜。洗滌后，加入0.2U/ml親和素-堿性磷酸酶D (加利福尼亞州伯林格姆市載體實(shí)驗(yàn)室公司(Vector Laboratories ， Burlingame， CA))，室溫下溫育2小時(shí)。加入5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酶/ 硝基藍(lán)四唑鐠(印第安納州印第安納波利斯勃林格曼海姆公司(Boehringer Mannheim， Indianapolis, IN))并在室溫下溫育20分鐘使斑點(diǎn)顯色。利用 ELISPOT計(jì)數(shù)器(卡爾蔡司(Carl Zeiss),德國)計(jì)數(shù)諸斑點(diǎn)。 沐膽沐奔^
免疫前6天，隔天通過腹膜內(nèi)分別注射200 GK1.5和2.43 mAb，以 耗盡CD4+、 CD8+ T-細(xì)胞亞組。接種前1天通過FACS分析脾細(xì)胞來證實(shí) 有效耗盡了細(xì)胞亞組，在實(shí)驗(yàn)期間通過每周兩次的抗體注射維持。同種型 匹配的抗體用作對照。對于吞噬細(xì)胞的功能性抑制，如(15)所述通過腹膜內(nèi) 注射200 pi PBS配制的1 mg角叉聚糖(II型，西格瑪公司(Sigma))。
存敏微
用3%巰基醋酸鹽(或酯)肉湯培養(yǎng)基腹膜內(nèi)注射小鼠，4天后通過腹腔灌洗 收集引發(fā)的巨噬細(xì)胞。將M(I)在含10。/。胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng) 基中培養(yǎng)過夜，洗滌除去未附著的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)對此方式制備的M小 作CDllb常規(guī)染色呈陽性(>96%)。 37°C，用PBS配制的2 nM 5 (和6)-二 醋酸羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE，俄勒岡州尤金分子探針公司 (Molecular Probes ， Eugene ， OR))標(biāo)記UV處理的腫瘤細(xì)胞5分鐘。3 7 °C , 用等體積的胎牛血清溫育30分鐘以猝滅未結(jié)合的染料。用完全培養(yǎng)基洗滌 細(xì)胞，并以2:1的比例與巰基醋酸鹽(或酯)-引發(fā)的M([)共培養(yǎng)4小時(shí)。洗去 漂浮的細(xì)胞，收集附著的M^)并用CDllb-PE抗體(加利福尼亞州圣迭戈法 瑪金公司)染色。用BD公司(Becton Dickinson)的B-D FACScaliber通過 FACS將M^)的吞噬作用定量測定為雙陽性染色細(xì)胞的百分比。
粉學(xué)藩采用斯氏^檢驗(yàn)分析腫瘤生長。通過log-秩統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較無腫瘤小鼠。 /7 < 0.05認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
采用上述材料和方法獲得以下結(jié)果。
^經(jīng)厲射游#艘潘蘼接辨在^一-~/、^^導(dǎo)教銀斥免資嚴(yán)絲不虔游#蘑
利用免疫原性不佳和高度轉(zhuǎn)移性的腫瘤-D121 Lewis肺癌(16， 17)測定 SR-A缺乏是否影響腫瘤免疫原性。野生型(WT) C57BL/6和S及-X,'小鼠均用 電離照射(IR)-處理的D121腫瘤細(xì)胞免疫，1周后用活的腫瘤細(xì)胞攻擊。如 預(yù)計(jì)一般，用或不用IR-D121腫瘤細(xì)胞免疫的WT小鼠在腫瘤攻擊后產(chǎn)生 了侵襲性生長的腫瘤(圖1，右圖)。令人吃驚的是，用經(jīng)照射D121腫瘤細(xì) 胞的單劑量免疫能完全保護(hù)S7 "々vj、鼠免遭隨后的腫瘤攻擊，而接種在未 免疫^i J一小鼠中的D121腫瘤的生長情況與野生型小鼠中的相似(圖l，下 圖)。無腫瘤Si -^^—小鼠即使在8個(gè)月后也能耐受第二次腫瘤攻擊，提示存 在長期免疫記憶(數(shù)據(jù)未顯示)。在不同組織學(xué)來源的另一弱免疫原性腫瘤， B16(F10)黑色素瘤中證實(shí)了增強(qiáng)的腫瘤-保護(hù)性免疫力具有普遍性(數(shù)據(jù)未 顯示)。此外，用UV處理的B16腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單劑量接種在57MZ—而不是 WT小鼠中導(dǎo)致這種預(yù)防性腫瘤排斥(圖2)，提示輻射源不影響經(jīng)處理腫瘤 細(xì)胞的免疫原性。雖然用腫瘤裂解液免疫Si ^4一小鼠還顯著減輕了 M"一 小鼠中的腫瘤生長，但所有小鼠最終還是產(chǎn)生了腫瘤(圖2)。
，+ r紛應(yīng)參與n'-稀纖灘拔辦滅力
通過體內(nèi)抗體耗盡研究檢測免疫效應(yīng)細(xì)胞是否參與D121腫瘤細(xì)胞排斥。 免疫前，用抗-CD4 Ab GK1.5或抗-CD8 Ab 2.43處理來耗盡小鼠的CD4+或 CD8+ T-細(xì)胞亞組。通過脾和淋巴結(jié)(細(xì)胞)群的FACS分析評估耗盡了全部 (細(xì)胞)的98%以上(數(shù)據(jù)未顯示)。然后用4 ><105個(gè)D121腫瘤細(xì)胞攻擊小鼠 (圖3)。耗盡CD8+T細(xì)胞完全消除了腫瘤保護(hù)性免疫力(p = 0.002，，與IgG 處理組)，而耗盡CD4+T細(xì)胞對D121腫瘤的排斥沒有影響(p〉0.05，與IgG 處理組)。在致敏階段還利用角叉聚糖(15)耗盡吞噬細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)耗盡吞噬細(xì) 胞也降低了腫瘤保護(hù)作用(p- 0.002，與IgG處理組)。
y^經(jīng)席i^W欲應(yīng)麥辨歹/發(fā)57^八V、嚴(yán)游貧嚴(yán)辨^絲C7X《座
B16黑色素瘤用作相關(guān)模型來評估內(nèi)源性腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，因?yàn)槠浔磉_(dá)多種黑色素瘤相關(guān)抗原，包括gpl00和TRP-2(18)。用經(jīng)照射的B16腫瘤細(xì) 胞免疫后，分離WT或Si J一小鼠的脾細(xì)胞，并用CTL表位§ 10025.32或 TRP2,8(M88刺激。ELISPOT試驗(yàn)顯示與未免疫的小鼠或免疫的WT小鼠相比， 經(jīng)照射B16細(xì)胞免疫的s/m^j、鼠的脾細(xì)胞顯示穩(wěn)定產(chǎn)生抗原特異性 IFN-H圖4)。此外，體外用經(jīng)照射B16細(xì)胞而不是D121細(xì)胞刺激時(shí)，經(jīng)免疫 s/ j^小鼠的脾細(xì)胞也產(chǎn)生高水平的IFN-y，表明致敏CTL有腫瘤特異性。
『r浙1^-^/'//、^效3/-,褒存敏垂^#應(yīng)
破壞凋亡細(xì)胞吞噬作用可能破壞自身耐受性(19-21)， SR-A參與凋亡細(xì)胞 的清除(22)。我們比較了M-i〃和WT小鼠的巨噬細(xì)胞的吞噬能力。通過檢測 也含有CFSE的CDllb+ M小，采用FACscan分析來衡量吞噬作用。吞噬細(xì) 胞攝取的定量測定表明衍生自兩種小鼠的M(()均有效吞沒垂死的腫瘤細(xì)胞 0 > 0.05)(圖5)。用熒光顯微鏡目測觀察細(xì)胞進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果(數(shù)據(jù)未 顯示)，提示APC上存在清除垂死細(xì)胞的豐余受體(23)。
I經(jīng)庸射,蘑潘應(yīng)必^激餘W-Z- V、 ^已夯游#蘑潘應(yīng)
鑒于預(yù)防性免疫在^S7 -X〃小鼠中導(dǎo)致腫瘤排斥這一事實(shí)，我們測定了免疫 接種對荷瘤小鼠中的療效。首先在第0天用D121腫瘤細(xì)胞接種Si "一小鼠， 然后在第2、 4、 6禾卩8天用經(jīng)照射的D121腫瘤細(xì)胞治療。未治療的SR-A—" 小鼠中D121腫瘤侵襲性生長。然而，給予經(jīng)照射的D121細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤生長 速度顯著降低，并且50%的小鼠維持沒有腫瘤(圖6， /7<0.05，與未處理組)。 在B16黑色素瘤模型中也觀察到相似療效(圖6)。
因此，以上實(shí)施例首次證明SR-A負(fù)調(diào)節(jié)抗原-特異性抗腫瘤免疫力。該實(shí) 施例還證明將某抗原給予SR-A受抑制的哺乳動物導(dǎo)致對該抗原的免疫應(yīng)答增 強(qiáng)。
實(shí)施例2
本實(shí)施例證明通過抑制野生型小鼠的抗原呈遞細(xì)胞(例如，樹突細(xì)胞)中的 SR-A,并且給予該小鼠增強(qiáng)的免疫應(yīng)答所針對的抗原可以復(fù)制實(shí)施例1所示 SR-A -/-小鼠中對某抗原的增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
首先，為測定樹突細(xì)胞(DC)對在SR-A敲除小鼠中觀察到的缺乏SR-A能否增強(qiáng)疫苗效力，我們比較了野生型(WT)或SR-A敲除小鼠的骨髓(BM)-DC刺激抗原-特異性抗腫瘤免疫力的能力(圖7A)。
為獲得圖7所示的結(jié)果，用經(jīng)模型抗原卵白蛋白(OVA)脈沖的DC免疫WT C57BL/6小鼠，然后用表達(dá)OVA的B16黑色素瘤進(jìn)行腫瘤攻擊。DC是在有GM-CSF和IL-4存在下從骨髓產(chǎn)生的。簡言之，37°C，在5%加濕C02中，用含重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml; BD生物科學(xué)公司(BD Bioscience))和重組小鼠IL-4 (5 ng/ml; BD生物科學(xué)公司)的完全RPMI 1640培養(yǎng)小鼠BM細(xì)胞。在培養(yǎng)的第2和4天，除去上清液，替換以含有GM-CSF和IL-4的新鮮培養(yǎng)液。用OVA (10嗎/ml)溫育培養(yǎng)7天的未附著細(xì)胞3小時(shí)，然后用1 ng/ml LPS (大腸桿菌血清型026:B6，密蘇里州圣路易斯西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-Aldrich， St. Louis， MO))刺激16小時(shí)。
觀察到DC在控制免疫原性不佳的B16腫瘤生長方面遠(yuǎn)比WTDC強(qiáng)效。此外，我們比較了兩種小鼠品系的BM-DC引發(fā)OVA-特異性細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)的能力。用OVA-特異性MHC I-限制性CTL表位(即，SIIMFEKL; SEQ ID NO:2)刺激后，DC-免疫小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-Y水平遠(yuǎn)高于WT DC，表明DC在引發(fā)抗原-特異性效應(yīng)器T-細(xì)胞反應(yīng)方面遠(yuǎn)比WTDC強(qiáng)(圖7A)。因此，這些結(jié)果證明SR-A負(fù)調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞(APC)，特別是DC的免疫活化功能，從而提供了DC能控制先天和獲得性免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制。
鑒于我們發(fā)現(xiàn)SR-A在APC的免疫刺激功能中具有抑制性作用，我們測定了阻斷或下調(diào)(即，抑制)SR-A是否會改善DC(通常認(rèn)為是免疫啟動的至關(guān)重要APC)介導(dǎo)的疫苗效力。
與通過促進(jìn)DC成熟和共-刺激而體外產(chǎn)生免疫強(qiáng)效DC所用的大多數(shù)方案不同，本方法試圖去除免疫抑制性SR-A的作用。利用慢病毒載體作基因轉(zhuǎn)移和通過RNA干擾(RNAi)使基因沉默，我們檢測了使DC的內(nèi)源性SR-A沉默是否增強(qiáng)了 CTL活化和抗腫瘤免疫力。
利用shRNA的RNA干擾可在哺乳動物細(xì)胞中介導(dǎo)有效的序列特異性沉默或下調(diào)基因表達(dá)。自身滅活的慢病毒載體(LV)用于遞送RNAi，因?yàn)樗鼈冊诜至押头欠至鸭?xì)胞，包括造血干細(xì)胞和它們終末分化細(xì)胞后代，例如DC，中安全且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)異(24)。
我們設(shè)計(jì)并篩選了各種慢病毒編碼的短發(fā)夾RNA(shRNA)來鑒定能下調(diào)SR-A表達(dá)的shRNA。為進(jìn)行篩選，37°C，將非復(fù)制性LV-SRA-shRNA與DC以50:1比例溫育24小時(shí)。我們在DC中鑒定了特異性下調(diào)SR-A的小干擾RNA(siRNA)(圖8A)。如免疫印跡試驗(yàn)所示，與未處理或偽感染細(xì)胞相比，用LV-SRA-shRNA感染以產(chǎn)生SEQ ID NO:l構(gòu)成的shRNA的DC1.2細(xì)胞中，SR-A蛋白質(zhì)水平降低約90。/。。重要的是，觀察到用可溶性O(shè)VA抗原加載時(shí)，SR-A下調(diào)的DC消除表達(dá)OVA抗原的高度侵襲性B16腫瘤遠(yuǎn)比用擾亂性shRNA處理的對照DC有效(圖8B)。此外，我們證明與擾亂性shRNA相比，通過RNA干擾下調(diào)DC中的SR-A更有效地促進(jìn)抗原
4寺異性CTL反應(yīng)，如OVA257_264肽刺激后脾細(xì)胞中IFN-Y產(chǎn)生水平較高(圖9A)和OVA-特異性效應(yīng)器€08+-丁細(xì)胞的溶胞活性增強(qiáng)(圖9B)所示。
因此，綜合起來，本文所示的數(shù)據(jù)表明在WT和Si d々'小鼠中觀察到的免疫應(yīng)答的功能差異可能是因?yàn)镾R-A表達(dá)的直接作用，而不是，例如沒有SR-A存在下DC發(fā)育的改變。重要的是，我們證明特異性抑制DC中的SR-A能增強(qiáng)哺乳動物對所需抗原的免疫應(yīng)答。
參考文獻(xiàn)
1. Hughes等，Eur J Immunol 1995;25:466-73.
2. Pearson等，Chem Biol 1998;5:R193-203.
4. Krieger等，Curr Opin Lipidol 1997;8:275-80.
5. Berwin等，Embo J 2003;22:6127-36.
6. Kodama等，ProcNatl Acad Sci U S A 1988;85:9238-42.
7. Suzuki等，Nature 1997;386:292-6.
8. Thomas等，J Exp Med 2000;191:147-56.
9. Ishiguro等，Am J Pathol 2001;158:179-88.
10. Peiser等，Infect Immun 2002;70:5346-54.
11. Kunjathoor等，J Biol Chem 2002;277:49982-8.
12. Wang等，Cancer Res 2003;63:2553-60.13. Bloom等，J Exp Med 1997;185:453-9.
14. Overwijk等，J Exp Med 1998;188:277-86.
15. Udono等，Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:3077-81.
16. Sugiura等，Cancer Res 1955;15:38-51.
17. Popovic等，Clin Exp Metastasis 1998;16:623-32.
18. Engelhard等，Immunological Reviews 2002;188:136-46.
19. Bondanza等，J Exp Med 2004;200:1157-65.
20. Asano等，J Exp Med 2004;200:459-67.
21. Cohen等，J Exp Med 2002;196:135-40.
22. Piatt等，Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:12456-60.
23. Piatt等，J Immunol 2000;164:4861-7.
24. Rubinson等，Nat Genet 2003;33:401-6.
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)個(gè)體對所需抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括給予該個(gè)體有效量的包含樹突細(xì)胞的組合物，其中所述樹突細(xì)胞的特征在于其A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)被特異性抑制，并且其中所述該組合物增強(qiáng)了該個(gè)體對該所需抗原的免疫應(yīng)答。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞先接觸所述所需抗原再給予所述個(gè)體。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述個(gè)體已診斷具有表達(dá)所述所需抗原的腫瘤，其中給予包含所述樹突細(xì)胞的所述組合物后該腫瘤的生長受抑制。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞從所述個(gè)體分離，并在分離后但將所述組合物給予所述個(gè)體之前接觸所述所需抗原。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞的SR-A活性被具有與編碼SR-A的核苷酸序列相同或互補(bǔ)的序列的多核苷酸特異性抑制。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是shRNA。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述核多核苷酸包含SEQIDNO:l所示序列。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞的所述SR-A活性被與SR-A有反應(yīng)活性的抗體，或被與SR-A有反應(yīng)活性的抗體片段特異性抑制。
9. 一種增強(qiáng)個(gè)體對所需抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括給予該個(gè)體該所需抗原和能特異性抑制A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)的藥物，該藥物的用量有效增強(qiáng)該個(gè)體對該所需抗原的免疫應(yīng)答。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述藥物包含具有與編碼SR-A的核苷酸序列相同或互補(bǔ)的序列的多核苷酸。
11. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是shRNA。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述核糖多核苷酸是shRNA。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述核糖多核苷酸由SEQIDNO:l所示序列構(gòu)成。
14. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述藥物是與SR-A有反應(yīng)活性的抗體，或被與SR-A有反應(yīng)活性的抗體片段。
15. —種增強(qiáng)診斷具有腫瘤的個(gè)體對該腫瘤所表達(dá)抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予該個(gè)體能抑制A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)的藥物，該藥物的用量有效增強(qiáng)該個(gè)體對該抗原的免疫應(yīng)答，其中該腫瘤的生長在給予該藥物后受到抑制。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述藥物包含具有與編碼SR-A的核苷酸序列相同或互補(bǔ)的序列的多核苷酸。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是shRNA。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，還包括給予所述個(gè)體包含所述抗原的組合物。
19. 一種基本上純化的哺乳動物樹突細(xì)胞群，其中該樹突細(xì)胞的特征在于其SR-A活性被特異性抑制。
20. 如權(quán)利要求19所述的基本上純化的哺乳動物樹突細(xì)胞群，其特征在于，所述SR-A活性被shRNA抑制。
全文摘要
提供了增強(qiáng)個(gè)體對所需抗原的免疫應(yīng)答的方法。通過給予該個(gè)體能抑制A類巨噬細(xì)胞清道夫受體(SR-A)的藥物，并任選給予該所需抗原來實(shí)施該方法。還提供了通過給予個(gè)體包含抗原呈遞細(xì)胞的組合物來增強(qiáng)對某抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述抗原呈遞細(xì)胞的特征在于SR-A被特異性抑制。還提供了基本上純化的哺乳動物樹突細(xì)胞群體，其特征在于SR-A被特異性抑制。
文檔編號A61K31/70GK101675066SQ200880012072
公開日2010年3月17日 申請日期2008年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日
發(fā)明者J·薩布杰克, 王向陽 申請人:健康研究股份有限公司