專利名稱：：結(jié)合生長因子的融合蛋白的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及抗-血管發(fā)生組合物領域。本發(fā)明還涉及一種同時結(jié)合兩種不同生長因子或細月包因子的組合物。
背景技術：
：人體中存在三種已知的VEGF受體，即VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。人類VEGFR1由1338個氨基酸組成，3皮分成三個主要區(qū)域由7個免疫球蛋白(Ig)-樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的胞外結(jié)構(gòu)域、；夸膜結(jié)構(gòu)i或和月包內(nèi)酪氨酉臾酶結(jié)構(gòu)i或(UniProKB/Swiss-ProtentryP17948)(圖1)。VEGFR2和VEGFR3具有類似的構(gòu)成并且在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域上顯示與VEGFR1約80%的同一'I"生。VEGFR1和VEGFR2通過結(jié)合VEGF-A的^敫活對于血管內(nèi)皮細胞的生長、遷移和存活(它們是血管發(fā)生和血管生成的基本過程)起關4建作用，而VEGFR3通過結(jié)合VEGF-C和VEGF-D的激活對于淋巴內(nèi)皮細胞的生長、遷移和存活(它們是另外具體指出的淋巴管形成的基本過程)起主要作用(ShibuyaMandClaessson-WelshL,Exp.CellResearch312:549-560,2006;AlitaloK,etal.,Nature438:946-953)。VEGF-A對VEGFR1的親和力比3于VEGFR2的親詳口力高大約10倍。在VEGFR1的7個Ig-樣結(jié)構(gòu)域中，Ig-樣結(jié)構(gòu)域2對于VEGF-A結(jié)合是必需的(圖2)。然而，VEGFR1的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2包含許多石成性氨基酸并且它的理i侖等電點(pi)為9.19(ComputepI/MwtoolforSwiss畫Prot/TrEMBLentries,http:〃kr.expasy.org/tools/pi—tool,html)。因此，VEGFR1的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2本身不能一皮用作具有i秀何受體性能的治療蛋白，因為它具有低的藥代動力學性能。具有免疫^求蛋白和表皮生長因子同源性結(jié)構(gòu)域-2的酪氨酸激酶(Tie2)是主要在內(nèi)皮和造血細胞上表達的一種受體酪氨酸激酶(RTK)(DumontDJ,etal.,Oncogene8:1293-1301,1993)。Tie2對于血管形成、血管發(fā)生和造iM艮關4建(YancopoulosGD，etal.,Nature407:242-248,2000)。4種Tie2配體已^皮鑒定血管生成素-l(Angl)、血管生成素-2(Ang2)、血管生成素-3(Ang3)和血管生成素-4(Ang4)(YancopoulosGD,etal.,Nature407:242-248,2000)。盡管Angl似乎是Tie2的專性(obligate)激活劑，但是Ang2似乎具有上下文中所述的特定作用，在一些細胞上激活這種受體而在其他細胞上或在不同條4牛下阻斷Tie25敫活(YancopoulosGD,etal.,Nature407:242-248,2000)。人類Tie2由1124個氨基S吏構(gòu)成，一皮分成三個主要區(qū)域由兩個Ig-樣結(jié)構(gòu)域、三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域、一個Ig-樣結(jié)構(gòu)域、三個III型纖連蛋白組成的胞外結(jié)構(gòu)域；跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(UniProtKB/Swiss-ProtentryQ02763)(圖1)。在Tie2的胞外亞結(jié)構(gòu)域中，Ig-樣結(jié)構(gòu)域2對于血管生成素結(jié)合是必需的，但Ig-樣結(jié)構(gòu)域1和三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域看起來是與血管生成素的穩(wěn)-定結(jié)合所必需的(圖2)。重要地，這些亞結(jié)構(gòu)i或包含許多酸性氨基酸并且它的理-淪等電點(pl)為6.55(ComputepI/MwtoolforSwiss-Prot/TrEMBLentries,http://kr.expasy.org/tools/pitool.html)。因此，這些結(jié)構(gòu)i或本身能夠用作治療蛋白，因為它可以具有高的藥代動力學值。在VEGF和血管生成素家力矣蛋白中，VEGF-A和血管生成素-2(Ang2)是對于以下的關鍵分子肺瘤血管發(fā)生(Holash,J.etal.,Science1999;284:1994-1998;Holash,J.etal.,Oncogene1999;18:5356-5362)和轉(zhuǎn)移(Saaristo,A.etal"Oncogene2000;19:6122-6129)、老年性黃斑退化癥((Otani,A.etal.，InvestOphthalmol.Vis.Scl，1999;40:1912-1920)、4唐尿病一見網(wǎng)月莫病變(Watanabe，D.etal"Am.J.Ophthalmol.2005;139:476-481)、風濕性關節(jié)炎(Fearon,U.etal"J.Rheumatol2003;30:260-268;Paleolog,E.M.etal"ArthritisRes.2002;4:S81-S90)、銀屑病(Kuroda，K.etal"J.InvestDermatol.2001;116:713-720)、急性和十曼4生炎癥(McDonald,D.M.etal"Am.J.Respi.Cri.CareMed.2001;164:S39-S45;Roviezzo,F.etal"J.Pharmacol.Exp.Ther.2005;314:738-744)、動脈粥樣硬<匕(LimHS,etal.，Atherosclerosis,2005;180:113-118)以及'淋巴i曾生性疾病如腫瘤、淋巴管生成(Scavelli，C.etal"Leukemia2004;18:1054-1058)和淋巴4爭移(Sfiligoi,C.etal"Int.J.Cancer2003;103:466-474)。因此，本發(fā)明對于治療VEGF-A和/或Ang2相關疾病才是供VEGF-A和Ang2的同時阻斷，優(yōu)選地利用i秀辨受體、內(nèi)只又凈爭異抗體(intradiabody)(乂又抗體)或RNA干#尤。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明還提供一種組合物，其結(jié)合兩種不同生長因子或細胞因子。優(yōu)選地，這樣的組合物是能夠同時結(jié)合兩種蛋白的融合蛋白。在一個方面，這樣的融合多肽不是抗體。在一個優(yōu)選方面，這樣的融合多肽包4舌該生長因子或細月包因子的天然結(jié)合伴侶的全長形式或片,殳。更優(yōu)選地，該融合多肽能夠同時地結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素，即"雙抗-血管生成蛋白(DAAP)"。才皮露的DAAP對于治療VEGF和血管生成素相關病癥和疾病4o癌癥、老年性黃斑退化癥、糖尿病一見網(wǎng)膜病變、風濕性關節(jié)炎、4艮屑病、急性和慢性炎癥、動脈粥樣硬化及淋巴增生性疾病是治療有用的。在一個特定方面，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，該核酸分子編碼能夠同時結(jié)合VEGF多肽和血管生成素多肽的多肽，其包括編碼Tie2部分(組成部分，component)和VEGFR部分的核苦酸序列。該Tie2和VEGFR部分可以可才喿作地連4妾至編碼多聚化部分(形成多聚體的部分，multimerizingcomponent)的沖亥苦酸序列。VEGFR可以是VEGFR1或VEGFR3，并不限于此沒有限制。并且該多聚體部分可以是免疫5求蛋白結(jié)構(gòu)域。在一個方面，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以是IgG的Fc結(jié)構(gòu)域、IgG的重鏈、或IgG的輕鏈。而且，Tie2部分可以<立于VEGFR部分的上游或下游。在另一方面，在該核S臾分子中，Tie2部分可以包4舌編碼Tie2的胞外結(jié)構(gòu)域的Ig-樣結(jié)構(gòu)域1、Ig-樣結(jié)構(gòu)域2和三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的核苷酸序列。在另一方面，VEGFR1部分可以基本上由編碼VEGFR1的胞外結(jié)構(gòu)域的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2的氨基酸序列的核苷酸序列組成；并且VEGFR3部分可以基本上由VEGFR3的胞外結(jié)構(gòu)域的Ig-樣結(jié)構(gòu)域1、Ig-樣結(jié)構(gòu)域2和Ig-樣結(jié)構(gòu)域3的氨基酸序列組成。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種分離的核S菱分子，其包含編碼以下(核苷酸序列)的核苷酸序列(a)在表1中列出的稱為DAAP#1的核苦酉臾序列；(b)在表1中列出的稱為DAAP#2的核苦商吏序列；(c)H1中歹'J出的碎爾為DAAP弁3的才亥^S^f歹'J;(d)在表1中列出的稱為DAAP#4的核苷酸序列；(e)在表1中列出的稱為DAAP#11的核苦酸序列；(f)在表1中列出的稱為DAAP#12的核普酸序列；(g)在表1中列出的稱為DAAP#13的核苦酸序列；(h)在表1中列出的稱為DAAP#14的核苷S臾序列；(i)在表1中列出的稱為DAAP#15的核苷酸序列；(j)在表1中列出的稱為DAAP#16的核苷酸序列；(k)在表1中列出的稱為DAAP#17的核苷酸序列；或(1)一個核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并而不同于上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)或(k)的核苷酸序列，但編碼由它們(上述(a)(k)的核苦酸序列)表達的相同氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種載體，其包含所有上述的核酸分子。該載體可以是表達載體。本發(fā)明還涉及一種宿主載體系統(tǒng)，用于在合適宿主細胞中生產(chǎn)融合多肽，其包含上述表達載體。這樣的合適宿主細胞可以包括細菌細月包、酵母細月包、昆蟲細月包或哺乳動物細月包。本發(fā)明還涉及一種融合多肽，其由上述分離的核酸分子中的任一種編碼，包括^旦不限于DAAP#l-4和DAAP#11-17的氨基S吏序列。本發(fā)明還涉及一種組合物，其能夠同時地結(jié)合VEGF和血管生成素分子以形成一種包含上述融合多肽的多聚體的非功能性復合體，包4^f旦不限于利用VEGFR1或VEGFR3部分的那些融合構(gòu)建體。該多聚體可以是二聚體。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)融合多肽的方法，其包括在允許生產(chǎn)融合多肽的條件下，生長上述宿主-載體系統(tǒng)的細月包，以及回收所生產(chǎn)的融合多肽。這樣的融合多肽可以通過乙?；蚓垡叶蓟M行》務飾。乙?；梢岳媚栠^量的乙?；噭﹣硗瓿?，其范圍為至少約104咅摩爾過量至約1004咅摩爾過量。聚乙二醇化可以利用1OK或20KPEG。在又一個方面，本發(fā)明涉及一種降低或抑制哺乳動物中的血漿滲漏的方法，其包括對需要其的哺乳動物給予有效量的本文所述的融合多肽。在一個優(yōu)選實施方式中，所述滲漏可以是在浮見網(wǎng)膜中。在又一方面，本發(fā)明涉及一種阻斷哺乳動物體內(nèi)血管生長的方法，其包括對需要其的哺乳動物給予有效量的本文描述的融合多肽。在某些方面，血管生長阻斷活性可以尤其用于治療癌癥、老年性黃斑退化癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、風濕性關節(jié)炎、4艮屑病、急性和慢性炎癥、動脈粥樣硬化和淋巴增生性疾病。在又一方面，本發(fā)明涉及一種減弱或防止哺乳動物體內(nèi)肺瘤生長的方法，其包括對需要其的哺乳動物給予有效量的本文描述的融合多肽。在又一方面，本發(fā)明涉及一種減弱或防止哺乳動物體內(nèi)的水月中的方法，其包括對需要其的哺乳動物給予有效量的本文描述的融合多肽。該水肺可以是一見網(wǎng)月莫水腫和腦水腫。在又一方面，本發(fā)明涉及一種減弱或防止哺乳動物體內(nèi)腹水形成的方法，其包括對需要其的哺乳動物給予有效量的本文描述的融合多肽。腹水可以是與卵巢癌相關的。本發(fā)明還涉及一種抑制哺乳動物體內(nèi)VEGF受體配體和Tie2配體活性的方法，包括向該哺乳動物給予有效量的本文描述的融合多肽。在又一方面，本發(fā)明涉及一種減弱或防止哺乳動物體內(nèi)炎性血管發(fā)生的方法，其包括對需要其的哺乳動物給予有效量的本文描述的融合多肽。由炎性血管發(fā)生引起的紊亂的一個實例是風濕性關節(jié)炎。由炎性血管發(fā)生引起'病、4艮屑病、沖唐尿病一見網(wǎng)"莫病變、動月永粥樣》更化。才艮據(jù)下文給出的詳細描述以及附圖將可以更充分地理解本發(fā)明，其中附圖僅以舉例說明方式給出，因而對本發(fā)明不是限制性的，并且其中圖1示出了,皮分成以下三個主要區(qū)i或的人類VEGFR1的示意圖由7個免疫球蛋白(Ig)-樣結(jié)構(gòu)域組成的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。圖1還示出了被分成以下三個主要區(qū)域的人類Tie2的示意圖由兩個Ig-才羊結(jié)構(gòu)i或、三個EGF才羊結(jié)構(gòu)域、一個Ig-樣結(jié)構(gòu)域、三個III型纖連蛋白組成的胞外結(jié)構(gòu)域；膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。圖2示出了用于Ang2和Tie2之間以及VEGF和VEGFR1之間的結(jié)合的結(jié)構(gòu)性相互作用。Tie2的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2對于血管生成素結(jié)合是必需的，并且Ig-樣結(jié)構(gòu)域1和三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域看起來是對于血管生成素的穩(wěn)、定結(jié)合所必需的，而VEGFR1Ig-才羊結(jié)構(gòu)域2對于VEGF-A結(jié)合是必需的。圖3A和3B示出了DAAP(#1,#2,#3和弁4)構(gòu)建體的示意圖。圖3A示出了來自Tie2和VEGFR1的胞外結(jié)構(gòu)域的亞結(jié)構(gòu)域組裝體(assemblies),而圖3B示出了來自Tie2和VEGFR1的對應的氨基酸。EcoRl和Xhol是限制性酶切位點。圖4示出了關于pCMV-dhfr和pCMV-DAAP-dhfr載體的基因構(gòu)建體的示意圖。圖5示出了用于來自Tie2和VEGFR1的月包外結(jié)構(gòu)i或的亞結(jié)構(gòu)域組裝體的DAAP(#1，#11，#12,#13，#14,#15,#16和#17)構(gòu)建體的示意圖，以及它們來自Tie2和VEGFRl的對應的氨基酸。圖6示出了用于來自Tie2和VEGFR1的月包外結(jié)構(gòu)i或的亞結(jié)構(gòu)域組裝體的DAAP(#11,#12,#13，#14，#15,#16和#17)構(gòu)建體的示意圖，以及它們乂十應的來自Tie2和VEGFR1的氨基酸。圖7示出了對于DAAP(弁l,#2，#3，#4,#11,#12，#13，#14,#15,#16和#17、VEGF-trap(VEGF-i秀捕)、Tie2-Fc和Fc蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。圖8示出了對于DAAP與VEGF-A的ELISA結(jié)合測定示意圖。圖9示出了乂于于DAAP與Ang2的ELISA結(jié)合測定的示意圖。圖10示出了乂寸于DAAP與VEGF-A和Ang2的ELISA結(jié)合測定的結(jié)果。圖11A和11B示出了》十于DAAP與VEGF-A和Ang2的竟爭性結(jié)合的結(jié)合測定。圖12A-12D示出了在DAAP與VEGF-A和Ang2的體外結(jié)合之后的蛋白質(zhì)印跡分析。圖13示出了VEGF禾口血管生成素與DAAP同時結(jié)合的示意圖。圖14示出了IgFc、DAAP弁1、VEGF-Trap和Tie2-Fc的大小和二聚體狀態(tài)。蛋白在CHO細胞中生產(chǎn)，利用蛋白-A瓊脂糖親和層析進行純化，在還原和未還原條件下將2昭加載到SDS-PAGE中，并用考馬其斤藍(Coomassieblue)染色。圖15A和15B示出了DAAP#1、VEGF-Trap和Tie2國Fc與(A)VEGF-A和(B)Ang2的親和力常數(shù)的ELISA分析。圖17示出了對于才企測在DAAP弁1、VEGF-Trap或Tie2-Fc與多種指定類型的VEGF和血管生成素之間的物理相互作用的體外下4立測定(invitropull-downassay)。圖18示出了不同DAAP的理i侖等電點《直。圖19示出了胞外基質(zhì)結(jié)合測定的示意圖。圖20示出了對于不同DAAP的胞外基質(zhì)結(jié)合的ELISA測定。圖21示出了對于更高濃度的DAAP#1、VEGF-Trap和Tie2-Fc的胞外基質(zhì)結(jié)合的ELISA測定。圖22示出了利用小鼠的藥代動力學分析的示意圖。圖23示出了Fc、DAAP#1、VEGF-Trap和Tie-Fc的藥代動力學i普圖。圖24示出了GFP-LLC月中瘤移4直才莫型的形成和PBS、Fc、DAAP#1、VEGF-Trap和Tie2-Fc的治療方案的示意圖。圖25A和25B示出了PBS、Fc、DAAP#l、VEGF-Trap和Tie2-Fc對#4居圖24的GFP-LLC腫瘤生長的影響。A表示在腫瘤移纟直后29天和在治療后24天腫瘤大小的照片。B表示每一個組(n-4)中肺瘤體積(平均^L士SE)的變化。圖26示出了在利用Fc、VEGF-Trap或DAAP#1治療的小鼠腫瘤的血管的代表性照片。圖27示出了形成ROP才莫型和PBS、Fc、DAAP#1、VEGF-Trap和Tie2-Fc的治療方案的示意圖。圖28A-28F示出了PBS、Fc、DAAP弁1、VEGF畫Trap和Tie2-Fc對ROP小鼠模型的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的影響。A、B、C和D示出了整個視網(wǎng)膜、#見盤、中間部分和邊緣部分的^L網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)。E和F示出了PBS、Fc、DAAP弁1、VEGF-Trap和Tie2畫Fc對ROP才莫型中新血管叢面積和邊血彖血管密度的影響。圖29A-29B示出了風濕性關節(jié)炎模型動物的形成。A示出了對于II型膠原誘導的風濕性關節(jié)炎(CIA)的實驗小鼠模型的生成和治療時間的示意圖。B示出了手爪中在指定時間點的腫"長、紅斑和關節(jié)僵化確定和定量的平均臨床關節(jié)炎評分。圖30A-30B示出了風濕性關節(jié)炎的治療。A示出了利用指定藥劑治療的RA小鼠的膝和踝關節(jié)的代表性放射照像結(jié)果。B示出了在利用指定藥劑治療的CIA小鼠的膝、；f果和跗跖(tarsometatarsal)關節(jié)中的骨破壞的》文射照像評分。數(shù)值是平均值士SD。圖31A-31B示出了風濕性關節(jié)炎的治療。A示出了利用指定藥劑治療18天的CIA小鼠的膝和踝關節(jié)的代表性組織病理學結(jié)果。B示出了在利用指定藥劑治療18天的CIA小鼠的膝和踝關節(jié)中的骨異常的組織病理學評分。凄史值是平均值士SD。表1示出了DAAP#1、DAAP#2、DAAP弁3、DAAP#4、DAAP#11、DAAP#12、DAAP#13、DAAP#14、DAAP#15、DAAP#16、DAAP#17的核酸和氨基酸序列。更具體地，SEQIDNO:l表示DAAP弁1圖示的核酸的正義《連。SEQIDNO:2表示DAAP#1圖示的氨基酸序列。SEQIDNO:3表示DAAP弁2圖示的核酸的正義《連。SEQIDNO:4表示對于DAAP#2圖示的氨基酸序列。SEQIDNO:5表示DAAP弁3圖示的4亥酉殳的正義4連。SEQIDNO:6表示DAAP#3圖示的氨基酸序列。SEQIDNO:7表示DAAP#4圖示的核酸的正義4連。SEQIDNO:8表示DAAP#4圖示的氨基酸序列。SEQIDNO:9表示DAAP弁ll圖示的4亥酸的正義4連。SEQIDNO:IO表示DAAP#11圖示的氨基酉臾序列。SEQIDNO:ll表示DAAP#12圖示的核酸的正義《連NO:12表示DAAP#12圖示的氨基酸序列。SEQIDNO:13表示DAAP射3圖示的核酸的正義鏈NO:14表示DAAP#13圖示的氨基酉菱序列。SEQIDNO:15表示DAAP#14圖示的核酸的正義4連NO:16表示DAAP#14圖示的氨基酸序列。SEQIDNO:17表示DAAP#15圖示的核酸的正義《連NO:18表示DAAP#15圖示的氨基酉吏序列。SEQIDNO:19表示DAAP#16圖示的核酸的正義《連NO:20表示DAAP#16圖示的氨基酸序列。SEQIDNO:21表示DAAP#17圖示的核酸的正義《連NO:22表示DAAP#17圖示的氨基酸序列。具體實施例方式在本申請中，"一個"用來指單個和多個對象。如本文使用的，"約"或"大致"通常對被限定的精確數(shù)字提供一個可允許的余裕。例如，如在多肽序列的長度的上下文中4吏用的，"約"或"大致"表明該多肽不限于所列舉的氨基酸數(shù)。在N-端或C-端增加或減少一些氨基酸可以包括在內(nèi)，只要功能活性如其結(jié)合活性存在即可。^口本文^f吏用的，"聯(lián)合(incombinationwith,纟且合)"一種或多種其他治療劑的給藥包括同時(共同)和以任何順序的連續(xù)給藥。如本文使用的，"氨基酸"是指所有天然L-a-氨基酸。這個定義用來包4舌正亮氨酸、鳥氨酸和高半胱氨酸。。SEQID。SEQID。SEQID。SEQID。SEQID。SEQID如本文使用的，一般地，術語"氨基酸序列變體"是指相比于參考(例如天然序列)多肽，在它們的氨基酸序列上具有一些差異的分子。氨基酸改變可以是天然氨基酸序列的^辜^、插入、缺失或這些變化的任何期望組合。替代變體是天然序列中去除至少一個氨基酸殘基并且在該相同位置處在其原位插入一個不同的氨基酸。取J氏可以是單個的，其中分子中僅一個氨基酸被替代，或者它們可以是多個的，其中兩個或更多個氨基酸在相同分子中被替代。序列內(nèi)的氨基酉交取^可以選自該氨基酸所屬的種類的其4也成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性天然氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是它們的表現(xiàn)出相同或類似生物學活性的蛋白或片,殳或衍生物以及在翻i,過程中或之后被差異修飾，例如通過糖基化、蛋白質(zhì)水解切割、鍵j妄至抗體分子或其4也細力包配體等的衍生物。插入變體是指其在緊鄰天然氨基酸序列中特定位置的一個氨基酸處插入一個或多個氨基酸。緊鄰一個氨基酸是指連接于該氨基酸的a-羧基或a-氨基官能團。缺失變體是指其在天然氨基酸序列中除去一個或多個氨基酸。通常，缺失變體在該分子的特定區(qū)i或中缺失一個或兩個氨基酸。如本文使用的，"拮抗劑"是指趨于使另一配體的作用無效的配體，由于一個配體結(jié)合至細胞受體而不引發(fā)生物學響應。本發(fā)明的配體的優(yōu)選生物學活性包括抑制血管通透性的能力。抑制血管通透性的能力對于治療醫(yī)學病癥和疾病如糖尿病視網(wǎng)月莫病變、水腫和腹水很有用。本發(fā)明的配體的優(yōu)選生物學活性包括維持內(nèi)皮細胞完整性(包括防止細胞凋亡)的能力。維持內(nèi)皮細胞完整性的能力對于治療醫(yī)學病癥和疾病如甘露醇治療、方文射和敗血癥很有用。還考慮了，利用可檢測標記如放射性同位素、熒光標簽、酶標簽或化學發(fā)光標簽標記DAAP融合蛋白以確定配體-受體結(jié)合的相互作用。同樣，還考慮了采用該嵌合分子的測定系統(tǒng)。如本文〗吏用的，"載體"包4舌對暴露于所采用的劑量和濃度下的細力包或哺乳動物無毒的藥用載體、賦形劑、或穩(wěn)、定劑。常用藥用載體是含水pH緩沖溶液。藥用載體的實例包括但不限于緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(低于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠、或免疫王求蛋白；親水性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖、和其他糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA;糖醇如甘露醇或山梨醇；鹽形成抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS⑧。如本文使用的，當用于核酸序列或氨基酸序列的上下文時，"基本上由...組成"是指對于實現(xiàn)由核酸編碼的氨基酸的預計功能所必需的序列。如本文使用的，"有效量"是足以實現(xiàn)有益或期望臨床或生化結(jié)果的量。有歲支量可以》會予一次或多次。對于本發(fā)明的目的而言，抑制劑化合物的有效量是足以緩和、減輕、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延遲疾病4夫態(tài)進展的量。如本文使用的，"片^殳"或"功能性衍生物"是指本發(fā)明的天然配體或受體的生物學活性氨基酸序列變體和片l殳，以及共fH奮飾體包括通過與有機衍生試劑反應、翻譯后修飾獲得的衍生物、具有非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物和免疫粘附素的衍生物。如本文使用的，"宿主細胞"包括可以是或者已經(jīng)是本發(fā)明的載體的受體的單個細月包或細月包i咅養(yǎng)物。宿主細月包包4舌單個宿主細月包的后，并且由于自然、意外或有意突變和/或變^b,該后^不一定與原始親代細胞是完全相同的(在形態(tài)上或在總DNA組(DNAcomplement)上)。如本文使用的，"配體"是指共價或瞬時地特異性結(jié)合至諸如多肽的分子的任何分子或試劑或化合物。當在某一上下文中使用時，配體可以包括抗體。在其他上下文中，"配體"可以是指能夠以高親和力結(jié)合到另一分子的分子，如在配體i秀捕(trap)中。如本文〗吏用的，用于治療目的的"哺乳動物"是指歸類為哺乳動物的4壬4可動物，包括人類、家養(yǎng)和農(nóng)場動物、以及動物園、運動場的或?qū)櫸飫游?，如狗、貓、牛、馬、羊、豬等。優(yōu)選地，哺乳動物是人類。如本文使用的，"藥用載體和/或稀釋劑"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層抗細菌和抗真菌劑、等;參和吸收延遲試劑等。為了藥學活性物質(zhì)使用這樣的介質(zhì)和試劑在本領域是熟知的。除非任何傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑與活性成分不相容的情況，它們在治療組合物中的4吏用均考慮在內(nèi)。輔助活性成分也可以并入到這些組合物中。將非腸道組合物配制成劑量單位形式(單位劑型)對于纟合藥的方便和劑量的一致性是特別有利的。如本文使用的，劑量單位形式是指適合作為用于待治療哺乳動物對象的單一劑量的物理分散單位；每個單位包含計算的預定量的活性材料以產(chǎn)生與所需藥學載體相關的期望療效。對本發(fā)明的劑量單位形式的說明專用于和直接依賴于(a)活性材料的獨特特性和要實現(xiàn)的特定療效；以及(b)在配制這樣的活性材料用于治療其中身體健康受損的患有疾病病癥的活體對象的疾病治療的4頁i或中本身的局限性。為了方便和有效給藥，主要活性成分以有效量與合適藥用載體配制成劑量單位形式。單位劑量形式可以例如包含在0.5(ag至約2000mg范圍內(nèi)的量的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物通常以約0.5|ag/ml載體的量存在。在包含輔助活性成分的組合物的情況下，劑量通過參考所述成分給藥的常規(guī)劑量和方式來確定。如本文^f吏用的，'4羊品"或"生物^^羊品"是指其最寬意義，并且包凌舌/人個體、體液、纟田月包系、組織i咅養(yǎng)物、或可以包含嵌合Angl結(jié)合因子的其他來源獲得的任何生物樣品，取決于要實施的領，定的類型。如指出的，生物才羊品包4舌體、液，如斗青、液、、淋巴液、血清、血漿、尿液、滑液、脊髓液等。用于從哺乳動物獲得組織活檢和體液的方法在本領域是熟知的。如本文使用的，"對象"是脊推動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類。如本文使用的，"同時"或"同日于地"結(jié)合是指DAAP蛋白同時與兩種或更多種指定蛋白(如果這些蛋白可以結(jié)合)的結(jié)合。如本文使用的，"治療"是一種用于荻得有益或期望臨床結(jié)果的方式。對于本發(fā)明的目的而言，有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀減輕、疾病程度消除、疾病穩(wěn)、定(即沒有惡化)狀態(tài)、疾病進展的延遲或減'ft、疾病a犬態(tài)的減輕或纟爰和、以及減退(部分或全部)，無論是可檢測到的或不可^r測到的。"治療"也可以是指相比于沒有4妻受治療的預期存活而延長了存活。"治療，，是指治療性治療和預防或防止性4晉施。需要治療的對象是那些已經(jīng)患有該病癥以及要預防該病癥的對象。相比于沒有治療的情形，"緩和，，疾病是指疾病狀態(tài)的程度和/或不期望的臨床表現(xiàn)被減輕和/或進展的時間期被減慢或拉長。如本文4吏用的，"載體"、"多核苷酸載體"、"構(gòu)建體"和"多核苷酸構(gòu)建體"在本文中可互換使用。本發(fā)明的多核普酸載體可以為多種形式中的任一種，包括但不限于RNA、DNA、封裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒包衣中的RNA、封裝在腺病毒包衣中的DNA、包入另一病毒或病毒樣形式(如單純皰滲病毒，和腺病毒結(jié)構(gòu)，如聚酰胺)中的DNA。炎'l!ijfiL管發(fā)生康和疾病中的重要過程。炎性疾病(如風濕性關節(jié)炎、脊推關節(jié)病、4艮屑病、糖尿病-見網(wǎng)膜病變、動月永粥樣石更化)中的血管發(fā)生的永存可以有利于炎性細胞侵入病理區(qū)域。這些與永存血管發(fā)生相關的病癥被認為是"炎性血管發(fā)生"疾病。多種血管發(fā)生遞質(zhì)，包括生長因子、細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、基質(zhì)大分子、細胞粘附受體、趨化因子和趨化因子受體，已經(jīng)與炎性血管發(fā)生有關。在炎性組織中存在一種調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，其涉及血管發(fā)生的上調(diào)或下調(diào)(Lainer-CarrandBrahnNatureClinicalPracticeRheumatology3,434-442,2007)。炎性血管發(fā)生的開始和擴增可能根據(jù)以下順序發(fā)生(1)不同刺激物(自身免疫反應，急性和慢性炎癥，急性和慢性缺氧、肺瘤細胞增殖、壞死和凋亡)引起固有巨噬細胞和其他巨p塞細胞激活，從而引起促炎性遞質(zhì)釋放；(2)這些巨噬細胞來源因子激活內(nèi)皮細胞乂人而產(chǎn)生粘附分子、趨化因子和細胞因子；(3)來自活化內(nèi)皮的粘附分子和可;容因子募集并刺激循環(huán)的巨嗟細胞，由此增加反應性細胞的量；(4)組織重建(重構(gòu))的活化巨噬細胞反過來又釋放可溶性因子，該可溶性因子促進內(nèi)皮細胞向外生長和遷移以形成新血管。巨噬細月包來源血管發(fā)生刺激物的效力必需達到"臨界量"，因此，步驟(4)僅在另外的巨噬細胞募集之后才是可能的。生長因子和細胞因子可以制備期望被同時結(jié)合的任何生長因子和細胞因子，包括對疾病進展具有相似作用的那些因子。本發(fā)明涵蓋的生長因子和細胞因子包4舌^f旦不限于VEGF-A、EGF-B、VEGF-C、VEGF-D、P1GF、PDGF、血管生成素-1、血管生成素-2、血管生成素-3、血管生成素-4、HGF、EGF、FGF、TNF-a、白介素腳lf3、白介素畫6、白介素-12、TGF-p、RANKL等。用于結(jié)合至生長因子和細胞因子的融合多肽候選物在實施本發(fā)明中，可以^吏用制備融合多肽的一種方法，涉及以下用于選4^性地制備融合多肽的標準。用于對疾病進展具有相似效應的兩種或更多種生長因子的不同受體的結(jié)合區(qū)i或，可以連4妄在一起以同時阻斷兩個、三個或多個生長因子的作用。新型融合多肽候選物可以對它們的同時結(jié)合親和力進行篩選并且在結(jié)合生長因子和細胞因子的任意組合上對中和針對生長因子和細胞因子活性進4亍測試。例如，VEGF-A和TNF-ot;VEGF-A和白介素-l(3;VEGF-A和VEGF-C;VEGF-C和血管生成素；VEGF畫C和TNF-a;TNF畫a和血管生成素；以及VEGF-C和HGF?？梢孕纬伞度?，可生長因子的<壬意組合并才艮據(jù)本發(fā)明加以使用。這些組合可以應用于三次或多次結(jié)合至三個或更多個生長因子，而不限于本文所列出的雙重阻斷。核酸構(gòu)建體還提供了一種表達載體，其包含如本文所描述的本發(fā)明的核臥復分子，其中該核酸分子可才喿作地連4妾至表達控制序列。還才是供了一種用于生產(chǎn)融合多肽的宿主-載體系統(tǒng)，其包含本發(fā)明的表達栽體，該表達載體已被引入到適合該融合多肽表達的宿主細胞中。適合的宿主細胞可以是細菌細胞如大腸桿菌、酵母菌細胞如畢赤酵母(i^c/n'a/09toh51)、昆蟲纟田月包3口草；也貪夜蟲我(5^odo/7/en2女wgz》enia)、或哺乳動物細胞如COS或CHO細胞。本發(fā)明還才是供用于生產(chǎn)本發(fā)明的融合多肽的方法，通過在允i午生產(chǎn)融合多肽的條件下生長本文所描述的宿主-載體系統(tǒng)的細J包，以及回收所生產(chǎn)的融合多肽。對于實現(xiàn)本發(fā)明有用的融合多肽可以通過在原核或真核表達系統(tǒng)中的表達進行制備。重組基因可以被表達并且多肽利用任意多種方法進行純化。基因可以一皮亞克隆入細菌表達載體例如不限于pZErO中。融合多月太可以通過允i午隨后形成一種穩(wěn)、定的生物學活性蛋白的任何-技術進行純化。例如^f旦不限于，這些因子可以/人細胞作為可溶性蛋白或作為包涵體(乂人其中可以才是取8M胍鹽酸鹽)回收并透析。為了進一步純化這些因子，可以使用任意多種純化方法，包括但不限于傳統(tǒng)的離子交換色譜、親和色語、不同糖色語、疏水性相互作用色i普、反相色i普或凌是力交過濾。當在本文中使用時，融合多肽包括功能性等^f介分子，其中在該序列內(nèi)氨基酸殘基^皮殘基耳又^，導致一種沉默或{呆守改變。例如，該序列內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以;故類似極性的另一氨基酸(其充當功能等《介物)所耳又,導致一種沉默或《呆守變化。對于該序列內(nèi)的氨基酸的取代可以選自該氨基酸所屬種類的其他成員。例23如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性天然氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是它們的表現(xiàn)出相同或類似生物學活性的蛋白或片l殳或個;亍生物以及在翻譯過程中或之后被差異修飾，例如通過糖基化、蛋白質(zhì)水解切割、鍵接至抗體分子或其他細胞配體等的衍生物。表達本發(fā)明融合多肽的細胞通過例如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導、電穿孔或微注射4支術一皮遺傳改造以生產(chǎn)所述融合多肽。另外，本發(fā)明考慮了標記形式的本文描述的融合多肽的用途。利用恰當轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號和蛋白編碼序列，可以使用本領域技術人員已知的用于將DNA片段插入到載體中的任何方法來構(gòu)建編石馬本發(fā)明的融合多月太的表達載體。這些方法可以包4舌體外重^LDNA和合成^支術以及體內(nèi)重組(遺傳重組)。編碼本發(fā)明融合多肽的核酸序列的表達可以通過第二核酸序列加以調(diào)控，以〗吏該融合多肽在利用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中表達。例如，本文中描述的融合多肽的表達可以通過本領域已知的任何啟動/增強元件加以控制?？梢杂脕砜刂迫诤隙嚯牡谋磉_的啟動子包括但不限于如在Squinto等(1991,Cell65:1-20)中描述的長末端重復序列；SV40早期啟動子區(qū)i或(BemoistandChambon，1981,Nature290:304-310);CMV啟動子，M-MuLV5，末端重復序列，包含在Rous肉瘤病毒的3'長末端重復序列中的啟動子(Yamamoto,etal.，1980,Cell22:787-797),皰瘠胸普激酶啟動子(Wagneretal.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:144-1445)，金屬石克蛋白基因的調(diào)控序列(Brinsteretal"1982,Nature296:39-42);原核表達載體如|3-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff,etal.,1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731),或tac啟動子(DeBoer，etal"1983,Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25),還參見"Useflilproteinsfromrecombinantbacteria"inScientificAmerican,1980,242:74-94;來自酵母菌或其他真菌的啟動子元件如Gal4啟動子，ADH(醇脫氪酶)啟動子，PGK(磷酸甘油激酶)啟動子，堿性磷酸酶啟動子，以及以下動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，其表現(xiàn)出組織特異性并且已在轉(zhuǎn)基因動物中利用彈性蛋白酶I基因控制區(qū)域，其在胰腺腺細胞中是有活性的(Swiftetal.,1984,Cell38:639-646;Omitzetal"1986,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50:399-409;MacDonald，1987,Hepatology7:425-515);胰島素基因控制區(qū)域，其在胰腺(3細胞中是活性的(Hanahan，1985,Nature315:115-122)，免疫球蛋白基因控制區(qū)域，其在淋巴細胞中是活性的(Grosschedletal.，1984,Cell38:647-658;Adamesetal"1985,Nature318:533-538;Alexanderetal"1987,Mol.Cell.Biol.7:1436-1444),小鼠乳腺瘤病毒控制區(qū)域，其在睪丸、乳房、淋巴纟田月包禾口月巴大纟田月包中是5舌'〖生的(Lederetal"1986,Cell45:485—495),白蛋白基因控制區(qū)域，其在肝中是活性的(Pinkertetal.,1987,GenesandDevel.1:268-276)，a-胎蛋白基因控制區(qū)域，其在肝中是活性的(Krunilaufetal"1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648;Hammeretal"1987，Science235:53-58);a1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)域，其在肝中是活寸生的(Kelseyetal.,1987,GenesandDevel.1:161-171)，(3-球蛋白基因控制區(qū)域，其在髓系細胞中是活性的(Mogrametal.,1985,Nature315:338-340;Kolliasetal"1986，Cell46:89-94);髓鞘堿蛋白基因控制區(qū)域，其在大腦的少突月交質(zhì)細胞中是活性的(Readheadetal"1987，Cell48:703-712);月/L球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)域，其在骨骼月幾中是活性的(Shani,1985，Nature314:283-286),以及促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)域，其在下丘腦中是活性的(Masonetal"1986,Science234:1372-1378)。因此，才艮據(jù)本發(fā)明，包含編碼如本文所述的融合多肽的核酸的能夠在細菌或真核宿主中被復制的表達載體，并且尤其是改性DAAP，被用來轉(zhuǎn)染宿主，由此指導這樣的核酸的表達以生產(chǎn)融合多肽，其然后可以以生物學活性形式回收。如本文使用的，生物活性形式包括能夠結(jié)合至相關受體并引起分化功能和/或影響表達該受體的細力包表型的形式。這樣的生物學活性形式例如將阻斷VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和Tie2受體的磷酸化作用，或者抑制細力包DNA的合成。含有核酸插入物的表達載體可以通過^f旦不限于至少三種主要方式加以鑒定(a)DNA-DNA雜交；(b)受否有"標記，，基因功能；以及(c)插入序列的表達。在第一種方式中，插入表達載體中的外來核酸的存在可以利用#1針(包含與插入的核酸序列同源的序列)通過DNA-DNA雜交進行檢測。在第二種方式中，重組載體/宿主系統(tǒng)可以基于是否有通過在該載體中插入外來核酸序列所引起的某些"標記"基因功能(例如胸香激酶活性，對抗生素的抗性，轉(zhuǎn)化表型，在桿狀病毒中包涵體形成等)而進行鑒定和選擇。例如，如果e/7核酸序列插入到載體的標記基因序列內(nèi)，則含有該插入物的重組體可以通過沒有該標記基因功能而進4亍鑒定。在第三種方式中，重組表達載體可以通過測定由該重組構(gòu)建體表達的外來核酸產(chǎn)品而鑒定。這樣的測定可以是基于例如感興趣的核酸產(chǎn)品的物理或功能特性，例如，通過配體與受體或其部分(該受體或其部分可以用例如可4企測抗體或其部分標i己)結(jié)合或結(jié)合至4十對感興趣蛋白產(chǎn)生的抗體或其部分。本發(fā)明的融合多肽，尤其是改性DAAP可以在宿主細胞中瞬時、組成性或永久地表達。本發(fā)明進一步4是供用于開發(fā)融合多肽作為用于治療患有涉及表達VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3或Tie2受體的細月包、組織或器官的病癥的患者的治療劑。這4羊的分子可以用于治療人類或動物體的方法中，或者用于i貪斷方法中。對于治療這些或其他疾病或病癥有用的有效劑量可以利用本領i或#支術人員已知的方法確定(參見例如Fingl,etal.,ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,GoodmanandGilman，eds.MacmillanPublishingCo,NewYork,pp.1-46(1975))。對于才艮才居本發(fā)明使用的藥物組合物包括上面所述的連接至載體或耙向分子(例如抗體、激素、生長因子等)在藥用液體、固體或半固體載體中的融合多肽和/或在體內(nèi)給藥之前并入到脂質(zhì)體、微膠嚢和控釋制劑中。例如，該藥用組合物可以包含在含水溶液，如無菌水、鹽水、磷酸緩沖液或葡聚糖溶液中的融合多肽?？商鎿Q地，活性劑可以包含在固體(例如石蠟)或半固體(例如凝月交態(tài))制劑(其可以才直入需要這樣的治療的患者體內(nèi))中。給藥途徑可以是本領域已知的任何纟合藥才莫式，包括f旦不限于省爭月永內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、子宮內(nèi)、注入涉及的組織中、動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、口服或通過植入的裝置。給藥可以導致本發(fā)明的活性劑在整個身體或局部區(qū)域分布。例如，在涉及神經(jīng)系統(tǒng)的遠端區(qū)域的一些情況下，藥劑的靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)纟合藥是期望的。在一些情況下，含有活性試劑的才直入物可以置于病變區(qū)域中或病變區(qū)域附近。合適的植入物包括^f旦不限于凝月交海綿、石蠟、噴霧劑或纟鼓粒基纟直入物。本發(fā)明還4是供包含本文所述融合多肽的藥物《且合物。該組合物可以系統(tǒng)或局部給藥?？梢?吏用本領域已知的4壬何合適的給藥才莫式，包括但不限于靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、皮下、腹膜內(nèi)、或通過局部注射或手術才直入物。還才是供ll釋制劑。基因療法在一個特定實施方式中，通過基因療法給予包含編碼嵌合Angl多肽的序列的核酸以防止血管滲漏，并且用于治療血管發(fā)生?；虔煼ㄊ侵竿ㄟ^纟合予對象一種表達或可表達的核酸而實施的療法。在本發(fā)明的實施方式中，核酸產(chǎn)生它們編碼的介導治療效果的蛋白。根據(jù)本發(fā)明可以利用本領域可獲得的用于基因療法的任何方法。示例性方法描述如下。對于基因療法的方法的斗既述，參見Goldspieletal.,ClinicalPharmacy12:488-505(1993),WuandWu,Biotherapy3:87-95(1991)、Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)、Mulligan,Science260:926-932(1993)、以及MorganandAnderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);May,TIBTECH11(5):155-215(1993)?？梢?吏用的本4頁i或通常已知的的重組DNA4支術的方；去4苗述在Ausubeletal.(eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993);andKriegler,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990)中。一個優(yōu)選的方面，核S吏序列可以編碼嵌合-Angl或Tie2多肽，其中該核g吏序列是在合適宿主中表達該多肽的表達載體的部分。尤其是，這樣的核酸序列具有可才喿作地連4妄至多肽編碼區(qū)i或的啟動子，所述啟動子是可i秀導的或組成性的，并且可選地是組織特異性的。在另一特定實施方式中，4吏用核酸分子，其中多肽編碼序列和任何其他期望序列在側(cè)面與促進基因組中的期望部位的同源性重組的區(qū)i或相4妄，由此l是供用于編碼核酸的抗體的染色體內(nèi)表達(KollerandSmithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935(1989);Zijlstraetal"Nature342:435-438(9))。這些核酸遞送到患者體內(nèi)可以是直接的，在這種情況下，患者直接暴露于這些核酸或攜帶核酸的載體，或者是間接的，在這種情況下，細胞首先利用核酸體外轉(zhuǎn)化，然后植入患者。這兩種方式分別^^稱為體內(nèi)基因療法或回體基因療法。在一個特定實施方式中，核酸序列直4妄體內(nèi)給予，在此該核酸序列表達而產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可以通過本領域已知的多種方法中的任一種完成，例如通過將它們作為恰當核酸表達載體的一部分進行構(gòu)建并給予它們，以4吏它們在細胞內(nèi)，例如通過利用缺陷或弱化逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體，或者通過直接注射4果露DNA、或具有脂質(zhì)或細胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑的涂層，脂質(zhì)體中的嚢化、微粒、或微膠嚢，或者通過將它們鍵接至已知進入核的肽而給予，通過將其鍵接至經(jīng)歷受體介導的胞吞作用的配體而進行給予(參見例如WuandWu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))(其可以用來輩巴向特異性表達該受體的細^^型)等。在另一實施方式中，可以形成核酸-酉己體復合體，其中該配體包含基因融合病毒月太以石皮壞內(nèi)涵體，4吏該核酸可以避免溶酶體降解。在又一個實施方式中，核酸可以通過靶向特定受體而在體內(nèi)被靶向用于細胞特異性攝取和表達?？商鎿Q地，核S史可以引入到細胞內(nèi)并通過同源性重組整合到宿主細胞DNA中用于表達(KollerandSmithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935(1989》Zijlstraetal.，Nature342:435-438(1989))。在一個特定實施方式中，使用含有編碼所述多月太的核S臾序列的病毒載體。將用于基因療法的編碼多肽的核酸序列克隆入一個或多個載體中，這有利于基因遞送到患者。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒是可以使用的病毒載體的實例。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有對病毒基因組正確包裝和整合到宿主細胞DNA中所需的部分。腺病毒對于將基因遞送至呼吸上皮是特別具有吸引力的J某介物，因為它們自然感染呼吸上皮并引起中度疾病。用于腺病毒基遞送系統(tǒng)的其他耙標是肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞、和肌肉。&泉病毒具有能夠感染不分裂細胞的優(yōu)點。另外，腺相關病毒(AAV)也已^是出用于基因療法?；虔煼ǖ牧硪环N方式涉及通過諸如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸4丐介導的轉(zhuǎn)染或病毒感染的方法將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)的細胞中。通常，轉(zhuǎn)移的方法包括將可選擇標記物轉(zhuǎn)移到這些細胞中。然后將這些細胞進行選擇以分離那些已攝取并且表達該被轉(zhuǎn)移基因的纟田月包。這些細胞然后一皮遞送至患者。在該實施方式中，在體內(nèi)給予所得到的重組細胞之前，將核酸虧1入到細月包中。這才羊的？1入可以通過本領i或已知的4壬4可方法實施，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、利用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體的感染、細胞融合、染色體介導的基因轉(zhuǎn)移、微細胞介導的基因轉(zhuǎn)移、質(zhì)體融合等。對于將外來基因引入到細胞中在本領域已知有大量技術并且可以依照本發(fā)明〗吏用，4叚定不會破壞受體細月包的必要生長和生理功能。該4支術應該向該細力包l是供核酸的穩(wěn).定轉(zhuǎn)是可繼K的和可表達的。其中可以引入用于基因療法的核酸的細胞涵蓋任何期望的可利用的細胞類型，并且包括但不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角蛋白細月包、成纖維細月包、月幾肉細月包、肝纟田月包；血細月包3口T-淋巴細月包、B-淋巴細胞、單核細胞、巨嗟細胞、中性粒細月包、嗜酸性粒細胞、巨牙亥細月包、沖立纟田月包；各種干細月包或牙且細月包，例^^cr乂人骨ft、臍帶血、外周血、胎兒肝等獲得那些造血干細"包或纟且細月包。在一個優(yōu)選實施方式中，用于基因療法的細胞與患者是自體同源的。30在重組細胞一皮用于基因療法的一個實施方式中，編碼多肽的核酸序列被引入到細胞中，以使它們通過這些細胞或它們的后代是可表達的，并且這些重組細月包然后體內(nèi)給予用于治療效果。在一個特定實施方式中，4吏用干細胞或祖細胞?？梢泽w外分離和保持的任何干細胞和/或祖細胞都可潛在地依照本發(fā)明的實施方式^f吏用。在一個特定實施方式中，待引入用于基因療法目的的核酸包含可才喿作地連接至編碼區(qū)域的可請導啟動子，以使該核酸的表達通過控制是否存在合適的轉(zhuǎn)錄誘導子而是可控制的。治療組合物在一個實施方式中，本發(fā)明涉及以血管-參漏或在夬少血管形成為特征的各種疾病的治療。在這種方式中，本發(fā)明的治療化合物通過提供激活Tie2的化合物，可以給予患有或易于患有該疾病的人類患者。治療化合物的配制在本領域通常是已知的并且可以方<更地參考Remington'sPharmaceuticalSciences,17thed.，MackPublishingCo.,Easton，Pa.,USA。例如，可以纟合予/人約0.05}xg至約20mg/kg體重/天。劑量方案可以調(diào)整以l是供最佳治療效果。例如，可以每天多次分開給藥或者劑量可以根據(jù)治療情形的緊急程度指示而4安比例減少。活性化合物可以以方便方式給予，如口服、靜脈內(nèi)(其中是水溶性的)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)或才全劑^各徑，或才直入(例如使用緩釋分子，通過腹膜內(nèi)路徑，或通過使用細胞例如體外敏化且選擇性地轉(zhuǎn)移至受體的單核細胞或樹突細胞)。取決于給藥路徑，肽可能需要包覆一種材料以保護其不受酶、酸和可能4吏所述成分失活的其^也天然條件的作用。例如，肽的低親脂性使它們在胃腸道中被能夠切割肽鍵的酶破壞以及在胃中^皮酸水解而石皮壞。為了通過不是腸胃外給藥而纟會予肽，它們用一種材料涂覆或與一種材料一起給予，以防止其失活。例如，肽可以在佐劑中給予，與酶抑制劑一起給藥或在脂質(zhì)體中給予。本文考慮的佐劑包括間苯二酚、非離子型表面活性劑如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑，二異丙基氟磷酸(DEP)和特斯樂(trasylol)。脂質(zhì)體包括水包油包水CGF乳液以及傳統(tǒng)脂質(zhì)體?；钚曰衔镆部梢阅c胃外或腹膜內(nèi)給藥。分散液也可以在甘油液體聚乙二醇和它們的混合物以及油中制備。在通常儲存和使用的條件下，這些制劑包含用來防止樣i生物生長的防腐劑。適合可注射用途的藥物形式包括無菌含水溶液(其中是水溶性的)或分散液以及用于臨時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，所述形式必須是無菌的并且必須存在達到易于注射程度的流體。它在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的并且必須防止孩t生物如細菌和真菌的污染。載體可以是i^劑或含有例如水、乙醇、多醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的分散介質(zhì)、它們的合適混合物、以及4直物油。合適的流動'I"生可以例3。通過4吏用》余層如卵》粦脂、在分散液和利用表面活性劑的情況下通過〗呆持所需的粒徑而保持。纟敬生物作用的防止可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑產(chǎn)生，例如三氯^又丁醇、苯酚、沆壞血酸、石克柳汞(theomersal)等。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲試劑，例如糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可以通過在組合物中^f吏用延遲吸收例如單石更脂酸鋁禾口明"交而產(chǎn)生。無菌可注射溶液通過在恰當溶劑中并入所需量的活性化合物與根據(jù)需要的上述各種其他成分，進行過濾無菌處理而制備。通常，分散液通過將各種無菌活性成分并入到無菌纟某介物中而制備，該4某介物含有基礎分散基質(zhì)和來自上述列舉的所需其他成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，其產(chǎn)生活性成分和來自其之前無菌過濾的溶液的任何另外需要的成分的粉末。當肽如上所述被合適保護時，活性化合物可以口服給予，例如與惰性稀釋劑或與可吸收的可食用載體一起，或者它可以包封在硬或軟外殼明膠膠嚢中，或者它可以壓縮成片劑，或者它可以直接摻入到食用的食物中。對于口服治療給藥，活性化合物可以與賦形劑整合并以可消化片劑、含片、糖錠、膠嚢、酏劑、懸浮液、糖漿、晶片紙等形式使用。這樣的組合物和制劑應含有至少1%重量的活性化合物。當然，組合物和制劑的百分凄t可以變化并且可以Y更利地在單位的約5%至約80%重量之間。在這樣的治療用的組合物中的活性化合物的量是使得可以獲得合適的劑量。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的組合物或制劑被制備成使得口服劑量單位形式含有約O.l昭至2000mg的活性化合物。片劑、丸劑、膠嚢等也可以含有以下成分粘結(jié)劑如黃蓍樹膠、洋槐樹力交、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鉤；崩解劑如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；以及甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精可以加入或增味劑如薄荷油、冬青樹油、或一嬰桃風p未劑。當劑量單位形式是膠嚢時，除了上述類型的材料外，它可以含有液單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠嚢可以涂覆有蟲膠、糖或二者均有。糖漿或酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥苯曱酸甲酯和對羥苯曱酸丙酯、染^牛和增，味劑如草莓或桔子口p未。當然，在制備任何給藥單位形式中使用的任何材料應是藥物純并且在采用的量上基本上是無毒的。另外，活性化合物可以并入到緩釋制劑和配方中。遞送系統(tǒng)各種遞送系統(tǒng)是已知的并且可以用來給予本發(fā)明的化合物，例如嚢化在脂質(zhì)體、微粒、微膠嚢中，能夠表達該化合物的重組細胞、受體介導的J包吞、核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體的一部分構(gòu)建等。引入的方法包括^f旦不限于真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、石更月莫外以及口月良^各徑。這些化合物或組合物可以通過4壬4可方侵J各徑《合予，例3。通過灌注或4,注、通過上皮或內(nèi)^H"粘月莫(例如口腔粘膜、直腸和小腸粘膜等)吸收，并且可以與其他生物學活性劑一起給予。給藥可以是全身性或局部的。另外，可以期望將本發(fā)明的藥物化合物或組合物通過任何合適路徑引入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可以通過心室內(nèi)導管實現(xiàn)，例如附著至貯器如奧瑪耶貯器(Ommayareservoir)。月申部纟會藥也可以采用，例如通過利用吸入器或噴霧器，以及具有霧4匕劑的制劑。在一個特定實施方式中，可能期望將本發(fā)明的藥物化合物或組合物給予到需要治療的區(qū)域；這可以例如但不限于通過在手術期間的局部灌注、局部涂覆例如聯(lián)合術后的傷口敷料，通過注射，借助于導管，借助于栓劑，或借助于植入，所述植入是多孔、無孔、或明膠狀材料，包括膜，如硅橡膠膜或纖維。優(yōu)選地，當給予蛋白，包括本發(fā)明的抗體或肽時，必須小心使用蛋白不吸收的材料。在另一個實施方式中，該4匕合物或組合物可以在嚢泡中尤其是在脂質(zhì)體中遞送。在又一個實施方式中，該4匕合物或組合物可以在控釋系統(tǒng)中遞送。在一個實施方式中，可以4吏用泵。在另一個實施方式中，可以使用聚合物材料。在又一個實施方式中，控釋系統(tǒng)可以置于治療靶標附近，由此僅需要全身性給藥劑量的一部分。34標記合適的酶標記包括例如來自氧化酶類的那些，其通過與底物反應而催化生成過氧化氫。葡萄糖氧化酶是特別優(yōu)選的，因為它具有良好的穩(wěn)定性并且其底物(葡萄糖)易于獲得。氧化酶標記的活性可以通過才企測通過酶標記的抗體/底物反應形成的過氧化氫的濃度而測定。除了酶，其他合適的標記包括》文射性同位素，如;典(1251、1211)、碳(14C)、硫(35S)、氖(3H)、銦(112In)和锝(99mTc)，以及熒光才示i己，如熒光素和羅丹明、以及生物素。對于本發(fā)明的嵌合Angl、Tie2或嵌合Angl/Tie2復合物特異性抗體的其他合適標記在以下提供。合適酶標記的實例包括蘋果酸脫氫酶、5-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母-S孚脫氬酶、(x-甘油^粦酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、過氧化物酶、石成性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、p-半乳^唐苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰月旦石威酯酶。合適的放射性同位素標記的實例包括311、mIn、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、9°Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、，Pd等。min是優(yōu)選的同位素，其中使用體內(nèi)成像，因其避免了1251或1311標記的多肽被肝去卣化的問題。另夕卜，這種》文射性核苷酸對于成^象具有更有利的y輻射能量。例如，偶聯(lián)于具有l(wèi)-(P-異硫氰基千基)-DPTA的單克隆抗體的min在非肺瘤組織中表現(xiàn)出很少的攝取，尤其肝，因此增強腫瘤定位的特異性。合適的非放射活性同位素標記的實例包括^Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。合適熒光標記的實例包括152Eu標記、熒光素標記、異碌u氰酸酯標記、羅丹明標記、藻紅蛋白標記、藻青蛋白標i己、百藻藍蛋白才示i己、4卩苯二醛才示i己禾口熒光胺才示i己。合適毒素標記的實例包括假單胞菌毒素、白喉毒素、蓖麻蛋白和霍亂毒素。4b學發(fā)光標i己的實例包4舌苯巴比妥標記、異苯巴比妥才示i己(isoluminallabel)、芳力矣吖"定酯標i己、口米口坐標i己、吖口定鹽才示i己、草酸酯標記、螢光素標i己、螢光素酶標i己和水母發(fā)光蛋白標i己。核》茲共振造影劑的實例包括重金屬核如Gd、Mn和鐵。也可以使用氘。對于EPR、PET或其他成像機制還存在其他造影劑，它們對于本領域技術人員來說是已知的。用于將上述標記結(jié)合至多肽的常用4支術由Kennedyetal.(1976)Clin.Chim.Acta70:1-31，andSchursetal.(1977)Clin.Chim.Acta81:1-40提供。偶聯(lián)技術包括戊二醛方法、高硪酸鹽方法、二馬來酰亞胺方法、間-馬來酰千基-N-羥基-琥珀酰亞胺酯方法，所有這些方法并入本文作為參考。實施例實施例l一實驗方案編碼由人類Tie2的Ig-樣結(jié)構(gòu)域1、人類Tie2的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2、人類Tie2的三個EGF-樣結(jié)構(gòu)域、人類VEGFR1的Ig-樣結(jié)構(gòu)域和人類IgG的Fc結(jié)構(gòu)i或構(gòu)成的四種不同組裝融合蛋白(DAAP#1,DAAP#2，DAAP#3和DAAP#4)(圖3A和3B)的基因構(gòu)建體被克隆入pCMV-dhfr載體中(HwangSJ,etal"ProteinExpressPurif.2005;39:175-183)(圖4)。由于l又DAAP#1展示同時結(jié)合至VEGF-A和Ang2,所以進一步制備編碼能夠結(jié)合至VEGF-A和Ang2的DAAP#1基因構(gòu)建體的7種i奮飾形式(DAAP#11，DAAP#12,DAAP#13，DAAP#13,DAAP#14，DAAp#15,DAAP#16和DAAP#17)(圖5和圖6)。所有DAAP重組蛋白才艮才居制造商i兌明書(Qiagen,Inc.,Hilden，Germany)利用Effectene脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染通過在HEK293細胞(美國典型微生物培養(yǎng)保藏中心，弗吉尼亞州馬納薩斯)中的瞬時表達而獲得。上清液收集自自48-96小時后的轉(zhuǎn)染細胞。重組蛋白利用蛋白-A瓊脂親和層碎斤，隨后酸洗脫和中和進4亍純化。在純^b后，該蛋白利用Bradford實-驗定量并利用SDS-PAGE凝力交的考馬斯藍染色加以確認。對于蛋白質(zhì)印跡分析，lOOng每個樣品與樣品《爰沖液混合，熱變性10min,在10。/。SDS-PAGE上跑帶，并在硝基纖維素力莫上進4亍電印跡(electro-blotted)。該月莫用在含有0.05%TritonX-100的Tris-IC沖液(50mMTris,100mMNaCl，pH7.5)中的5%脫脂奶佳于閉，并利用l束才艮過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichA0170)進行蛋白質(zhì)印跡，以4全測Fc融合的蛋白。利用化學熒光掃描4義(LAS-1000,FujiFilm,Tokyo),才艮據(jù)制造商方案(AmershamPharmaciaBiotech)通過4匕學發(fā)光才全測^/f言號可^L化(圖7)。DAAP重組蛋白與VEGF-A或Ang2的結(jié)合能力通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)進行才企測(圖8和圖9)。在100pl石舞酸緩沖鹽水(PBS)中的200ngVEGF-A165(乂人CHO細月包產(chǎn)生)(下文稱為VEGF-A)或Ang2(/人CHO細月包產(chǎn)生)等分到96孑Ul中并在4。C孵育過夜。在用每400(xlPBS清洗并反3次之后，利用封閉溶液(在100(alPBS中的1%牛血清白蛋白(BSA))在370C實施封閉2小時。將在100pi去于閉液中的100ng每個DAAP蛋白加入到該^反中，并在37QC孵育2小時。加入相同量的VEGF-Trap(Holash，J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A99:11393-11398)、Tie2畫Fc或Fc重組蛋白并以相同方式作為陽性和陰性對照孵育。在每次用400ialPBS清洗板3次之后，將50plf束才艮過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichA0170)力口入到該氺反中，并在37QC孵育2小時。在用每400(xlPBS清洗板3次之后，4奪50pl3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液(Sigma-AldrichT0440)加入到該^反中，并在室溫下孵育10min。通過加入50pl的1MHC1<吏反應終止并且反應顏色通過ELISA讀凄t器(BioRadM680)在光學密度415nm處進行分析。才艮才居之前4笛述的方、^:(HwangSJ,etal.，ProteinExpressPurif.2005;39:175-183)建立表達VEGF-Trap的重組中華倉鼠卵巢(rCHO)細胞(CHO-VT1)。簡而言之，CHO-VT1細胞通過含有二氫葉酸還原酶(dhfr)和VEGF-trap(HolashJ.etal.,PNAS99:11393-11398,2002)基因的載體轉(zhuǎn)染到dhfr缺陷型CHO細胞中而建立(CRL-9096,美國典型樣i生物培養(yǎng)收藏中心，弗吉尼亞州馬納薩斯)。這之后是dhfr/曱胺喋呤(MTX)介導的基因擴增。分泌VEGF-trap的三種穩(wěn)定rCHO細胞利用按順序遞增濃度的MTX(0.02-1.0(xM，Sigma-Aldrich)進4亍選4奪。在它們之中，選擇表達最高量的VEGF-trap的一個細胞系并稱為"CHO-VTl"。CHO-VT1纟田月包在》真力口了5%透才斤月臺牛血5青(Invitrogen，Carlsbad,California,USA)和1MTX(Sigma-Aldrich)的Iscove改性杜氏i咅養(yǎng)基(Iscove，smodifiedDulbecco，smedium)中生長和纟焦持。7寸于重纟且VEGF-trap蛋白生產(chǎn)，CHO-VTl細胞在370C下，在加濕的5%C02中，在1lOrpm的專九道4吝床(Vision,Bucheon，Korea)上，在容納由100ml培養(yǎng)基的250ml錐形并瓦中以2xl()5個細胞/mL進行4妄種。在指定天數(shù)之后，含有VEGF-trap重組蛋白的培養(yǎng)基通過利用蛋白-A瓊脂親和層析、酸洗脫和隨后的中和加以純4匕。在純化之后，蛋白利用Bmdford測定進行定量并利用SDS-PAGE凝月交的考馬斯藍染色加以確i人。分才斤表明，收集了大約10mg/L的VEGF-trap。實施例2ELISA分析表明，DAAP#1、DAAP#14、DAAP#16和DAAP#17能夠結(jié)合VEGF-A和Ang2(圖10)。DAAP#2、DAAP#3、DAAP#4、DAAP#11和Fc不負fe結(jié)合至VEGF-A和Ang2(圖10)。DAAP#12和VEGF-trap能夠優(yōu)先并選擇性地結(jié)合至VEGF-A,而DAAP#13和Tie2-Fc能夠優(yōu)先和選"^爭性第結(jié)合至VEGF-A(圖10)。因為DAAP#1和DAAP#14與VEGF-A和/或Ang2的結(jié)合能力與VEGF-trap或Tie2-Fc的相當，所以DAAP#1和DAAP#14可能是用于作為治療蛋白進一步開發(fā)的最強候選物。為了驗證DAAP重組蛋白是否能夠同時地結(jié)合至VEGF和Ang2,將lOOng每種DAAP重組蛋白(DAAP#1,DAAP#12，DAAP#13,DAAP#14,DAAP#15，DAAP#16和DAAP#17)，在它們加入到用于上述ELISA的用VEGF-A或Ang2涂覆的才反之前，在37。C、用在100(il去于閉液中的系歹'J量(Ong,10ng,100ng,1,000ng)的Ang2或VEGF-A予貞先孵育2小時。作為陽'I"生和陰'1"生只寸照，相同量的VEGF-trap、Tie2-Fc或Fc重纟且蛋白以相同方式利用系列量的Ang2或VEGF-A預先孵育。Ang2或VEGF-A的預先孵育占據(jù)DAAP蛋白與Ang2或VEGF-A的結(jié)合位點。在Ang2預先孵育中，DAAP#1、DAAP#12、DAAP#14、DAAP#16、DAAP#17和VEGF-trap能夠結(jié)合VEGF(圖11A)。相反，在VEGF預先孵育中，DAAP#1、DAAP#13、DAAP#14、DAAP#16、DAAP#17和Tie2-Fc育fe句多纟吉合Ang2(圖11B)。因:t匕，DAAP#1、DAAP#14、DAAP#16和DAAP#17能夠同時地結(jié)合VEGF-A和Ang2(圖12)。對于DAAP#1、DAAP#14、VEGF-trap和Tie2-Fc與VEGF-A和Ang2的結(jié)合能力的進一步分析，實施體外結(jié)合測定(圖13)。500ng每個DAAP#1、DAAP#14、VEGF-trap或Tie2-Fc在4°C,用在500pi含1.0%NonidetP-40的Tris-纟爰沖溶液(50mMTris100mM39NaCl,pHp.7.5)中的100ngFLAG-標i己的VEGF-A、FLAG畫才示記的Ang2、或VEGF-A和Ang2聘育2小時。然后，力口入20jal蛋白-A瓊脂J朱(Oncogene)并在4。C再孵育2小時。蛋白-A偶聯(lián)樣品用lml含1.0%NonidetP-40的Tris-緩沖溶液清洗3次。樣品用樣品纟爰沖液洗脫，并熱變性。4羊品通過10。/。SDS-PAGE分離，并在硝基纖維素膜上電印跡。膜用在含有0.05%TritonX-100的Tris-纟爰沖液(50mMTris，100mMNaCl，pH7.5)中的5%脫脂奶封閉，并利用辣才艮過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichA8592)進4亍蛋白質(zhì)印跡，以才全測結(jié)合的FLAG標i己的VEGF-A和FLAG標記的Ang2。利用化學焚光掃描儀(LAS-1000,FujiFilm,Tokyo)，沖艮才居弟寸造商方案(AmershamPharmaciaBiotech)通過化學發(fā)光才全測4吏信號可浮見化。體外結(jié)合表明，DAAP#1和DAAP弁14能夠同時結(jié)合至VEGF-A和Ang2(圖12、圖13A和13B)。VEGF-trap能夠結(jié)合至VEGF-A^f旦不能結(jié)合至Ang2(圖13C),而Tie2-Fc表現(xiàn)出與Ang2的結(jié)合^f旦沒有與VEGF-A的結(jié)合(圖13D)。實施例3基于上面的發(fā)現(xiàn)，對DAAP弁1進一步考察用作治療蛋白。表達DAAP#1的重組中華倉鼠卵巢(rCHO)細胞(CHO-DAAP#l)依照之前4笛述的方法建立(HwangSJ，etal.,ProteinExpressPurif.2005;39:175-183)。簡而言之，CHO-DAAP#l細胞通過將含有二氪葉酸還原酶(dhfr)和DAAP#1基因構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)染到dhfr缺陷型CHO細胞(CRL-9096,美國典型孩i生物培養(yǎng)保藏中心，弗吉尼亞州馬納薩斯)中而建立。這之后是dhfr/甲胺喋呤(MTX)介導的基因擴增。分泌DAAP弁1的穩(wěn)定rCHO細胞利用按順序擴增濃度的MTX(0.02-1.0jxM,Sigma-Aldrich)進4亍選才奪。只于于重組DAAP#1蛋白生產(chǎn)，CHO-DAAP#l細胞在37GC下，在加濕5%C02孵箱中，在llOrpm的專九道搖床(Vision,Bucheon，Korea)上，在容納有100ml40培養(yǎng)基的250ml錐形弁瓦中以2xl05個細胞/mL進行4妄種。在指定天數(shù)之后，含有DAAP#1重組蛋白的培養(yǎng)基通過利用蛋白-A瓊脂親和層片斤、酸洗脫和隨后的中和加以純j匕。在純化之后，DAAP#1的尺寸和二聚狀態(tài)通過SDS-PAGE和考馬斯藍染色在還原和非還原條件下進行檢測(圖14)。分析表明DAAP弁1是二聚體蛋白(150kDa)(圖14)。實施例4Fc、DAAP#1、VEGF-trap和Fc蛋白與VEGF國A和Ang2的結(jié)合能力利用ELISA方法進行4企測。對于VEGF-A結(jié)合，將96孔板每個孑L用在100piPBS中的200ngVEGF-A涂覆過夜。在用每次400(ilPBS清洗4反3次之后，該+反用在100filPBS中的1%牛血清白蛋白在37。C封閉2小時。在3次PBS清洗之后，不同的封閉液中DAAP弁1、Fc、VEGF-trap或Tie2-Fc蛋白的量(0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3nM)在37。C佳于閉2小時。在3次PBS清洗之后，將在封閉液中的50[il辣才艮過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichA0170)在37°C封閉2小時。在3次PBS清洗之后，向每個孔加入50(ilTMB溶液(Sigma-AldrichT0440)，并4奪該斧反在室溫下孵育10min。通過加入50jil的1MHC1^吏反應終止并且反應的顏色通過ELISA讀數(shù)器(BioRadM680)在光學密度415nm處進行分沖斤。對于Ang2結(jié)合，Ang2以上述相同方式涂覆并且DAAP#1、VEGF-trap和Fc蛋白與Ang2的結(jié)合能力也以上述相同方式進行4企測。對于結(jié)合能力的這些測定表明，DAAP#1與VEGF-A結(jié)合的Kd為5pM并且VEGF-trap與VEGF-A的結(jié)合Kd為lpM,而DAAP#1與Ang2結(jié)合的Kd為10nM并且Tie2-Fc與Ang2結(jié)合的Kd為50nM(圖15)。VEGF-trap與Ang2沒有結(jié)合，Tie2-Fc與VEGF-A沒有結(jié)合(圖15)。實施例5由于DAAP#1含有與VEGF-A和Ang2二者的結(jié)合位點，所以其對VEGF-A或Ang2的結(jié)合活性當DAAP#1的一個位點首先4皮Ang2或VEGF-A占據(jù)或預先占據(jù)時可能受其構(gòu)象變4匕的影響。為了測試DAAP#1的VEGF-A結(jié)合4立點凈皮VEGF-A預先占據(jù)是否影響Ang2結(jié)合能力，將重組DAAP弁l蛋白用增量(0，10,30100:300,1000ng/pl)的VEGF-A預先孵育，然后實施上述的結(jié)合Ang2的ELISA測定。相反i也，為了測試DAAP#1的Ang2結(jié)合位點當#皮Ang2預先占據(jù)時是否影響VEGF-A的結(jié)合能力，將重組DAAP弁1蛋白用增量(0,10，30100,300,1000ng/jul)的Ang2預先將育，然后實施上述的結(jié)合VEGF的ELISA測定。作為乂t照，S奪重組VEGF畫trap用增量(0，10，30100,300,1000ng/pl)的Ang2預先孵育，然后實施上述結(jié)合VEGF的ELISA測定。作為對照，將重組Tie2-Fc蛋白用i曾量(0，10,30100，300，1000ng/(al)的VEGF-A予貞先孵育，然后實施上述結(jié)合Ang2的ELISA測定。有趣地是，Ang2對DAAP弁1的預先占據(jù)增強了DAAP#1與VEGF-A的結(jié)合活性(圖16A)。另外，VEGF-A對DAAP幷1的預先占據(jù)增強了DAAP#1與Ang2的結(jié)合活性(圖16B)。相反，VEGF-A對DAAP#1的預先占據(jù)抑制VEGF-A與DAAP#1的進一步結(jié)合，并且Ang2對DAAP#1的預先占據(jù)抑制Ang2與DAAP#1的進一步結(jié)合(圖16)。三次重復實-驗表明類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，DAAP#1能夠同時;也結(jié)合VEGF-A和Ang2。實施例6為了進一步分析DAAP#1的結(jié)合能力，在多種VEGF和血管生成素蛋白(n=3)存在下實施通過下4立測定(pulldownassay)的體外結(jié)合(圖17)。每200ngFLAG標記的蛋白(人類VEGF-A165,小鼠VEGF-A164,人類VEGF-A189，人類VEGF-A121,人類VEGF-C，VEGF-E,人類Ang2,小鼠Ang2,人類Angl,人類Ang4和小鼠Angptl4)在4。C,用在500含有1.0%NonidetP-40的Tris畫纟爰沖液(50mMTris，100mMNaCl,pH7.5)中的500ngDAAP弁1、VEGF-trap和Tie2-Fc孵育2h。然后，加入20pl蛋白-A瓊脂玉朱(Oncogene)并4°C孵育另外2h。蛋白-A偶聯(lián)的樣品用lml含1.0%NonidetP-40的Tris-《爰沖液清洗3次，并熱變性。4羊品通過10%SDS-PAGE分離，并在硝基纖維素膜上電印跡。該膜用在含有0.05%TritonX-100的Tris-緩沖液中的5%脫脂奶封閉，并利用#束才艮過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的小鼠抗-FLAGM2抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichA8592)進行蛋白質(zhì)印跡。利用化學焚光掃描儀(LAS-1000,FujiFilm,Tokyo)，才艮才居制造商方案(AmershamPharmaciaBiotech)通過4匕學發(fā)光才企測佳j言號可#見4匕。在剝離后，該膜利用抗-Fcf束才艮過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichA0170)再次才企測DAAP、VEGF-trap和Tie2-Fc。DAAP#l能夠結(jié)合人類VEGF國A165、小鼠VEGF-A164、人類VEGF畫A189、人類VEGF國A121、人類Ang2、小鼠Ang2、人類Angl和人類Ang4,而VEGF-trap能夠結(jié)合人類VEGF-A165、小鼠VEGF-A164、人類VEGF-A189和人類VEGF-A121并且Tie2-Fc育巨句多纟吉合人類Ang2、小i鼠Ang2、人類Angl和人類Ang4(圖17)。圖18中示出了關于重組DAAP蛋白、含有Fc蛋白的VEGFR1的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2[VEGFR1(2)-Fc]、含有Fc蛋白的VEGFR1的Ig-樣結(jié)構(gòu)域2和3[VEGFR1(2-3)-Fc]、VEGF-trap和Tie2-Fc的理論pl值。實施例7一般地，更高的蛋白pl值與更高的胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)合相關。更高的蛋白ECM結(jié)合還與更低的藥代動力學性能相關。將ECM43涂4隻的96孔才反(BectonDickinsonCatNo.354607)利用封閉、液(在PBS中的1%BSA)在37°C孵育2小時，利用每次400jilPBS清;先3次。然后一奪在去于閉'液中的改變量(0、0.1、0.3、1.0、3.3、10、33、100ng)的每種DAAP重組蛋白加入到4反中，并在37。C孵育2小時(圖19)。在用每400piPBS清洗3次之后，S奪50|al辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma國AldrichA0170)加入到斧反中，并在37。C孵育2小時。在用每400nlPBS清洗才反3次之后，^j奪50piTMB;容'液(Sigma-AldrichT0440)力口入4反中，并將該4反在室溫下將育10min。通過加入50pi的1MHC1l吏反應終止并且反應的顏色通過EUSA讀凌史器(BioRadM680)在光學密度415nm處進行分析(圖19)。ECM結(jié)合測定表明，與ECM結(jié)合分別為，DAAP#1、DAAP#14、DAAP#15和Tie2-Fc非常^f氐，DAAP#17和VEGF-trap相乂于專交低，DAAP#16中等而VEGFRl(2-3)-Fc非常高(圖20)。因此，DAAP#1、DAAP#14、DAAP#15和Tie2-Fc可以具有相對較高的藥代動力學性能。ECM結(jié)合測定進一步利用更高濃度的DAAP#1、VEGF-trap和Tie2-Fc蛋白來實施。ECM〉余覆的96孑14反(BectonDickinsonCat.No.354607)利用100[il去于閉液(在PBS中的2%BSA)在37。C卵孚育2小時。板利用每次400nlPBS清洗3次。然后將在封閉液中的不同量(0.1,0.3,1,3,10,30nM)的每個DAAP#1、VEGF-trap、Tie2-Fc重組蛋白加入到+反中，并在37。C孵育2小時。在用PBS清洗3次之后，將50pi享束沖艮過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000譯希釋；Sigma-AldrichAO170)力口入到凈反中，并在37°C孵育2小時。在用PBS清洗3次之后，將在封閉液中的50pi,束根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichA0170)在37。C孵育2小時。在3次PBS清洗之后,S奪50(ilTMB〉容液(Sigma-AldrichT0440)加入+反中，并^1奪該板在室溫下孵育10min。通過加入50|al的1MHC1〗吏反應纟冬止并且反應的顏色通過ELISA讀數(shù)器(BioRadM680)在光學密度415nm處進行分析(圖19)。該ECM結(jié)合測定(n=4)表明，與ECM結(jié)合分別為DAAP#1低、Tie2-Fc非常低而VEGF-trap相對庫交高(圖21)。實施例8實施標準藥4戈動力學分4斤(n=3)。^爭100jag的Fc、DAAP#1、VEGF-trap或Tie2-Fc重組蛋白皮下注入到8周齡名1i性C57BL/6小鼠(25g體重)，然后乂人尾部靜脈在l、2、4、8、12、24、48、96禾口144小日于才是耳又血才羊(圖22)。DAAP#1禾口VEGF-trap的血清水平通過VEGF-A結(jié)合ELISA方法進ff沖全測，而Tie2-Fc通過Ang2結(jié)合ELISA方法進行4全測。Fc蛋白的血清水平通過利用針對人類IgGl的小鼠單克隆抗體(克隆體No.2C11，AbeamAB1927)作為捕獲抗體并且辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗-人類Fc抗體(1:10000稀釋；Sigma-AldrichAO170)作為4企測抗體，通過夾心ELISA方法進4亍才企測。Fc、DAAP#1、VEGF-trap和Tie2-Fc的半衰期(Tl/2)為200h、~48h、24h和12h(圖23)。因此，在皮下給藥后，DAAP弁l在血液中消失比VEGF-trap在血液中消失更慢(圖23)。實施例9為了考察DAAP弁1對腫瘤生長的作用，將lx106的綠色熒光蛋白標記的劉易斯肺癌(GFP-LLC)細胞皮下植入到8周齡雄性C57BL/6小鼠的切開的右側(cè)腹區(qū)。在4直入之后5天，小鼠分成5組進4亍治療第1纟且(n=4),PBS(100fil);第2纟且(n=4)，F(xiàn)c(25mg/kg);第3組(n=4),DAAP#1(25mg/kg);第4組(n=4)，VEGF-Trap(25mg/kg);第5組(n=4)，Tie2-Fc(25mg/kg)。這些試劑以每隔一天皮下注射《合予(圖24)。生長的腫瘤尺寸利用7>式寬x長x深x0.5通過側(cè)徑器每6天4企測一次。相比于對照PBS治療，DAAP#1和VEGF-Trap產(chǎn)生LLC腫瘤生長的顯著抑制，而Fc和Tie2-Fc沒有產(chǎn)生LLC肺瘤生長的顯著抑制(圖25)。DAAP#1對腫瘤生長的抑制比VEGF-Trap更顯著(圖25)。因此，腫瘤生長抑制的效力為DAAP#1>VEGF-trap>Tie2-Fc〉Fc>PBS。實施例10為了考察肺瘤血管的變4b,在指定天lt，將才直入有GFP-LLC細月包的小鼠通過月幾內(nèi)注射麻醉劑組合(80mg/kg氯胺酮和12mg/kg賽拉溱)進行麻醉，并通過全身性血管灌注在PBS中的1%低聚曱醛固定月中瘤，移出，用組織》令凍介質(zhì)(Leica,Nussioch,Germany)包埋并以10nm厚度冷凍切片。在室溫下用在PBST(在PBS中的0.3%TritonX-100)中的5%驢血清封閉lh之后，切片組織用抗小鼠PECAM國1抗體，倉鼠克隆2H8，1:1000(ChemiconInternational,Temecula,CA)孵育。在PBST中多次清洗之后，才羊品在室溫下用Cy3畫4禺聯(lián)的#元畫倉鼠IgG4元體，1:1000(JacksonImmunoResearch)孵育。4吏熒光4言號可^/f匕，并利用Zeiss倒置顯孩支4竟、ZeissApoTome顯微鏡或ZeissLSM510共焦顯微鏡(裝配有氬氣和氦-氖激光器(CarlZeiss)獲得數(shù)字圖像。腫瘤組織切片中血管的形態(tài)和密度的沖企測利用ImageJ4欠件中的圖形分析(http:〃rsb.info.nih.gov/ij)或利用與單色電荷耦合裝置(CCD)相機和圖Y象分析軟件相接的ZeissApoTome顯樣史4竟(AxioVision,Zeiss)，以PECAM-1免疫染色實施。在GFP-LLC細胞植入之后的29天，在用PBS治療的LLC腫瘤中形成更高密度和良好連接的血管(圖26)。腫瘤血管的減少在通過VEGF-誘捕蛋白的治療中可以觀察到(圖26)，而腫瘤血管的減少和窄化通過DAAP射的治療可以^見察到(圖26)。實施例11視網(wǎng)膜中伴隨血管滲漏和水腫的異常眼部血管生成是糖尿病視網(wǎng)膜病變和老年性黃斑退化癥的一個主要原因。具有異常眼部血管生成的小鼠模型可以通過使新生小鼠暴露于含氧量高的環(huán)境而制得，即"未成熟的視網(wǎng)膜(ROP)或氧誘導視網(wǎng)膜病變"(圖27)。氧誘導視網(wǎng)膜病變引入到C57/BL6野生型小鼠中。新生小鼠和它們的護理母鼠在新生后第7天(P7)和P12之間暴露于75%氧氣(使用PROOXIIO小室氧控制器)，在中央一見網(wǎng)膜的毛細血管床中產(chǎn)生血管閉合和停止血管形成(圖27)。這些動物在P12返回到含氧量正常的室內(nèi)空氣條件j吏產(chǎn)生局部擊夾血和含氧量低的中央^L網(wǎng)膜，并導致一見網(wǎng)月莫前新生血管形成(圖27)。在每一組中(PBS對照(n^4)，F(xiàn)c(n=4)，Tie2-Fc(n=4),VEGF-trap(n=4)，DAAP(n=4)}，P12動物每隔一天直至P164妄受皮下注射每種蛋白(25mg/kg)并在P17殺死(圖27)。然后，制作^l網(wǎng)膜的整體標本和對血管的免疫組織化學染色實施如下。乂人小鼠立即摘除眼球并在4%低聚甲醛(PFA)中在40C固定2小時。視網(wǎng)膜在PBS中分離，并在25°(:用含有5%驢血清的0.3%TritonX國IOO(JacksonImmunoResearch)佳t閉1小日于，并用PECAM-1抗體，倉鼠克隆體2H8,1:10003希釋(ChemiconInternational,Temecula,CA)在4°C染色過夜。在TBS-T中清洗6次之后，樣品在25°C用Cy3-偶聯(lián)的抗-倉鼠IgG抗體1:1000稀釋液孵育4h。在繼續(xù)在TBS-T中清洗6次之后，視網(wǎng)膜的整體標本固定至'J至iJSuperfrost/Plus顯樣史4竟載3皮片(12-550-15，F(xiàn)isher)上，其中光接收器面向下并埋入VECTASHIELD(媒介)試劑中。用PECAM-1染色的P17^L網(wǎng)膜血管對每一組表現(xiàn)出^L網(wǎng)膜的整個血管分布(圖28A)。在高ii大一見盤區(qū)i或中，在PBS、Fc和Tie2-Fc治療組中檢測到生長的視網(wǎng)膜微靜脈數(shù)量增多，而生長的47-現(xiàn)網(wǎng)膜樣i靜脈的數(shù)量在DAAP#1和VEGF-Trap治療組中顯著減少(圖28B)。在視網(wǎng)膜血管中的血管微小叢的數(shù)量(視網(wǎng)膜病變的典型特征)在PBS、Fc和Tie2-Fc治療組中高度增多，而在視網(wǎng)膜樣吏靜脈中的血管孩i小叢的凄t量在DAAP#1和VEGF-trap治療組中顯著減少(圖28C)。血管密度和視網(wǎng)膜邊緣迂曲度在PBS、Fc和Tie^Fc治療組中高度增大，而這些在DAAP弁1和VEGF-trap治療組中顯著減少(圖28D)。定量分析表明，視網(wǎng)膜血管中血管微小叢的ROPi秀導形成和增加的邊皇彖-現(xiàn)網(wǎng)月莫血管密度凈皮DAAP#1和VEGF-trap治療有歲丈;也承卩制(圖28E和28F)。這些之中，DAAP#1的效力高于VEGF-trap。這些凄欠據(jù)表明，DAAP弁1比VEGF-trap用于治療患有糖尿病洋見網(wǎng)膜病變和老年性黃斑退化癥的患者更有效。炎性血管形成在風濕性關節(jié)炎中是一個標志和關4建起作用的因素(Lainer-CarrandBrahn，2007,NatureClinicalPracticeRhuematology3:434-442)。因it匕，^口果我Cl氺卩弗寸炎寸生血管開j成，我們可以減少RA的進展和關節(jié)損害。對于作為RA的一個實驗小鼠模型的膠原誘導關節(jié)炎(CIA)的誘導，將雄性DBA/1J小鼠在尾巴基部利用在等體積的弗氏完全佐劑中乳化的II型牛膠原在真皮內(nèi)免疫接種(圖29A)。三周后，這些小鼠以相同方式加強(圖29A)。具有CIA的小鼠通過皮下注射對照纟爰沖液(n=5)、Fc-蛋白(25mg/kg)(n=5)、VEGF-Trap(25mg/kg)(n=6)或DAAP#1(25mg/kg)(n=6),每周兩次持續(xù)18天進行治療(圖29A)。疾病嚴重程度利用以下系統(tǒng)對每只爪進行臨床評分0級，沒有肺脹；1級，輕微肺脹和紅斑；2級，顯著水肺；3級，關節(jié)硬化(圖29B)。放射照相分析利用改進的乳房攝影成像實施并且評分在膝、iE果和廚f跖關節(jié)中確定(圖30)。在開始治療后18天，還實施組織病理分析并確定評分(圖31)?？傊琕EGF-Trap和DAAP#1減輕臨床評分以及》丈射學和組織病理學異常，而對照i爰沖液和Fc蛋白在RA的疾病嚴重度和關節(jié)損害方面沒有產(chǎn)生任何減輕作用。然而，明顯;也，DAAP#1在減小RA的》文射學和組織病理學異常的臨床評分和進展方面優(yōu)于VEGF-Trap的作用。因此，DAAP#1可以是用于治療RA患者的有步文治療劑。本發(fā)明不限于本文中描述的具體實施方式的范圍。確實，除了本文中描述的那些之外，對于本領i或才支術人員來i兌，才艮才居前述描述和附圖，各種變形是顯而易見的。這樣的變形也落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。以下實施例以舉例說明本發(fā)明的方式^是供，不用于限制。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>670680690700710720禽★★*■*CATCTCTGTACTGCTTGTATGAACAATGGTGTCTGCCATGAA卿ACTTGCTTGGTAGAGACATGACGAACATACTTGTTACCACAGACGGTACTTTGACCTCTTACGAsnHisLeuCysThrAlaCysMetAsnAsnGlyValCysHisGluASpThrGlyGluCys221225hT工E2EGF樣結(jié)構(gòu)域l235240730740750710*804食喻*ATTTGCCCTCCTGGGTTTATGGGAAGGACGTGTGAGAAGGCTTGT鵬CTGCACACGTTTGGAGGACCCTACCCTTCCTGCACACTCrrcCGAACAGACGTGAAAlieCysProProGlyPheMetGlyArgThrCysGluLysAlaCysGluI*euHisThrPhe241245hTIE2EGF樣結(jié)構(gòu)域l25325、255260790800810820830840★*食★GGCAGAACTTGTAAAGAAAGGTGCAGTGGACAAGAGGGAAAGTCTTATGTGTTCTGTCCGTCTTGAACATTTCTTTCCACGTCACCTGTTCTCCCTACGTTCATACACAAGACAGlyArgTh:rCysGluArgCysSerGlyGinGluGlyCysIiysSerTyrValPheCys261265hTIE2EGF樣結(jié)構(gòu)域2275280850860870890900■*食食喻*■*■CTCCCTGACCCCTATGGGTGTTCCTGTGCCACAGGCTGGGGTCTGTGCAATGAAGAGGGACTGGGGATACCCACAAGGACACGGTGTCCGACCTTCCCAGACGTCACGCTTLeuProAspProTyrGlyCysseeCysAlaThrGlyTrpGlyLeuGillCysAsnGlu281285hT工E2EGF樣結(jié)構(gòu)域2295300910920930950960*食★*喻GCATCCCACCCTGGTTTTTACGGGCCAGATTGTAAGCTrAGGTGCAGCTGCAACAATGGGCGTACGGTGGGACCAAAAATGCCCGGTCTAACATTCTCCACGTCGACGTTGTTACCCAlaCysHisProGlyPheTyrGiyProAspCysLysLeuCysSerCysAsnAsnGly301305hTIE2EGF4結(jié)構(gòu)域3315320980990100010101020*喻喻GAGATGTGTGATCGCTTCCAAGGATGTCTCTGC"TCTCCATGGCAGGGGCTCCAGTGTCTCACACTAGCGAAGGTTCCTACAGAGACGAGAGGTCCTACCGTCCCCGAGGTCACAGluMetCysAspArgPheGinGlyCysLeuCysSerProGlyTrpGinGlyLeuGinCys321325hT工E2EGF樣結(jié)構(gòu)域3335340103010401050106010701080GAGAGAGAAGGCATACCGAGGATGGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCCTCTCTCTTCCGTATGGCTCCTACCCATCTGGAAAGCATCTCTACATGTCACTTTAGGGGGluArgGluGlylieProArgMetGlyArgProPheV3lGiuMetTyrSerGluliePro341345348349hVEGFRlIG結(jié)構(gòu)域2360109011001U011201130**■食食GAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTCTTTAATATGTGTACCTTCCTTCCCTCGAGCAGTAAGGGACGGCCCAATGCAGTGGAGlulielieHisMetThrGluGlyArgGluLeuVallieProCys;ugValThrSerPro361365hVEGFRlIG結(jié)構(gòu)域2!3753801150U601170ll的ll卯1200*禽食食IkAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCTTGTAGTGACAATGAAATTTTTTCAAAGGTGAACTGTGAAACTAGCTACCTGCGAsnlieThrVaiThrlieuLysLysPheProLeuAspThrLeulieProAspGlyLysArg381385hVEGFRlIG結(jié)構(gòu)域2395400121012201230124012501260*食■*喻ATAATCTGGGACAGTAGAAAt3GGCTTCATCATATCAAATACGTACAAAGAAATAGGGTATTAGACCCTGTCATCTTTCCCGAAGTAGTATAGTTTACGTTGCATGTTTCTTTATCCClielieTrpAspSerArgLysGlyPhelielieSerAsnThrTyrGlulieGly401405hVEGFRl工G結(jié)構(gòu)域24154201270128012901300mo1320**會食CTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATGAAGACTGGACACTTCGTTGTCAGTTACCCGTAAACATATTCTGTTTGATAGAGTGT咖LeuLeuThrCysGluAlaThrVa工AsnGlyHisI*euTyrUysThrAsnTyrLeuThrHis421425hVEGFRlIG結(jié)構(gòu)域243544013401350136013701380喻食食CGACAACTCGAGGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGCTGTTGAGCTCCTGTTT,G扭窗ACGGGT敏戯GGTCGT卿CTT鵬CCCArgSinli抑GiuAspLysTharHisThrCysProProCysPi:cXlaProGluIvsuLeuGly"i一"2443_"5__喊結(jié)構(gòu)域_455_U901400mo014301440TTCCCA鵬CCCAAGCTCATCTCCCGGACCCCTGGCAAGGAG妙GGGG(3GTTTTGGG咖條:御怵TAGGC《，GGGlyProSerValPheXi的Ph6ProPj:oI*ysProI*ysA，pTteLeviMetlieSerArg加r465hrc結(jié)構(gòu)域4754801450"70"So1500喻CCTGAGTGCGTGGTGGACGTSAGCCACCCTGAGGTCAW3TTCAACACGCACCACCTGCACTCGGGACASTTC鵬TTGProGluCysValV"valAspUalSerHisGluAspProGluAsn485hFC結(jié)構(gòu)域495500151015201530iS401560**■**★GGCGTSGAGOTGCATAATGCCAAG織敏GCGCGGGAG<3AGC&GATGCACCTGCCGCACCTCGTATTACGGTGTTTCGGCCTCCTCATGTrpTyrVai鄉(xiāng)GlyValGluVaiHisAsnJUaI*ysThrtysProArgGluGiiiGin501505hFC結(jié)構(gòu)域5155201570u的喻AACAGCAC<3TACCGTAGCGTCCTCACCCTGCACCAGGACAATTtGTCGTGCATGGCACACC&GGAGTGGCA<3幼CGTGCTGACCGACA3nSea:vaiValLeuTh;cValI^uHisGinA鄰Gly525ilHT結(jié)構(gòu)域535546momo卿!柳，0'l飾O★AAG幼GTAGTGCAAGTCCftACAAAGCCCTCCCft<3CCCCCATCGAGAAA&ceTOCTCATGTTCCASTTGTTTCGGGAG加T;郎輛TAGCTCTTTTAGLysGiuTyrLysCysAsnLysAlaLeuProAiSProlieTftrlie541545hFC結(jié)構(gòu)域555560momo1730喻★■*食TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC卿卿CtACAGGTG敏GTGCCCCCATCCCGGGAG織TTTC鄰TTTCCC鵬CT*T.GGTGTCCAC鵬加GGACGGGGGTAGGCTCSet1LysAlaLysGlyGinProGluProGinV3lTyr飾rteuProProSer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