專利名稱：用于制備纖維蛋白膠的含有濃縮纖維蛋白原的組合物和相關(guān)系統(tǒng)的制備方法
用于制備纖維蛋白膠的含有濃縮纖維蛋白原的組合物和相關(guān)系統(tǒng)的制
備方法
本申請要求2007年3月30日提交的美國臨時專利申請序號60/920，900 的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
基于纖維蛋白的封閉劑經(jīng)常用于減少手術(shù)期間/之后的出血。封閉劑通 過將纖維蛋白原的濃縮溶液與凝血酶和Ca^'昆合以生成纖維蛋白而形成， 其應(yīng)用于出血的傷口和縫合線以幫助止血。濃縮的混合的人纖維蛋白原可 以購買，但其帶來污染的風(fēng)險，或者其通過進一步加工來降低該風(fēng)險，但 卻增加了商品化的封閉劑的成本。很少關(guān)注的從自體血液中制備濃縮纖維 蛋白原的方法相對于昂貴的商品化封閉劑將是一種有吸引力的替代方案。
從人類血液中分離纖維蛋白原的最普通方法是通過低溫沉淀來獲得 20-40 mg/mL的纖維蛋白原濃度。該方法需要數(shù)個小時，并且形成粗的凝 血因子濃縮物，其可用于控制有止血缺陷的患者，但是對于從少量體積的 血液中收集纖維蛋白原來說不太實際。
纖維蛋白原也可以使用化學(xué)試劑來沉淀，例如乙醇、聚乙二醇(PEG) 或硫酸銨。這些方法需時較短，并且提供的纖維蛋白原濃度為30到>50 mg/mL。但是，醇沉淀可能造成纖維蛋白原濃縮物中乙醇水平增高，這可 能導(dǎo)致纖維蛋白原的過早凝固和降低因子XIII的活性(以及降低封閉劑抗 張強度)。用硫酸銨分離纖維蛋白原還使大量的白蛋白沉淀，其可以干擾凝 血。使用PEG沉淀纖維蛋白原需要使用BaS04和MgS04進行費時的凝血 酶原的預(yù)吸收，并且也不希望在纖維蛋白原制劑中存在PEG，因為其可導(dǎo) 致功能下降。由于這些限制因素，無法廣泛采用化學(xué)方法來快速收獲作為 封閉劑用于臨床的纖維蛋白原。
10一種商品化的纖維蛋白原濃縮物Tisseel VH (Baxter Healthcare公司， Westlake Village, CA)從1998年起已經(jīng)可以在美國購得。它是通過復(fù)雜的 過程制備的，包括從混合的人血漿中分離纖維蛋白原并進行熱滅活或溶劑/ 洗滌劑提取，以減少病毒污染物的風(fēng)險。Tissed相對較貴，并且貯存期在 一度程度上受到限制。
作為商品化封閉劑的替代品，纖維蛋白封閉劑已經(jīng)通過將血漿或冷沉 淀物與牛凝血酶混合而制備。但是，正如所述的，使用類似于血漿中的較 低濃度的纖維蛋白原制備的封閉劑可能不具有所希望的物理化學(xué)性能，并 且其止血能力有限。另外，制備冷沉淀物也是費時的，而且通常對于小體 積而言成本并不合算。當(dāng)從血庫中獲得血漿或冷沉淀物時，也伴有傳遞血 液傳染的病原體的風(fēng)險。
因此，需要更容易的和能廣泛利用的制備纖維蛋白膠的改進的系統(tǒng)、 方法和組合物。
附圖簡述


圖1是在含有濃縮纖維蛋白原的組合物中的纖維蛋白原回收率(在原始 血漿中的纖維蛋白原的百分率)的圖示，其作為在血漿中所用的魚精蛋白濃 度的函數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SD(1^4)。
圖2是作為沉淀溫度的函數(shù)的濃縮物中纖維蛋白原回收率(在原始血漿 中的纖維蛋白原的百分率)的圖示。數(shù)據(jù)表示為平均值± SD (n=4)。
圖3是作為氯化鈣濃度函數(shù)的纖維蛋白膠或封閉劑的抗張強度(11=4) 和粘合強度(11=8)的圖示。所用的封閉劑纖維蛋白原濃度為15 mg/mL。數(shù) 據(jù)表示為平均值士 SD。
圖4是向純纖維蛋白原(15 mg/mL)中加入因子XIII (10 ng/mL)和氯化 鉤(8.9 mM)時抗張強度的圖示。數(shù)據(jù)表示為平均值士 SD (n=4)。
圖5是作為在含有或不含氯化鈣(8.9 mM)條件下愈合時間的函數(shù)的封 閉劑抗張強度(11=4)和粘合強度(11=8)的圖示。封閉劑在37。C從沉淀的血漿 纖維蛋白原(15mg/mL)形成，并保持于22°C下30分鐘。數(shù)據(jù)表示為平均值± SD。
圖6是封閉劑的抗張強度(11-4)和粘合強度(!1=8)的圖示，其表現(xiàn)為纖維 蛋白原濃度的近似于線性的函數(shù)，并且隨著CaCl2(8.9mM)的加入而增大。 還顯示了來自于凝固的Tissed、血漿和純纖維蛋白原(15mg/mL)的結(jié)果。 數(shù)據(jù)表示為平均值士 SD。
圖7是15 mg/mL纖維蛋白原濃縮物的抗張強度的圖示，其制備自 l)純纖維蛋白原；2)用魚精蛋白沉淀、離心、隨后重新溶解的純纖維蛋白 原；和3)用魚精蛋白沉淀、離心、隨后重新溶解的血漿纖維蛋白原。數(shù)據(jù) 表示為平均值士 SD (n=4)。
圖8是在抗纖維蛋白溶解藥存在下、在含有和不含氯化鈣(8.9 mM)條 件下從封閉劑制備的凝塊的抗張強度和粘合強度的圖示。所用封閉劑纖維 蛋白原濃度為15mg/mL。所用抗纖維蛋白溶解藥為抑肽酶(3000 KIU/mL) 和s-氨基己酸(s-ACA， 10 mg/mL)。數(shù)據(jù)表示為平均值士 SD (n=4)。
圖9是從全血中濃縮纖維蛋白原的濾器設(shè)計的圖示。過濾室可以為一 定范圍的血液體積(例如10-20 ml、 25-50 ml、 50-75 ml、 75-100 ml)而設(shè)計。 從將血液加入混合室到回收濃縮物的時間通常少于15分鐘。從全血制備的 纖維蛋白原濃縮物具有類似于市售的纖維蛋白膠Tisseel V (Baxter Healthcare, CA)的物理化學(xué)特性。
發(fā)明詳述
現(xiàn)在借助示例性的實施方案和本文所用的具體陳述來描述本發(fā)明。然 而，應(yīng)當(dāng)理解它不意味著限制本發(fā)明的范圍。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員了解本 文內(nèi)容后，可以對本文所述的發(fā)明特點進行改變和進一步修飾，并可對本 文所說明的本發(fā)明的原理進行其他應(yīng)用，這些都被;f見為涵蓋于本發(fā)明的范 圍內(nèi)。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文所^Hf的具體構(gòu)造、方法步驟和材 料，因為它們可以在一定程度上變化。而且，應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語僅 用于描述具體方案的目的，并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
應(yīng)當(dāng)注意的是，除非文中另有清楚的說明，否則本說明書和權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指示物。
本文所用的術(shù)語"活動性出血"是指任何從循環(huán)系統(tǒng)中失血，無論其 原因是什么。
本文所用的術(shù)語"傷口"是指個體的任何組織的任何損傷。傷口可以 經(jīng)歷活動性出血，但不是必須經(jīng)歷。損傷可以是受傷或手術(shù)產(chǎn)生，并且可 以是個體的肌體內(nèi)或肌體外的。受傷的非限制性的例子包括潰瘍、骨折、 刺傷、割傷、擦傷、撕裂傷、手術(shù)切口等。
本文所用的"流體"是指可流動的成分，其可以包括液體、懸浮固體 或其他可流動物質(zhì)。流體可以是混懸液、乳濁液、溶液、混合物、膠體等。
本文所用的術(shù)語"含有纖維蛋白原的流體"是指含有纖維蛋白原的任 何生物學(xué)或人造的流體。這類流體的非限制性的例子包括各種形式的血液 血漿。
"濃縮纖維蛋白原組合物"是指來自于含有纖維蛋白原的流體的纖維 蛋白原組合物，所述纖維蛋白原存在于介質(zhì)或液體中，所述的介質(zhì)或液體 與產(chǎn)生濃縮纖維蛋白原的所述含有纖維蛋白原的流體不同。濃縮纖維蛋白 原組合物可以(但不是必需)具有高于含有纖維蛋白原的流體的濃度。例如，
中的纖維蛋白原濃度，或者可以具有高于原始的含有纖維蛋白原的流體中 的纖維蛋白原濃度。換言之，術(shù)語"濃縮"不意味著與產(chǎn)生濃縮纖維蛋白 原組合物的原始的含有纖維蛋白原的流體相比是濃縮物，而僅僅是指其濃 度足以在適宜條件下形成凝塊。
本文所用的術(shù)語"收集"在用于纖維蛋白原沉淀物時，是指從大量的 含有纖維蛋白原的流體中分離纖維蛋白原沉淀物。該步驟不是必需的，但 是可使沉淀物實際上富集?？梢酝ㄟ^任何一種本領(lǐng)域內(nèi)的手段來實現(xiàn)收集， 包括但不限于重力分離、潷出、離心、過濾等。
本文所用的纖維蛋白原和凝血因子I是同義的。
本文所用的術(shù)語"凝固試劑"是指幫助或造成含有纖維蛋白原的組合 物凝固形成纖維蛋白膠或封閉劑的任何流體或物質(zhì)。舉例性的物質(zhì)如鈣(例
13如鉤鹽)、鎂(例如鎂鹽)、促凝血酶原激酶、肌動蛋白、凝血酶、膠原、血 小板混懸液、沉淀或變性的蛋白、復(fù)合糖、硅石、鋅、硅藻土、高嶺土、 魯塞爾煃蛇毒、利托菌素以及它們的混合物。但是，凝固試劑也可在通常 存在于正常傷口處的流體中發(fā)現(xiàn)，從而使纖維蛋白原形成纖維蛋白膠或封 閉劑，但速率一般比較慢。
本文所用的術(shù)語"陽離子劑"是指陽離子的物質(zhì)，其與纖維蛋白原發(fā) 生反應(yīng)或相互作用從而產(chǎn)生一定量的沉淀或絮凝，以便至少在某種程度上 可將沉淀或絮凝物從其流體中分離。合適的陽離子劑的例子包括胺類，例 如魚精蛋白、聚賴氨酸、聚烯丙胺、組蛋白及它們的混合物。
本文所用的術(shù)語"約"是用來提供數(shù)字范圍端點的彈性，其表示給定 的數(shù)值可以是"略高于"或"略低于"端點。該術(shù)語的彈性程度可以通過 特定變量來表示，并且處于本領(lǐng)域技術(shù)人員基于經(jīng)驗和本文的相關(guān)描述而 能加以確定的知識范圍之內(nèi)。
如本文所用，可以為了方便而在共同列表中提供多種成分。但是，這 些列表應(yīng)當(dāng)被視為如同該列表的每個成員都作為分開的和唯一的成員各自 進行了確認。因此，如果沒有相反的說明的話，所述列表中每個單獨的成 員都不應(yīng)當(dāng)僅僅才艮據(jù)它們出現(xiàn)在共同的組中就被視為該列表的任何其他成 員的事實上的替代方案。
濃度、數(shù)量以及其它數(shù)值數(shù)據(jù)在本文中可以范圍形式來表達或者提供。 應(yīng)當(dāng)理解，這類范圍形式僅僅用于方便和簡潔的目的，因此應(yīng)當(dāng)被靈活地 解釋為不僅包括該范圍邊界所具體描述的數(shù)值，而且包括在該范圍內(nèi)涵蓋 的所有單個數(shù)值或亞范圍，就如同每個數(shù)值和亞范圍被具體描述一樣。例
如，數(shù)值范圍"約0.01-2.0"應(yīng)當(dāng)被解釋為不僅包括具體描述的數(shù)值約0.01 到約2.0，還包括在所述范圍內(nèi)的單個數(shù)值和亞范圍。因此，單個數(shù)值例如 0.5、 0.7和1.5，以及亞范圍如0.5-1.7、 0.7-1.5和1.0-1.5等，都包括在該數(shù) 值范圍內(nèi)。同樣的原則也適用于僅描述了一個數(shù)值的范圍。而且，不論范 圍的寬度或所描述的特征如何，都應(yīng)當(dāng)采用這種解釋。
在理解這些定義后，可以認識到提供制備用于通過造成血液凝固而減少或停止出血的濃縮纖維蛋白原組合物的方法是有利的。
因此，本發(fā)明提供了濃縮纖維蛋白原組合物、系統(tǒng)以及相關(guān)制備方法 和用途。
本文提供了制備和凝固濃縮纖維蛋白原組合物的方法。步驟可包括 向包含纖維蛋白原的流體中加入足夠量的陽離子劑，使纖維蛋白原形成纖 維蛋白原沉淀，收集纖維蛋白原沉淀，并在收集后將該纖維蛋白原沉淀懸 浮或溶解在液態(tài)溶媒中以形成濃縮纖維蛋白原組合物。額外的步驟包括使 該濃縮纖維蛋白原組合物凝固。
在另一項實施方案中，治療傷口的方法可以包括向包含纖維蛋白原 的流體中加入足夠量的陽離子劑，使纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀，收 集纖維蛋白原沉淀，并在收集后將該纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解在液態(tài)溶 媒中以形成濃縮纖維蛋白原組合物。額外的步驟可以包括將濃縮纖維蛋白 原組合物與凝固試劑混合來形成纖維蛋白封閉劑，并向傷口應(yīng)用 一定量的 纖維蛋白封閉劑，從而形成凝塊。
在另一項實施方案中，從血液中制備濃縮纖維蛋白原組合物的方法可 以包括向血液中加入足夠量的陽離子劑，從而使全血中存在的纖維蛋白 原形成纖維蛋白原沉淀，收集纖維蛋白原沉淀，并在收集后將該纖維蛋白 原沉淀懸浮或溶解在液態(tài)溶媒中以形成濃縮纖維蛋白原組合物。
在另 一項實施方案中，制備和使用自體的纖維蛋白膠的方法可以包括 從個體收集包含纖維蛋白原的流體，向包含纖維蛋白原的流體樣品中加入 足夠量的陽離子劑，使纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀，并收集纖維蛋白 原沉淀。額外的步驟包括將纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解在液態(tài)溶媒中，形 成濃縮纖維蛋白原組合物，并將該濃縮纖維蛋白原組合物應(yīng)用于個體的傷 口以形成纖維蛋白膠，其中該纖維蛋白膠形成凝塊。
在另一項實施方案中，制備纖維蛋白膠的系統(tǒng)可以包括第一種組分， 其為包含10 mg/ml至200 mg/ml纖維蛋白原以及至少一種選自因子II、因 子IX、因子X和因子XIII的凝血因子的流體。該系統(tǒng)還可以包括第二種 組分，其包含用于所述纖維蛋白原的凝固試劑。當(dāng)?shù)谝环N組分和第二種組
15分接觸時，可以形成纖維蛋白膠。
在另一項實施方案中，制備濃縮纖維蛋白原組合物的方法可以包括 向包含纖維蛋白原的流體中加入足夠量的魚精蛋白，使得纖維蛋白原形成 纖維蛋白原沉淀，通過離心收集纖維蛋白原沉淀，在收集完成后，將纖維 蛋白原沉淀物懸浮或溶解在包含檸檬酸鈉的液態(tài)溶4某中，以形成濃縮纖維 蛋白原組合物。在濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度可以至少 是包含纖維蛋白原的流體中纖維蛋白原濃度的兩倍。
在另 一項實施方案中，制備纖維蛋白膠的系統(tǒng)可以包括包含IO mg/ml 至200 mg/ml纖維蛋白原和至少一種選自因子II、因子IX、因子X和因 子XIII的凝血因子的流體。在應(yīng)用于傷口時，可以形成纖維蛋白膠。
應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)提及濃縮纖維蛋白原組合物、其制備方法以及在纖維蛋 白膠和纖維蛋白膠系統(tǒng)中的相關(guān)使用方法時，所有此類論述都可被認為適 用于所有這些實施方案，無論其是否在實施方案的上下文中被明確地論述。 因此，例如在論述用于制備纖維蛋白膠的濃縮纖維蛋白原組合物時，該濃 縮纖維蛋白原組合物還可以用于制備纖維蛋白膠的系統(tǒng)，反之亦然。
根據(jù)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)，纖維蛋白原可以從多種生理或人造的包含 纖維蛋白原的流體中收集。在本發(fā)明的一方面，該包含纖維蛋白原的流體 可以是全血。在另一方面，該包含纖維蛋白原的流體可以是血漿，包括普 通血漿以及富含血小板的血漿(PRR)和缺乏血小板的血漿(PPP)。血液或血 漿的來源可以是來源于人或其它動物。本發(fā)明特別是可用于當(dāng)包含纖維蛋 白原的流體是所希望的纖維蛋白原來源時，它也同樣是濃縮纖維蛋白原的 應(yīng)用或者最終從濃縮纖維蛋白原形成的纖維蛋白膠的目標(biāo)對象時。例如， 在預(yù)期進行手術(shù)時制備。血漿的纖維蛋白原水平在個體間有很大差異，其 受年齡、性別、種族、酒精攝入和吸煙以及某些疾病影響。在普通患者群 體中通常的纖維蛋白原濃度為2-6 mg/mL;然而，從非濃縮的纖維蛋白原 溶液制備的凝塊不能提供所需的機械特性，從而導(dǎo)致封閉劑的再現(xiàn)性較差 和不可靠的效力。本發(fā)明提供了控制最終濃縮物中的纖維蛋白原濃度的能 力，因此有助于使封閉劑性能的差異最小化。當(dāng)選擇了包含纖維蛋白原的流體時，就可以向該流體中加入陽離子劑， 使該纖維蛋白原沉淀或者絮凝。有很多種陽離子劑可以使用，包括多種胺 類，包括魚精蛋白、聚賴氨酸、聚烯丙胺、組蛋白及其混合物。在一項實 施方案中，魚精蛋白是陽離子劑。由陽離子劑如魚精蛋白引起的纖維蛋白 原沉淀是迅速的，并且通常導(dǎo)致在包含纖維蛋白原的流體中的大量(如果基
本上不是全部的)纖維蛋白原得到回收。其還有利于包括因子x、因子xin 和/或因子n在內(nèi)的某些凝血因子的沉淀。
當(dāng)沉淀產(chǎn)生后，可以通過任何本領(lǐng)域已知的收集手段對沉淀的纖維蛋 白原進行收集，包括但不限于重力沉降、離心、過濾或其組合。在一項實 施方案中，通過過濾來進行收集。過濾可以是有利的收集方法，因為其可
以-使用便攜式過濾裝置來進行，例如美國專利公布號20070037132中所示，
其引入本文作為參考，在另一項實施方案中，沉淀的纖維蛋白原的收集可 以通過離心來實現(xiàn)。
當(dāng)收集完成后，可將該纖維蛋白原沉淀物懸浮或溶解在液體載體中以 形成濃縮纖維蛋白原組合物。該液態(tài)溶媒可以是水性或非水性的，只要其 為生理學(xué)可接受的并且不會使纖維蛋白原顯著降解或變性。液態(tài)溶媒的實 例包括但不限于檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、肝素、硫酸類肝素的水 溶液、其它陰離子的溶液，及其混合物等。在一項實施方案中，該液態(tài)溶 媒是檸檬酸鈉水溶液。
蛋白原的包含纖維蛋白原的液體濃度的至少兩倍，換言之，本發(fā)明的方法 提供了將原始的包含纖維蛋白原的流體制成濃縮纖維蛋白原組合物后，纖
維蛋白原濃度至少增加100%。在一項實施方案中，在濃縮纖維蛋白原組 合物中存在的纖維蛋白原可以是10 mg/ml-200 mg/ml的濃度。在另一項實 施方案中，在濃縮纖維蛋白原組合物中存在的纖維蛋白原可以是20 mg/ml-100 mg/ml的濃度。在另一項實施方案中，在濃縮纖維蛋白原組合 物中存在的纖維蛋白原可以是20 mg/ml-60 mg/ml的濃度。在另外一項實 施方案中，在濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原可以以至少約15200880017128.1
說明書第9/18頁
mg/ml的濃度存在。
上述的收集纖維蛋白原方法的其它益處是可以同時收集可能存在于包 含纖維蛋白原的流體中的凝血因子。所述凝血因子可以包括但不限于因子 x、因子IX、因子xni、因子H、因子VIII等，其存在于血漿和全血中。 因此，在一項實施方案中，按照任何上述方法獲得的濃縮纖維蛋白原組合
物可以包含因子ix、因子x、因子xiii、因子n和因子vni中的至少一 種因子。在另一項實施方案中，按照任何上述方法獲得的濃縮纖維蛋白原 組合物可以包含因子x、因子ix、因子xni、因子n和因子VIII中的至 少兩種因子。在另外一項實施方案中，按照任何上述方法獲得的濃縮纖維 蛋白原組合物可以包含因子x、因子ix、因子xiii和因子viii中的每一 種因子。當(dāng)包含濃縮纖維蛋白原的組合物是獲自全血或血漿時，至少一種 凝血因子，例如因子x、因子n、因子ix或因子xni,可以在濃縮纖維
但這并不是必需的。僅僅是這些凝血因子在濃縮纖維蛋白原組合物中的存 在就可以為增強凝固功能帶來益處。
纖維蛋白封閉劑或纖維蛋白膠，其可以應(yīng)用于傷口。傷口的實例包括意外 割傷、刺傷、內(nèi)出血、其它損傷、外科手術(shù)切口等。因此，術(shù)語"傷口，， 不一定意味著該傷口是暴露在空氣中，但是與其正常狀態(tài)相比它是開放性 的。通常而言，傷口將暴露在空氣中，但是內(nèi)出血也包括在本文中。本發(fā) 明的纖維蛋白原組合物可以通過將濃縮纖維蛋白原組合物與 一定量的凝血 酶或其它凝固試劑混合以形成纖維蛋白封閉劑而應(yīng)用于傷口。該纖維蛋白 封閉劑可以應(yīng)用于傷口，迅速形成凝塊，其減少或停止傷口的活動性出血。
在一個實施例中，如果使用凝血酶的話，其可以以每ml纖維蛋白封閉劑 中為50單位-500單位的量存在于纖維蛋白封閉劑中。
本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑還可以包含其它可在傷口愈合和血液凝固中 有幫助的化合物，例如任何凝血因子(如上文所述)或凝固試劑。在一項實
施方案中，該纖維蛋白封閉劑可以包含至少一種選自因子x、因子xin、
18因子n、因子viii及其混合物的凝血因子。如果存在的話，因子vin可以幫助形成具有所需特性的更為粘稠的封閉劑。在纖維蛋白封閉劑中包含的因子xm所具有的一項益處是它確保纖維蛋白封閉劑交聯(lián)，并因此降低了對纖溶作用的敏感性。因子xiii需要鈞作為輔因子，以使纖維蛋白交聯(lián)，提高凝塊的抗張強度，減少其斷裂。
可以與濃縮纖維蛋白原組合物進行組合用于纖維蛋白封閉劑或纖維蛋
白膠的凝固試劑包括但不限于鉤鹽、鎂鹽、促凝血酶原激酶、肌動蛋白、
凝血酶、膠原、血小板混懸液、沉淀或變性的蛋白、復(fù)合糖、硅石、鋅、硅藻土、高嶺土、魯塞爾蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。 一般而言，當(dāng)凝固試劑與濃縮纖維蛋白原組合物一起使用以形成纖維蛋白膠時，在將纖維蛋白膠應(yīng)用于傷口前，迅速混合凝固試劑與濃縮纖維蛋白原組合物。凝固
實施方案中，凝固試劑可以存在于分開的或者笫二種流體中，該流體在需要使用纖維蛋白膠的時間之前與濃縮纖維蛋白原組合物(即，第 一種流體)迅速混合。為了避免凝固過早形成，第一種溶液即濃縮纖維蛋白原組合物和包含凝固試劑的第二種溶液可以在分開的容器中保存，直到使用前。在本發(fā)明的一項實施方案中，第二種溶液可以以傷口分泌的流體形式由傷口
本身提供。
在另一項實施方案中，纖維蛋白封閉劑可以包含4丐和鎂。將鈣或鎂加入纖維蛋白原濃縮物可以增加所形成凝塊的抗張強度和粘合強度，推測(至
少一部分)是由于因子xiii作為輔因子在使纖維蛋白原交聯(lián)中起作用。在
某些情況下，可能需要鈣、鎂在纖維蛋白封閉劑中的閾濃度以產(chǎn)生最大效
應(yīng)(對于抗拉強度為8.9 mM，對于粘合強度為3.6mM，該濃度是基于鈣或鎂以氯化鈣或氯化鎂存在時的濃度)，說明需要足夠的鈣或鎂在其與因子xiii相互作用之前，與存在于纖維蛋白流體中的陰離子成分結(jié)合，例如來自檸檬酸鈉的檸檬酸根離子。 一般而言，氯化鈣或氯化鎂在纖維蛋白封閉劑中的濃度超過0.05M時對所得凝塊的抗張強度沒有積極作用，并且在某些情況下該凝塊的抗張強度可能會降低。在不受理論束綽的情況下，認為該結(jié)果可能是由于離子強度增加和纖維蛋白原的部分沉淀，這兩者都對凝塊的完整性有不利影響。 一般而言，認為任何生理學(xué)可接受的鈣或鎂來源都可以使用，包括鈣鹽或鎂鹽。在一項實施方案中，鈣或鎂可以氯化鈣
(CaCl2)或氯化鎂(MgCh)存在。在一項實施方案中，鈣可以氯化鈣形式在纖維蛋白原封閉劑中以1.8nM-100nM的氯化《丐濃度存在。在另一項實施方案中，鈣可以氯化鈣形式在纖維蛋白原封閉劑中以8.9 nM-50 nM的氯化鈣濃度存在。在一項實施方案中，鎂可以氯化鎂形式在纖維蛋白原封閉劑中以1.8nM-100nM的氯化鎂濃度存在。在另一項實施方案中，鎂可以氯化鎂形式在纖維蛋白原封閉劑中以8.9 nM-50 nM的氯化鎂濃度存在。
當(dāng)本發(fā)明的纖維蛋白原封閉劑應(yīng)用于傷口時，其有助于通過粘合組織而使缺口粘接，并通過形成凝塊來止血。在一項實施方案中，纖維蛋白原封閉劑可以在少于約5分鐘內(nèi)停止個體出血。在另一項實施方案中，纖維蛋白原封閉劑可以在少于約3分鐘內(nèi)停止個體出血。在另外一項實施方案中，纖維蛋白原封閉劑可以在少于約1.5分鐘內(nèi)停止個體出血。此外，在另一項實施方案中，纖維蛋白原封閉劑可以在少于約5分鐘內(nèi)在體外形成凝塊。在另一項實施方案中，纖維蛋白原封閉劑可以在少于約3分鐘內(nèi)在體外形成凝塊。在另外一項實施方案中，纖維蛋白原封閉劑可以在少于約1.5分鐘內(nèi)在體外形成凝塊。在另外一項實施方案中，纖維蛋白原封閉劑可以在少于約30秒內(nèi)在體外形成凝塊。
實施例
以下實施例說明了目前已知的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。但是，也可實施其它實施方案，它們同樣涵蓋于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例1 從全血制備缺乏血小板的血漿
按照赫爾辛基宣言的原則，從健康成年人供者中通過靜脈穿刺采集血液到檸檬酸鈉(Sigma化學(xué)品公司，St. Louis, MO;終濃度0.38 g/100mL)中。將血液在1200g離心30分鐘，得到缺乏血小板的血漿(PPP)。該缺乏血小板的血漿可以立即用于制備纖維蛋白原濃縮物或者可以儲存用于在稍
晚的時間使用。在儲存時，PPP應(yīng)當(dāng)儲存在-80。C。
實施例2從混合的人血漿中制備纖維蛋白原濃縮物 通過加入硫酸魚精蛋白(Sigma化學(xué)品公司)，從混合的人血漿中沉淀纖 維蛋白原。用硫酸魚精蛋白制備40 mg/mL的儲備液。接著將魚精蛋白加 入血漿中(終濃度=10 mg/ml)，混合，繼而在1000g離心5分鐘以使沉淀物 沉積。隨后潷出血漿，將剩余沉淀物溶解于0.2M檸檬酸鈉(37。C，pH7.4)。
實施例3 測定纖維蛋白原和因子XIII的濃度
按實施例2所述制備濃縮的纖維蛋白原溶液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA; AssayPro LLC，布魯克林，紐約)評價纖維蛋白原和因子XIII的 濃度。所建立的ELISA板的色強度用Dynex MRX微孔板讀數(shù)器(Dynex Technologies, Chantilly, VA)測量，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。
血漿中的纖維蛋白原濃度用Clauss法測量，其中血漿樣品在CoaData 2000凝血時間測定儀(Labor GmbH，漢堡，德國)中在過量的凝血酶存在 下凝固。記錄凝血時間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算纖維蛋白原濃度。
在濃縮物中與纖維蛋白原結(jié)合的魚精蛋白的量使用1251-魚精蛋白測 定。使用IODOGEN預(yù)涂覆的管(產(chǎn)品號28601， Pierce, Rockford，IL)，按 照其推薦的程序，用125碘標(biāo)記2 mg的魚精蛋白。在最終試驗中，將1.0 mg 1251-魚精蛋白與99.0 mg未標(biāo)記的魚精蛋白混合，接著加入10 ml血漿中。 所形成的沉淀物用水洗滌3次，溶解于0.2 M檸檬酸鈉中，并通過Y計數(shù) 來測量與纖維蛋白原濃縮物相關(guān)的放射性的量。
按照文獻的指導(dǎo)，通過改變加入血漿中的魚精蛋白的量而使魚精蛋白 終濃度達到5 mg/mL到15 mg/mL，可以獲得不同的纖維蛋白原濃度。在 血液或血漿的魚精蛋白濃度為10 mg/mL時，可以沉淀和回收到最多的纖 維蛋白原(96 ± 4%, 11=4)(圖1)。較低的魚精蛋白濃度沉淀了較少的纖維蛋 白原，較高的魚精蛋白濃度可造成低密度聚集物的沉淀，其可能難以分離，并且可能不易溶解。
使用魚精蛋白沉淀來提取纖維蛋白原的效率受到溫度的影響。通過在
37、 22、 15和7。C下將魚精蛋白(10mg/mL)加入血漿樣品，可以研究纖維 蛋白原沉淀的溫度依賴性的性質(zhì)。當(dāng)提取溫度為22°C和更低時，纖維蛋 白原的回收不是溫度依賴性的(圖2)，并且在22。C回收(96 ± 4%， n=4，22。C) 比在37。C (75 ± 6%， 11=4)顯著更好。
當(dāng)使用血漿時，纖維蛋白原濃縮物中的因子XIII的回收可以達到終濃 度3.60 ± 0.05 fig/mL，其為最初血漿中的因子XIII的47 ± 0.6% (n=4)。
實施例4 沉淀的纖維蛋白原的凝固性
回收的纖維蛋白原的凝固性評價如下。按照實施例2的制備方法制備 并使用纖維蛋白原溶液。向1 mL纖維蛋白原溶液中加入100uL牛凝血酶 (Vital Products公司，Boynton Beach, FL， 500 U/mL)，使凝塊在22。C放置 30分鐘。接著將凝塊在3500 g離心2分鐘，取出上清液。通過ELISA測 定在纖維蛋白原濃縮物溶液和凝塊上清液中存在的纖維蛋白原的量，根據(jù)
差異來確定凝塊中存在的纖維蛋白原。
為了評價摻入凝塊中的因子XIII，上述過程可在加入氯化鈣(Spectrum Quality Products 乂>司，Gardena， CA)的條件下重復(fù)。在凝塊上清液和濃縮 物中的纖維蛋白原和因子XIII的量可以用ELISA測量，根據(jù)差異來確定 凝塊中保留的纖維蛋白原和因子XIII的量。
如上所述，濃縮物中的纖維蛋白原聚合形成凝塊。在凝塊中保留的纖 維蛋白原的量測定為原始濃縮物中纖維蛋白原的量的98±0.9%(n=4)。當(dāng) 向濃縮物中加入氯化鈣時，未觀察到纖維蛋白原凝固性的改變，并且有30 ± 1%的因子XIII與凝塊結(jié)合(11=4)。
實施例5肝素對纖維蛋白原濃縮物凝固作用的影響 在臨床上大多數(shù)需要抗凝作用的操作中都使用肝素。評價了肝素對纖 維蛋白原和因子XIII的收集以及對所收集的纖維蛋白原隨后凝固的影響。
22將血液吸入含有豬的肝素(ESi Pharmaceuticals, Cherry Hill, NJ;終濃度2 U/mL)的注射器中，在1200g離心30分鐘以獲得PPP。將魚精蛋白加入到 已知量的血漿中以使血漿濃度為10、 11或12 mg/mL。按上文的實施例2 所述來制備纖維蛋白原濃縮物。用ELISA測定濃縮物中的纖維蛋白原和因 子XIII的量。
當(dāng)血液^^皮收集到肝素中時，最大產(chǎn)量的纖維蛋白原出現(xiàn)在血漿中魚精 蛋白濃度為11 mg/mL時(與之不同的是當(dāng)不存在肝素時為10mg/mL)，使 血漿中95±1%(11=4)的纖維蛋白原沉淀。在該魚精蛋白濃度下，在濃縮物 中發(fā)現(xiàn)了 31士3。/o(rF4)的血漿中的因子XI11。當(dāng)存在肝素時，未觀察到纖 維蛋白原凝固性的改變。
實施例6纖維蛋白凝塊的抗張強度
測試了纖維蛋白凝塊的抗張強度。將有機玻璃加工成兩半部分的狗骨 形的模子，形成凝塊的形狀。將硬海綿置于端部，以使凝塊在其中或圍繞 其形成；海綿通過帶有O環(huán)封口的可移動的有機玻璃托中的插銷;故固定在 模子中。凝塊直徑在狹窄頸部的中心為2 mm， 在較寬的端部為6.5 mm, 長度為31 mm，模子的總體積為1.5 mL。狹窄的頸部提供了凝塊斷裂的最 薄弱點；使凝塊斷裂的力被用作其抗張強度的指征。
通過同時將不同注射器中的纖維蛋白原和凝血酶排到共同的導(dǎo)管中， 再將混合物通過一端的海綿進入模子并通過另 一端的海綿排出而制備試驗 樣品。注意避免在空腔填充過程中引入空氣。所述的海綿有凝塊物質(zhì)滲透 至其核心，提供了在測試過程中牢固吸附凝塊的方法。當(dāng)對樣品給予時間 進行"愈合"(除非是在測試不同的愈合時間，否則為30分鐘)后，取下有 機玻璃模子，將凝塊轉(zhuǎn)移至Instron Model 1120通用測試儀器(Instron公 司，Norwood, MA，最大載量500g)上，在此處它通過海綿"夾子"被固定 在端點。在樣品以100mm/分鐘伸張的同時，記錄應(yīng)力-應(yīng)變曲線，直到其 破裂?？箯垙姸缺挥涗洖槌掷m(xù)的最大應(yīng)力。實施例7纖維蛋白凝塊的粘合強度
測試了纖維蛋白凝塊的粘合強度。通過將纖維蛋白膠夾在兩條主動脈 組織之間，并隨后將它們拉開，從而模擬封閉劑粘合組織的性能來評價纖 維蛋白膠的粘合強度。牛的主動脈通過將主動脈沿長度方向縱切并將其攤 平來制備。接著將該主動脈切成更小的條，每個約3cm長，lcm寬。由于 凝塊不粘附內(nèi)皮層，所以將小條沿長度方向在血管外膜和內(nèi)膜之間切開， 得到兩條更薄的條，它們各有一側(cè)暴露的介質(zhì)。使用封閉劑(O.l mL)覆蓋 到約1 ci^面積的所示暴露介質(zhì)上。形成重疊的連接處(占各條約1/3的長 度)，并在22。C下用100 g重量保持在此位置上使之"愈合"30分鐘。愈 合后的樣品的未重疊端點;故夾在Instron Model 1120通用測試儀器(最大載 量500g)上，在樣品以100mm/分鐘伸張的同時，記錄應(yīng)力-應(yīng)變曲線，直 到重疊(膠合)的連接處斷開。用持續(xù)的最大應(yīng)力除以連接處的面積(通過在 連接處斷開后仍可見到的膠合區(qū)域來指示，并用數(shù)字測徑儀測量)而獲得粘 合強度。
實施例8釣對抗張強度和粘合強度的影響
為了評價在向纖維蛋白原濃縮物中加入氯化鉀時抗張強度的增加(參 見結(jié)果部分)是否由因子XIII造成，對從純纖維蛋白原(Enzyme Research Laboratories, Swansea, Mid Glamorgan,英國)制備的才羊品在力口入和不力口 入因子XIII (Enzyme Research Laboratories, Swansea, Mid Glamorgan, 英國，平均官能度為6200 Loewy單位/mg)和鈣的條件下的抗張強度進行了 測量。從15 mg/mL純纖維蛋白原濃縮物(按實施例2所述制備)制備了如下 所述的樣品
1. 只有纖維蛋白原
2. 纖維蛋白原+氯化釣(8.9 mM)
3. 纖維蛋白原+因子XIII(10ng/mL)
4. 纖維蛋白原+因子乂111(10^^/1111^)+氯化《丐(8.9 mM)。 通過將氯化鈣(濃度為1.8-100 mM)加入到15 mg/mL纖維蛋白原濃縮物中，研究鈣對凝塊抗張強度和粘合強度的影響。鈣濃度為8.9-50 mM時 達到最大的抗張強度，鈣濃度為3.6-100 mM時獲得最大的粘合強度(圖3)。 如上所述在加入和不加入鉀和因子XIII的條件下從純纖維蛋白原制 備凝塊。當(dāng)因子XIII和鉤一起加入時，抗張強度增加約50 kPa (圖4)，類 似地，發(fā)現(xiàn)當(dāng)4丐濃度從0增加到8.9 mM時，封閉劑的抗張強度增加65 kPa (圖3)。
實施例9愈合時間對抗張強度的影響
通過將用模子制備的凝塊和膠合的主動脈條(如實施例7所述)在22°C 下愈合l、 5、 10、 15、 30和60分鐘來評價愈合時間對抗張強度和粘合強 度的影響。在加入和不加入氯化鈣(8.9 mM)的條件下從15 mg/mL纖維蛋 白原濃縮物制備樣品。
對于不同愈合時間的凝塊，加4丐的在1分鐘內(nèi)(可以被測量的最短時間) 達到最大抗張強度，未加鈣的約為5分鐘(圖5)。鈣存在時的最大粘合強度 約兩倍于不含鉀時的粘合強度，但是需要更長的愈合時間來實現(xiàn)(15分鐘對 比5分鐘)。
實施例IO纖維蛋白原濃度對抗張強度的影響
為了評價纖維蛋白原濃度對抗張強度和粘合強度的影響，在加入和不 加入氯化鉤(終濃度8.9 mM)的條件下使用纖維蛋白原濃度15、 30、 45和 60 mg/mL來制備樣品。對照采用混合的人血漿(纖維蛋白原濃度約3 mg/mL)、純纖維蛋白原(15 mg/mL)和Tisseel(平均纖維蛋白原濃度約95 mg/mL)。模制的凝塊和膠合的連接處的愈合時間為30分鐘。
發(fā)現(xiàn)抗張強度和粘合強度隨纖維蛋白原濃度增加而近似于線性的增加 (圖6)。從血漿制備的樣品的粘合強度接近于從魚精蛋白-纖維蛋白原濃縮 物制備的樣品的曲線。15 mg/mL純纖維蛋白原樣品的抗張強度顯著高于 15 mg/mL魚精蛋白-纖維蛋白原樣品(p0.05)。與濃縮纖維蛋白原形成的蛋 白膠相比，發(fā)現(xiàn)魚精蛋白在纖維蛋白原濃縮物中的存在降低了所形成的蛋白股的粘合強度。
在每種纖維蛋白原濃度下，與不加鉤的纖維蛋白原濃縮物相比，加入
氯化4丐都顯著增加抗張強度(pO.05)和粘合強度(pO.05)。當(dāng)向純纖維蛋白 原中加入氯化釣時，未觀察到抗張強度或粘合強度的改變，推測這是因為
在純纖維蛋白原濃縮物中沒有因子xin存在。而且，當(dāng)向檸檬酸鹽血漿中
加入氯化鉀時，也未觀察到抗張強度或粘合強度的改變。這可能是因為 l)某些游離的鈣仍然存在于檸檬酸鹽血漿中，使得因子XIII在即使不加入 氯化鈣時也能起作用；或者2)血漿中的因子XIII濃度很低(與魚精蛋白-纖 維-蛋白原濃縮物中的濃/復(fù)20、 50、 70和95jtg/mL相比而言，在血漿中正 常的濃度為10jig/mL)。
Tisseel顯示出與魚精蛋白-纖維蛋白原濃縮物(45-60 mg/mL纖維蛋白 原)在加鈣的條件下制備的封閉劑相似的抗張強度，以及與魚精蛋白-纖維 蛋白原濃縮物(45-60 mg/mL纖維蛋白原)在不加鈣的條件下制備的封閉劑 相似的粘合強度。Tisseel的粘合強度顯著低于由30、 45和60 mg/mL的纖 維蛋白原濃縮物在加入氯化4丐條件下形成的封閉劑膠的粘合強度(p0.05)。
15 mg/mL的純纖維蛋白原樣品的抗張強度和粘合強度顯著高于15 mg/mL魚精蛋白-纖維蛋白原樣品(p0.05)。這兩種制備物的主要差別在于 其中一種使用魚精蛋白進行沉淀。為了檢驗該假設(shè)(即，加入魚精蛋白對抗 張強度有不利影響)，從純纖維蛋白原通過魚精蛋白沉淀制備了纖維蛋白原 濃縮物(15 mg/mL)，與15 mg/mL沒有進行沉淀的純纖維蛋白原濃縮物進 行比較(纖維蛋白原濃度在這兩種樣品中都已進行了確認)。魚精蛋白沉淀 的純纖維蛋白原的抗張強度顯著低于(p〈 .05)純纖維蛋白原(圖7)，推測這 是由于濃縮物中存在魚精蛋白。
實施例11 纖維蛋白溶解的抑制劑對抗張強度的影響 由于負責(zé)血漿中的纖溶作用的酶可以影響凝塊的抗張強度和粘合強
度，所以研究了纖溶作用抑制劑的存在對抗張強度和粘合強度的影響。在 加入或不加入氯化鈣(8.9 mM)的條件下從15 mg/mL纖維蛋白原濃縮物制備樣品。在某些樣品中，將抑肽酶(特斯樂注射劑，拜爾公司，WestHaven，CT)加入到纖維蛋白原濃縮物中(終濃度- 3000 KIU/mL)。在其他樣品中，將s-氨基己酸(Sigma化學(xué)品公司)加入到纖維蛋白原濃縮物中(終濃度=10mg/mL)。在加入抗纖維蛋白溶解藥后，未觀察到抗張強度或粘合強度的顯著改變(圖8)。
實施例12從全血中制備自體的纖維蛋白膠
使用藍頭的真空采血管(vacutainer)系統(tǒng)來收集檸檬酸鹽血(20 ml),并轉(zhuǎn)移到預(yù)先分裝了 200 mg魚精蛋白(4.0 ml,來自50 mg/ml的溶液)的30ml注射器中，輕柔混合5分鐘，將魚精蛋白和血的混合溶液2倒入如圖9所示的特別設(shè)計的管中。當(dāng)血液通過濾器6時，沉淀的纖維蛋白原被捕獲在玻璃珠4 (0.1 mm直徑的珠,在1-cm柱中，由尼龍篩網(wǎng)濾器支持)上。一旦所有的血液排盡，將濾器用15 ml等份的鹽水(0.15 M NaCl)清洗3次，以除去未粘附的細胞/蛋白質(zhì)。在第三次清洗后，排出所有殘余在管中的鹽水，關(guān)閉龍頭，加入2.0ml0.2M檸檬酸鈉。在用巴斯德吸管充分混合后，將所述流體排出到3-ml注射器中作為纖維蛋白原濃縮物。當(dāng)纖維蛋白原濃縮物與凝血酶溶液(在2M CaCl2中，濃度為每ml纖維蛋白原濃縮物中為500單位的溶液；1:4體積/濃縮物體積)混合時，立即形成粘稠的纖維蛋白凝膠，用作纖維蛋白封閉劑。從將血液加入混合室到回收濃縮物的時間一般不超過15分鐘。從全血中制備的纖維蛋白原濃縮物具有類似于市售的纖維蛋白膠Tisseel V (Baxter Healthcare, CA)的物理化學(xué)特性。
應(yīng)當(dāng)理解，上述的方案僅是對本發(fā)明原理的應(yīng)用的說明。在不背離本發(fā)明的主旨和范圍的條件下，可以做出許多修改和替代方案，同時本發(fā)明已經(jīng)在附圖中顯示并且通過特征和細節(jié)以及目前看來是最實際和最優(yōu)選的本發(fā)明實施方案而得到了充分的描述，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言很明顯的是，在不背離如權(quán)利要求所述的本發(fā)明的原理和概念的條件下可以進行很多修改。
權(quán)利要求
1.制備和凝固濃縮纖維蛋白原組合物的方法，其包括向包含纖維蛋白原的流體中加入足夠量的陽離子劑，使纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀；收集纖維蛋白原沉淀；收集后，將該纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解于液態(tài)溶媒中以形成濃縮纖維蛋白原組合物；以及使該濃縮纖維蛋白原組合物凝固。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物具有至少是 包含纖維蛋白原的流體中纖維蛋白原濃度的兩倍的纖維蛋白原濃度。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的收集是通過重力沉降、離心、 過濾或其組合來進行。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的收集是通過過濾來進行。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的收集是使用便攜式過濾裝置 來進行。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的收集是通過離心來進行。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中液態(tài)溶媒包括選自檸檬酸鈉、氫氧 化鈉、氫氧化鉀、肝素、硫酸類肝素及其混合物的成員。
8. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中液態(tài)溶媒包括檸檬酸鈉。
9. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中包含纖維蛋白原的流體是全血。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中陽離子劑選自魚精蛋白、聚賴氨 酸、聚烯丙胺、組蛋白及它們的混合物。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中陽離子劑是魚精蛋白.
12. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中包含纖維蛋白原的流體是血漿。
13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的收集是通過離心來進行并 且液態(tài)溶媒包括檸檬酸鈉。
14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中 的纖維蛋白原的濃度為10mg/ml-200 mg/ml。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中 的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-100 mg/ml。
16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中 的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-60 mg/ml。
17. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中 的纖維蛋白原的濃度至少為約15 mg/ml。
18. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至 少一種選自因子II、因子IX、因子x和因子xin的凝血因子。
19. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至 少兩種選自因子IX、因子X、因子XIII和因子II的凝血因子。
20. 如權(quán)利要求1所迷的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至 少三種選自因子II、因子1X、因子X和因子XIII的凝血因子。
21. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包舍每 一種凝血因子II、因子IX、因子X和因子XIH。
22. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中凝固步驟包括將凝固試劑與濃縮 纖維蛋白原組合物混合。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中凝固試劑選自鈣鹽、鎂鹽、促凝 血酶原激酶、肌動蛋白、凝血酶、膠原、血小板混懸液、沉淀或變性的蛋 白、復(fù)合糖、硅石、鋅、硅藻土、高嶺土、魯塞爾蝰蛇毒、利托菌素及其 混合物。
24. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中凝固試劑是鈣鹽。
25. 治療傷口的方法，其包括a) 向包含纖維蛋白原的流體中加入足夠量的陽離子劑，使纖維蛋白原 形成纖維蛋白原沉淀；b) 收集纖維蛋白原沉淀；c) 收集后，將該纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解于液態(tài)溶媒中以形成濃縮 纖維蛋白原組合物；d) 將濃縮纖維蛋白原組合物與凝固試劑混合形成纖維蛋白封閉劑，和e) 將一定量的纖維蛋白封閉劑應(yīng)用于傷口，從而形成凝塊。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中傷口是外科手術(shù)產(chǎn)生的切口。
27. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中傷口是受傷的結(jié)果。
28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中受傷是潰瘍、骨折或組織撕裂。
29. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中在傷口位置有身體表面的活動性 出血。
30. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中凝固試劑選自鈣鹽、鎂鹽、促凝 血酶原激酶、肌動蛋白、凝血酶、膠原、血小板混懸液、沉淀或變性的蛋 白、復(fù)合糖、硅石、鋅、硅藻土、高嶺土、魯塞爾蝰蛇毒、利托菌素及其 混合物。
31. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中凝血酶以每ml纖維蛋白封閉劑 中為50單位-500單位的濃度存在于纖維蛋白封閉劑中。
32. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物包含至少 一種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
33. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中凝固試劑包括鈣、鎂或其混合物。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中凝固試劑包括鈣，并且其以氯化 鉤形式在纖維蛋白原封閉劑中以1.8nM-100nM的濃度存在。
35. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中凝固試劑包括鈣，并且其以氯化 鉤形式在纖維蛋白原封閉劑中以8.9nM-50nM的濃度存在。
36. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中凝固試劑包括鎂，并且其以氯化 鎂形式在纖維蛋白原封閉劑中以1,8nM-100nM的濃度存在。
37. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中凝固試劑包括鎂，并且其以氯化 鎂形式在纖維蛋白原封閉劑中以8.9nM-50nM的濃度存在。
38. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中纖維蛋白原封閉劑在少于5分鐘 內(nèi)形成凝塊。
39. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中纖維蛋白原封閉劑在少于約3分 鐘內(nèi)形成凝塊。
40. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中纖維蛋白原封閉劑在少于約1.5 分鐘內(nèi)形成凝塊。
41. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中纖維蛋白原封閉劑在少于約30秒內(nèi)形成凝塊。
42. 從血液中制備濃縮纖維蛋白原組合物的方法，其包括向血液中加入足夠量的陽離子劑，使存在于全血中的纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀；收集纖維蛋白原沉淀；收集后，將該纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解于液態(tài)溶媒中以形成濃縮纖維蛋白原組合物。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物具有至少是包含纖維蛋白原的流體中纖維蛋白原濃度的兩倍的纖維蛋白原濃度。
44. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中該方法還包括使?jié)饪s纖維蛋白原組合物凝固的步驟。
45. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中收集是通過重力沉降、離心、過濾或其組合來進行。
46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中收集是通過過濾來進行。
47. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中收集是通過離心來進行。
48. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中液態(tài)溶媒包括選自檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、肝素、硫酸類肝素及其混合物的成員。
49. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為10 mg/ml-200 mg/ml。
50. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-100 mg/ml。
51. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-60 mg/ml。
52. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至少一種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
53. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中至少一種凝血因子在濃縮纖維蛋白原組合物中以所述至少 一種凝血因子在全血中濃度的25%的濃度存在。
54. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中至少一種凝血因子在濃縮纖維蛋白原組合物中以所述至少 一種凝血因子在全血中濃度的50%的濃度存在。
55. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中至少一種凝血因子在濃縮纖維蛋白原組合物中以所述至少 一種凝血因子在全血中濃度的75%的濃度存在。
56. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至少兩種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
57. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至少三種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
58. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中陽離子劑選自魚精蛋白、聚賴氨酸、聚烯丙胺、組蛋白及它們的混合物。
59. 制備和使用自體的纖維蛋白膠的方法，其包括收集來自個體的包含纖維蛋白原的流體；向包含纖維蛋白原的流體樣品中加入足夠量的陽離子劑，使纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀；收集纖維蛋白原沉淀；將該纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解于液態(tài)溶媒中以形成濃縮纖維蛋白原組合物；將濃縮纖維蛋白原組合物應(yīng)用于個體傷口以形成纖維蛋白膠，其中該纖維蛋白膠形成凝塊。
60. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中收集是通過重力沉降、離心、過濾或其組合來進行。
61. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中液態(tài)溶媒包括選自檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、肝素、硫酸類肝素及其混合物的成員。
62. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中包含纖維蛋白原的流體是全血。
63. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中包含纖維蛋白原的流體是血漿。
64. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為10mg/ml-200 mg/ml。
65. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-100 mg/ml。
66. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-60 mg/ml。
67. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至少一種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
68. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至少兩種選自因子ii、因子ix、因子x和因子xni的凝血因子。
69. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至少三種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
70. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物與用來加快傷口上的纖維蛋白膠形成速度的凝固試劑一起應(yīng)用于傷口 。
71. 如權(quán)利要求70所述的方法，其中凝固試劑選自鈣鹽、鎂鹽、促凝血酶原激酶、肌動蛋白、凝血酶、膠原、血小板混懸液、沉淀或變性的蛋白、復(fù)合糖、硅石、鋅、硅藻土、高嶺土、魯塞爾蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。
72. 如權(quán)利要求70所述的方法，其中凝固試劑和濃縮纖維蛋白原組合物在應(yīng)用步驟之前或應(yīng)用過程中立即混合。
73. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中濃縮纖維蛋白原組合物通過其與存在于傷口位置的體液相互作用來形成纖維蛋白膠。
74. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中陽離子劑選自魚精蛋白、聚賴氨酸、聚烯丙胺、組蛋白及它們的混合物。
75. 制備纖維蛋白膠的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括第一種組分，所述第一種組分是包含10 mg/ml-200 mg/ml纖維蛋白原以及至少一種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子的流體；和第二種組分，其包含用于所述纖維蛋白原的凝固試劑，其中當(dāng)所述第一種組分與第二種組分接觸時，形成纖維蛋白膠。
76. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中凝血因子是因子X。
77. 如權(quán)利要求76所述的系統(tǒng)，其中因子X在第一種組分中以因子X在正常血液中濃度的25%的濃度存在。
78. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中凝血因子是因子II。
79. 如權(quán)利要求78所述的系統(tǒng)，其中因子II在第一種組分中以因子II在正常血液中濃度的25%的濃度存在。
80. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中凝血因子是因子XIII。
81. 如權(quán)利要求80所述的系統(tǒng)，其中因子XIII在第一種組分中以因子XIII在正常血液中濃度的25%的濃度存在。
82. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中在第一種組分中至少存在兩種凝血因子。
83. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中在第一種組分中至少存在三種凝血因子。
84. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中在第一種流體中存在每一種凝血因子II、因子IX、因子X和因子XIII。
85. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中存在于第一種組分中的纖維蛋白原的濃度為10 mg/ml-100 mg/ml。
86. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中存在于第一種組分中的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-60mg/ml。
87. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中第二種組分由傷口提供。
88. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)的配置使得笫一種組分與第二種組分存在于不同容器內(nèi)。
89. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中凝固試劑選自釣鹽、鎂鹽、促凝血酶原激酶、肌動蛋白、凝血酶、膠原、血小板混懸液、沉淀或變性的蛋白、復(fù)合糖、硅石、鋅、硅藻土、高嶺土、魯塞爾蝰蛇毒、利托菌素及其混合物。
90. 如權(quán)利要求75所述的系統(tǒng)，其中第一種流體的制備是通過以下步驟向包含纖維蛋白原的流體中加入足夠量的魚精蛋白，使纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀；收集纖維蛋白原沉淀；將纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解在液態(tài)溶^f某中以形成第一種流體。
91. 制備濃縮纖維蛋白原組合物的方法，其包括向包含纖維蛋白原的流體中加入足夠量的魚精蛋白，使纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀；通過離心收集纖維蛋白原沉淀；收集后，將纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解在包含檸檬酸鈉的液態(tài)溶媒中，形成濃縮纖維蛋白原組合物；其中在濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原濃度是包含纖維蛋白原的流體中纖維蛋白原濃度的至少兩倍。
92. 如權(quán)利要求91所述的方法，其中包含纖維蛋白原的流體是全血。
93. 如權(quán)利要求91所述的方法，其中包含纖維蛋白原的流體是血漿。
94. 如權(quán)利要求91所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為10 mg/ml-200 mg/ml。
95. 如權(quán)利要求91所述的方法，其中存在于濃縮纖維蛋白原組合物中的纖維蛋白原的濃度為20 mg/ml-60 mg/ml。
96. 如.權(quán)利要求91所述的方法；其中濃縮纖維蛋白原組合物還包含至少一種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子。
97. 制備纖維蛋白膠的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括包含10 mg/ml-200 mg/ml纖維蛋白原以及至少一種選自因子II、因子IX、因子X和因子XIII的凝血因子的流體，其中在應(yīng)用于傷口時形成纖維蛋白膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及濃縮的纖維蛋白原組合物和相關(guān)方法以及其用途。所述濃縮的纖維蛋白原組合物可以通過以下步驟制備向含有纖維蛋白原的流體中加入足夠量的陽離子劑如魚精蛋白，使纖維蛋白原形成纖維蛋白原沉淀；通過收集手段例如離心來收集纖維蛋白原沉淀；并將該纖維蛋白原沉淀懸浮或溶解在液態(tài)溶媒中以形成濃縮纖維蛋白原組合物。該濃縮纖維蛋白原組合物可以摻入用于制備纖維蛋白膠的系統(tǒng)中并用于治療傷口。
文檔編號A61B19/00GK101677836SQ200880017128
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者S·F·穆罕默德, S·蘇卡文內(nèi)什沃爾 申請人:斯魯姆博達因公司