專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于治療自身免疫疾病的BLyS抑制和/或APRIL抑制與免疫抑制劑的組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療自身免疫疾病的新型聯(lián)合療法，所述聯(lián)合療法牽涉BLyS或BLyS/APRIL抑制以及免疫抑制劑。
背景技術(shù)：
：淋巴細(xì)胞是幾種白細(xì)胞群體之一；它們特異性地識(shí)別外來(lái)抗原并對(duì)其作出應(yīng)答。淋巴細(xì)胞的三種主要類(lèi)別為B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)、T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。B細(xì)胞是負(fù)責(zé)抗體產(chǎn)生的細(xì)胞，并且提供體液免疫。B細(xì)胞在骨髓內(nèi)成熟，并且伴隨著在其細(xì)胞表面上表達(dá)抗原結(jié)合性抗體而離開(kāi)骨髓。當(dāng)幼稚B細(xì)胞首次遇到結(jié)合在其膜上的抗體所特異于的抗原時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始快速分裂，并且其后代分化為記憶B細(xì)胞和稱(chēng)為漿細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞具有更長(zhǎng)的壽命，并且繼續(xù)表達(dá)具有與原始親本細(xì)胞相同的特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不產(chǎn)生膜結(jié)合抗體而是產(chǎn)生分泌形式的抗體。分泌型抗體是體液免疫的主要效應(yīng)分子。在各種條件下在B細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤壞死因子(TNF)受體屬于在免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞功能的細(xì)胞調(diào)節(jié)劑。特別地，三種TNF受體跨膜激活齊'J與CAML相互作用物(transmembraneactivatorandCAMLinteractor,TACI),屬于TNF家族的B細(xì)胞激活因子的受體(BcellactivatorbelongingtotheTNFfamilyreceptor,BAFF-R)，以及B細(xì)萬(wàn)包成熟蛋白(Bcellmaturationprotein,BCMA)，已知與下列兩種TNF配體之一或兩者結(jié)合B淋巴細(xì)胞刺激劑(BLyS(BLymphocytestimulator)，也稱(chēng)為為BAFF、TAIX-1、ztnf4和THANK)和i曽歹直"i秀導(dǎo)酉己體(aproliferation—inducingligand,APRIL)。特別地，已知TACI和BCMA結(jié)合BLyS和APRIL兩者，而B(niǎo)AFF-R只結(jié)合BLyS。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多BLyS和/或APRIL拮抗劑以阻斷BLyS的各種功能，所述功能包括但不應(yīng)限于B細(xì)胞共刺激、成漿細(xì)胞和漿細(xì)胞存活、Ig類(lèi)別轉(zhuǎn)換、增強(qiáng)的B細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞功能、惡性B細(xì)胞的存活、B-l細(xì)胞功能的形成、超過(guò)T-l期的B細(xì)胞發(fā)育、以及完全的生發(fā)中心的形成。這些分子中的一些還可以結(jié)合APRIL并阻斷APRIL對(duì)于B細(xì)胞和免疫系統(tǒng)其他組分的效應(yīng)(Dillon等人，(2006)Nat.Rev.DrugDis.5，235-246)。已開(kāi)發(fā)的通過(guò)干擾BLyS和/或APRIL結(jié)合來(lái)影響B(tài)細(xì)胞功能的分子包括BLyS抗體例如Lymphostat-B(貝利木單抗(Belim畫(huà)b))(Baker等人，(2003)ArthritisRh函，48，3253-3265和W002/02641);受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域/Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白例如TACI-Ig，包括一個(gè)具體的實(shí)施方案，即atacicept(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0060034852)，BAFF-R-Fc(WO05/0000351),和BCMA-Ig或其他使用受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。BLyS和/或APRIL拮抗劑的另外類(lèi)別包括其他依靠BLyS結(jié)合能力從而阻斷與其受體結(jié)合的分子，例如AMG623、受體抗體以及在WO03/035846和WO02/16312中公開(kāi)的其他分子。目前用于治療自身免疫疾病的方法是抑制不希望的免疫反應(yīng)。例如，在狼瘡腎炎(LN)(—種牽涉患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的患者的腎的嚴(yán)重并發(fā)癥)的治療中，幾種免疫抑制藥物已被證明是有益的。這些藥物包括環(huán)磷酰胺(CYC)、硫唑噪呤(AZA)、環(huán)孢菌素A(CSA)和嗎替麥考酴酸酯(固FX關(guān)于綜合性的綜述，可參見(jiàn)Mok等人，UOO3)AnnRheumDis62，799-804;和Iaccarino等人，(2007)AutoimmunityReviews6，190-195)。雖然這些藥物是有益的，但在本領(lǐng)域中仍然需要改善對(duì)于免疫抑制藥物的應(yīng)答以有效地治療自身免疫疾病。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面為用于降低哺乳動(dòng)物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用BLyS和/或APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物。一種優(yōu)選的方法是這樣的，其中所述BLyS和/或APRIL拮抗劑為Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白可以是包含TACI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白或者包含BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。特別地，所述Fc融合蛋白包含SEQIDN0:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25或SEQIDNO:26的多肽序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑為BLyS抗體，其優(yōu)選地在包含SEQIDNO:8的氨基酸162-275的區(qū)域內(nèi)結(jié)合BLyS;或者稱(chēng)為L(zhǎng)ymphoStat-B的BLyS抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑為T(mén)ACI抗體，其優(yōu)選地在包含選自SEQIDNO:2的氨基酸72-109或SEQIDNO:2的氨基酸82-222的區(qū)域內(nèi)結(jié)合TACI。在本發(fā)明的方法中，所考慮的免疫抑制藥物中的一些包括環(huán)磷酰胺(CYC)、硫唑噤呤(AZA)、環(huán)孢菌素A(CSA)或嗎替麥考酚酸酯(MMF)，盡管任何抑制免疫系統(tǒng)的藥物可以是適合的。通過(guò)本發(fā)明方法而降低的免疫球蛋白水平可以是IgM、IgG、IgA、IgD或IgE或者其組合。本發(fā)明還包括用于減輕由B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥的方法，所述方法包括給患有所迷病癥的患者施用治療有效量的免疫抑制藥物以及BLyS和/或APRIL拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述自身免疫病癥選自類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼疳(SLE)、狼瘡腎炎(LN)、韋格納病(Wegener'sdisease)、炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫瘕(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、IgA腎病、IgM8多發(fā)性神經(jīng)病、重癥肌無(wú)力、脈管炎、糖尿病、Reynaud，s綜合征、Sjorgen，s綜合征和腎小球腎炎。特別用該方式治療的一種疾病為狼瘡腎炎。特別地，當(dāng)自身免疫病癥為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘉或狼瘡腎炎時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑和所述免疫抑制藥物可以以進(jìn)一步與使用第二免疫抑制藥物的療法相聯(lián)合的方式進(jìn)行施用，所述第二免疫抑制藥物例如為非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAID)、糖皮質(zhì)激素、潑尼松和疾病緩解抗風(fēng)濕藥(DMARD)。本發(fā)明的方法使用與BLyS和/或APRIL拮抗劑相組合的已顯示在治療自身免疫疾病方面有效的免疫抑制藥物。被考慮用于本發(fā)明方法的免疫抑制藥物包括環(huán)磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、環(huán)孢菌素A(CSA)或嗎替麥考酚酸酯(醒F)。在其中給患者施用免疫抑制藥物和BLyS和/或APRIL拮抗劑的用于治療或減輕病癥的任何方法中，所述免疫抑制藥物和所述BLyS和/或APRIL拮抗劑可以同時(shí)或順次施用。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，免疫抑制劑在BLyS和/或APRIL拮抗劑之前施用。還提供了包含免疫抑制劑和BLyS和/或APRIL拮抗劑的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制品，其包含免疫抑制劑、BLyS和/或APRIL拮抗劑以及標(biāo)簽，其中所述標(biāo)簽指明所述組合物用于治療由B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥。在本發(fā)明的方法、組合物和制品的任何實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑，如果是抗體，那么包括嵌合抗體和人源化抗體。在本發(fā)明的方法、組合物和制品的任何實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑，在一個(gè)實(shí)施方案中，為結(jié)合BLyS的受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域之間的融合蛋白，或者Fc融合蛋白。在特別的實(shí)施方案中，所述Fc融合蛋白選自包含TACI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的TACIFc融合蛋白，特別是atacicept;包含BAFF-R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的BAFF-RFc融合蛋白，特別是BR3-Ig;和包含BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的BCMAFc融合蛋白。在其他實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑為BLyS抗體，特別是在包含殘基162-275的BLyS的區(qū)域內(nèi)結(jié)合BLyS的BLyS抗體，特別是LymphosUtB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑為BAFF-R抗體，包括在包含人BAFF-R的殘基23-38的區(qū)域中進(jìn)行結(jié)合的BAFF-R抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑為T(mén)ACI抗體、BCMA抗體或與這兩種分子都結(jié)合的抗體，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?003-0012783中所描述的。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了四個(gè)治療組的IgG的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)媒介物(vehicle)，僅MMF,僅atacicept,以及atacicept和MMF。通過(guò)使用經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，除了"媒介物"對(duì)"僅MMF"之外，這些值的所有成對(duì)比較都是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P<0.05)。圖2顯示了四個(gè)治療組的IgM的平均值(土標(biāo)準(zhǔn)差)媒介物，僅薩F，僅atacicept,以及atacicept和MMF。通過(guò)4吏用經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，除了"媒介物"對(duì)"僅MMF"之外，這些值的所有成對(duì)比較都是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p<0.05)。圖3顯示了四個(gè)治療組的IgA的平均值(土標(biāo)準(zhǔn)差)媒介物，僅麗F，僅atacicept,以及atacicept和固F。通過(guò)使用經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，除了"媒介物"對(duì)"僅MMF"之外，這些值的所有成對(duì)比較都是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p<0.05)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述盡管免疫抑制治療看起來(lái)在自身免疫疾病的治療中有用，但是從此處所描述的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，施用免疫抑制劑與BLyS和/或APRIL拮抗劑的組合是一種將會(huì)阻斷B細(xì)胞中的多條信號(hào)途徑的治療方法，所述信號(hào)途徑被認(rèn)為負(fù)責(zé)針對(duì)自身抗原的抗體的產(chǎn)生，從而觸發(fā)和/或維持10自身免疫狀況。這導(dǎo)致在經(jīng)歷此類(lèi)治療的哺乳動(dòng)物中循環(huán)免疫球蛋白減少。由于此類(lèi)循環(huán)免疫球蛋白被認(rèn)為至少部分地負(fù)責(zé)觸發(fā)自身免疫疾病的負(fù)'f生癥狀(negativesymptoms),因jt匕免疫抑命J藥物和4十對(duì)BLyS途徑的療法的組合提供了用于治療由B細(xì)胞介導(dǎo)的疾病(例如基于B細(xì)胞的自身免疫疾病)的新型方法。免疫抑制藥物與BLyS和/或APRIL拮抗劑的聯(lián)合療法可以為某些疾病例如狼瘡腎炎的現(xiàn)有治療提供更有效的備選方案。在本文中，"自身免疫疾病，，為任何起因于針對(duì)個(gè)體自己(自身)抗原和/或組織而產(chǎn)生的抗體的非惡性疾病或病癥。如本文中所使用的，"B細(xì)胞耗竭"是指在藥物或抗體治療后，與治療前的水平相比較，動(dòng)物或人中的B細(xì)胞水平的降低。使用眾所周知的測(cè)定法，例如通過(guò)獲得全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過(guò)對(duì)于已知的B細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行FACS分析染色，和通過(guò)諸如在實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例中所描述的方法，可以測(cè)量B細(xì)胞水平。B細(xì)胞耗竭可以是部分的或完全的。在接受B細(xì)胞耗竭性藥物的患者中，一般地，在當(dāng)藥物在患者體內(nèi)循環(huán)和恢復(fù)B細(xì)胞的時(shí)間期間，B細(xì)胞被耗盡。"免疫抑制藥物"為干擾免疫系統(tǒng)并鈍化其對(duì)于外來(lái)或自身抗原的應(yīng)答的任何分子。環(huán)磷酰胺(CYC)和嗎替麥考酚酸酯(醒F)是兩種此種類(lèi)型的分子。該術(shù)語(yǔ)意欲包括任何在下調(diào)免疫系統(tǒng)中可用作治療劑的藥物或分子。該方法特別考慮了已被用于治療自身免疫疾病，d如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎(LN)、韋格納病、炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、重癥肌無(wú)力、脈管炎、糖尿病、Reynaud，s綜合征、Sjorgen，s綜合征和腎小球腎炎的藥物。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"BLyS"或"BLyS多肽"、"TALL-1"或"TALL-1多肽，，、或者"BAFF，，或"BAFF多肽，，包括"天然序列BLyS多肽"和"BLyS變體"。"BLyS"是給予由人BLyS序列(SEQIDNO:7)或小鼠BLyS序列(SEQIDNO:9)所編碼的那些多肽的名稱(chēng)。顯示出BLyS生物學(xué)活性的多肽也被包括在此名稱(chēng)之內(nèi)。例如，具有生物學(xué)活性的BLyS在體外或在體內(nèi)加強(qiáng)下列事件中的任何一個(gè)或組合增加的B細(xì)胞存活、增加的IgG和/或IgM水平、增加的漿細(xì)胞數(shù)目以及在脾B細(xì)胞中NF-Kb2/100被加工成p52NF-Kb(例如，Batten,M等人，(2000)J.Exp.Med.192:1453-1465;Moore等人，(1999)Science285:260-263;Kayagaki等人，(2002)10:515-524)。幾種可用于測(cè)試BLyS和/或APRIL拮抗劑的測(cè)定法，例如WO00/40716中所描述的B細(xì)胞增殖測(cè)定法，尤其是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，用CD19磁珠和VarioMacs磁力分離系統(tǒng)(MiltenyiBiotecAuburn,CA)從外周血單核細(xì)胞中分離人B細(xì)胞。將經(jīng)純化的B細(xì)胞與可溶性BLyS(25ng/ml)和重組人IL-4(10ng/mlPharmingen)相混合，并且以1x105個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞鋪板在圓底96孔平板上。待測(cè)試的BLyS和/或APRIL拮抗劑可以從約5jag/ml稀釋至約6ng/ml,并與B細(xì)胞一起溫育五天，其中在第四天用liiiCi3H-胸苷/孔進(jìn)行脈沖過(guò)夜。作為對(duì)照，還可以將BLyS和/或APRIL拮抗劑與沒(méi)有BLyS的B細(xì)胞和IL-4一起溫育。用Packard平板收獲器來(lái)對(duì)平板進(jìn)行收獲，并用Packard閱讀器進(jìn)行計(jì)數(shù)。"天然序列"多肽包括具有與源自自然界的相應(yīng)多肽相同的氨基酸序列的多肽。此類(lèi)天然序列多肽可以從自然界中分離，或者通過(guò)重組和/或合成手段來(lái)產(chǎn)生。特別地，術(shù)語(yǔ)"天然序列"包括所迷多肽的天然出現(xiàn)的截短的、可溶性的或分泌的形式(例如，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列)，所述多肽的天然出現(xiàn)的變體形式(例如，選擇性剪接的形式)，和所述多肽的天然出現(xiàn)的等位基因變體。一般地，在本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的任何多肽的"變體"多肽包括這樣的多肽，其中在全長(zhǎng)或"天然序列"氨基酸序列的N-和/或C-末端以及一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域內(nèi)添加或刪除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。當(dāng)討論受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域時(shí)，還考慮了與天然序列BLyS多肽結(jié)合的片段。反過(guò)來(lái)，當(dāng)討論BLyS片段時(shí)，考慮了與三種BLyS受體中的一種或多種結(jié)合的片段。一般地，變體多肽將會(huì)與所述多肽或其指定片段具有至少約80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約81%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約82%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約83%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約84%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約85%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約86%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約87%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約88%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約89%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約90%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約91%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約92%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約93%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約94%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約95%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約96%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約97%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地至少約98。/。的氨基酸序列同一性和更加優(yōu)選地至少約99%的氨基酸序列同一性。一般地，變體多肽不包括天然多肽序列。通常，變體多肽的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)氨基酸，經(jīng)常至少約20個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約30個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約40個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約50個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約60個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約70個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約80個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約90個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約IOO個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約150個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約200個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約250個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少約300個(gè)氨基酸，或者更長(zhǎng)。如上面所提及的，BLyS和/或APRIL拮抗劑可以在體外或在體內(nèi)以直接或間接的方式發(fā)揮功能，以部分地或完全地阻斷、抑制或中和BLyS信號(hào)傳導(dǎo)。例如，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑可以直接結(jié)合BLyS。例如，直接的結(jié)合劑為包含BLyS受體例如TACI、BAFF-R和BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的多肽。可以如下來(lái)描述在本發(fā)明中涉及的BLyS受體。本發(fā)明的TACI多肽包括包含或由SEQIDNO:2的氨基酸1-246組成的TACI多肽。總括的術(shù)語(yǔ)"TACI"包括在WO98/39361、WO00/40716、WO01/85782、WO01/87979、WO01/81417和WO02/094852中描述的TACI多肽。本發(fā)明的TACI多肽可以分離自各種來(lái)源，例如人組織類(lèi)型或其他來(lái)源，或者通過(guò)重組和/或合成方法來(lái)制備。本發(fā)明的BAFF-R多肽包括包含或由SEQIDNO:4的氨基酸殘基1至184的鄰接序列組成的BAFF-R多肽?？偫ǖ男g(shù)語(yǔ)"BAFF-R"包括在WO02/24909和WO03/14294中描述的BAFF-R多肽。本發(fā)明的BAFF-R多肽可以分離自各種來(lái)源，例如人組織類(lèi)型或其他來(lái)源，或者通過(guò)重組和/或合成方法來(lái)制備。本發(fā)明的BCMA多肽包括包含由SEQIDNO:6的氨基酸殘基1-184組成的BCMA多肽。總括的術(shù)語(yǔ)"BCMA"包括了在Laabi等人，EMBOJ.，11:3897-3904(1992);Laabi等人，NucleicAcidsRes.，22:1147-1154(1994);Gras等人，Int.Immunology,7:1093-1106(1995);和Madry等人,Int.Immunology,10:1693-1702(1998)中描述的BCMA多肽。本發(fā)明的BCMA多肽可以分離自各種來(lái)源，例如人組織類(lèi)型或其他來(lái)源，或者通過(guò)重組和/或合成方法來(lái)制備。為了發(fā)揮作為BLyS和/或APRIL拮抗劑的功能，這些受體的ECD為基本上沒(méi)有跨膜或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的多肽，其一般保留了結(jié)合BLyS的能力。特別地，TACI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包含TACI多肽序列(SEQIDNO:2)的氨基酸1至154。此外，ECD可以是該序列的片段或變體，例如在vonBulow等人(同上)、WO98/39361、WO00/40716、WO01/85782、W001/87979和WO01/81417中描述的TACI的ECD形式。特別地，這些ECD形式可以包含SEQIDNO:2的氨基酸1-106、SEQIDNO:2的氨基酸卜142、SEQIDNO:2的氨基酸30-154、SEQIDNO:2的氨基酸30-106、SEQIDNO:2的氨基酸30-110、SEQIDNO:2的氨基酸30-119、SEQIDNO:2的氨基酸1-166、SEQIDNO:2的氨基酸1-165、SEQIDNO:2的氨基酸1-114、SEQIDNO:2的氨基酸1-119、SEQIDNO:2的氨基酸1-120和SEQIDNO:2的氨基酸1-126。此外，TACIECD可以包括只具有一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的那些分子。BAFF-R的ECD形式包括包含BAFF-R多肽序列(SEQIDNO:4)的氨基酸卜71的那些。此外，ECD可以是該序列的片段或變體，例如在WO02/24909、WO03/14294和WO02/38766中描述的BAFF-R的BCD形式。特別地，這些ECD形式可以包含SEQIDNO:4的氨基酸1-77、SEQIDNO:4的氨基酸7-77、SEQIDNO:4的氨基酸1-69、SEQIDNO:4的氨基酸7-69、SEQIDNO:4的氨基酸2-62、SEQIDNO:4的氨基酸2-71、SEQIDNO:4的氨基酸1-61和SEQIDNO:4的氨基酸2-63、SEQIDNO:4的氨基酸1-45、SEQIDNO:4的氨基酸1-39、SEQIDNO:4的氨基酸7-39、SEQIDNO:4的氨基酸1-17、SEQIDNO:4的氨基酸39-64、SEQIDNO:4的氨基酸19-35和SEQIDNO:4的氨基酸17-42。此外，BAFF-RECD可以包括具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的那些分子。BCMA的ECD形式包括包含BCMA多肽序列(SEQIDNO:6)的氨基酸l-48的那些。此外，BCD可以是該序列的片段或變體，例如在WO00/40716和WO05/075511中描述的BCMA的ECD形式。特別地，這些ECD形式可以包含SEQIDNO:6的氨基酸1-150、SEQIDNO:6的氨基酸1-48、SEQIDNO:6的氨基酸l-41、SEQIDNO:6的氨基酸8-41、SEQIDNO:6的氨基酸8-37、SEQIDNO:6的氨基酸8-88、SEQIDNO:6的氨基酸41-88、SEQIDNO:6的氨基酸1-54、SEQIDNO:6的氨基酸4-55、SEQIDNO:6的氨基酸4-51和SEQIDNO:6的氨基酸21-53。此外，BCMAECD可以包括只具有部分富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的那些分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，BLyS受體的BLyS結(jié)合區(qū)域(例如BAFF-R、BCMA或TACI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其片段)可以與免疫球蛋白分子的Fc部分相融合以促進(jìn)其在體內(nèi)的溶解性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑以100nM或更低的結(jié)合親和力與BLyS多肽結(jié)合。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑以10nM或更低的結(jié)合親和力與BLyS多肽結(jié)合。根據(jù)另外一個(gè)實(shí)施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑以1nM或更低的結(jié)合親和力與BLyS多肽結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)例中，BLyS和/或APRIL拮抗劑包括這樣的BLyS結(jié)合多肽，其不是天然序列或其變體。此類(lèi)多肽的一些例子為在WO1505/000351中描述的具有式I、式II、式III的序列的那些多肽。特別地，一些結(jié)合多肽包括ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO:13)、ECFDLLV麗VPCGLLR(SEQIDNO:14)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO:15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO:16)、ECFDLLV麗VACGLLR(SEQIDNO:17)、或在WO05/000351的圖32中所列出的序列。備選地，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑可以在體外、原位或在體內(nèi)，在其BLyS結(jié)合區(qū)域處與天然序列TACI、BAFF-R或BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而部分或完全地阻斷、抑制或中和BLyS結(jié)合。例如，此類(lèi)間接拮抗劑為T(mén)ACI抗體，所述TACI抗體在TACI的區(qū)域中進(jìn)行結(jié)合，從而在空間上阻礙了BLyS的結(jié)合。例如，在氨基酸72-109或鄰近區(qū)域處的結(jié)合被認(rèn)為阻斷了BLyS結(jié)合。阻斷APRIL與該分子結(jié)合也可以是有利的，所述結(jié)合被認(rèn)為發(fā)生在氨基酸82-222的區(qū)域中。另一種BLyS和/或APRIL拮抗劑為BAFF-R抗體，所述BAFF-R抗體在BAFF-R的區(qū)域中進(jìn)行結(jié)合，從而在空間上阻礙了人BAFF-R與BLyS的結(jié)合。例如，在氨基酸23-38或氨基酸17-42或者鄰近區(qū)域處的結(jié)合被認(rèn)為阻斷了BLyS結(jié)合。最后，另外的間接拮抗劑為BCMA抗體，所述BCMA抗體在BCMA的區(qū)域中進(jìn)行結(jié)合，從而在空間上阻礙了BLyS的結(jié)合。例如，在氨基酸5-43或鄰近區(qū)域處的結(jié)合被認(rèn)為阻斷了BLyS(或APRIL)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的BLyS和/或APRIL拮抗劑為BLyS抗體。當(dāng)提及時(shí)，術(shù)語(yǔ)"抗體"以最寬的意義進(jìn)行使用，并且特別地涵蓋例如單克隆抗體、多克隆抗體、具有多表位特異性的抗體、單鏈抗體、和抗體的片段。根據(jù)一些實(shí)施方案，將本發(fā)明的多肽融合入抗體框架中，例如在可變區(qū)中或在CDR中，從而所述抗體可以與BLyS結(jié)合，并抑制BLyS與TACI、BAFF-R或BCMA的結(jié)合，或抑制BLyS信號(hào)傳導(dǎo)。包含本發(fā)明多肽的抗體可以是嵌合的、人源化的或人的。包含本發(fā)明多肽的抗體可以是抗體片段。備選地，本發(fā)明的抗體可以通過(guò)用本發(fā)明的多肽對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種來(lái)產(chǎn)生。因此，考慮了針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體。特別地，考慮了特異于BLyS的抗體，所述抗體在人BLyS(SEQIDNO:8)的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行結(jié)合，所述區(qū)域包含殘基162-275和/或選自人BLyS的162、163、206、211、231、233、264和265的氨基酸的鄰近氨基酸。所述抗體的結(jié)合是這樣的，即從而所述抗體在空間上阻礙BLyS與一種或多種其受體的結(jié)合。此類(lèi)抗體描述于W002/02641和W003/055979中。特別優(yōu)選的抗體為被描述為L(zhǎng)yphostat-B的抗體(Baker等人，(2003)ArthritisRheum，48，3253-3265)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"是指從基本上同質(zhì)的抗體的群體中獲得的抗體，即包含該群體的那些獨(dú)個(gè)抗體是同樣的，除了可能的天然出現(xiàn)的突變外，所述突變可以以較少的量存在。單克隆抗體是高度特異性的，其針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。此外，與常規(guī)的(多克隆)抗體制備物(其通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體)相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體也是有利的，因?yàn)樗鼈兪峭ㄟ^(guò)雜交瘤培養(yǎng)物來(lái)合成的，沒(méi)有被其他免疫球蛋白污染。修飾詞"單克隆的"將抗體的特征指明為獲自基本上同質(zhì)的抗體群體，而并不是解釋為需要通過(guò)任何特定方法來(lái)產(chǎn)生抗體。例如，待根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用的單克隆抗體可以通過(guò)首次由Kohler等人，Nature,256:495(1975)所描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567)來(lái)制備。還可以例如通過(guò)4吏用在Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol，222:581-597(1991)中所描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫(kù)中分離出"單克隆抗體"。特別地，此處的單克隆抗體包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)型或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)型或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源；以及此類(lèi)抗體的片段，只要它們展示出所希望的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567;Morrison等人，Proc.Natl，Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。制備嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域中已知的。20非人(例如，鼠類(lèi))抗體的"人源化"形式為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原結(jié)合亞序列)，其包含最小限度的源自非人免疫球蛋白的序列。在極大程度上，人源化抗體為這樣的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來(lái)自受者的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來(lái)自具有所希望的特異性、親和力和能力的非人物種(供者抗體)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基所替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基所替代。此外，人源化抗體可以包含這樣的殘基，所述殘基既不在受者抗體中也不在所輸入的CDR或構(gòu)架序列中發(fā)現(xiàn)。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步細(xì)化和最大化抗體性能。一般地，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個(gè)，和通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的高變環(huán)(hypervariableloop)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR區(qū)為人免疫球蛋白序列的那些，盡管FR區(qū)可以包括一個(gè)或多個(gè)改善結(jié)合親和力的氨基酸置換。FR中的這些氨基酸置換的數(shù)目在H鏈中通常不多于6，和在L鏈中不多于3。最好地，人源化抗體還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)(通常為人免疫球蛋白的Fc)的至少一部分。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)Jones等人，Nature,321:522-525(1986);Reichmann等人，Nature,332:323-329(1988);和Presta，Curr.Op.Struct,Biol，2:593-596(1992)。人源化抗體包括靈長(zhǎng)類(lèi)化抗體(PRIMATIZEDantibody)，其中該抗體的抗原結(jié)合區(qū)域源自通過(guò)例如用目的抗原對(duì)獼猴進(jìn)行免疫接種而產(chǎn)生的抗體。制備人源化抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。還可以通過(guò)使用各種本領(lǐng)域中已知的技術(shù)(包括噬菌體展示文庫(kù))來(lái)產(chǎn)生人抗體。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.，227:381(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)對(duì)于制備人單克隆抗體也是可用的。Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985);Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。本發(fā)明的結(jié)合性抗體的"功能性片段"為這樣的那些片段，所迷片段保持了以與它們所源自的完整全長(zhǎng)鏈分子基本上相同的親和力與BLyS、TACI、BAFF-R或BCMA結(jié)合，并且可以能夠耗竭B細(xì)胞，如通過(guò)體外或體內(nèi)測(cè)定法(例如本文所描述的那些)所測(cè)量的?？贵w"效應(yīng)子功能"是指歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性，并且隨著抗體同種型而變化?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括Clq結(jié)合和依賴(lài)補(bǔ)體的細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體)的下調(diào)；和B細(xì)胞激活。"依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性"或"ADCC，，是指這樣的細(xì)胞毒性形式，其中在存在于某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上的Fc受體(FcRs)之上所結(jié)合的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性地與攜帶抗原的靶細(xì)胞結(jié)合并隨后用細(xì)胞毒素殺傷靶細(xì)胞?？贵w"武裝"了細(xì)胞毒性細(xì)胞，并且是此類(lèi)殺傷所絕對(duì)必需的。用于介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在Ravetch和Kinet，Ann.Rev.Immunol9:457-92(1991)的第464頁(yè)上的表3中概括了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，500，362或5,821,337中所描述的那種。對(duì)于此類(lèi)測(cè)定法有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地，或者另外地，目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)進(jìn)行評(píng)估，例如在動(dòng)物模型中，例如Clynes等人，PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公開(kāi)的那種。"依賴(lài)補(bǔ)體的細(xì)胞毒性"或"CDC"是指在補(bǔ)體存在下靶細(xì)胞的裂解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與(合適亞類(lèi)的)抗體結(jié)合來(lái)起始的，所述抗體結(jié)合至其關(guān)聯(lián)抗原(cognateantigen)。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)4亍CDC測(cè)定法，例如如在Gazzano-Santoro等人，LImmunol.Methods202:163(1996)中所描述的。"分離的，，抗體是已被鑒定并且與其天然環(huán)境的組分分開(kāi)和/或從中回收的抗體。其天然環(huán)境的污染物組分為干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，所述物質(zhì)可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體(1)純化至抗體的大于95重量％,如通過(guò)Lowry方法所測(cè)得的，和最優(yōu)選地大于99重量％,(2)純化至這樣的程度，即足以通過(guò)使用旋杯式序列分析儀來(lái)獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基，或者(3)純化至通過(guò)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選地銀染色，經(jīng)在還原或非還原條件下的SDS-PAGE而確定的同質(zhì)性。分離的抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境的至少一種組分將不會(huì)存在。然而，通常，經(jīng)過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備分離的抗體。氨基酸可以根據(jù)其側(cè)鏈性質(zhì)的相似性進(jìn)行分組(A.L.Lehninger，Biochemistry,第二版，第73-75頁(yè)，WorthPublishers,NewYork(1975)):(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)不帶電荷且極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gin(Q);(3)酸性的Asp(D)、Glu(E);(4)堿性的Lys(K)、Arg(R)、His(H-)。備選地，基于共同的側(cè)鏈性質(zhì)，可以將天然存在的殘基劃分為幾個(gè)組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性且親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)堿性的His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"保守"氨基酸置換意指這樣的氨基酸置換，其替換了功能上等價(jià)的氨基酸。保守氨基酸改變導(dǎo)致所得的肽的氨基酸序列中的沉默改變。例如，具有相似極性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸充當(dāng)了功能等價(jià)物，并導(dǎo)致在肽的氨基酸序列內(nèi)的沉默改變。一般地，組內(nèi)的置換可以被認(rèn)為在結(jié)構(gòu)和功能方面是保守的。然而，技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，特定殘基的作用是由它在分子(該殘基出現(xiàn)在所述分子中)的三維結(jié)構(gòu)中的情境所決定的。例如，Cys殘基可以以氧化20(二疏化物)形式存在，這具有比還原(硫醇)形式更小的極性。Arg側(cè)鏈的長(zhǎng)脂肪族部分可以構(gòu)成其結(jié)構(gòu)或功能作用的關(guān)鍵特征，并且這可以通過(guò)非極性的而不是另一個(gè)堿性的殘基的置換而最佳地得到保存。此外，還將會(huì)認(rèn)識(shí)到，包含芳香族基團(tuán)的側(cè)鏈(Trp、Tyr和Phe)可以參與離子-芳香族相互作用或"陽(yáng)離子-TT"相互作用。在這些情況下，用酸性的或不帶電荷且極性的組的成員置換這些側(cè)鏈之一可以是在結(jié)構(gòu)和功能方面保守的。諸如Pro、Gly和Cys(二硫化物形式)的殘基可以對(duì)主鏈構(gòu)象具有直接的影響，并且常常不可能在沒(méi)有結(jié)構(gòu)變形的情況下被置換。關(guān)于本文所鑒定的配體或受體多肽序列，"氨基酸序列同一性百分比(％)"被定義為候選序列中這樣的氨基酸殘基的百分比，所述氨基酸殘基在經(jīng)過(guò)下列程序后與本文所鑒定的此類(lèi)配體或受體序列中的氨基酸殘基相同對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)，并如果需要?jiǎng)t引入缺口以獲得最大序列同一性百分比，并且不將任何保守置換考慮作為序列同一性的一部分。為了測(cè)定氨基酸序列同一性百分比的比對(duì)可以以處于本領(lǐng)域技能之內(nèi)的各種方式來(lái)達(dá)到，例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在所比較的序列的全長(zhǎng)上獲得最大比對(duì)所需的任何算法，然而，為了此處的目的，如下面所描述的，通過(guò)使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2來(lái)獲得氨基酸序列同一性％值，其中ALIGN-2程序的完整源代碼提供在下表中。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序的創(chuàng)造者是Genentech，Inc.，并且下表中所顯示的源代碼已與用戶(hù)文檔一起提交給了美國(guó)版權(quán)局(U.S.CopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559)，在那里它以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087進(jìn)行了注冊(cè)。ALIGN-2程序是通過(guò)Genentech，Inc.,SouthSanFrancisco,California而公眾可獲得的，或者可以從下表中所提供的源代碼進(jìn)行編譯。為了在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選地?cái)?shù)字UNIXV4.OD上進(jìn)行使用，應(yīng)當(dāng)對(duì)ALIGN-2程序進(jìn)行編譯。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序進(jìn)行設(shè)置并且不再變化。用于鑒定在蛋白質(zhì)中的作為優(yōu)選的誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種有用方法稱(chēng)為"丙氨酸掃描資變法(alaninescanningmutagenesis)，，,如由Cunningham和Wells，Science,244:1081-1085(1989)所描述的。鑒定出一個(gè)或一組把殘基(例如，帶電荷的殘基例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選地，丙氨酸或聚丙氨酸)來(lái)替代之以影響所述氨基酸與結(jié)合靼的相互作用。然后，通過(guò)在置換位點(diǎn)處或者為置換位點(diǎn)引入進(jìn)一步的或其他的變體，來(lái)對(duì)那些顯示出對(duì)于置換的功能敏感性的氨基酸位置進(jìn)行細(xì)化。因此，雖然用于引入氨基酸序列變化的位點(diǎn)是預(yù)先確定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先確定。例如，為了分析在給定位點(diǎn)處的突變的性能，在靶密碼子或區(qū)域處進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并且就所希望的活性來(lái)對(duì)所表達(dá)的變體進(jìn)行篩選。術(shù)語(yǔ)"雙面角"是指圍繞鍵的旋轉(zhuǎn)。參見(jiàn)例如，Creighton，T.E.，(1993)Protein:StructuresandMolecularProperties,第2版，W.H.FreemanandCompany,NewYork,NY。術(shù)i吾"<J>"是表示了圍繞氨基酸的N-C鍵的旋轉(zhuǎn)的雙面角。參見(jiàn)例如，Creighton,T.E.，(1993)Protein:StructuresandMolecularProperties,第2版,W.H.FreemanandCompany,NewYork,NY。I型P轉(zhuǎn)角描述于Hutchinson,E.G.&Thornton,J.M.(1994)Arevisedsetofpotentialsforbetaturnformationinproteins.ProteinScience3，2207-2216中。"融合蛋白"和"融合多肽"是指具有共價(jià)連接在一起的兩個(gè)部分的多肽，其中每一部分為具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物學(xué)特性，例如體外或體內(nèi)活性。所述特性也可以是簡(jiǎn)單的化學(xué)或物理特性，例如與靶分子的結(jié)合、反應(yīng)的催化等。所述兩個(gè)部分可以通過(guò)單個(gè)肽鍵直接連接，或者通過(guò)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的肽連接體來(lái)連接。一般地，所述兩個(gè)部分和連接體將會(huì)彼此地處于閱讀框中。"綴合物"是指任何雜合分子，包括融合蛋白以及包含氨基酸或蛋白質(zhì)部分和非蛋白質(zhì)部分的分子。綴合物可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來(lái)合成，包括例如重組DNA技術(shù)、固相合成、液相合成、有機(jī)化學(xué)合成技術(shù)或這些技術(shù)的組合。合成的選擇將依賴(lài)于待產(chǎn)生的特定分子。例如，性質(zhì)上不是完全"蛋白質(zhì)"的雜合分子可以通過(guò)重組技術(shù)和液相技術(shù)的組合來(lái)合成。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"Fc融合蛋白"是指抗體樣分子，其組合了異源蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性和免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能。從結(jié)構(gòu)上說(shuō)，F(xiàn)c融合蛋白包含了具有所希望的結(jié)合特異性的氨基酸序列(其不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(即，是異源的))與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的融合。Fc融合蛋白分子通常包括至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的鄰接氨基酸序列。Fc融合蛋白中的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以獲自任何免疫球蛋白，例如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型，IgA(包括lgA-l和IgA-2)，IgE,IgD或IgM。例如，根據(jù)本發(fā)明有用的Fc融合蛋白為包含BLyS受體的BLyS結(jié)合部分而沒(méi)有BLyS受體的跨膜或胞質(zhì)序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，BAFF-R、TACI或BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白序列的恒定結(jié)構(gòu)域相融合。術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物，，是指任何被歸類(lèi)為哺乳類(lèi)的動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，此處的哺乳動(dòng)物為人。術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指對(duì)于"減輕，，或"治療"受試者或哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥而言有效的抗體或拮抗劑藥物的量。在癌癥的情況下，治療有效量的藥物可以減少癌細(xì)胞的數(shù)目；減少腫瘤大小；抑制(即，在某種程度上減緩和優(yōu)選地終止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)入外周器官中；抑制(即，在某種程度上減緩和優(yōu)選地終止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上抑制肺瘤生長(zhǎng)；和/或在某種程度上緩解一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。參見(jiàn)下面的"治療"的定義。在藥物可以阻止生長(zhǎng)或殺死現(xiàn)有的癌細(xì)胞方面來(lái)說(shuō)，它可以是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的和/或細(xì)胞毒性的。本發(fā)明的BLyS或BLyS受體抗體可以通過(guò)瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞例如CH0細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。本文所用的"載體(carrier)"包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們?cè)谒捎玫膭┝亢蜐舛鹊那闆r下對(duì)暴露于它們的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無(wú)毒的。通常，生理學(xué)上可接受的栽體為pH被緩沖的水溶液。生理學(xué)上可接受的載體的例子包括緩沖液，例如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螫合劑，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。多核苷酸，載體(vector)，宿主細(xì)胞根據(jù)本文公開(kāi)的許多實(shí)施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗劑可產(chǎn)生的特定多肽。本發(fā)明的各種類(lèi)型的多肽可以寬泛地進(jìn)行描述，并且選自基于受體的序列、基于抗體的序列和人工的(即非天然的)結(jié)合序列?；谑荏w的序列的例子為結(jié)合BLyS的那些序列，其分離自或源自在體內(nèi)結(jié)合BLyS的受體(例如TACI、BAFF-R或BCMA)的結(jié)構(gòu)域?；诳贵w的序列為通過(guò)使用抗體形成技術(shù)而產(chǎn)生的并保持了抗體分子一般結(jié)構(gòu)的那些序列?；诳贵w的序列的例子為L(zhǎng)ymphoStat-B或針對(duì)BLyS的受體的抗體。人工的結(jié)合序列的例子包括本文所描述的17肽，摻入了一個(gè)或多個(gè)17肽作為核心區(qū)的多肽，以及17肽和多肽的經(jīng)共價(jià)修飾的形式(例如Fc融合蛋白、經(jīng)標(biāo)記的多肽、受保護(hù)的多肽、經(jīng)綴合的多肽、融合蛋白等)。用于制備這些形式的多肽各種技術(shù)在本文中進(jìn)行了描述。用于標(biāo)記多肽和將分子綴合至多肽的方法是本領(lǐng)域中已知的。本發(fā)明的組合物可以通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的重組技術(shù)來(lái)制備。24宿主細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽來(lái)產(chǎn)生此類(lèi)特定多肽的方法。(參見(jiàn)例如,Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)jDieffenbach等人，PCRPrimer:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995))。為了進(jìn)一步的克隆(DNA的擴(kuò)增)或表達(dá)，可以將編碼所希望的多肽的核酸(例如，cDNA或基因組DNA)插入可復(fù)制的載體中。各種載體是公眾可獲得的。栽體組分一般包括但不限于下列中的一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列，它們中的每個(gè)均在下面進(jìn)行了描述?？梢圆捎玫目蛇x的信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件和轉(zhuǎn)錄終止子序列是本領(lǐng)域中已知的并在WO97/25428中作了進(jìn)一步詳細(xì)的描述。通常，表達(dá)和克隆載體包含被宿主生物體所識(shí)別并有效連接至編碼性核酸序列的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子上游(5')的非翻譯序列(一般在約100至1000bp之內(nèi))，其控制與它們有效連接的特定核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。通常，此類(lèi)啟動(dòng)子分為兩類(lèi)，即誘導(dǎo)型的和組成型的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為這樣的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子響應(yīng)于培養(yǎng)條件的某些變化(例如，營(yíng)養(yǎng)物的存在或不存在，或者溫度的變化)而起始從在其控制之下的DNA上所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的水平增加。目前，眾所周知許多被各種潛在的宿主細(xì)胞所識(shí)別的啟動(dòng)子。通過(guò)經(jīng)限制酶消化從源DNA中移除啟動(dòng)子并將分離的啟動(dòng)子序列插入到載體中，將這些啟動(dòng)子有效連接至編碼性DNA。包含一種或多種上面所列的組分的合適載體的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。將分離的質(zhì)粒或DNA片段進(jìn)行切割、剪裁、并重新連接為對(duì)于產(chǎn)生所需要的質(zhì)粒而言所希望的形式。為了進(jìn)行分析以確認(rèn)所構(gòu)建的質(zhì)粒中的正確序列，可以使用連接混合物來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(AK12菌抹294(ATCC31,446)，并在合適時(shí)通過(guò)氨爺青霉素或四環(huán)素抗性來(lái)選擇成功的轉(zhuǎn)化體。從轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶消化進(jìn)行分析，和/或通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。[參見(jiàn)例如，Messing等人，NucleicAcidsRes.，9:309(1981);Maxam等人，MethodsinEnzymology，65:499(1980)]?？梢圆捎锰峁┝司幋a性DNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)的表達(dá)載體。一般地，瞬時(shí)表達(dá)牽涉使用這樣的表達(dá)載體，其能夠在宿主細(xì)胞中有效地復(fù)制，從而使得宿主細(xì)胞積累許多拷貝的該表達(dá)載體，并從而合成高水平的由該表達(dá)載體所編碼的所希望的多肽[Sambrook等人，同上]。包含合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)使得能夠方便而肯定地鑒定出由經(jīng)克隆的DNA所編碼的多肽，以及就所希望的生物學(xué)或生理學(xué)特性來(lái)快速地篩選此類(lèi)多肽。適合于為了在重組脊推動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中合成所希望的多肽而進(jìn)行調(diào)整的其他方法、載體和宿主細(xì)胞描述于Gething等人，Nature,293:620-625(1981);Mantei等人，Nature,281:40-46(1979);EP117，060;和EP117，058中。用于在此處的載體中克隆或表達(dá)DM的適合的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。用于此目的的適合的原核細(xì)胞包括但不限于真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物，例如腸桿菌科(f/^ero6acter/aceae)，4列^口埃希氏菌屬(fsc/er/cA/a)伊j^口大腸桿菌，腸桿菌屬(^2"ro6s"er)，歐文氏菌屬(Srw^3ia)，克雷伯氏菌屬(iT/e^/e/"),變形菌屬(ZVWe^)，沙門(mén)氏菌屬(Sa7邊o/e/7a)移'j:ft口鼠^f夷寒沙，門(mén)氏菌(Sa7邁o/7e/hOT^/邁f/r/"邁)，沙雷氏菌屬(〃a)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(tora〃a邁flrce"m)，和志賀氏菌屬(57;e7/a)，以及芽孢桿菌屬(&"7/wi)例如枯草芽孢桿菌(A^6〃//s)和地衣芽孢桿菌(A//cAe/z//or/")(例如，在于1989年4月12日/>布的DD266，710中公開(kāi)的地衣芽孢桿菌41P),假單胞菌屬(/^e"f/o邁o"as)例如銅綠假單胞菌(戶(hù).aeri^/zzosa)，和鏈霉菌屬(S打e/^o邊/ces)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶。除了原核生物以外，真核^:生物例如絲狀真菌或酵母也是載體的合適的克隆或表達(dá)宿主。用于表達(dá)糖基化多肽的合適的宿主細(xì)胞源自多細(xì)胞生物體。所有此類(lèi)宿主細(xì)胞的例子在W097/25428中作了進(jìn)一步描述。用上面描述的表達(dá)或克隆栽體轉(zhuǎn)染和優(yōu)選地轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)改良而適合于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所希望的序列的基因。"轉(zhuǎn)染"是指，表達(dá)載體被宿主細(xì)胞吸收，不論編碼序列是否事實(shí)上被表達(dá)。眾多轉(zhuǎn)染方法是普通技術(shù)人員已知的，例如，CaP04和電穿孔。一般地，當(dāng)該載體的運(yùn)轉(zhuǎn)的任何指征出現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，認(rèn)為是成功的轉(zhuǎn)染。"轉(zhuǎn)化"表示將DNA引入生物體中，從而該DNA作為染色體外元件或通過(guò)染色體整合體而成為可復(fù)制的。依賴(lài)于所使用的宿主細(xì)胞，可以通過(guò)使用適合于此類(lèi)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。一般地，將采用氯化鈣的鈣處理(如在Sambrook等人(同上)中所描述的)或電穿孔用于原核細(xì)胞或包含實(shí)質(zhì)性細(xì)胞壁屏障的其他細(xì)胞。將使用根瘤土壤桿菌(v^ro6ac^er/〃頂f咖e尸ac/e/^)的感染用于轉(zhuǎn)化某些植物細(xì)胞，如由Shaw等人，Gene，23:315(1983)和于1989年6月29日公布的W089/05859所描述的。此外，可以通過(guò)使用超聲處理來(lái)轉(zhuǎn)染植物，如在于1991年1月10日公布的W091/00358中所描述的。對(duì)于沒(méi)有此類(lèi)細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以采用Graham和vanderEb，Virology,52:456-457(1978)的磷酸釣沉淀法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面已在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,399,216中作了描述。通常，根據(jù)VanSolingen等人，J.Bact.，130:946(1977)和Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76:3829(1979)的方法來(lái)施行向酵母中的轉(zhuǎn)化。然而，也可以使用用于將DNA引入細(xì)胞中的其他方法，例如通過(guò)核微量注射、電穿孔、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞融合、或者聚陽(yáng)離子(例如polybrene、聚鳥(niǎo)氨酸)。關(guān)于用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)，參見(jiàn)Keown等人，MethodsinEnzymology185:527-537(1990)，和Mansour等人，Nature,336:348-352(1988)。原核細(xì)胞可以在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如在Sambrook等人(同上)中所一般性地描述的。商購(gòu)可得的培養(yǎng)基的例子包括Ham'sFIO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基("MEM",Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基("DMEM"，Sigma)。在需要時(shí)，任何此類(lèi)培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有激素和/或其他生長(zhǎng)因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如慶大霉素)、痕量元素(其定義為通常以在微重量摩爾濃度范圍內(nèi)的最終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)和葡萄糖或等價(jià)的能量來(lái)源。還可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知曉的適當(dāng)濃度包含任何其他必需的補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH等，為先前關(guān)于被選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所使用的那些，并且對(duì)于普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。一般地，用于最大化哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)力的原理、方案和實(shí)用技術(shù)可以在MammalianCellBiotechnology:APracticalApproach,M.Butler(編輯)(IRLPress,1991)中找到。經(jīng)表達(dá)的多肽可以作為分泌型多肽從培養(yǎng)基中回收，雖然當(dāng)直接產(chǎn)生而沒(méi)有分泌信號(hào)時(shí)，也可以從宿主細(xì)胞裂解液中回收。如果多肽是膜結(jié)合的，可以通過(guò)使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)從膜上將它釋放出來(lái)，或者可以通過(guò)酶促切割來(lái)釋放其細(xì)胞外區(qū)域。當(dāng)在非人起源的重組細(xì)胞中產(chǎn)生多肽時(shí)，它沒(méi)有人起源的蛋白質(zhì)或多肽。但是，常常必需從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽中回收或純化所述多肽，以獲得基本上同質(zhì)的制備物。作為第一步，可以離心培養(yǎng)基或裂解液以去除顆粒狀的細(xì)胞碎片。下面是合適的純化操作程序的示例性的操作程序在離子交換柱上進(jìn)行分級(jí)；乙醇沉淀；反相HPLC;在二氧化硅或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(例如DEAE)上的色譜法；層析聚焦；SDS-PAGE;;琉酸銨沉淀；凝膠過(guò)濾，其4吏用例如SephadexG-75;和A蛋白Sepharose柱，以去除污染物例如IgG。噬菌體展示28根據(jù)一些實(shí)施方案，選自下列的本發(fā)明的多肽可以在噬菌體展示中使用式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO:13)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO:14)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO:15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO:16)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO:17)和在WO05/000351的圖32中所列出的序列。使用噬菌體展示技術(shù)使得能夠產(chǎn)生大的蛋白質(zhì)變體文庫(kù)，可以就那些以高親和力與靶分子結(jié)合的序列來(lái)快速地對(duì)所述蛋白質(zhì)變體進(jìn)行分選。將編碼變體多肽的核酸與編碼病毒外殼蛋白(例如基因III蛋白或基因VIII蛋白)的核酸序列相融合。已開(kāi)發(fā)出了單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)，其中編碼所述蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列與編碼基因III蛋白的部分的核酸序列相融合。(Bass，S.，Proteins,8:309(1990);Lowman和Weils，Methods:ACompaniontoMethodsinBnzymology，3:205(1991))。在單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)中，基因融合物以低水平表達(dá)，并且還表達(dá)了野生型基因III蛋白，從而保持了顆粒的感染性。用于產(chǎn)生肽文庫(kù)和篩選那些文庫(kù)的方法已在許多專(zhuān)利(例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，723，286;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，432，018;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,580，717;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,427,908;和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，498，530)中公開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，式I、式II或式III被表達(dá)為在噬菌體上的肽文庫(kù)。然后，使表達(dá)式I、式II或式III的多肽文庫(kù)的噬菌體經(jīng)歷基于BLyS結(jié)合的選擇。在一些實(shí)施方案中，選擇過(guò)程牽涉允許某些噬菌體與生物素化的BLyS結(jié)合，后者隨后被結(jié)合至中性抗生物素蛋白(neutravidin)平板?；厥詹⒎敝惩ㄟ^(guò)BLyS-生物素-中性鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合而結(jié)合至平板的噬菌體。在一些實(shí)施方案中，使所述噬菌體經(jīng)歷幾輪選擇。在一些實(shí)施方案中，將所述噬菌體與BLyS-生物素一起進(jìn)行溫育，隨后添加未生物素化的BLyS作為竟?fàn)幗Y(jié)合劑。在實(shí)施例中提供了在本發(fā)明的情況下使用噬菌體展示的另外的指導(dǎo)。融合或綴合至異源多肽的多肽進(jìn)一步考慮在此處的方法中使用包含本發(fā)明的多肽的Fc融合蛋白分子。在一些實(shí)施方案中，所述分子包含本發(fā)明的多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區(qū)域的融合。對(duì)于Fc融合蛋白的二價(jià)形式，這樣的融合物有用地包含IgG分子的Fc區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)來(lái)自人IgGl分子。在一些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白融合物包括IgGl分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)或者鉸鏈、CH1、CH2和CH3區(qū)。關(guān)于免疫球蛋白融合物的產(chǎn)生，還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,428,130，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,843,725，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,018,026，和Chamow等人，TIBTECH，14:52-60(1996)。最簡(jiǎn)單和最直接的Fc融合蛋白設(shè)計(jì)常常將本發(fā)明的拮抗劑多肽(優(yōu)選地，天然序列)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)相組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽可以是人工的，例如可以將包含下列序列的多肽共價(jià)連接至免疫球蛋白的Fc部分式I、式II、式III、ECFDLLVRA證CSVLK(SEQIDN0:13)、ECFDLL額WVPCGLLR(SEQIDNO:14)、ECFDLL窗WVPCEMLG(SEQIDNO:15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO:16)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SBQIDNO:17)、或在圖32中所列出的序列。此外，這些多肽中的一個(gè)或多個(gè)可以彼此連接和連接至免疫球蛋白的Fc部分。通常，當(dāng)制備本發(fā)明的Fc融合蛋白時(shí)，將編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸在C-末端融合至編碼免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的N-末端的核酸，然而，N-末端融合物也是可能的。通常，在此類(lèi)融合物中，所編碼的嵌合多肽將會(huì)至少保留免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的在功能上有活性的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。也可以向恒定結(jié)構(gòu)域的Fc部分的C-末端進(jìn)行融合，或者在對(duì)于重鏈的CHI或輕鏈的相應(yīng)區(qū)域而言緊N-末端處進(jìn)行融合。進(jìn)行融合的精確位點(diǎn)不是關(guān)鍵性的；具體位點(diǎn)是眾所周知的并且可以進(jìn)行選擇以?xún)?yōu)化Fc融合蛋白的生物學(xué)活性、分泌或結(jié)合特征。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列融合至免疫球蛋白Gl(IgGl)的Fc區(qū)的N-末端?？梢詫⒄麄€(gè)重鏈恒定區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列相融合。然而，更優(yōu)選地，在融合中使用這樣的序列，所述序列開(kāi)始于剛好在木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)(其在化學(xué)上定義了IgGFc)(即殘基216,將重鏈恒定區(qū)的第一個(gè)殘基作為殘基114)或其他免疫球蛋白的類(lèi)似位點(diǎn)上游的鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨基酸序列融合至IgG重鏈的(a)鉸鏈區(qū)以及CH2和CH3，或者(b)CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。對(duì)于雙特異性Fc融合蛋白，將Fc融合蛋白裝配為多聚體，和特別地異二聚體或異四聚體。一般地，這些經(jīng)裝配的免疫球蛋白將會(huì)具有已知的單元結(jié)構(gòu)?；镜乃逆溄Y(jié)構(gòu)單元為IgG、IgD和IgE所存在的形式。四鏈單元在更高分子量的免疫球蛋白中重復(fù)；IgM—般作為通過(guò)二硫鍵而聯(lián)合在一起的四基本單元的五聚體存在。IgA球蛋白，和偶然地IgG球蛋白，也可以以多聚體形式存在于血清中。在多聚體的情況下，所述四單元中的每一個(gè)可以是相同的或不同的。在本文范圍內(nèi)的各種示例性的經(jīng)裝配的Fc融合蛋白示意性地圖解如下(a)ACL-ACL;(b)ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH);(c)ACL-ACH-(ACL-ACH,ACL-VHCH，VLCL-ACH,或VLCL-VHCH);(d)ACL-雷H-(ACH,或ACL-VHCH，或VLCL-ACH);(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH,或VLCL-ACH);和(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2，其中每個(gè)A代表相同或不同的多肽，所述多肽包含下列氨基酸序列源自BLyS受體結(jié)構(gòu)域的序列，源自針對(duì)BLyS或針對(duì)BLyS受體的抗體的序列，或者人工序列，例如式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO9)或在圖32中所列出的序列，或其組合。VL為免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH為免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域；CL為免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；CH為免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；n為大于l的整數(shù)；Y指明了共價(jià)交聯(lián)劑的殘基。為了簡(jiǎn)潔，上述結(jié)構(gòu)只顯示關(guān)鍵特征；它們沒(méi)有標(biāo)明免疫球蛋白的連接(J)或其他結(jié)構(gòu)域，也沒(méi)有顯示二硫鍵。但是，當(dāng)此類(lèi)結(jié)構(gòu)域是結(jié)合活性所必需的時(shí)，應(yīng)當(dāng)將它們構(gòu)建成存在于它們?cè)诿庖咔虻鞍追肿又兴紦?jù)的通常位置中。備選地，可以將Fc序列插入在免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，從而獲得包含嵌合重鏈的免疫球蛋白。在該實(shí)施方案中，在鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)域之間，或者在CH2和CH3結(jié)構(gòu)域之間，將Fc序列融合至在免疫球蛋白的每個(gè)臂中的免疫球蛋白重鏈的3'末端。Hoogenboom等人，Mol.Immunol,28:1027-1037(1991)已凈艮道了類(lèi)似的構(gòu)建體。雖然在本發(fā)明的Fc融合蛋白中免疫球蛋白輕鏈的存在不是必需的，但是可以存在免疫球蛋白輕鏈，其或者共價(jià)聯(lián)合至結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白重鏈融合多肽，或者直接融合至結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在前一種情況下，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DM—起共表達(dá)。在分泌后，所述雜合的重鏈和輕鏈將會(huì)共價(jià)聯(lián)合，從而提供包含兩個(gè)經(jīng)二硫鍵連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。適合于制備此類(lèi)結(jié)構(gòu)的方法例如在于1989年3月28日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567中公開(kāi)。最方便地，通過(guò)將編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分的cDNA按閱讀框架融合至免疫球蛋白cDNA序列來(lái)構(gòu)建Fc融合蛋白。然而，也可以使用與基因組免疫球蛋白片段的融合(參見(jiàn)例如，Aruffo等人，Cell,61:1303-1313(1990);和Stamenkovic等人，Cell,66:1133-1144(1991))。后一種類(lèi)型的融合要求存在用于表達(dá)的Ig調(diào)節(jié)序列。基于所發(fā)表的來(lái)自源于脾或外周血淋巴細(xì)胞的cDNA文庫(kù)的序列，通過(guò)雜交或通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)可以分離出編碼IgG重鏈恒定區(qū)的cDNA。將編碼所述Fc融合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白部分的cDM串聯(lián)插入到指導(dǎo)在所選宿主細(xì)胞中的有效表達(dá)的質(zhì)粒載體中。進(jìn)行了特定的修飾，以產(chǎn)生在形成用于在本發(fā)明中使用的融合分子(例如，BLyS和/或APRIL拮抗劑Fc融合分子)中有用的Fc序列。特別地，產(chǎn)生了六種形式的經(jīng)修飾的人IgGlFc以用于形成Fc融合蛋白，并將它們命名為Fc-488以及Fc4、Fc5、Fc6、Fc7和Fc8。Fc-488(SEQIDNO:39)被設(shè)計(jì)用于方便地克隆包含人y1Fc區(qū)的融合蛋白，并且通過(guò)使用野生型人免疫球蛋白yl恒定區(qū)作為模板來(lái)構(gòu)建它。對(duì)于由于未成對(duì)的半胱氨酸殘基而引起的潛在有害影響的關(guān)注導(dǎo)致決定用絲氨酸殘基替代通常與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)形成二硫鍵的半胱氨酸。在編碼EU索引(EUindex)位置218的密碼子處引入另外的變化以引入BglII限制酶識(shí)別位點(diǎn)，從而方便將來(lái)的DNA操作。將這些變化被引入在PCR引物上所編碼的PCR產(chǎn)物之中。由于BglII位點(diǎn)的位置并且為了使Fc鉸鏈區(qū)完整，將EU索引位置216和217的密碼子摻入到融合蛋白伙伴序列中。Fc4、Fc5和Fc6包含突變，以通過(guò)減少FcyRI結(jié)合和補(bǔ)體Clq結(jié)合來(lái)降低由Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。Fc4包含被引入Fc-488中的相同氨基酸置換。引入另外的氨基酸置換以降低潛在的由Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。特別地，引入三個(gè)氨基酸置換以減少FcyRI結(jié)合。這些為在EU索引位置234、235和237處的置換。在這些位置處的置換已顯示減少了與FcyRI的結(jié)合(Duncan等人，Nature332:563(1988))。這些氨基酸置換還可以減少FcyRIIa結(jié)合，以及FcyRIII結(jié)合(Sondermann等人，Nature406:267(2000);Wines等人，J.Immunol.164:5313(2000))。幾個(gè)小組已經(jīng)描述了EU索引位置330和331(SEQIDNO:6的氨基酸殘基134和135)在補(bǔ)體Clq結(jié)合和隨后的補(bǔ)體固定中的相關(guān)性(Canfield和Morrison,J.Exp.Med.173:1483(1991);Tao等人，J.Exp.Med.178:661(1993))。在Fc4中引入在這些位置處的氨基酸置換以減少補(bǔ)體固定。Fc4的CH3結(jié)構(gòu)域與在相應(yīng)的野生型多肽中發(fā)現(xiàn)的相同，除了終止密碼子外，所述終止密碼子被從TGA改變?yōu)門(mén)AA以消除當(dāng)所克隆的DM在大腸桿菌的dam+菌抹中生長(zhǎng)時(shí)潛在的dam甲基化位點(diǎn)。在Fc5中，將EU索引位置218處的精氨酸殘基突變回賴(lài)氨酸，因?yàn)樵诎撎囟‵c的融合蛋白中未使用BglII克隆流程。Fc5的其命部分與上面關(guān)于Fc4的描述相匹配。33Fc6與Fc5相同，除了已消除了羧基末端賴(lài)氨酸密碼子外。常常在從B細(xì)胞中分泌之前在翻譯后從成熟免疫球蛋白中去除成熟免疫球蛋白的C-末端賴(lài)氨酸，或者在血清循環(huán)期間去除。因此，在循環(huán)抗體上通常找不到C-末端賴(lài)氨酸殘基。正如上面在Fc4和Fc5中，F(xiàn)c6序列中的終止密碼子被改變?yōu)門(mén)AA。Fc7與野生型ylFc相同，除了位于(:2結(jié)構(gòu)域中的EU索引位置297處的氨基酸置換外。EU索引位置Asn-297是N-聯(lián)碳水化合物附著位點(diǎn)。由于碳水化合物結(jié)構(gòu)中潛在的批與批之間的(batch-to-batch)變化，因而N-聯(lián)碳水化合物在重組表達(dá)的蛋白質(zhì)中引入潛在的變異性來(lái)源。在消除這種潛在變異性的嘗試中，將Asn-297突變?yōu)楣劝滨０窔埢苑乐筃-聯(lián)碳水化合物附著在該殘基位置處。殘基297處的碳水化合物還參與Fc與FcRIII的結(jié)合(Sondermann等人，Nature406:267(2000))。因此，一般地，碳水化合物的去除應(yīng)當(dāng)減少了包含重組Fc7的融合蛋白與FcyR的結(jié)合。如上面一樣，將Fc7序列中的終止密碼子突變?yōu)門(mén)AA。Fc8與seqidno:6中所顯示的野生型免疫球蛋白y1區(qū)相同，除了在EU索引位置220處的半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代外。該突變消除了通常與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)形成二硫鍵的半胱氨酸殘基。使用這些特定Fc結(jié)構(gòu)域中的任一種來(lái)形成所述BLyS和/或APRIL拮抗劑在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還考慮了這些分子的亮氨酸拉鏈形式。"亮氨酸拉鏈"是在本領(lǐng)域中用于指富含亮氨酸的序列的術(shù)語(yǔ)，所述富含亮氨酸的序列增強(qiáng)、促進(jìn)或驅(qū)動(dòng)其融合伙伴(例如，亮氨酸拉鏈所融合或連接至的序列或分子)的二聚化或三聚化。各種亮氨酸拉鏈多肽已在本領(lǐng)域中作了描述。參見(jiàn)例如，Landschulz等人，Science,240:1759(1988);美國(guó)專(zhuān)利5，716，805;W094/10308;Hoppe等人，F(xiàn)EBSLetters,344:1991(1994);Maniatis等人，Nature,341:24(1989)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，可以將亮氨酸拉鏈序列融合在本發(fā)明的多肽的5'或3'末端。還可以以這樣的方式來(lái)修飾本發(fā)明的多肽，即通過(guò)將所述多肽融合至另一個(gè)異源多肽或氨基酸序列而形成嵌合分子。根據(jù)一些實(shí)施方案，此類(lèi)異源多肽或氨基酸序列為發(fā)揮使嵌合分子低聚化的作用的多肽或氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，這樣的嵌合分子包含所述多肽與標(biāo)簽多肽的融合，所述標(biāo)簽多肽提供了標(biāo)簽抗體可以選擇性地與之結(jié)合的表位。該表位標(biāo)簽一般置于所述多肽的氨基或羧基末端。表位;示簽的形式的存在。'此》卜，提供表位標(biāo)i使得所述多肽能夠容易地通過(guò)親和純化來(lái)進(jìn)行純化，其中使用標(biāo)簽抗體或與該表位標(biāo)簽結(jié)合的另一類(lèi)型的親和基質(zhì)。各種標(biāo)簽多肽及其各自的抗體是本領(lǐng)域中眾所周知的。例子包括多組氨酸(poly-his)或多組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽；fluHA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5[Field等人，Mol.Cell.Biol.，8:2159-2165(1988)];c一myc標(biāo)簽及針對(duì)其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體[Evan等人，MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985)];和單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體[Paborsky等人，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990)〗。其他標(biāo)簽多肽包括Flag-肽[Hopp等人，BioTechnology，6:1204-1210(1988)];KT3表位肽[Martin等人，Science,255:192-194(1992)];a-微管蛋白表位肽"[Skinner等人，J.Biol.Chem.，266:15163-15166(1991)];和T7基因10蛋白肽標(biāo)簽[Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl.Acad.Sci:USA,87:6393-6397(1990)]。肽-聚合物綴合物的構(gòu)建在一些實(shí)施方案中，用于給合成肽綴合聚合物(例如PEG化)的策略在于，通過(guò)在溶液中形成綴合物連接來(lái)將肽和PEG部分相組合，它們各自攜帶有能相互反應(yīng)的特殊官能度。可以用常規(guī)的固相合成而容易地制備所述肽。在特定位點(diǎn)處用合適的官能團(tuán)來(lái)"預(yù)活化"所述肽。在與PEG部分反應(yīng)之前，純化并充分表征所述前體。所述肽與PEG的連接通常在水相中發(fā)生，并且可以通過(guò)反相分析型HPLC而容易地進(jìn)行監(jiān)測(cè)。PEG化的肽可以容易地通過(guò)制備型HPLC來(lái)進(jìn)行純化，并且通過(guò)分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸質(zhì)鐠法來(lái)進(jìn)行表征。在一些實(shí)施方案中，主要依賴(lài)于反應(yīng)條件、聚合物的分子量等，經(jīng)由肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基將所述肽共價(jià)鍵合至聚合物上的末端反應(yīng)性基團(tuán)。具有反應(yīng)性基團(tuán)的聚合物在本文中被稱(chēng)為活化的聚合物。所迷反應(yīng)性基團(tuán)選擇性地與所述肽上的游離氨基或其他反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)。潛在的反應(yīng)位點(diǎn)包括N-末端氳基，賴(lài)氨酸殘基上的e-氨基，以及其他氨基、亞氨基、羧基、巰基、羥基和其他親水基團(tuán)。然而，可以理解，為了獲得最佳結(jié)果而選擇的反應(yīng)性基團(tuán)的類(lèi)型和數(shù)量以及所釆用的聚合物的類(lèi)型將會(huì)依賴(lài)于所釆用的特定的肽，以避免使反應(yīng)性基團(tuán)與太多的在所述肽上的特別活躍的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可以在適合于綴合的位置處置換反應(yīng)性殘基(例如，賴(lài)氨酸(K)、經(jīng)修飾的非天然氨基酸或其他小分子)。在一些實(shí)施方案中，所述肽包含下列序列W005/000351的式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO9)、或在圖32中所列出的序列，具有末端反應(yīng)性基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，所述肽包含至少一個(gè)，和更優(yōu)選地多于一個(gè)的包含下列序列的多肽W005/000351的式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO9)、或在圖32中所列出的序列。被連接在一起的多肽可以具有相同的序列或具有不同的序列和末端反應(yīng)性基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，這些多肽可以彼此連接，可選地，通過(guò)使用連接體。盡管綴合可以出現(xiàn)在所述多肽上的任何反應(yīng)性氨基酸處，但在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)性氨基酸為賴(lài)氨酸，其通過(guò)其游離s-氨基而連接至活化的聚合物的反應(yīng)性基團(tuán)，或者為谷氨酸或天冬氨酸，其通過(guò)酰胺鍵而連接至所述聚合物。在一些實(shí)施方案中，所述肽的反應(yīng)性氨基酸在位置X2和Xlz處不是半胱氨酸殘基。與每種肽的聚合物綴合的程度將依賴(lài)于所述肽上反應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)目，聚合物的分子量、親水性和其他特性，以及所選擇的具體的肽衍生化位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述綴合物具有1至io個(gè)聚合物分子/肽分子的最終摩爾比，但也考慮了更大數(shù)目的附著至本發(fā)明的肽的聚合物分子。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)綴合物包含一個(gè)聚合物分子。通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)矩陣(experimentalmatrix)(其中改變時(shí)間、溫度和其他反應(yīng)條件以改變置換的程度)容易地獲得所希望的數(shù)量的衍生化，在這之后通過(guò)大小排阻層析或其他本領(lǐng)域中已知的手段來(lái)測(cè)定綴合物的聚合物取代的水平。在一些實(shí)施方案中，所述聚合物僅包含單個(gè)具有反應(yīng)性的基團(tuán)。這有助于避免蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)。但是，在本文范圍之內(nèi)的是，使反應(yīng)條件最大化以減少交聯(lián)，或者通過(guò)凝膠過(guò)濾或離子交換色譜法來(lái)純化反應(yīng)產(chǎn)物以回收基本上同質(zhì)的衍生物。在其他實(shí)施方案中，所述聚合物包含兩個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)，以便將多個(gè)肽連接至聚合物主鏈。再次，可以使用凝膠過(guò)濾或離子交換色譜法來(lái)以基本上均質(zhì)的形式回收所希望的衍生物。在一些實(shí)施方案中，所述聚合物直接共價(jià)鍵合至所述肽，而不使用多官能的(通常雙官能的)交聯(lián)劑。在一些實(shí)施方案中，存在1:1的PEG鏈對(duì)肽的摩爾比。共價(jià)修飾反應(yīng)可以通過(guò)一般用于使具有生物學(xué)活性的材料與惰性聚合物進(jìn)行反應(yīng)的任何合適的方法來(lái)進(jìn)行，優(yōu)選地，在約pH5-9,更優(yōu)選地7-9，如果在所述肽上的反應(yīng)性基團(tuán)為賴(lài)氨酸基團(tuán)。一般地，所述過(guò)程牽涉制備活化的聚合物(通常具有至少一個(gè)待活化的末端羥基的聚合物)，從該聚合物制備活性基材，和之后使所述肽與所述活性基材反應(yīng)從而產(chǎn)生適合于配制的肽。上面的修飾反應(yīng)可以通過(guò)幾種方法來(lái)進(jìn)行，所述方法可以牽涉一個(gè)或多個(gè)步驟?？梢杂糜谠谝徊椒磻?yīng)中產(chǎn)生活化的聚合物的修飾試劑的例子包括氯化三聚氰酸(2，4，6-三氯-S-三溱)和氟化三聚氰酸。在一些實(shí)施方案中，修飾反應(yīng)以?xún)刹桨l(fā)生，其中使聚合物首先與酸酐例如琥珀酸酐或戊二酸酐進(jìn)行反應(yīng)從而形成羧酸，然后使所述羧酸與能夠與羧酸反應(yīng)的化合物進(jìn)行反應(yīng)從而形成活化的聚合物，該活化的聚合物具有能夠與所述肽反應(yīng)的反應(yīng)性酯基團(tuán)。此類(lèi)化合物的例子包括N-羥基琥珀酰亞胺、4-幾基-3-硝基苯磺酸等，并且優(yōu)選地使用N-羥基琥珀酰亞胺或4-羥基-3-硝基苯磺酸。例如，可以在提高的溫度，優(yōu)選地約100-110'C下，使單甲基取代的PEG與戊二酸酐反應(yīng)四小時(shí)。然后，在碳二亞胺試劑例如二環(huán)己基碳二亞胺或異丙基碳二亞胺存在下，使如此產(chǎn)生的單曱基PEG-戊二酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)從而產(chǎn)生活化的聚合物，曱氧基聚乙二醇基-N-琥珀酰亞胺基戊二酸酯，它然后可以與GH反應(yīng)。該方法在Abuchowski等人，CancerBiochem.Biophys.，7:175-186(1984)中詳細(xì)作了描述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單曱基取代的PEG可以與戊二酸酐反應(yīng)，隨后在二環(huán)己基碳二亞胺存在下與4-羥基-3-硝基苯磺酸(HNSA)反應(yīng)從而產(chǎn)生活化的聚合物。HNSA由Bhatnagar等人，Peptides:Synthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium,Rich等人(編輯)(PierceChemicalCo.，Rockfordlll，1981)，第97-100頁(yè)，以及在Nitecki等人，High-TechnologyRoutetoVirusVaccines(AmericanSocietyforMicrobiology:1986)，題名為"NovelAgentforCouplingSyntheticPeptidestoCarriersandItsApplications."中作了描述。在一些實(shí)施方案中，與氨基的共價(jià)結(jié)合通過(guò)基于氰尿酰氯、碳酰二咪唑、醛反應(yīng)性基團(tuán)(PEG醇鹽+溴代乙醛的二乙基乙縮醛；PEG+DMS0和乙酸酐，或PEG氯化物+4-羥基苯甲醛的酚鹽、活化的琥珀酰亞胺基酯，活化的二硫代碳酸酯PEG,2，4，5-三氯苯基氯曱酸酯或?qū)ο趸交燃姿狨セ罨腜EG)的已知化學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)使用碳二亞胺偶聯(lián)PEG-胺來(lái)使羧基衍生化。通過(guò)偶聯(lián)至經(jīng)馬來(lái)酰亞氨基取代的PEG(例如，烷氧基-PEG胺+4-(N-馬來(lái)酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-l-羧酸磺基琥珀酰亞胺基酯)(如在于1997年3月27日公布的WO97/10847中所描述的)，或者偶聯(lián)至從NektarTechnologies,SanCarlos,CA(以前稱(chēng)為ShearwaterPolymers,Inc.)商購(gòu)可得的PEG-馬來(lái)酰亞胺來(lái)使巰基衍生化。備選地，可以將所述肽上的游離氨基(例如賴(lài)氨酸殘基上的s-氨基)偶聯(lián)至經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺基取代的PEG(從NektarTechnologies可得的PEG-NHS),或者可以用2-亞氨基-四氬噻吩(Traut試劑)進(jìn)行硫醇化，然后偶聯(lián)至PEG的含有馬來(lái)酰亞胺的衍生物，如在Pedley等人，Br.J.Cancer,70:1126-1130(1994)中所描述的。許多惰性聚合物(包括但不限于PEG)適合于在藥物中使用。參見(jiàn)例如,Davis等人，BiomedicalPolymers:PolymericMaterialsandPharmaceuticalsforBiomedicalUse,第441-451頁(yè)(1980)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物。通常，非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物通常為親水性的合成聚合物，即否則在自然界中找不到的聚合物。但是，存在于自然界中的并且通過(guò)重組或體外方法產(chǎn)生的聚合物也是有用的，如從天然來(lái)源分離出的聚合物。親水性聚乙烯基聚合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特別有用的是聚亞烷基醚，例如聚乙二醇(PEG);聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯，以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics);聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支化的或非支化的多糖，其包含糖單體D-甘露糖、D-和L-半乳糖、巖藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸，包括同多糖和雜多糖，例如乳糖、支鏈淀粉、淀粉、羥乙基淀粉、直鏈淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖(例如，透明質(zhì)酸)的多糖亞單位；糖醇的聚合物，例如聚山梨糖醇和聚甘露醇；肝素或乙酰肝素。綴合之前的聚合物不需要，但優(yōu)選地，為水溶性的，但是最終的綴合物優(yōu)選地為水溶性的。優(yōu)選地，綴合物展示出至少約O.01mg/ml，和更優(yōu)選地至少約O.1mg/ml，和更加優(yōu)選地至少約lmg/ml的水溶解度。此外，聚合物在綴合物形式中不應(yīng)是高度免疫原性的，也不應(yīng)具有與靜脈內(nèi)輸液、注射或吸入不相容的粘度，如果綴合物意欲通過(guò)此類(lèi)途徑進(jìn)行施用的話(huà)。聚合物的分子量可以高至IOO，000D,和優(yōu)選地至少約500D,或至少約1，000D，或至少約5，000D。在一些實(shí)施方案中，PEG或其他聚合物具有5000至20，000D的分子量。所選擇的分子量可以依賴(lài)于待實(shí)現(xiàn)的綴合物的有效尺寸，聚合物的性質(zhì)(例如，結(jié)構(gòu)，例如線(xiàn)性或支化的)，和衍生化的程度，即聚合物分子的數(shù)目/肽，以及聚合物在肽上的附著位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，支化的PEG可以用于引起肽的有效尺寸的大大增加。PEG或其他聚合物綴合物可以用于增加半衰期、增加溶解度、抵抗蛋白水解攻擊和降低免疫原性。用于修飾本發(fā)明的肽的官能化的PEG聚合物是從NektarTechnologiesofSanCarlos,CA(以前稱(chēng)為ShearwaterPolymers,Inc.)可得的。此類(lèi)商購(gòu)可得的PEG衍生物包括但不限于，氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-N-羥基琥珀酰亞胺化學(xué)(NHS)、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧曱基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酸琥珀酰亞胺基酯、PEG丙酸琥珀酰亞胺基酯、羧曱基化的PEG的琥珀酰亞胺基酯、PEG的碳酸琥珀酰亞胺基酯、氨基酸PEG的琥珀酰亞胺基酯、PEG-氧基羰基咪唑、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG三氟乙磺酸酯、PEG-縮水甘油醚、PEG-醛、PEG乙烯基砜、PEG-馬來(lái)酰亞胺、PEG-鄰吡啶基二硫化物、雜官能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEGphospholides。用于偶聯(lián)這些PEG衍生物的反應(yīng)條件將會(huì)依賴(lài)于蛋白質(zhì)、所希望的PEG化程度和所使用的PEG衍生物而變化。在選擇PEG衍生物中所牽涉的因素包括所希望的附著點(diǎn)(例如，賴(lài)氨酸或半胱氨酸R-基團(tuán))，衍生物的水解穩(wěn)定性和反應(yīng)性，連接物的穩(wěn)定性、毒性和抗原性，用于分析的適宜性等。關(guān)于使用任何特定衍生物的具體指導(dǎo)可從制造商處獲得。所述綴合物可以通過(guò)SDS-PAGE、凝膠過(guò)濾、NMR、胰蛋白酶消化作圖(trypticmapping)、液相色謙-質(zhì)語(yǔ)法和體外生物學(xué)測(cè)定法來(lái)進(jìn)行表征。例如，PEG綴合的程度可以通過(guò)SDS-PAGE和凝膠過(guò)濾來(lái)顯示，然后通過(guò)NMR進(jìn)行分析，該NMR具有關(guān)于PEG的亞曱基氫的特殊的共振峰。每個(gè)分子上PEG基團(tuán)的數(shù)目可以由NMR鐠或質(zhì)譜法進(jìn)行計(jì)算。合適地，在10mMTris-HClpH8.0，100mMNaCl(作為洗脫緩沖液)中進(jìn)行在10%SDS中的聚丙烯酰胺凝膠電泳。為了證明哪個(gè)殘基被PEG化了，可以進(jìn)行胰蛋白酶消化作圖。因此，在10QmM乙酸鈉，10mMTris-HCl，1mM氯化鉤，pH8.3中，在37T下，以100:1(以mg為基礎(chǔ))的蛋白質(zhì)/酶比率，用胰蛋白酶消化PEG化的肽4小時(shí)，并且酸化至pH<4以終止消化，隨后在HPLCNucleosilC-18(4.6mmxl50mm，5.mu.，100A)上進(jìn)行分離。將色i昝圖與非PEG化的起始材料的色鐠圖進(jìn)行比較。然后，每個(gè)峰可以通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)進(jìn)行分析，以驗(yàn)證該峰中的片段的大小。攜帶PEG基團(tuán)的片段通常在注射后不滯留在HPLC柱上，并且從色鐠上消失。這種從色譜上的消失是在應(yīng)當(dāng)包含至少一個(gè)賴(lài)氨酸殘基的那個(gè)特定片段上的PEG化的指征。然后，可以通過(guò)常規(guī)方法就與BLyS結(jié)合的能力來(lái)分析PEG化的肽。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)離子交換色譜法(例如離子交換HPLC)來(lái)純化綴合物。許多經(jīng)親電活化的PEG的化學(xué)導(dǎo)致PEG化的產(chǎn)物的氨基負(fù)荷減少。因此，可以使用高分辨率離子交換色譜法來(lái)分開(kāi)游離的和綴合的蛋白質(zhì)，并且分辨出具有不同PEG化水平的種類(lèi)。事實(shí)上，由于未反應(yīng)的氨基酸的離子特性的差異，分辨不同的種類(lèi)(例如，包含一個(gè)或兩個(gè)PEG殘基)也是可能的。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)WO96/34015(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US96/05550，1996年10月31日公布)中所描述的方法來(lái)分辨具有不同PEG化水平的種類(lèi)。以相同的方式，相互純化出異質(zhì)的綴合物種類(lèi)。在一些實(shí)施方案中，PEG-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與伯胺(例如賴(lài)氨酸和N-末端)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，PEG-NHS與多肽的C-末端賴(lài)氨酸(K)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，將賴(lài)氨酸殘基添加至所迷17聚體多肽的C-末端，而在其他實(shí)施方案中，Xi被賴(lài)氨酸置換。在一些實(shí)施方案中，聚合物與N-末端反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在下面實(shí)施例中所描述的衍生化和純化方法來(lái)產(chǎn)生綴合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了任何由其組成部分(即一個(gè)或多個(gè)共價(jià)附著于一個(gè)或多個(gè)聚合物分子的肽)形成的上面所描述的綴合物，在所述綴合物的共價(jià)分子結(jié)構(gòu)中沒(méi)有任何無(wú)關(guān)物質(zhì)。本發(fā)明的方法和制品使用或摻入了抗體，所述抗體與BLyS或者其三種受體中的一種或多種結(jié)合。因而，將在此處描述用于產(chǎn)生此類(lèi)抗體的方法。用于產(chǎn)生或篩選抗體的BLyS或BLyS受體可以例如是包含所希望的表位的抗原或其部分的可溶性形式。如在上面所描述的，BLyS序列和BLyS受體序列是已知的，如這些多肽的各種結(jié)構(gòu)域的邊界是已知的一樣?？梢詫⒓?xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的肽片段用作免疫原。基于這些已知的序列和結(jié)構(gòu)域描繪，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以表達(dá)出BLyS或BLyS受體多肽及其片段以用于產(chǎn)生抗體。為了產(chǎn)生針對(duì)BLyS或其受體的抗體，可以將全長(zhǎng)多肽或者長(zhǎng)度為6個(gè)或更多個(gè)殘基的肽片段用作免疫原，以在嚙齒動(dòng)物(包括小鼠、倉(cāng)鼠和大鼠)中，在兔、山羊或其他合適的動(dòng)物中引起抗體?？梢栽诤线m的宿主細(xì)胞例如細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達(dá)可溶性BLyS或BLyS受體多肽或其免疫原性片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，在大腸桿菌中產(chǎn)生人和鼠類(lèi)的經(jīng)去污劑增溶的全長(zhǎng)BLyS，并用于免疫接種和篩選產(chǎn)生BLyS抗體的雜交瘤。備選地，或者另外地，可以將在其細(xì)胞表面上表達(dá)BLyS或BLyS受體的B細(xì)胞或細(xì)胞系用于產(chǎn)生和/或篩選抗體。可用于產(chǎn)生抗體的其他形式的BLyS對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，例如噬菌體展示方法也可以用于產(chǎn)生BLyS結(jié)合抗體。結(jié)合BLyS或BLyS受體的抗體可以是嵌合的、人源化的或人的。此類(lèi)抗體和產(chǎn)生它們的方法在下面更詳細(xì)地進(jìn)4于描述。優(yōu)選地，通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑，在動(dòng)物體中引起多克隆抗體。將相關(guān)抗原綴合至在待進(jìn)行免疫接種的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)(例如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)可以是有用的，其中使用雙官能或衍生化試劑例如馬來(lái)酰亞氨基苯甲?；腔牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴(lài)氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12或R1N-C-NR,其中R和IT為不同的垸基。通過(guò)將例如100wu或5g的蛋白質(zhì)或綴合物(分別對(duì)于兔或小鼠)與3體積的弗氏完全佐劑相組合并在多個(gè)位點(diǎn)處皮內(nèi)注射溶液，而針對(duì)抗原、免疫原性綴合物或衍生物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。一個(gè)月后，用1/5至1/10原始量的在弗氏完全佐劑中的肽或綴合物，通過(guò)在多個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行皮下注射來(lái)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7至14天后，抽取動(dòng)物的血液，并就抗體滴度來(lái)分析血清。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫直至滴度的穩(wěn)定水平。優(yōu)選地，用相同的但綴合至不同蛋白質(zhì)和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑的抗原的綴合物來(lái)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。也可以在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來(lái)制備綴合物。此外，聚集劑(aggregatingagent)例如明礬也合適地用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。從基本上同質(zhì)的抗體的群體中獲得單克隆抗體，即包含該群體的那些獨(dú)個(gè)抗體是同樣的，除了可能的天然出現(xiàn)的突變外，所述突變可以以較少的量存在。因此，修飾詞"單克隆的"將抗體的特征指明為不是互不相關(guān)的抗體的混合物。例如，單克隆抗體可以通過(guò)使用首次由Kohler等人，Nature,256:495(1975)所描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567)來(lái)制備。在雜交瘤方法中，如上面所描述的，對(duì)小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物例如倉(cāng)鼠進(jìn)行免疫接種以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將會(huì)特異性地與用于免疫接種的蛋白質(zhì)結(jié)合。備選地，可以在體外對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫接種。然后，使用合適的融合試劑(例如聚乙二醇)，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合從而形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103頁(yè)(AcademicPress,1986))。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種在合適的培養(yǎng)基中并使其生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選地包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃噤呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶這種酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將會(huì)包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞為這樣的那些骨髓瘤細(xì)胞，所述骨髓瘤細(xì)胞有效地進(jìn)行融合，支持由所選擇的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定而高水平地產(chǎn)生抗體，并對(duì)培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感。在這些骨髓瘤細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系為鼠類(lèi)骨髓瘤系，例如源自MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤(從SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA可獲得)的那些，和SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞(從AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MarylandUSA可獲得)。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系也被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63頁(yè)(MarcelDekker，Inc.，NewYork,1987)。就針對(duì)所迷抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生而言，對(duì)其中正生長(zhǎng)著雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行分析。優(yōu)選地，通過(guò)免疫沉淀或者通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，例如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，來(lái)測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可以例如通過(guò)Munson等人，Anal.Biochem.，107:220(1980)的斯卡查德分析(Scatchardanalysis)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。在鑒定出了產(chǎn)生具有所希望的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，所述克隆可以通過(guò)有限稀釋程序進(jìn)行亞克隆并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行生長(zhǎng)(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,笫59-103頁(yè)(AcademicPress,1986))。用于該目的的合適的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可以作為在動(dòng)物中的腹水瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。合適地通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化程序例如A蛋白-Sepharose、羥基磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離出由亞克隆所分泌的單克隆抗體。通過(guò)使用常規(guī)的程序而容易地分離出編碼單克隆抗體的DNA并進(jìn)行測(cè)序(例如，通過(guò)使用能夠與編碼鼠類(lèi)抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性地結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞充當(dāng)此類(lèi)DNA的優(yōu)選的來(lái)源。一旦經(jīng)分離，就可以將DNA放置入表達(dá)載體中，隨后將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入否則不產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中，以獲得在重組宿主細(xì)胞中單克隆抗體的合成。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DM的綜述文章包括Skerra等人，Curr.OpinioninIm隨o1.,5:256-262(1993)，和Pluckthun，ImmunolRevs.，130:151-188(1992)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體或抗體片段可以分離自通過(guò)使用在McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)中所描述的技術(shù)而產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌體文庫(kù)來(lái)分別分離鼠類(lèi)和人抗體。隨后的出版物描迷了通過(guò)鏈改組(chainshuffling)(Marks等人,BiolZ'echraology，10:779-783(1992))，以及作為用于構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21:2265-2266(1993))，來(lái)產(chǎn)生高親和力(nM范圍)的人抗體。因此，這些技術(shù)是對(duì)于用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行的備選方案。還可以^修飾DM，例如，通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列代替同源的鼠類(lèi)序列(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567;Morrison等人，Proc.NatlAcad.Sci.USA,81:6851(1984))，或者通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分共價(jià)連接至編碼免疫球蛋白的序列。通常，用這樣的非免疫球蛋白多肽代替抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者用它們代替抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，從而形成嵌合的二價(jià)抗體，其包含一個(gè)對(duì)于抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和另一個(gè)對(duì)于不同抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。用于使非人抗體人源化的方法已在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述。優(yōu)選地，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)被從非人來(lái)源引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常被稱(chēng)作"輸入(import)，，殘基，其通常取自"輸入，，可變結(jié)構(gòu)域?？梢曰旧弦勒誛inter及合作者(Jones等人，Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))的方法，通過(guò)用高變區(qū)序列代替人抗體的相應(yīng)序列，來(lái)進(jìn)行人源化。因此，此類(lèi)"人源化"抗體為嵌合抗體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567)，其中，實(shí)質(zhì)上小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列所代替。實(shí)際上，人源化抗體通常為這樣的人抗體，其中某些高變區(qū)殘基和可能地某些FR殘基被來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體中的類(lèi)似位點(diǎn)的殘基所代替。待用于制備人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈)的選擇對(duì)于降低抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的"最佳適配(best-fit)"方法，針對(duì)已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫(kù)來(lái)對(duì)嚙齒動(dòng)物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列進(jìn)行篩選。然后，將最接近嚙齒動(dòng)物序列的人序列當(dāng)作用于人源化抗體的人構(gòu)架區(qū)(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等人，J.Mol.Biol.，196:901(1987))。另一種方法使用特定的構(gòu)架區(qū)，其源自輕鏈或重鏈的特定亞群的所有人抗體的共有序列。相同的構(gòu)架可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad,Sci.USA，89:4285(1992);Presta等人，J.Immunol.，15-1:2623(1993))。進(jìn)一步重要的是，可以在使抗體人源化的同時(shí)保留對(duì)于抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，根據(jù)優(yōu)選的方法，通過(guò)下列方法來(lái)制備人源化抗體，即使用親本和人源化序列的三維模型來(lái)分析親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)品。三維免疫球蛋白模型是通?？傻玫模⑶沂潜绢I(lǐng)域技術(shù)人所熟悉的。圖解并展示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可得的。檢查這些展示使得能夠分析所述殘基在候選免疫球蛋白序列的功能發(fā)揮中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方式，可以從受者和輸入序列中選擇出FR殘基并將它們相組合，從而獲得所希望的抗體特征，例如增加的對(duì)于耙抗原的親和力。一般地，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)上地參與影響抗原結(jié)合。作為人源化的一個(gè)備選方案，可以產(chǎn)生人抗體。例如，現(xiàn)在可以產(chǎn)生在免疫接種后能夠在沒(méi)有內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生人抗體的完全儲(chǔ)庫(kù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)。例如，已描述了，在嵌合的和種系突變型的小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變型小鼠中將會(huì)導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。參見(jiàn)例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA，90:2551(1993);Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等人，YearinI謹(jǐn)no.，7:33(1993);和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，591，669、5，589,369和5,545，807。備選地，可以使用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等人，Nature348:552-553(1990))來(lái)從來(lái)自未免疫接種的供者的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因儲(chǔ)庫(kù)中在體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)該技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因按閱讀框架克隆入絲狀噬菌體(例如，M13或fd)的大或小外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段而展示在噬菌體顆粒的表面上。因?yàn)樗鼋z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能特性的選擇也導(dǎo)致選擇出編碼顯示那些特性的抗體的基因。因此，所述噬菌體模擬了B細(xì)胞的某些特性。噬菌體展示可以以各種形式來(lái)施行；關(guān)于其綜述，參見(jiàn)例如Johnson,KevinS.和Chiswell，DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。V-基因區(qū)段的幾種來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)從V基因(源自經(jīng)免疫接種的小鼠的脾)的小隨機(jī)組合文庫(kù)中分離了各種各樣的一系列抗喁唑酮抗體?？梢詷?gòu)建來(lái)自未免疫接種的人供者的V基因儲(chǔ)庫(kù)，并且可以基本上依照由Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，或Griffith等人，薩0J.12:725-734(1993)所描述的技術(shù)，分離出針對(duì)各種各樣的一系列抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，565,332和5，573，905。也可以通過(guò)體外激活的B細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生人抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，567，610和5，229，275)。已開(kāi)發(fā)了各種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)地，經(jīng)由完整抗體的蛋白水解消化而得到這些片段(參見(jiàn)例如，Morimoto等人，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)，和Brennan等人，Science,229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可以通過(guò)重組宿主細(xì)胞而直接產(chǎn)生這些片段。例如，可以從上面所討論的抗體噬菌體文庫(kù)中分離出抗體片段。備選地，可以直接從大腸桿菌中回收Fab'-SH片段，并進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)從而形成F(abO;片段(Carter等人，Bio/Technology10:163-167(1992))。根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離出F(ab')2片段。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。在其他實(shí)施方案中，所選擇的抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見(jiàn)W093/16185;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，571，894;和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，587，458?？贵w片段還可以為"線(xiàn)性抗體"，例如，如在美國(guó)專(zhuān)利5，641，870中所描述的。此類(lèi)線(xiàn)性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。雙特異性抗體為對(duì)于至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可以與B細(xì)胞表面標(biāo)志物的兩種不同表位結(jié)合。其他的此類(lèi)抗體可以結(jié)合第一B細(xì)胞標(biāo)志物和進(jìn)一步結(jié)合第二B細(xì)胞表面標(biāo)志物。備選地，抗B細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)合臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子(triggeringmolecule)的臂相組合，所述觸發(fā)分子例如為T(mén)-細(xì)胞受體分子(例如，CD2或CD3)，或關(guān)于IgG的Fc受體(FcyR)，例如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)，以l更使細(xì)胞防御機(jī)制集中于B細(xì)胞。雙特異性抗體也可以用于將細(xì)胞毒劑定位至B細(xì)胞。這些抗體擁有結(jié)合B細(xì)胞標(biāo)志物的臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如，肥急草毒蛋白、抗干擾素、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？梢詫㈦p特異性抗體制備為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab02雙特異性抗體)。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)產(chǎn)生過(guò)程基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中該兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等人，Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化(其通常通過(guò)親和層析步驟來(lái)進(jìn)行)是相當(dāng)繁瑣的，并且產(chǎn)物產(chǎn)量低。在WO93/08829中，和在Traunecker等人，EMB0J.，10:3655-3659(1991)中公開(kāi)了相似的程序。根據(jù)一種不同的方法，將具有所希望的結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))融合至免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。優(yōu)選地，該融合物具有包含至少一部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的是，具有第一重鏈恒定區(qū)(CH1)，其包含對(duì)于在所述融合物的至少一個(gè)中存在的輕鏈結(jié)合而言所必需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物(和免疫球蛋白輕鏈，如果需要)的DNA插入到分開(kāi)的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。這在當(dāng)在構(gòu)建中所使用的不等比率的三種多肽鏈提供了最佳產(chǎn)量這樣的實(shí)施方案中，在調(diào)整所述三種多肽片段的相互比例方面提供了極大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩種多肽鏈以等比率進(jìn)行表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量或者當(dāng)所述比率不是特別重要時(shí)，可以將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入到一個(gè)表達(dá)載體中。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗體由在一個(gè)臂中的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和在另一個(gè)臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)有助于將所希望的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開(kāi)，因?yàn)閮H在所述雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供了一種容易做到的分離方式。該方法公開(kāi)在WO94/04690之中。關(guān)于產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)例如Suresh等人，MethodsinEnzymology，121:210(1986)。根據(jù)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，731,168中所描迷的另一種方法，可以改造抗體分子對(duì)之間的界面以使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面至少包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域的部分。在該方法中，來(lái)自第一抗體分子的界面的一個(gè)或多個(gè)小的氨基酸側(cè)鏈被更大的側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通過(guò)用更小的氨基酸側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)替代大的氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生具有與所述大側(cè)鏈相同或相似的大小的補(bǔ)償性"空穴"。這為將異二聚體的產(chǎn)量增加超過(guò)其他不想要的最終產(chǎn)物(例如同二聚體)提供了機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的抗體或"雜綴合物(heteroconjugate)"抗體。例如，可以將雜綴合物中的抗體之一偶聯(lián)至抗生物素蛋白，另一個(gè)偶聯(lián)至生物素。此類(lèi)抗體例如已被建議用于使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，676，980)，和用于治療HIV感染(W091/00360、W092/200373和EP03089)?？梢允褂萌魏魏?jiǎn)便的交聯(lián)方法來(lái)制備雜綴合物抗體。合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，676，980中與許多交聯(lián)技術(shù)一起被公開(kāi)。用于從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)已在文獻(xiàn)中作了描述。例如，可以采用化學(xué)連接來(lái)制備雙特異性抗體。Brennan等人，Science,229:81(1985)描述了其中對(duì)完整抗體進(jìn)行蛋白水解切割以產(chǎn)生F(ab')2片段的程序。在二巰基絡(luò)合劑((Uthiolcomplexingagent)亞砷酸鈉存在下使這些片段還原，以穩(wěn)定鄰近的二巰基和防止分子間二硫化物的形成。然后，將所產(chǎn)生的FaV片段轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然后，通過(guò)用巰基乙胺進(jìn)行還原而將Fab'-TNB衍生物之一再轉(zhuǎn)變成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一Fab'-TNB衍生物相混合以形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可以被用作用于酶的選擇性固定化的試劑。最近的進(jìn)展已促進(jìn)了從大腸桿菌中直接回收FaV-SH片段，所述Fab'-SH片段可以進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Sha1aby等人，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(abO2分子的產(chǎn)生。每個(gè)FaV片段分開(kāi)地從大腸桿菌中分泌，并在體外經(jīng)歷直接化學(xué)偶聯(lián)而形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠與過(guò)表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞結(jié)合，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)于人乳腺腫瘤靶標(biāo)的裂解活性。還已描述了用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)。例如，已通過(guò)使用亮氨酸拉鏈來(lái)產(chǎn)生了雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通過(guò)基因融合將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接至兩個(gè)不同抗體的Fab'部分。在鉸鏈區(qū)使抗體同二聚體還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。該方法也可以用于產(chǎn)生抗體同二聚體。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)所描述的"雙抗體"技術(shù)為制備雙特異性抗體片段提供了備選的機(jī)制。所述片段包含通過(guò)連接體而聯(lián)接至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，所述連接體太短以致不能允許在同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行配對(duì)。因此，一個(gè)片段的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一個(gè)片段的互補(bǔ)的VL和VH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了用于通過(guò)使用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(jiàn)Gruber等人，J.Immunol,152:5368(1994)?？紤]了具有超過(guò)兩價(jià)的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)。考慮了此處所描述的蛋白質(zhì)或肽拮抗劑和抗體的氨基酸序列修飾。例如，可以希望改善BLYS結(jié)合抗體或拮抗劑的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)特性。通過(guò)將合適的核苷酸變化引入拮抗劑核酸中，或者通過(guò)肽合成，來(lái)制備拮抗劑的氨基酸序列變體。此類(lèi)修飾包括，例如在拮抗劑的氨基酸序列中的殘基的刪除和/或插入和/或置換。進(jìn)行刪除、插入和置換的任何組合以獲得最終的構(gòu)建體，條件是所述最終的構(gòu)建體擁有所希望的特征。氨基酸變化還可以改變拮抗劑的翻譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。用于鑒定拮抗劑的作為優(yōu)選的誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種有用方法稱(chēng)為"丙氨酸掃描誘變法"，如由Cunningham和Wells，Science,244:1081-1085(1989)所描述的。在此，鑒定出一個(gè)或一組耙殘基(例如，帶電荷的殘基例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選地，丙氨酸或聚丙氨酸)來(lái)替代之以影響所述氨基酸與抗原的相互作用。然后，通過(guò)在置換位點(diǎn)處或者為置換位點(diǎn)引入進(jìn)一步的或其他的變體，來(lái)對(duì)那些顯示出對(duì)于置換的功能敏感性的氨基酸位置進(jìn)行細(xì)化。因此，雖然用于引入氨基酸序列變化的位點(diǎn)是預(yù)先確定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先確定。例如，為了分析在給定位點(diǎn)處的突變的性能，在靶密碼子或區(qū)域處進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并且就所希望的活性來(lái)對(duì)所表達(dá)的拮抗劑變體進(jìn)行篩選。氨基酸序列插入包括長(zhǎng)度為一個(gè)殘基到包含成百或更多殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或者融合至細(xì)胞毒性多肽的拮抗劑。拮抗劑分子的其他插入性變體包括將酶或增加拮抗劑的血清半衰期的多肽融合至拮抗劑的N-或C-末端。另一種類(lèi)型的變體是氨基酸置換變體。這些變體具有至少一個(gè)在拮抗劑分子中的被不同殘基替代的氨基酸殘基。最令人感興趣的用于抗體拮抗劑的置換誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也考慮FR改變。保守置換顯示在表l中的標(biāo)題"優(yōu)選的置換"之下。如果此類(lèi)置換導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化，那么可以引入更多的實(shí)質(zhì)性變化(在表l中命名為"示例性的置換"，或如在下文中關(guān)于氨基酸類(lèi)別而進(jìn)一步描述的)，并篩選產(chǎn)物。拮抗劑的生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾通過(guò)選擇這樣的置換來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述置換在它們對(duì)于維持下列方面的影響方面顯著不同(a)置換區(qū)域中的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，作為片層或螺旋構(gòu)象，(b)所述分子在靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性，或者(c)側(cè)鏈的體積?；诠灿械膫?cè)鏈特性，將天然出現(xiàn)的殘基分成組(l)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性且親水性的cys、ser、thr;(3)酸性的asp、glu;(4)堿性的asn、gln、his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基gly、pro;和(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守置換將會(huì)導(dǎo)致這些類(lèi)別之一的成員交換成另一類(lèi)別的成員。還可以置換不參與維持拮抗劑的正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基(通常用絲氨酸來(lái)置換)，以改善所述分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常的交聯(lián)。反過(guò)來(lái)，可以向拮抗劑添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)所述拮抗劑為抗體片段例如Fv片段時(shí))。置換變體的一種特別優(yōu)選的類(lèi)型牽涉置換親本抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。一般地，所得的被選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的變體將會(huì)具有相對(duì)于親本抗體(它們從中產(chǎn)生)而言經(jīng)改善的生物學(xué)特性。用于產(chǎn)生此類(lèi)置換變體的一種簡(jiǎn)便的方法為通過(guò)使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，使幾個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如，6-7個(gè)位點(diǎn))發(fā)生突變以在每個(gè)位點(diǎn)處產(chǎn)生所有可能的氨基酸置換。作為包裝在每個(gè)顆粒中的與M13的基因III產(chǎn)物的融合物，將如此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)方式從絲狀噬菌體顆粒進(jìn)行展示。然后，就此處所公開(kāi)的其生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力)對(duì)經(jīng)噬菌體展示的變體進(jìn)行篩選。為了鑒定出用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對(duì)于抗原結(jié)合作出顯著貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基。備選地，或者另外地，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定出抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。此類(lèi)接觸殘基和相鄰殘基是用于置換的候選者，根據(jù)此處所闡述的技術(shù)。一旦產(chǎn)生了此類(lèi)變體，就使變體小組經(jīng)歷此處所描述的篩選，并且可以在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)測(cè)定法中選擇出具有優(yōu)異特性的抗體以用于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)。拮抗劑的另一種類(lèi)型的氛基酸變體改變拮抗劑的原始糖基化模式。"改變"意味著刪除一個(gè)或多個(gè)在所述拮抗劑中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物部分，和/或添加一個(gè)或多個(gè)在所述拮抗劑中不存在的糖基化位點(diǎn)。多肽的糖基化通常為N-聯(lián)或O-聯(lián)的。N-聯(lián)是指碳水化合物部分附著至天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列"天冬酰胺-X-絲氨酸"和"天冬酰胺-X-蘇氨酸，，(其中，X為除了脯氨酸之外的任意氨基酸)為碳水化合物部分酶促附著至天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，這些三肽序列中的任一個(gè)在多肽中的存在形成了潛在的糖基化位點(diǎn)。0-聯(lián)糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖這些糖之一附著至羥基氨基酸，最通常為絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴(lài)氨酸。通過(guò)改變氨基酸序列從而使得其包含一個(gè)或多個(gè)上面所描述的三肽序列，方便地實(shí)現(xiàn)向拮抗劑添加糖基化位點(diǎn)(對(duì)于N-聯(lián)糖基化位點(diǎn))。所述改變也可以通過(guò)向原始拮抗劑的序列添加一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基或者用一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基進(jìn)行置換來(lái)進(jìn)行(對(duì)于0-聯(lián)糖基化位點(diǎn))。通過(guò)各種本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)制備編碼拮抗劑的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源中分離(在天然出現(xiàn)的氨基酸序列變體的情況下)，或者通過(guò)早先制備的變體或非變體形式的拮抗劑的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變(或位點(diǎn)定向誘變)、PCR誘變和盒式誘變進(jìn)行制備?？梢韵Ｍ托?yīng)子功能對(duì)本發(fā)明的拮抗劑進(jìn)行修飾，例如，以便增強(qiáng)拮抗劑的依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或依賴(lài)補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。這可以通過(guò)在抗體拮抗劑的Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換來(lái)達(dá)到。備選地，或者另外地，可以將半胱氨酸殘基引入到Fc區(qū)中，從而允許在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或增加的由補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron等人，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。還可以使用在Wolff等人，CancerResearch53:2560-2565(1993)中所描述的異雙官能交聯(lián)劑來(lái)制備具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體。備選地，可以改造出這樣的抗體，其具有雙重Fc區(qū)并由此可以具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解和ADCC能力。參見(jiàn)Steve扁n等人，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。為了增加拮抗劑的血清半衰期，可以將補(bǔ)救受體結(jié)合表位(salvagereceptorbindingepitope)捧入到戶(hù)斤述枯抗齊'J(尤其是抗體片段)中，例如，如在美國(guó)專(zhuān)利5，739,277中所描述的。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"是指IgG分子(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)的這樣的表位，其負(fù)責(zé)增加所述IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。測(cè)定法通過(guò)計(jì)數(shù)003-/0040+細(xì)胞的？人03方法來(lái)測(cè)定外周8-細(xì)胞濃度?？梢酝ㄟ^(guò)下述的門(mén)控(gating)策略來(lái)獲得樣品中總淋巴細(xì)胞的CD3-CD40+B細(xì)胞百分比。在前向散射/側(cè)向散射散射圖上對(duì)淋巴細(xì)胞群進(jìn)行標(biāo)記以定義區(qū)域1(RU。通過(guò)使用RI中的事件，關(guān)于CD"和CD3標(biāo)志物，展示出熒光密度點(diǎn)圖。使用經(jīng)熒光標(biāo)記的同種型對(duì)照來(lái)確定關(guān)于CD40和CD3陽(yáng)性的各自的截止點(diǎn)。FACS分析洗滌50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞并重懸浮于1001的FACS緩沖液中，所述FACS緩沖液為具有1%BSA的磷酸緩沖鹽水，其包含5ul的染色或?qū)φ湛贵w。所有染色抗體(包括同種型對(duì)照)從PharMingen，SanDiego，CA獲得。通過(guò)用Rituxan(美羅華)以及綴合有FITC的抗人IgGl二抗進(jìn)行染色來(lái)評(píng)估人BLYS表達(dá)。使用FACScan和Cel1Quest(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose，CA)來(lái)進(jìn)行FACS分析。以前向和側(cè)向光散射來(lái)定義所有淋巴細(xì)胞，而用細(xì)胞表面上B220的表達(dá)來(lái)定義所有B淋巴細(xì)胞。通過(guò)下列方式來(lái)評(píng)估B細(xì)胞耗竭和回收在注射后第一周每天和此后每周，分析外周B細(xì)胞計(jì)數(shù)和用FACS分析脾、淋巴結(jié)和骨髓中的hBLYS+B細(xì)胞。監(jiān)測(cè)所注射的2H7變體抗體的血清水平。藥物制劑通過(guò)將具有所希望的純度的抗體與可選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)、定齊寸(Reraitgtorz'sPhamamaceuticalScience,第16版，Osol，A.編輯(198(J))相混合，以?xún)龈芍苿┗蛩芤旱男问街苽銪LyS和/或APRIL拮抗劑(例如根據(jù)本發(fā)明所使用的BLyS結(jié)合抗體)的治療制劑，以用于貯藏?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度下對(duì)于受者是無(wú)毒的，并且包括緩沖液，例如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如氯化十八烷基二甲基千基銨；六甲氯銨；苯扎氯銨，芐索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯類(lèi)，例如對(duì)羥基苯曱酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、雙糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA;糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。此處的制劑還可以包含超過(guò)一種活性化合物(對(duì)于正進(jìn)行治療的特定適應(yīng)癥而言所需要的)，優(yōu)選地為具有不會(huì)不利地相互影響的互補(bǔ)活性的那些。例如，可以希望進(jìn)一步提供細(xì)胞毒劑、化學(xué)治療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑(例如，作用于T細(xì)胞的那種，例如環(huán)孢菌素，或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，例如結(jié)合LFA-1的那種)。此類(lèi)其他試劑的有效量依賴(lài)于存在于制劑中的抗體的量、疾病或病癥或者治療的類(lèi)型、和其他上面所討論的因素。一般地，這些試劑以相同的劑量和用此處所描述的施用途徑，或者以約1至99%的迄今所采用的劑量進(jìn)行使用。還可以將活性成分包載入例如通過(guò)凝聚(coacervation):技術(shù)或通過(guò)界面聚合而制備的微膠嚢中，例如，分別為羥甲基纖維素或明膠微膠嚢和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠嚢，包載入膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳狀液、納米顆粒和納米膠嚢)中，或者包載入粗乳狀液中。此類(lèi)技術(shù)公開(kāi)在Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol，A.編輯(1980)中?？梢灾苽渚忈屩苿＞忈屩苿┑暮线m例子包括包含拮抗劑的固體疏水性聚合物的半滲透性基體，所述基體以成形的物品例如膜或微膠嚢的形式存在。緩釋基體的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，773,919)、L谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRONDEPOT(可注射的微球，其由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這經(jīng)由通過(guò)無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾而容易地實(shí)現(xiàn)。疾病治療疾病本發(fā)明的免疫抑制藥物和BLyS和/或APRIL拮抗劑可用于治療由B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥。由B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病包括關(guān)節(jié)炎(類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，青少年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎)，銀屑病，皮炎(包括特應(yīng)性皮炎)；慢性自身免疫性蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮壞死溶解，全身性硬皮病和硬化，與炎癥性腸病(IBD)(克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎)相關(guān)的反應(yīng)，呼吸窘迫綜合征，成人型呼吸窘迫綜合征(ARDS)，腦膜炎，變應(yīng)性鼻炎，腦炎，葡萄膜炎，結(jié)腸炎，腎小球腎炎，過(guò)敏性病狀，濕疹，哮喘，牽涉T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎癥反應(yīng)的病狀，動(dòng)脈粥樣硬化，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，狼疳(包括腎炎，非腎的，盤(pán)狀的，脫發(fā))，青少年糖尿病，多發(fā)性硬化癥，變應(yīng)性腦脊髓炎，與由細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答，結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，肉芽肺病(包括韋格納肉芽肺病)，粒細(xì)胞缺乏，脈管炎(包括ANCA)，再生障礙性貧血，Coombs陽(yáng)性貧血，戴-布貧血，免疫性溶血性貧血(包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA))，惡性貧血，純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性中性白細(xì)胞減少癥，各類(lèi)血細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少癥，牽涉白細(xì)胞滲出的疾病，CNS炎性病癥，多器官損傷綜合征，重癥肌無(wú)力，由抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，Bechet病，卡斯?fàn)柭C合征，蘭-伊肌無(wú)力綜合征，Reynaud，s綜合征，Sjorgen's綜合征，斯-約綜合征，固體器官移植排斥(包括關(guān)于高小組反應(yīng)性抗體(highpanelreactiveantibody)滴度，IgA在組織中的沉積等的預(yù)處理)，移植物抗宿主病(GVHD)，大皰性類(lèi)天皰瘡，天皰瘡(所有的，包括尋常性的，落葉性的)，自身免疫性多內(nèi)分泌腺病，賴(lài)特爾病，僵人綜合征，巨細(xì)胞動(dòng)脈炎，免疫復(fù)合物腎炎，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病或由IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP),自身免疫性血小板減少癥，睪丸和卵巢的自身免疫疾病(包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎)，原發(fā)性甲狀腺機(jī)能減退；自身免疫性?xún)?nèi)分泌疾病，包括自身免疫性甲狀腺炎，慢性甲狀腺炎(橋本曱狀腺炎)，亞急性曱狀腺炎，特發(fā)性曱狀腺機(jī)能減退，艾迪生病，格雷夫斯病，自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)，I型糖尿病(也稱(chēng)為胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM))和希恩綜合征；自身免疫性肝炎，淋巴樣間質(zhì)性肺炎(HIV)，閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植的)對(duì)NSIP，吉-巴綜合征，大血管脈管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安)動(dòng)脈炎，中血管脈管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)，強(qiáng)直性脊椎炎，貝格爾病(IgA病)，急進(jìn)性腎小球腎炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，乳糜瀉(麩質(zhì)性腸病)，冷球蛋白血癥，ALS，冠狀動(dòng)脈疾病。所希望的B-細(xì)胞耗竭水平將依賴(lài)于疾病。優(yōu)選地，B細(xì)胞耗竭足以阻止疾病進(jìn)展至少2個(gè)月，更優(yōu)選地3個(gè)月，更加優(yōu)選地4個(gè)月，更優(yōu)選地5個(gè)月，更加優(yōu)選地6個(gè)或更多個(gè)月。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，B細(xì)胞耗竭足以使緩解時(shí)間增加至少6個(gè)月，更優(yōu)選地9個(gè)月，更優(yōu)選地l年，更優(yōu)選地2年，更優(yōu)選地3年，更加優(yōu)選地5或更多年。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，B細(xì)胞耗竭足以治愈所述疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，自身免疫患者中的B細(xì)胞耗竭至少暫時(shí)地為治療前基線(xiàn)水平的約75%，和更優(yōu)選地80%、85%、亂95%、99%和甚至100%。對(duì)于治療自身免疫疾病，可以希望通過(guò)調(diào)整免疫抑制藥物或者BLyS和/或APRIL拮抗劑的劑量而根據(jù)所述疾病和/或個(gè)體患者中病狀的嚴(yán)重度來(lái)調(diào)節(jié)B細(xì)胞耗竭的程度。因此，B細(xì)胞耗竭可以但并非必須是完全的。或者，在初始治療中可以希望全部的B細(xì)胞耗竭，但在隨后的治療中可以調(diào)整劑量以達(dá)到僅部分的耗竭。在一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞耗竭為至少20%,即相比于治療前的基線(xiàn)水平而言保留了80%或更少的B-細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，B-細(xì)胞耗竭為25。/。、30%、40%、50%、60%、70%或更大。優(yōu)選地，B細(xì)胞耗竭足以使所述疾病的進(jìn)展停止，更優(yōu)選地，減輕處于治療下的特定疾病的征候和癥狀，更加優(yōu)選地，治愈所述疾病。對(duì)于治療應(yīng)用，本發(fā)明的免疫抑制藥物和BLyS和/或APRIL拮抗劑組合物可以以與另外的藥物例如抗炎藥(包括DMARDS和其他生物制品)的聯(lián)合療法形式進(jìn)行使用。前面的治療方法可以與用于自身免疫疾病的其他形式的常規(guī)療法相聯(lián)合地施行，與常規(guī)療法相連續(xù)地、在常規(guī)療法之前或在常規(guī)療法之后。如果在施用了本發(fā)明的組合物后相比于治療前而言在癥狀或其他適用的標(biāo)準(zhǔn)方面存在有可測(cè)量的改善，那么通過(guò)本發(fā)明的方法減輕了或成功地治療了患者的由B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病。治療的效果可以在施用本發(fā)明的組合物之后3-10周內(nèi)是明顯的。每種疾病的適用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于相稱(chēng)領(lǐng)域中的專(zhuān)業(yè)醫(yī)生來(lái)說(shuō)將是熟知的。例如，醫(yī)生可以就疾病的臨床或血清學(xué)證據(jù)(例如，疾病的血清學(xué)標(biāo)志物、全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(包括B細(xì)胞計(jì)數(shù))和血清免疫球蛋白水平)來(lái)對(duì)所治療的患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)。療的小鼠中降低。同樣地，響應(yīng)于atacicept治療的人患者顯示出血清IgG和IgM水平的降低。用于評(píng)估自身免疫疾病或自身免疫相關(guān)疾病的治療的功效或成功的參數(shù)對(duì)于相稱(chēng)疾病中的專(zhuān)業(yè)醫(yī)生來(lái)說(shuō)將是已知的。一般地，專(zhuān)業(yè)醫(yī)生將會(huì)期望所述特定疾病的征候和癥狀的減少。下面通過(guò)實(shí)例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因?qū)W未知的自身免疫病癥。大多數(shù)RA患者遭受疾病的慢性過(guò)程，其(甚至在接受治療的情況下)可以導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞、變形、殘疾和甚至過(guò)早死亡。RA療法的目標(biāo)為防止或控制關(guān)節(jié)損傷、防止功能喪失和減少疼痛。RA的初始療法常常牽涉施用一種或多種下列藥物非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAID)、糖皮質(zhì)激素(經(jīng)由關(guān)節(jié)注射)和低劑量潑尼松。參見(jiàn)"Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis"Arthritis&Rhemmatism46(2):328-346(2002年2月)。大多數(shù)具有新診斷的RA的患者在診斷3個(gè)月之內(nèi)以疾病緩解抗風(fēng)濕藥(DMARD)療法開(kāi)始。通常在RA中使用的DMARD為羥氯喹、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、來(lái)氟米特、依那西普、英利昔單抗(+口服和皮下的氨曱蝶呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金制劑(Gold)(口服)、金制劑(肌內(nèi))、米諾環(huán)素、環(huán)孢菌素、葡萄球菌A蛋白免疫吸附。因?yàn)樵赗A期間機(jī)體產(chǎn)生腫瘤壞死因子a(TNFa)，所以已將TNFa抑制劑用于該疾病的治療。依那西普(ENBREL)是一種在美國(guó)被批準(zhǔn)用于活動(dòng)性RA的治療的可注射藥物。依那西普與TNFa結(jié)合并用于從關(guān)節(jié)和血液中移除大多數(shù)的TNFa，從而防止TNFa促進(jìn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥和其他癥狀。依那西普是一種"Fc-融合蛋白"融合蛋白質(zhì)，其由連接至人IgGl的Fc部分的人75kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細(xì)胞外配體結(jié)合部分組成。英利昔單抗(以商品名REMICADE進(jìn)行銷(xiāo)售)是一種規(guī)定用于治療RA和克羅恩病的免疫抑制藥物。英利昔單抗是與TNF結(jié)合的嵌合單克隆抗體，并且通過(guò)靶向并結(jié)合產(chǎn)生炎癥的TNFa來(lái)減少體內(nèi)的炎癥。阿達(dá)木單抗(HUMIRATM，AbbottLaboratories)(以前稱(chēng)為D2E7)是一種人單克隆抗體，其與TNFa結(jié)合，并被批準(zhǔn)用于在具有中等至嚴(yán)重活動(dòng)性RA的成人(其對(duì)于一種或多種傳統(tǒng)的疾病緩解性DMARD具有不足的應(yīng)答)中減少征候和癥狀以及抑制結(jié)構(gòu)損傷的進(jìn)展。通過(guò)施用免疫抑制藥物和BLyS和/或APRIL拮抗劑來(lái)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可以與使用一種或多種前面所提及的用于RA的藥物的療法相聯(lián)合地施行。對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，例如，治療進(jìn)展的測(cè)量可以包括腫脹和觸痛的關(guān)節(jié)的數(shù)目和晨僵的時(shí)長(zhǎng)?？梢酝ㄟ^(guò)使用X-射線(xiàn)和稱(chēng)為Sharp得分的評(píng)分系統(tǒng)，就手和腳中有多少關(guān)節(jié)已被侵蝕來(lái)對(duì)患者進(jìn)行檢查。另一種評(píng)分系統(tǒng)基于用于評(píng)估對(duì)療法的應(yīng)答的美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(AmericanCollegeofRheumatology)標(biāo)準(zhǔn)。一種用于評(píng)價(jià)在RA中的治療功效的方法基于美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)標(biāo)準(zhǔn)，其尤其測(cè)量在觸痛和腫脹的關(guān)節(jié)方面改善的百分比。例如，相比于無(wú)抗體治療(例如，治療前的基線(xiàn))或用安慰劑的治療而言，RA患者可以被評(píng)分為ACR20(20%的改善)。用于評(píng)價(jià)抗體治療的功效的其他方式包括X-射線(xiàn)評(píng)分，例如SharpX-射線(xiàn)得分，其用于對(duì)結(jié)構(gòu)損傷例如骨質(zhì)侵蝕和關(guān)節(jié)空間變窄進(jìn)行評(píng)分。還可以在治療期間或治療后的時(shí)間段，基于健康評(píng)估調(diào)查表(HealthAssessmentQuestionnaire[HAQ])得分、AIMS得分、SF-36,就殘疾的防止或改善來(lái)對(duì)患者進(jìn)行評(píng)價(jià)。ACR20標(biāo)準(zhǔn)可以包括觸痛的(疼痛的)關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)和腫脹的關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)改善了20%+5個(gè)另外的測(cè)量中的至少3個(gè)改善了20%:1.患者的疼痛評(píng)估，通過(guò)直觀模擬標(biāo)尺(visualanalogscale,VAS),2.疾病活動(dòng)性的患者的總體評(píng)估(VAS)，3.疾病活動(dòng)性的醫(yī)生的總體評(píng)估(VAS)，4.通過(guò)健康評(píng)估調(diào)查表而測(cè)量的患者的自我評(píng)估的殘疾，和5.急性期反應(yīng)物，CRP或ESR。ACR50和70類(lèi)似地進(jìn)行定義。優(yōu)選地，給患者施用對(duì)于達(dá)到至少ACR20的得分，優(yōu)選地至少ACR30，更優(yōu)選地至少ACR50，更加優(yōu)選地至少ACR70，最優(yōu)選地至少ACR75和更高得分而言有效的量的本發(fā)明的BLYS結(jié)合抗體。銀屑病關(guān)節(jié)炎具有獨(dú)特和明顯的放射攝影術(shù)特征。對(duì)于銀屑病關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)侵蝕和關(guān)節(jié)空間變窄也可以通過(guò)Sharp得分來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)?？稍摬“Y的疾病征4矣和癥狀。本發(fā)明的另外一個(gè)方面為通過(guò)給患有SLE的患者施用治療有效量的本發(fā)明的與免疫抑制藥物相組合的BLyS和/或APRIL拮抗劑來(lái)治療狼疳或SLE的方法。SLEDAI得分提供了疾病活動(dòng)性的數(shù)值定量。SLEDAI是已知與疾病活動(dòng)性相關(guān)的24個(gè)臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的加權(quán)指數(shù)，具有0-103的數(shù)值范圍。參見(jiàn)BryanGescuk或JohnDavis,"Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus",CurrentOpinioninRheumatology2002，14:515-521。針對(duì)雙鏈DNA的抗體被認(rèn)為引起狼瘡的腎臟突發(fā)(renalflare)和其他表現(xiàn)。可以就腎臟突發(fā)所需時(shí)間來(lái)對(duì)經(jīng)歷抗體治療的患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述腎臟突發(fā)被定義為尿中的血清肌酸酐、尿蛋白和血液的顯著且可重現(xiàn)的增加。備選地或者另外地，可以就抗核抗體和針對(duì)雙鏈DNA的抗體來(lái)對(duì)患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)。對(duì)SLE的治療包括高劑量的皮質(zhì)類(lèi)固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡，可以就抗核抗體和針對(duì)雙鏈DNA的抗體的水平來(lái)對(duì)患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本發(fā)明的一個(gè)特別的方面為用免疫抑制藥物與BLyS和/或APRIL拮抗劑(例如atacicept)的組合來(lái)治療狼瘡腎炎。脊推關(guān)節(jié)病是一組關(guān)節(jié)病癥，包括強(qiáng)直性脊推炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和克羅恩病。治療的成功可以通過(guò)經(jīng)驗(yàn)證的患者和醫(yī)生總體評(píng)估測(cè)量工具來(lái)進(jìn)行測(cè)定。可以通過(guò)使用本發(fā)明的方法來(lái)治療的其他自身免疫疾病為銀屑病。目前，使用各種藥療法來(lái)治療銀屑病；治療直接地與疾病嚴(yán)重性相關(guān)地而不同。具有更溫和形式的銀屑病的患者通常采用局部治療(例如局部的類(lèi)固醇、蒽林、卡泊三烯、氯倍他索和他扎羅汀)來(lái)對(duì)付該疾病，而具有中等和嚴(yán)重銀屑病的患者更可能釆用全身性療法(氨甲蝶呤、類(lèi)視黃醇、環(huán)孢菌素、PLTVA和UVB)。還使用焦油。這些療法具有治療的安全性的關(guān)注、耗時(shí)的制度或不方便的過(guò)程的組合。而且，有些需要昂貴的設(shè)備和診所布置中的專(zhuān)用空間。全身性的藥療法可產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，包括高血壓、高脂血癥、骨髓抑制、肝病、腎病和胃腸不適。此外，光療法的使用可能增加皮膚癌的發(fā)病率。除了與使用局部療法相關(guān)的不方便和不舒適之外，光療法和全身性治療還由于其副作用而需要使患者在進(jìn)行治療和不進(jìn)行治療之間循環(huán)，并監(jiān)測(cè)終生暴露量(lifetimeexposure)。銀屑病的治療功效通過(guò)監(jiān)測(cè)相比于基線(xiàn)狀況而言該疾病的臨床征候和癥狀的改變來(lái)進(jìn)行評(píng)估，包括醫(yī)生的總體評(píng)估(Physician'sGlobalAssessment,PGA)變化和《艮屑病面積和嚴(yán)重度指數(shù)(PsoriasisAreaandSeverityIndex,PASI)得分、銀屑病癥狀評(píng)估(PsoriasisSymptomAssessment,PSA)?？梢酝ㄟ^(guò)在直觀模擬標(biāo)尺上進(jìn)行處理來(lái)周期性地對(duì)患者進(jìn)行測(cè)量，所述直觀模擬標(biāo)尺用于指明在特定時(shí)間點(diǎn)處所經(jīng)歷的瘙癢的程度。具有自身免疫性起因的各種其他炎性疾病也在本治療方法的范圍之內(nèi)。其中特別考慮的疾病為自身免疫性肝炎和自身免疫性曱狀腺炎。自身免疫性肝炎牽涉由于患者自己的免疫系統(tǒng)進(jìn)行自身攻擊而引起的肝臟的炎癥。類(lèi)似地，甲狀腺的自身攻擊和所導(dǎo)致的炎癥是自身免疫性曱狀腺炎的生物學(xué)原因。預(yù)期諸如此類(lèi)的疾病通過(guò)使用BLyS和/或APRIL拮抗劑與免疫抑制藥物(例如匪F)的組合而得到減輕。按劑量給藥(dosing)依賴(lài)于待治療的適應(yīng)癥和本領(lǐng)域?qū)I(yè)醫(yī)生所熟悉的與按劑量給藥相關(guān)的因素，本發(fā)明的BLyS和/或APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物將以這樣的劑量來(lái)施用，所述劑量對(duì)于治療該適應(yīng)癥來(lái)說(shuō)是有效的，而同時(shí)最小化毒性和副作用。一般地，本發(fā)明的BLyS和/或APRIL拮抗劑將以約O.25mg/kg體重至約25mg/kg體重，優(yōu)選地約lrag/kg至約10mg/kg的劑量范圍施用給人患者。換另一種方式進(jìn)行表述，BLyS和/或APRIL拮抗劑的優(yōu)選劑量范圍為約75至約190mg/劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)于BLyS和/或APRIL拮抗劑，劑量為約150mg/劑。本發(fā)明的治療方法包括同時(shí)和順次地施用免疫抑制藥物和BLyS和/或APRIL拮抗劑(在此均稱(chēng)為"治療部分")的組合。在順次施用中，所述治療部分可以以任一種順序進(jìn)行施用，即先施用免疫抑制藥物，隨后施用BLyS和/或APRIL拮抗劑。患者可以用一種藥物進(jìn)行治療，并就面對(duì)用該種藥物進(jìn)行治療的功效進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如，如果免疫抑制藥物產(chǎn)生了部分的應(yīng)答，那么可以用BLyS和/或APRIL拮抗劑繼續(xù)進(jìn)行治療以獲得完全的應(yīng)答，反之亦然。備選地，起初可以給患者施用這兩種藥物，隨后可以只用一種藥物或另一種藥物進(jìn)行按劑量給藥。為了使患者適應(yīng)于耐受所述藥物和/或減少由于治療化合物的初始和后續(xù)施用而引起的不良反應(yīng)(例如與輸注相關(guān)的癥狀)的出現(xiàn)，可以給有此需要的哺乳動(dòng)物施用第一或初始調(diào)適劑量的所述一種或兩種藥物，然后施用至少第二治療有效劑量的所述一種或兩種藥物，其中第二和任何后續(xù)的劑量比第一劑量高。第一劑量用于使哺乳動(dòng)物適應(yīng)于耐受更高的第二治療劑量。如此，所述哺乳動(dòng)物能夠耐受比在初始時(shí)可施用的更高的劑量的治療化合物。"調(diào)適劑量(conditioningdose)"為這樣的劑量，其減弱或降低與施用治療化合物相關(guān)的首次劑量不良副作用的頻率或嚴(yán)重度。調(diào)適劑量可以為治療劑量、亞治療劑量、癥狀劑量(symptomaticdose)或亞癥狀劑量(sub-symptomaticdose)。治療劑量為對(duì)于患者展現(xiàn)出治療效應(yīng)的劑量，和亞治療劑量為對(duì)于所治療的患者不展現(xiàn)出治療效應(yīng)的劑量。癥狀劑量為在施用時(shí)引起至少一種不良反應(yīng)的劑量，和亞癥狀劑量為不引起不良反應(yīng)的劑量。一些不良反應(yīng)為發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難、肌痛和寒戰(zhàn)。64除了調(diào)適劑量給藥方案之外，還有許多可以采用以達(dá)到本發(fā)明的疾病減輕的其他給藥方案。一種這樣的方法為用一種免疫抑制藥物進(jìn)行短期治療，接著逐漸減少，隨后用另一種免疫抑制藥物與BLyS和/或APRIL拮抗劑的組合進(jìn)行治療。例如，可以通過(guò)在4周內(nèi)每天兩次口服來(lái)給予1000-1500mg皮質(zhì)類(lèi)固醇，隨后在10周的過(guò)程中從5mg/周逐漸減少至IOmg/天。一旦到了開(kāi)始BLyS和/或APRIL拮抗劑的時(shí)間，負(fù)荷劑量給藥方案可以是合適的。特別地，atacicept可以每周施用兩次并持續(xù)4周，隨后在延長(zhǎng)的時(shí)間段(例如48周)內(nèi)每周進(jìn)行施用。相反地，免疫抑制藥物傾向于以逐步升高的劑量給藥方案進(jìn)行施用。例如，MMF可以以每天兩次500mg的劑量進(jìn)^f亍施用，并在兩周后增加至每天兩次750mg。如果患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)保持在可接受的水平(即，高于3.0x107L或3000/mm2)，劑量的每周的進(jìn)展可以直至每天3次1000mg的最大劑量。特別地，可以預(yù)期，畫(huà)F施用的最大范圍為2000至3000rag/患者/天。施用途徑根據(jù)已知的方法給人患者施用BLyS和/或APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物，例如通過(guò)靜脈內(nèi)施用，例如作為推注或者在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注，通過(guò)皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)或吸入途徑。采用合適制劑的免疫抑制藥物還可以口服或局部地進(jìn)行施用。一般地，BLyS和/或APRIL拮抗劑和一些免疫抑制藥物將通過(guò)靜脈內(nèi)或皮下施用來(lái)進(jìn)行施用。不同的治療部分可以通過(guò)相同或不同的途徑來(lái)進(jìn)行施用。制品和試劑盒本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為制品，其包含BLyS和/或APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物以用于治療上面所公開(kāi)的由B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述制品包含用于治療狼瘡腎炎的actacicept和匪F。所述制品包含至少一個(gè)容器以及在容器上或與容器相連的標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)。合適的容器包括，例如瓶子(bottle)、小瓶(vial)、注射器等。所述容器可以由各種材料例如玻璃或塑料形成。所述容器裝有對(duì)于治療所述病狀而言有效的本發(fā)明的組合物，并且可以具有無(wú)菌入口(例如，所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋，或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。所述標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)指明，所述組合物用于治療特定的病狀，例如狼瘡腎炎或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。所迷標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)將進(jìn)一步包括關(guān)于給患者施用所述組合物的指導(dǎo)。另外，所述制品可以進(jìn)一步包含第二個(gè)容器，其包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸緩沖鹽水、林格溶液和右旋糖溶液。它可以進(jìn)一步包括從商業(yè)或用戶(hù)觀點(diǎn)來(lái)看所希望的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭和注射器。還提供了試劑盒，其可用于各種目的，例如用于B-細(xì)胞殺傷測(cè)定法。如關(guān)于制品一樣，所述試劑盒包含容器以及在容器上或與容器相連的標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)。所述容器裝有包含本發(fā)明的至少一種免疫抑制藥物和至少一種BLyS和/或APRIL拮抗劑的組合物。可以包括另外的容器，其包含例如稀釋劑和緩沖液、對(duì)照抗體。所述標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)可以提供關(guān)于該組合物的描述以及關(guān)于所預(yù)計(jì)的體外或診斷用途的指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例實(shí)施例lBLyS和/或APRIL拮抗劑的制備產(chǎn)生了TACI-Fc的四種氨基末端截短的形式。所有這四種形式具有融合至SEQIDNO:2的氨基酸殘基編號(hào)30的在WO02/094852中公開(kāi)的經(jīng)修飾的人組織纖溶酶原激活物信號(hào)序列(SEQIDNO:41)。然而，這四種蛋白質(zhì)在其中Fc5被融合至SEQIDN0:2的TACI氨基酸序列的位點(diǎn)方面不同。表l概述了這四種融合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。66<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)重疊PCR來(lái)產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)盒(參見(jiàn)例如，Horton等人，Gene77:61(1989))。將編碼TACI的核酸分子和編碼Fc5的核酸分子用作PCR模板。寡核苷酸引物列于表2和表3中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>對(duì)于所述四種氨基末端截短的形式中的每一種，第一輪PCR擴(kuò)增由兩個(gè)反應(yīng)組成。所述兩個(gè)反應(yīng)分別如下來(lái)進(jìn)行對(duì)于每一種形式，在一個(gè)反應(yīng)中使用5'和3'TACI寡核苷酸，和在另一個(gè)反應(yīng)中使用5'和3'Fc5寡核苷酸。第一輪PCR擴(kuò)增的條件如下。向25ul的最終體積中添加約200ng的模板DNA，2.5|a110xPfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)，2pl的2.5mMdNTPs，0.5pl的各20mM的5'寡核苷酸和3'寡核苷酸，和O.5inl的Pfu聚合酶(2.5個(gè)單位，Stratagene)。擴(kuò)增的溫度特性i普的組成如下94。C3分鐘；以94。C15秒，50。C15秒，72°C2分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；隨后于72。C延伸2分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行分級(jí)，并且將相應(yīng)于預(yù)期大小的條帶從凝膠上切除并根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用QIAGENQIAQUICKGelExtractionKit(Qiagen)來(lái)進(jìn)4亍回收。通過(guò)使用來(lái)自第一輪PCR的經(jīng)凝膠純化的片段作為DNA模板來(lái)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增或重疊PCR擴(kuò)增反應(yīng)。第二輪PCR擴(kuò)增的條件如下。向25ja1的最終體積中添加各約1Qng的TACI片段和Fc5片段的模板DNA，2.5pi10xPfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)，2pl的2.5mMdNTPs,0.5u1的各20jjM的ZC24，903(SEQidno:27)和zc24，946(SEQidno:30)，和O.5jLil的Pfu聚合酶(2.5個(gè)單位，Stratagene)。擴(kuò)增的溫度特性譜的組成如下94。Cl分鐘；以94。C15秒，55'C15秒，72匸2分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；隨后于72X:延伸2分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行分級(jí)，并且將相應(yīng)于預(yù)期大小的條帶從凝膠上切除并根據(jù)制造商的指導(dǎo)4吏用QIAGENQIAQUICKGelExtractionKit(Qiagen)來(lái)進(jìn)行回收。根據(jù)制造商推薦的方案，使用Invitrogen的ZEROBLUNTT0P0PCRCloningKit,分開(kāi)地克隆所述四種形式的氨基末端截短的TACI-FcPCR產(chǎn)物中的每一種。表4列出了這些TACI-Fc構(gòu)建體的核苷酸和氨基酸序列。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>在驗(yàn)證了核苷酸序列后，將包含所述四種形式的氨基末端截短的TACI-Fc融合物中的每一種的質(zhì)粒用FseI和AscI進(jìn)行消化，以釋放出氨基酸編碼區(qū)段。將FseI-AscI片段連接入包含CMV啟動(dòng)子和SV40polyA區(qū)段的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。如下面所描述的，將表達(dá)載體引入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中。實(shí)施例2通過(guò)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生TACI-Fc蛋白將TACI-Fc表達(dá)構(gòu)建體用于經(jīng)由電穿孔來(lái)轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)在無(wú)動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中的懸浮適應(yīng)型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)DG44細(xì)胞(Urlaub等人，Som.Cell.Molec.Genet.12:555(1986))。CHODG44細(xì)胞由于在兩個(gè)二氫葉酸還原酶染色體位置處發(fā)生缺失而缺乏功能性的二氫葉酸還原酶基因。所述細(xì)胞在濃度增加的氨曱蝶呤存在下的生長(zhǎng)導(dǎo)致在所述表達(dá)構(gòu)建體上的二氫葉酸還原酶基因以及所連接的編碼重組蛋白質(zhì)的基因的擴(kuò)增。使CH0DG44細(xì)胞在PFCH0培養(yǎng)基(JRHBiosciences,Lenexa，KS)、4mML-谷氨酰胺(JRHBiosciences)和lx次黃噪呤-胸苷補(bǔ)充物(LifeTechnologies)中進(jìn)行傳代，并且在37。C和5。/。0)2下在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)平臺(tái)上以120RPM在Corning搖瓶中培育所述細(xì)胞。分開(kāi)地用線(xiàn)性化的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。為了確保無(wú)菌，通過(guò)在Eppendorf管中將200jag質(zhì)粒DNA與20n1經(jīng)剪切的鮭精載體DNA(5'—3'Inc.Boulder，C0，10mg/ml)、22u13MNa0Ac(pH5.2)和484ja1畫(huà)乙醇(GoldShieldChemicalCo.，Hayward，CA)相合并，在冰上進(jìn)行單次乙醇沉淀步驟25分鐘。在溫育后，將管在置于4。C冷室中的微量離心機(jī)(microfuge)之中以14，000RPM進(jìn)行離心，除去上清液，并且用O.5ml70%乙醇洗滌粒狀沉淀兩次并讓其風(fēng)干。在干燥DNA粒狀沉淀的同時(shí)，通過(guò)在25ml錐形離心管中以900RPM使106個(gè)總細(xì)胞(16.5ml)離心5分鐘來(lái)制備CH0DG44細(xì)胞。將CHODG44細(xì)胞重懸浮于總體積為300y1的PFCH0生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并置于具有O.4cm電極隙的Gene-PulserCuvette(Bio-Rad)中。在大約50分鐘的干燥時(shí)間后，將DNA重懸浮于500u1的PFCH0生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并且以使總體積不超過(guò)800inl的方式添加至在杯池(cuvette)中的細(xì)胞，和讓其在室溫下靜置5分鐘以減少氣泡形成。將杯池置于被設(shè)置在O.296kV(千伏)和0.950HC(高電容)的BioRadGenePulserII裝置中，并立即進(jìn)行電穿孔。在置于在CoStarT-75燒瓶中的20ml總體積的PFCHO培養(yǎng)基中之前，將細(xì)胞在室溫下溫育5分鐘。將燒瓶置于37^和5%C02下48小時(shí)，然后采用臺(tái)盼藍(lán)排除法通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并放置在沒(méi)有次黃嘌呤-胸苷補(bǔ)充物且包含200mM氨甲蝶呤(CalBiochem)的PFCHO選擇培養(yǎng)基中。在氨甲蝶呤選擇過(guò)程恢復(fù)后，就通過(guò)Western印跡分析來(lái)檢查包含分泌的TACI-Fc融合蛋白的該條件培養(yǎng)基。實(shí)施例3小鼠中Atacicept和醒F的組合在一個(gè)28天的研究中，在CD-1小鼠中測(cè)試atacicept和固F(CellCept)的共施用。將150只動(dòng)物分為四個(gè)治療組。組l接受用于atacicept和MMF的媒介物對(duì)照物品，其中使用與用于每個(gè)測(cè)試物品的相同的途徑和給藥方案。組2經(jīng)由每天經(jīng)口管飼法接受醒F(351mg/kg)。組3經(jīng)由皮下注射每周三次接受atacicept(20mg/kg)。組4接受atacicept(20mg/kg，3次/周，SC)和固F(351mg/kg，每天，口月良)，通常在彼此30分鐘內(nèi)施用。將所施用的醒F的劑量選擇為小鼠中的最大可行劑量，并通過(guò)使用體表面積將人劑量換算成小鼠劑量來(lái)模仿用于肝移植患者的29mg/kg的關(guān)于70kg的人而言的人等價(jià)劑量(約2g/天)。在基線(xiàn)(第l天)以及第14、28(治療的最后一天)、42、56和112天處死動(dòng)物。每天就死亡率、異常和疼痛或痛苦的征候?qū)π∈筮M(jìn)行檢查。在該研究的第l天和此后每周，以及在處死之前，測(cè)量和記錄體重。為了全面的血液學(xué)和血清化學(xué)分析，淋巴細(xì)胞亞型的流式細(xì)胞術(shù)分析，以及總血清IgG、IgM和IgA濃度，從被處死的動(dòng)物中收集血液。使用來(lái)測(cè)量總血清IgG、IgM和IgA。在被處死的動(dòng)物上進(jìn)行全面的尸體剖檢，以評(píng)價(jià)器官重量變化、宏觀病理學(xué)和組織病理學(xué)。使用小鼠IgGELISA定量試劑盒(目錄號(hào)E90-131，BethylLaboratories,Montgomery,TX)，并結(jié)合ELISAStarterAccessoryPackage(目錄號(hào)EIOI，BethylLaboratories,Montgomery,TX),來(lái)評(píng)價(jià)總IgG水平。所有的液體操作通過(guò)使用所整合的FreedomEvo150液體操作系統(tǒng)和ColumbusWasher(TECAN，Denmark)來(lái)進(jìn)行。微量滴定孔用經(jīng)親和純化的山羊抗小鼠IgG來(lái)進(jìn)行包被，并在室溫下溫育l小時(shí)。對(duì)所述孔進(jìn)行抽吸，用洗滌溶液進(jìn)行洗滌，然后用封閉溶液封閉30分鐘。除去封閉溶液，洗滌平板，并一式兩份地添加樣品/標(biāo)準(zhǔn)品。l小時(shí)后，抽吸掉樣品/標(biāo)準(zhǔn)品，并用洗滌溶液洗滌所述孔。添加綴合有辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗小鼠IgG，并將所述孔在室溫下溫育l小時(shí)。通過(guò)洗滌來(lái)除去未結(jié)合的經(jīng)綴合的抗體，并通過(guò)與TMB底物(BethylLaboratories,Montgomery,TX)—起溫育IO分鐘來(lái)測(cè)量留存在孔中的綴合物的量。通過(guò)添加2MH2S04來(lái)終止顏色反應(yīng)，并且在Spectramax190微量培養(yǎng)板閱讀器上測(cè)量所得的吸光度(OD-450)。關(guān)于總IgG的數(shù)據(jù)計(jì)算如下來(lái)進(jìn)行從每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中減去平均零標(biāo)準(zhǔn)(空白平板)OD-450值，并計(jì)算一式兩份的讀數(shù)的平均值。通過(guò)將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的平均OD對(duì)濃度進(jìn)行作圖來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中采用四參數(shù)對(duì)數(shù)曲線(xiàn)擬合。通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中進(jìn)行內(nèi)插法來(lái)獲得樣品濃度。將平均樣品濃度乘以稀釋倍數(shù)。使用SoftMax⑧Pro軟件來(lái)分析的數(shù)據(jù)包括OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，重復(fù)之間的標(biāo)準(zhǔn)差和y。cv，以及未知者的內(nèi)插值。使用小鼠IgMELISA定量試劑盒(目錄號(hào)E90-101，BethylLaboratories,Montgomery,TX),并結(jié)合EUSAStarterAccessoryPackage(目錄號(hào)EIOI，BethylLaboratories,Montgomery,TX)，來(lái)評(píng)價(jià)總IgM水平。所有的液體操作通過(guò)使用所整合的FreedomEvo150液體操作系統(tǒng)和ColumbusWasher(TECAN,Denmark)來(lái)進(jìn)行。二微量滴定孔用經(jīng)親和純化的山羊抗小鼠IgM來(lái)進(jìn)行包被，并在室溫下溫育l小時(shí)。對(duì)所述孔進(jìn)行抽吸，用洗滌溶液進(jìn)行洗滌，然后用封閉溶液封閉30分鐘。除去封閉溶液，洗滌平板，并一式兩份地添加樣品/標(biāo)準(zhǔn)品。l小時(shí)后，抽吸掉樣品/標(biāo)準(zhǔn)品，并用洗滌溶液洗滌所迷孔。添加綴合有辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗小鼠IgM，并將所述孔在室溫下溫育l小時(shí)。通過(guò)洗滌來(lái)除去未結(jié)合的經(jīng)綴合的抗體，并通過(guò)與TMB底物(BethylLaboratories,Montgomery,TX)—起溫育IO分鐘來(lái)測(cè)量留存在孔中的綴合物的量。通過(guò)添加2MH^0,來(lái)終止顏色反應(yīng)，并且在Spectramax190微量培養(yǎng)板閱讀器上測(cè)量所得的吸光度(0D-450)。關(guān)于總IgM的數(shù)據(jù)計(jì)算如下來(lái)進(jìn)行從每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中減去平均零標(biāo)準(zhǔn)(空白平板)OD-450值，并計(jì)算一式兩份的讀數(shù)的平均值。通過(guò)將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的平均0D對(duì)濃度進(jìn)行作圖來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中采用四參數(shù)對(duì)數(shù)曲線(xiàn)擬合。通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中進(jìn)行內(nèi)插法來(lái)獲得樣品濃度。將平均樣品濃度乘以稀釋倍數(shù)。使用SoftMax⑧Pro軟件來(lái)分析的數(shù)據(jù)包括OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，重復(fù)之間72的標(biāo)準(zhǔn)差和n/。CV，以及未知者的內(nèi)插值。使用小鼠IgAELISA定量試劑盒(目錄號(hào)E90-103，BethylLaboratories,Montgomery,TX),并結(jié)合ELISAStarterAccessoryPackage(目錄號(hào)EIOI，BethylLaboratories,Montgomery,TX),來(lái)評(píng)價(jià)總IgA水平。所有的液體操作通過(guò)使用所整合的FreedomEvo150液體操作系統(tǒng)和ColumbusWasher(TECAN，Denmark)來(lái)進(jìn)行。微量滴定孔用經(jīng)親和純化的山羊抗小鼠IgA來(lái)進(jìn)行包被，并在室溫下溫育l小時(shí)。對(duì)所述孔進(jìn)行抽吸，用洗滌溶液進(jìn)行洗滌，然后用封閉溶液封閉30分鐘。除去封閉溶液，洗滌平板，并一式兩份地添加樣品/標(biāo)準(zhǔn)品。l小時(shí)后，抽吸掉樣品/標(biāo)準(zhǔn)品，并用洗滌溶液洗滌所述孔。添加綴合有辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗小鼠IgM，并將所述孔在室溫下溫育l小時(shí)。通過(guò)洗滌來(lái)除去未結(jié)合的經(jīng)綴合的抗體，并通過(guò)與TMB底物(BethylLaboratories,Montgomery,TX)—起溫育IO分鐘來(lái)測(cè)量留存在孔中的綴合物的量。通過(guò)添加2MH2SO,來(lái)終止顏色反應(yīng)，并且在Spectramax190微量培養(yǎng)板閱讀器上測(cè)量所得的吸光度(0D-450)。關(guān)于總IgA的數(shù)據(jù)計(jì)算如下來(lái)進(jìn)行從每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中減去平均零標(biāo)準(zhǔn)(空白平板)ODM50值，并計(jì)算一式兩份的讀數(shù)的平均值。通過(guò)將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的平均0D對(duì)濃度進(jìn)行作圖來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中采用四參數(shù)對(duì)數(shù)曲線(xiàn)擬合。通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中進(jìn)行內(nèi)插法來(lái)獲得樣品濃度。將平均樣品濃度乘以稀釋倍數(shù)。使用SoftMax⑧Pro軟件來(lái)分析的數(shù)據(jù)包括OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，重復(fù)之間的標(biāo)準(zhǔn)差和n/。CV，以及未知者的內(nèi)插值。免疫球蛋白測(cè)量值的變化的平均結(jié)果記錄在下面的表5中，并且以圖形形式記錄在圖l、2和3中。表5第28天時(shí)的數(shù)值平均IgG、IgM和IgA結(jié)果以及與媒介物的差異(pg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>如可以從這些計(jì)算中所看出的，所述組合對(duì)于減少所有三種類(lèi)型的免疫球蛋白具有協(xié)同效應(yīng)(即，所述組合相對(duì)于媒介物的平均變化(A3)比從媒介物至僅醒F的平均變化(厶1)和從媒介物至僅Atacicept的平均變化(A2)的加合更大(或者，在數(shù)學(xué)上來(lái)說(shuō)，A3>厶l+A2))。結(jié)論此處的實(shí)驗(yàn)顯示了令人驚人的結(jié)果，因?yàn)橄啾扔谑褂脝为?dú)的免疫抑制藥物和BLyS和/或APRIL拮抗劑所導(dǎo)致的減少水平而言，免疫抑制藥物與BLyS和/或APRIL拮抗劑(例如，醒F與atacicept)的組合導(dǎo)致Ig水平的協(xié)同耗竭。實(shí)施例4Atacicept和MMF組合實(shí)驗(yàn)的重復(fù)和延伸74通過(guò)使用與在實(shí)施例3中所描述的那些相似的程序，并且按劑量給藥直至第91天，來(lái)重復(fù)實(shí)施例3的結(jié)果并在時(shí)間上延伸至第35、91、126和182天。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確證了在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處Atacicept和匪F對(duì)于所述三種類(lèi)型的免疫球蛋白中至少之一的平均免疫球蛋白水平的協(xié)同效應(yīng)。所述協(xié)同結(jié)果概括在下面的表6中。表6關(guān)于延伸實(shí)驗(yàn)的IgG、IgM和IgA結(jié)果的數(shù)值平均值的協(xié)同結(jié)果以及與媒介物的差異(Hg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)所選擇的免疫球蛋白亞型達(dá)到最大抑制時(shí)，觀察到協(xié)同效應(yīng)的能力由于低的絕對(duì)數(shù)目而被掩蔽了。這種"掩蔽效應(yīng)"解釋了為什么在后面的時(shí)間點(diǎn)處在所有三種免疫球蛋白亞型中較少一貫地看到協(xié)同作用?？傊?，這些結(jié)果確證了在實(shí)施例3中所看到的Atacicept與醒F的組合對(duì)于所示免疫球蛋白類(lèi)型的水平的數(shù)值平均值的協(xié)同效應(yīng)，并且將該結(jié)論延伸至在35、91、126和182天的時(shí)間過(guò)程中。為了完整起見(jiàn)，下面描述了在該重復(fù)和延伸實(shí)驗(yàn)中所使用的實(shí)驗(yàn)組、劑量、施用的體積和濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>施用方案ATACICEPT:每隔一天，進(jìn)行3天/周，通過(guò)皮下途徑。MMF:每天，通過(guò)口服途徑。組l以與治療組相同的處理頻率接受用于ATACICEPT的媒介物和用于Ce11Cept的媒介物。組2只用ATACICEPT進(jìn)行治療。組3只接受CellCept。組4接受Cel1Cept經(jīng)口管飼法，隨后為在約30分鐘的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行ATACICEPT皮下注射。將第一次治療的那天視為所述研究的第l天。在整個(gè)研究期間，進(jìn)行臨床觀察、血液學(xué)和血液化學(xué)測(cè)試、毒物動(dòng)力學(xué)和另外的調(diào)查。總IgG、IgM和IgA測(cè)定/衛(wèi)星組9、10、11和12將另外的衛(wèi)星組(satellitegroup)動(dòng)物用于總免疫球蛋白測(cè)定和抗體測(cè)定。根據(jù)與主研究相同的程序，對(duì)它們進(jìn)行處理和稱(chēng)重。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>以3只小鼠/性別/籠，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行圈養(yǎng)。從3只動(dòng)物/性別/組中收集血液樣品(以漸進(jìn)的號(hào)數(shù)順序)，以用于測(cè)定在下列時(shí)間處的IgG、IgM和IgA血清水平從對(duì)照組(組9)的動(dòng)物中預(yù)劑量從組9、10、11和12的動(dòng)物中-在5周治療期的第34天一在13周治療期的第90天-在5周恢復(fù)期的第34天一在13周恢復(fù)期的第90天。在用乙醚將它們完全麻醉后，在處死時(shí)從小鼠腹主動(dòng)脈中收集血液(至少O.8-1mL)。將樣品收集在沒(méi)有任何抗凝劑的管中，并讓其在室溫下凝固大約l小時(shí)。凝塊通過(guò)于+4。C以3000rpm離心15分鐘來(lái)旋轉(zhuǎn)沉降。棄去血細(xì)胞，并且將血清以100juL等份試樣(對(duì)于每單個(gè)分析，4個(gè)等份試樣)進(jìn)行儲(chǔ)放，并貯存于-80。C直至分析。通過(guò)經(jīng)驗(yàn)證的ELISA方法來(lái)測(cè)定總IgG、IgM和IgA水平。在5周治療期結(jié)束時(shí)對(duì)4只動(dòng)物/性別/組(以號(hào)數(shù)順序的第一只)施行處死；在13周治療期結(jié)束時(shí)對(duì)8只動(dòng)物/性別/組(以號(hào)數(shù)順序的第二只)施行處死；在5周恢復(fù)期結(jié)束時(shí)對(duì)4只動(dòng)物/性別/組(以號(hào)數(shù)順序的第一只恢復(fù)的動(dòng)物)施行處死；和在13周恢復(fù)期結(jié)束時(shí)對(duì)4只動(dòng)物/性別/組(其余的動(dòng)物)施行處死。結(jié)論此處所報(bào)道的延伸實(shí)驗(yàn)支持了實(shí)施例3的結(jié)果，其中令人驚奇地顯示，相比于使用單獨(dú)的免疫抑制藥物和BLyS和/或APRIL拮抗劑所導(dǎo)致的減少水平而言，免疫抑制藥物與BLyS和/或APRIL拮抗劑(例如，畫(huà)F與atacicept)的組合導(dǎo)致Ig水平的協(xié)同耗竭。參考文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中所引用的參考文獻(xiàn)(包括專(zhuān)利、公布的申請(qǐng)和其他出版物)通過(guò)提及而合并入本文。權(quán)利要求1.用于降低哺乳動(dòng)物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用BLyS拮抗劑和免疫抑制藥物。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗劑為Fc融合蛋白。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述Fc融合蛋白選自包含TACI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白以及包含BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述Fc融合蛋白包含選自SEQIDN0:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的多肽序列。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述Fc融合蛋白包含SEQIDNO:26的多肽序列。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗劑為BLyS抗體。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述BLyS抗體在包含SEQIDNO:8的氨基酸162-275的區(qū)域內(nèi)結(jié)合BLyS。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述BLyS抗體為L(zhǎng)ymphoStat-B。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗劑為T(mén)ACI抗體。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述TACI抗體在包含選自SEQIDNO:2的72-109和SEQIDNO:2的82-222的氨基酸的區(qū)域內(nèi)結(jié)合TACI。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述TACI抗體結(jié)合TACI和BCMA兩者。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫抑制藥物選自環(huán)磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、環(huán)孢菌素A(CSA)和嗎替麥考酚酸酯(醒F)。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述免疫抑制藥物為嗎替麥考酚酸酯(醒F)。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗劑和所述免疫抑制藥物協(xié)同作用從而降低免疫球蛋白水平。15.權(quán)利要求l的方法，其中被降低的免疫球蛋白水平選自IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。16.用于減輕由B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥的方法，所述方法包括給患有所述病癥的患者施用治療有效量的BLyS拮抗劑和免疫抑制藥物。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗劑為Fc融合蛋白。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述Fc融合蛋白選自包含TACI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白以及包含BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述Fc融合蛋白包含選自SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的多肽序列。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述Fc融合蛋白包含SEQIDNO:26的多肽序列。21.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗劑為BLyS抗體。22.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS抗體在包含SEQIDNO:8的氨基酸162-275的區(qū)域內(nèi)結(jié)合BLyS。23.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS抗體為L(zhǎng)ymphoStat-B。24.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗劑為T(mén)ACI抗體。25.權(quán)利要求16的方法，其中所述TACI抗體在包含選自SEQIDNO:2的72-109和SEQIDNO:2的82-222的氨基酸的區(qū)域內(nèi)結(jié)合TACI。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述TACI抗體結(jié)合TACI和BCMA兩者。27.權(quán)利要求16的方法，其中所述免疫抑制藥物選自環(huán)磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、環(huán)孢菌素A(CSA)和嗎替麥考酚酸酯(醒F)。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫抑制藥物為嗎替麥考酚酸酯(固F)。29.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗劑和所述免疫抑制藥物協(xié)同作用從而降低免疫球蛋白水平。30.權(quán)利要求16的方法，其中被降低的免疫球蛋白水平選自IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。31.權(quán)利要求16的方法，其中所述自身免疫疾病選自類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎(LN)、韋格納病、炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫瘕(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、重癥肌無(wú)力、脈管炎、糖尿病、Reynauld，s綜合征、Sjorgen，s綜合征、腎小球腎炎、自身免疫性肝炎和自身免疫性曱狀腺炎。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述自身免疫疾病為狼瘡腎炎。33.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗劑以約1至約2.5mg/kg的劑量進(jìn)行施用，和所述免疫抑制藥物以約1至約4mg/kg的劑量進(jìn)行施用。34.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗劑和所述免疫抑制藥物以與使用選自下列的第二免疫抑制藥物的療法相聯(lián)合的方式進(jìn)行施用非類(lèi)固醇抗炎藥(NSAID)、糖皮質(zhì)激素、潑尼松和疾病緩解抗風(fēng)濕藥(DMARD)。35.包含BLyS拮抗劑和免疫抑制藥物的組合物。36.包含BLyS拮抗劑和免疫抑制藥物以及標(biāo)簽的制品，其中所述標(biāo)簽指明所述組合物用于治療由B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥。37.權(quán)利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗劑也是APRIL拮抗劑。38.權(quán)利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗劑也是APRIL拮抗劑。39.權(quán)利要求34的組合物，其中所述BLyS拮抗劑也是APRIL拮抗劑。40.權(quán)利要求35的制品，其中所述BLyS拮抗劑也是APRIL拮抗劑。41.用于降低哺乳動(dòng)物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物。42.用于減輕由B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥的方法，所述方法包括給患有所述病癥的患者施用治療有效量的APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物。43.包含APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物的組合物。44.包含APRIL拮抗劑和免疫抑制藥物以及標(biāo)簽的制品，其中所述標(biāo)簽指明所述組合物用于治療由B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫病癥。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療自身免疫疾病的新型聯(lián)合療法，所述聯(lián)合療法牽涉BLyS或BLyS/APRIL抑制以及免疫抑制劑。一種優(yōu)選的方法是這樣的，其中BLyS和/或APRIL拮抗劑為Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白可以是包含TACI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白或者包含BCMA的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。在本發(fā)明的方法中，所考慮的免疫抑制藥物中的一些包括環(huán)磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、環(huán)孢菌素A(CSA)或嗎替麥考酚酸酯(MMF)，雖然任何抑制免疫系統(tǒng)的藥物可以是適合的。本發(fā)明的方法降低需要此類(lèi)降低的患者(例如患有自身免疫疾病的那些患者)中各種免疫球蛋白的水平。文檔編號(hào)A61K38/19GK101678106SQ200880015590公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年3月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月27日發(fā)明者A·M·李特奧,C·皮納羅斯,H·O·L·格拉夫尼爾,K·P·范尼斯,L·祖克曼,M·S·赫德倫,R·A·小龐斯,W·J·瓦利斯申請(qǐng)人:津莫吉尼蒂克斯公司;阿瑞斯貿(mào)易股份有限公司