專利名稱：：來自NephilengysCruentata蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛和ParawixiaBistriata蜘蛛的網(wǎng)的蛋白的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及從編碼與蜘蛛網(wǎng)相關的蛋白的核酸分離的分子、這些分子的片段或其他衍生物。本發(fā)明還涉及含有分離自編碼與iVepfe7ewg^Craewtoto蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛(v4v/cw/fl〃'aJwn/em&)和Paraw/x/a5/Wn'ato蟲知妹的網(wǎng)相關的蛋白的核酸的分子的嵌合基因和表達載體。本發(fā)明的另一實施方案是含有本發(fā)明的基因構建物或表達載體的轉化細胞。本發(fā)明的另一實施方案還涉及獲得含有本發(fā)明的基因構建物或表達載體的遺傳修飾的生物體的方法以及從A^p/w7e"g^CraeMtoto蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛和i^rmv/jda5/Whflto蜘蛛的絲獲得重組蛋白的方法。最后，本發(fā)明說明了由本發(fā)明的重組蛋白組成的產品，諸如生物絲和組合物。
背景技術：
：近年來工業(yè)對于獲得同時提供高耐性、輕重量和全面通用性的合成或天然纖維給予了極大的關注。目前使用的大多數(shù)合成纖維，諸如尼龍或芳綸，表現(xiàn)為高生產成本以及一些其他不需要的特性諸如高密度或應用領域受限。在天然纖維中，由蠶(家蠶)提供的絲在紡織工業(yè)中已經(jīng)使用了5000年以上(Hyde,N.1984.Thequeenoftextiles.iVaf/.Geogr.165,3-49)。此卵嚢的纖維由兩條絲的連續(xù)纖維，重鏈-(三350kDa)和輕鏈絲心蛋白(三25kDa)通過稱為絲膠蛋白的粘附蛋白連才妾組成(JinH.J.,KaplanD.L.(2003).Mechanismofsilkprocessingininsectsandspiders.Atowre424:1057-1061)。在商業(yè)上，絲月交蛋白通過在熱水和肥皂中浸泡而從卵囊中去除，每個卵嚢產生300-1200m可用纖維(絲心蛋白)。不同于蠶，蜘蛛還沒有被馴化用于紡織應用中。此基本差異的原因是由于蜘蛛的獨處性和掠食特性難以獲得大量的蜘蛛群體；此外，蜘蛛絲的產量小，不能以蠶繭的方式聚集成束樣的簡單纖維。然而，由蜘蛛產生的絲所表現(xiàn)的物理特性遠遠優(yōu)于來自蠶的絲(DickinsonM.H.(1999).Bionics:Biologicalinsightintomechanicaldesign./Voc.Ato/.爿cadSd.96:14208-14209)。由于其極大的彈性和耐性，蜘蛛網(wǎng)的絲不僅在紡織工業(yè)中而且在來自最多樣化產業(yè)的其他工業(yè)，諸如化妝品工業(yè)中(US20050019297)也倍受關注。蜘蛛是地球上表現(xiàn)最大多樣性和豐度的生物體之一。蜘蛛目為蛛形綱中第二大類以及節(jié)肢動物中第七大類，其在110個科中包括超過39,000個種類(SeldenP.A.1989.Orb-weavingspidersintheearlyCretaceous.Atowre，340:711-712;ShearW.A.,PalmerJ.A.,CoddingtonJ:A.,BonamoP.M.1989.aDevonianSpinnert:earlyevidenceofspidersandsilkuse.&/ewce246:479-481;Platnick,N.I.2006.77ze衡r/t/一t/e7'cato/og,vw/ow6.5.AmericanMuseumofNaturalHistory)。據(jù)估計單巴西就有4,000-10,000個蜘蛛種類[Brescovit,A.D.1999.Araneae.見5/oWvera油tfe<iofcto^foflfeMo尸做/。,Brazil.Joly,C.A.&C.E.M.Bicudo(orgs.).Funda;aodeAmparoaPesquisadoEstadodeSSoPaulo,SaoPaulo,SP]。從蜘蛛絲的蛋白獲得的纖維的耐性比鋼高5倍，柔韌性比尼龍高30%。在其他應用當中，它們可用于制造繩和纜、釣線、防彈衣、降落傘材料。此外，由于它們以生物可降解物質組成，蜘蛛絲可具有醫(yī)療應用，諸如制造縫合線和外科敷料、繃帶、人工腱和韌帶、用于藥物載體的基質等(W02004016651;Gosline,J.M.;P.AGuarette;C.S.Ortlepp&K.N.Savage,1999.Themechanicaldesignofspidersilks:fromfibroinsequencetomechanicalfunction.TTzeo/Expen'膨幽/腸/ogy,202:3295-3303;Heslot,1998.Artificialfibrousproteins:areview.80:19-31)。由蜘姝產生的絲在位于腹部的區(qū)域中的腺體中合成并通過一系列將具有高分子量的水溶性絲蛋白轉變?yōu)榉撬苄岳w維的噴絲頭而聚合(BenitoB.,2002.Synthesizingspidersilk.7>e"ABfotec/mo/.20:189)。纖維的類型和性質有幾種，并且它們耳又決于蜘蟲朱的種類[Denny,M.W"1980.Silks-theirpropertiesandfunctions.見Afec/aw'cfl/p/*Bz.o/og/c"/Afoten'a/s.Vincent,J.F.V.,Currey,J.D.(Eds.),CambridgeUniversityPress,Cambridge,pp.247-272]。蟲知蛛具有7種產絲腺體負責產生用于包封昆蟲的葡萄狀腺、產生形成存放卵的卯嚢的絲的圓柱腺和產生形成球體網(wǎng)的絲的鞭毛狀腺、"主壺腹腺(majorampullate)"、"次壺腹腺(minorampullate)"、梨狀腺和冠狀腺，然而，沒有已知科的蜘蛛具有全部7種腺體。在由蜘蛛產生的不同的絲中，由"主壺腹腺"合成的牽絲非常堅硬并且具有與7良好的粘彈性(牽絲35%，芳綸5%)有關的類似于芳綸的拉伸強度(4><109N/m2)(OroudjevE.,SoaresJ.,ArcidiaconoS.,ThompsonJ.B.,FosseyA.S.,HansmaH.G.(2002).Segmentnanofibersofspiderdraglinesilk:Atomicforcemicroscopyandsingle-moleculeforcespectroscopy./Voc./V"http://.5W.USA99:6460-6465)。牽絲被蜘蛛用來逃避捕食者并且用作產生絲的框架。由"次壺腹腺"產生的絲，當建造網(wǎng)時用于加固，其具有與牽絲類似的拉伸強度，但彈性較小(ColginM,A,,LewisR.V.1998.Spiderminorampullatesilkproteinscontainnewrepetitivesequencesandhighlyconservednon-si!k-like'spacerregions'./Vote/w5W.7:667-672;HayashiC.Y.,BlackledgeT.A.,LewisR.V.2004.Molecularandmechanicalcharacterizationofaciniformsilk:uniformityofiteratedsequencemodulesinanovelmemberofthespidersilkfibroingenefamily.Mo〖.27:1950-1959)。蜘蟲未絲是表現(xiàn)非凡的物理特性的生物聚合物(CunniffP.M.,FosseyS.A.,AuerbachM.A.，1994a.MechanicalandthermalpropertiesofdraglinesilkfromthespiderNephilaclavipes.尸o/yJdv.7fec/2"o/.5:401-410，CunniffP.M.,FosseyS.A.，AuerbachM.A.,1994b.MechanicalpropertiesofmajorampullateglandsilkfibersextractedfromiVep/H'/ac/av—sspiders.見Kaplan,D丄.,Adams,W.W.,Farmer,B.,Viney,C.(主編)，S涯S戸，/扁544,pp.234-251;KoF.K.,JovicicJ.,2004.Modellingofmechanicalpropertiesandstructuraldesignofspiderweb.5/owacromo/ecw/e515:780-785),但關于由特定種類的蜘蛛產生的不同的絲的組成，了解有限。不同的絲蛋白含有重復氨基酸，這些重復氨基酸根據(jù)絲的目的而變化并由此賦予生物聚合物以不同的機械性能(GoslineJ.M.,GueretteP.A.,OrtleppC.S.,SavageK.N.(1999).Themechanicaldesignofspidersilks:fromfibroinsequencetomechanicalfunction.TTzeJ五罕.S/o/.202:3295-3303)。才艮據(jù)環(huán)境條件和要求，絲氨基酸的組成不僅在不同的蜘4未之間而且對于同一蜘蟲朱在不同日時可發(fā)生相當大的變化(WorkR.W.，YoungC.T.,,1987.Theaminoacidcompositionsofmajorandminorampullatesilksofcertainorb-web-buildingspiders(Araneae,Araneidae)./y^ac/zwo/.15:65-80;VolltrahF.1999.Biologyofspidersilk.S/o/.TWacrcwzo/.24:81-88;CraigC丄.，RiekelC，HerbersteinM.E.，WeberR.S.,KaplanD.,PierceN.E.,2000.Evidencefordieteffectsonthecompositionofsilkproteinsproducedbyspiders.Mo/.Aw/.17:1904-1913)。此事實提出了關于基因組序列和編碼這些蛋白的基因的結構的問題。準備工業(yè)應用這些絲的第一個研究主要涉及兩個種類的蛋白分析絡新婦蛛(A^//w7ac/avipey)和十字圓蟲朱(JrawewJ/"Je附aMs)。從這兩個種類中分離的牽絲是所有由蜘蛛合成的纖維中研究最多的。牽絲由"主壺腹腺"產生的兩種蛋白形成，在絡新婦蛛中稱為MaSpl和MaSp2(主壺腹腺蜘蛛絲蛋白)，在十字圓蛛中稱為ADF-3和ADF-4(十字圓蛛絲心蛋白)(HinmanM.B.，Lewis,R.V.1992.Isolationofaclonecodingaseconddraglinesilkfibroin,A^epM"c/謂joes1draglinesilkisatwoproteinfiber.i/o/.CAew.267:19320-19324;GueretteP.,GinzingerD"WeberB.，Gosline丄1996.Silkpropertiesdeterminedbygland-specificexpressionofaspiderfibroingenefamily.5Wewce272:112-115;BeckwittR.,ArcidiaconoS.1994.SequenceconservationintheC-terminal5regionofspidersilkproteins(Spidroin)from/VepM"c/avipas'(Tetragnathidae)andAraneusZ>/ce"te，,/t(Araneidae).d'附.269:6661-6663;BeckwitR.,ArcidiaconoS.，StoteR.1998.Evolutionofrepetitiveproteins:spidersilksfrom7VepMac/謂》as1(Tetragnathidae)andy^Y/we^/H'ct'w/",/M5(Araneidae).Afo/ec.28:121-130)。牽絲蛋白的分子量為80kDa-720kDa，取決于分析條件(MelloCM.，SenecalK.YeungB.,VourosP.,KaplanD.I.1994.InitialcharacterizationofNephilaclavipesdraglineprotein.見KaplanD.L.AdamsW.WFarmerB.VineyC.(主編).SilkPolymers:MaterialsScienceandBiotechnology.J膨〃'c朋C7;價/cfl/Soc/,5^m;ow'Mm&n'e&544:67-79)。在牽絲纖維中這些蛋白的氨基酸組成趨于表明MaSpl和MaSp2、以及ADF-4和ADF-3之間的分子比為大約3:1(HinmanM.B.,Lewis,R.V.1992.Isolationofaclonecodingaseconddraglinesilkfibroin,A^//w7ac/m^esdraglinesilkisatwoproteinfiber.J.Biol.Chem.267:19320-19324;LombardiS丄，KaplanD.L.1990.Theaminoacidcompositionofmajorampullateglandsilk(dragline)ofTVepM"c/av—s(Araneae,Tetragnathidae).J.Arachnol.18:297-306;GueretteP..GinzingerD.,WeberB.,GoslineJ.1996.Silkpropertiesdeterminedbygland-specificexpressionofaspiderfibroingenefamily.Science272:112-115)。盡管由兩種不同的種類產生，但"主壺腹腺"的蛋白包括大量的相同氨基酸的重復。例如，在MaSp2和ADF-3中，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸占存在于其結構中的氨基酸的99%(HayashiC.Y.,LewisR.V.1998.Evidencefromflagelliformsilk.cDNAforthestructuralbasisofelasticityandmodularnatureofspidersilks./—M>/.275:773-784》對于絡新婦蛛的牽絲的特性和可能應用已經(jīng)進行了幾項工作[US6268169;US6412261;W09U635〗；BeckwittR.&ArcidiaconoS.，1994.SequenceconservationintheC陽terminalregionofspidersilkproteins(Spidroin)from7Ve//7//ac/"vz》es(Tetragnathidae)andJrawews6/ce"te"an'ws(Araneidae)./C/zem.269,6661-6663;ArcidiaconoS.，Mello,C,KaplanD丄.，Cheley,S.,Bayley，H.,1998.Purificationandcharacterizationofrecombinantspidersilkexpressedinco/Z.J///.歷0阮/7"0/.49,31-38]。除了由"主壺腹腺"產生的絲的蛋白以外，絡新婦蛛的另一經(jīng)常被研究的絲是由"次壺腹腺"產生的絲。正如由前一腺體產生的絲的情況一樣，該絲也是從由氨基酸序列的不完全重復構成的兩種肽(MiSPl和MiSP2)形成的(US5733771)。在1998年，Hayashi和Lewis(HayashiC.Y.,LewisR.V.,1998.Evidencefromflagelliformsilk.cDNAforthestructuralbasisofelasticityandmodularnatureofspidersilks.J.Tkfo/.8/0,275:773-784)對由絡新婦蛛的鞭毛狀腺產生的絲的蛋白進行了測序(Gosline,J.M.;P.AG彥tte;C.S.Ortlepp&K.N.Savage,1999.Themechanicaldesignofspidersilks:fromfibroinsequencetomechanicalfunction.77ze■/owma/q/"E印e,'/附e"to/5/o/ogy，202:3295-3303)。對于十字圓蟲朱，已經(jīng)發(fā)表了涉及產生蛋白ADMAG1和ADMAG2的"主壺腹腺"的類似結果(GueretteP.,GinzingerD.,WeberB.,GoslineJ.,1996.Silkpropertiesdeterminedbygland-specificexpressionofaspiderfibroingenefamily.S"'e"ce，272:112-115)?；贒NA分析，能夠證實所有包括蜘蛛絲的蛋白由重復肽單位形成。這些重復肽單位可分為四大類GPGXX(其中X常常代表Q)，富丙氨酸序列(An或(GA)n)、GGX(其中X^A、Y、L或Q)以及間隔區(qū)。第五類相當于蛋白的N-和C-末端處的非重復區(qū)，并且通常是由100或更多個氨基酸構成的鏈(XuM.,LewisR.V.,1990.Structureofaproteinsuperfiber:Spiderdraglinesilk.Ato/.Jcad5W.87:7120-7124;HinmanM.B.,Lewis,R.V.1992.Isolationofaclonecodingaseconddraglinesilkfibroin,iVep/7/7ac/謂》&sdraglinesilkisatwoproteinfiber.C7ze附.267:19320-19324;ColginM.A.,LewisR.V.1998.Spiderminorampullatesilkproteinscontainnewrepetitivesequencesandhighlyconservednon-silk-like'spacerregions'.fVo/e/"<SW.7:667-672;HayashiC.C.Y.,ShipleyN.H.,LewisR.V.1999.Hypothesisthatcorrelatethesequence,structureandmechanicalpropertiesofspidersilkproteins.S/o/..Macrowo/.24:271-275;OroudjevE.,SoaresJ.,ArcidiaconoS.，ThompsonJ.B.,FosseyA.S.，HansmaH.G.2002.Segmentnanofibersofspiderdraglinesilk:Atomicforcemicroscopyandsingle-moleculeforcespectroscopy.Pra。淑/.USA99:6460-6465;TaiP丄.，HwangG.Y.,TsoI.M.,2004.Inter-specificsequenceconservationandintra-individualsequencevariationinaspidersilkgene./"fer.J.Sz'o/.Macra,/eci//es34:295-301》根據(jù)不同的研究，在蜘蛛絲中存在的大多數(shù)重復單位表現(xiàn)特定的結構特性(XuM.，LewisR.V.,1990.Structureofaproteinsuperfiber:Spiderdraglinesilk.TVoc.Ato/.JcaJ.USA87:7120-7124;HayashiC.Y.,LewisRV.1998.EvidencefromflagelliformsHk.cDNAforthestructuralbasisofelasticityandmodularnatureofspidersilks.M/.i/'o/275:773-784;VanBeekJ.D.,HessS.，VollrathF.，MeierB.H.,2002.Themolecularstructureofspiderdraglinesilk:Foldingandorientationoftheproteinbackbone,編.JcadSc/USA99:10266-1027；BiniE.,KnightD.P.,KaplanD丄.2004.Mappingdomainstructuresinsilksfrominsectsandspidersrelatedtoproteinassembly.tWo/.335:27-40;ScheibelT.2004.Spidersilks:recombinantsynthesis,assembly,spinning,andengineeringofsyntheticproteins.A/icoZ).3:14;StantchevaN.N.P.，MasonS.J.M.2004.Molecularstudiesofanoveldraglinesilk—fromnurserywebspider,EwpraW/zewo/w(Psauridae).Ccw/.S/oc/zew.P/n'Wo/.138:371-376)。GPGXX模塊負責[3-螺旋結構的形成，并且可能賦予絲以彈性。由鞭毛狀腺產生的鞭毛狀絲具有超過200%的彈性，并在每個重復單位中包括至少43個GPGXX模塊(HayashiC.Y.，LewisR.V.2000.Moleculararchitectureandevolutionofamodularofspidersilkproteingene.5Wewce287:1477-1479)。與牽絲的低彈性相一致，后者在被另一模塊中斷之前僅顯示此基序的9次重復。富丙氨(酸模塊通常由6-9個此氨基酸的殘基組成，這些殘基負責形成為纖維提供剛性的P-折疊。由"主壺腹腺"和"次壺腹腺"產生的絲都非常堅固并且顯示An或(GA)r基序，然而，這些基序沒有出現(xiàn)在鞭毛狀絲中(GatesyJ.,HayashiC,Motriu'〈D.,WoodsJ.，LewisR.2001.Extremediversity,conservation,andconvergenceofspidersilkfibroinsequences.5We"ce291:2603-2605)。依次地,GGX,是310螺旋，可能與GPGXX結合形成連接結晶區(qū)的無定形基質并賦予纖維彈性。此基序可見于所有的鞭毛狀腺、"主壺腹腺"和"次壺腹腺"中。間隔區(qū)由分隔富甘氨酸區(qū)的帶電荷基團構成(ColginM.A.,LewisR.V.1998.Spiderminorampullatesilkproteinscontainnewrepetitivesequencesandhighlyconservednon-silk-like'spacerregions'.Prate/w5W.7:667-672;HayashiC.C.Y.,ShipleyN.H.,LewisR.V.1999.Hypothesisthatcorrelatethesequence,structureandmechanicalpropertiesofspidersilkproteins./W.S/o/.A/acrawo/.24:271-275)，4旦其結構的目的產生的所有纖維中很常見，在種間c-末端序列高度保守(BiniE.，KnightD.P.,KaplanD丄.2004.Mappingdomainstructuresinsilksfrominsectsandspidersrelatedtoproteinassembly./Afo/.S/o/.335:27-40;HayashiC.Y.,BlackledgeT,A.,LewisR.V.2004.Molecularandmechanicalcharacterizationofaciniformsilk:uniformityofiteratedsequencemodulesinanoveJmemberofthespidersilkfibroingenefamily.Mo/,fi/o/.￡Vo/.21:1950-1959;StantchevaN.N.P.,MasonS丄M.2004.Molecularstudiesofanoveldraglinesilkfromnurserywebspider,E"甲，/Ze朋/ws/(Psauridae).Cow/,5/oc/ze附.尸/7/wo/.138:371-376;TknM.,LiuC,LewisR.,2004.AnalysisofmajorampullatesilkcDNAfromtwonoivorb-weavingspiders,5/owacn3附o/ecw/es5:657-660)。最近對ADF-3和4進行的研究揭示了由C-末端區(qū)形成的a-螺旋結構，提出了此區(qū)在纖維的聚合中具有重要作用的假設(HuemmerichD.，ScheibelT.,VoUrathF.，CohenS.，GatU.,IttahL2004.Novelassemblypropertiesofrecombinantspiderdraglinesilkproteins.Q#-,.S/o/.14:A12-A16)。紡絲機制，或，換句話說，水溶性蛋白聚合成為不溶性纖維，是從形成"紡絲溶液，，的腺腔中的蛋白濃度增加開始的過程。例如，在主壺腹腺中，牽絲蛋白的濃度超過50%(m/v)(ArtkinsE.:2003.Silk'ssecrets.Atowe424:1010;ScheibelT.2004.Spidersilks:recombinantsynthesis,assembly,spinning,andengineeringofsyntheticproteins./W/craACe〃3:14)。MaSp的濃度增加導致這些蛋白的結構修飾，從巻曲改變?yōu)閜-螺旋結構并增加其穩(wěn)定性(DickoC,KnightD.,KenneyJ.M.，VollrathF.2004.Structuralconformationofspidroininsolution:Asynchrotronradiationcirculardchroismstudy.Sw/wacTomo/ecw/es5:758-767)。以A匕方式,錄口蟲朱保持相當高濃度的蛋白水溶液，而不導致不溶性P-折疊的形成。當"紡絲溶液"經(jīng)過腺導管時，發(fā)生蛋白的聚合，同時伴有水、鈉和氯的萃取。分泌氫和鉀離子，將pH從6.9減少至6.3(ChenX.,KnightD.P.,ShaoZ.，VollrathF.2002.Conformationtransitioninsilkproteinfilmsmonitoredbytime-resolvedfouriertransforminfraredspectroscopy:EffectofpotassiumionsonTVepMaspidroinfilms,所oc/ze附/幼:y41:14944-14950;DickoC,VollrathF.，KenneyJ.M.2004,SpidersilkproteinrefoldingiscontrolledbychangingpH.5:704-710)。這些改變觸發(fā)了導管遠端部分中蛋白的對位，并且在其聚-A疏水序列對位并靠近的同時，它們暴露于越來越疏水的環(huán)境，這種環(huán)境最有可能促進這些蛋白的結構轉變?yōu)?3-折疊(ScheibelT.2004.Spidersilks:recombinantsynthesis,assembly,spinning,andengineeringofsyntheticproteins.M/m^.Q〃Fa".3:14)，并且，因此，促進纖維的聚合。纖維結構的高度組織、廣泛的氫鍵和范德華相互作用誘導水從P-折疊之間的區(qū)域排出。蜘蛛絲不溶于水、稀酸和稀堿、促溶劑諸如尿素和鹽酸胍以及大多數(shù)有才幾溶齊寸(Lombai'diS丄,KaplanD丄.1990.Theaminoacidcompositionofmajorampullateglandsi!k(dragline)ofc/rtv—s(Araneae,Tetragnathidae).J爿rac/ww/.18:297-306)。該絲也耐受大多數(shù)蛋白水解酶。該絲微溶于溴化鋰、硫氰酸鋰、氯化鈣和其他鈣鹽的鹽水溶液中。也可使用高濃度的丙酸/鹽酸混合物以及甲酸(MelloCM.,SenecalK.Ye'..mgB"VourosP.,KaplanD.L1994.Initialcharacterizationof,jVe/:^/:/ac/av/pesdraglineprotein.In:KaplanD.L.AdamsW.WFarmerB.VineyC.(主編).S川〈Polymers:MaterialsScienceandBiotechnology.v4附en'ca"C72，/'ca/5V兀'f,^v附/o,s/畫Se:T/es'.544:67-79LewisR.V.,HinmanM.，KothakotaS.,Foun〗ierM丄1996.Expressionandpurificationofaspidersilkproteins:Anewstrategyforproducingrepetitiveproteins./V^/"4:400-406)。不同的團體.已經(jīng)嘗試使用不同類型的稀釋劑人工地加工絲。大多數(shù)努力集中在用于家蠶的液體加工。已經(jīng)使用諸如六氟異丙醇(WO9429450)的溶劑作為稀釋劑或在濃縮甲酸溶液中稀釋的蛋白溶液[LewisR.V.，HinmanM"KothakotaS.,FoumierM丄,1996.Expressionandpurificationofaspidersilkprotein:Anewstrategyforproducingrepetitiveproteins,fixprnw'./V,):400-406]力口工絲重組蛋白。然而，在上述兩種情況下，天然絲的機械性能不能充分地再現(xiàn)(FahnestockS.R.,BedzykLA,1997.ProductionofsyntheticspiderdraglinesilkproteininP/c/w'a/os^on'51.y4萍/.Mkro/":(:)/■,'3/'他，c/z/w/,47:23-32)。其他嘗試成功地通過將纖維浸泡在濃鹽水諸如溴化鋰、硫氰酸鋰、氯化鈣和其他媽鹽中來增加蜘蜂絲的溶解。也可使用高濃度的丙酸/鹽酸混合物以及曱酸[MelloCM.,Seneca!K,，YeungB.,VourosP.,KaplanD丄，1994.InitialcharacterizationofAfe/A/'/ac/tn力esdragHn.eprotein.少L:SilkPolymers:MaterialsScienceandBiotechnology,/f"'e〃—cr//7C7e附/ca/Soc/e^y5y附/os7'w附SeWes.KaplanD.L.,AdamsW.W,FarmerB.，VineyC.(Eds,),544pp]。最初，導致蜘蛛絲蛋白的高疏水性的過程觸發(fā)了重復結晶序列的形成。在蠶中，該過程伴隨著腺休中生理條件諸如pH和鹽濃度的改變并且推測有助于保持溶解。在可溶絲的紡絲過程期間產生的物理斷裂似乎，很大程度上解釋了在天然加工次序中可溶性蛋白向不溶性纖維的轉變。[Ilzuka,E.，1985.Silk:anoverview.jp//.Pofymer.J^".41:163-171;Ilzuka,E.,1985.Silkthread:Mechanismofspinninganditsmechanicalproperties.J///.尸o/，er41:173-185;MagoshiJ.,MagoshiY.,NakamuraS.，1985.Crystallization,liquidcrystal,andfiberformationofsilkfibroin.J.J///.Po/ywerSc/.41:187-204;MagoshiJ.,MagoshiY.,NakamuraS.,1994.Mechanismoffiberformationofsilkworm.見SilkPolymers:materialsScienceandBiotechnology,爿附en'c"wC/zew/ca/S，/as7.廳KaplanD丄",AdamsW.W.,FarmerB"VineyC.(主編),544pp].大規(guī)模生產蜘蛛絲纖維將能夠產生具有很高的可生物降解率的新一代生物材料，其在工業(yè)產業(yè)的多個領域中將具有實際應用。不能馴化蜘蛛以便為其充分的研究和商業(yè)應用產生足夠量的蛋白已經(jīng)促使開展研究以能夠通過大規(guī)模異源表達系統(tǒng)產生絲蛋白。最近在克隆cDNA和合成基因以及在不同系統(tǒng)中表達蜘蛛絲重組蛋白的成功對于更好地理解這些蛋白的結構、加工和功能以及它們的重要機械性能至關重要(KaplanD丄.，AdamsW.W.,FarmerB.,VineyC.1994.SilkPolymers:MaterialsScienceandBiotechnology.J附m'c"wC7^wic"/Soc/砂5y附/os7'M附Ser/csVolume544;Kaplan.I).L"MelloC.M,,ArcidiaconoS.,FosseyS.,SenecalK.,MullerW.,1998,Silk.見McGrath，K.,Kaplan.D.L.(主編)，BasedM她,'/"/s.Birkhauser,Boston)。目前研究正在增加對這些過程的了解。然而，這些基因的高度重復特性、蜘蛛使用的特定密碼子和mRNA所采用的罕見二級結構導致蛋白不能有效的翻譯并且限制了能夠產生的纖維的大小(FahnestockS.R.,BedzykLA.1997.Productionofsyntheticsp;derdraglinesilkproteininP/c/n'aM/'crc^/o/.6io/"7W(9/.47:23-32;ScheibelT.2004.Spidersilks:recombinantsynthesis,assembly,spinning,andengineeringofsyntheticproteins.M/cra6.CW/Fa".3:14)。由于序列的重復特性，最初對從絡新婦蛛的"主壺腹腺"采集的mRNA進行的研究沒有在體外成功地進行翻譯(CandelasG.C.,CintronJ丄1981.Aspiderfibroinanditssynthesis,J!A，平216:1-6;CandelasG.C.,Lopez,F.1983.SynthesisoffibroinintheculturedglandsofTVep/w'/ac/av—C謂/.S/oc/z倒.尸/"/。/.74:637-641:Cande.asG.C.，CandeiasT"OrtizA.，RodriguezO.1983.Translationpausesduringaspiderfibroinsynthesis.5/oc/7，.5/o//2_y5.C歸m肌116:1033-1038).不同的異源表達系統(tǒng)被用于嘗試產生蜘蛛纖維。最近使用由牽絲基因的部分cDNA制備的構建物的研究在大腸桿菌中(ArcidiaconoS.,Mello,C，KaplanD丄.,Cheley,S.,Bayley,H.1998.Purificationandcharacterizationofrecombinantspidersilkexpressedinfoc'/zen'c/w'aco/Z.Mf'm6z'o/.49:31-38)，在MAC-T(牛)和BHK(倉鼠)細胞培養(yǎng)物中(LazarisA.,ArcidiaconoS.,HuangY.,ZhouJ.F,DuguayF.,ChretienN.,WelshE.A.,SoaresJ.W.,KaratzasC.N.2002.Spidersilkfibersspunfromsolublerecombinantsilkproducedinmammaliancells.Sc/ewce295:472-476)，以及在使用桿狀病毒表達系統(tǒng)在草地貪夜蛾昆蟲的細胞系中(HuemmerichD.,ScheibelT.,VollrathF.,CohenS.,GatU.,IttahI.2004.Novelassemblypropertiesofrecombinantspiderdraglinesilkproteins.Cm/t.S/o/.14:472-476)產生了重組蛋白。幾個研究使用了含有編碼蜘蛛的"小壺狀腺"和鞭毛狀腺的蛋白的基因的cDNA的構建物，諸如在專利文件US576677和US5994099中。專利文件US5728810說明了在微生物中表達絡新婦蛛的蟲朱絲蛋白1和2。文件US6608242、US20050010035和WO01943934艮道了用于在植物中產生錄ni朱絲的合成蛋白并產生表達來源于絡新婦蟲朱和其他蜘*朱種類的絲的合成蛋白的構建物的方法。專利CN1380418的文件說明了用于在棉花招d朱中表達的蜘蛛網(wǎng)"蛛絲蛋白"的合成構建物。研究已顯示了蜘蛛絲蛋白在動物中的表達，如在專利文件W09947661和US2001042255中，說明了用于在轉基因動物的乳和/或尿中重組產生生物絲的方法.，基于絡新婦棘知/<r"./Je.s的MaSp序列的合成基因也已經(jīng)用來在大月^一干菌(FahnestockS,:R..BedzykL.A.1997.Productionofsyntheticspiderdraglinesilkprotein./0i<:'/2,'<3zip//.A//cro/)ic/.47:23-32)、巴,斤《憂、畢赤酵母(PichiaPastoris)(Fahne;;tockS.R.,BedzykL.A.1997.Productionofsyntheticspiderd，鄰iin;silkproteininP,'c/7/"Mt'cra^/o/.5/她c/z"o/.47:23-32)和植物(US20040210956;SchellerJ.，GurhunsK.H.，GrosseF.,ConradU.2001.Productionofspidersilkproteinsintobaccoandpotato.Ato.S/她c/wo/.19:573-577;PiruzianE.S.,Bogush,V.G.,SidomkK.V.，GoldenkovaI.V.，MysiychukK.A.,DebabovV.G.2003.Constructionofsyntheticgenesforanaloguesofspidersilkspidroin1andtheirexpressioninTabaccoplants.JWo/.5/o/.27:554-560;Scheller,1"HenggelerD.，VivianiA.，ConradU.2004.Purificationofspider-elastinfromtransgenicplantsandapplicationforhumanchondrocyteproliferation.『raw,sg.仏s.13:51-57)中表達異源蛋白。遺憾地是，到目前為止MaSp基因還沒有被完全克隆，并且已有的數(shù)據(jù)涉及由絡新婦蛛、十字圓蛛和其他種類的牽絲基因的3'末端創(chuàng)建的部分cDNA克隆(XuM"LewisR.V.,1990.Structureofaprotein';uperfiber:Spiderdraglinesilk./Voc.Ato/.Jcad.87:7120-7124;Hin懇nMB.,Lewis,R.V.1992.Isolationofaclonecodingaseconddraglinesilkfibroin,/Ve/Mcfo—esdraglinesilkisatwoproteinfiber.5/o/.C/綴267:19320-19324;BeckwittR.,Arcidia函oS.1994.SequenceconservationintheC-terminalregionofspidersilkproteins(Spidroin)from臉/7Mac/av—(Tetragnathidae)and,4ra"ms'/Wcewte腦"'ws(Araneidae).J.所o/.CTz價.269:666卜6663G'jeretteP.,GinzingerD.,WeberB.,GoslineJ.1996.Silkpropertiesdeterminedbygland-s))e'::ificexpressionofaspiderfibroingenefamily.5"c/ece272:112-115Haya;」t;C.,Y"lewisR.V.!998.Evidencefromflagelliformsilk.cDNAforthestructuralbasisof"eiasticityandmodularnatureofspidersilks.乂A/o/.275:773-784)。對此結果的解釋可能是當構建cDNA文庫時從產絲腺體中提取mRNA期間mRNA可能降解，囚為mRNA越長，對酶的降解越敏感(StantchevaN.N.P.,MasonS丄M.2004,Moieeularstudiesofanoveldraglinesilkfromnurserywebspider,E〃pm"/6'/w/s,sy)(Psauridae).Co/早8/ot如附./V^/o/.138:371-376)。基于對天然蜘蛛絲的已有知識，已經(jīng)在異源系統(tǒng)中產生蜘蛛絲蛋白和使用模塊結構工程操縱這些蛋白的一級結構(CappelloJ"CrissmanJ"DormanM.1990.Geneticengineeringofstructuralp，'oteinpolymers.6:198-202;ScheibelT.2004.Spidersi!ks:recombinantsynthesis,assembly,spinning,andengineeringofsyntheticproteins.Mctt乂，(:e〃Fa".3:14;KangW.J.，ChoS.S.,HuhH.，ChungD.T1997.Identificationofdynamicbehaviorofsheetmetalsforanauto-bodywithtensionsplitHopkinsonba二Tram.KSME21:2209-2219,KangW丄，ChoS.S.，HuhH.,ChungD.T.1999.ModifiedJohnson-Cookmodelfordynamicbehaviourofsheetmetalsforauto-bodyCrash-worthiness.J.Ke//c/eDes'z'g",21:424-435)。有可能大規(guī)模地在異源系統(tǒng)屮產生來自蜘蛛絲的具有目標動力學和功能的蛋白應該使其應用于大量的醫(yī)療用品諸如敷料和神經(jīng)外科用微縫合線。這些高性能纖維可具有多種技術和工業(yè)應用。絲可用于繩和專用漁網(wǎng)、降落傘、防彈應用(防彈衣等)、運動用品.紡織工業(yè)、化妝品工業(yè)以及用作^^天建筑用輕重量原料。其他的益處是蜘蛛絲蛋白在農業(yè)、家畜和人類健康領域中制造對抗疾病和害蟲的殺菌劑和防御素中的應用。因此需要鑒定新的l姝絲蛋白，在不同的系統(tǒng)中表達它們并且開發(fā)為上述領域中的現(xiàn)有問題提供解決方案的其他方法。本發(fā)明說明了從Wep/H'/ewg^Ow"/ato蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛和尸amw/jd"所s/riato蜘蛛中提取的新的蜘蛛絲蛋白，以及這些蛋白在重組系統(tǒng)中的表達。本發(fā)明進一步說明了絲蛋白在植物、動物和產纖維微生物細胞中的表達以便產生新的具有增強特性的纖維生物材料。
發(fā)明內容新蜘蛛絲蛋白的發(fā)現(xiàn)以及其特性和在不同異源系統(tǒng)中的表達應該在許多領域，諸如醫(yī)療和工業(yè)產業(yè)中非常有用。來自蜘蛛絲的蛋白可通過具有基本上與絲蛋白的共有序列類似的氨基酸序列的合成多肽或通過從編碼天然絲或工程絲的蛋白的核酸序列表達的多肽，或這些多肽的衍生物而獲得。根據(jù)絲蛋白所需的應用，可用于從單一蜘蛛網(wǎng)蛋白或從不同的蜘蛛網(wǎng)蛋白的組合形成纖維。本發(fā)明的一個方面提供了分離的蜘蛛核酸分子，其特征在于包括a)與選自鑒定為SEQIDN.1-19的任一序列基本上類似的序列；b)SEQIDN.1-19中所述的序列的互補序列；c)SEQIDN.1-19中所述的序列的反向互補序列；d)SEQIDN.1-19中所述的序列的反向序列。本發(fā)明的第二個方面涉及一種嵌合基因，其特征在于包括a)啟動子，其與前導序列連接或不連接并且可操作地連接到；b)與SEQIDN.1-19中所示的任一序列基本上類似的編碼序列。本發(fā)明的另一個方面涉及一種表達載體，其特征在于包括a)啟動子，其與前導序列連接或不連接并且可操作地連接到；b)與鑒定為SEQIDN.1-19的任一序列基本上類似的編碼序列，其可操作地連接到；c)終止信號；d)復制起點；e)選擇標記；和f)克隆位點。本發(fā)明的第四個方面涉及從蜘蛛絲蛋白分離的分子，其特征在于包括與鑒定為SEQIDN.20-38的任一序列基本上類似的序列。本發(fā)明還有另一個方面提供了包括至少一種由核酸編碼的蜘蛛絲蛋白的宿主細胞。這些宿主細胞包括但不限于細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物細胞。過度表達一種或多種由本發(fā)明的核酸編碼的蜘蟲朱絲蛋白的宿主細胞提供了用于多種目的有用試劑，包括但不限于，產生可摻入至材料內以調節(jié)該材料的結構特性的包括至少一種絲蛋白的絲纖維。本發(fā)明還說明了產生遺傳修飾的生物的方法，其特征在于包括以下的步驟a)用根據(jù)權利要求3-11任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權利要求12-23任一項所述的表達載體轉化細胞、組織、器官或胚胎；b)選擇轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子；c)再生階段b)中選擇的轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子的成熟植物、成熟胚胎或微生物；d)選擇階段(c)的含有具有編碼蜘蛛絲蛋白的核苷酸序列的嵌合基因或表達載體的成熟植物、成熟胚胎或微生物細胞。本發(fā)明還說明了在原核細胞和真核細胞中產生重組蜘蛛絲蛋白的方法，其特征在于包括以下的步驟a)用根據(jù)權利要求12-23任一項所述的表達載體轉化細胞、組織、器官或胚胎；b)選擇轉化的細胞、愈傷組織細胞、胚胎或種子；c)再生階段b)中選擇的轉化的細胞、愈傷組織細胞、胚胎或種子的成熟植物、成熟胚胎或微生物；d)選擇階段(c)的含有具有編碼蜘蛛絲蛋白的核苷酸序列的表達載體的成熟植物、成熟胚胎或微生物細胞；e)提取在階段d)中選擇的微生物中產生的重組蜘蛛絲蛋白。本發(fā)明還包括具有殺微生物劑、防御素和皮膚病學活性的重組蛋白，以及藥用的皮膚病學組合物和農用的殺微生物劑組合物。本發(fā)明進一步涉及一種皮膚病學組合物，其特征在于包括a)根據(jù)權利要求42所述的重組蛋白；b)藥學可接受的載體。本發(fā)明還說明了一種殺微生物劑組合物，其特征在于包括a)根據(jù)權利要求43所述的重組蛋白；b)農業(yè)可接受的載體，和，C)包括或不包括添加劑。最后，本發(fā)明說明了由本發(fā)明的重組蛋白產生的生物聚合物。圖1-SEQIDN.1和別7106229之間的比對。插入在帶有黑色背景的矩形中的序列突出與兩條序列都相同的氨基酸。序列上的數(shù)字表明比對中的位置，并且不對應于任一條序列中的位置。該差異是插入空位以維持比對所引起的。圖2-在用于大豆和棉花植抹的轉化和共轉化系統(tǒng)中用于轟擊的含有信號肽和(3-伴大豆球蛋白啟動子的載體。圖3-在用于大豆和棉花植株的轉化和共轉化系統(tǒng)中用于轟擊的載體pAGl。圖4-在大腸桿菌的轉化中用于表達絲蛋白的載體pET19b:SEQ.1-19。圖5-用于在哺乳動物細胞中表達的含有序列l(wèi)-19的載體pCMV-Script。MCS:多克隆位點；含有15種不同的具有單一位點的酶的克隆位點。圖6-用于在轉基因動物的乳中表達網(wǎng)蛋白的含有序列l(wèi)-19的載體pBCl。圖7-獲得的SEQIDN.1(基因產物A^p/w'/ewg^cn^wtoto-NCFlag)的蛋白結構的模型。A.代表結構的水平視圖以及B.代表從端點之一觀看上端的視圖。圖8-體外產生的絲。具體實施例方式提供以下的定義以更好地理解本發(fā)明關于本發(fā)明的核S吏使用術語"分離的核酸分子"。此術語當應用于DNA時是指與其來源的生物體的基因組中天然存在的直接鄰接序列(以5'和3'方向)分離的DNA分子。例如，"分離的核酸分子"可插入至載體諸如質?；虿《据d體中，或并入至原核生物或真核生物的基因組DNA內。"分離的核酸分子"也可包括cDNA分子。插入在載體中的分離的核酸分子在本文中有時也稱為重組核酸分子。術語"分離的核酸分子"也可應用于從如上所述的分離的DNA分子轉錄的RNA分子?？蛇x地，該術語也可指已經(jīng)充分地從以前與其相關聯(lián)的其天然狀態(tài)(即，在細胞或組織中)的RNA分子分離的RNA分子。如本文所使用的術語"互補序列"、"反向互補序列"和"反向序列"的定義可通過下列的實例來說明對于序列5'AGTGAAGT3',互補序列是3TCACTTCA5',"編碼序列"是指編碼特定蛋白并且不包括非編碼序列的DNA序列。"斷裂的編碼序列"是指用作分隔子(例如，一個或多個通過接頭連接的內含子)的序列。"內含子"是被轉錄并存在于前體-mRNA中，但隨后通過切割被去除并且在生成可被翻譯成蛋白的成熟mRNA的細胞內再連接產生mRNA的核苷酸序列。內含子的實例包括但不限于內含子pdk2、蓖麻油過氧化氫酶內含子、M2棉花脫飽和酶內含子、A12擬南齊脫飽和酶、玉米泛素內含子、SV40內含子、蘋果酸合成酶基因內含子。"基因構建物"是包括啟動子和具有不同起點的編碼區(qū)的基因。在本發(fā)明的情況下，基因構建物包括以分離的形式或連接的形式與表達調控區(qū)諸如啟動子和終止信號連接的本發(fā)明的多核苷酸。獲得包括與核酸連接的啟動子的基因構建物的方法在本領域中是公知的，并且可見于Sambrook等人，(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress)。術語"載體，，是指復制子，諸如質粒、粘粒、BAC、噬菌體或病毒，其中其他基因序列或元件(DNA或RNA)可用連接到載體上并與載體一起被復制。優(yōu)選地，病毒來源載體選自細菌噬菌體、痘苗、逆轉錄病毒或牛乳頭狀瘤病毒。"表達載體"是含有具有宿主細胞表達所必需的調控區(qū)的基因的專用載體。這些載體可從商業(yè)上獲得，包括ClontechLaboratories,Inc(PaloAlto,Calif.)、Stratagene(LaJolla,Calif)、Invitrogen(Carlsbad,Calif)、NewEnglandBiolabs(Beverly,Mass.)和Promega(Madison,Wis.)。用于本發(fā)明中的載體的一些實例為，但不限于pMAC/PS、pCMV-Gal和pGFP/NEO。術語"可操作地連接"是指為了編碼序列的表達，表達編碼序列所需的調控序列置于DNA分子中與編碼序列相關的適當位置上。此相同定義有時應用于在表達載體中編碼序列和轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子和終止元件)的排列。外源編碼區(qū)的側翼典型地是可操作連接的調控區(qū)，該調控區(qū)調控外源編碼區(qū)在轉化細胞(可以是微生物、植物或動物)中的表達。可操作地連接外源編碼區(qū)的典型調控區(qū)包括啟動子，其是位于外源編碼區(qū)5'區(qū)中的可引起外源編碼區(qū)轉錄的核酸片段。本發(fā)明不限于使用任意具體的啟動子，并且大量的啟動子在現(xiàn)有技術中是公知的。這些啟動子可以是，但不限于誘導性、組成性和組織特異性的。優(yōu)選地，本發(fā)明的啟動子選自用于棉纖維基因的啟動子，并且可以是，但不限于，E6、H6S、Racl3、LTP、ACP、擴張蛋白(expansin)、CAP、anexin、FbL2A和肌動蛋白2。在本發(fā)明的一個方面，啟動子是組成性啟動子。在本發(fā)明的另一方面，啟動子活性通過外界因素激發(fā)，外界因素諸如，但不限于，激素、化學組合物、機械脈沖、以及生物逆境或非生物脅迫條件。啟動子活性也可以時間方式和空間方式調控(-諸如，例如，組織特異性啟動子和發(fā)育期間調控的啟動子)。啟動子可含有"增強子"元件。"增強子"是能夠激發(fā)啟動子活性的DNA序列。其可以是啟動子本身具有的元件或插入以增加啟動子的組織特異性和/或強度的外源元件。"組成性啟動子"是指那些以恒定的方式引導基因在所有組織中表達的啟動子。"組織特異性啟動子"或"發(fā)育特異性啟動子"是那些引導基因幾乎完全在特定組織諸如葉、根、莖、花、果實或種子中表達，或僅在組織發(fā)育的特定階段，諸如胚胎發(fā)生的開始或結束期間表達的啟動子。在本發(fā)明的一個方面中，啟動子是在植物中表達的啟動子。如本文中所使用的，術語"在植物中表達的啟動子"是指能夠在植物細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。這包括植物來源的任意啟動子；能夠引導在植物細胞中表達的非植物來源的任意啟動子，例如，病毒或細菌來源的啟動子諸如CaMV的19S和35S(諸如專利申請US20030175783、Hapster等人，1988嵐212,182-190中提到的啟動子)、細菌噬菌體啟動子T7和農桿菌的T-DNA中存在的基因啟動子；組織特異性或器官特異性啟動子，其包括，但不限于種子特異性啟動子(W08903887)、初生器官特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、An等人，1996ThePlantCell8,15-30中提到的啟動子)、莖特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Keller等人，1988EM5(9/7:3625-363中提到的啟動子)、葉特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Hudspeth等人，1989尸/a^Mo/歷o/12:579-589中提到的啟動子)、葉肉特異性啟動子、根特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Keller等人，1989Ge"&sDeve/3:1639-1646中提到的啟動子)、小塊莖特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Keil等人，1989五M56U8:1323:1330中提到的啟動子)、維管組織特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Peleman等人，1989Gene84:359-369中提到的啟動子)、雄蕊特異性啟動子(W08910396、W09213956)、裂開特異性啟動子(W09713865);和類似啟動子。除了特異性啟動子以外，存在其他內源性植物啟動子。這些啟動子包括，但不限于，尤其是1.6二磷酸核酮糖的小亞單位的啟動子(RUBP)、P-伴大豆球蛋白啟動子、(3-菜豆素啟動子、Y-高粱醇溶蛋白啟動子、卩-淀粉酶、玉米醇脫氫酶、十字花科蛋白(cruciferine)(種子特異性)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、RD2煙草基因、SAG擬南芥基因(葉)、多聚半乳糖醛酸酶(果實)、塊莖特異蛋白(patatin)(小塊莖)、大麥醇溶蛋白、油菜籽蛋白(napin)、大米肌動蛋白、玉米泛素啟動子、ADH啟動子、GPAL2啟動子、GPAL3啟動子和熱休克蛋白啟動子。在產纖維植物諸如尤其是棉花、劍麻、燈心草、棕櫚、黃麻、甘蔗、竹子、龍舌蘭和大麻中絲的表達可使用尤其是(3-微管蛋白、Al、A2、A4和MYB(MYB樣轉錄因子)纖維素合成酶基因啟動子(US6608242)。本發(fā)明優(yōu)選地包括棉纖維基因啟動子，包括但不限于E6、H6S、Racl3、LTP、ACP、擴張蛋白、CAP、膜連蛋白、FbL2A和肌動蛋白2基因啟動子。在本發(fā)明的一個方面，啟動子是在動物中表達的啟動子。如本文中所使用的，術語"在動物中表達的啟動子"是指能夠在動物細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。這包括動物來源的任意啟動子和能夠在動物細胞中引導表達的非動物來源的任意啟動子，例如，奶(3-酪蛋白啟動子(Invitrogen)。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選啟動子在產奶細胞中引導蛋白的轉錄，諸如，但不限于，下列基因的啟動子尤其是乳清酸蛋白(WAP)、a酪蛋白Sl、a酪蛋白S2、(3酪蛋白、k酪蛋白、P乳球蛋白、a乳清蛋白。此外本發(fā)明的優(yōu)選啟動子在產尿細胞(例如，尿路上皮細胞或具有相同特性的細胞)中引導蛋白的轉錄；這些啟動子包括，但不限于，尿斑蛋白(uroplakin)基因啟動子。本發(fā)明的其他優(yōu)選的啟動子在胚胎細胞中引導蛋白的轉錄。除了上述的啟動子以外，本發(fā)明的實施方案之一涉及在細菌、真菌和昆蟲中表達的啟動子。如本文中所使用的，術語"在細菌中表達的啟動子"是指能夠在細菌細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。如本文所使用的，術語"在真菌中表達的啟動子"是指能夠在真菌細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。如本文所使用的，術語"在昆蟲中表達的啟動子"是指能夠在昆蟲細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。本發(fā)明中的"引導序列"或"信號序列"是指當可操作地與核酸分子連接時使核酸分子的產物分泌的核酸序列。引導序列優(yōu)選地位于核酸分子的5'區(qū)中。優(yōu)選地，引導序列獲自與使用啟動子來引導核酸分子轉錄的相同基因，或獲自核酸分子所來源的相同基因。優(yōu)選地，本發(fā)明使用a-薏苡醇溶蛋白(a-coixin)的信號序列。本發(fā)明的轉錄終止信號和多聚腺苷酸化區(qū)包括，但不限于，SV40終止信號、HSVTK腺香化信號、根癌農桿菌的胭脂堿合成酶基因(NOS)的終止信號、章魚堿合成酶基因終止信號、CaMV的19S和35S基因的終止信號、玉米醇脫氫酶基因終止信號、甘露堿合成酶基因終止信號、p-菜豆素基因終止信號、ssRUBISCO基因終止信號、蔗糖合成酶基因終止信號、攻擊地三葉草的病毒(SCSV)的終止信號、構巢曲霉的trpC基因的終止信號和其他類似終止信號。如上所述，"表達載體"可包括與編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸序列可操作地連接的誘導性啟動子。"誘導性"啟動子可引導它們可操作地連接的多核苷酸在組織中或發(fā)育的特定階段中表達或響應于環(huán)境條件而表達。在本發(fā)明的一個方面中，表達載體包括與編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸分子可操作地連接的強調控的誘導性載體。此表達載體可進一步包括與組成性啟動子或強調控的誘導性啟動子可操作連接的選擇標記基因(例如，編碼賦予抗生素抗性的蛋白的基因)。根據(jù)所述目的，可通過病原體誘導性啟動子促進編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸序列的表達。白(PR蛋白)的啟動子，這些蛋白諸如，例如，PR蛋白、SAR蛋白、P-1.3-葡聚糖酶、幾丁質酶等。在本發(fā)明的一個方面中，使用局部表達或靠近病原體感染部位表達的啟動子可能是有益的。此外，由于許多病原體通過經(jīng)常由昆蟲傷害創(chuàng)傷誘導性啟動子包括，但不限于，馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因(pinll)啟動子、winl和win2基因啟動子、系統(tǒng)素基因啟動子、MPI基因啟動子。誘導性啟動子的轉錄活性也可通過多種環(huán)境因素包括，但不限于，溫度、厭氧脅迫和光來調控。誘導性啟動子的實例包括Adhl啟動子(由缺氧或冷脅迫誘導)、Hsp70啟動子(由熱脅迫誘導)和PPDK啟動子(由光誘導)。如本文所使用的，術語"變異體"或"基本上類似"包括與具體鑒定的序列不同的氨基酸或核苷酸的序列，在該序列中一個或多個核苷酸或氨基酸殘基被缺失、替代或添加。變異體可以是天然的等位基因變異體或非天然來源的變異體。變異體或基本上類似的序列是指可通過由現(xiàn)有技術中使用的通用算法測定的其核苷酸或氨基酸序列與本文所述的核苷酸(SEQIDNl-19)序列或氨基酸(SEQIDN20-38)序列的同一性百分比來表征的核酸或肽的片段。優(yōu)選的核酸或肽的片段是具有與參考序列相比具有至少大約40或45%的序列同一性，優(yōu)選大約50或55%的序列同一性，更優(yōu)選大約60或65%的序列同一性，更優(yōu)選大約70或75%的序列同一性，更優(yōu)選大約80或85%的序列同一性，還更優(yōu)選大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%,、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸或氨基酸的序列的那些核酸或肽的片段。通過將要比較的兩條序列進行比對，確定在排列部分中相同殘基的數(shù)目，將此數(shù)目除以被評價的序列中的殘基總數(shù)并將結果乘以100來確定同一性百分比。此比對可使用公共領域中的軟件工具來完成，上述軟件工具之一是BLASTN,可在美國國立生物信息中心/NCBI(西w.ncbi.nlm.nih.gov)主頁上獲得。本發(fā)明的序列比對和同一性百分比計算已經(jīng)完成，并且通過網(wǎng)絡瀏覽器的匯總，序列已經(jīng)存放于GeneBank。術語"特異地雜交"是指兩個具有充分互補性以允許在現(xiàn)有技術中通常所述的預定條件下進行此種雜交的單鏈核酸序列分子之間的結合(在本發(fā)明中有時稱為"基本上互補的")。更具體地，該術語指具有含有本發(fā)明的單鏈DNA或RNA分子的基本上互補的序列的寡核苷酸的雜交。使具有可變互補性的單鏈核酸分子之間進行特異性雜交所需的適當條件在現(xiàn)有技術中是公知的。下面的公式通常用于計算對于核酸分子之間發(fā)生的雜交的嚴謹性所需的條件(Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress):Tm=81.5°C+16.6Log[Na+〗+0.41(%G+C)-0.63(%甲酰胺)-600/雙鏈堿基對(pbinduplex)(探針)從上述公式可見，使用[Na+]=以及50%曱酰胺，GC含量為42%并且平均探針大小為200個堿基，則Tm應該為57°C。術語"寡核苷酸"在本文中指本發(fā)明的"引物"和"探針"，并且被定義為包括一個或多個，優(yōu)選三個以上核糖-或脫氧核糖核苷酸的核酸分子。寡核苷酸的確切大小應該取決于各種因素以及寡核苷酸的特殊應用和使用。優(yōu)選的寡核苷酸包括15-50個連續(xù)堿基。術語"探針"當用于本發(fā)明中時指寡核普酸、多核苷酸或核酸，當天然存在時諸如在純化的或合成產生的限制性酶的消化過程中其為RNA或DNA,并且其能夠與含有探針的互補序列的核酸退火或特異地雜交，可進一步為單鏈或雙鏈。探針的確切長度取決于許多因素，包括溫度、探針的來源和方法的使用。例如，根據(jù)靶序列的復雜性，寡核苷酸探針一般可含有15-25個或更多個核苷酸，盡管實際上其可含有較少的核苷酸。在此選擇具有互補性的探針以便確認特殊核酸序列的鏈。這意味著探針可具有充分的互補性以便能夠在一系列預定條件下與其各自的靶鏈"特異地雜交，，或退火。因此，探針序列沒有必要完全地體現(xiàn)靶互補序列。例如，非互補核苷酸片段可連接到探針的5'或3'端，探針的剩余序列與靶鏈是互補的?？蛇x地，非互補堿基或長序列可在探針中是散在的，只要探針與靶核酸序列具有充分的互補性以便與其特異地退火。如本文所使用的術語"引物"是指來源于生物系統(tǒng)并通過純化的或合成產生的限制性酶的消化產生的寡核苷酸，為RNA或DNA，單鏈或雙鏈，當置于適當?shù)沫h(huán)境中時，其能夠在功能上用作模板依賴性核酸合成酶的引發(fā)劑。當存在適當?shù)暮怂崮０濉⒑线m的核酸的三磷酸核苷前體、聚合酶、足夠的輔因子和條件諸如溫度和適當?shù)膒H值時，通過聚合酶或一些類似活性的作用引物可通過在其3'末端添加核苷酸而延伸以形成產物的第一次延伸。"引物"的長度可根據(jù)具體的條件和應用要求而發(fā)生變化。例如，對于診斷應用，寡核苷酸"引物"的長度一般為含有15-25或更多個核苷酸。"引物"必須與目標模板具有充分的互補性以啟動目標產物的延伸合成酶。這并不意味著"引物"必須完全代表目標模板。例如，非互補核苷酸序列可連接到互補"引物"的5'端。可選地，非互補的堿基或長序列可在"引物"的寡核苷酸序列中散在，只要"引物"與目標模板序列具有充分的互補性以便在功能上為產物的延伸合成酶提供模板-引物。本發(fā)明中使用的引物的說明可見于需要這些引物的實施例(例如，PCR反應)的章節(jié)。術語"分離的蛋白"或"分離的和純化的蛋白"偶爾用于本發(fā)明中。此術語指通過表達本發(fā)明的分離的核酸分子產生的蛋白?？蛇x地，此術語可指已經(jīng)從其可能天然結合的其他蛋白中被充分地分離，諸如當以其"基本上純的"形式存在時的蛋白。術語"分離的"并不排除合成的或與其他化合物或物質的人工混合物，或存在不干擾該蛋白的基本活性的雜質。這些情況是可能存在的，例如，在不完全純化或添加穩(wěn)定劑后，以及混合在免疫原制劑或藥學可接受的制劑內。例如，藥學可接受的制劑可用于產生纖維和合成聚合物，并且可摻入至許多醫(yī)療用器具中，包括，但不限于，縫合線、創(chuàng)傷敷料和植入物中。術語"藥學可接受的載體"指其中可保持蜘蛛網(wǎng)蛋白或蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸編碼序列而對本文所述的用于藥學目的的蜘蛛網(wǎng)分子的功能特性沒有任何改變的溶液。對于哺乳動物的給藥，例如，蜘蛛網(wǎng)蛋白或蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸編碼序列可懸浮在任意的藥學可"t妻受的載體中，諸如，例如，pH大約為7.8的"HEPES"鹽水緩沖液。其他有用的藥學可接受的載體包括，但不限于，甘油、水、鹽水溶液、乙烷和其他藥學可接受的鹽水溶液諸如磷酸鹽和有機酸鹽溶液。這些和其4也藥學可4妄受的載體的實例在Remington'sPharmaceuticalSciences(1991,MackPublicationCo.,NewJersey)中說明。術語"農業(yè)可接受的載體"指其中可保持蜘蛛網(wǎng)蛋白或蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸編碼序列而對本文所述的用于農業(yè)目的的蜘蛛網(wǎng)分子的功能特性沒有任何改變的溶液。用于本發(fā)明的載體可以是液體或固體?？捎脕硎褂帽景l(fā)明的重組蛋白形成組合物的液體載體可以是，但不限于，水或有機溶劑，諸如多元醇、酯類、二氯曱烷、醇或植物油?？蓳饺胫羷┬椭械钠渌M分包括濕潤劑、防腐劑、增稠劑、抗微生物劑、抗氧化劑、乳化劑、成膜聚合物和這些組分的混合物。濕潤劑可包括多元醇、糖類(諸如糖蜜)、二元醇和吸濕鹽。形成玻璃體膜和膜的聚合物包括松香膠、乳膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙酸乙烯酯和這些物質的混合物。此外任選的添加劑包括丙晞酸甲酯、曱基丙烯酸酯和這些添加劑的混合物。術語"成熟蛋白"或"成熟多肽"指在其生成期間通常對多肽發(fā)生的任意加工事件，諸如多蛋白前體的蛋白水解加工之后具有氨基酸序列的多肽。當命名成熟蛋白的序列或界限時，成熟蛋白序列的第一個氨基酸被命名為氨基酸殘基l。在本發(fā)明的情況下，通常在自然界不能發(fā)現(xiàn)的與成熟蛋白結合的、蛋白的氨基酸l之前的任意氨基酸殘基被指定為氨基酸-l、-2、-3等。在重組表達系統(tǒng)的情況下，當試圖進行有效的翻譯時經(jīng)常使用曱硫氨酸起始密碼子。如本文所使用的，在得到的多肽中此曱硫氨酸殘基必須在成熟蛋白的序列的-1位。術語"肽類似物"指蛋白的天然或突變類似物，包括該蛋白的一系列線性或不連續(xù)片段，并且可具有被其他氨基酸替代的一個或多個氨基酸。與親代或非突變蛋白相比，其也可具有改變、增強或消除的生物學活性。術語"生物學活性"指在生物學環(huán)境(即，在生物體或體外替代物或一些類似的模型中)中由分子執(zhí)行的功能或一組功能。在蜘蛛網(wǎng)蛋白的情況下，生物學活性由其如本文所述的物理特性(例如，拉伸強度和彈性)來表征。術語"基本上純的"指包括至少50-60%重量的目的組分(例如，核酸、寡核苦酸、多肽、蛋白等)的制劑。更優(yōu)選地，該制劑包括至少75%重量，以及還更優(yōu)選地，卯-99%重量的目的組分。純度應該通過適于目的組分的方法來測定(例如，色譜法、HPLC分析、質譜和類似方法)。術語"載體"指復制子，諸如質粒、粘粒、桿粒、噬菌體或病毒，其中其他基因序列或元件(DNA或RNA)可用載體連接在一起以便被復制。優(yōu)選地，病毒來源載體選自細菌噬菌體、痘苗、逆轉錄病毒或牛乳頭狀瘤病毒。"表達載體，，是含有具有宿主細胞表達所必需的調控區(qū)的基因的專用載體。這些載體可從商業(yè)上獲得,包括ClontechLaboratories,Inc(PaloAlto,Calif.)、Stratagene(LaJolla,Calif)、Invitrogen(Carlsbad,Calif)、NewEnglandBiolabs(Beverly,Mass.)和Promega(Madison,Wis.)。用于本發(fā)明中的載體的一些實例為，但不限于pMAC/PS、pCMV-Gal和pGFP/NEO。術語"可操作地連接"指為了編碼序列的表達，表達編碼序列所需的調控序列置于DNA分子中與編碼序列相關的適當位置上。此相同定義有時應用于在表達載體中編碼序列和轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子和終止元件)的排列。外源編碼區(qū)的側翼典型地是可"l喿作連接的調控區(qū)，該調控區(qū)調控外源編碼區(qū)在轉化細胞(可以是^L生物、植物或動物)中的表達?？刹僮鞯剡B接外源編碼區(qū)的典型調控區(qū)包括啟動子，其是位于外源編碼區(qū)5'區(qū)中的可引起外源編碼區(qū)轉錄的核酸片段。本發(fā)明不限于使用任意的特殊啟動子，并且大量的啟動子在現(xiàn)有技術中是公知的。這些啟動子可以是，但不限于誘導性、組成性和組織特異性的。在本發(fā)明的一個方面，啟動子是組成性啟動子。在本發(fā)明的另一方面，啟動子活性通過外界因素激發(fā)，外界因素諸如，但不限于，激素、化學組合物、機械脈沖、以及生物脅迫或非生物脅迫條件。啟動子活性也可以時間方式和空間方式調控(諸如，例如，組織特異性啟動子和發(fā)育期間調控的啟動子)。啟動子可含有"增強子"元件。"增強子"是能夠激發(fā)啟動子活性的DNA序列。其可以是啟動子本身具有的元件或插入以增加啟動子的組織特異性和/或強度的外源元件。"組成性啟動子"是指那些以恒定的方式引導基因在所有組織中表達的啟動子。"組織特異性啟動子"或"發(fā)育特異性啟動子"是那些引導基因幾乎完全在特定組織諸如葉、根、莖、花、果實或種子中表達，或僅在組織發(fā)育的特定階段，諸如胚胎發(fā)生的開始或結束期間表達的啟動子。在本發(fā)明的一個方面中，啟動子是在植物中表達的啟動子。如本文中所使用的，術語"在植物中表達的啟動子"是指能夠在植物細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。這包括植物來源的任意啟動子和能夠在植物細胞中直接表達的非植物來源的任意啟動子，例如，病毒或細菌來源的啟動子諸如CaMV的19S和35S(諸如專利申請US20030175783、Hapster等人，1988Mo/.212，182-190中才是到的啟動子)、細菌噬菌體啟動子T7和農桿菌的T-DNA中存在的基因啟動子；組織特異性或器官特異性啟動子包括，但不限于，種子特異性啟動子(W08903887)、初生器官特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、An等人，1996ThePlantCell8,15-30中提到的啟動子)、莖特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Keller等人，1988^EM50J7:3625-363中提到的啟動子)、葉特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Hudspeth等人，1989戶/a"fMo/5/0/12:579-589中提到的啟動子)、葉肉特異性啟動子、根特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Keller等人，1989Ge腳Deve/3:1639-1646中提到的啟動子)、小塊莖特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Keil等人，1989五A/50J8:1323:1330中4是到的啟動子)、維管組織特異性啟動子(諸如專利申請US20030175783、Pel函n等人,1989Gene84:359-369中提到的啟動子)、雄蕊特異性啟動子(W08910396、W09213956)、裂開特異性啟動子(W09713865);和類似啟動子。除了特異性啟動子以外，存在其他內源性植物啟動子。這些啟動子包括，但不限于，尤其是1.6二磷酸核酮糖的小亞單位的啟動子(RUBP)、(3-伴大豆球蛋白啟動子、(3-菜豆素啟動子、"高粱醇溶蛋白啟動子、P-淀粉酶、玉米醇脫氫酶、十字花科蛋白(種子特異性)、核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、RD2煙草基因、SAG擬南芥基因(葉)、多聚半乳糖醛酸酶(果實)、塊莖特異蛋白(小塊莖)、大麥醇溶蛋白、油菜籽蛋白、大米肌動蛋白、玉米泛素啟動子、ADH啟動子、GPAL2啟動子、GPAL3啟動子和熱休克蛋白啟動子。在產纖維植物諸如尤其是,棉花、劍麻、燈心草、棕櫚、黃麻、甘蔗、竹子、龍舌蘭和大麻中絲的表達可使用尤其是(3-微管蛋白、Al、A2、A4和MYB(MYB樣轉錄因子)纖維素合成酶基因啟動子(US6608242)。本發(fā)明優(yōu)選地包括棉纖維基因啟動子，包括但不限于，E6、H6S、Racl3、LTP、ACP、擴張蛋白、CAP、膜連蛋白、FbL2A和肌動蛋白2基因啟動子。在本發(fā)明的一個方面，啟動子是在動物中表達的啟動子。如本文中所使用的，術語"在動物中表達的啟動子"是指能夠在動物細胞中啟動和/控制轉錄的DNA序列。這包括動物來源的任意啟動子和能夠在動物細胞中引導表達的非動物來源的任意啟動子，例如，奶(3-酪蛋白啟動子(Invitrogen)。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選啟動子在產奶細胞中引導蛋白的轉錄，諸如，但不限于，下列基因的啟動子尤其是乳清酸蛋白(WAP)、a酪蛋白Sl、a酪蛋白S2、(3酪蛋白、k酪蛋白、(3乳球蛋白、a乳清蛋白。此外本發(fā)明的優(yōu)選啟動子在產尿細胞(例如，尿路上皮細胞或具有相同特性的細胞)中引導蛋白的轉錄；這些啟動子包括，但不限于，尿斑蛋白基因啟動子。本發(fā)明的其他優(yōu)選的啟動子在胚胎細胞中引導蛋白的轉錄。除了上述的啟動子以外，本發(fā)明的實施方案之一涉及在細菌、真菌和昆蟲中表達的啟動子。如本文中所使用的，術語"在細菌中表達的啟動子"是指能夠在細菌細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。如本文所使用的，術語"在真菌中表達的啟動子"是指能夠在真菌細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。如本文所使用的，術語"在昆蟲中表達的啟動子"是指能夠在昆蟲細胞中啟動和/或控制轉錄的DNA序列。本發(fā)明中的"引導序列"或"信號序列"是指當可操作地與核酸分子連接時使核酸分子的產物分泌的核酸的序列。引導序列優(yōu)選地位于核酸分子的5'區(qū)中。優(yōu)選地，引導序列獲自與用來引導核酸分子轉錄的啟動子相同的基因，或獲自核酸分子所來源的相同基因。優(yōu)選地，本發(fā)明使用a-薏苡醇溶蛋白的信號序列。本發(fā)明的轉錄終止信號和多聚腺苷酸化區(qū)包括，但不限于，SV40終止信號、HSVTK腺普化信號、根癌農桿菌的胭脂堿合成酶基因(NOS)的終止信號、章魚堿合成酶基因終止信號、CaMV的19S和35S基因的終止信號、玉米醇脫氫酶基因終止信號、甘露堿合成酶基因終止信號、P-菜豆素基因終止信號、ssRUBISCO基因終止信號、蔗糖合成酶基因終止信號、攻擊地三葉草的病毒(SCSV)的終止信號、構巢曲霉的trpC基因的終止信號和其他類似終止信號。如上所述，"表達載體"可包括與編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸序列可操作地連接的誘導性啟動子。"誘導性"啟動子可引導它們可操作地連接的多核苷酸在組織中或發(fā)育的特定階段中表達或響應于環(huán)境條件而表達。在本發(fā)明的一個方面中，表達載體包括與編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸分子可操作地連接的強調控的誘導性載體。此表達載體可進一步包括與組成性啟動子或強調控的誘導性啟動子可操作地連接的選擇標記基因(例如，編碼賦予抗生素抗性的蛋白的基因)。根據(jù)目的，可通過病原體誘導性啟動子促進編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸序列的表達。白(PR蛋白)的啟動子，這些蛋白諸如，例如，PR蛋白、SAR蛋白、(3-1.3-葡聚糖酶、幾丁質酶等。在本發(fā)明的一個方面中，使用局部表達或靠近病原體感染部位表達的啟動子可能是有益的。此外，由于許多病原體通過經(jīng)常由昆蟲傷害所導致的傷口進入植物，因此在本發(fā)明的表達載體中可包括創(chuàng)傷誘導性啟動子。創(chuàng)傷誘導性啟動子包括，但不限于，馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因(pinll)啟動子、winl和win2基因啟動子、系統(tǒng)素基因啟動子、MPI基因啟動子。誘導性啟動子的轉錄活性也可通過多種環(huán)境因素包括，但不限于，溫度、厭氧脅迫和光來調控。誘導性啟動子的實例包括Adhl啟動子(由缺氧或冷脅迫誘導)、Hsp70啟動子(由熱脅迫誘導)和PPDK啟動子(由光誘導)。包括與核酸連接的啟動子的載體的構造在現(xiàn)有技術中是公知的，并且可見于Sambrook等人，(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二片反(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress)。包括編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸序列的表達載體包括在本發(fā)明的范圍內。下列也包括在本發(fā)明中包括編碼本文所述的蜘蛛網(wǎng)蛋白的表達載體的植物細胞、重組種子、重組植物胚、重組植物、動物細胞、重組動物胚胎、重組動物、昆蟲細胞、重組昆蟲和重組;微生物。"轉染細胞"或"轉化細胞"指其中使用重組DNA技術已經(jīng)插入了編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子的細胞。該細胞可來自宿主生物體，包括，但不限于，細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、才直物細胞和動物細胞。優(yōu)選地，該細胞是多細月包生物(例如，才直物和動物)的真核細月包。表達載體可通過多種常規(guī)技術被插入至目的宿主4i物的基因組中。例如，使用諸如電穿孔和植物細胞原生質體微注射的技術可將它們直接導入進植物細胞的基因組DNA中，或，另外，使用沖擊法，諸如，DNA包被顆粒的轟擊，可將表達載體直接導入至植物組織。微注射技術在現(xiàn)有技術中是公知的，并且在科學和專利文獻中有詳細的說明。Paszkowski等人，3:2717-2722,1984(如專利申請US2002015250130中所提到的)說明了使用聚乙二醇沉淀來導入表達載體。From等人，Prac.Ato/.爿c^/.USA82:5824,1985(如專利申請US20020152501中所提到的)說明了電穿孔的技術。Klein等人，淑歸327:70-73,1987(如專利申請US20020152501中所提到的)說明了沖擊轉化技術?？蛇x地，含有重組核酸分子的表達載體可被合并至適當?shù)腡-DNA側翼區(qū)并被導入至常規(guī)的宿主載體根癌農桿菌中。當植物細胞被根癌農桿菌感染時，此根癌農桿菌宿主的致病功能將引導重組核酸分子和相鄰標記插入至此細胞的DNA內。由根癌農桿菌介導的轉化技術，包括雙元載體致瘤因子的缺失(disarmament)和使用，在科學文獻中有詳細說明(如在專利申請US20020152501、Horsch等人，5We"ce233:496-498，1984;和Fraley等人，Ato/.Jca^USA80:4803,1983中所-提到的)。通過上述轉化技術的任一種得到的轉化植物的細胞可被培育以再生具有轉化基因型并且由此具有用于產生蜘蛛網(wǎng)蛋白的目標表型的完整植物。這些再生技術依賴于在組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中使用某種植物激素并且一般含有必須與目標核苷酸序列一起導入的抗微生物劑和/或除草劑標記。優(yōu)選地，本發(fā)明使用選自抗生素和除草劑的抗性基因的選擇標記，諸如，尤其是卡那霉素、新霉素、氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、潮霉素、遺傳霉素、草丁膦、草甘磷、草胺磷。本發(fā)明還使用報告基因以評價基因的轉化潛力，諸如AHAS、BAR和GUS。Evans等人,ProtoplastsIsolationandCulture,HandbookofPlantCellCulture,pp.124-176,MacMillilanPublishingCompany,NewYork,1983;和Binding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,pp.21-73，CRCPress,BocaRaton,1985(如專利申請US20020152501中所提到的)說明了從原生質體培養(yǎng)再生植物。也可從植物的愈傷組織、外植體、器官或這些的部分而獲得再生。此再生技術由Klee等人，爿朋.Ferq/"尸/m^戶/^.38:467-486,19871985(如專利申請US20020152501中所提到的)綜述，并也可見Clark,1997(Clark,M.S.主編，1997.PlantMolecularBiologyAlaboratoryManual.Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg);Maliga等人,1995(Maliga,P.;D.F.Flessing,A.R.Cashmore,W.Cruissem，J.E.Varner,主編，1995.MethodsinPlantMolecularBiology,ALaboratoryCourseManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress)和Martinez-Zapater&Salinas,1998(Martinez-Zapater,J.M.&J.Salinas,主編，1998.MethodsinMolecularBiology,v.82:ArabidopsisProtocols.HumanaPress,Totowa,N.J.)。;微生物培養(yǎng)物(細菌、真菌、酵母)的維持和生長的方法學對于本領域技術人員是公知的。這些技術的說明也可見相關技術手冊，諸如Gerhardt等人，1994(Gerhardt,P.;R.G.E.Murray;R.N.Costilow;E.W.Nester;W.A.Wood;N.R.Krieg&G.B.Phillips主編.ManualofMethodsforGeneralBacteriology,y^総〃'c"wSoc/砂/orM/cra6/o/ogy,Washington,D.C)或Brock，1989(Brock,T.D.I989.Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology.第二版,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,Mass)的技術手冊。"胚細胞"指能夠作為生物體的體細胞系和生殖系的所有細胞的祖先的細胞。胚細胞的實例包括干細胞(ES細胞)和受精卵母細胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的胚細胞是哺乳動物的胚胎細胞。"生殖細胞系"指真核祖細胞或祖細胞的類似物，其是細胞減數(shù)分裂的產物。"克隆"或"克隆細胞群"是通過有絲分裂來源于單細胞或共同祖先的細胞的群體。"細胞系"是原代細胞的克隆或能夠在體外穩(wěn)定生長許多代的細胞群。"植物"指光合生物，真核生物或原核生物兩者，由此術語"發(fā)育的植物"特定地指真核植物。本發(fā)明的核酸可用來賦予基本上任意植物以所需的性狀。因此，本發(fā)明能用于植物的許多種類，包括腰果屬、番荔枝屬(Anona)、花生屬、桂木屬、天門冬屬、顛茄屬、燕麥屬、蕓苔屬、番木瓜屬、柑桔屬、西瓜屬、辣椒屬、紅花屬、椰子屬、咖啡屬、黃瓜屬、南瓜屬、胡蘿卜屬、油棕屬(Elaeis)、草莓屬、大豆屬(Glycine)、棉屬、向日葵屬、萱草屬(Heterocallis)、大麥屬、莨菪屬(Hyoseyamus)、萵苣屬、亞麻屬、黑麥草屬、羽扇豆屬、番茄屬、蘋果屬、木薯屬、馬約蘭屬(Majorana)、苜蓿屬、煙草屬、木犀欖屬、稻屬、黍屬(Panieum)、狼尾草屬、西番蓮屬、鱘梨屬、菜豆屬、黃連木屬、豌豆屬、梨屬、李屬、番石榴屬、蘿卜屬、蓖麻屬、黑麥屬、千里光屬、芥屬(Sinapis)、茄屬、高粱屬、可可屬(Theobromus)、葫聲巴蜀、小麥屬、蠶豆屬、葡萄屬、虹豆屬和玉蜀黍屬的種類。"動物"指可屬于脊推動物門或無脊推動物門的真核生物，由此術語"高級動物"指脊推動物門動物。本發(fā)明的核酸可用來賦予基本上任意動物以所需的性狀。因此，本發(fā)明能用于脊推動物的許多種類，包括哺乳動物的種類，包括，^旦不限于，靈長類、鯨類、食蟲動物、皮翼目(dermopters)、翼手目(chiropters)、嚙齒類、兔形目、肉食動物、奇蹄目、蹄兔目、長鼻目、偶蹄目、異關節(jié)類、鱗曱目(folidotes)、管齒目、海牛目、有袋目和單孔目。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及在哺乳動物的種類中使用本發(fā)明的核酸，上述哺乳動物的種類包括，但不限于非洲獸總目(Afrotheria)、靈長總目、勞亞獸類(Laurasiatheria)和異節(jié)亞目的類群。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及選自鼠、牛、羊、山羊和馬的哺乳動物。術語"低級動物"指無脊推動物門動物。本發(fā)明能用于無脊推動物的許多種類，包括蛛形綱的種類，包括，但不限于，蜱螨亞綱、無鞭目、蜘蛛目、盲蛛目、鞭蝎目、偽蝎目、節(jié)腹目、蝎目、避日目、尾鞭目。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及在蜘蛛的種類中使用本發(fā)明的核酸，上述蜘蛛的種類包括，但不限于，新蛛亞目、中突蛛亞目和原d朱亞目。"微生物"指諸如細菌、病毒、真菌和原生動物的微小生物。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物包括選自細菌類群和真菌類群的生物。"細菌"指除藍藻門以外的原核生物。本發(fā)明的核酸可用來賦予基本上任意細菌以所需的性狀。因此，本發(fā)明能用于細菌的許多種類，包括，但不限于，放線菌門、產水菌門、擬桿菌門/綠菌門類群、衣原體門/疣微菌門類群、綠彎菌門、產金菌門、藍藻門、粘桿菌(Gloeobacteria)、念珠藻目、顫藻目、寬球藻目、原綠菌目、真枝藻目、脫鐵桿菌門、異常球菌-棲熱菌門、網(wǎng)團菌門、纖維桿菌門/酸桿菌門類群、厚壁菌門、梭桿菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、變形菌門、螺旋體門、熱脫硫桿菌門和熱袍菌門的類群。"真菌"指真菌界的生物，其可以是單細胞的或多細胞的。本發(fā)明的核酸可用來賦予基本上任意真菌以所需的性狀。因此，本發(fā)明能用于真菌的許多種類，包括，但不限于，子嚢菌門和擔子菌門的類群。優(yōu)選地，本發(fā)明使用選自曲霉屬、桿菌屬、埃希菌屬、畢赤酵母屬、酵母屬或鏈霉菌屬的微生物的類群。"免疫應答"指在具有功能性免疫系統(tǒng)的宿主中響應于諸如病毒抗原的抗原而發(fā)生的任何反應。免疫應答可以是"本質上"體液的(即，涉及免疫球蛋白或抗體的產生)或"本質上，，細胞的(涉及多種類型的"B"和"T"淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞、攜帶抗原的細胞和類似細胞)。免疫應答也可涉及幾種效應分子諸如細胞因子、淋巴因子和類似物的產生或生成。免疫應答可在體外或在動物細胞和系統(tǒng)中進行評價。這些免疫應答對于保護宿主免于疾病可以是很重要的并且可預防性地和治療性地使用。蜘蛛網(wǎng)蛋白或其片段的"衍生物"指通過在蛋白的氨基酸序列中的變化而修飾的多肽(例如，通過操作編碼蛋白的核酸或通過蛋白本身的改變)。天然氨基酸序列的此種衍生作用可涉及一個或多個氨基酸的插入、添加、缺失或替代，并且可以改變或不改變蜘蟲朱網(wǎng)蛋白的基本活性。術語"天生的或天然的蜘蛛網(wǎng)蛋白"指存在于由蜘蛛產生的網(wǎng)中的那些蛋特定網(wǎng)絲腺體獲得。該術語也可應用于使用多種表達系統(tǒng)產生的蜘蛛網(wǎng)蛋白，但這些蜘蛛網(wǎng)蛋白基本上包括與蜘蛛產生的氨基酸序列相同的氨基酸序列。術語"合成的蜘蛛網(wǎng)蛋白"指由表達系統(tǒng)產生的蛋白，其具有可基于天然蜘蛛網(wǎng)蛋白序列的序列或人工產生的編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的氨基酸基序的核酸序列。術語"生物絲"指通常由許多昆蟲和蛛形綱動物的任意一種產生和分泌的纖維蛋白。生物絲由交替的晶體和非晶體區(qū)組成。生物絲的實例包括蜘蛛網(wǎng)，在大量^朱形綱動物中發(fā)現(xiàn)的外編織纖維蛋白分泌物(例如，7V印/n7e"g^蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛和Paraw/;dfl5/WWato蜘蛛)，和絲心蛋白，在許多昆蟲中發(fā)現(xiàn)的外吐纖維蛋白分泌物(例如，家蠶)。優(yōu)選地，當經(jīng)過噴絲頭作用和機械拉伸生物絲以分泌物的形式分泌時，其將具有形成結晶疇的聚丙氨酸片段，該片段經(jīng)歷從螺旋至P-折疊的轉變，由此形成使此結構穩(wěn)定的((3)晶體。優(yōu)選地，生物絲的無定形區(qū)形成(3型折疊，其中折疊之間的空間為3-8埃，并且優(yōu)選3.5-7.5埃。優(yōu)選地，生物絲具有C-末端部分，該部分具有長度為20-40個氨基酸，更優(yōu)選地，長度為34個氨基酸的重復氨基酸基序，以及長度為35-55個氨基酸，更優(yōu)選地，長度為47個氨基酸的共有序列。優(yōu)選地，生物絲具有重復氨基酸基序(產生非晶疇和晶疇兩者)，該基序具有與選自SEQIDN.19-34)的序列至少50%相同的序列,更優(yōu)選地，與如SEQIDN.19-34所鑒定的序列至少70%相同,并且還更優(yōu)選地，至少90%相同的序列。"培養(yǎng)基"指圍繞細胞并且維持其生存的媒介。如果細胞正在分泌蛋白(例如，生物絲)，則細胞的培養(yǎng)基應當含有由此細I包分泌的蛋白。34新蜘蛛絲蛋白的發(fā)現(xiàn)，以及對它們的表征和在不同異源系統(tǒng)中的表達應該在許多領域，諸如醫(yī)療和工業(yè)中非常有用。蜘蛛絲蛋白可通過具有基本上與絲蛋白的共有單位類似的氨基酸序列的合成多肽或通過從編碼天然或工程絲蛋白的核酸序列表達的多肽，或這些多肽的衍生物而獲得。根據(jù)絲蛋白所需的應用，其可用于從單一蜘蛛網(wǎng)蛋白或從不同的蜘蛛網(wǎng)蛋白的組合形成纖維。本發(fā)明的一個方面提供了編碼新的蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸序列，本發(fā)明的核酸序列包括SEQIDN.1-19。本發(fā)明的一個具體的方面提供了編碼主要但不限于與主壺狀腺相關的絲蛋白的核S交序列。與此腺體相關的核酸序列的實例包括SEQIDN.3、17和18。本發(fā)明的一個具體的方面提供了編碼主要但不限于與次壺狀腺相關的絲蛋白的核酸序列。與此腺體相關的核酸序列的實例包括SEQIDN.4、5、6和16。本發(fā)明的一個具體的方面提供了編碼主要但不限于與鞭毛狀腺相關的絲蛋白的核酸序列。與此腺體相關的核S臾序列的實例包括SEQIDN.1和15。本發(fā)明的一個具體的方面提供了編碼主要但不限于與管狀腺相關的絲蛋白的核酸序列。與此腺體相關的核酸序列的實例包括SEQIDN.2。本發(fā)明的一個具體的方面提供了編碼主要但不限于與葡萄狀腺相關的絲蛋白的核酸序列。與此腺體相關的核酸序列的實例包括SEQIDN.14。編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子可通過兩種綜合方法制備人工合成編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核苷酸或通過分離來源于蜘蛛本身的核苷酸。兩種方法使用現(xiàn)有技術中詳細說明的實驗方案。來自核苷酸序列，諸如編碼合成的或天然的蜘蛛網(wǎng)蛋白的DNA序列的信息可從本發(fā)明的分離的核酸分子通過合成寡核苷酸來制備。寡核苷酸的合成可通過由AppliedBiosystems的DNA合成儀38A或類似裝置使用的磷酰胺法來制備。得到的構建物可直接使用或根據(jù)現(xiàn)有技術中通用的方法諸如液相色譜法(HPLC)純化。根據(jù)本發(fā)明，具有與編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的序列具有適當?shù)男蛄型绰实暮怂峥赏ㄟ^雜交條件和適當?shù)膰乐敍_洗來鑒定。此類方法用于多種目的，包括包含編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸的突變序列的文庫篩選。雜交可根據(jù)Sambrook等人(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress)中所述的方法學來進行。本發(fā)明也涉及新蜘蛛絲蛋白的分子。在本發(fā)明的具體方面，蜘蛛絲蛋白包括序列SEQIDN.20-38。本發(fā)明的一個具體的方面提供了主要但不限于與主壺腹腺相關的絲的氨基酸序列。與此腺體相關的氨基酸序列的實例包括SEQIDN.22、35和36。本發(fā)明的一個具體的方面提供了主要但不限于與次壺腹腺相關的絲的氨基酸序列。與此腺體相關的氨基酸序列的實例包括SEQIDN.23、24、25和37。本發(fā)明的一個具體的方面提供了主要但不限于與鞭毛狀腺相關的絲的氨基酸序列。與此腺體相關的氨基酸序列的實例包括SEQIDN.20和34。本發(fā)明的一個具體的方面提供了主要但不限于與管狀腺相關的絲的氨基酸序列。與此腺體相關的氨基酸序列的實例包括SEQIDN.21。本發(fā)明的一個具體的方面提供了主要但不限于與葡萄狀腺相關的絲的氨基酸序列。與此腺體相關的氨基酸序列的實例包括SEQIDN.33。本發(fā)明的另一個方面提供了具有選自SEQIDN.:1-19的序列的分離的核酸分子，并且由此通過特異性或組成性啟動子和具有多聚腺苷酸化區(qū)的終止子控制表達。本發(fā)明還說明了從在原核細胞和真核細胞中產生的蜘姝絲蛋白產生生物絲的方法。本發(fā)明的另一個方面提供了包括由核酸編碼的蜘蛛絲蛋白的至少一種的宿主細胞。這些宿主細胞包括，^旦不限于，細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物細胞。超表達一種或多種由本發(fā)明的核酸編碼的蜘蛛絲蛋白的宿主細胞提供了用于多種目的的有用試劑，包括，但不限于，產生包括至少一種可被摻入至材料內以調節(jié)該材料的結構特性的絲蛋白的絲纖維。本發(fā)明進一步涉及皮膚病學組合物，其特征在于包括a)重組蜘^Mi蛋白；b)藥學可接受的載體。本發(fā)明還說明了殺微生物劑組合物，其特征在于包括a)重組蜘蟲朱絲蛋白；b)農業(yè)可接受的載體，和，c)包4舌或不包4舌添加劑。本發(fā)明的另一個目的是提供含有本發(fā)明的DNA分子的原核細胞和原核生物—所述DNA分子可以是來自SEQIDN.1-19的鑒定序列的任一種一或含有能夠產生本發(fā)明的蛋白(SEQIDN.20-38)的基因構建物的細胞，或這些細胞或生物的變異體?；驑嫿ㄎ锟煞€(wěn)定地合并入原核生物細胞的基因組中。本發(fā)明的另一個目的是提供含有本發(fā)明的DNA分子的真核細胞和真核生物，所述DNA分子可以是來自SEQIDN.1-19的鑒定序列的任一種，或含有能夠產生本發(fā)明的蛋白(SEQIDN.20-38)的基因構建物的細胞，或這些細胞或生物的變異體?；驑嫿ㄎ锟煞€(wěn)定地合并入真核生物細胞的基因組中。在本發(fā)明的另一個方面，基因構建物可具有能夠以自發(fā)方式在真核生物的細胞中復制的DNA分子，諸如病毒載體?；驑嫿ㄎ镆部梢运矔r的方式在真核生物的細胞中排列。本發(fā)明也說明了產生遺傳修飾的生物體的方法，其特征在于包括以下的階段a)用根據(jù)權利要求3-11任一項所述的基因構建物或根據(jù)權利要求12-23任一項所述的表達載體轉化細胞、組織、器官或胚胎；b)選4奪轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子；c)再生具有階段b)中選擇的轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子的成熟植物、成熟胚胎或微生物；d)選擇階段(c)的含有具有編碼蜘蛛絲蛋白的核苷酸序列的基因構建物或表達載體的成熟植物、成熟胚胎或微生物細胞。本發(fā)明還說明了產生重組蛋白的方法，其特征在于包括以下的階段a)用根據(jù)權利要求12-23任一項所述的表達載體轉化細胞、組織、器官或胚胎；b)選擇轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子；c)再生具有階段b)中選擇的轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子的成熟植物、成熟胚胎或微生物；d)選擇階段c)的含有具有編碼蜘蛛絲蛋白的核苷酸序列的表達載體的成熟植物、成熟胚胎或微生物細胞；e)提取在階段d)中選擇的微生物中產生的重組蜘蛛絲蛋白。用核酸分子編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的可能性使得在活性原核生物或真核生物系統(tǒng)中產生大量的蜘蛛網(wǎng)蛋白變得可行。例如，至少一種編碼天然或合成的蜘蛛網(wǎng)37蛋白的DNA分子的部分或全部，諸如選自SEQIDN.1-19的核S臾序列，可被插入至適于細菌細胞諸如大腸埃希桿菌的表達的質粒載體中。此類載體包括在宿主細胞中表達DNA所需的調控元件，該調控元件以使DNA在該宿主細胞中表達的方式定位。表達所需的此類調控元件包括啟動子序列、轉錄起始序列和任選地，增強子序列。此類方法可用來例如，在細菌系統(tǒng)中，評價用于表達蜘蛛網(wǎng)蛋白的構建物，由此提供快速和真正的分類技術。通過重組原核生物或真核生物系統(tǒng)中的基因表達產生的蜘蛛網(wǎng)蛋白可根據(jù)現(xiàn)有技術中已知的方法來進行純化。優(yōu)選地，可使用市售的活性分泌/表達系統(tǒng)，由此由宿主細胞表達并隨后分泌重組蛋白，以便促進培養(yǎng)基中的純化。如果不使用表達/分泌載體，可替代的技術涉及純化來自表達該蛋白的原核細胞或真核細胞的裂解細胞的重組蛋白。處理這類細胞裂解產物的方法在現(xiàn)有技術中是公知的。重組蛋白可通過親和分離而純化，諸如通過與特異結合重組蛋白的抗體的免疫相互作用或用于分離在N-末端或C-末端標記有6-8個組氨酸的重組蛋白的鎳柱?？蛇x的標記由FLAG抗原表位或血凝素抗原表位組成。此類方法在現(xiàn)有技術中是公知的，并被本領域中的專業(yè)技術人員所廣泛使用?？蛇x地，設計用來從植物勻漿差異分離絲蛋白的標準純化策略也可用來獲益。由于在通常使一般型蛋白變性的條件諸如，例如，高溫和低pH值下的極大穩(wěn)定性，在植物中表達的蜘蛛網(wǎng)蛋白的純化可以變得更容易。蛋白純化策略可通常適用于優(yōu)化來自葉的蜘蛛網(wǎng)蛋白的純化?？赏ㄟ^常規(guī)方法挑取轉基因植物的地上部分并干燥。這些脫水植物部分可在適當?shù)木彌_液中勻漿，然后進行幾次被設計用來差異消除污染物的處理?；厥盏慕z蛋白可在處理后被優(yōu)化，在該處理中植物提取物經(jīng)過下列步驟的一種或多種組合處理1)存在或不存在洗滌劑的情況下，煮沸；2)差速離心；3)進行性地降低pH,以及；4)用不同濃度的尿素或硫酸銨沉淀。這些步驟可根據(jù)在植物中的蜘蛛網(wǎng)蛋白的期望生產優(yōu)化和純化效率而變化。蜘蛛網(wǎng)蛋白水平可通過免疫印跡來測定，而純度和濃度通過氨基酸的分析來測定。純化的蜘蛛網(wǎng)蛋白可通過其機械性能來分析以便確認重組蛋白具有目標特性。如上所述制備的蜘蛛網(wǎng)蛋白可根據(jù)標準步驟來分析。例如，這些蛋白可才艮據(jù)已知的方法進行氨基S交序列的分析。本發(fā)明的蜘蛛網(wǎng)蛋白可用作針對病毒復制的殺微生物劑；針對昆蟲和害蟲的防御素；化妝品或皮膚病學組合物；與其他物質組合。它們也可被導入至棉花植抹中以與棉纖維一起表達以增加纖維的耐性和柔韌性。本發(fā)明的蛋白也涉及產生蜘蛛天然產生的絲的新變體和具有不同的物理和化學特性的新蛋白、肽和多肽。實施例本發(fā)明進一步由下列的實施例限定。應當理解的是盡管這些實施例顯示了本發(fā)明的一部分，但它們僅以說明的形式提供，并且因此不對本發(fā)明的范圍作任何限制。通用分子生物學技術諸如細菌的轉化和核酸在瓊脂糖凝膠中的電泳以通常說明它們的術語提及。這些技術的實施細節(jié)在現(xiàn)有技術中都是公知的，在Sambrook等人(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)中說明。實驗操作中使用的幾種溶液以其通用名稱提及，諸如"裂解溶液"、"SSC"、"SDS"等。這些溶液的組成可見上述提到的文獻(Sambrook等人)。實施例1掩妹及其網(wǎng)的收桌和分類從巴西生物多樣性，主要從亞馬遜區(qū)域、大西洋雨林和科拉爾(corral)采集金珠屬(Ag—e平)蟲知蛛、￡//^6<9戸5平、絡新婦妹、jVe/Me"gyscn^e齒to、黃帶粉趾食鳥蛛和尸arawZ;d"Z)ZWn'ato蜘蛛的種類的絲。絲在室溫下干燥，并通過紅外顯微鏡(FTIR)分析。在a-和(3-折疊的結果中觀察到顯著差異，主要與涉及絡新婦蛛的絲的柔韌性和耐性相關。最近已經(jīng)使用FTIR作為測定固體狀態(tài)的蛋白的二級結構的方法，并且已經(jīng)證明是最可行的，尤其對于不溶性蛋白諸如蜘蛛網(wǎng)的蛋白。使用由Forato等人，1998開發(fā)的標準品識別方法來定量蛋白的二級結構。從以KBr壓片制成的樣品獲得蜘蛛網(wǎng)和轉基因表達產物的譜，并且用于在1600至1800cm-l之間定量酰胺條帶I。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實施例2獲得多^"苷酸序列cDA^丈岸的構建，測序采集后，蜘蛛的產絲腺體在實驗室中分離，立即在液氮中冷凍，并保持在-70。C的溫度下。4分碎后，使用試劑TRJZOL(Invitrogen)根據(jù)生產廠商的說明書進行總RNA的提取。Oligotex試劑盒(Qiagen)用于純化用于合成cDNA的mRNA，優(yōu)選地通過根據(jù)生產廠商的指南使用"SUPERSCRIPTIIPlasmidSystemwithGATEWAYTechnologyforcDNASynthesisandCloning"i式劑盒(Invitrogen)。在合成后，使用SepharoseCL-2B樹脂(Pharmacia)在色譜柱中進行大小分離。大(l-5Kb)和小(0.5-2Kb)cDNA片段都插入進適當載體諸如pSPORT-l(Life)、pCMV-SPORT6或pTrueBlue(Genetix)中。由此獲得的文庫導入進宿主細胞中，優(yōu)選地通過電穿孔(25mF、200W、1.8KV)導入至DH5a細菌(Invitrogen)中。轉化的細菌在含有具有適當?shù)倪x擇試劑的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基的7.5cmPetri平皿中培養(yǎng)(Sambrook等人，1989)。表現(xiàn)有插入物的那些細菌(白色)轉移至96孔板中。借助于復制儀制備每個96孔板的拷貝，并且兩個復制板都保持在-70°C的溫度下。使用改良的使用96孔板的堿裂解法(Sambrook等人，1989)從來自復制板之一的接種物制備用于測序的DNA。使用BigDyeTerminatorCycleSequencingKit(AppliedBiosystems)進行測序反應。根據(jù)其中構建文庫的載體選擇在測序反應中使用的引物。所有克隆從插入物的mRNA的初始5'端進行測序，并且部分克隆也從3'端測序。在AppliedBiosystems3700自動測序4義中讀取測序反應。得到的電泳圖譜轉移至位于Laborat6riodeBioinform站cadaEmbrapaRecursosGen6ticoseBiotecnologia[BioinformaticsLaboratoryofEmbrapaGeneticResourcesandBiotechnology]的中央數(shù)據(jù)庫，以進行處理和分析。產生的序列存放在GenBank(Benson等人；1999)中，并轉移至BCCC(http:〃www.bcccenter.fcav.unesp.br)，在jt匕它們由國際牙牛學共同體(internationalscientificcommunity)處理。這些序列也在序列表SEQ.ID.N.1-SEQ.ID.N.19中說明。本文所述的遺傳工程技術對于本領域專業(yè)技術人員是公知的，并且也在Sambrook等人，1989(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual-volumes1,2and3.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork),Silhavy等人，1984(Silhavy,T.J.;M.L.Bennan&L.W.Enquist.1984.ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.)和Ausubel等人，1987.(CurrentProtocolsinMolecularBiology,pub.byGreenePublishingAssoc,andWiley-Interscience)中說明。實施例3耒^不同掩j昧種類的ii的批械分析i^的采桌—如Stauffer等人(StaufferSL，CoguilSL,LewisRV.Comparisonofphysicalpropertiesofthreesilksfrom7Ve/Mac/謂》es1andJrawe^ThejournalofArachnology.1994;22:5-1l)以前所述，每個種類的長度為大約5cm的5個樣品置于機械實驗卡上。測量幹維苴徑-使用裝有照相機的NikonEclipseE200顯孩吏鏡分析纖維。每種絲放大800倍觀察，并且使用SPOTBasic軟件顯示圖像。使用ImageJ軟件，1.32版(http:〃rsb.info.nih.gov/ii/)測定直徑，并且沿纖維的長度取5次測量值的均數(shù)而獲得最終值。機械試驗-每種纖維用Synergie100機械測試系統(tǒng)(MTS)，采用定制的lO-g側力傳感器測試。纖維以2mm/min的速率拉伸，并以35Hz的頻率采集數(shù)據(jù)。使用Testworks4軟件(MTSSystemsCorporation,Gary,NC)完成數(shù)據(jù)采集。使用MicrosoftOfficeExcel2003軟件構建應力x應變圖。下面的等式用來計算應力、應變和剛度值。<應力)=/%4,其中F為施加的力，且A為橫截面積?！?^變)=/1丄/10，其中AL為纖維長度的變化，且L0為初始長度。r(^!/產-或楊政模量戶o/￡種類直徑(,)應變(％)應力(GPa)剛度(GPa)黃帶粉趾食鳥妹9.62±3.927.54±5.710.07±0.030.017±0.0184.82±0.6111.88±2.970.8U0.230.253±0.30641<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>12.91±7.38*BrooksAE,SteinkrausHB,NelsonSR,LewisRV.AninvestigationofthedivergenceofmajorampullatesilkfibersfromTVepMac/謂》es1andJrg/o/eawraw"a.Biomacromolecules.2005Nov-Dec;6(6):3095-9.**Motriuk-SmithD，LewisRV.BrownWidow(丄a/nfifecft^geo附e/n'cws)majorampullatesilkproteinanditsmaterialproperties.S/菌e必c/Tmfra/w.2004;40:64-9.***MadsenB,ShaoZZ,VollrathF.Variabilityinthemechanicalpropertiesofspidersilksonthreelevels:interspecific,intraspecificandintraindividual.Macrawo/.1999Mar-Apr;24(2-3):301-6.實3包例4本發(fā)明的序列與現(xiàn)有技術中的觀有序列'的比較關于SEQIDN.1(基因產物M//z,7e"gvwcn/e"tato-NCFlag)，使用BLASTP軟件在GenBank中搜索發(fā)現(xiàn)了下列10個蛋白序列被說明為最相似的序列1.gi|7106228|gb|AAF36091.12.gi|7106224|gb|AAF36090.13.gi|2833649|gb|AAC38847.14.gi|13561982|gb|AAK30594.15.gi|2833647|gb|AAC38846.16.gil70913024|gb|AAZ15322.17.gi|13562004|gb|AAK30605.18.gi|93138993|gb|ABE99838.19.gi|7106229|gb|AAF36092.110.gi|89276819|gb|ABD66603.1如表1所驗證，序列編號9(gi|7106229，在表中由星號突出顯示)是當與SEQIDN.1比對時具有最小的氨基酸差異百分比的一個。在這兩個蛋白序列之間比對的總氨基酸中，23%是相異的。重要的是要注意到在此計算中并不包括具有空位的比對氨基酸，并且由此分析所考慮的比對是所有11種蛋白之間的多重比對。觀察到信息"錯誤未發(fā)現(xiàn)參考源(Error:Referencesourcenotfound)",可能要注意，如果在計算中包括空位，則差異將會更大。該表還確認以前說明的幾種其他序列(下劃線值)顯示其間較高的相似性水平，而非SEQIDN.1和以前所述序列之間觀察到的相似性水平。表l:ll條序列相對于SEQIDN.1的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI1"表示SEQIDN.1。標明行和列的數(shù)字對應于以前在現(xiàn)有技術中說明的序列的列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.1和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.1所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。SI1123456789144239325464044247434342邊274547652545250535375254525053538535755525555923*4041旦43375151541059656260596258586160圖1指示了SEQIDN.1和序列編號9(別7106229)之間的比斧卜，其突出顯示了兩條序列之間相同的氨基酸。序列上方的數(shù)字標明對比中的位置。由于插入空位以保持比對引起了差異。為了計算差異的百分比，本發(fā)明的序列用于GenBankCDS非冗余蛋白序列庫(non-redundantproteinsequencesbank)(Benson,D.A.，Karsch-Mizrachi,I.,Lipman,D丄，Ostell，J.,Wheeler,D丄.(2006).GenBank.NucleicAcidsRes.34(Databaseissue):D16-20)的比較搜索。該搜索的進行不使用低復雜性濾波器，大小為3個字，使用BLOSUM62矩陣，空位開放罰分為11點，且每延伸一個氨基酸1點。具有10的最高"分值"的序列用于使用ClustalX(Thompson,J.D.,43Gibson,T丄，Plewniak,F.，Jeanmougin,F.和Higgins，D.G.(1997).TheClustalXwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools.NucleicAcidsResearch,24:4876-4882)的多重比對。多重比對使用Gonnet250矩陣，空位開放罰分10點，并且給予每個延伸的氨基酸以0.20點。成對比對使用通過將空位延伸罰分降低至0.10點的"慢-精確"法。最終多重比對的結果借助于MEGA3軟件(Kumar,S.,Tamura，K.andNei，M.(2004).MEGA3:IntegratedsoftwareforMolecularEvolutionaryGeneticsAnalysisandsequencealignment.BriefingsinBioinformatics5:150-163)用于成只于3巨離比4交。差異的百分比通過將不同氨基酸的數(shù)目除以比較的氨基酸的總數(shù)目來計算。比對中的空位保留在分析中，并成對地清除。使用與單一比對的相同參數(shù)，從被研究的兩條序列之間的比對生成比對圖。使用ESPript軟件(Gouet,P.，Courcelle,E.，Stuart，D丄和Metoz,F.(1999).ESPript:multiplesequencealignmentsinPostScript.5/o//orw"/cs.15:305-8.http:〃espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)編排比對結果。關于SEQIDN.2(基因產物AAep/w7e"g^crwe"toto-NCTuSp),已i兌明的IO條最相似的蛋白序列為1.gil837584272.gi|683425013.gi|893657764.gi|893657745.gi|630543296.gi|613872447.gi|709276548.gil630543279.gi|6138723710.gi(61387234表2:11條序列相對于SEQIDN.2的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI2"表示SEQIDN.2。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.2和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.2所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>關于SEQIDN.3(基因產物yVep/w'/ewg^cn/ewtoto-NCMaSp),已說明的10條最相似的蛋白序列為1.gi|837584272.gi|683425013.gi|893657764.gi|893657745.gi|630543296.gi|613872447.gi|709276548.gi|630543279.gi|6138723710.gi|61387234表3:11條序列相對于SEQIDN.3的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI3"表示SEQIDN.3。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.3和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.3所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。SI312345678917承215745<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表4:11條序列相對于SEQIDN.4的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI4"表示SEQIDN.4。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.4和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.4所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>關于SEQIDN.5(基因產物7Vep///e"g^crw朋toto-NCMiSp06A01),已說明的IO條最相似的蛋白序列為1.gi|26057982.gi|85720613.gi|7653234.gi|272289595.gi|470079236.gi|470079637.gi|135619928.gi|1087077649.gi|8927681710.gi|2914731表5:11條序列相對于SEQIDN.5的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI5"表示SEQIDN.5。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.5和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.5所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表6:11條序列相對于SEQIDN.6的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI6"表示SEQIDN.6。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.6和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.6所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>關于SEQIDN.7(基因產物iVep/H7e"gyscme"toto-NCfibroin)，已說明的10條最相似的蛋白序列為1.gi|630543312.gi|6984160|3.g3i|709056424.gi|893657765.gi|709056416.gi|630543297.gi|709056438.gi|149732699.gi|1356201810.gi|8885520|表7:11條序列相對于SEQIDN.7的成對比對之間的^酸差異百分比。"SI7"表示SEQIDN.7。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.7和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.7所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>關于SEQIDN.8(基因產物7Ve;/z,7e"g^-NCdefensin),已說明的IO條最相似的蛋白序列為l.gi|8951212<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>5.gi|522096736.gi|714163557.gi|892768198.gi|135620189.gi|7165476010.gi|109511662表9:11條序列相對于SEQIDN.9的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI9"表示SEQIDN.9。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.9和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.9所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。SI91234567891842868738283864828386丄828386丄丄6808487777777776*818387878780876*85878686868484979848876767679831082868381818179848878關于SEQIDN.10(基因產物黃帶粉趾食鳥蛛AJFibroinIB),已說明的10條最相似的蛋白序列為1.gi|681715642.gi|175369633.gi|892768194.gi|381977455.gi|135620206.gi|381977437.gi|83758429518.gi|714163559.gi|7091302210.gi|1263289表10:11條序列相對于SEQIDN.10的成對比對之間的^tj^酸差異百分比。"SI10"表示SEQIDN.IO。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.10和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.10所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。SI10122!45678918828391375918147586854176908476避6748885777888485878485882898478818580849768883221^82781073*88832^41857842關于SEQIDN.ll(基因產物黃帶粉趾食鳥蛛AJFibroin2)，已說明的10條最相似的蛋白序列為1.gi|14053872.gi|381977493.gi|381977514.gi|381977455.gi|503091996.gi|381977557.gi|381977598.gi|381977479.gi|5042356310.gi|3819775752表11:11條序列相對于SEQIDN.11的成對比對之間的M酸差異百分比。"SI11"表示SEQIDN.11。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.11和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.11所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。SI11123.45678916624176342761455771688383838663375旦81742768184276丄丄丄83297686878889688686871032*771212128284關于SEQIDN.12(基因產物黃帶粉趾食鳥蟲朱AJNegProtein1),已說明的IO條最相似的蛋白序列為1.gi|871332392.gi|871332413.gi|175393084.gi|720113705.gi|709130246.gi|683650427.gi|498711018.gi|1107564879.gi|8511170510.gi|39973263表12:11條序列相對于SEQIDN.12的成對比對之間的^J^酸差異百分比。"SI12"表示SEQIDN.12。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在53SEQIDN.12和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.12所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>關于SEQIDN.13(基因產物黃帶粉趾食鳥蛛AJNegProtein2)，已說明的IO條最相似的蛋白序列為1.gi|220742922.gi|150214223.gi|887131134.gi|555931565.gi|825394046.gil1094670827.gi|32363708.gi|66778179.gi|7199204810.gi|62175305|表13:11條序列相對于SEQIDN.13的成對比對之間的#^酸差異百分比。"SI13"表示SEQIDN.13。標明行和列的數(shù)字對應于上迷列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.13和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.13所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>關于SEQIDN.14(基因產物尸araw/jda6/Wn'oto-PBAciniform),已i兌明的IO條最相似的蛋白序列為1.gi|498711012.gi|891140103.gi|449806334.gi|407873725.gi|588648996.gi|829361547.gi|167413978.gi|72431039.gi|l159614410.gi|45439370表14:11條序列相對于SEQIDN.14的成對比對之間的M酸差異百分比。"SI14"表示SEQIDN.14。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.14和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.14所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表16:11條序列相對于SEQIDN.16的成對比對之間的M酸差異百分比。"SI16"表示SEQIDN.16。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.16和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.16所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>關于SEQIDN.17(基因產物ParawZx/a6/W〃'ato—PBMaSpl),已說明的10條最相似的蛋白序列為1.gi|475692342.gi|328156713.gi|493298924.gi|519752465.gi|427827896.gi|1095000957.gi|552741048.gi|552740849.gi|5036314510.gi|1263285表17:11條序列相對于SEQIDN.17的成對比對之間的U酸差異百分比。"SI17"表示SEQIDN.17。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.17和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN17所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>關于SEQIDN.18(基因產物ParaiWx/a-PBMaSp2)，已說明的10條最相似的蛋白序列為1.gi|709130222.gi|328156713.gi|552741044.gi|552740805.gi|552740926.gi|552741367.gi|552741288.gi|552740869.gi|3819774510.gi|55274082表18:11條序列相對于SEQIDN.18的成對比對之間的IL^酸差異百分比。"SI18"表示SEQIDN.18。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.18和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN.18所發(fā)現(xiàn)的相似性。表^f又填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>關于SEQIDN.19(基因產物Amwi;d"6/5伊/flto-絲腺體蛛絲蛋白)，已說明的IO條最相似的蛋白序列為1.gi|13999452.gi|709130223.gi!175078794.gi|552740805.gi|552740866.gi|552741367.gi|552741288.gi|552741129.gi|5527413810.gi|55274092表19:11條序列相對于SEQIDN.19的成對比對之間的氨基酸差異百分比。"SI19"表示SEQIDN.19。標明行和列的數(shù)字對應于上述列表上的數(shù)字。在行和列的相交處的數(shù)字代表在兩條序列的比對中觀察到的差異百分比。星號表示在SEQIDN.19和以前所述的序列之間出現(xiàn)的最大相似性。下劃線值代表以前說明的序列之間的相似性大于對SEQIDN,19所發(fā)現(xiàn)的相似性。表僅填寫了一半，因為這些值是交互的。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>實施例5在控#中狗建食^"掩i^i^蛋白的基園的表這裁體本發(fā)明中使用的表達載體含有至少一條啟動子序列和一條編碼選自SEQIDN.1-19的蜘蛛絲蛋白的序列和一條多聚腺*酸化序列。表達載體可進一步含有負責翻:i奪后加工和異源蛋白的區(qū)室化的調控序列。使用標準的重組DNA操作方法學來構建表達載體(Sambrook，J.Molecular60Cloning:ALaboratoryManual(3-VolumeSet)ColdSpringHarborLaboratoryPress;第三版，2001)?；旧?，與片段相關的編碼區(qū)在大豆中，絲蛋白的編碼序列在(3-伴大豆3求蛋白肽信號和啟動子的控制下纟皮克隆(以前在Labomt6riodeTransfer&nciadeGenes[GeneTransferLaboratory]-EMBRAPA中克隆)(圖2)。目標改變的目的是使片段適于添加植物肽信號的編碼序列，由此使其正確地加工重組蛋白。在棉中，絲蛋白的編碼序列在擬南芥的肌動蛋白2肽信號和啟動子的控制下被克隆(AragacF丄L.,ViamiaG.R.,CarvalheiraS.B.R.,RechE丄.(2005)Germlinegenetictransformationincotton((7ow_y//Mw/HVswfMw丄.)byselectionoftransgenicmeristematiccellswithanherbicidemolecule.P/aw/Sc/.168:227-1233)。本發(fā)明的基因和蛋白序列可根據(jù)其目標應用來修飾并且仍然在本發(fā)明的范圍內。例如，當預期纖維應該具有低彈性時，應該去除丙氨酸(Ala)重復的序列，并且反之，當要求高彈率時，可增加聚Ala部分的大小。而且，構建物有可能僅包括本文所提到的序列的重復模塊，并且也可能包括不同蛋白模塊的組合以便達到目標特性。實施,例6產蘭舍有掩妹i^蛋白的差歐序#V的大—豆和祐花植棘獲得的表達載體用于使用含有在ahas基因啟動子和NOS終止子控制下的ahas基因的編碼序列的載體pAG(圖3)轉化和共轉化試驗中。此載體允許在體外選擇轉基因大豆和棉花植抹。當需要時，在35SCaMV啟動子和nos終止子控制下的GUS標記基因被克隆進pAGl中。通過由EMBRAPA開發(fā)并由專利PI9714887-3保護的生物轟擊系統(tǒng)培育轉基因大豆和棉花植S朱。產生的轉基因植物通過PCR(Delhporta,S丄"Wood,J.and5Hicks,J.B.(1983).AplantDNAminipreparation:versionII./V朋ZAfo/ecw/arWe/o他1:19-21;AragSo,F.J丄.，Barros,L.M.G.,Brasileiro,A.C.M.,Ribeiro,S.G.,Smith,F.D.,Sanford,J.C.RechE丄.(:19%).Inheritanceofforeigngenesintransgenicbean(/Vzoseo/wsvM/gaWs丄.)co-transformedviaparticlebombardment.T/zeorJ/;/GeweZ93:142-150)和Southern印跡(Ddlaporta,S丄.，Wood,丄andHicks,J.B.(1983).AplantDNAminipreparation:versionII../)/""/.M/ecw/ar說o/c^1:19-21;SambrookJ.,FritschE.F,,Maniat]sT.(1989).Molecularcloning:alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)分析以及通過生物化學分析和生物測定來檢測轉基因。進行組織化學分析來檢測異源基因的整合。實施例7使用農軒窗滲入法和病毒裁體表達糸。妹蛋白通過對植抹原位接種含有克隆在雙元載體pCambia1300(www.cambia.org)中，或基于馬鈐薯X病毒(PVX)的病毒載體中的蜘蛛基因的根癌農桿菌抹來評價蜘蛛基因的瞬時表達?；谳d體pGR107的此病毒載體(ChapmanS,KavanaghT和BaucombeD(1992)PotatovirusXasavectorforgeneexpressioninplants.ZV朋ZJ2:549-557)呈現(xiàn)蛋白鞘啟動子的復制和用于克隆外源基因的限制性位點。與PVX對應的序列克隆在雙元載體中的CaMV35S啟動子的控制下，由此能夠通過農桿菌接種(農桿菌接種)。初始載體pGR107通過在Smal位點添加來自GatewayTM克隆系統(tǒng)(Invitrogen)的轉換盒而被改造。因此，得到的載體PVXGW與GatewayTM克隆系統(tǒng)(:h]vitrogen)是相容的，使得與常規(guī)的限制酶切和連接的方法相比，基因的克隆更快和更有效。具有含有蜘蛛基因的雙元載體或病毒載體的根癌農桿菌抹接種在本塞姆氏煙草(Nkotianabenthamiana)的葉子上，并且4-6天后評價瞬時表達。實施例8在細窗裁體f^7建含有蜘娣.絲蛋白的差因的產達裁體并在細窗產達系統(tǒng)中產蘭這些蛋白使用pET系統(tǒng)(Nov,agen)構建用于本發(fā)明中的細菌表達載體。根據(jù)Lewis等人(LewisRV,HinmanM.,KothakcrtaS》Foumie.rMJ.Expressionandpurificationofaspidersilkprotein:Anewstrategyforproducingrepetitiveproteins.PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION7(4):400-406JUN1996)所述的策略，合成選自SEQIDN.l-19的蜘蛛絲蛋白編碼序列的重復模塊并克隆在pUC19載體中，與能使該重復單位倍增N次的限制性位點相連。含該重復模塊的表達盒被轉移至pET19b載體(Novagen)在T7啟動子的控制下(圖4)并與N-末端組氨酸的尾部融合。得到的這些載體被用來通過熱休克轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞(BL21(DE3)抹和BL21(DE3)pLysS抹)。含有表達載體的重組細菌接種在含有適當?shù)目股氐呐囵B(yǎng)基中，并生長至OD600nir為0.8-0.9。以濃度為lmM的IPTG在37°C下振蕩3h誘導蛋白產生。如系統(tǒng)生產廠商所述，然后培養(yǎng)物以1500g離心15min,并重新懸浮在裂解緩沖液中。在這些試驗條件下，BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS62細胞誘導在此異源系統(tǒng)中所引用的基因的表達，并且裂解提取物被用來通過柱色譜使用裝有50mMNiS04和5mM咪唑的Ni-NTAHis-BindResin(Qiagen)進行純化。含有重組蛋白的餾分使用含有l(wèi)OOmM咪唑的洗脫緩沖液洗脫，在蒸餾水中透析2天，然后凍千。純化蛋白的回收保持在0.2mg/g-10mg/g細胞干重。在噴逸動#細應的裁體中枸建舍有妙妹i蛋白的羞的襲達裁體并在動#表達,系銃中產蘭這些蛋白至少一條序列用于在pCMV-script載體(Stratagene)中克隆。此載體用于在培養(yǎng)的哺乳動物細胞，CHO(中國倉鼠卵巢)中表達，使用巨細胞病毒啟動子和SV40多聚腺芬酸化位點，其允許很高的組成性表達率。產物從純化的培養(yǎng)上清液中表達并存留。選自SEQIDN.1-19的絲蛋白編碼序列，以及這些序列的模塊操縱形式的序列，插入至基于巨細胞病毒早期啟動子的載體中。使用脂質轉染試劑和磷酸鈣，將得到的載體(圖5)與報告栽體p(:MV,Gal(Promega)和pGFP/NEO(Promega)一起用于共轉染倉鼠卵巢細胞(CHO-中國倉鼠卵巢)。通過Western印跡在還原劑或非還原劑條件下評價絲蛋白的完整性。此技術旨在通過聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離后并轉移至硝酸纖維素或尼龍膜來檢測蛋白。通過與目標蛋白的抗原表位特異反應的抗體，然后經(jīng)比色反.應或放射顯像反應進行檢測。使用原核微注射技術產生含有具有蜘蛛網(wǎng)蛋白基因序列的表達載體的轉基因小鼠。此技術用于通過加入生成轉基因動物。該技術進一步能夠在賦予高表達水平的哺乳動物的基因組中導入來自不同種類的長DNA序列并在生殖細胞中整合轉基因。使用與高分辨率顯微鏡連接的微操縱儀，含有選自SEQIDN.1-19的蜘蛛網(wǎng)蛋白基因序列的表達載體的拷貝被直接注射進從超排雌性供體的輸卯管中采集的新鮮受精胚胎原核中。在組合在一起變成含有新個體的基因組的單核之前，原核是分別在卵和游動精子中發(fā)生的母系核和父系核。在微注射后，胚胎轉移至之前與切除輸精管的雄性交配的假孕雌性受體，該受體將足月孕育可能具有轉基因的幼仔，將在以后測定這些幼仔的基因型以確定外源基因的存在。由原核微注射引起的轉基因的整合在基因組中以隨機的方式發(fā)生，并且所有的動物細胞被遺傳修飾，包括生殖細胞，由此生殖細胞將變化傳給其子代。就轉基因在基因組中的插入〃立置和拷貝數(shù)目而言，從微注射的胚胎發(fā)生的完全63陽性的轉基因動物被歸類為一個轉基因系的建立者，不同于另一建立者。處理動物加入基因的詳細試驗方案在現(xiàn)有技術中有詳細的i兌明，并且可見于文獻中的各手冊和4奮訂版(Hogan,B"Beddington,R"Costantini,F.，Lacy,E.(1994).Manipulatingthemouseembryo:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor;Godard,A丄.B.,Gu6net,J.(1999)GeneticadeCamundongos.Modelosanimaisdedoen;ashumanas.Sz》/ec/og/",C/^w"'"tfeZ)esewvo/W膨wto9:96-100)。轉基因牛的產生用于在奶中實際生產蜘蛛網(wǎng)蛋白。衍生于pBC1的表達載體(Invitrogen)用于在轉基因動物的奶中表達重組蛋白。選自SEQIDN.1-19的蜘蟲朱網(wǎng)蛋白基因被克隆在這些載體的Xhol位點處(圖6)，其結構含有引導乳蛋白表達的啟動子，諸如(3-酪蛋白啟動子和組成性啟動子(IgumaL.T.，LisauskasS.F.C.,MeloE.O.,FrancoM.M.,PivatoI.,ViarmaG.R.,SousaR.V.,DodeM.A.N.,Arag汪oFJ丄.,RechE.L"R腦pfR.(2005)Developmentofbovineembryosreconstructedbynucleartransferoftransfectedandnon-transfectedadultfibroblastcells.Ge滅Afo/.4:55-66;OliveiraR.R.，CarvalhoD.M.de,LisauskasS.,MelloE.,ViannaG.R.,DodeM.A.N.,RumpfR.,AragSoFJ丄.，RechE.L.(2005)Effectivenessofliposomestotransfectlivestockfibroblasts.GeweAMb/.Wes.4:185-196)。實ife侈寸10掩妹河蛋白的合成使用自動合成技術在PerseptiveBiosystemsPioneerSynthesiser中在F-moc固相合成本發(fā)明的蜘蛛網(wǎng)蛋白。在Sh;,madzuClassVPandAktaExplorer液相色譜儀中使用反相柱純化蛋白。蛋白和肽類通過MALDI-TOF質譜儀分析并分別l吏用VoyagerDESTR分光計、4700蛋白質組分析系統(tǒng)(ProteomicsAnalyser)和Q-TOF通過MS/MS測序。根據(jù)市售的GIBCOBRL(USA)試劑盒的說明書制備具有可變磷脂組成的脂質體。適過電子掃貓il微鏡分浙掩妹網(wǎng)if維使用電子掃描顯微鏡進行研究以確認蜘蛛網(wǎng)纖維的超微結構細節(jié)(厚度、長度、外部布局.蛋白層的排列等)。為此，纖維樣品被固定，脫水至臨界點，安裝在樣品臺上，并用不同的金屬合金金屬化,，之后使用ZeissDSM962顯微鏡根據(jù)Bozzola&Russel修改的方法學對其進行觀察(Bozzola,J丄;Russel;，L.D.(1999).Electronmicroscopy:principlesandtechniquesforbiologists.JonesandBartlletPublishers,Inc.(主編).London,UK.pp.670-678)。遞過高放濕初色謹儀W/.O和與質7著儀連接的毛細管淚初色譜僅rapZC/(9-r<9F/MS/MS,7—OF/MS/MVj分離和鑒定餘妹蛋白目的蛋白提取物在HPLC系統(tǒng)中分離，并且獲得的餾分被酶消化，呈送至與質譜儀連接的毛細管液相色i普儀分析。此方法提供分離蛋白的內部序列，然后該序列被鑒定、物理和化學定性并用于數(shù)據(jù)庫中的搜索(PegahR.,DassJ.C.(2004).Proteomeanalysisinthebovineadrenalmedullausingliquidchromatographywithtandemmassspectrometry,RapidCommun..MassSpectrom.18:1877-1884)。使用HPLC評價蛋白的純度和氨基酸組成。通過Western印跡確認蛋白的身份。使用消光系數(shù)法(280nm)以及ELTSA采用多克隆抗體對純化物質定量。蘭#聚合物的剝備和聚合制備在大腸桿菌中表達的、純化的、透析的和凍干的蜘蛛網(wǎng)腺體蛋白的樣品用于聚合和擠出。60-90mg蛋白溶解在200|il六氟異丙醇(HFIP)、異丙醇或乙醇中，并在室溫下持續(xù)攪動過夜。通過離心去除不溶物質，上清液置于適用于HPLC用管的直徑為4-300f.d的注射器中r從注射裝置中去除所有空氣后，在裝有異丙醇/曱醇或乙醇或其他有機溶劑的容器中的凝固浴中制備擠出物，產生類似天然纖維的纖維(見圖8中的實例體外產生的絲)。此方法》務改自Seidel所述的方法學(SeidelA.('998)Artificialspinningofspidersilk.她cro脂/ecw/es31:6733-6736)。蘭#聚合#的測試使用Instron55R4201裝置在23°C和50%相對濕度下進行準靜態(tài)機械測試。使用專用于測試物質的Instron系列〖X軟件測定機械性能。高負荷試驗使用Hopkinson張力裝置，該裝置被確定最適用于不同物質的靈敏度分析(Shim實施例12實施例15V.P.W.(2001)Dynamicmechanicalpropertiesoffabricarmor./o/7w/ac/￡>g.25:1-15;HuhH..KangW丄，HanS.S.(2002),AtensionsplitHopkinsonbarforinvestigatingdynamicbehaviourofsheetsmetals.￡平Mec/aw'"'42:8-17)。將絲對齊并預加張力以確保在試驗期間分布的一致性。實施例6用作防/命素、抗微蘭#妖和殺微蘭#剎的餘妹產it腺體的重紐蛋白蜘蛛絲的重組蛋白用來在植物和動物中抑制幾種病毒和其他致病微生物的復制。這種作月一。r由多種機制引起，諸如絲腺體的帶負電荷的重組蛋白與不同病毒的蛋白鞘的電荷連接，從而抑制其復制并用作殺微生物劑(Scordi-BelloI.A.，MosoianA.,HeC，ChenY.,Jarvis.Mar!aG,A.,KellerJ.,HogartyK.,WallerD.P.，ProfyA.T.,HerodB.G,KlotmanM.E.2005.CandidateSulfonatedandSulfatedTopicalMicrobicides:ComparisonofAnti-HumanimmunodeficiencyVirusactivitiesandMechanismsofAction.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,49:3607-3615)、防御素(ThevissenK.,FrancoisI.E丄A.,AlbertsA.M.,CammueB.P.A.(2005)Fungalsphingolipidsastargetsforthedevelopmentofselectiveantifungic&ltherapeutics.CurrentDrugsTarg.6:923-928)和抗樣i生物肽或多肽(Prares!VLV.，SfonaM.1,RegisW.C.B.，LeiteJ.R.S.A.，SilvaL.P.,PertinhezH.A.,AraujoA,L,T.,AzevedoR.B.,SpisniA.,BlochC.Jr.(2004)TheNMR-derivedSolutionStructureofaNewCationicAntimicrobialPeptidefromtheSkinSecretionofthe/1.響w外/"戸wcto/a../別o/.C7e附/s"279:13018-13026)。因此，表達產絲腺體的蛋白并測試此類活性，顯示了抑制病毒、真菌和細菌生長的陽性結^，—m^iiz凝^來網(wǎng)蛋白的為、子建;^通過同源建模或"比較蛋白建模"來完成蜘蛛網(wǎng)腺體的三維結構的預測，該預測基于下列的觀察氨基酸序列之間的同源性提示結構和功能相似性，以及同源蛋白顯示保守的內部區(qū)域〖主要由二級結構(X-螺旋和(3-折疊元件形成)。通過同源性對這些蛋白的建?；竟ぷ裱铝兴膫€連續(xù)步驟-使用直接來自PDB(ProtdnDataBank)的已知三維結構鑒定和選擇模板蛋白。在來自在PDB中保存的具有確認的三級結抅的蛋白的一級結構數(shù)據(jù)庫中使用BLAST36并使.用蛋白--級結構作為i秀斜進行系統(tǒng)搜索以搜尋一條或多條滿足要求的序列。-比對氨基酸殘基序列。比對的目的是考慮常用結構特性，諸如二級結構元件，來比對結構上等價的殘基。由此有可能識別結構保守區(qū)和可變區(qū)。-模型構建。此階段涉及對結構保守區(qū)建模、對環(huán)區(qū)建模和對側鏈建模。jl匕階l殳4吏用BueStarSting軟件(GoranNeshich,IvanMazoni,StanleyR.M.Oliveira，MichelE.B.Yamagishi,PauJaR,Kuser-FalcSo,LuizC.Borro,DouglasU.Morita,KassyusR.R.Souza,GustavoV.Almeida,DiegoN.Rodrigues,Jos6G.Jardine，RobertoC.Togawa,AdautoL.Ma.ncini,RobertoH.Higa,S6rgioA.B.Cruz:FdbioD.Vieira,EdgardH.dosS:tntc)s,RaquelC.deMeloandMarceloM.Santoro.TheStarSTINGserver:Amu〗tiplatformenvironmentforproteinstructureanalysis.GeweZ.Afo/.Wes.5(2)2006)來完成。-模型驗證。適當建模的蛋白應該具有滿意的三級結構。其質量取決于選擇作為模板的蛋白和計算的比對。重要的是驗證在模板結構和建模結構的二級結構元件(保守區(qū))之間是否存在任何主要的未經(jīng)說明的一致性差異。此實施例使用PROCHECK軟件驗證(Laskowski,R。A.;MacArthur,M,W.;Moss,D.S.;Thornton,J.M.;J.(>7成!〃>《''.993,26,283)。對于SEQ!DN.1侵.用這些步驟(基因產物A^//〃7e/ig^-NCFlag),并且獲得的模型可見圖7。由于絲蛋白和模塊結構到H前為止沒有已知的原子結構，應該從頭開始(預測由其一級結構得到的蛋白的三維結構)，基于二級結構的內容和涉及蛋白折疊的假設來構建幾何體。不含有模塊序列塊的部分諸如N-末端和C-末端應該由x-射線結晶學測定其結構。純化蛋白應該通過矩陣結果的優(yōu)化而結晶。由于它們具有新蛋白的特性，因此應該在處理原子后使用多重同晶置換(MIR)或通過含有硒代蛋氨酸的晶體的反常色散夾測定結構。權利要求1.分離的蜘蛛核酸分子，包括a)與選自鑒定為SEQIDN.1-19的任一序列基本上類似的序列；b)SEQIDN.1-19中所述的序列的互補序列；c)SEQIDN.1-19中所述的序列的反向互補序列；d)SEQIDN.1-19中所述的序列的反向序列。2.根據(jù)權利要求1所迷的分離的蜘蛛核酸分子，其中所述序列從蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛和/V/rau'/x/fi!錄a蛛中分離。3.包括權利要求1和2的任一項所述的分離分子的嵌合基因。4.一種嵌合基因，包括a)啟動子，其與前導序列連接或不連接并且可操作地連接到；b)與SEQIDN.1-19中所示的任一序列基本上類似的編碼序列。5.根據(jù)權利要求4所述的嵌合基因，其中所述啟動子選自組成性啟動子、誘導性啟動子和組織特異性啟動子。6.根據(jù)權利要求5所述的嵌合基因，其中所述組織特異性啟動子選自棉纖維基因啟動子。7.根據(jù)權利要求6所述的嵌合基因，其中所述棉纖維基因啟動子選自E6、H6S、Racl3、LTP、ACP、擴張蛋白、CAP、膜連蛋白、FbL2A和肌動蛋白2。8.根據(jù)權利要求3所述的嵌合基因，其中所述啟動子含有增強子元件。9.才艮據(jù)權利要求4所述的嵌合基因，其中所述啟動子可在植物、動物、真菌或昆蟲中表達。10.根據(jù)權利要求4所述的嵌合基因，其中所述前導序列從與用來指導轉錄所述分離的核酸分子的啟動子相同的基因獲得。11.包括根據(jù)權利要求3-10的任一項所述的嵌合基因的表達載體。12.—種表達載體，包括a)啟動子，其與前導序列連接或不連接并且可操作地連接到；b)與鑒定為SEQIDN.1-19的任一序列基本上類似的編碼序列，其可操作地連接到；c)終止信號；d)復制起點；e)iti才奪才示i己；詳口f)克隆位點。13.根據(jù)權利要求12所述的表達載體，其中所述啟動子選自組成性啟動子、誘導性啟動子和組織特異性啟動子。14.根據(jù)權利要求13所述的表達載體，其中所述組織特異性啟動子選自棉纖維基因啟動子。15.根據(jù)權利要求14所述的表達載體，其中所述棉纖維基因啟動子選自E6、H6S、Racl3、LTP、ACP、擴張蛋白、CAP、膜連蛋白、FbL2A和肌動蛋白2。16.根據(jù)權利要求11所述的表達載體，其中所述啟動子含有增強子元件。17.根據(jù)權利要求12所述的表達載體，其中所述前導序列從與用來指導轉錄所述分離的核酸分子的啟動子相同的基因獲得。18.根據(jù)權利要求12所述的表達載體，其中所述啟動子可在植物、動物、真菌或昆蟲中表達。19.根據(jù)權利要求12所述的表達載體，其中本發(fā)明的轉錄終止信號和多聚腺苷酸化區(qū)包括但不限于SV40終止信號、HSVTK腺苷化信號、根癌農桿菌的胭脂堿合成酶基因(NOS)的終止信號、童魚堿合成酶基因終止信號、CaMV的19S和35S基因的終止信號、玉來醇脫氫酶基因終止信號、甘露堿合成酶基因終止信號、卩-菜豆素基因終止信號、ssRUBISCO基因終止信號、蔗糖合成酶基因終止信號、攻擊地三葉草的病毒(SCSV)的終止信號、構巢曲霉的trpC基因的終止信號和其他類似終止信號。20.根據(jù)權利要求12所述的表達載體其中所述選擇標記選自賦予對抗生素的抗性的序列或可^L標記。21.根據(jù)權利要求20所述的表達載體，其中所述選擇標記選自賦予對卡那霉素、新霉素、氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、潮霉素、遺傳霉素、草丁膦、草甘磷、草胺磷、AHAS、BAR和GUS的抗性的基因編碼序列。22.分離的蜘蛛絲蛋白分子，包括與鑒定為SEQIDN.20-38的任一序列基本上類似的序列。23.根據(jù)權利要求22所述分離的蜘蛛絲蛋白分子，其中所述序列從A/ep/2//e，crwewtoto蟲知蟲朱、黃帶粉處食-鳥蛛和i'/x/"蟲知蛛中分離。24.包含根據(jù)權利要求3-10任一項所述的嵌合基因的轉化細胞。25.包含根據(jù)權利要求U-21任一項所述的表達載體的轉化細胞。26.包含根據(jù)權利要求22或23任一項所迷的分離的蛋白分子的轉化細胞。27.根據(jù)權利要求24-26任一項所述的轉化細胞，其中所述細胞來源于細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物和^i物的任一種。28.植物，或其部分，或其繁殖體或其子代，包括根據(jù)權利要求3-10任一項所述的嵌合基因。29.植物，或其部分，或其繁殖體或其子代，包括根據(jù)權利要求11-21任一項所述的表達載體。30.植物，或其部分，或其繁殖體或其子代，包括根據(jù)權利要求22或23任一項所述的分離的蛋白分子。31.根據(jù)權利要求30所述的植物或其部分，或其繁殖體或其子代，其中所述蛋白在種子中表達。32.動物，或其部分，或其子代，包括根據(jù)權利要求3-10任一項所述的嵌合基因。33.動物，或其部分，或其子代，包括根據(jù)權利要求11-21任一項所述的表達載體。34.動物，或其部分，或其子代，包括根據(jù)權利要求22或23任一項所述的分離的蛋白分子。35.根據(jù)權利要求34所述的動物，或其部分，或其子代，其中所述蛋白在乳腺中表達。36.微生物，或其部分，包括根據(jù)權利要求3-]0任一項所述的嵌合基因。37.微生物，或其部分，包括根據(jù)權利要求11-21任一項所述的表達載體。38.產生遺傳修飾的生物體的方法，包括以下的階段a)用根據(jù)權利要求3-11任一項所述的嵌合基因或根據(jù)權利要求11-21任一項所述的表達載體轉化細胞、組織、器官或胚胎；b)選擇轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子；c)再生具有階段b)中選擇的轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子的成熟植物、成熟胚胎或微生物；d)選擇階段(c)的含有具有編碼蜘蛛絲蛋白的核苷酸序列的嵌合基因或表達載體的成熟植物、成熟胚胎或微生物細胞。39.產生重組蛋白的方法，包括以下的階段a)用根據(jù)權利要求1]-2，任一項所述的表達載體轉化細胞、組織、器官或胚胎；b)選"t奪轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子；c)再生具有階段b)中選擇的轉化的細胞、細胞愈傷組織、胚胎或種子的成熟植物、成熟胚胎或微生物；d)選擇階段c)的含有具有編碼蜘蛛絲蛋白的核苷酸序列的表達載體的成熟植物、成熟胚胎或微生物細胞；e)提取在階段d)中選擇的生物中產生的重組蜘蛛絲蛋白。40.通過權利要求39中所述的方法獲得的重組蛋白。41.根據(jù)權利要求40所述的重組蛋白，其特征在于所述蛋白表現(xiàn)殺微生物活性。42.才艮據(jù)權利要求41所述的重組蛋白，其中所述殺微生物活性是對抗病毒復制。43.根據(jù)權利要求40所述的重組蛋白，其中所述蛋白表現(xiàn)防御素活性。44.根據(jù)權利要求43所述的重組蛋白，其中所述防御素活性針對害和昆蟲。45.根據(jù)權利要求40所述的重組蛋白，其中所述蛋白表現(xiàn)皮膚病學活性。46.皮膚病學組合物，包括a)根據(jù)權利要求40所述的重組蛋白；b)藥學可接受的載體。47.根據(jù)權利要求46所述的皮膚病學組合物，其中所述藥學可接受的載體選自甘油、水、鹽水溶液、乙烷、具有磷酸鹽和有機酸鹽的溶液。48.殺微生物劑組合物，包括a)根據(jù)權利要求41所述的重組蛋白；b)農業(yè)可接受的載體，和，c)包括或不包括添加劑。49.根據(jù)權利要求48所述的殺微生物劑組合物，其中所述農業(yè)可接受的載體選自水、有機溶劑、保濕劑、防腐劑、增稠劑、抗菌劑、抗氧化劑、乳化劑、成膜聚合物和這些載體的混合物。50.根據(jù)權利要求48所述的殺微生物組合物，其中所述添加劑選自松香膠、乳膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙酸乙烯酯和它們的混合物，此外包括或不包括的添加劑包括丙烯酸曱酯、曱基丙烯酸酯和這些添加劑的混合物。51.由根據(jù)權利要求39中所述的方法獲得的重組蛋白產生的生物聚合物。全文摘要本發(fā)明涉及從編碼蜘蛛網(wǎng)蛋白的核酸分離的分子或這些分子的片段或這些分子的其他衍生物。本發(fā)明還涉及含有分離自編碼與NephilengysCruentata蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛和ParawixiaBistriata蜘蛛的網(wǎng)相關蛋白的核酸的分子的嵌合基因和表達載體。本發(fā)明的另一實施方案是含有本發(fā)明的嵌合基因或表達載體的轉化細胞。本發(fā)明的另一實施方案還涉及獲得含有本發(fā)明的嵌合基因或表達載體的遺傳修飾的生物體的方法以及從NephilengysCruentata蜘蛛、黃帶粉趾食鳥蛛和ParawixiaBistriata蜘蛛的絲獲得重組蛋白的方法。最后，本發(fā)明說明了使用本發(fā)明的重組蛋白的產品，諸如生物絲和組合物。新蜘蛛絲蛋白的發(fā)現(xiàn)及其特性和在不同異源系統(tǒng)中的表達在眾多領域諸如醫(yī)學和工業(yè)中應該非常有用。文檔編號A61K8/64GK101679975SQ200880015224公開日2010年3月24日申請日期2008年3月13日優(yōu)先權日2007年3月16日發(fā)明者丹尼拉·馬蒂亞斯·德·卡瓦略·比頓科特,喬瓦尼·羅得里格斯·維亞娜,保羅·凱撒·莫塔,埃利彼奧·萊奧波爾多·雷希·菲洛,弗朗西斯科·約賽·利瑪·阿拉岡,彼得羅·伊斯瑪艾爾·達·席爾瓦·朱尼爾,納塔莉亞·克里斯蒂娜·維爾扎·費里拉,艾倫·卡瓦略·安德拉德,貝圖里亞·德·莫拉伊斯·蘇托,費利佩·羅得里格斯·達·席爾瓦,路易薩·德·莫拉埃斯·馬德拉,魯伊茲·艾伯托·科爾納格申請人:巴西農牧研究企業(yè)