專利名稱：包含hcmv顆粒的組合物的制作方法
包含HCMV顆粒的組合物本發(fā)明涉及包括一種試劑的組合物，所述組合物的應(yīng)用和制備所述組合物的方 法，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMVNIEP的組。人巨細(xì)胞病毒(HCMV)，一種0 _皰疹病毒，是普遍存在的病原體。在具免疫活性的 人群中，HCMV感染通常不引人注意，最多具有輕微非特定癥狀。相反，在某些風(fēng)險組中，例 如，在受免疫抑制的患者，諸如AIDS患者或移植受體中，和在產(chǎn)前感染后，HCMV感染具有嚴(yán) 重表現(xiàn)?；瘜W(xué)療法可以用于治療HCMV感染。然而，HCMV感染的抗病毒化學(xué)療法的成功受 到，具體地如果延長治療期的藥物毒性和病毒抗性變體發(fā)展的限制。另外，抗病毒超免疫血 清的預(yù)防或治療應(yīng)用被證實僅具有有限的功效。開發(fā)抗HCMV疫苗的工作已經(jīng)進(jìn)行了許多年。因此，已經(jīng)進(jìn)行了使用弱化的(減毒 的)活疫苗的嘗試，以誘導(dǎo)理想的免疫性。然而，該疫苗被證實僅具有有限的功效。其原因 可能是，特別地，所述減毒病毒在人中受限存活力和抗原性的毒株-特異性變化。除了不足 以誘導(dǎo)持久的免疫性外，活疫苗的使用必須嚴(yán)格對待；缺乏關(guān)于HCMV感染中致病機(jī)制的知 識以及免疫抑制后重新激活疫苗毒株使得活疫苗在這些臨床情形中的應(yīng)用似乎至少是有 疑問的。為了避免這些風(fēng)險，近期優(yōu)選遵從的策略是開發(fā)抗HCMV的亞單位疫苗，其包含來 自在多種表達(dá)系統(tǒng)中合成的病毒包膜的蛋白質(zhì)。所述包膜蛋白，具體地糖蛋白gB和gH，是 中和抗HCMV抗體的主要靶抗原。中和抗體能夠防止感染。可能在實驗動物中和在臨床研 究中關(guān)于gB亞單位疫苗誘導(dǎo)所述中和抗體。然而，在人中，以這種方式誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)被 證明是短壽命的且不適合于在所有情形中防止感染。這不利于專門基于HCMV的gB的亞單 位疫苗的廣泛應(yīng)用。隨之對所述抗原制劑有限功效提出的原因是免疫反應(yīng)中的種系-特異 性變化，缺乏充足的細(xì)胞免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，和所用抗原的結(jié)構(gòu)限制，已知所述抗原的表位在 一些情形中是構(gòu)象-依賴性的。因此，基于該經(jīng)驗，有效且廣泛使用的抗HCMV疫苗所需達(dá)到的要求如下(1)長 期_持久誘導(dǎo)中和抗體，所述中和抗體以毒株_重疊方式保護(hù)免受HCMV感染。這些需要有 效誘導(dǎo)所謂的抗HCMV的“輔助性細(xì)胞反應(yīng)”(CD4-陽性T淋巴細(xì)胞)，從而協(xié)助抗體-分泌 性B淋巴細(xì)胞的熟化。(2)誘導(dǎo)抗HCMV的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的形成。這種類型的淋巴細(xì)胞對 于終止發(fā)生的HCMV感染和限制病毒在體內(nèi)擴(kuò)散至關(guān)重要。(3)最小化由疫苗引起的副作 用。根據(jù)目前的知識，可能源自接種活病毒的風(fēng)險應(yīng)該是具有在免疫抑制后建立無法估計 的潛伏的能力。因此目標(biāo)應(yīng)該是制備不能生活的病毒抗原作為疫苗。那種類型的疫苗記述在國際專利申請W0 00/53729中。盡管這些類型的疫苗的確有幫助，但是由于可能存在殘余的感染性HCMV病毒體， 所以在減少該類型病毒顆粒的殘余感染性方面必須達(dá)到高標(biāo)準(zhǔn)。因此，本發(fā)明待解決的問 題是提供包含HCMV顆粒，且更具體地不具有殘余感染性，特別是在本文中所述的測定中不 具有殘余感染性的HCMV病毒體和/或HCMV密體的組合物。本發(fā)明待解決的另一個問題是提供一類非_感染性但提供抗原特異性CD8+、細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的HCMV顆粒。本發(fā)明待解決的另一個問題是提供一類非_感染性但提供 抗原特異性免疫反應(yīng)的HCMV顆粒，其中所述免疫反應(yīng)包括抗所述抗原的抗體，優(yōu)選抗所述 抗原的中和抗體。這個以及其他問題通過獨立權(quán)利要求的主題解決。優(yōu)選的實施方案可以獲自從屬 權(quán)利要求。更具體地，本發(fā)明待解決的問題在第一方面通過包含選自包括HCMV病毒體、HCMV 密體和HCMV NIEP的組中的試劑的組合物解決，其中所述組合物能夠在所述病毒體、NIEP 和/或密體是非-融合的時，闡明(elucidating)免疫反應(yīng)。在一個實施方案中，所述試劑 是非-感染性的。本發(fā)明待解決的問題在第二方面通過包含選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和 HCMV NIEP的組中的試劑的組合物解決，其中所述組合物能夠在所述病毒體、NIEP和/或密 體是非_融合時，闡明免疫反應(yīng)，其中所述組合物可以通過包括以下步驟的方法獲得a)提供一種或多種所述試劑；b)處理所述試劑以致使它們在仍能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的同時是非_融合的。在一個實施方案中，所述試劑是非_感染性的。在所述第一和第二方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+反應(yīng)。在所述第一和第二方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì) 胞反應(yīng)。在所述第一和第二方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+、細(xì)胞毒 性T細(xì)胞反應(yīng)。在所述第一和第二方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)，優(yōu) 選地所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)，其中所述抗體是中和抗體。在所述第一和第二方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD4+T輔助細(xì) 胞反應(yīng)。 在所述第一和第二方面的實施方案中，所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV抗原 優(yōu)選選自包括以下各項的組PP65抗原，pp65抗原衍生物，pp28和pp28衍生物，ppl50和 PP150衍生物，gB和gB衍生物，gH和gH衍生物，及其即時早期抗原和衍生物，糖蛋白和糖 蛋白衍生物，優(yōu)選HCMV糖蛋白和HCMV糖蛋白衍生物，其中所述糖蛋白優(yōu)選是gM和gM衍生 物，或gN和gN衍生物。在所述即時早期抗原組中，即時早期抗原-1 (IE-1)是特別優(yōu)選的。在所述第一和第二方面的實施方案中，所述試劑是滅活的。在所述第一和第二方面的實施方案中，所述組合物是藥物組合物或診斷組合物。本發(fā)明待解決的問題在第三方面通過試劑，或包含所述試劑的組合物，用于制備 藥物，優(yōu)選用于闡明針對一種或多種HCMV抗原的免疫反應(yīng)的藥物的應(yīng)用解決，其中所述試 劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述試劑是非-融合的。本發(fā)明待解決的問題在第四方面通過試劑，或包含所述試劑的組合物，優(yōu)選地如 所述第三方面中定義的組合物制備用于闡明免疫反應(yīng)，優(yōu)選地針對一種或多種HCMV抗原 的免疫反應(yīng)的藥物的應(yīng)用解決，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述組合物和/或所述試劑經(jīng)歷過滅活。
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本發(fā)明待解決的問題在第五方面通過試劑或包含所述試劑的組合物制備疫苗的 應(yīng)用解決，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述試 劑是非-融合的。
本發(fā)明待解決的問題在第六方面通過試劑，或包含所述試劑的組合物，優(yōu)選地如 所述第三方面中定義的組合物制備疫苗的應(yīng)用解決，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、 HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述組合物和/或所述試劑經(jīng)歷過滅活。在所述第三和第四方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+反應(yīng)。在所述第三至第六方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì) 胞反應(yīng)。在所述第三至第六方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+、細(xì)胞毒 性T細(xì)胞反應(yīng)。在所述第三至第六方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)，優(yōu) 選地所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)，其中所述抗體是中和抗體。在所述第三至第六方面的實施方案中，所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD4+T輔助細(xì) 胞反應(yīng)。在所述第三至第六方面的實施方案中，所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV抗原 優(yōu)選選自包括以下各項的組PP65抗原，pp65抗原衍生物，pp28和pp28衍生物，ppl50和 PP150衍生物，gB和gB衍生物，gH和gH衍生物，和即時早期抗原及其衍生物，糖蛋白和糖 蛋白衍生物，優(yōu)選HCMV糖蛋白和HCMV糖蛋白衍生物，其中所述糖蛋白優(yōu)選是gM和gM衍生 物，或gN和gN衍生物。在所述第五和第六方面的實施方案中，所述疫苗用于治療和/或預(yù)防HCMV感染。在所述第五和第六方面的實施方案中，所述疫苗用于治療和/或預(yù)防在移植供體 和/或移植受體中由HCMV引起的疾病。本發(fā)明待解決的問題在第七方面通過試劑，或包含所述試劑的組合物用于制備診 斷劑的應(yīng)用解決，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中 所述試劑是非-融合的，。本發(fā)明待解決的問題在第八方面通過試劑，或包含所述試劑的組合物制備診斷劑 的應(yīng)用解決，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述 組合物和/或所述試劑經(jīng)歷過滅活。本發(fā)明待解決的問題在第九方面通過用于制備如所述第一和第二方面定義的組 合物的方法解決，所述方法包括以下步驟a)提供選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組的試劑；b)處理所述試劑，以致使所述試劑在仍能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的同時是非_融合的。在第九方面的實施方案中，步驟b)的處理是選自包括UV處理、高能量照射、低pH 處理、熱處理和用交聯(lián)劑處理的組中的方法中的一種或任意組合。在第九方面的優(yōu)選實施方案中，UV處理是UVC處理，其中波長是約100nm-280nm， 或用長波UV處理。除使用UVC進(jìn)行滅活外還可以使用長波UV屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這種情形中， 長波UV與受所述長波UV活化的光敏劑一起使用。在一個實施方案中，所述光敏劑分別是與UVA —起使用的amotosalen，與UVA —起使用的4’ -氨基甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂 素，和與UVA和UVB —起使用的二甲基亞甲基藍(lán)。在第九方面的實施方案中，UV處理使用的劑量范圍是約100-約2000mJ/cm2，優(yōu)選 約 100-約 1000mJ/cm2 和更優(yōu)選約 150-約 900mJ/cm2。在第九方面的實施方案中，UV處理之前，伴隨著UV處理或在UV處理之后，所述試 劑經(jīng)歷、照射。在第九方面的優(yōu)選實施方案中，所述高能量照射是、照射。在第九方面的進(jìn)一步優(yōu)選實施方案中，以約15-約70KGy，更優(yōu)選約20-約65KGy 和更優(yōu)選約20-約60KGy的劑量范圍施加與、照射有關(guān)的、輻射。在第九方面的實施方案中，所述處理是低pH處理且所述低pH處理包括將所述試 劑暴露于約0-5，優(yōu)選1-4. 5和更優(yōu)選地約2-4. 5的pH。在第九方面的優(yōu)選實施方案中，所述試劑經(jīng)歷低pH處理約0. 5-24小時，優(yōu)選約 0. 5-12小時和更優(yōu)選約0. 5-6小時的時期。在第九方面的實施方案中，所述試劑在約1-50°C，優(yōu)選在約1-約45°C和更優(yōu)選在 約1-約40°C下經(jīng)歷低pH處理。在第九方面的實施方案中，所述熱處理包括以約37. 5°C -約65°C的溫度，優(yōu)選以 約37. 5-約60°C的溫度和更優(yōu)選以約37. 5-約56°C的溫度溫育所述試劑。在第九方面的優(yōu)選實施方案中，溫育所述試劑約5秒-約36小時，優(yōu)選約5秒-約 30小時，和更優(yōu)選約5秒-約24小時的時期。在第九方面的實施方案中，所述處理是使用一種或多種交聯(lián)劑的處理，且其中所 述交聯(lián)劑分別獨立地選自包括內(nèi)酯、乙醇鹽和醛的組。在第九方面的實施方案中，所述交聯(lián)劑是丙酸內(nèi)酯。在第九方面的實施方案中，所述交聯(lián)劑是環(huán)氧乙烷。在第九方面的實施方案中，所述交聯(lián)劑是甲醛。在第九方面的實施方案中，所述試劑暴露于交聯(lián)劑，包含所述試劑的培養(yǎng)基中的 所述交聯(lián)劑的濃度和更優(yōu)選丙酸內(nèi)酯的濃度是約0. 05-約10% (v/v)，優(yōu)選約0. 05-約 10% (v/v)，和更優(yōu)選約 0. 05-約 7. 5% (v/v)。在第九方面的實施方案中，用交聯(lián)劑和優(yōu)選地0 -丙酸內(nèi)酯溫育所述試劑一段約 1分鐘_約72小時，優(yōu)選約1分鐘-約48小時，和更優(yōu)選約1分鐘-約24小時的時期。在第九方面的實施方案中，以約rc -約6o°c的溫度，優(yōu)選以約rc -約5o°c的溫 度，和更優(yōu)選以約rc -約4o°c的溫度溫育所述試劑。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，認(rèn)為HCMV顆粒，為了針對病毒抗原和病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生抗原特 異性⑶8+、細(xì)胞毒性T-細(xì)胞反應(yīng)，必須與靶細(xì)胞膜融合(P印perl等2000 J Virol (病毒 學(xué)雜志)74 =6132-6146)。認(rèn)為該融合是在進(jìn)入細(xì)胞后直接或在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯病毒蛋 白后，引導(dǎo)病毒抗原進(jìn)入抗原處理和呈遞的MHC I類途徑的先決條件(P印perl等2000J Virol (病毒學(xué)雜志)74:6132-6146)?？乖ㄟ^MHC I類途徑呈遞隨之是免疫系統(tǒng)能夠針 對病毒抗原和病毒感染的細(xì)胞發(fā)動(mount)或闡明抗原特異性CD8+、細(xì)胞毒性T-細(xì)胞反應(yīng) 的先決條件。本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不再是融合的HCMV顆粒仍能夠針對病毒抗原和病毒感染的細(xì)胞激發(fā)該類抗原特異性CD8+，細(xì)胞毒性T-細(xì)胞反應(yīng)。這特別應(yīng)用于這樣的HCMV顆粒，所述 HCMV顆粒是已經(jīng)或正在分別通過應(yīng)用一種或多種本文中所述分別關(guān)于或與任何滅活和滅 活程序有關(guān)的方式和方法處理或產(chǎn)生的。本發(fā)明的第一個發(fā)現(xiàn)就根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)而言是令人 驚訝的，即如上所概述地，現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為HCMV顆粒的融合性(fusiogenicity)是該類T_細(xì) 胞反應(yīng)的先決條件。所述非-融合性可以通過對HCMV顆粒應(yīng)用本質(zhì)上本領(lǐng)域中常規(guī)已知的用于滅 活HCMV或減小HCMV和HCMV顆粒感染性的方法(measure)和方法(method)，優(yōu)選本文中 所述的那些還分別被稱為本文中所述關(guān)于或與滅活和滅活程序有關(guān)的方式和方法的方法 (measure)和方法(method)產(chǎn)生。這些滅活或滅活方法(measure)和方法(method)分別 使用和進(jìn)行到一定程度，以將所述非_融合性施加于或賦予給所述HCMV顆粒。作為本發(fā)明基礎(chǔ)的第二個發(fā)現(xiàn)涉及提供HCMV顆粒或包含所述HCMV顆粒的組合 物，其不具有感染性，優(yōu)選無殘余感染性，其中所述HCMV顆粒和包含所述HCMV顆粒的組合 物是通過分別應(yīng)用連同本發(fā)明第一方面在本文中公開的方法(measure)和方法(method) 之一產(chǎn)生的，其由HCMV顆?；蛉园腥拘訦CMV顆粒和具體地HCMV病毒體的包含HCMV顆 粒的組合物開始。而且，意外地發(fā)現(xiàn)這類HCMV顆粒適合于激發(fā)如本文中所述的免疫反應(yīng)， 即具體地，抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，抗原特異性抗體反應(yīng)，其中所述抗體反應(yīng) 優(yōu)選是提供抗原特異性中和抗體的反應(yīng)，和抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞反應(yīng)。本領(lǐng)域中技術(shù)人員普遍已知，誘導(dǎo)抗原_特異性抗體反應(yīng)和抗原_特異性CD8+細(xì) 胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)分別需要產(chǎn)生抗原-特異性CD4+T輔助細(xì)胞。因此，在本發(fā)明中，產(chǎn)生抗 原_特異性⑶4+T輔助細(xì)胞是通過顯示pp65-特異性⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)和產(chǎn)生特 異于HCMV抗原的抗體，具體地中和抗體而證明。因此，接受滅活殘余HCMV感染性和導(dǎo)致該 材料非_融合(non-fusiogenic)的處理的HCMV顆粒仍能夠誘導(dǎo)抗原-特異性⑶4+T輔助 細(xì)胞。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，術(shù)語無殘余感染性意指利用感染性測定，更優(yōu)選本文中 所述的感染性測定不能在包含HCMV顆粒的樣品或組合物中檢測到感染性顆粒和具體地感 染性HCMV顆粒。換言之，包含一種或多種HCMV密體、HCMV病毒體和/或HCMV NIEP的組合 物或制劑分別是這樣的組合物和制劑，其中在恰當(dāng)?shù)母腥拘詼y定中不能檢測到感染性HCMV 或HCMV顆粒。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)，檢測范圍應(yīng)該限定有無和如果有，達(dá)到何種 程度，即多少所述HCMV顆粒仍然分別存在于各種組合物和制劑中。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，術(shù)語HCMV顆粒包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，HCMV病毒體是感染性病毒顆粒，其由膜、間層和包含病毒 DNA的殼體組成。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，HCMV密體(DB)是非感染性HCMV顆粒，其缺少HCMV殼體 和HCMV DNA,但包含膜和間層。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，HCMV NIEP是非-感染性，有包膜HCMV顆粒，其缺少DNA 但包含膜、殼體和間層。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，術(shù)語密體包括非_重組和重組密體。重組密體優(yōu)選表達(dá) 一種或多種異種抗原。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，術(shù)語NIEP包括非-重組和重組NIEP。重組NIEP優(yōu)選表達(dá)一種或多種異種抗原。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，術(shù)語病毒體包括非_重組和重組病毒體。重組病毒體優(yōu) 選表達(dá)一種或多種異種抗原。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，術(shù)語異種抗原是處于不同表達(dá)環(huán)境中表達(dá)的抗原。在一 個實施方案中，所述不同的表達(dá)環(huán)境是這樣的環(huán)境，其中所述抗原是不對各種野生型密體、 野生型NIEP和野生型病毒體固有的抗原。更具體地，所述異種抗原優(yōu)選是作為HCMV顆粒 內(nèi)在或內(nèi)部成分的抗原，包括但不限于非_結(jié)構(gòu)性HCMV抗原，或異種生物體的抗原，所述異 種生物體優(yōu)選異種病原體。在另一個實施方案中，所述不同的環(huán)境是與野生型環(huán)境不同的 環(huán)境，其中控制抗原表達(dá)的啟動子與控制野生型密體、野生型NIEP和野生型病毒體中的抗 原表達(dá)的啟動子不同。在另一個實施方案中，所述不同的環(huán)境由在其中表達(dá)所述抗原的不 同翻譯系統(tǒng)或翻譯背景組成，其，同樣與野生型系統(tǒng)或野生型背景不同。更具體地，所述野 生型密體是HCMV野生型密體，所述野生型NIEP是野生型HCMV NIEP且所述野生型病毒體 是野生型HCMV病毒體。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，野生型意指或來自優(yōu)選在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下能夠形成 密體的毒株。所述野生型或野生型毒株優(yōu)選是Adl69和Towne。應(yīng)該公認(rèn)，本文中關(guān)于HCMV顆粒所述的任何陳述、實施方案、特征或優(yōu)勢也且特 別適用于HCMV密體和HCMV NIEP,且更特別適用于HCMV密體。當(dāng)優(yōu)選地用于本文中時，術(shù)語融合性指由病毒和亞病毒顆粒膜分別與靶細(xì)胞的細(xì) 胞膜融合介導(dǎo)的病毒和亞病毒顆粒諸如HCMV融合靶細(xì)胞的能力。這樣的病毒和亞病毒顆 粒，分別，稱為“融合的”；而不能與靶細(xì)胞融合的病毒和亞病毒顆粒分別稱為非_融合的?；诒景l(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即所述HCMV顆粒包括，但不限于，進(jìn)行或已經(jīng)進(jìn)行了處理 以滅活其殘余HCMV感染性的HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP,盡管證明缺失融合性， 仍能夠針對病毒抗原有效誘導(dǎo)抗原特異性CD8+、細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，分別通過適應(yīng)(go along with)缺少融合性的方式和在適應(yīng)缺少融合性的條件下用于滅活HCMV感染性和更 具體地滅活殘余HCMV感染性的方式和方法(method)可以分別應(yīng)用于包含HCMV顆粒的制 劑和組合物，從而產(chǎn)生安全的HCMV疫苗和抗原特異性⑶8+、細(xì)胞毒性T-細(xì)胞反應(yīng)。形成用于分別產(chǎn)生分別作為本發(fā)明主題的HCMV顆粒和包含所述HCMV顆粒的組合 物的起始原料的HCMV顆粒，優(yōu)選是由HCMV感染哺乳動物細(xì)胞后釋放的病毒顆粒。所述作 為起始材料使用的HCMV顆粒由脂質(zhì)膜包圍，這使得所述顆粒有可能與某些哺乳動物細(xì)胞 融合，從而使其內(nèi)容物進(jìn)入細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，盡管，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，所述通過對其進(jìn) 行本文中所述關(guān)于或適合于滅活的方式和方法(method)獲得的顆粒是非融合的。與此無 關(guān)地，HCMV顆粒的膜含有病毒糖蛋白，其代表病毒-中和抗體的主要抗原。另外，它們包含 病毒抗原PP65 (ppUL83)，其正是T-輔助細(xì)胞的免疫原性靶標(biāo)并是用于誘導(dǎo)抗HCMV的細(xì)胞 毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的基本抗原。分別由HCMV顆粒和具體地HCMV病毒體、HCMV NIEP和/或HCMV密體，和包括所 述HCMV顆粒和具體地HCMV病毒體、HCMV NIEP和/或HCMV密體的組合物引起的免疫反應(yīng) 類型，各自根據(jù)本發(fā)明，與施用Thl型T-輔助細(xì)胞反應(yīng)無關(guān)。由于該特征，HCMV顆粒和具 體地HCMV病毒體、HCMV密體和/或HCMV NIEP,和包括它們中至少一種的組合物分別適合 作為抗HCMV的疫苗。
本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)，本發(fā)明的HCMV顆粒和包括所述HCMV顆粒的任何組 合物可以用于制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物，優(yōu)選地，所述疾病是涉及HCMV作為病 原體或機(jī)會病原體的疾病。在優(yōu)選的實施方案中，所述藥物是疫苗。按照本發(fā)明使用所述藥物治療和/或預(yù)防的具體的受試者，優(yōu)選哺乳動物受試者 和更優(yōu)選人受試者的組是遭受或處于發(fā)展由HCMV引起的疾病的風(fēng)險中的那些，其中所述 受試者是移植供體和/或移植受體。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員還應(yīng)該公認(rèn)，本發(fā)明的HCMV顆粒 和包括所述HCMV顆粒的任何組合物可以用于制備診斷劑。更優(yōu)選地，所述診斷劑是一種用 于診斷涉及HCMV作為病原體或機(jī)會病原體的疾病的診斷劑。最后，所述HCMV顆?？梢杂糜诋a(chǎn)生或制備藥物或診斷劑，其中所述藥物和診斷劑 是選自包括抗體、適體和spiegelmer的組中的一種試劑，其中所述試劑針對，優(yōu)選特別針 對本發(fā)明的一種或多種HCMV顆粒。所述抗體、適體和spiegelmer的產(chǎn)生是本領(lǐng)域中技術(shù) 人員已知的。制備特異于本發(fā)明HCMV顆粒的抗體是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的，例如，記述在 Harlow, E.，禾口 Lane，D. ，‘‘ Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，‘‘Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，Cold SpringHarbor (冷泉港)，NY, (1988) 中。優(yōu)選地，可以根據(jù)Cesar和Milstein的方案和基于其上的進(jìn)一步發(fā)展制備的單克隆抗 體可以連同本發(fā)明一起使用?？贵w，用于本文中時，包括，但不限于，完整抗體、抗體片段或 衍生物，諸如Fab片段、Fc片段和單鏈抗體，條件是它們適合于且能夠結(jié)合本發(fā)明的HCMV顆 粒。除單克隆抗體外，還可以使用和/或產(chǎn)生多克隆抗體。多克隆抗體的產(chǎn)生也是本領(lǐng)域中 技術(shù)人員已知的，且，例如，記述在 Harlow，E.，和 Lane，D.，‘ Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，“ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，NY，(1988)中。優(yōu)選地，用于治療目的的抗體是如上定義的人源 化或人抗體。可以按照本發(fā)明使用的抗體可以具有一種或多種標(biāo)記或標(biāo)簽。所述標(biāo)記或標(biāo)簽 可以有效用于在其診斷應(yīng)用中或在其治療應(yīng)用中檢測抗體。優(yōu)選地，所述標(biāo)記和標(biāo)簽選自 包括抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素、金和熒光素的組，并用于，例如，ELISA法 中。這些和其他標(biāo)記以及方法，例如，記述在Harlow，E.，和Lane，D.，“ Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，“Cold Spring Harbor Laboratory ( 7令泉港實 驗室)，ColdSpring Harbor (冷泉港)，NY, (1988)中。本發(fā)明還包括，所述標(biāo)簽或標(biāo)記表現(xiàn)出除檢測以外的另外的功能，諸如與其他分 子相互作用。所述相互作用可以是，例如，與其他化合物的特異性相互作用。這些其他化合 物可以是使用所述抗體的系統(tǒng)，諸如人或動物體固有的那些，或利用各種抗體分析的樣品。 合適的標(biāo)記可以，例如，是與其配偶體，諸如抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白特異性相互 作用的生物素或熒光素，和存在于各種化合物或結(jié)構(gòu)上從而與由此標(biāo)記或標(biāo)明的抗體相互 作用的類似物。適體，作為本發(fā)明的主題，是D-核酸，其是單鏈的或雙鏈的，且與靶分子特異性相 互作用。適體的制備或選擇，例如，記述在歐洲專利EP 0 533838中?；旧?，實行以下步 驟。第一，提供核酸，即潛在適體的混合物，其中每種核酸典型地包括若干，優(yōu)選至少8個隨
11后隨機(jī)化核苷酸的片段。該混合物隨后與靶分子相接觸，由此所述核酸，諸如基于與候選混 合物相比針對所述靶標(biāo)增高的親和力或以比其更大的力與靶分子結(jié)合。結(jié)合的核酸隨后與 混合物的剩余部分分開。任選地，利用例如聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增由此獲得的核酸。這些步驟可 以重復(fù)若干次，最終提供具有增高比例的特異性結(jié)合所述靶標(biāo)的核酸的混合物，然后任選 地從所述混合物中選擇最終的結(jié)合核酸。這些特異性結(jié)合的核酸稱為適體。顯然，在用于產(chǎn) 生或鑒定適體的方法的任何階段，可以取各種核酸的混合物利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定其序列。本 發(fā)明的范圍包括，所述適體可以諸如，例如，通過引入定義的本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的產(chǎn)生 適體的化學(xué)基團(tuán)而穩(wěn)定化。這樣的修飾可以例如位于在核苷酸的糖部分的2’_位置處引入 氨基基團(tuán)。適體目前用作治療劑。然而，本發(fā)明的范圍還包括，由此選擇或產(chǎn)生的適體可以 用于靶標(biāo)確認(rèn)和/或作為開發(fā)藥物，優(yōu)選基于小分子的藥物的前導(dǎo)物質(zhì)。這實際上是通過 競爭測定完成的，其中靶分子與適體之間的特異性相互作用受候選藥物的抑制，由此從靶 標(biāo)和適體的復(fù)合物中替換適體時，可以假定各種藥物候選物允許特異性抑制靶標(biāo)和適體之 間的相互作用，且如果該相互作用是特異性的，則所述候選藥物應(yīng)該，至少原則上，適合于 阻斷該靶標(biāo)并由此降低其在各種包括所述靶標(biāo)的系統(tǒng)中的生物利用率或活性。然而，可以 對由此獲得的小分子進(jìn)一步進(jìn)行衍生化和修飾，從而最優(yōu)化其物理、化學(xué)、生物學(xué)和/或醫(yī) 學(xué)特征，諸如毒性、特異性、生物可降解性和生物利用率。利用本發(fā)明的HCMV顆粒生產(chǎn)或制備可以按照本發(fā)明使用或產(chǎn)生的spiegelmer基 于類似的原則。Spiegelmer的制備記述在國際專利申請W098/08856中。Spiegelmer是 L-核酸，這意味著它們由L-核苷酸組成，而不如適體那樣，由D-核苷酸組成。Spiegelmer 的特征在于這樣的事實，即它們在生物學(xué)系統(tǒng)中具有非常高的穩(wěn)定性，且與適體相當(dāng)，與它 們針對的靶分子特異性相互作用。在生產(chǎn)spiegelmer的目的中，構(gòu)建D_核酸的異源種群， 并在存在例如天然存在的本發(fā)明HCMV顆粒的L-對映異構(gòu)體或其ilart的D-對映異構(gòu)體的 條件下，使該種群與靶分子的光學(xué)對映體相接觸。隨后，分離這些D-核酸，其不與靶分子的 光學(xué)對映體相互作用。然而，對與靶分子的光學(xué)對映體相互作用的那些D-核酸進(jìn)行分離、 任選地確定和/或測序，并隨后基于由D-核酸獲得的核酸序列信息合成相應(yīng)的L-核酸。這 些在序列上與前述與靶分子的光學(xué)對映體相互作用的D-核酸相同的L-核酸應(yīng)該與天然存 在的靶分子，而非其光學(xué)對映體特異性相互作用。類似于生成所述適體的方法，還可能重復(fù) 多種步驟若干次，并由此富含與靶分子的光學(xué)對映體特異性相互作用的那些核酸。本發(fā)明的范圍包括，所述藥物和診斷劑可以用于分別治療、預(yù)防和診斷與使用本 發(fā)明的HCMV顆粒相關(guān)的本文中所述的各種和任何疾病和病癥。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該 理解，本發(fā)明的HCMV顆粒還可以用作治療和/或預(yù)防可以由激發(fā)針對抗原的免疫反應(yīng)治療 的那些疾病，且所述抗原通過本發(fā)明的HCMV顆粒表達(dá)。本發(fā)明的范圍包括所述抗原，具體 相對于所述HCMV顆粒是同種或異種的。 至少根據(jù)本發(fā)明，確定HCMV顆粒和具體地HCMV病毒體和/或HCMV密體和包含它 們中的至少一種的組合物在所述顆粒、病毒體和/或密體優(yōu)選是非_融合的時，是否分別能 夠闡明免疫反應(yīng)的方法對本領(lǐng)域中的技術(shù)人員是顯然的。各種測試中的一些記述在本文 中，具體地在其實施例部分中。 為了提供免疫反應(yīng)，本發(fā)明的HCMV顆粒必須包含或提供相關(guān)抗原，從而誘導(dǎo)抗原 特異性抗體，優(yōu)選中和抗體并刺激輔助細(xì)胞(TH-淋巴細(xì)胞)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。
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原則上，適合于激發(fā)免疫反應(yīng)的HCMV抗原，優(yōu)選地在人中，具體是以下的一種，盡 管本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)其他HCMV抗原也可以達(dá)到起作用的程度(Sylwester AW, JEM 卷 202，2005 年 9 月 5 日，p. 673-685)。由⑶4+T細(xì)胞識別的HCMV抗原優(yōu)選地選自包括以下各項的組UL55 (gB)， UL83 (pp65), UL86, UL99 (pp28)，UL122(IE2), UL36, UL48, UL32(ppl50), UL113, IRS-1， UL123(IE1) , UL25, UL141, UL52, UL82(pp71) , US22, UL75 (gH)，US23, UL69, US26, UL44 (pp50)，UL16, US3, US18, UL78, UL18, UL17, TRL14, UL100, UL45, UL145, UL154, UL43, UL152，UL144，UL24，UL4 (gp48)，UL49，UL102 和 UL87。更優(yōu)選地，經(jīng)歷 CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)的抗 原選自包括 UL55，UL83, UL86, UL99, UL153 和 UL32 的組。由⑶8+T細(xì)胞識別的HCMV抗原優(yōu)選地選自包括以下各項的組UL48，UL83 (pp65)， UL123(IE1), UL122(IE2), US32, UL28, US29, US3, UL32(ppl50), UL55(gB)， UL94, UL69, UL105, UL82(pp71)，UL99 (pp28)，UL154, UL44 (pp50)，UL86, UL33, UL49, US1, UL150, UL34, US30, TRL14, IRS-1, UL36, UL37, UL75 (gH)，UL45, UL153, UL116 和 UL54。更優(yōu)選地，經(jīng)歷 CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)的抗原選自包括 UL123，UL83, UL122, UL28, UL48, US3, UL151, UL82, UL94, US29, UL99, UL103, US32, US24 和 UL36 的組。中和抗體，按照現(xiàn)有技術(shù)，在HCMV感染后專門針對病毒包膜蛋白，和具體地針對 糖蛋白 gB, gH, gM 和 gN 形成(Shen 等，Vaccine (疫苗)20，2007)。TH細(xì)胞主要針對病毒的間層蛋白，和具體針對所謂的pp65(ppUL83)，gH和gB形 成(Sylwester等.，J.Exp. Medicine (實驗醫(yī)學(xué)雜志)卷202，2005)。更具體地，pp65是誘 導(dǎo)抗HCMV的CTL的基本抗原。pp65的呈遞不僅照常在關(guān)于MHC I類分子由細(xì)胞從頭合成 后發(fā)生；而且還可以通過所謂的“外源負(fù)載”將其引入到MHC I呈遞途徑中。所述抗原是本發(fā)明的HCMV顆粒和更具體地本發(fā)明的HCMV密體和HCMV NIEP的基 本成分。更具體地，所述密體(DB)是在電子顯微鏡下可視的結(jié)構(gòu)。DB中最富含的蛋白質(zhì) (質(zhì)量)是間層蛋白PP65。DB在擁有細(xì)胞脂質(zhì)膜的方面與病毒顆粒相當(dāng)，所述細(xì)胞脂質(zhì)膜 也回復(fù)為包膜，由病毒糖蛋白修飾。病毒糖蛋白在該包膜中非常可能處于天然構(gòu)象。由于 DB不含有病毒DNA且不含有病毒殼體，所以它們是非-感染性的。它們可以通過已確定方 法從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中大量濃縮。以下實施方案通過參考pp65進(jìn)行描述。然而，應(yīng)該理解，原則上，相同的考慮適用 于其他適合于實踐本發(fā)明的抗原和/或本文中直接或通過參考所述的抗原。在另一個實施方案中，公開并描述了包含融合蛋白的HCMV顆粒，所述融合蛋白在 一部分包括病毒T-細(xì)胞抗原pp65(ppUL83)的一個或多個部分或完整蛋白，且在另一部分 包括一種或多種其他蛋白的一個或多個部分。這使得可能最優(yōu)化HCMV顆粒的抗原性，因為該融合蛋白大量存在于所述顆粒中。 另外已知細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的抗原在一個分子中的表達(dá)可以明顯地增加抗原性。PP65 和其他蛋白的不同部分可以直接融合在一起，但是也可能例如在不同部分之間存在接頭序 列，所述接頭序列不是所涉及的蛋白之一的天然成分。這種類型的序列可以由于克隆或有 意的引入而產(chǎn)生，從而影響抗原的性質(zhì)。然而，融合蛋白優(yōu)選不包含不是融合配偶體之一的 成分的外源序列。在這樣的實施方案中，融合蛋白由PP65的一個或多個部分和一種或多種 其他蛋白的一個或多個部分組成。
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對下文中提到的所有實施方案應(yīng)用融合蛋白中可以存在的完整pp65或其一個或 多個部分。語句“PP65(組成)的融合蛋白”不是為了使該應(yīng)用被理解為局限于完整pp65 的目的。融合蛋白中存在的“部分(part)”或“部分(section)”包括至少6，優(yōu)選至少8， 更優(yōu)選至少9，15或20個源自該蛋白的連續(xù)氨基酸。優(yōu)選的實施方案包括pp65(ppUL83)的融合蛋白和病毒糖蛋白gB或gH的一種或 多種中和表位。這種類型的顆?？梢匀?br>
圖1中所述產(chǎn)生。融合蛋白可以通過抗原-特異性 吸收，在MHC II類環(huán)境中，進(jìn)入糖蛋白-特異性B細(xì)胞，所述糖蛋白-特異性B細(xì)胞又能 夠呈遞糖蛋白和PP65的表位。另外，還可能在MHC II類環(huán)境中，由專職抗原-呈遞細(xì)胞 (APC)呈遞融合蛋白的一部分。在這兩種情形中，結(jié)果是有效刺激針對pp65和病毒糖蛋白 的TH反應(yīng)。這些⑶4陽性TH細(xì)胞能夠刺激糖蛋白-特異性B細(xì)胞，所述糖蛋白-特異性 B細(xì)胞在MHC II類環(huán)境中呈遞pp65和病毒糖蛋白的肽，從而形成抗體，具體地中和抗體， 其中所述抗體在一個實施方案中針對同種抗原，且在另一個實施方案中針對異種抗原。另 外，這種類型的顆粒可以，如感染性病毒體，被吸收到細(xì)胞中，且PP65的肽可以通過外源負(fù) 載被引入到MHC I類途徑中。這難得地對于死疫苗，獲得對針對HCMV的CTL反應(yīng)的刺激。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，HCMV顆粒包含這樣的融合蛋白，其由pp65和另一種 HCMV蛋白，IE1蛋白(ppUL123)的一個或多個部分組成。待呈遞的IE1蛋白的部分特別是 天然感染過程中在人體內(nèi)針對其形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的那些。IE1蛋白的肽在一些情形中 由與PP65的肽不同的MHCI類分子呈遞。加入所述來自IE1的其他“CTL表位”意欲確保免 疫后表達(dá)不同MHC I類分子的接種受試者能夠以盡可能廣泛的方式產(chǎn)生抗HCMV的CTL。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，HCMV顆粒包含這樣的融合蛋白，其由pp65，由HCMV 糖蛋白的一個或多個中和表位和由IE1的一個或多個CTL表位組成。pp65與中和表位和 CTL表位的融合意欲確保接種的受試者以盡可能廣泛的方式，即最大數(shù)量在MHC I類模式 上不同的人可能同時形成中和抗體和CTL。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，HCMV顆粒包含pp65和另一種人病原體的一個或多 個表位的融合蛋白。其他人病原體的合適部分是針對其在人中形成中和抗體的抗原。通過 這樣的“中和抗原”與T-細(xì)胞抗原pp65的融合可能與使用分離的“中和抗原”相比，預(yù)期 免疫反應(yīng)，即抗體反應(yīng)顯著增加。應(yīng)該提到的這樣的“中和抗原”的實例是乙型肝炎病毒的 表面蛋白(來自HBsAG區(qū))、丙型肝炎病毒(例如E2)的表面蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV， 來自Env區(qū))的表面蛋白、流感病毒(血凝素、神經(jīng)氨酸酶、核蛋白)或其他病毒病原體的 表面蛋白。其他適合的人病原體是細(xì)菌，諸如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、百 日専H牛寺ft (Bordetellapertussis) .^WM^PfM (Mycobacterium tuberculosis)、 腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)和其他。最后，來自真核病原體諸如瘧原蟲 (瘧疾)的抗原可以與PP65融合。這樣的抗原或融合蛋白在本文中也稱為抗原衍生物，且 其作用為抗原包括全長或顆粒PP65的融合蛋白在本文中也稱為pp65抗原衍生物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，HCMV顆粒包含由pp65和其它病原體的蛋白或肽的 一個或多個部分組成的融合蛋白，其中所述PP65作用可以分別起所述蛋白和肽的aq支架 的作用，在被所述其它病原體天然感染的人中針對這些病原體產(chǎn)生CTL?？梢蕴峒暗倪@樣的 CTL表位的實例是HIV-1、HBV、HCV或流感病毒的蛋白的部分。該程序的目的是利用DB在 人中產(chǎn)生抗異種病原體的保護(hù)性CTL，即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，優(yōu)選CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的獨特免疫原性性質(zhì)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，HCMV顆粒包含由pp65，由異種病原體的一個或多個 中和表位和由相同病原體的一個或多個CTL表位組成的融合蛋白。該融合意欲確保接種的 受試者能夠針對該病原體形成保護(hù)性抗體和CTL。本發(fā)明另外涉及包含至少兩種不同的糖蛋白的HCMV顆粒，所述不同的糖蛋白是 相同糖蛋白來自不同HCMV毒株的變體。優(yōu)選的實施方案包括正好兩種變體，一種變體對應(yīng)于HCMV Towne毒株，且另一種 變體對應(yīng)于HCMV Adl69毒株。優(yōu)選的實施方案包括Towne毒株和Adl69毒株的糖蛋白gB?？梢砸韵嗤墓π⑦@兩種蛋白引入到感染的細(xì)胞的重組密體的膜中。所述重組 密體不僅適合于針對這兩種原型HCMV毒株誘導(dǎo)毒株-重疊，而且還適合于誘導(dǎo)毒株-特異 性中和免疫反應(yīng)。本發(fā)明的范圍包括，除野生型抗原，即諸如HCMV野生型毒株中存在的抗原，或 非-重組抗原外，其衍生物可以用于實踐本發(fā)明。術(shù)語衍生物連同抗原一起用于本文中時 優(yōu)選指這樣的抗原，即重組抗原。重組抗原是一種抗原，在一個實施方案中，其與平截的全 長抗原相比，在與野生型抗原具有相同的長度的同時包括一個或多個氨基酸改變，或包括 另外的氨基酸殘基。本發(fā)明的范圍包括，可以將另外的氨基酸殘基添加到抗原的平截形式 或包括一個或若干個氨基酸改變的形式中。所述平截可以以這樣的程度進(jìn)行，即使得所述 平截的抗原的抗原特征仍存在。在另一個實施方案中，重組抗原包括，除全長抗原或平截抗 原外，另一個部分。所述另一個部分優(yōu)選源自病毒的抗原，其中所述病毒與HCMV不同，是微 生物，優(yōu)選病原性微生物的抗原，或非_微生物病原體的抗原。優(yōu)選地，病原性微生物是對 哺乳動物和更具體地對人致病的微生物，且病原體是對哺乳動物和更具體地對人致病的病 原體。所述另一個部分可以是全長抗原或其平截形式。在一個實施方案中，所述另一個部 分適合于激發(fā)本文中所述的一種或多種免疫反應(yīng)。在另一個實施方案中，抗原的衍生物是 異種抗原。在再一個實施方案中，抗原的衍生物優(yōu)選是如本文中所定義的異種抗原。優(yōu)選 地，可以由處于其不同形式的HCMV顆粒激發(fā)的免疫反應(yīng)是以下各項中的至少一種抗原特 異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)、抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)、抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞 反應(yīng)、抗原特異性抗體反應(yīng)、抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞反應(yīng)，其中，優(yōu)選地，所述抗體反應(yīng) 的抗體是中和抗體。特別有效用于實踐本發(fā)明的HCMV的病毒體和/或密體可以如國際專利申請TO 00/53729中所述制備。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)，本文中所述的用于滅活的多種方法同樣是本領(lǐng)域 中已知的且可以應(yīng)用于本發(fā)明?，F(xiàn)通過附圖和實施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，其中可以采用其他特征、實施方案 和優(yōu)點，其中圖1顯示用于產(chǎn)生重組DB的策略，所述重組DB包含具有同種或異種抗原的融合 蛋白；圖2顯示當(dāng)用pp65肽混合物(圖2a)和用非-HCMV肽(圖2b)再刺激時，針對用 多種滅活程序處理過的DB制劑的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)；圖3顯示用多種滅活程序處理過的DB制劑的抗HCMV IgG反應(yīng)；
圖4顯示當(dāng)用pp65肽混合物(圖4a)和用非-HCMV肽(圖4b)再刺激時，針對用 兩種不同滅活程序處理過的DB制劑的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)；圖5顯示用兩種不同滅活程序處理過的DB制劑的抗HCMV IgG反應(yīng)；圖6顯示針對DB制劑的⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)，其中所述DB制劑受到滅活殘 余感染性或致使其具有非-融合性的處理(半動態(tài)UVC照射)，或未受到這樣的處理。用 PP65肽混合物(圖6a)和用非-HCMV肽(圖6b)再刺激；圖7-12是顯示融合性測定結(jié)果的顯微照片，其中進(jìn)行融合性測試的HCMV顆粒經(jīng) 歷了不同的滅活方法；和圖13-19是顯示感染性測定結(jié)果的顯微照片，其中進(jìn)行融合性測試的HCMV顆粒經(jīng) 歷了不同的滅活方法。實施例1 材料和方法以下是實踐本發(fā)明中使用的或本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)該有效用于實踐本發(fā)明的 多種材料和方法的概述。簡言之，HCMV DB制劑接受處理，以滅活殘余HCMV感染性并致使該材料是非-融 合的。然后，對滅活的材料進(jìn)行4種不同的主要類型的分析。分析在小鼠中誘導(dǎo)抗原特異 性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的能力。分析誘導(dǎo)特異性抗-HCMV抗體的能力。分析受到過 滅活殘余感染性的處理的DB材料的感染性。分析滅活的材料的融合性。1.滅活殘余HCMV感染性關(guān)于本發(fā)明使用了多種方法，以使得滅活包含HCMV病毒體和/或HCMV密體的組 合物中的殘余HCMV感染性。1.1半動態(tài)UVC處理由來自以上的 UVC 光(254nm ；UVC 劑量 720mJ/cm2 ；UVC 光SchiittOsram HNS 11 Watt)照射處于緩慢搖動的24-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的300 u 1 DB制劑等分試樣(0. 2mg蛋白/ ml PBS)達(dá)5分鐘。1.2Y 照射處于2ml玻璃瓶中的675 ill DB制劑等分試樣(0. 2mg蛋白/ml)在干冰上接受 52KGy的、輻射。滅活過程后，將該材料冷凍于_80°C，以用于后繼的分析。1.3 低 pH將1. 15ml DB制劑(0. 2mg蛋白/ml)與100mM檸檬酸鈉pH4. 5混合并在30°C溫育 60分鐘。隨后，通過超速離心法沉淀該材料(45分鐘，SW 50. 1轉(zhuǎn)子)并懸浮在1. lml PBS 中以用于后繼的分析(貯存與-80°C)。1.4熱處理將1. 15ml DB制劑(0. 2mg蛋白/ml)在56°C溫育30分鐘。滅菌過程后，將該材料 冷凍于-80°C，以用于后繼的分析。1.53-丙酸內(nèi)酯(BPL)將1. 15ml 樣品(0. 2mg 蛋白/ml)與 10ml 50mM Tris/HCl pH 8. 0 和 0. 24ml 在 50mM Tris/HCl pH 8. 0中新鮮制備的10% BPL溶液(0. 21% v/v BPL終濃度)混合。樣品 在30°C溫育60分鐘。隨后，通過超速離心法沉淀該材料(45分鐘，SW 50. 1轉(zhuǎn)子)并懸浮 在1. lml PBS中以用于后繼的分析(保存在-80°C )。
1. 6隨后進(jìn)行Y照射的動態(tài)UVC處理包含細(xì)胞培養(yǎng)上清液(無染料的培養(yǎng)基)的HCMV顆粒接受使用小UVivatec Lab 單位(由 BTS Bayer Technology Services (BTS Bayer 技術(shù)服務(wù))提供，D_51368 Leverkusen，德國)產(chǎn)生的劑量為200mJ/cm2的動態(tài)UVC。按照由BTS提供的計算書計算 254nm處的劑量。隨后，將DB制劑填充到玻璃瓶中并在干冰上接受23. 8KGy的、照射。保 存在-80°C，以用于后繼的分析。2.測試HCMV病毒體和HCMV密體在小鼠中誘導(dǎo)抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞 反應(yīng)的能力總述用經(jīng)過處理滅活殘余HCMV感染性的DB材料免疫小鼠。將小鼠處死，并摘除 脾。隨后，制備脾單細(xì)胞混懸液，并裂解紅血細(xì)胞。然后，將剩余的脾細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且與定義的肽一起溫育。稍后，分析 脾細(xì)胞的IFN- y陽性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。特異于HCMV抗原pp65的肽會再刺激脾細(xì)胞，因 為它們源自用DB中包含的pp65免疫的小鼠。在該測定中，特異于pp65的CD8陽性細(xì)胞毒 性T-細(xì)胞(包含在脾細(xì)胞混懸液中)將產(chǎn)生IFN- y。用無關(guān)、非-HCMV肽處理脾細(xì)胞作為 陰性對照。用無關(guān)、非-HCMV肽的處理不應(yīng)該引起誘導(dǎo)IFN- y陽性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞， 因為小鼠之前未受到該抗原的免疫。產(chǎn)生IFN-y的CD8+T細(xì)胞毒性細(xì)胞的分析將通過流 式細(xì)胞術(shù)(FACS)進(jìn)行。2.1小鼠的免疫用20 ii g DB制劑免疫(s. c. ) 8周齡雌性BALB/c小鼠。3周后，它們接受用20 u g DB制劑的加強(qiáng)(s. c.)。另外2周后，處死動物，以分析pp65-特異性CTL反應(yīng)，分析抗原-特 異性CD4+T輔助細(xì)胞，分析HCMV-特異性抗體反應(yīng)和分析HCMV-中和抗體反應(yīng)。2. 2在小鼠脾中再_刺激pp65特異性CTL2. 2.1制備脾細(xì)胞-將所有需要的緩沖液加溫到37°C-取脾-將100iim Falcon尼龍篩置于50ml falcon管上，擠榨脾通過篩孔產(chǎn)生單細(xì)胞混 懸液，用總共10ml PBS/1% FCS沖洗-離心1400rpm(250-300g)，5 分鐘，20°C-棄去上清液，將沉淀重新懸浮在10ml紅細(xì)胞裂解緩沖液中(37°C)-在室溫(RT)溫育3分鐘-離心1400rpm(250-300g)，4 分鐘，20°C-用10ml PBS/1% FCS 清洗沉淀；離心 1400rpm，4 分鐘，20°C ；用 10ml PBS/1% FCS重新懸浮第二次并去除結(jié)締組織塊-取等分試樣確定細(xì)胞濃度(使用1 10稀釋度進(jìn)行確定)-離心1400rpm(250-300g)，4 分鐘，20°C-將沉淀重新懸浮在ClickRPMI/完全培養(yǎng)基中，將濃度調(diào)節(jié)到1. 5X107個細(xì)胞 /ml-4個平行孔(100 yl細(xì)胞混懸液/孔)/所需再刺激類型(一式四份)2. 2. 2 肽
2. 2. 2. 1用于用HCMV pp65特異性肽再刺激試劑P印Mixpp65 HCMVA，來自 JPT Peptide Technologies GmbH(JPT 肽技術(shù) GmbH)，10115 柏林；pp65 (HCMVA) #P06725，1 瓶 1 = 25 ii g/ 肽；138 種肽的混合物(15mers， 重疊11) ；400 u g/ml的處于分析級DMS0中的儲液(保存在_20°C )；制備2 u g/ml的工作 儲液。2. 2. 2. 2用于用非-相關(guān)對照肽再刺激試劑非-相關(guān)九堿基順序?qū)φ针?。例如，對于BALB/c小鼠，Kd結(jié)合瘧疾肽 (SYVPSAEQI) ； lmg/ml處于DMS0中的儲液(保存在-20°C )；制備2 u g/ml的工作儲液。2. 2. 3布雷菲德菌素A在DMS0 中制備 10mg/ml 的布雷菲德菌素 A 儲液(Sigma#B_7651)；在 Click RPMI/ 完全培養(yǎng)基中制備20 u g/ml的工作溶液(在再刺激孔中的的終濃度為5 u g/ml)。布雷菲德菌素A阻斷高爾基體的運輸由此抑制產(chǎn)生的細(xì)胞因子的分泌。細(xì)胞因子 在布雷菲德菌素A的處理下保持在細(xì)胞內(nèi)，由此產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞可以利用細(xì)胞內(nèi)染色 法檢測。2. 2. 4PMA/伊屋諾霉素PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)，Sigma#P8139 ；在DMS0中制備lmg/ml 的儲液；在Click RPMI/完全培養(yǎng)基中制備0. 4 y g/ml的工作溶液(在再刺激孔中0. 05 u g PMA/ml)。伊屋諾霉素，Sigma#I0634 ；在DMS0中制備lmg/ml的儲液；在ClickRPMI/完全培 養(yǎng)基中制備4 u g/ml的工作溶液(在再刺激孔中0. 5 u gPMA/ml)。PMA和伊屋諾霉素多克隆地刺激T細(xì)胞。其在測定中起陽性對照的作用，從而確保 細(xì)胞質(zhì)量和細(xì)胞內(nèi)染色程序最佳。2. 2. 5Click RPMI/ 完全培養(yǎng)基10. 81g 粉末 Click RPMI (+L_ 谷氨酰胺 /_NaHC03)來自 AppliChem#A2504.+1. 175g NaHC03用蒸餾水加到1升一無菌過濾+谷氨酰胺2mM+PenStrep-100U/ml 青霉素，100 u g/ml 鏈霉素+5%胎牛血清(FCS)，Invitrogen/Gibco#10106-185,+3-巰基乙醇 4X1(T6M+Hepes 緩沖液 10mM, Invitrogen/Gibco#15630-0492. 2. 6 再刺激設(shè)置(set up)-每一種用于再刺激的脾和肽，分別將100u 1脾細(xì)胞混懸液吸取到96-圓底板的 4個孔中(最終1，5X106個細(xì)胞/孔)-加入50u 1肽工作溶液或25 u 1 PMA/25 u 1伊屋諾霉素工作溶液-加入50u 1布雷菲德菌素A (具有20 ii g/ml)-FACS 分析前，在 37 °C (5 % C02)溫育 4h2. 3CD8陽性(CD8+)T細(xì)胞/用于FACS分析的細(xì)胞內(nèi)IFN Y染色第1天
18
-將固定緩沖液調(diào)節(jié)至室溫(RT)-離心包含再刺激設(shè)置的96-孔圓底板(1400rpm/4分鐘/4°C/具有制動減速； 250-300g)。-將平行溫育的沉淀(一式四份)與90ill緩沖液A(PBS+0. 5% (w/v)BSA+0. 1% (w/v)NaN3)匯集在一起并轉(zhuǎn)移到新的96-孔圓底板中。重復(fù)用90 yl體積沖洗，以從再刺 激裝置中獲得所有剩余細(xì)胞。- > 180 ill總體積/設(shè)置類型。-離心新板-加入120u 1雜交瘤上清液(2. 4G2) /孔，混合并在4°C溫育15分鐘_離心板+除去上清液-加入100ill抗-小鼠⑶8. PE (在緩沖液A中稀釋1 200)—重新懸浮沉淀一
在4°C溫育20分鐘-溫育時間后加入100U 1緩沖液A-離心板并用150u 1 Puffer A/離心清洗2次-向沉淀加入150ill固定緩沖液(處于PBS中的低聚甲醛)，重新懸浮一在 RT溫育15分鐘(在黑暗中)-離心板一用150u 1緩沖液A重新懸浮沉淀_在進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色前，像這樣將板保存在4°C一或兩夜第2天-離心板一用150u 1緩沖液B/孔重新懸浮一在RT溫育15分鐘(黑暗中)-離心一加入50iU/孔的抗-IFNy.FITC(在緩沖液B中1 200稀釋)—重新懸浮并在RT溫育30分鐘(黑暗中)-加入100 Pi 緩沖液 B (PBS+0. 5 % (w/v) BSA+0. 5 % (w/v)皂苷 +0. 05 % (w/v) NaN3)，旋轉(zhuǎn)。-用150ill緩沖液B/孔清洗3次-將細(xì)胞重新懸浮在150u 1緩沖液A/孔中并轉(zhuǎn)移到FACS-管中-再次將剩余細(xì)胞重新懸浮在150u 1 Puffer A中并匯集到相同的FACS管中-通過流式細(xì)胞術(shù)分析60.000⑶8+T細(xì)胞/樣品其他試劑Falcon 尼龍-篩 100 um (Falcon Cat#352360)?？剐∈驝D8a PE 綴合物，0. 2mg/ml ；Cat#553033 ；BD Biosciences (BD 生物科學(xué))。大鼠抗小鼠IFNy FITC 綴合的，0. lmg ；大鼠 IgGl ；克隆 XMG1. 2，Cat#554411 ；BD Biosciences (BD 生物科學(xué))。低聚甲醛 EM 級，Cat#00380_250 ;250mg Polysciences Europe.皂苷(來自Quillaja 樹皮)，Sigma#S_2149 ；25g ；紅細(xì)胞裂解混懸液制備NH4C1儲液0. 16M。制備Tris儲液0. 17M?；旌?. 5升NH4C1儲液和0. 5升 Tris儲液，攪拌1小時，然后將pH調(diào)節(jié)到7. 2。高壓滅菌。2. 4G2雜交瘤上清液抗-Fcy受體FCRII ；來自約4-天培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液(密集細(xì)胞菌苔)。
抗-Fcy受體FCRII用于防止用于染色⑶8和IFNY的抗體與細(xì)胞Fc受體的非 特異性結(jié)合。用于染色的抗體的非特異性結(jié)合會導(dǎo)致假陽性信號。2. 4G2雜交瘤可獲自ATCC。固定緩沖液PBS中的的低聚甲醛lg低聚甲醛處于100ml PBS中(在化學(xué)通風(fēng)櫥中稱重)； 在70°C加熱1小時溶解；保存在4°C。3.ELISA確定小鼠中的抗HCMV IgG反應(yīng)材料SERION ELISA經(jīng)典CMV IgG(Clindia)；條帶覆蓋有HCMV裂解物，備用 (ESR109G)
樣品小鼠血清(見2.1)
程序
-血清向每個孔中加入100 u 1稀釋的血清(在PBS/T中)
例如 1 125 ;1 250 ； 1 500 ；1 1000 ； 1 2000 ； 1 1 8000
在37 °C不搖動溫育1小時 -清洗將抗體溶液輕拍到水槽中。
通過每次用200 u清洗緩沖液沖洗孔5次清洗板 第三次清洗步驟后，通過輕拍面向下置于若干張 紙巾層上的板除去剩余的液體 -AK/HRP 加入在PBS/T中1 1000稀釋的AK抗-小鼠IgG HRP綴合物100 u 1/孔，在37°C不搖動溫育1小 時
-清洗重復(fù)步驟2
-染色在即將使用前制備染色溶液lmg OPD/mL底 物緩沖液+1 U 1/ml H202 (例如，溶解llmg OPD/llml底物緩沖液，加入 11 u 1 H202)
加入染色液100 u 1/孔，在RT，黑暗中溫育10-15 分鐘
-終止加入50 u 1終止溶液并在ELISA讀數(shù)器中在492 nm處測量。
試劑
PBST具有 0. 05% (v/v)吐溫 20 的 PBS
底物緩沖液 0. 1M KH2P04pH 6. 0 終止溶液 IN H2S04( = 0. 5M H2S04) 底物(0PD) 鄰苯二胺，晶體狀；Sigma P-2903
4000 和
H20230%
抗體
多克隆兔抗_小鼠IgG HRP綴合物，DAK0 (1. 3g/l)，#P0260
20
4.測試HCMV顆粒的融合性本測定的目的是測試HCMV顆粒是否仍能夠與顆粒靶細(xì)胞諸如MRC5人成纖維細(xì)胞 融合。分析HCMV pp65蛋白是否可以被引入到各自的靶細(xì)胞中。這是通過免疫熒光顯微鏡 法完成的(抗PP65;核中的綠色熒光染色)。通過DB與成纖維細(xì)胞的融合，pp65蛋白得到 釋放進(jìn)入靶細(xì)胞的胞質(zhì)中。當(dāng)pp65被運送到核中時，通過免疫染色在其中檢測。在不與 HCMV-陰性靶細(xì)胞融合的HCMV顆粒中，間層蛋白pp65位于HCMV顆粒內(nèi)。其不存在于靶細(xì) 胞中。反之亦然，在與HCMV顆粒融合的細(xì)胞中，該細(xì)胞中應(yīng)該存在綠色熒光染色，表示該細(xì) 胞的核中存在PP65。融合性測定流程-將100ill來自正在進(jìn)行培養(yǎng)的MRC5人成纖維細(xì)胞細(xì)胞(ATCC，#ATCC_CCL_171) 置于新鮮培養(yǎng)基(1X105個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基；37°C，5% C02 ；一式四份；96孔板)中。-在37°C溫育過夜-從每個孔中除去70U 1培養(yǎng)基并加入5 U 1待測試融合性的樣品-1小時后加回70 u 1培養(yǎng)基并溫育24小時-從細(xì)胞中除去上清液(96孔板)-加入200ill/孔的96%乙醇并在RT溫育20分鐘-用150 ii 1 PBS/0. 1 % Triton X100/ 孔清洗 4 次-用50ill的SN2. 4G2/孔在RT封閉15分鐘_從細(xì)胞中除去上清液-加入初次抗體(50Pi/ 孔)抗 _pp65，在 PBS 中 1 100 稀釋，#C8A023M。-在37°C溫育1小時-用150 ii 1 PBS/0. 1 % Triton X100/ 孔清洗 3 次-50 u 1/ 孔加入二次抗體 + 伊文思藍(lán)(Evans Blue)(在 PBS 中，2. Abl 50/ 伊 文思藍(lán)1 25)，#E0413，并在37°C溫育30分鐘。-用150 ii 1 PBS/0. 1% Triton X100/孔清洗 4 次-加入50 u 1/ 孔鏈霉抗生物素蛋白 /FITC (在 PBS 中 1 100)，BeckmanCoulter, #PN IM 0307。-在4°C溫育15分鐘。-用150 ii 1 PBS/0. 1 % Triton X100/ 孔清洗 3 次-加入150u 1 PBS/孔(無TX100)并保存在4°C，用鋁箔包裹(避光)直到準(zhǔn)備 用于通過熒光顯微鏡法進(jìn)行分析。-通過熒光顯微鏡法的方式進(jìn)行分析。初次抗體為了顯示融合性抗pp65，克隆 1-L-11，小鼠腹水，Biodesign，Cat#C8A023M，lmg/ ml ；在PBS中1 100稀釋使用。二次抗體多克隆兔抗-小鼠Ig/生物素化的兔F(ab，)2Dako，#E0413，(0. 79g/l)；在PBS中 1 50稀釋使用。伊文思藍(lán)
Fluka#46160-在PBS中溶解到0. 5%并在PBS中1 25稀釋使用。鏈霉抗生物素蛋白_DTAF(Str印/FITC)Beckman Coulter, #PN IM 0307(1. 8mg/ml)；在 PBS 中 1 100 稀釋使用。PBS/0. 1% Triton X_100(用于清洗)。SN2. 4G2雜交瘤上清液抗-Fc y Rezeptor FcRII ；來自約4_天培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液(密集細(xì)胞菌苔)。抗-Fcy受體FCRII用于防止用于染色⑶8和IFNY的抗體與細(xì)胞Fc受體的非 特異性結(jié)合。用于染色的抗體的非特異性結(jié)合會導(dǎo)致假陽性信號。2. 4G2雜交瘤可獲自ATCC。培養(yǎng)基具有10%FCS 的 MEM2mM谷氨酰胺50mg/ml 慶大霉素ImM MEM丙酮酸鈉lx NEAA (非必需氨基酸)5.測試HCMV顆粒的感染性感染性測試測定用于確定有效的病毒滅活。在該測定中，成纖維細(xì)胞與包含感 染性(陽性對照)或滅活的(非-感染性)病毒的樣品一起溫育。隨后的AEC( = 3_氨 基-9-乙基咔唑)染色是視覺化靶蛋白的免疫組化測定。在該情形中，單克隆小鼠抗體靶 向HCMV IEA(即時早期抗原)，所述HCMV IEA是細(xì)胞感染IEA在48小時達(dá)到強(qiáng)度峰之后不 久出現(xiàn)并在整個HCMV感染周期過程中保持的病毒蛋白。二次抗體是與HRP (辣根過氧化物 酶)綴合的抗-小鼠多克隆抗體。洗去未結(jié)合的綴合物并加入顯色底物(AEC)。該底物由 結(jié)合的酶綴合物水解并產(chǎn)生不溶性終產(chǎn)物，所述終產(chǎn)物是紅色的并可以通過顯微鏡法視覺 觀察。由于IEA是核蛋白，已經(jīng)受HCMV感染的細(xì)胞可以通過它們的帶色的核來識別。參考 項僅起染色程序?qū)φ盏淖饔?。?dāng)各自孔中無細(xì)胞核被染色時，認(rèn)為給定樣品是非_感染性 的。感染性測定流程-將100ill來自正在進(jìn)行培養(yǎng)的MRC5人成纖維細(xì)胞細(xì)胞(ATCC，#ATCC, #CCL-171)置于新鮮培養(yǎng)基(1\105個細(xì)胞/!111培養(yǎng)基；371，5%0)2;—式四份；96孔板)中。-24小時后，將100 u 1待測試感染性的材料的稀釋物加入到100 u 1細(xì)胞中(例 如，在表2中分別地，1 200的參考項稀釋物或0.3 yg測試項蛋白)-在37°C溫育48小時-48小時后除去HCMV上清液-分別用150u 1 PBS/孔清洗細(xì)胞-用96%乙醇(200yl/孔)在RT固定細(xì)胞20分鐘-用PBS (150 Pi/ 孔)清洗 2 次-加入針對IE抗原的初次抗體(aHCMV IEA, Argene ；#11-003)，在PBS中稀釋 1 100 (50 u 1/ 孑L )
-在37°C溫育60分鐘；在保濕室(培養(yǎng)箱)中用塑料包裹物包裹-分別用PBS/0. 1 % Triton X100,150 u 1/ 孔清洗 3 次。-加入二次抗體在PBS中1 500稀釋的抗-小鼠過氧化物酶(例如，Dako P0260) (50 ii 1/ 孔)-在37°C溫育60分鐘；在保濕室(培養(yǎng)箱)中用塑料包裹物包裹-分別用PBS/0. Triton X100，150 yl/孔清洗 3 次。-染色在乙酸鹽緩沖液中1 20稀釋的AEC-儲液，經(jīng)過之前用乙酸鹽緩沖液預(yù) 濕的濾紙過濾2次。-在即將染色程序之前加入1 1000H202(30% )-從該染色溶液加入100u 1/孔-在37°C，黑暗中溫育正好1小時(培養(yǎng)箱)-分別用2xPBS 清洗，150 u 1/ 孔-對于顯微鏡觀察，加入lXPBS(150iU/孔)；保存在4°C。感染的核應(yīng)該是亮紅 色。AEC 儲液用DMF( 二甲基-甲酰胺(Formamid) ；Roth ；#6251. 1)將 400mg AEC( = 3-氨 基-9-乙基咔唑；Sigma ;#A6926)配制為100ml ；制備2ml等分試樣并保存在_20°C。乙酸鹽緩沖液13. 6g 乙酸鈉 x 3H20+2. 88ml 冰乙酸 +H20 達(dá)到 1000ml，調(diào)節(jié)到 pH4. 9。培養(yǎng)基具有10% FCS 的 MEM2mM谷氨酰胺50mg/ml 慶大霉素ImM MEM丙酮酸鈉lx NEAA (非必需氨基酸)實施例2結(jié)果pp65特異性CD8+CTL反應(yīng)的結(jié)果總之，這顯示，受到滅活殘余HCMV感染性和使DB制劑非-融合處理的DB制劑保 持能夠在小鼠中誘導(dǎo)PP65特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(圖2和4)。受處理的樣品， 如圖7-12中所示，是非-融合的，且如表2中所示，是非感染性的。受到滅活殘余HCMV感染性和使DB制劑非-融合處理的DB制劑顯示出與未處理 的HCMV制劑具有相等的免疫原性(圖6)。這是通過小鼠中HCMV pp65_特異性⑶8+細(xì)胞 毒性T細(xì)胞反應(yīng)判斷的。圖2顯示來自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的結(jié)果，所述DB材料受到如實施例1 中所概述的滅活殘余感染性和使其非融合的處理分別地，UVC(720mJ/cm2)，低pH，高溫，、 照射(52KGy)和丙酸內(nèi)酯。X-軸表示產(chǎn)生IFN-y的⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量/105 個⑶8+T細(xì)胞。在該測定中，特異于pp65的⑶8陽性細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(包含在脾細(xì)胞混 懸液中)會產(chǎn)生IFN-Y (圖2a)。用無關(guān)、非-HCMV肽處理脾細(xì)胞起關(guān)于再刺激的陰性對照的作用(圖2b)。結(jié)果顯示，即使受到滅活殘余感染性處理的DB制劑仍能夠誘導(dǎo)特異于 HCMV pp65的⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。用PBS免疫的小鼠幾乎不表現(xiàn)出任何產(chǎn)生IFN-y 的⑶8+T細(xì)胞。圖4顯示來自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的結(jié)果，所述DB材料受到如實施例1 中所概述的滅活殘余感染性和使其非融合的處理分別地，單獨的UVC照射或動態(tài)UVC和隨 后Y照射(23.8KGy)。X-軸表示產(chǎn)生IFN_y的⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量/105個⑶8+T 細(xì)胞。在該測定中，特異于PP65的CD8陽性細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(包含在脾細(xì)胞混懸液中) 會產(chǎn)生IFN- Y (圖4a)。用無關(guān)、非-HCMV肽處理脾細(xì)胞起關(guān)于再刺激的陰性對照的作用 (圖4b)。結(jié)果顯示，即使受到兩種照射程序的組合處理的DB制劑仍能夠誘導(dǎo)特異于HCMV PP65的⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。用PBS免疫的小鼠幾乎不表現(xiàn)出任何產(chǎn)生IFN- y的 ⑶8+T細(xì)胞。圖6顯示來自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的結(jié)果。該材料受到滅活殘余感染性 和使其非融合(半動態(tài)UVC照射)的處理，或該材料未接受這樣的處理。X-軸表示產(chǎn)生IFN-Y的⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量/105個⑶8+T細(xì)胞。在該測定 中，特異于PP65的⑶8陽性細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(包含在脾細(xì)胞混懸液中)會產(chǎn)生IFN- y (圖 6a)。用無關(guān)、非-HCMV肽處理脾細(xì)胞起關(guān)于再刺激的陰性對照的作用(圖6b)。結(jié)果顯示， 受到滅活殘余HCMV感染性和使DB制劑非融合處理的DB制劑具有與未處理的HCMV制劑相 等的免疫原性。這是通過小鼠中HCMV pp65-特異性⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)判斷的。用 PBS免疫的小鼠幾乎不表現(xiàn)出任何產(chǎn)生IFN- y的⑶8+T細(xì)胞?？笻CMV IgG反應(yīng)的結(jié)果總之，這顯示，受到滅活殘余HCMV感染性和使DB制劑非-融合處理的DB制劑保 持能夠誘導(dǎo)特異性抗HCMV IgG反應(yīng)(圖3和5)。樣品，如圖7-12中所示，是非-融合的， 且如表2中所示，是非感染性的。圖3顯示來自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的結(jié)果，所述DB材料受到如實施例 1中所概述的滅活殘余感染性和使其非融合的處理分別地，UVC(720mJ/cm2)，低pH，高溫， Y照射(52KGy)和丙酸內(nèi)酯。仍能夠誘導(dǎo)測定信號的最大血清稀釋度越高，則誘導(dǎo)的 抗-HCMV反應(yīng)越強(qiáng)。結(jié)果顯示，即使受到兩種照射程序的組合處理的DB制劑仍能夠誘導(dǎo)特 異性抗-HCMV IgG反應(yīng)。圖5顯示來自用DB材料免疫的Balb/C小鼠的結(jié)果，所述DB材料受到如實施例1 中所概述的滅活殘余感染性和使其非融合的處理分別地，單獨的UVC照射或動態(tài)UVC和隨 后、照射(23. 8KGy)。仍能夠誘導(dǎo)測定信號的最大血清稀釋度越高，則誘導(dǎo)的抗-HCMV反應(yīng) 越強(qiáng)。結(jié)果顯示，即使受到兩種照射程序的組合處理的DB制劑仍能夠誘導(dǎo)特異性抗-HCMV IgG反應(yīng)。融合性測定結(jié)果總之，結(jié)果顯示，用于顯示pp65特異性⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(圖2和4)以 及誘導(dǎo)特異性抗-HCMV抗體(圖3和5)的滅活DB制劑是非融合的；且如表2中所示，是非 感染性的。如實施例1中所概述地處理樣品。樣品P4中的非特異性綠色染色歸因于人為產(chǎn)物。典型感染性測定結(jié)果
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總之，結(jié)果顯示，受到滅活殘余HCMV感染性和使DB制劑非-融合處理的DB制劑 是非感染性的。然而，如通過其誘導(dǎo)特異于HCMV抗原pp65的⑶8陽性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反 應(yīng)的能力判斷(圖2和4)和如通過其誘導(dǎo)特異性抗-HCMV IgG的能力(圖3和5)判斷， 這些樣品保持免疫原性。僅與培養(yǎng)基一起溫育的細(xì)胞起陰性對照的作用。只有未_滅活參 考項能夠誘導(dǎo)紅色染色的核，即是感染性的。如實施例1所概述地處理樣品。表2 本說明中、權(quán)利要求和/或附圖中公開的本發(fā)明特征可以分開地和以其任何組合 地作為以其多種形式實現(xiàn)本發(fā)明的材料。
權(quán)利要求
一種組合物，所述組合物包括選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組中的試劑，其中所述組合物在所述病毒體、NIEP和/或密體是非融合的時，能夠闡明免疫反應(yīng)。
2.一種組合物，所述組合物包括選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組中 的一種試劑，其中所述組合物在所述病毒體、NIEP和/或密體是非融合的時，能夠闡明免疫 反應(yīng)，其中所述組合物可以通過包括下列步驟的方法獲得a)提供一種或多種所述試劑；b)處理所述試劑以致使它們在仍能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的同時是非_融合的。
3.按照權(quán)利要求1和2中任一項的組合物，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+反應(yīng)。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項的組合物，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項的組合物，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+，細(xì)胞 毒性T細(xì)胞反應(yīng)。
6.按照權(quán)利要求1-5中任一項的組合物，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)， 優(yōu)選所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)，其中所述抗體是中和抗體。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項的組合物，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD4+T輔助 細(xì)胞反應(yīng)。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項的組合物，其中所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV抗 原優(yōu)選選自包括以下各項的組PP65抗原，pp65抗原衍生物，pp28和pp28衍生物，ppl50 和pp 150衍生物，gB和gB衍生物，gH和gH衍生物，和即時早期抗原及其衍生物，糖蛋白和 糖蛋白衍生物，優(yōu)選HCMV糖蛋白和HCMV糖蛋白衍生物，其中所述糖蛋白優(yōu)選是gM和gM衍 生物，或gN和gN衍生物。
9.按照權(quán)利要求1-8中任一項的組合物，其中所述試劑的滅活的。
10.按照權(quán)利要求1-9中任一項的組合物，其中所述組合物是藥物組合物或診斷組合物。
11.試劑或包括所述試劑的組合物用于制備藥物的用途，其中所述試劑選自包括HCMV 病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述試劑是非融合的，所述藥物優(yōu)選用于闡明針 對一種或多種HCMV抗原的免疫反應(yīng)。
12.試劑或包括所述試劑的組合物、優(yōu)選如權(quán)利要求11中定義的組合物用于制備藥物 的用途，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，所述藥物用于 闡述免疫反應(yīng)、優(yōu)選針對一種或多種HCMV抗原的免疫反應(yīng)，其中所述組合物和/或所述試 劑經(jīng)歷過滅活。
13.試劑或包括所述試劑的組合物用于制備疫苗的用途，其中所述試劑選自包括HCMV 病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述試劑是非融合的。
14.試劑或包括所述試劑的組合物、優(yōu)選如權(quán)利要求11中定義的組合物用于制備疫苗 的用途，其中所述試劑選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述組合 物和/或所述試劑經(jīng)歷過滅活。
15.按照權(quán)利要求11和12中任一項的用途，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+反應(yīng)。
16.按照權(quán)利要求11-15中任一項的用途，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)。
17.按照權(quán)利要求11-16中任一項的用途，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD8+，細(xì)胞 毒性T細(xì)胞反應(yīng)。
18.按照權(quán)利要求11-17中任一項的用途，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)， 優(yōu)選所述免疫反應(yīng)是抗原特異性抗體反應(yīng)，其中所述抗體是中和抗體。
19.按照權(quán)利要求11-18中任一項的用途，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性CD4+T輔助 細(xì)胞反應(yīng)。
20.按照權(quán)利要求11-19中任一項的用途，其中所述抗原是HCMV抗原，其中所述HCMV 抗原優(yōu)選選自包括以下各項的組PP65抗原，pp65抗原衍生物，pp28和pp28衍生物，ppl50 和PP150衍生物，gB和gB衍生物，gH和gH衍生物，和即時早期抗原及其衍生物，糖蛋白和 糖蛋白衍生物，優(yōu)選HCMV糖蛋白和HCMV糖蛋白衍生物，其中所述糖蛋白優(yōu)選是gM和gM衍 生物，或gN和gN衍生物。
21.按照權(quán)利要求13-20中任一項的用途，其中所述疫苗用于治療和/或預(yù)防HCMV感
22.按照權(quán)利要求13-21中任一項的用途，其中所述疫苗用于治療和/或預(yù)防移植供體 和/或移植受體中由HCMV引起的疾病。
23.試劑或包括所述試劑的組合物用于制備診斷劑的用途，其中所述試劑選自包括 HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述試劑是非融合的。
24.試劑或包括所述試劑的組合物用于制備診斷劑的用途，其中所述試劑選自包括 HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組，其中所述組合物和/或所述試劑經(jīng)歷過滅活。
25.用于制備如權(quán)利要求1-10中任一項所定義的組合物的方法，包括以下步驟 a)提供選自包括HCMV病毒體、HCMVNIEP和HCMV密體的組的試劑；b)處理所述試劑，以致使所述試劑在仍能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的同時是非_融合的。
26.按照權(quán)利要求25的方法，其中所述步驟b)的處理是選自包括UV處理、高能量照 射、低PH處理、熱處理和用交聯(lián)劑處理的組中的方法中的一種或任意組合。
27.按照權(quán)利要求26的方法，其中所述UV處理是UVC處理，其中波長是約 100nm-280nm,或用長波UV處理。
28.按照權(quán)利要求26和27中任一項的方法，其中所述UV處理使用的劑量范圍是 100-2000mJ/cm2，優(yōu)選 100-1000mJ/cm2 和更優(yōu)選 150_900mJ/cm2。
29.按照權(quán)利要求26-28中任一項的方法，其中在所述UV處理之前，過程中或之后，對 所述試劑進(jìn)行Y照射。
30.按照權(quán)利要求26的方法，其中所述高能量照射是γ照射。
31.按照權(quán)利要求30的方法，其中連同所述Y照射的Y輻射在約15-70KGy，更優(yōu)選 20-65KGy和更優(yōu)選20_60Kgy的劑量范圍內(nèi)施用。
32.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述處理是低pH處理且所述低pH處理包括將所述 試劑暴露于約0-5，優(yōu)選1-4. 5和更優(yōu)選2-4. 5的pH。
33.按照權(quán)利要求32的方法，其中所述試劑經(jīng)歷低pH處理約0.5-24小時，優(yōu)選0. 5-12小時和更優(yōu)選0. 5-6小時。
34.按照權(quán)利要求32和33中任一項的方法，其中所述試劑在約1_50°C，優(yōu)選1_45°C和 更優(yōu)選1-40°C經(jīng)歷低pH處理。
35.按照權(quán)利要求26的方法，其中所述熱處理包括在37.5°C _65°C的溫度，優(yōu)選在 37. 5-60°C的溫度和更優(yōu)選在37. 5_56°C的溫度溫育所述試劑。
36.按照權(quán)利要求35的方法，其中溫育所述試劑5秒-36小時，優(yōu)選5秒-30小時，和 更優(yōu)選5秒-24小時的時期。
37.按照權(quán)利要求26的方法，其中所述處理是用一種或多種交聯(lián)劑處理且其中所述交 聯(lián)劑，分別且獨立地選自包括內(nèi)酯、乙醇鹽和醛的組。
38.按照權(quán)利要求37的方法，其中所述交聯(lián)劑是β-丙酸內(nèi)酯。
39.按照權(quán)利要求37的方法，其中所述交聯(lián)劑是環(huán)氧乙烷。
40.按照權(quán)利要求37的方法，其中所述交聯(lián)劑是甲醛。
41.按照權(quán)利要求37-40中任一項的方法，其中所述試劑暴露于交聯(lián)劑，包含所述 試劑的培養(yǎng)基中的所述交聯(lián)劑和更優(yōu)選β-丙酸內(nèi)酯的濃度是0.01-10% (ν/ν)，優(yōu)選 0. 05-10% (ν/ν)，和更優(yōu)選約 0. 05-7. 5% (ν/ν)。
42.按照權(quán)利要求37-41中任一項的方法，其中所述試劑與所述交聯(lián)劑和更優(yōu)選β-丙 酸內(nèi)酯一起溫育1分鐘-72小時，優(yōu)選1分鐘-48小時，和更優(yōu)選1分鐘-24小時的時期。
43.按照權(quán)利要求37-42中任一項的方法，其中所述試劑在約1°C-約60°C的溫度，優(yōu) 選在約1°C -50°C的溫度，和更優(yōu)選在約1°C -40°C的溫度下溫育。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合物，其包括選自包括HCMV病毒體、HCMV密體和HCMV NIEP的組中的試劑，其中所述組合物在所述病毒體、NIEP和/或密體是非融合的時，能夠闡明免疫反應(yīng)。
文檔編號A61P31/22GK101868250SQ200880014911
公開日2010年10月20日 申請日期2008年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者萊安德·格羅德 申請人:疫苗工程管理有限公司;萊因生物技術(shù)-新生物技術(shù)工藝和產(chǎn)品有限公司