專利名稱：突變的呼腸孤病毒及其制備和使用方法
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背景
呼腸孤病毒建立生產(chǎn)性感染的能力需要蛋白水解外衣殼。蛋白水解將 病毒體轉(zhuǎn)變?yōu)榉Q為中間亞病毒體粒子(ISVP)的形式，該形式具有穿透細(xì)胞 膜的能力并因此接近病毒基因表達(dá)所需的細(xì)胞質(zhì)成分。對(duì)完整呼腸孤病毒 病毒體部分蛋白水解以產(chǎn)生ISVP還可在體外使用蛋白酶諸如糜蛋白酶或 胰蛋白酶進(jìn)行。參見例如，Golden等人.(2002, Mra/., 76:7430-43)和 Chandran & Nibert (1998，丄Mra/., 72:467-75)。
概述
本公開描述了缺乏d3多肽表達(dá)或展示o3多肽表達(dá)減少或缺乏功能性 cj3多肽的突變的呼腸孤病毒。本文所述的突變的呼腸孤病毒可用于產(chǎn)生和 穩(wěn)定地繁殖ISVP。
描述了一種突變的呼腸孤病毒，其包含減少o3多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消 除cr3多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄詏3多肽不存在的第一突變。該第一突變可 在編碼所述a3多肽的核酸中或在調(diào)節(jié)所述d3多肽表達(dá)的核酸中。在某些 情況中，該核酸是S4基因。代表性的突變包括遺傳改造的取代和遺傳改 造的插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。通常，該第一突變減少所述cj3多肽 表達(dá)的至少30%。如本文所述的突變的呼腸孤病毒可包含一種或多種另外的突變。該另 外的突變可為減少多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除pl多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄?br> pl多肽不存在的突變；減少X2多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除X2多肽表達(dá)、或?qū)?致功能性多肽不存在的突變；和/或減少crl多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除cj1 多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄詀l多肽不存在的突變。
還提供一種遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)。這種呼 腸孤病毒ISVP可被遺傳改造以展示a3多肽表達(dá)減少、以缺乏cj3多肽表 達(dá)、或以表達(dá)非功能性cj3多肽。如本文所述的呼腸孤病毒ISVP可被遺傳 改造以包含第一突變。該第一突變可在編碼所述a3多肽的核酸中或在調(diào) 節(jié)所述cy3多肽表達(dá)的核酸中。在某些情況中，該核酸是S4基因。代表性 突變包括取代和插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。通常，該笫一突變減少所 述cj3多肽的表達(dá)的至少30%。
如本文所述的突變的呼腸孤病毒可包含一種或多種另外的突變。所述 另外的突變可為減少lil多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除pl多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ?性pl多肽不存在的突變；減少人2多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除多肽表達(dá)、 或?qū)е鹿δ苄訶2多肽不存在的突變；和/或減少dl多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除 ol多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄詂jl多肽不存在的突變。
提供一種制備具有增加的感染性的呼腸孤病毒的方法。這種呼腸孤病 毒可通過以下步驟來(lái)制備突變第一呼腸孤病毒以產(chǎn)生突變的呼腸孤病 毒，其中所述突變的呼腸孤病毒展示a3多肽表達(dá)減少、缺乏cj3多肽表達(dá)、 或表達(dá)非功能性cj3多肽，和分離所述突變的呼腸孤病毒，其中所述突變 的呼腸孤病毒與所述第一呼腸孤病毒相比具有增加的感染性。增加的感染 性可由以下證實(shí)與所述第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病毒可感 染的瘤細(xì)胞范圍增加、或與所述第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病 毒感染的細(xì)胞數(shù)目增加。
還提供一種獲得遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)的方 法。這種方法包括遺傳改造第一呼腸孤病毒以展示a3多肽表達(dá)減少、 以缺乏o3多肽表達(dá)、或以表達(dá)非功能性o3多肽；培養(yǎng)所述遺傳改造的呼 腸孤病毒，并分離ISVP從而獲得遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。方法 包括向所述受治療者施用本文公開的突變的呼腸孤病毒或本文公開的遺 傳改造的呼腸孤病毒ISVP。這種方法還可包括至少一種選自手術(shù)、化療、 放療和免疫抑制療法的程序。
提供包含本文所述的突變的呼腸孤病毒或本文所述的遺傳改造的呼
腸孤病毒ISVP的藥物組合物。這種藥物組合物進(jìn)一步可包含一種或多種
化療劑和/或 一種或多種免疫抑制劑。
還提供一種包含突變的a3多肽，所述突變產(chǎn)生不結(jié)合入病毒衣殼的cj3 多肽或以減少的水平結(jié)合入所述衣殼的a3多肽。
除非另外限定，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明方 法和組合物所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的具有相同含義。下文描 述了適合的方法和材料，盡管與本文描述的方法和材料相似或等價(jià)的方法 和材料可用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明的方法和組合物。此外，材料、方法和實(shí)
例僅僅是示例性的并不意為限制。本文提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專 利和其它參考文獻(xiàn)通過引用以其全部?jī)?nèi)容并入本文。


圖1是顯示呼腸孤病毒病毒體和呼腸孤病毒ISVP的結(jié)構(gòu)元件的示意圖。
詳述
本文描述了缺乏cj3多肽表達(dá)或展示o3多肽表達(dá)減少或缺乏功能性a3 多肽的突變的呼腸孤病毒。除了在編碼或調(diào)節(jié)d3多肽的核酸中含有突變， 本文所述的突變的呼腸孤病毒還可在一種或多種其它外衣殼蛋白中含有 另外的突變。本文提供的突變的呼腸孤病毒可用于產(chǎn)生中間亞病毒體粒子 (ISVP)，其可以ISVP穩(wěn)定地繁殖用于多次傳代。與呼腸孤病毒自身相比 ISVP通常展示增加的感染性和/或減少的免疫原性，但I(xiàn)SVP通常缺乏以穩(wěn) 定方式繁殖的能力。相反，以突變的呼腸孤病毒形成的ISVP證實(shí)了可用于多次復(fù)制的穩(wěn)定繁殖，不同于酶處理或類似方法產(chǎn)生的ISVP。
炎ir^呼應(yīng)孤^毒fp翔備才法
如本文所述的突變的呼腸孤病毒可含有減少o3多肽表達(dá)或?qū)嵸|(zhì)上消 除a3多肽表達(dá)或?qū)е鹿δ苄詏3多肽不存在的第一突變。消除cj3多肽表 達(dá)或?qū)е鹿δ苄詂j3多肽不存在的突變可在編碼o3多肽的核酸(即S4基因) 中或在編碼調(diào)節(jié)cj3多肽的表達(dá)或功能的多肽的核酸中。
o3多肽長(zhǎng)度為365個(gè)氨基酸并具有41 kDa的分子量。完整病毒體含 有600個(gè)拷貝的o3多肽。cj3多肽很可能與包括例如pl、 X2和al的其它 外衣殼蛋白相互作用，并還可能在RNA選擇或RNA包裝中起作用。呼腸 孤病毒病毒體的圖表明，o3多肽象手指一樣在病毒體表面上伸出并對(duì)病毒 體密度有顯著貢獻(xiàn)。參見圖1。
本文所用的減少cj3多肽表達(dá)的突變是指與表達(dá)野生型水平cj3多肽的 呼腸孤病毒相比，導(dǎo)致d3多肽的量減少至少30%(如，至少40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或95%)的突變。本文所用的實(shí)質(zhì)上消除cj3多肽表 達(dá)的突變是指相對(duì)于野生型呼腸孤病毒產(chǎn)生的多肽的量，導(dǎo)致cj3多肽 的量減少至少95%(如，96%、 97%、 98%、 99%或100%)的突變。本文所 用的導(dǎo)致功能性a3多肽減少或不存在的突變是指允許cj3多肽表達(dá)但導(dǎo)致 a3多肽不能組裝或結(jié)合入病毒衣殼的突變。應(yīng)理解的是，對(duì)于o3多肽可 能期望或需要保持其它功能性(如，結(jié)合RNA的能力)以使突變的呼腸孤病 毒保持繁殖能力。
如本文所述的o3多肽突變可產(chǎn)生以減少的水平結(jié)合入衣殼的a3多 肽，該減少是相對(duì)于不含有該突變的cj3多肽(如野生型cr3多肽)而言。如 本文所述的cj3多肽突變還可產(chǎn)生不能結(jié)合入病毒衣殼的a3多肽。不受任 何具體機(jī)制限制，cj3多肽可具有減少的功能或缺乏功能，例如，由于a3 多肽和pl多肽不能適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合，或由于減少或禁止cr3多肽結(jié)合入衣殼的 構(gòu)象改變。
根據(jù)本公開的突變的呼腸孤病毒可為3型哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒。3 型哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒包括但不限于Dearing和Abney毒抹(分別是T3D或T3A)。參見例如，ATCC登記號(hào)VR-232和VR-824。如本文所述的突變 的呼腸孤病毒可含有自發(fā)產(chǎn)生的突變或遺傳改造的突變。例如，可突變天 然產(chǎn)生的呼腸孤病毒(如分離自天然來(lái)源，如從患者分離)或可產(chǎn)生不表達(dá) cj3多肽或缺乏功能性cj3多肽的重組的呼腸孤病毒(參見如美國(guó)專利第 7,163,678號(hào))。注意到在S4基因中攜帶突變的呼腸孤病毒，諸如Clark等 人(2006,丄80:671-81)、 Ebert等人(2001,丄,/., 75:3197-206)和 Wetzel等人(1997乂. Mra/., 71:1362-9)描述的那些不是本發(fā)明突變體的部分 并從本發(fā)明突變體排除，因?yàn)檫@種突變體被認(rèn)為表達(dá)功能性cr3多肽。
本文所指的突變可為取代或插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。點(diǎn)突變包 括，例如單個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)變(嘌呤到噪呤或嘧啶到嘧夂)或顛換(。票呤到嘧啶 或反之亦然)和單個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失或插入。核酸中的突變可導(dǎo)致編碼 的多肽中一種或多種保守性或非保守性氨基酸取代，這可能造成構(gòu)象改變 或失去或部分地失去功能，翻譯讀碼框中位移("移碼")導(dǎo)致從該位點(diǎn)起 開始編碼的完全不同的多肽，提前終止密碼子導(dǎo)致平截的多肽("平截")， 或呼腸孤病毒核酸中的突變完全不改變編碼的多肽("沉默"或"無(wú)義")。 參見例如，Johnson & Overington, 1993,丄Afo/. 5,。/., 233:716-38; Henikoff & Henikoff, 1992,尸rac. 爿cad[/&4, 89:10915-19;和美國(guó)專利第
4,554,101號(hào)公開的保守性和非保守性氨基酸取代。
使用本領(lǐng)域已知的任何多種方法可在呼腸孤病毒的核酸中產(chǎn)生突變。 例如，位點(diǎn)定向誘變可用于修飾呼腸孤病毒的核酸序列。位點(diǎn)定向誘變的 一種最常用方法是針對(duì)寡核苷酸的誘變。在針對(duì)寡核苷酸的誘變中，將編 碼序列中期望改變的寡核苷酸退火到目標(biāo)DNA的一條鏈，并作為開始 DNA合成的引物。以這種方式，將含有序列改變的寡核苷酸并入新合成的 鏈。參見例如，Kunkel, 1985, P亂編ia"c/. ,, 82:488; Kunkel等 人，1987,她仇五，膨/., 154:367; Lewis & Thompson, 1990,油c/.勿<* i^y., 18:3439; Bohnsack, 1996, A/e仇A/o/.說o/., 57:1; Deng & Nickoloff, 1992,加/. Aoc/zew., 200:81;和Shimada, 1996,嵐57:157。 本領(lǐng)域中例行使用其它方法來(lái)修飾蛋白或多肽的序列。例如，使用PCR或 化學(xué)合成可產(chǎn)生含有突變的核酸，或可化學(xué)合成氨基酸序列中具有期望改變的多肽。參見例如，Bang & Kent, 2005,尸rac. 爿cad "&4,
102:5014-9和其中的參考文獻(xiàn)。
除了消除cj3多肽表達(dá)或減少a3多肽表達(dá)或產(chǎn)生非功能性a3多肽或 導(dǎo)致cj3多肽功能減少的突變，如本文所述的突變的呼腸孤病毒還可包-舍 其它呼腸孤病毒衣殼多肽(如，)Lll、人2和/或ol)之一中的一種或多種另外 的突變(如，第二、第三或第四突變)。可對(duì)含有影響(J3多肽的突變和任選 地在任何或所有其它外衣殼蛋白中的另外的突變的呼腸孤病毒篩選這種 突變的呼腸孤病毒感染和導(dǎo)致細(xì)胞溶解的能力。例如，耐受野生型呼腸孤 病毒溶解的瘤細(xì)胞可用于篩選本文所述的突變的呼腸孤病毒。
例如，另外的突變可減少或?qū)嵸|(zhì)上消除pl多肽的表達(dá)或?qū)е鹿δ苄詐l 多肽不存在。M2基因編碼的jil多肽可能牽涉在細(xì)胞滲透中并可能在轉(zhuǎn)錄 酶活化中起作用。每個(gè)病毒體包含約600個(gè)拷貝的pi多肽，其以與ct3多 肽的1:1復(fù)合體形式存在。pl多肽在其N-末端^皮豆蔻酰化(myristolated)， 隨后豆蔻?；?mynstolated)的N-末端42個(gè)殘基被切除，形成C-末端片段 OIC)。此外或選擇性地，另外的突變可減少或?qū)嵸|(zhì)上消除人2多肽的表達(dá) 或?qū)е鹿δ苄訶2多肽不存在，和/或另外的突變可減少或?qū)嵸|(zhì)上消除dl多 肽的表達(dá)或?qū)е鹿δ苄詀l多肽不存在。X2多肽由L2基因編碼，牽涉在粒 子組裝中，并展示鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性。crl多肽由S1基因編 碼，牽涉在細(xì)胞附著中并作為病毒血凝素。
使用可購(gòu)得的標(biāo)準(zhǔn)核酸方法可從呼腸孤病毒粒子分離核酸。還參見例 3口, Schiff等人，"Orthoreoviruses and Their Replication(正呼腸孑瓜病毒和其 復(fù)制)，"第52章，f7e/血Mra/ogy(費(fèi)氏病毒學(xué))，Knipe & Howley編輯，2006, Lippincott Williams & Wilkins。本文所用的分離的核酸是指與通常伴隨它們 的其它核酸分開的核酸。因此，分離的核酸包括但不限于基本上沒有非-呼腸孤病毒(如宿主細(xì)胞)核酸的呼腸孤病毒核酸，或基本上沒有對(duì)應(yīng)其它 基因組區(qū)段的核酸的呼腸孤病毒基因組區(qū)段。此外，分離的核酸可包括工 程化核酸諸如重組或合成核酸。
可使用本領(lǐng)域已知方法通過重構(gòu)含有影響cj3多肽的至少第一突變的 基因組區(qū)段來(lái)產(chǎn)生感染性亞病毒粒子(ISVP;如遺傳改造的ISVP)而產(chǎn)生如本文所述的突變的呼腸孤病毒。參見例如，Schiff等人，"Orthoreoviruses and Their Replication(正呼腸孤病毒和其復(fù)制),，，第52章，F(xiàn)/e/必Wra/ogy(費(fèi)氏病 毒學(xué))，Knipe & Howley編輯，2006, Lippincott Williams & Wilkins; Smith等 人，1969,〖々ra/ogv, 39(4):791-810;和美國(guó)專利第7,1S6，542; 750495〗27; 6,808,916和6,528,305號(hào)。還可使用基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)通過表達(dá) 呼腸孤病毒基因組區(qū)段來(lái)產(chǎn)生ISVP而產(chǎn)生突變的呼腸孤病毒。參見例如， Kobayashi等人，2007, Ce〃 //oW cfe M/craZ)e, 1:147-57 。本文所用的遺傳改造 的或突變的ISVP是突變的呼腸孤病毒并指從攜帶影響至少cj3多肽的遺傳 改造的或自發(fā)產(chǎn)生的突變的呼腸孤病毒產(chǎn)生的ISVP。本文所述的ISVP是 穩(wěn)定的并可以ISVP繁殖用于多次(如多于一次，如，2、 3、 4、 5、 10、 20、 50或更多)傳代。
經(jīng)由遺傳改造的ISVP或經(jīng)由基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生的本文 所述的突變的呼腸孤病毒可培養(yǎng)在例如人類瘤細(xì)胞或L929小鼠成纖維細(xì) 胞。本文公開的突變的呼腸孤病毒可培養(yǎng)在僅允許缺乏a3多肽的呼腸孤 病毒毒林的細(xì)胞中。使用這種細(xì)胞系來(lái)傳代本文所述的突變的呼腸孤病毒
使用標(biāo)準(zhǔn)方法可純化突變的呼腸孤病毒。參見例如，Schiff等人, "Orthoreoviruses and Their R印lication(正呼腸孤病毒和其復(fù)制),"第52章, F,'e/A F/ra/ogy (費(fèi)氏病毒學(xué))，Knipe & Howley編輯，2006, Lippincott Williams &Wilkins; Smkh等人，1969, Mra/ogy, 39(4):791-810;和美國(guó)專利 第7,186,542; 7,049，127; 6,808,916和6,528,305號(hào)。可以例如針對(duì)。3多 肽的抗體使用親和色譜來(lái)除去含有g(shù)3多肽的呼腸孤病毒并允許缺乏cj3多 肽的突變體流過。本文所用的純化的突變的呼腸孤病毒是指已經(jīng)從天然伴 隨其的細(xì)胞組分分離的呼腸孤病毒。通常，當(dāng)至少70%(如至少75%、 80%、 85%、 90%、 95%或99%)干重的呼腸孤病毒不含天然伴隨該病毒的蛋白和 其它細(xì)胞組分時(shí)，認(rèn)為呼腸孤病毒是純化的。
本文所述的突變的呼腸孤病毒如與非突變的呼腸3瓜病毒(如，對(duì)照呼腸 孤病毒)相比展示增加的感染性和/或減少的免疫原性，并可根據(jù)這種性狀 來(lái)選擇。增加的感染性可由以下證實(shí)與表達(dá)功能性cj3多肽的呼腸孤病毒(如，完整病毒體；如，野生型呼腸孤病毒)相比，突變的呼腸孤病毒感 染的瘤細(xì)胞范圍增加和/或感染的細(xì)胞數(shù)目增加。突變的呼腸^^病毒的減少 的免疫原性可由這種突變的呼腸孤病毒不能在受治療者中引起顯著的免 疫應(yīng)答而證實(shí)。本文所述的突變的呼腸孤病毒還可才艮據(jù)其它期望性狀篩選
和選擇，所述性狀包括但不限于復(fù)制速率更快；包裝速率更快；誘導(dǎo)凋 亡的能力；實(shí)現(xiàn)溶解和有效殺死人類瘤細(xì)胞系的能力；釋放有效腫瘤表位 的能力；與標(biāo)準(zhǔn)化療的相互作用；和病毒后代數(shù)目增加。此外，突變的呼 腸孤病毒可根據(jù)溶解地感染瘤細(xì)胞(如，具有活性Ras途徑的哺乳動(dòng)物細(xì)胞) 的能力來(lái)選擇。參見例如，美國(guó)專利第7,052,832號(hào)。
炎,弄l滲謬W^/V^呼廯遂^^ ^才法
如以前所述(參見例如，美國(guó)專利第6,110，461; 6,136,307; 6,261,555; 6,344,195; 6,576,234和6,811,775號(hào))，呼腸孤病毒使用宿主細(xì)胞的Ras途 徑機(jī)制來(lái)下調(diào)雙鏈RNA-活化的蛋白激酶(PKR)并因此在細(xì)胞中復(fù)制?；?這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)開發(fā)了使用呼腸孤病毒來(lái)治療哺乳動(dòng)物增生性病癥的方 法，哺乳動(dòng)物諸如小鼠、犬、貓、綿羊、山羊、牛、馬、豬、非-人類靈長(zhǎng) 類和人類。本文所述的突變的呼腸孤病毒可用于治療受治療者的增生性病 癥。
增生性病癥是任何細(xì)胞病癥，其中細(xì)胞增殖比正常組織生長(zhǎng)更快。因 此增殖細(xì)胞是比正常細(xì)胞增殖更快的細(xì)胞。增生性病癥包括^旦不限于瘤， 也稱為腫瘤。瘤可包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、腦癌(如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、 肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、曱狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、神經(jīng) 纖維瘤病1和白血病。瘤可為實(shí)體瘤(如肉瘤或癌瘤)或影響造血系統(tǒng)的癌 性生長(zhǎng)(如淋巴瘤或白血病)。其它增生性病癥包括但不限于神經(jīng)纖維瘤病。
通常，在呼腸孤病毒用作療法的增生性病癥中，至少一些增殖細(xì)胞可 具有突變，其中Ras基因(或Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的元件)被直接地(如通過活 化Ras中的突變)或間接地(如通過活化Ras途徑中的上游或下游元件)活 化。活化Ras途徑中的上游元件包括，例如藉由表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR) 或Sos的轉(zhuǎn)化。參見例如，Wiessmuller & W他mghofer, 1994, CW/"/"r S,g"a/,"g, 6(3):247匿267;和Barbacid, 1987,4朋.Wev.說oc/^肌，56, 779-827?；罨疪as途徑中的下游元件包括，例如B-Raf內(nèi)的突變。參見例如，Brose 等人(2002, C朋cerPe&, 62:6997-7000)。此外，呼腸孤病毒可用于治療PKR 突變或失調(diào)引起的增生性病癥。參見例如，Strong等人(1998, 17:3351-62)。
本文所述的突變的呼腸孤病毒可施用于患有增生性病癥的哺乳動(dòng)物。 本文所用的施用是指遞送突變的呼腸孤病毒(如，ISVP)以使突變的呼腸孤 病毒接觸增殖細(xì)胞。施用突變的呼腸孤病毒的途徑取決于病癥類型和增殖 細(xì)胞的位置?？舍娪枚喾N施用途徑，并且以下僅通過示例方式提供而不意 為以任何方式限制。
對(duì)于實(shí)體瘤，例如，可通過包括向腫瘤直接注射或通過注射、輸注或 類似方式系統(tǒng)施用(如靜脈內(nèi))的方法施用突變的呼腸孤病毒。對(duì)于造血的 瘤，例如，可靜脈內(nèi)或血管內(nèi)施用突變的呼腸孤病毒。例如，對(duì)于轉(zhuǎn)移瘤 或瘤諸如腦瘤，突變的呼腸孤病毒可經(jīng)由使其系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)過身體的方式施用 (如鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi))。突變的呼腸孤病毒還可皮下地、腹膜內(nèi)地(如對(duì) 于卵巢瘤)、局部地(如對(duì)于黑素瘤)、口地(如對(duì)于口瘤或食管瘤)、直腸地(如 對(duì)于結(jié)腸直腸瘤)、陰道地(如對(duì)于子宮頸或陰道瘤)、鼻地或通過吸入噴霧 劑(如對(duì)于肺瘤)施用?？捎啥嘤谝环N途徑施用突變的呼腸孤病毒和/或施用 突變的呼腸孤病毒到受治療者中多于一處位置。
如本文公開的突變的呼腸孤病毒以足以治療增生性病癥的量施用(如， 有效量)。當(dāng)向增殖細(xì)胞施用突變的呼腸孤病毒實(shí)現(xiàn)細(xì)胞溶解(如溶瘤作 用)、導(dǎo)致增殖細(xì)胞數(shù)目減少、瘤大小減小、和/或增生性病癥相關(guān)的癥狀(如 疼痛)減少或消除時(shí)，認(rèn)為治療了該增生性病癥。本文所用的術(shù)語(yǔ)溶瘤作用 是指溶解至少10。/。的增殖細(xì)胞(如溶解至少約20%、 30%、 40%、 50%或75% 的細(xì)胞)。可確定溶解百分比，例如，通過測(cè)量哺乳動(dòng)物中瘤大小的減小或 增殖細(xì)胞數(shù)目的減少，或通過體外測(cè)量溶解的細(xì)胞的量(如根據(jù)增殖細(xì)胞的 活組織檢查)。
將在個(gè)體基礎(chǔ)上確定突變的呼腸孤病毒的有效量，并且可以至少部分 地基于所用的具體突變的呼腸孤病毒；個(gè)體的尺寸、年齡、性別；和增殖 細(xì)胞的大小和其它特征。例如，對(duì)于治療人類，可使用大約103至1012個(gè)蝕斑形成單位(PFU)的突變的呼腸孤病毒，這取決于增殖細(xì)胞或存在的瘤
的類型、大小和數(shù)目。例如，有效量可為從約1.0 PFU/kg體重至約1015 PFU/kg體重(如從約102 PFU/kg體重至約10" PFU/kg體重)?？梢詥蝿┝?或多劑量(如二、三、四、六或更多劑量)施用突變的呼腸孤病毒?？赏瑫r(shí) 或連續(xù)地(如經(jīng)過數(shù)天或數(shù)周時(shí)間)施用多劑量。突變的呼腸孤病毒的治療 可持續(xù)數(shù)天至數(shù)月，或直到實(shí)現(xiàn)減少疾病。
預(yù)期如本文公開的突變的呼腸孤病毒可聯(lián)合手術(shù)或除去增殖細(xì)胞(如 瘤)施用。還預(yù)期突變的呼腸孤病毒可聯(lián)合放療施用或除放療以外施用。進(jìn) 一步預(yù)期突變的呼腸孤病毒可聯(lián)合抗癌化合物、化療劑和/或免疫抑制劑施 用或除抗癌化合物、化療劑和/或免疫抑制劑以外施用。這種劑包括但不限 于5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、甲氨蝶呤、羥基脲、吉西他濱、環(huán)磷酰胺、 達(dá)卡巴口秦、米托蒽醌、蒽環(huán)類(如，表柔比星和多柔比星(doxurubicin));微 管蛋白穩(wěn)定劑(如，長(zhǎng)春花生物堿)、針對(duì)受體的抗體諸如HERCEPTIN (赫 賽?、?(Genentech, South San Francisco, CA)、依4乇泊普禾口 pregnasome、 ^白 化合物諸如碳鉑和順鉑、紫杉烷類諸如TAXOL (紫杉醇⑧)(Bristol-Myers Sqmbb， New York， NY)和TAXOTERE (多西紫杉醇⑧)(Rhone-Poulenc Rorer SA, Antony, France)、激素治療劑諸如他莫昔芬和抗雌激素、千擾素、 芳香酶抑制劑、促孕劑和LHRH類似物。還預(yù)期如本文公開的突變的呼腸 孤病毒可聯(lián)合血管滲透劑施用或除血管滲透劑以外施用，血管滲透劑諸如 但不限于IL-2、 TNF-a、 VEGF、 AVASTIN (Genenteeh)和松弛素。
秀參i 合參
提供包括如本文所述的突變的呼腸孤病毒的藥物組合物。參見例如，
美國(guó)專利第6,576，234號(hào)。除了 一種或多種突變的呼腸孤病毒，藥物組合 物通常包括藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體可以是作為突變的 呼腸孤病毒的運(yùn)載體、載體或介質(zhì)的固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)材料。因此，含 有突變的呼腸孤病毒的組合物可為以下形式片劑、丸劑、粉末劑、錠劑、 嚢劑、扁嚢劑、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣溶膠(作為固體 或在液態(tài)介質(zhì)中)、含有例如達(dá)10。/。的重量的活性化合物的軟膏劑、軟和硬 明膠膠嚢、栓劑、無(wú)菌注射溶液和無(wú)菌包裝粉末。適合載體的一些實(shí)例包括磷酸鹽緩沖鹽水或另一種生理上可接受的 緩沖劑、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸 鈣、藻酸鹽、黃芪膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖 維素、無(wú)菌水、糖漿和曱基纖維素。藥物組合物另外可包括但不限于，潤(rùn)
滑劑諸如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；潤(rùn)濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑諸 如苯曱酸曱酯和苯曱酸丙基羥基酯；甜味劑和調(diào)味劑。藥物組合物可配制 為在通過采用本領(lǐng)域已知程序施用后，提供突變的呼腸孤病毒的快速、持 續(xù)或延遲的釋放。除了下述的代表性制劑，用于藥物組合物的其它適合制 齊寸可見于7 ew/wgtow, T72e Sc/ewce 尸ra"/ce qf尸/zfi^77 acj(雷氏藥學(xué)5里i侖禾口 實(shí)踐)(2003, Gennaro & Gennaro編輯，Lippincott Williams & Wilkens)。
對(duì)于制備固態(tài)組合物諸如片劑，可將突變的呼腸孤病毒與藥物載體混 合以形成固態(tài)組合物。任選地，片劑或丸劑可^皮包衣或以其它方式復(fù)合以 提供給予延長(zhǎng)作用的益處的劑型。例如，片劑或丸劑可包括內(nèi)劑量組分和 外劑量組分，后者為包封前者的形式。這兩種組分可被腸衣層分開，腸衣 層用于抵抗胃中的崩解并允許內(nèi)組分完整地進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。多 種材料可用于這種腸衣層或包衣，這種材料包括多種聚合物酸(polymeric acid)和聚合物酸與諸如蟲膠、十六醇和醋酸纖維素等材料的混合物。
用于口服施用或用于注射的包括突變的呼腸孤病毒的液態(tài)制劑通常 包括水性溶液、適當(dāng)調(diào)味的糖漿劑、水性或油性懸浮液和帶有可食用油諸 如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的調(diào)味乳劑、以及酏劑和類 似藥物運(yùn)載體。
用于吸入或吹入的組合物包括藥學(xué)上可接受的水性溶劑或有機(jī)溶劑 或其混合物中的溶液和懸浮液，和粉末。這些液態(tài)或固態(tài)組合物可包含如 本文所述的合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑。為了區(qū)域或系統(tǒng)作用，這種組 合物可通過口或鼻呼吸途徑施用。藥學(xué)上可接受的溶劑中的組合物可通過 使用惰性氣體霧化?？芍苯訌撵F化裝置吸入霧化溶液，或者所述霧化裝置 可與面罩幕(face mask tent)或間歇性正壓呼吸機(jī)連接?？蓮囊院线m方式 遞送制劑的裝置口地或鼻地施用溶液、懸浮液或粉末組合物。
可用于本公開方法的另一種制劑采用經(jīng)皮遞送裝置(如貼片)。這種經(jīng)皮貼片可用于提供連續(xù)或不連續(xù)的如本文所述的突變的呼腸孤病毒的輸 入。用于遞送藥物劑的經(jīng)皮貼片的構(gòu)造和使用是本領(lǐng)域公知的。參見例如，
美國(guó)專利第5,023,252號(hào)。這種貼片可構(gòu)造為連續(xù)、脈動(dòng)性或按需地遞送 突變的呼腸孤病毒。
如果需要，可將突變的呼腸孤病毒包^^在脂質(zhì)體或膠束中以減少或防 止在對(duì)呼腸孤病毒有建成的免疫的哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。這種組合物稱 為免疫保護(hù)的呼腸孤病毒。參見例如，美國(guó)專利第6,565,831和7,014,847 號(hào)。此外，本文所^Hf的突變的呼腸孤病毒(如，缺乏o3多肽或cj3多肽缺 陷或cj3多肽功能缺陷的突變的呼腸孤病毒)可^_酶蛋白水解地處理以除去 或部分地除去存在的任何其它外衣殼蛋白。
突變的呼腸孤病毒或包含這種突變的呼腸孤病毒的藥物組合物可包 裝到藥盒中。預(yù)期藥盒還可包含一種或多種化療劑、 一種或多種免疫抑制 劑和/或一種或多種抗-抗呼腸孤病毒抗體。藥物組合物可配制為單位劑型。 術(shù)語(yǔ)"單位劑型"是指適合作為用于人類受治療者和其它哺乳動(dòng)物的單一 劑量的物理上離散的單位，各單位含有預(yù)先確定量的突變的呼腸孤病毒連 同適合的藥學(xué)上可接受的載體，該量是計(jì)算以產(chǎn)生期望治療效果的量。
根據(jù)本公開，可釆用本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、 微生物學(xué)、生物化學(xué)和重組DNA技術(shù)。這種技術(shù)在文獻(xiàn)中充分闡釋。在 以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的方法和組合物，以下實(shí)施例不限制本發(fā)明 范圍，本發(fā)明范圍描述于權(quán)利要求書。
實(shí)施例
實(shí)施例1 -產(chǎn)生突變的呼腸孤病毒
產(chǎn)生在組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)S4基因突變形式的構(gòu)建體， 以便轉(zhuǎn)錄正鏈RNA。在一個(gè)實(shí)例中，翻譯S4基因的起始密碼子通過缺失、 插入或取代而突變。隨后以該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化易感染呼腸孤病毒的細(xì)胞系。
以呼腸孤病毒感染轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，且如果需要的話誘導(dǎo)S4基因的表 達(dá)。含有該突變的正鏈S4 RNA是病毒RNA-依賴性RNA聚合酶的底物，該酶產(chǎn)生^^皮包裝但非功能性的雙鏈突變的S4 RNA，至少關(guān)于將編碼的(i3多肽結(jié)合入衣殼是非功能性的。
來(lái)自轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代病毒包括表達(dá)cj3多肽的野生型呼腸孤病毒以及不表達(dá)cr3多肽的突變的呼腸孤病毒。不表達(dá)o3多肽的突變的呼腸孤病毒偶爾被稱為棵的呼腸孤病毒。
例如，用已證實(shí)在脫被步驟中阻滯的細(xì)胞系使用蝕斑滴定檢測(cè)選擇棵病毒。在這種細(xì)胞系中，野生型病毒不能有效復(fù)制。選擇和擴(kuò)增最大的蝕斑?？蛇x擇地，以針對(duì)a3多肽的抗體使用親和色譜將野生型呼腸孤病毒純化出來(lái)。a3多肽的存在或不存在通過蛋白印跡法和/或免疫沉淀法確定。
應(yīng)理解的是，盡管已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)的說明書描述了材料和方法，但是如上的說明書意為闡釋而不是限制材料和方法的范圍，材料和方法的范圍由所附權(quán)利要求書的范圍限定。其它方面、益處和修飾在如下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
公開了這樣的方法和組合物——其可用于公開的方法和組合物，可聯(lián)合公開的方法和組合物使用，可用于制備公開的組合物，或是公開的方法和組合物的產(chǎn)物。本文公開了這些和其它材料，應(yīng)理解公開了這些方法和組合物的組合、子集、相互作用、組等。即，盡管可能沒有明確地公開所具體提到的這些組合物和方法的每一種不同的個(gè)體和集合的組合和排列，但是本文具體地預(yù)期和描述了每一個(gè)。例如，如果公開和討論了呼腸孤病毒的具體突變或具體方法，且討論了可對(duì)呼腸孤病毒進(jìn)行的多種突變或可對(duì)方法進(jìn)行的多種修飾，那么除非明確地另外指出，否則明確地包含呼腸孤病毒和方法的每種和所有組合和排列。類似地，還明確地包含和7>開這些的任何子集或組合。
權(quán)利要求
1.一種突變的呼腸孤病毒，其中所述突變的呼腸孤病毒包含第一突變，其中所述第一突變減少σ3多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除σ3多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄驭?多肽不存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述第一突變?cè)诰幋a所述(j3多肽的核酸中或在調(diào)節(jié)所述cj3多肽表達(dá)的核酸中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述核酸是S4基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述笫一突變是遺傳改造的取代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述第一突變是遺傳改造的插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苦酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其進(jìn)一步包含一種或多種另外的突變。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述另外的突變選自以下組成的組減少pi多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除pl多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄詐l多肽不存在的突變；減少X2多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除X2多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄訶2多肽不存在的突變；和/或減少g1多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除ol多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄詂jl多肽不存在的突變。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變的呼腸孤病毒，其中所述第一突變減少所述cj3多肽的表達(dá)的至少30%。
9. 一種遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述呼腸孤病毒ISVP被遺傳改造以展示o3多肽表達(dá)減少、以缺乏a3多肽表達(dá)、或以表 達(dá)非功能性o3多肽。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述呼腸孤病毒IS VP #皮遺傳改造以包含笫 一 突變。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述第一突變?cè)诰幋a所述a3多肽的核酸中或在調(diào)節(jié)所述cj3多肽表達(dá)的核酸中。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述核酸是S4基因。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述第一突變是取代。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP,其中所述第一突變是插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的呼腸孤病毒ISVP，其進(jìn)一步包含一種或多種另外的突變。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的呼腸孤病毒ISVP,其中所述另外的突變選自以下纟且成的纟且減少pl多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除pl多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄詐l多肽不存在的突變；減少多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除人2多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄远嚯牟淮嬖诘耐蛔?；?或減少cj1多肽表達(dá)、實(shí)質(zhì)上消除crl多肽表達(dá)、或?qū)е鹿δ苄詀l多肽不存在的突變。
18. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的呼腸孤病毒ISVP，其中所述多肽的表達(dá)凈皮減少至少30%。
19. 一種制備具有增加的感染性的呼腸孤病毒的方法，其包括突變第一呼腸孤病毒以產(chǎn)生突變的呼腸孤病毒，其中所述突變的呼腸孤病毒展示cj3多肽表達(dá)減少、缺乏cj3多肽表達(dá)、或表達(dá)非功能性a3多肽，和分離所述突變的呼腸孤病毒，其中所述突變的呼腸孤病毒與所述第一呼腸孤病毒相比具有增加的感染性。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述增加的感染性由以下證實(shí)與所述第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病毒可感染的瘤細(xì)胞范圍增加、或與所迷第一呼腸孤病毒相比所述突變的呼腸孤病毒感染的細(xì)胞數(shù)目增加。
21. —種獲得遺傳改造的呼腸孤病毒感染性亞病毒粒子(ISVP)的方法，其包括遺傳改造第一呼腸孤病毒以展示o3多肽表達(dá)減少、以缺乏cj3多肽表達(dá)、或以表達(dá)非功能性a3多肽；培養(yǎng)所述遺傳改造的呼腸孤病毒，和分離ISVP從而獲得遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。
22. —種治療受治療者的增生性病癥的方法，其包括向所述受治療者施用權(quán)利要求1所述的突變的呼腸孤病毒或權(quán)利要求9所述的遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其進(jìn)一步包括至少一種選自手術(shù)、化療、^:療和免疫抑制療法所組成的組的程序。
24. —種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的突變的呼腸孤病毒或權(quán)利要求9所述的遺傳改造的呼腸孤病毒ISVP。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種化療劑和/或一種或多種免疫抑制劑。
26. —種包含突變的a3多肽，其中所述突變產(chǎn)生不結(jié)合入病毒衣殼的ct3多肽或以減少的水平結(jié)合入所述衣殼的(j3多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供突變的呼腸孤病毒和遺傳改造的ISVP。具體地，本發(fā)明提供缺乏σ3多肽表達(dá)或展示σ3多肽表達(dá)減少或缺乏功能性σ3多肽的突變的呼腸孤病毒。其中所描述的突變的呼腸孤病毒可用于產(chǎn)生和穩(wěn)定地繁殖ISVP。還提供了包含突變的呼腸孤病毒的組合物以及使用這種突變的呼腸孤病毒的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101679953SQ200880016669
公開日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日
發(fā)明者B·G·湯普森, M·C·科菲 申請(qǐng)人:昂科利蒂克斯生物科技公司