專利名稱：：包含環(huán)糊精和生物活性分子的納米顆粒及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有生物粘附特征的納米顆粒，其包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物以及生物活性分子。本發(fā)明還涉及制備該納米顆粒的方法以及含有所述納米顆粒的組合物及其應用。
背景技術：
：在過去的數(shù)年中，已經(jīng)開發(fā)了生物可降解的聚合納米顆粒作為藥物給藥、特別是通過口服途徑給藥的載體的用途。納米顆粒通常被定義為由天然或合成的聚合物形成的、尺寸小于一微米的固體顆粒型膠體系統(tǒng)。取決于其制備中所采用的方法，能獲得兩種類型的結構納米球或納米膠嚢。納米球具有其中分散有活性成分的聚合基質型結構，而納米膠嚢具有被諸如聚合殼的殼包圍的含有活性成分的核。由于這些系統(tǒng)的高比表面，活性成分還能在納米顆粒系統(tǒng)的表面被吸收?？诜緩绞怯糜卺t(yī)藥產(chǎn)品給藥的最廣泛和最吸引人的途徑。該途徑的用途與患者對藥物接受的明顯增加以及較低衛(wèi)生成本有關。然而，當通過該途徑給藥時，相當一部分藥物具有非常低的功效。這種現(xiàn)象能被歸結于一種或數(shù)種如下的限制藥物的口服生物利用度的因素(i)活性分子通過粘膜(通常與親水藥物締合)的低滲透性、(ii)胃腸環(huán)境(存在極端pH值、酶等)中的低穩(wěn)定性、(iii)藥物從劑型中不完全的釋放、(iv)活性成分在胃腸環(huán)境(與疏水藥物締合)中的低溶解性以及(v)首過效應。在許多情況下，納米顆粒系統(tǒng)允許明顯地增加生物活性分子的生物利用度并因此提供新的給藥策略。使用這些載體后獲得的生物利用度的改善能夠通過聚合納米顆粒的發(fā)展與胃腸粘膜道的生物吸附相互作用的能力來解釋。因此，當口服給予納米顆粒懸浮液時，這些載體能與粘膜的某些組分相互作用并發(fā)展與其的粘附相互作用。取決于某些物理化學參數(shù)(例如聚合物的性質、大小、表面電荷或在載體中存在的某些涂層或配體)，納米顆粒的生物粘附特征能夠變化并在某些情況下，允許到達腸上皮細胞表面并可能發(fā)展與胃腸道非常特定的區(qū)域的生物粘附相互作用。所有的這些現(xiàn)象導致了(i)與粘膜表面緊密接觸的劑型的停留時間的增加，或(ii)載體(與藥物物質)在某些區(qū)域特定的定位。一旦納米顆粒被粘膜粘附，其能通過數(shù)種機制促進被攜帶的藥物的吸收及進入體循環(huán)。通過其封裝或與納米顆粒的締合增加了口服生物利用度的藥物的示例性實例包4舌鮭魚降釣素、呋塞米(furosemide)、阿伐醇(avarol)、雙香豆素(dicumarol)、硝苯地平、氟嘧啶、質粒等。乳酸與乙醇酸的單聚物和共聚物(PLGA)是特別重要的制備微粒系統(tǒng)的生物可降解的聚合物，因為它們具有很好的組織相容性，是無毒的并已經(jīng)被用作可重吸收的縫合材料很多年了。這些(共)聚合物可溶于諸如氯仿、二氯曱烷、丙酮和乙酸乙酯的有機溶劑，不溶于水性介質；然而，取決于其分子量及其組成，其能捕獲水并或大或小地膨脹。在這些聚合物的缺點中，需要強調的是與其攜帶的許多抗原相比，PLGA是更疏水的。而且，PLGA的水合作用和降解都是在腐蝕相(erosionphase)中釋放抗原的基本要求。由于聚合物降解產(chǎn)物，乳酸和乙醇酸的積累，該腐蝕導致了更酸性的微環(huán)境；pH能降至2-3的尺度。在這些情況下，被釋放的蛋白質發(fā)生水解并在酸化的介質中聚集，并且許多抗原失去其抗原能力。最后，其高成本能限制其用途并促成尋找其它廉價的材料。作為聚酯的替代選擇，用其它聚合物制備的納米顆粒被證明適合于藥物的口服給藥。最常用的聚合物之一是殼聚糖。殼聚糖是類似于纖維素的聚合物，其來自曱殼綱動物外骨骼的主要成分曱殼素的脫乙酰作用。能將殼聚糖制成不同大小的包含藥物的納米顆粒。殼聚糖顆粒能增加粘膜表面的蛋白質吸收，誘導緊密結點的瞬時開放。此外，殼聚糖能具有免疫調節(jié)效果，在不存在抗原時在體外刺激細胞因子產(chǎn)生并在粘膜水平改善天然的Th2/Th3平^f軒。曱基乙烯基醚與馬來酸酐的共聚物(PVM/MA)[Gantrez]最近被認為是制備納米顆粒的生物可降解的材料(ArbosWa/.,J.Control.Release,83(2002)321-330)。這些PVM/MA共聚物廣泛地用作增稠劑、水溶液的穩(wěn)定劑、牙齒粘附成分、透皮貼劑和用于口服片劑。在這些聚酐的主要優(yōu)勢中，應強調其低成本、低口服毒性和能容易地與含有羥基或氨基基團的分子反應的官能團的可用性(Arbos"a/.,J.Control.Release,89(2003)19-30)。因此，在水性介質中，酸酐基團被水解產(chǎn)生兩個羧基基團，并且該反應允許將配體與聚合鏈或制備的納米顆粒表面容易地結合。環(huán)糊精(CD)是通過酶促淀粉降解獲得的一類環(huán)狀低聚糖。其由互相結合的a-l,4-吡喃葡萄糖單位形成，從而形成了具有疏水內(nèi)部空腔的截頭錐型結構。CD能含有多于15個a-l,4-吡喃葡萄糖單位，盡管豐度最高的CD包含6(a-CD)、7(/3-CD)或8(，CD)個a-l,4-吡喃葡萄糖單位。在藥物應用中，/3-CD及其衍生物是最常用的，尤其是2-羥丙基-/3-環(huán)糊精(OH-jS-CD)。與原始化合物(j8-CD)相比，這種CD具有高度水溶性、較低毒性以及更疏水的空腔。通過使用環(huán)糊精形成的復合體能為主分子提供穩(wěn)定性和增加的水溶性，這能導致該分子(如藥物)生物利用度的增加和/或副作用的減少。而且，文獻中已經(jīng)描述了增加脂質體和微粒負載容量的能力。CD還能調節(jié)被封裝的藥物的釋放譜。許多抗腫瘤劑通過腸胃外給藥，這引起了一些問題。在與抗腫瘤劑的口服給藥有關的主要優(yōu)勢中，應強調患者生存質量的提高以及衛(wèi)生成本的降低。這種給藥途徑會允許將癌細胞持續(xù)地暴露于合適和持續(xù)的濃度水平的抗腫瘤藥物下，這能改善治療指數(shù)并減少副作用。然而，當被口服給藥時，這些藥物的大部分(如紫杉醇)具有低生物利用度。1971年首次描述了提取自短葉紅豆杉(rajowZ^ev(/b〃a)樹的產(chǎn)物紫杉醇(Taxo1⑧，BristolMyersSquibbCompany)，并且自1993年以來，其是全世界最常用的抗癌癥化療劑。紫杉醇在細胞水平起作用，促進微管蛋白的聚合。因此，在紫杉醇的存在下形成的微管是非常穩(wěn)定并且無功能的，從而通過使細胞分裂的微管的動態(tài)和功能無能而導致細胞死亡。在歐洲，這種藥物#皮標示為單獨藥劑(individualagent)和與其7它腫瘤學療法聯(lián)合，用于治療晚期和轉移的卵巢癌、乳腺癌和非小細胞肺癌。這種藥物的主要缺點是其差的口服生物利用度，這是由于其低水溶性并主要由于首過代謝效應?？诜o藥后，紫杉醇是P-糖蛋白以及諸如BCRP和MRP2的ABC(ATP結合盒)超家族其它成員的底物。蛋白質轉運蛋白ABC超家族在有機體對毒性化合物和某些抗癌劑的防御中起主要作用。所述蛋白質(P-糖蛋白、MRP2和BCRP)位于腸、肝和腎的膜的頂端區(qū)域，介導生物異源物質和毒素向腸、膽腔和尿的泵送。而且，P-糖蛋白和MRP2都與CYP3A4、谷胱甘肽S-轉移酶以及UDP-葡萄糖醛酸轉移酶共同地一起定位，這涉及調節(jié)被給予的藥物的口服生物利用度的協(xié)同作用。由于前述原因，為了將其用于臨床實踐并通過靜脈內(nèi)途徑使用，將紫杉醇配制在由CremophorEL:乙醇(1:1)形成的載體中。為了防止和最小化CremophorEL通過靜脈內(nèi)途徑的毒性作用和改善藥物的治療指數(shù)，最近上市了基于將藥物封裝于被稱為Abraxane⑧的白蛋白納米顆粒中的制劑(Green"a/.AnnalsofOncology17:1263-1268,2006)。因此需要開發(fā)藥物給藥系統(tǒng)，其能在口服給藥時增加許多活性成分的生物利用度，特別是那些具有親脂性和/或是P-糖蛋白的底物的藥物(如紫杉醇)。有利地，所述給藥系統(tǒng)應具有生物粘附特征，應具有并入可變的量的親脂性藥物的能力，并且，理想地，應能防止P-糖蛋白對被運送的藥物的影響。通過本發(fā)明提供的納米顆粒能實現(xiàn)這些目標。發(fā)明概述足夠令人驚訝的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸如甲基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物的生物可降解的聚合物的納米顆粒與結合了生物活性分子的環(huán)糊精的締合允許獲得具有物理化學特性和與胃腸粘膜發(fā)生生物粘附的特性的納米顆粒，這使其成為所有類型的生物活性分子，特別是諸如紫杉醇的疏水(親脂)生物活性分子的轉運蛋白的非常有趣的系統(tǒng)。所述納米顆粒能延長其口服給藥后在粘膜中的停留時間。而且，所述納米顆粒能改善可以是P-糖蛋白底物的生物活性分子的生物利用度。同樣地，所述納米顆粒能用作高毒性藥物(如細胞抑制劑)給藥的系統(tǒng)，因為其在高達24小時的時間段內(nèi)，提供持續(xù)和恒定的生物活性分子的血漿水平，這實現(xiàn)了可能的醫(yī)院灌流替代療法，允許減少用這些類藥物進行治療的衛(wèi)生成本。因此，本發(fā)明提供了為有效地通過粘膜給藥，特別是通過口服途徑給藥，而具有締合大量生物活性分子，特別是具有疏水性的生物活性分子的納米顆粒。由于它們具有合適的、有助于納米顆粒(含有生物活性分子)與粘膜表面的相互作用的生物粘附特性，它們能運送大范圍的生物活性分子，特別是具有親脂性的生物活性分子，尤其是，當被口服給藥或通過有機體的任何其它粘膜給藥時，它們能釋放生物活性分子，提供其持續(xù)和恒定的血漿水平。如果被運送的生物活性分子是P-糖蛋白的底物，本發(fā)明的納米顆粒能防止該蛋白質對要考慮的生物活性分子的影響。本發(fā)明提供的納米顆粒包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物，以及生物活性分子。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)容易制備由聚乙烯基甲基醚與馬來酸酐的共聚物與j8-環(huán)糊精(j8-CD)、2-羥丙基-/3-環(huán)糊精(OH-j8-CD)或6-—脫氧-6-單氨基-/3-環(huán)糊精(1^11-/3《0)形成的納米顆粒，并且其提供優(yōu)異的生物粘附、大小和^電位，使其適合于疏水性生物活性分子(如紫杉醇)的給藥。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)選擇其制備中使用的環(huán)糊精的類型允許適當?shù)卣{節(jié)這些納米顆粒的特性，使得其能夠根據(jù)要被運送的生物學分子的類型和/或藥物制劑的給藥方式而有利地使用。最后，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在這些納米顆粒中并入紫杉醇允許以非常重要的方式增加其口服生物利用度，從而使P-糖蛋白在胃腸粘膜水平的影響最小化。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物、以及生物活性分子，用于運送生物活性分子的納米顆粒。在一具體實施方案中，生物可降解的聚合物是曱基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物。在另一具體實施方案中，環(huán)糊精是/5-CD、OH-j8陽CD或NH曙/5-CD。9在一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的生物活性分子是紫杉醇。在這種情況下，納米顆粒允許驚人地增加紫杉醇的口服生物利用度，由于紫杉醇的物理化學特性(高親脂性)以及其是位于胃腸道的P-糖蛋白的底物的事實，其口服吸收幾乎為零。在另一方面，本發(fā)明涉及包含所述納米顆粒的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及制備所述納米顆粒的方法。附圖概述圖1示出與PMV/MA納米顆粒締合的環(huán)糊精的量根據(jù)所用CD的類型[iS-CD:j8-環(huán)糊精；OH-j8-CD:2-羥丙基-]3-環(huán)糊精；NH-/3-CD:6-一脫氧-6-單氨基-/3-環(huán)糊精]以及制備納米顆粒前將后者與曱基乙烯基醚和馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物孵育的時間的變化。結果示出平均值±標準偏差(11=8)。圖2是將基于PVM/MA的含有/3-環(huán)糊精0S-CD-NP)的納米顆粒的凍干樣品用掃描電子顯微術獲得的結果的照片。圖3示出于37土1。C下，在模擬的胃介質(在第一個小時中0-1h)并在模擬的腸介質(l至24h)中孵育后，RBITC從含有環(huán)糊精的納米顆粒(/3-CD-NP:基于PVM/MA的含有j8-CD的納米顆粒；OH-j8-CD-NP:基于PVM/MA的含有OH-jS-CD的納米顆粒；NH-/3-CD-NP:基于PVM/MA的含有NH-/3-CD的納米顆粒)和對照納米顆粒(NP)中的釋放。數(shù)據(jù)示出平均值±標準偏差(11=3)。圖4是示出口服給予10mg用RBITC進行熒光標記的納米顆粒后，代表(A)基于PVM/MA的含有羥丙基-j3-CD(OH-Z3-CD-NP)的納米顆粒；(B)基于PVM/MA的含有/3-CD的納米顆粒以及(C)對照納米顆粒(NP)在胃腸道粘膜中分布的柱形統(tǒng)計圖。X軸代表不同的粘膜部分；Y軸代表粘附至粘膜的納米顆粒部分；Z軸代表給藥后的時間。圖5示出通過將在全部胃腸道中粘附的納米顆粒部分獲得的生物粘附曲線相對于時間表示而獲得的生物粘附曲線。表示的制劑是O)OH-j3-CD-NP;(▲)/3-CD-NP;和(畫)對照NP。數(shù)值示出平均值士標準偏差(11=3)。圖6是示出口服給予10mg的單一劑量2小時后，通過熒光顯微法觀察的粘附至大鼠回腸的對照納米顆粒(A)和OH-/3-CD-NP(B、C)的一組照片。圖7示出根據(jù)所用的環(huán)糊精的類型和初始添加的藥物的量，被封裝于不同制劑的紫杉醇(PTX)量的變化。結果示出平均值±標準偏差(n=6)。PTX-NP:含有紫杉醇的常規(guī)PVM/MA納米顆粒；PTX-/8-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和/3-CD納米顆粒；PTX-OH-/3-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和OH-/3-CD納米顆粒；以及PTX-NH-/3-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和NH-jS-CD納米顆粒。圖8是表示根據(jù)向實驗室動物給予不同PTX制劑后的時間，紫杉醇(PTX)的血漿濃度的一組圖。結果示出平均值士標準偏差。(A)靜脈內(nèi)途徑，劑量10mg/kg。Taxol:商業(yè)紫杉醇制劑。(B)口服途徑，劑量10mg/kg。Taxol:商業(yè)紫杉醇制劑；PTX-]3-CD:含有紫杉醇的/3-CD復合體；PTX-OH-j3-CD:含有紫杉醇的OH-/3-CD復合體；PTX-NH-/3-CD:含有紫杉醇的NH-/3-CD復合體。(C)口服途徑，劑量10mg/kg。PTX-NP:含有紫杉醇的常規(guī)PVM/MA納米顆粒；PTX-(8-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和j8-CD納米顆粒；PTX-OH-j8-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和OH-/5-CD納米顆粒；PTX-NH-jS-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和NH-/3-CD納米顆粒；Taxol:含有紫杉醇商業(yè)制劑。對于商業(yè)紫杉醇制劑和PTX-NP獲得的值重疊并顯示于X軸(表9)。發(fā)明詳述納米顆粒一方面，本發(fā)明涉及納米顆粒，下文中稱為本發(fā)明的納米顆粒，其包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物、以及生物活性分子。本發(fā)明的納米顆粒具有合適的物理化學特性、對胃腸粘膜的特異性和生物粘附的特性，這使得其成為潛在的用于運送生物活性分子、尤其是親脂性生物活性分子(如紫杉醇等)和/或是P-糖蛋白底物的生物活性分子的系統(tǒng)。一般地，本發(fā)明的納米顆粒能夠改善生物活性分子的生物ii利用度，并且具體地能夠改善親脂性生物活性分子和/或是P-糖蛋白底物的生物活性分子的生物利用度。實際上，本發(fā)明的納米顆粒能延長其口服給藥后在粘膜中的停留時間。同樣地，本發(fā)明的納米顆粒能用作運送諸如細胞抑制劑的具有高毒性的生物活性分子的系統(tǒng)，因為其在高達24小時的時間段內(nèi)，提供這些藥物持續(xù)和恒定的血漿水平，這允許設計醫(yī)院灌注的替代療法，導致減少用這些類型藥物治療的衛(wèi)生成本。本文所用的術語"納米顆粒"涉及平均大小小于1.0微米0im)的球體或類似形狀。一般地，本發(fā)明的納米顆粒的平均粒徑為1納米至999納米(nm)，優(yōu)選10nm至900nm。在一具體實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒的平均粒徑為100nm至400nm。"平均大小"被理解為在水性介質中共同移動的納米顆粒群體的平均直徑。能通過本領域技術人員已知的標準程序測量這些系統(tǒng)的平均大小，并且在下文所述的實施例所附的試驗部分中示例性地描述這些標準程序。平均粒徑能夠主要受下列因素影響存在于本發(fā)明的納米顆粒中的生物可降解的聚合物的量和分子量、環(huán)糊精或其衍生物的性質和量以及生物活性分子的性質和量(一般地，所述成分的量或分子量越高，納米顆粒的平均大小越大)、以及諸如攪拌速度等的制備所述納米顆粒的方法的某些參數(shù)。生物可降解的聚合物本發(fā)明的納米顆粒包含生物可降解的聚合物。本文所用的術語"生物可降解的"涉及這樣的聚合物其在期望的應用中(本發(fā)明中，期望的應用是體內(nèi)治療)，一旦該聚合物在25。C至40。C的溫度下，暴露于pH為l至9，通常為4至9的生理學溶液時，該聚合物在可接受的時間段內(nèi)溶解或降解。本領域已知的幾乎任何引起納米顆粒形成的生物可降解的聚合物均能被用于實施本發(fā)明。所述生物可降解的聚合物的示例性的、非限制性的實例包括諸如聚乳酸、聚乙醇酸等的多羥基酸及其諸如乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等的共聚物；聚酸肝；聚酯；諸如殼聚糖等的多糖。所述生物可降解的聚合物的分子量可在大范圍內(nèi)變化，只要其滿足形成納米顆粒并且是生物可降解的確定條件。在一具體實施方案中，所用的生物可降解的聚合物是酸酐形式的曱基乙烯基醚與馬來酸酐的共聚物(PVM/MA)。在一具體實施方案中，例如，能^f吏用以商品名GantrezAN銷售的PVM/MA共聚物。在一具體實施方案中，所述PVM/MA共聚物的分子量為100kDa至2,400kDa，優(yōu)選200kDa至2,000kDa,更優(yōu)選180kDa至250kDa。這種生物可降解的聚合物(PVM/MA)是特別有利的，因為由于其低毒性(口服途徑的LD5。=8-9g/kg)和優(yōu)異的生物利用度，其被廣泛地用于制藥技術。而且，由于量及其成本，其容易獲得。由于其酸酐基團的存在，這種生物可降解的聚合物(PVM/MA)能與不同的親水物質反應，而不需要借助于通常的具有相當毒性的有機試劑(戊二醛、碳二亞胺衍生物等)。在水性介質中，PVM/MA共聚物是不溶的，但其酸酐基團被水解而產(chǎn)生羧基基團。溶解是緩慢的并取決于其發(fā)生的條件。由于PVM/MA中可用的官能團，通過在水性介質中簡單的孵育即可發(fā)生與帶有諸如氫氧化物或氨基的親核基團的分子的共價結合。國際專利申請WO02/069938描述了PVM/MA共聚物納米顆粒，其內(nèi)容被并入本說明書作為參考。作為示例，能通過共聚物的去溶劑化容易地獲得所述PVM/MA共聚物納米顆粒，通過向該共聚物的有才幾溶液中添加第一極性溶劑(與共聚物的溶液混溶)然后添加諸如水醇溶液的第二非溶劑液體來實現(xiàn)該去溶劑化。任選地，能添加交聯(lián)劑。環(huán)糊精及其衍生物除了生物可降解的聚合物之外，本發(fā)明的納米顆粒包含環(huán)糊精或其衍生物。本說明書中所用的術語"環(huán)糊精"包括由通過a-l,4(a-l，4-吡喃葡萄糖)糖苦鍵連接的葡萄糖單位形成的任何環(huán)狀低聚糖。這些單位是通過環(huán)糊精葡聚糖轉移酶(CGTase)引起的淀粉降解的分子內(nèi)轉糖苷反應的結果。"環(huán)糊精，，能含有超過15個a-l,4-吡喃葡萄糖單位，盡管豐度最高的環(huán)糊精含有6、7或8個a-l，4-吡喃葡萄糖單位，其分別形成所謂的a-環(huán)糊精(a-CD)、j8-環(huán)糊精(/3-CD)或7-環(huán)糊精OCD)。所有這些環(huán)糊精有具有疏水內(nèi)部空腔和親水外表面的截頭錐型結構。這是由于羥基基團朝向環(huán)糊精的外側，而在其疏水內(nèi)部空腔中，其被亞曱基基團的氫以及醚類型的氧所覆蓋。因此，其能充當完全或部分地捕獲客體分子的主體。在一具體實施方案中，所述環(huán)糊精是a-環(huán)糊精、/3-環(huán)糊精或7-環(huán)糊精。本說明書中所用的術語"環(huán)糊精衍生物"包括任何具有至少一個被修飾的末端羥基基團的環(huán)糊精。環(huán)糊精的化學修飾能改變其物理化學性質，改善溶解性、穩(wěn)定性并控制其所結合的分子(客體分子)的化學活性。已經(jīng)描述了通過環(huán)糊精的OH基團的反應并入烷基、芳基、羧基烷基、氰基烷基、羥基烷基、磺基烷基、氨基、疊氮基、雜環(huán)基、乙?；⒈綍貂；?、琥珀?；鶊F和其它含有磷、硫等的基團(Robyt(1998)"Essentialsofcarbohydratechemistry(碳水化合物化學的要點)",Ed.CharlesR.Canto,SpringerAdvancedTextinChemistry)。在一具體實施方案中，至少一個所述末端羥基基團被修飾，用下列基團取代氫諸如曱基、乙基、丙基等的直鏈或支鏈的d-Q烷基基團；諸如叔丁基二曱基硅烷基等的三(C廣Q)烷硅基；諸如2-羥基乙基、2-羥基丙基等的CVQ鞋基烷基；任選地用諸如乙?；?、琥珀酰基等羧基基團取代的(CrQ)烷基羰基；諸如苯甲酰基的芳基羰基；諸如氰基曱基、氰基乙基的(CrC。氰基烷基；被任選地取代的氨基；疊氮基；磺基；(CrC4)磺基烷基；或諸如葡糖基、甘露糖基等的糖類基團。在另一具體實施方案中，CD的兩個或更多個末端羥基基團，例如]8-CD中存在的2、3、4、5、6或7個末端羥基基團被任何的所述基團修飾。母體環(huán)糊精(即無衍生作用)，尤其是/3-CD,與無環(huán)的糖類相比，具有有限的水溶性，這部分地是由于結晶狀態(tài)的環(huán)糊精的分子間的強鍵。而且，/3-CD能在仲羥基基團間形成分子內(nèi)氫鍵，從而產(chǎn)生不利的溶液的焓并因此產(chǎn)生低水溶性。用諸如甲氧基或乙氧基的疏水基團取代任何氫鍵會導致水溶性的增加。例如，jS-CD在室溫下的水溶性是1.85%(w/v)，但隨著甲基化程度(曱基-j8-CD)的增加，其水溶性上升高達150倍。另一特別重要的環(huán)糊精衍生物是用環(huán)氧丙烷處理/5-CD后14得到的2-羥丙基-jS-環(huán)糊精(OH-i8-CD)，其水溶性為60%(w/v)。同樣地，這些衍生物能改善毒理學譜、封裝生物活性分子的能力以及調節(jié)其釋放鐠。母體環(huán)糊精的主要問題是腸胃外給藥后的腎毒性，主要對于CD，是由于其低水溶性。因此，諸如OH-Z3-CD的大部分親水性衍生物降低了這些腎毒性問題，因為其能被更容易地消除。相同的情況不發(fā)生于甲基化的i3-CD衍生物，盡管其比/3-CD更可溶，由于其與內(nèi)源脂質相互作用的能力更強，其并不免于導致全身毒性，這限制了其腸胃外用途。相反地，口服給藥后進行的毒性研究表明，環(huán)糊精及其衍生物通過這種途徑是無毒的。環(huán)糊精是水溶性大分子，其被認可用于藥物的口服、腸胃外和局部給藥。環(huán)糊精在藥物的口服給藥中的應用主要是由于因增加溶解性、增加藥物在胃腸道和/或制劑中的穩(wěn)定性而改善的藥物口服生物利用度。另外，對某些藥物，環(huán)糊精在降低藥物本身導致的局部刺激、控制藥物在整個胃腸道中的釋放或掩蓋不需要的感官特征等方面的潛力是有趣的。在美國和歐洲上市的、與OH-iS-CD締合用于口服給藥的伊曲康唑(itraconazole)就屬于這種情況，當其以單獨的方式給藥時，其明顯地降低了在胃腸道中產(chǎn)生的刺激。另外，使用環(huán)糊精還因為其增加藥物通過皮膚和粘膜的滲透性的能力，這引起藥物的更好和更均勻的吸收。這導致藥物給藥后其活性的增加，例如，氟他胺(flutamide)與OH-j8-CD之間形成的復合體顯著改善了口服給藥后藥物的吸收。在一具體實施方案中，所述環(huán)糊精衍生物是a-環(huán)糊精衍生物或/3-環(huán)糊精衍生物或t環(huán)糊精衍生物。能用于實施本發(fā)明的環(huán)糊精衍生物的示例性的、非限制性的實例包括乙基-j8-CD、七(2,3,6-三-O-乙基)-i3-CD、2-羥丙基-j8-CD、2-0-2-羥丙基-)S-CD、2-羥乙基-j3-CD、琥珀酰化的j8-CD衍生物、琥珀?；?-羥丙基-iS-CD衍生物、丁基-/5畫CD、七(2,6-二-0-正丁基)-Z-CD、七(2，6-二-0-正戊基)-iS-CD、曱基-/3-CD、曱基-i8-CD、羧甲基-i8-CD、羧乙基-]S-CD、七(2，6-二-0-曱基H3-CD、七(2，3,6-三-0-曱基)-i3-CD、乙?；?;3-CD、七(3-0-乙?；?2，6-二-0-正戊基)-18-。0、七(3-0-乙酰基-2,6-二-0-曱基H3-CD、磺基-lS-CD、磺丙基-j3-CD、正丁基-j3-CD、七(3-0-正丁?；?2，6-二-O-戊基)-l8-CD、2-氰基乙基-jS-CD、6-—脫氧-6-單疊氮基-j8-CD、七(2,3,6-三-0-卡基)-j3-CD、七(2,3,6-三-0-苯曱?；鵋3-CD、6-—脫氧-6-單氨基-iS-CD、七(2,6-二-0-正戊基-3-0-三氟乙酰基)-j8-CD、七(2,3，6-三-0-正辛基)-l8-CD、七(2,3-二-0-乙?；?6-0-叔丁基二甲基硅烷基)-i8-CD、七(6-0-叔丁基二曱基硅烷基)-j8-CD、七(6-0-叔丁基二曱基硅烷基-2，3-二-0-甲基)-]3-CD、七(2,6-二-叔丁基二甲基硅烷基)-j8-CD、七(2，3，6-三-O-三氟乙?；?-j8-CD、七(2，6-二-0-曱基-3-0-正戊基)-j8-CD。環(huán)糊精或其衍生物與生物可降解的聚合物之間的重量比能在大范圍內(nèi)變化，在一具體實施方案中，所述環(huán)糊精(或其衍生物)生物可降解的聚合物的重量比為1:1-10，優(yōu)選1:1-5，更優(yōu)選約1:4。在一具體實施方案中，所述生物可降解的聚合物是PVM/MA。如上文所述，在藥物應用中，/3-CD及其衍生物是最常用的，尤其是2-羥丙基-i8-環(huán)糊精(OH-i3-CD)，因為其具有高水溶性、低毒性以及比jS-CD更疏水的空腔。在一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的環(huán)糊精不帶有任何被取代的羥基基團。在一具體實施方案中，所述環(huán)糊精是含有7個a-l，4-吡喃葡萄糖單位的/3-環(huán)糊精(/3-CD)。盡管|3-CD:生物可降解的聚合物的重量比是1:1-10,優(yōu)選1:1-5,l:4的比率提供好的結果。作為示例，約0.25mgj3-CD/mg生物可降解的聚合物提供了有效的締合。在這種情況下，與納米顆粒締合的(3-CD的量是約90微克/mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征是通常具有球形的形狀并且大小接近150nm。在另一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的環(huán)糊精是更親水的/3-CD衍生物，例如包含一個或多個羥基烷基基團(如羥丙基)的羥基化的j8-CD衍生物。在一優(yōu)選的具體實施方案中，使用2-羥丙基-/3-環(huán)糊精(OH-)3-CD)。OH-i8-CD:生物可降解的聚合物的重量比是1:1-10,優(yōu)選1:1-5，盡管1:4的重量比提供了好的結果。作為示例，約0,25mgOH-^-CD/mg生物可降解的聚合物提供了有效的締合。在這種情況下，與納米顆粒締合的/3-CD的量是約65孩t克/mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征是通常具有球形的形狀并且大小接近150nm。在另一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的環(huán)糊精是具有一個或多個不同于羥基的末端官能團的CD^f汙生物，例如具有一個或多個被任選取代的氨基基團的CD衍生物。氨基基團能依次被取代并具有諸如CrQ烷基的其它官能團；所述被取代的氨基基團的示例性實例包括曱胺、乙胺、二乙胺等。在一優(yōu)選的具體實施方案中，所述氨基基團是不帶有取代基的游離氨基基團(-NH2)。在進行的一些分析中，已經(jīng)觀察到通過所述基團，口服給藥的本發(fā)明的納米顆粒在某些腸道部分聚集，這允許特異性的給藥。在一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的環(huán)糊精衍生物是6-—脫氧-6-單氨基-j3-環(huán)糊精(NH-j3-CD)。NH-/3-CD:生物可降解的聚合物的重量比是1:1-10，優(yōu)選1:1-5,盡管l:4的比例提供了好的結果。這些納米顆粒的特征是通常具有球形的形狀并且大小接近150nm。在一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的環(huán)糊精或其衍生物選自j3-環(huán)糊精(/3-CD)、2-羥丙基-j8-環(huán)糊精(OH-]8-CD)、6-—脫氧-6-單氨基-/3-環(huán)糊精^11-|3《0)及其混合物。發(fā)明者進行的一些分析表明，基于生物可降解的聚合物的含有環(huán)糊精的納米顆粒允許在這些載體(納米顆粒)和胃腸道表面成分之間形成直接生物粘附相互作用。當生物活性分子通過任何途徑(如口、直腸、陰道、眼或鼻的途徑)給藥以接近粘膜時，這種緊密接觸對于提高生物活性分子的生物利用度是有趣的。能通過基于例如國際專利申請WO02/069938中描述的溶劑置換法的方法獲得基于生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的含有環(huán)式糊精的納米顆粒(空納米顆粒，即沒有生物活性分子)。作為示例，能通過兩種可選的方法獲得包含生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和環(huán)糊精或其衍生物的所述空納米顆粒，具體地，通過在有機相中同時孵育生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和環(huán)糊精或其衍生物(如/5-CD、OH-i8-CD或NH-j3-CD)這兩種成分[選擇1],或通過將生物可降解的聚合物(如PVM/MA)納米顆粒與環(huán)糊精或其衍生物(如iS-CD、OH-/5-CD或NH-i8-CD)的水溶液孵育[選擇2]。生物活性分子除了生物可降解的聚合物和環(huán)糊精或其衍生物，本發(fā)明的納米顆粒包含生物活性分子。本文所用的術語"生物活性分子"涉及以預防或治療目的，向優(yōu)選人類的個體給予的任何物質；即能用于疾病的治療、治愈、預防或診斷或改善人或動物的身體或精神的健康的任何物質。所述"生物活性分子"術語通常包括藥物和抗原及變應原。本發(fā)明的納米顆粒能并入一個或多個生物活性分子，而與其溶解性特征無關，盡管所述納米顆粒已經(jīng)證明是用于給予疏水生物活性分子的尤其有用的系統(tǒng)。當其通過任何途徑(如口、直腸、鼻、陰道、眼的途徑等)給藥以接近有機體的任何粘膜時，本發(fā)明的納米顆粒允許調節(jié)其含有的生物活性分子的分布。所述生物活性分子的化學性質能在從小分子至大分子化合物(肽、多聚核苷酸等)的大范圍內(nèi)變化。在一具體實施方案中，所述生物活性分子是肽或蛋白質。本文所用的術語"肽"涉及由通過肽鍵結合的氨基酸形成的化合物，并包括寡肽(由IO個或更少的氨基酸形成)和多肽(由多于IO個氨基酸形成)。同樣地，本文所用的術語"蛋白質"涉及由通過肽鍵結合的氨基酸的直鏈形成的高分子量大分子；蛋白質能由一條或數(shù)條肽鏈形成。在另一具體實施方案中，所述生物活性分子是核苷、核苷酸、寡核苷酸、多聚核苷酸或核酸。本文所用的"寡核苷酸"是通過5，-3，磷酸二酯鍵結合的核苷酸的聚合物，其長度等于或少于50個核苷酸，而"多聚核苷酸"是通過5，-3，磷酸二酯鍵結合的核苷酸的聚合物，其長度大于50個單位。同樣地，術語"核酸"也涉及通過5，-3，磷酸二酯鍵結合的核苷酸的聚合物；取決于核苷酸是核糖核酸或脫氧核糖核酸，核酸將分別是RNA或DNA。核酸在活有機體的細胞中有不同的功能，例如，儲存遺傳信息并將其向下一代傳遞(DNA)或在蛋白質合成中表達該信息(mRNA和tRNA),它們是細胞器的結構成分，例如核糖體(rRNA),核酸催化某些化學反應(核糖核酸酶)并參與基因表達的調控機制(通過RNA干擾中mRNA或dsRNA的互補RNA)。在另一具體實施方案中，所述生物活性分子是小(有機或無機)分子；通常，通過化學合成或半合成方法獲得這些分子，或者，從其來源中分離這些分子。在一具體實施方案中，所述小(有機或無機)分子具有相對低的分子量，一般等于或小于5,000,通常等于或小于2,500，有利地，等于或小于1,500。許多治療活性成分具有這些特征從而能用于實施本發(fā)明。盡管存在于本發(fā)明的納米顆粒中的生物活性分子能是親水性物質和疏水性物質，在一具體實施方案中，本發(fā)明的納米顆粒尤其用于給予疏水性生物活性分子。因此，在一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的生物活性分子是疏水性物質。本文所用的"疏水性物質，，是由于其性質或組成而不非常溶解于水性介質的物質，在20。C、pH為1至7.5和大氣壓力的條件下，其通常的溶解度低于1%(每100ml水性溶劑1克活性成分)?；旧先魏问杷陨锘钚苑肿泳苡糜趯嵤┍景l(fā)明。能存在于本發(fā)明的納米顆粒中的疏水性生物活性分子的示例性、非限制性的實例包括抗寄生物劑(如阿苯達唑(albendazole)、曱苯p達唑(mebendazole)、吡全酮(praziquantel)等)、抗真菌劑(如克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑等)、抗生素(如磺胺曱二唑(sulfamethizole)、慶大霉素(gentamicin)、灰黃霉素(griseofulvin)等)、強心劑(如地高辛(digoxin)等)、抗腫瘤劑(如喜樹堿(camptothecin)、曱氨喋呤(methotrexate)、多西紫杉醇(docetaxel)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、紫杉醇等)、免疫抑制劑(如他克莫司(tacrolimus)、環(huán)孢菌素(cyclosporine))、(糖)腎上腺皮質激素(如可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氬化潑尼松(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、去炎松(triamcinolone)等)等。在另一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的生物活性分子是P-糖蛋白的底物物質。實際上，本發(fā)明的納米顆粒的重要應用在于其使P-糖蛋白對某些藥物通過粘膜的吸收的負面影響最小化的能力。已知P-糖蛋白(PGY1;酶EC3.6.3.44)是在人類中被又稱為MDR1(多藥耐藥性l)基因的ABCB1基因編碼的蛋白。P-糖蛋白充當跨膜轉運蛋白或泵，其將其底物(通常是藥物和其它生物異源物質)從其細胞內(nèi)區(qū)域運送至其細胞外區(qū)域。取決于其解剖學位置，P-糖蛋白通過三種主要方式起作用(l)由于P-糖蛋白在腸細胞管腔膜的表達，P-糖蛋白限制藥物物質在其口服給藥后進入有機體；(2)由于P-糖蛋白在肝細胞的小管膜和腎近端小管細胞管腔膜的表達，一旦藥物已經(jīng)達到血液循環(huán)，則P-糖蛋白促進其在膽汁和尿中的消除；和(3)—旦在全身血液循環(huán)中，P-糖蛋白限制了藥物在敏感組織中的滲透。因此，P-糖蛋白的底物物質涉及諸如生物異源物質的具有與P-糖蛋白的細胞內(nèi)區(qū)域相結合的親和力的物質，使得其能夠根據(jù)下列反應通過ATP消耗被傳送至細胞外ATP+H20+生物異源物質(內(nèi)部)=ADP+磷酸鹽+生物異源物質(夕卜部)蛋白底物的示例性的、非限制性的實例包括抗腫瘤劑(如多西紫杉醇、依托泊苷(etoposide)、伊馬替尼(imatinib)、紫杉醇、替尼泊苷(teniposide)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、蒽環(huán)類(如阿霉素(doxorubicin)、道諾霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)等)等)、jS-腎上腺素受體拮抗劑(如布尼洛爾(bunitrolol)、卡維地洛(carvedilol)、塞利洛爾(celiprolol)、他林洛爾(talinolol)等)、Ca"通道阻斷劑(如地爾硫卓(diltiazem)、咪拉地爾(mibefradil)、戊脈安(verapamil)等)、強心藥物(如洋地黃毒甙(digitoxin)、地高辛、奎納定(quinidine)等)、抗病毒劑(如安普那韋(amprenavir)、印地那韋(indinavir)、奈非那韋(nelfmavir)、沙奎那韋(saquinavir)、利托那韋(ritonavir)等)、類固醇(如地塞米松、曱基強的松龍(methylprednisolone)等)、免疫抑制劑(如環(huán)孢菌素A(cyclosporineA)、西羅莫司(sirolimus)、寸也克莫司等)、止吐藥物(多潘立酮(domperidone)、恩丹西酮(ondansetron)等)、抗生素(如紅霉素(erythromycin)、左氧氟沙星(levofloxacin)等)、降血脂劑(如阿伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)等)、組胺受體拮抗劑(如非索芬那定(fexofenadine)、特非那定(terfenadine)等)、和其它治療組的藥物(如阿密曲替林(amitriptyline)、-火水仙石威(colchicine)、異查胍(debrisoquine)、寸尹曲康哇、氯沙坦(losartan)、嗎啡(morphine)、苯妥英(phenytoin)、利3畐平(rifampin)、》文線菌素D(actinomycinD)、拓4卜替康(topotecan)、雌二醇(estradiol)、雷帕霉素(rapamycin)、FK506等)，等等(FrommMF;Trends2004;25:423-429)。在一具體實施方案中，所述生物活性分子是疏水物質或P-糖蛋白酶的底物物質，其選自放線菌素D、阿苯達唑、阿密曲替林、安普那韋、阿伐他汀、布尼洛爾、喜樹堿、卡維地洛、塞利洛爾、環(huán)孢菌素、克霉唑、秋水仙堿、可的+>、道諾霉素、異會胍、地塞米松、洋地黃毒甙、地高辛、地爾硫卓、多西紫杉醇、多潘立酮、阿霉素、表柔比星、紅霉素、雌二醇、依托泊苷、苯妥英、非索芬那定、FK506、氟尿嘧啶、慶大霉素、灰黃霉素、伊馬替尼、印地那韋、伊曲康唑、左氧氟沙星、氯沙坦、洛伐他汀、曱苯噠唑、曱基強的松龍、曱氨喋呤、咪拉地爾、嗎啡、奈非那韋、恩丹西酮、紫杉醇、吡喹酮、氫化潑尼松、潑尼松、奎納定、雷帕霉素、利福平、沙奎那韋、西羅莫司、磺胺曱二唑、利托那韋、他克莫司、他林洛爾、替尼泊苷、特非那定、拓樸替康、去炎松、戊脈安、長春堿、長春新堿及其混合物。在一優(yōu)選實施方案中，存在于本發(fā)明的納米顆粒中的生物活性分子是紫杉醇。在一具體實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括含有一種或多種不同藥物的本發(fā)明的納米顆粒。所述藥物的示例性的、非限制性的實例包括屬于不同治療組的藥劑，例如抗腫瘤劑、^-腎上腺素受體拮抗劑、鎮(zhèn)痛劑、Ca"通道阻斷劑、強心藥物、抗病毒劑、類固醇、免疫抑制劑、止吐藥物、抗生素(如抗菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗寄生物劑等)、降血脂劑、組胺H！受體拮抗劑、抗炎劑、神經(jīng)保護劑(neuroprotector)、抗過敏劑、平喘劑、抗生素、肺表面活性物質等。能觀察到某些是P-糖蛋白底物的生物活性分子具有疏水性。同樣地，本發(fā)明提供的用于生物活性分子給藥的系統(tǒng)考慮了多個治療組的藥物給藥的可能性。在另一具體實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的納米顆粒，該納米顆粒含有一種或多種不同的用于疫苗目的的抗原或者一種或多種不同的用于免疫治療目的的變應原作為生物活性分子。本說明書中所用的術語"抗原"涉及當被導入個體時，能夠被個體的免疫系統(tǒng)識別和/或能夠在個體中誘導導致B和/或T細胞激活的體液免疫應答或細胞免疫應答的任何物質；作為示例，所述術語包4舌從高等有機體或諸如細菌、病毒、寄生生物、原生動物、真菌等的微生物獲得的任何天然或重組的免疫原性產(chǎn)物，其含有一種或多種抗原決定簇，例如所述有機體的結構成分；毒素，例如外毒素。幾乎任何抗原均能用于制備負載有抗原的本發(fā)明的納米顆粒。作為非限制性的示例，術語"抗原"包括-"微生物"抗原，即微生物的抗原，其包括但不限于傳染性病毒、細菌、真菌和寄生生物；所述抗原包括天然或人工來源的完整的微生物及其部分、片段和衍生物，以及與微生物天然抗原相同或類似，并對該微生物誘導特異性免疫應答的合成或重組產(chǎn)物；從這個意義上講，如果化合物誘導了像微生物的天然抗原的免疫應答一樣的(體液和/或細胞)免疫應答，則該化合物類似于該微生物的天然抗原；本領域的技術人員常規(guī)地使用所述抗原；和-"肺瘤"抗原，即與腫瘤或癌癥("腫瘤標記")有關的諸如肽的物質，其能引起免疫應答，尤其是當存在于MHC分子的環(huán)境中時，所述MHC例如Her2(乳腺癌)；GD2(神經(jīng)母細胞瘤)；EGF-R(惡性膠質母細胞瘤)；CEA(髓樣甲狀腺癌)；CD52(白血病)；人黑素瘤gpl00蛋白；人黑素瘤Melan-A/MART-1蛋白；酪氨酸酶；NA17-Ant蛋白；MAGE-3蛋白；p53蛋白；HPV16E7蛋白；所述抗原的抗原性片段等。本說明書中所用的術語"變應原"涉及個體對其敏感并導致免疫反應的物質，例如，花粉變應原提取物、昆蟲變應原提取物、食物或食物產(chǎn)品變應原提取物、存在于昆蟲唾液、螯或刺中并在個體中誘導敏感性反應的成分、存在于植物中并在個體中誘導敏感性反應的成分等，例如諸如禾本科花粉、變應原性黑麥草提取物、變應原性洋橄欖(橄欖)提取物等的花粉蛋白提取物；諸如來自塵螨等的昆蟲蛋白提取物、變應原性食物成分提取物等。幾乎任何變應原都能用于制備本發(fā)明組合物的負載有變應原的納米顆粒；然而，在一具體實施方案中，所述變應原是卵白蛋白(OVA)，其是廣泛地用作試驗變應原模型的蛋白質。能夠含有本發(fā)明的納米顆粒的生物活性分子的示例性的、非限制性的實例包括細菌抗原細胞質、周質、胞外被膜抗原(如內(nèi)膜蛋白、外膜蛋白、脂多糖及雜配物(mixedcomplex)、與細胞壁締合的蛋白質等)等；表面結構抗原(如菌毛、多糖蛋白質復合物(glycocalix)、鞭毛等)，其包括諸如布魯氏菌(5n/ce〃a沙門氏菌(Sa/附o"e〃flsp.)的細月包內(nèi)病原體的表面結構抗原；真核微生物的可溶解的抗原和表面抗原；病毒抗原，如基質、衣殼、被膜、內(nèi)部(包括酶的)抗原、動物物種(螨等)變應原、植物(禾本科等)變應原等。能通過基于諸如國際專利申請WO02/069938中描述的溶劑置換法的方法獲得本發(fā)明的納米顆粒，該溶劑置換法包括(i)形成(環(huán)糊精或其衍生物)-(生物活性分子)復合體，在下文中稱為[CD:BAM]復合體，和(ii)在形成納米顆粒之前，將所述[CD:BAM]復合體并入生物可降解的聚合物的有機溶劑的溶液中。簡單地說，所述[CD:BAM]復合體的形成包括向環(huán)糊精或其衍生物(CD)的水溶液中添加生物活性分子(BAM)的諸如例如乙醇的醇的有機溶劑的溶液。攪拌混合物直至達到平衡。通過諸如減壓蒸發(fā)或任何用于除去溶劑的其它系統(tǒng)的任何合適的常規(guī)方法除去水和有機溶劑(如乙醇)。存在于所述[CD:BAM]復合體中的CD:BAM的摩爾比能在大范圍內(nèi)變化，除了其它因素以外，該比率取決于所述復合體中存在的環(huán)糊精或其衍生物(CD)和生物活性分子；然而，在一具體實施方案中，存在于所述[CD:BAM]復合體中的CD:BAM的摩爾比是1:1-4,通常是1:1-2。在一具體實施方案中，當生物活性分子是紫杉醇時，所述[CD:BAM]復合體中的CD:BAM的摩爾比是1:1。能在形成納米顆粒之前，以下列方式將所述[CD:BAM]復合體并入到生物可降解的聚合物的有機溶劑的溶液中向生物可降解的聚合物的溶液中添加所述復合體，然后在攪拌下(例如通過使用超聲、磁力或23機械攪拌器)以及約20。C至30。C的溫度下，將生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和[CD:BAM]復合體這兩種成分在包含生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的有機相(如丙酮)中，同時孵育通常是10分鐘至60分鐘的合適時間段(在一具體實施方案中，當生物活性分子是紫杉醇時，能在室溫(25。C)下孵育培育30分鐘的時間段)；通過以這種方式操作，通常獲得[CD:BAM]復合體與生物可降解的聚合物的高度締合。簡單地說，該步驟包括在有機溶劑(如丙酮)中同時溶解和/或分散生物可降解的聚合物和[CD:BAM]復合體。將混合物在室溫下，攪拌孵育一定的時間段。優(yōu)選地，生物可降解的聚合物的濃度為0.001%w/v至10%w/v，并且所述[CD:BAM]復合體的濃度為0.001%w/v至5%w/v。任選地，若需要，向所述溶液中添加一定體積與聚合物溶液可混溶的極性溶劑(如乙醇)。另外，任選地，若需要，如WO02/069938中描述的那樣，能使用交聯(lián)劑改善納米顆粒的穩(wěn)定性。能使用的交聯(lián)劑的示例性實例包括二胺化的分子(如1,3-二氨基丙烷等)、多糖或簡單的糖類、蛋白質、以及一般地具有能與存在于生物可降解的聚合物中的基團反應的官能團的任何分子，例如，與存在于PVM/MA中的酸酐基團反應。然而，一般不需要交聯(lián)，因為交聯(lián)由于存在環(huán)糊精或其衍生物而同時發(fā)生。如果期望交聯(lián)，應添加少量任何指出的產(chǎn)品。然后，為了形成本發(fā)明的納米顆粒，向前述混合物中添加類似體積的第二非溶劑液體，優(yōu)選水醇溶液。在一具體實施方案中，使用藥物品質的水(根據(jù)應用，純化水或注射用水(wfi))。優(yōu)選地，有機相水醇溶液體積比在1:1至1:10的范圍內(nèi)。當出現(xiàn)乳狀懸浮時，即刻在介質中形成了納米顆粒。能通過諸如減壓蒸發(fā)的任何合適的方法除去有機溶劑，而納米顆粒保留在穩(wěn)定的水性懸浮液中。若需要，能通過諸如離心、超速離心、切向過濾或包括使用真空的蒸發(fā)的常規(guī)方法可能地純化所述納米顆粒。最后，若需要，能夠將納米顆粒凍干以用于長期貯存和保存。為了有利于凍干，能夠使用諸如蔗糖、乳糖或甘露糖醇的普通冷凍防護劑，優(yōu)選其濃度為0.1%至10%重量比?；蛘?，能通過包括將生物可降解的聚合物(如PVM/MA)納米顆粒與包含[CD:BAM]復合體的水溶液孵育的方法獲得基于生物可降解的聚合物的本發(fā)明的納米顆粒。筒單地說，該替代選擇包括將生物可降解的聚合物溶解于諸如丙酮的有機溶劑中。然后，向該溶液中添加一定體積的諸如乙醇的水醇溶液，最后向該溶液中添加類似體積的水。當出現(xiàn)乳狀懸浮時，即刻在介質中形成了納米顆粒。通過類似于上文的方法中描述的方式，例如通過減壓蒸發(fā)，除去有機溶劑，而納米顆粒保留在穩(wěn)定的水性懸浮液中。然后在包含前述獲得的[CD:BAM]復合體的水溶液中孵育生物可降解的聚合物的納米顆粒。在類似于對于上文的方法所描述的條件下，在合適的溫度下和攪拌下(如通過使用超聲、^f茲力或機械攪拌器)將生物可降解的聚合物的納米顆粒與[CD:BAM]復合體的醉育進行一定的時間段(一般地，在20°C至30°C的溫度下，孵育IO分鐘至60分鐘的時間段)。然后通過諸如離心的常規(guī)方法純化納米顆粒，最后，若需要，按照相同的前述方法將其凍干。存在于本發(fā)明的納米顆粒中的BAM:生物可降解的聚合物的重量比能在大范圍內(nèi)變動，除了其它因素，該比例取決于存在于所述納米顆粒中的生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和生物活性分子；然而，在一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的所述納米顆粒中的BAM:生物可降解的聚合物的重量比是1:4-20，優(yōu)選1:10。存在于本發(fā)明的納米顆粒中的[CD-BAM]復合體生物可降解的聚合物的比率能在大范圍內(nèi)變動，除了其它因素，該比例取決于存在于所述納米顆粒中的生物可降解的聚合物(如PVM/MA)、環(huán)糊精或其衍生物以及生物活性分子(BAM);然而，在一具體實施方案中，存在于本發(fā)明的所述納米顆粒中的[CD-BAM]復合體生物可降解的聚合物的重量比是1:1-20，有利地是1:2-20,優(yōu)選3:10(約1:3.3)。在一具體實施方案中，生物可降解的聚合物是PVM/MA。在另一具體實施方案中，生物活性分子是紫杉醇。在另一具體實施方案中，環(huán)糊精衍生物是/5-環(huán)糊精(卩-CD)、2-羥丙基-lS-環(huán)糊精(0H-i3-CD)或6-—脫氧-6-單氨基-(8-環(huán)糊精(NH-j8-CD)。在另一具體實施方案中，生物活性分子是紫杉醇并且(環(huán)糊精或其衍生物)紫杉醇的摩爾比是l:l。在一具體實施方案中，[CD:BAM]復合體是摩爾比為1:1的/3-CD:紫杉醇復合體，并且紫杉醇生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的重量比是1:4-20，盡管接近1:10的比率提供了好的結果。作為示例，每mg聚合物對應摩爾比為1:1的j8-CD:紫杉醇的復合體中約0.25mg的紫杉醇提供了有效的締合。在這種情況下，與納米顆粒締合的藥物的量是約40微克紫杉醇/mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征是形狀為球形并且大小接近300nm。在另一具體實施方案中，[CD:BAM]復合體是摩爾比為1:1的OH-j8-CD復合體，并且紫杉醇生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的重量比是1:4-20，盡管接近1:10的比率提供了好的結果。作為示例，每mg聚合物對應摩爾比為1:1的OH-jS-CD:紫杉醇的復合體中約0.25mg的紫杉醇提供了有效的締合。在這種情況下，與納米顆粒締合的藥物的量是約170微克紫杉醇/mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征是形狀為球形并且大小接近300nm。在另一具體實施方案中，[CD:BAM]復合體是摩爾比為1:1的NH-i8-CD復合體，并且紫杉醇生物可降解的聚合物(如PVM/MA)的重量比是1:4-20，盡管接近1:10的比率提供了好的結果。作為示例，每mg聚合物對應摩爾比為1:1的OH-/3-CD:紫杉醇的復合體中約0.25mg的紫杉醇提供了有效的締合。在這種情況下，與納米顆粒締合的藥物的量是約100微克紫杉醇/mg納米顆粒。這些納米顆粒的特征是形狀為球形并且大小接近300nm。在另一具體實施方案中，當配制在含有j8-CD的本發(fā)明的納米顆粒中的劑量為10mg/kg的紫杉醇被口服給藥時，在約5小時內(nèi)達到最大血漿濃度(Cmax)后，獲得了至少24小時的恒定和持續(xù)的血漿水平。最大血漿濃度(Cmax)與商業(yè)制劑的靜脈內(nèi)給藥后獲得的最大血漿濃度相似。通過這種制劑獲得的紫杉醇血漿曲線下面積(AUC)比以相同劑量靜脈內(nèi)給藥的商業(yè)醫(yī)藥產(chǎn)品獲得的紫杉醇血漿曲線下面積大約5倍。這種制劑的特征是其提供的有機體中藥物的平均停留時間(MRT)比商業(yè)制劑的靜脈內(nèi)給藥后獲得的平均停留時間長約4倍。在另一具體實施方案中，當配制在含有OH-/3-CD的本發(fā)明的納米顆粒中的劑量為10mg/kg的紫杉醇被口服給藥時，在約6小時內(nèi)達到26最大血漿濃度(Cmax)后，獲得了至少24小時的恒定和持續(xù)的血漿水平。最大血漿濃度比商業(yè)制劑的靜脈內(nèi)給藥后獲得的最大血漿濃度大2倍。通過這種制劑獲得的紫杉醇血漿曲線下面積(AUC)比以相同劑量靜脈內(nèi)給藥的商業(yè)藥劑獲得的紫杉醇血漿曲線下面積大約5倍。這種制劑的特征是其提供的有機體中藥物的平均停留時間(MRT)比商業(yè)制劑的靜脈內(nèi)給藥后獲得的平均停留時間長約3.5倍。在另一具體實施方案中，當配制在含有NH-iS-CD的本發(fā)明的納米顆粒中的劑量為10mg/kg的紫杉醇被口服給藥時，在約4.7小時內(nèi)達到最大血漿濃度(Cmax)后，獲得了至少24小時的恒定和持續(xù)的血漿水平。最大血漿濃度約是商業(yè)制劑的靜脈內(nèi)給藥后獲得的最大血漿濃度的一半。通過這種制劑獲得的紫杉醇血漿曲線下面積(AUC)與以相同劑量靜脈內(nèi)給藥的商業(yè)醫(yī)藥產(chǎn)品獲得的紫杉醇血漿曲線下面積類似。這種制劑的特征是其提供的有機體中藥物的平均停留時間(MRT)比商業(yè)制劑的靜脈內(nèi)給藥后獲得的平均停留時間長約3倍。藥物組合物另一方面，本發(fā)明涉及包含至少本發(fā)明的納米顆粒和藥物可接受的賦形劑、載體或佐劑的藥物組合物。一般地，所述生物活性分子將與環(huán)糊精或其衍生物形成復合體，并且所述復合體將主要在本發(fā)明的納米顆粒內(nèi)；然而，能發(fā)生的是，含有生物活性分子的復合體的相當大部分與納米顆粒的表面結合，盡管其大部分在本發(fā)明的納米顆粒內(nèi)部(如被封裝)。當本發(fā)明的納米顆粒以接近有機體的任何粘膜的途徑(包括口、直腸、鼻、陰道或眼的途徑)給藥時，其能用于調節(jié)締合的生物活性分子的分布。另外，其也能被腸胃外給藥。藥物組合物的實例包括用于口、頰、舌下、局部、眼、鼻、陰道或腸胃外給藥的任何流體組合物(納米顆粒的懸浮液或分散體)；用于其局部、眼、鼻或陰道給藥的凝膠、軟膏、乳膏或香脂形式的任何組合物；或用于其口服給藥的任何固體組合物(片劑、膠嚢劑)。在一具體實施方案中，藥物組合物被口服給藥。在另一具體實施方案中，所述藥物組合物被腸胃外給藥。描述的藥物組合物對于每一制劑會包含合適的賦形劑。例如，在片劑或膠嚢劑形式的口服制劑的情況下，若需要，將包括粘合劑、崩解劑、潤滑劑、填充劑、腸溶衣等。通過混合、濕法或干法造粒和并入本發(fā)明的納米顆粒常規(guī)地制備口服固體制劑。還能使藥物組合物適應于以諸如無菌溶液、懸浮液或凍干產(chǎn)品的形式并以合適的劑型進行的其腸胃外給藥；在這種情況下，所述藥物組合物將包括諸如緩沖劑、表面活性劑等的合適的賦形劑。在任何情況下，將根據(jù)所選的藥物劑型選擇賦形劑。在C.FauliiTrillo的專著"TratadodeFarmaciaGal6nica"10thEdition,1993，Luzdn5,S.A.deEdiciones中能找到關于藥物的不同藥物劑型及其制備的綜述。本發(fā)明的納米顆粒中并入的生物活性分子的比例能在大范圍內(nèi)變化，例如，其能高達相對于納米顆?？傊亓康?5%重量比。然而，在每一情況下，合適的比例將取決于被并入的生物活性分子。被給藥的本發(fā)明的納米顆粒的劑量能在大范圍內(nèi)變化，例如每kg體重約0.01mg至約10mg，優(yōu)選每kg體重O.lmg至2mg。以下通過一些并不限制而是說明本發(fā)明的實施例描述本發(fā)明。實施例以下的實施例描述了基于生物可降解的聚合物(PVM/MA)的包含環(huán)糊精的納米顆粒(實施例1-5)和基于生物可降解的聚合物(PVM/MA)的包含環(huán)糊精和生物活性分子的納米顆粒(實施例6和7)的制備和表征，其中所述生物活性分子與環(huán)糊精締合和/或與形成所述納米顆粒的基質的生物可降解的聚合物(PVM/MA)締合。所述實施例示出納米顆粒發(fā)展與粘膜的生物粘附相互作用及促進諸如紫杉醇的生物活性分子的口服吸收的能力。在所述實施例中能觀察到，當使用紫杉醇作為在物活性分子時，其被并入基于PVM/MA并包含環(huán)式糊精，尤其是2-羥丙基-/3-環(huán)式糊精的所述納米顆粒中，允許獲得至少24小時的藥物物質恒定和持續(xù)的血漿水平。以下描述了用于制備和表征所述納米顆粒的一般方法。A.含有環(huán)糊精和任選的生物活性分子的納米顆粒的制備制備基于生物可降解的聚合物(PVM/MA)、包含環(huán)糊精和任選的生物活性分子的納米顆粒的方法是前述的基于聚合物的可控去溶劑化的一般方法[ArbosWa/.，J.Control.Release,83(2002)321-330]的修改。為了該目的，在磁力攪拌下將甲基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物和一定量的環(huán)糊精或者通過常規(guī)方法(如Hamada"a/.,JBiosciBioeng102(4):369-71,2006)獲得的環(huán)糊精生物活性分子復合體溶解在丙酮中。孵育后，在磁力攪拌下，向該相中添加可混溶的有機溶劑(乙醇)和類似體積的去離子水，以在乳狀懸浮出現(xiàn)時形成納米顆粒。然后通過減壓蒸發(fā)除去有機溶劑(乙醇和丙酮)，而顆粒保留在穩(wěn)定的水性懸浮液中。任選地，能用水溶性的生物活性分子或為所得的納米顆粒提供特異性靶向屬性(targetingproperties)的配體包被形成的納米顆粒。在使納米顆粒懸浮液均勻化后，將其減壓蒸發(fā)直至除去這兩種有機溶劑，例如通過使用諸如BiichiR-144旋轉蒸發(fā)儀(Switzerland)的旋轉蒸發(fā)儀。然后通過超速離心(Sigma3k30,rotorNo,12150，Germany)或切向過濾純化懸浮液，并可能地在-80。C冷凍納米顆粒，以用于隨后的凍干和長期保存(VirtisGenesis,NewYork,UnitedStates)。B.納米顆粒的物理化學表征納米顆粒的表征涉及下文描述的一些研究。在物理化學研究中，測定了納米顆粒的粒徑和表面電荷，其中后者通過測量f電勢而測定。通過光子相關光i普法(photoncorrelationspectroscopy),<吏用ZetasizernanoZ-S(MalvernInstruments/Optilas，Spain),獲得這兩種參數(shù)。通過兩種方法計算方法的收率。在第一種方法中，使用沒有冷凍防護劑的凍干樣品的重量，根據(jù)公式I，重量分析地計算收率收率=(凍干物的重量/初始重量^100[公式l]其中初始重量是加入到制劑中的生物可降解的聚合物(如PVM/MA)和環(huán)糊精的重量；并且凍干物的重量是凍干過程后制劑的重量。第二種方法基于通過與ELSD(蒸發(fā)光散射檢測(evaporativelight-scatteringdetection))型檢測器聯(lián)用的高效液相色譜(HPLC)(Agueros&a/"J.Pharm.andBiomed.Anal"39(2005)495-502)，通過下文描述的定量的方法進行的定量，其允許對環(huán)糊精和PVM/MA共聚物進行定量。在這種情況下，根據(jù)公式2計算收率收率-(Q初始-Qpvm/ma)x100[公式2]其中Q初始是添加的PVM/MA的初始的量；并且Qpvm/ma是上清液中測定的PVM/MA的量。通過掃描電子顯微法(scanningelectronmicroscopy)(Zeiss,DSM940AGermany)觀察納米顆粒的形態(tài)學。為了該目的，用約9nm的分子金層包4皮凍干的納米顆粒(EmitechK550Equipment,Sputter-Coater，UnitedKingdom),并用ZeissDMS940A顯微鏡(UnitedStates)拍照。為了證實存在與納米顆粒締合的環(huán)糊精(定量方法如下文所述)，使用LECOCHN-900型元素分析儀(LECOCorporation,UnitedStates),對不同的納米顆粒制劑進行了元素分析。與納米顆粒締合的環(huán)糊精的量的定量為了測定與納米顆粒締合的未被胺化的環(huán)糊精[如jS-環(huán)糊精(/3-CD)和2-鞋丙基-jS-環(huán)糊精(OH-]S-CD)]的量，使用與ELSD型檢測器聯(lián)用HPLC方法。在1100系列LC型色語儀(Agilent，Waldbomn，Germany)中進4亍分析，并4吏用Chem-StationG217l程序(Agueros"a/"J.Pharm.andBiomed.Anal.,39(2005)495-502)在惠普計算機中分析數(shù)據(jù)。為了樣品分析，用純化水將納米顆粒純化過程后獲得的上清液稀釋至10ml。添加內(nèi)標物(PEG6000)后，取lml等4分的上清液作為樣品。4吏用ZorbaxEclipseXDB-Phenyl色i普4主(Agilent150mmx2.1mm)和水/乙腈的梯度混合物(參見表1)作為流動相，以0.25ml/min的流量分析該樣品。30表l流動相的梯度條件(A:乙腈；B:水)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>優(yōu)化檢測器(ELSD)的條件直至根據(jù)流動相使用的梯度達到最大靈敏度(霧化器溫度115°C;氮氣流量3.2ml/min)。在不到15分鐘內(nèi)色語分離了不同的環(huán)糊精、PVM/MA和內(nèi)標物(PEG6000)。保留時間是對于PVM/MA是1.08±0.05分鐘；對于/3-CD是4.58±0.07分鐘；對于OH-i8-CD是10.27土0.06分鐘；和對于內(nèi)標物是13.60±0.04分鐘。環(huán)糊精的定量極限是0.2mg/ml，聚合物(PVM/MA)的定量極限是0.05mg/ml。準確度不超過7%的極限。在對與納米顆粒締合的胺化的環(huán)糊精[如6-—脫氧-6-單氨基-i8-環(huán)糊精(NH-0-CD)]進行定量的情況下，使用了上文描述的方法的變種以防止環(huán)糊精和聚合物的峰的重疊。因此，使用加熱至40。C的NH2-Zorbax色譜柱(Agilent4.6x150mm,5nm)并使用流量為1ml/min的曱醇/水混合物(80/20v/v)作為流動相來分析樣品。檢測器(ELSD)的條件如下霧化器溫度71。C并且氮氣流量1.9ml/min。在不到7分鐘內(nèi)色譜分離了6-—脫氧-6-單氨基-^環(huán)糊精。保留時間是3.8士0.07分鐘。最后，與納米顆粒締合的環(huán)糊精(CD)的量被計算為初始添加的CD的量和上清液中定量的CD的量的差。RBITC的定量通過比色法，在540nm的波長下測定并入在納米顆粒中的羅丹明B異硫氰酸酯(RBITC)的量(LabsystemsiEMSReaderMF,Finland)。對于該定量，使用了范圍是5pg/ml至50lag/ml的RBITC在0.1NNaOH中的才交準曲線，r=0.999。RBITC的量纟皮估計為添加的初始量和一定量的納米顆粒在O.lNNaOH中全部水解(24h，37。C)后發(fā)現(xiàn)的量的差。RBITC的釋放在Vivaspin100,000MWCO滲析管(VIVASPIN，Hannover,Germany)中進行RBITC從納米顆粒中釋放的動力學。為了該目的，在37士1。C下，將10mg納米顆粒分散于lml模擬的胃介質(Oh-lh)或模擬的腸介質(lh至24h)(USPXXIII)中。在一定的時間，將納米顆粒的懸浮液離心(5,000xg，15min)，并用比色法(入=540nm)定量濾液中RBITC的量。紫杉醇的定量用HPLC測定封裝于納米顆粒中的紫杉醇的量。在與二極管陣列UV檢測系統(tǒng)聯(lián)用的1100系列LC型色語儀(Agilent,Waldbornn，Germany)進行分析。通過Chem-StationG2171程序在惠普計算機中分析數(shù)據(jù)。為了分離紫杉醇，使用加熱至30。C的PhenomenexGeminiC18反相色譜柱(150mmx3mm;5pm)。流動相由磷酸調節(jié)溶液(pH-2;0.01M)和乙腈的混合物(體積比為50/50)組成，并以0.5ml/min的流量泵送。在288nm進行檢測。為了分析新鮮樣品，取IOOpl水性納米顆粒懸浮液并用100pl乙腈將其破壞。將溶劑蒸發(fā)(離心蒸發(fā)器)，并將樣品在所用的流動相中重建。將IOOpl等份進樣至HPLC柱中進行分析。C.生物粘附研究使用先前描述的方案[Arbos"a/.，Int.J.Pharm.,242(2002)129-136]，根據(jù)納瓦拉大學倫理學委員會(EthicsCommitteeoftheUniversityofNavarra)的規(guī)章和試驗動物歐洲法規(guī)(86/609/EU)進行生物粘附研究。為了該目的，將平均體重為225g的雄性Wistar大鼠(Harlan,Spain)保持在沒有食物和水的正常條件下。將lml包含10mg用RBITC標記的納米顆粒的水性懸浮液向動物口服給藥。在不同的時間(0.5、1、3和8小時)通過頸推脫位處死動物。打開腹腔，移除胃腸道并將其分成6個解剖學區(qū)域胃(Sto)、小腸(Il、12、13和I4)和盲腸(Ce)?？v向打開每一粘膜^:并用PBS(pH7.4)淋洗。依次將每一這些部分切成5個類似的部分，并用lml的3MNaOH消化組織24小時。用2ml曱醇提取羅丹明，將其渦流攪拌1分鐘然后在2,000xg下離心10分鐘(5804RCentrifuge,RotorA-4-44,Germany)。將lml等份獲得的上清液用水(3ml)稀釋，并用焚光光譜法在Xex540nm和Xem580nm(GENios，Austria)進行分析以估計粘附至粘膜的納米顆粒部分。通過向進行相同的提取步驟的對照組織片段中添加RBITC的3MNaOH的溶液(0.5|ig/ml-10pg/ml)來制備校正線(r〉0.996)。為了比較不同的制劑，研究了生物粘附動力學和曲線。為了該目的，將粘附的納米顆粒部分對時間作圖，從而獲得生物粘附曲線?；诤笳?，并4吏用WinNonlin1.5計算機應用(PharsightCorporation,UnitedStates),測定了如下的動力學生物粘附參數(shù)Qmax、AUCadh、Tmax、MRTadh和Kadh(Arbos"J.Control.Release,89(2003)19-30)。Qmax(mg)是粘附至胃腸粘膜的納米顆粒的初始最大容量，這涉及其發(fā)展生物粘附相互作用的能力。AUCadh(mg.h)是粘附的納米顆粒部分的曲線下面積，其代表生物粘附強度。MRTadh(h)是估計的制劑保持粘附至粘膜的平均時間。Kadh被定義為粘附在粘膜中的部分的消除速率。所有的這些參數(shù)都在0小時至8小時內(nèi)進行估計。使用WinNonlin1.5程序(PharsightCorporation,UnitedStates)進行計算。D.粘附至粘膜的納米顆粒的觀察通過熒光顯微法觀察胃腸粘膜中含有環(huán)糊精和任選的生物活性分子的納米顆粒的顯示。為了該目的，使用含有RBITC的制劑。將所述制劑(10mg納米顆粒)向實驗室動物(雄性Wistar大鼠)口服給藥并在兩小時后將動物處死。處死后，提取胃腸道，收集小腸的不同部分，并且如上文的生物粘附研究中所描述的那樣，將其用磷酸鹽緩沖鹽水(pH=7.4;0.15M)洗滌。將不同的腸部分用O.C.T.(Sakura,Netherlands)處理，并在液氮中冷凍。然后在溫恒溫器(2800FrigocutE，Reichert-Jung，Germany)中，將組織樣品切成5pm厚的部分，并將其固定至支持物以通過熒光顯微法進行觀察。E.藥代動力學研究根據(jù)納瓦拉大學倫理學委員會的規(guī)章以及試驗動物歐洲法規(guī)(86/609/EU)，進行藥代動力學研究。為了該目的，在給予制劑之前12小時，將平均體重為225g的雄性Wistar大鼠(Harlan，Spain)隔離于代謝籠中，不讓其進食，但是允許其隨意飲水。將動物分成8個處理組(每組6個動物)并用并入任何如下制劑的10mg/kg(2.25mg)的單一劑量紫杉醇進行處理(i)Taxol⑧的i.v.溶液(Bristol國MyersSquibb,Madrid,Spain);(ii)Taxol⑧的口月良溶液；(iii)紫杉醇(PTX)-2-羥丙基j-c環(huán)糊精(OH-/3-CD)[PTX-OH-/3-CD]復合體；(iv)紫杉醇(PTX)-j3-環(huán)糊精(j8-CD)[PTX-j8-CD]復合體；(v)紫杉醇(PTX)-6-—脫氧-6-單氨基環(huán)糊精(NH-i8-CD)[PTX-NH-]8-CD]復合體；(vi)基于PVM/MA(NP)的紫杉醇(PTX)-2-羥丙基-/3-環(huán)糊精(OH-i8-CD)-納米顆粒[PTX-OH-i8-CD-NP]復合體；(vii)基于PVM/MA(NP)的紫杉醇(PTX)-i8-環(huán)糊精(/5-CD)-納米顆粒[PTX-Z3-CD-NP]復合體；和(viii)基于PVM/MA(NP)的紫杉醇(PTX)-6-—脫氧-6-單氨基-Z-環(huán)糊精-納米顆粒[PTX-NH-i3-CD-NP]復合體。除了通過尾靜脈給藥(0.3ml)的i.v.溶液(商業(yè)制劑)的情況外，向動物給予溶解或分散于水中的1ml的不同制劑。給藥后，使用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑，在不同的時間提取約300pl體積的血液，并通過腹膜內(nèi)(i.p.)途徑用等體積的生理鹽水恢復動物(大鼠)的血液體積。將血液在5,000rpm下離心10分鐘并將上清液(血漿)冷凍于-80。C。根據(jù)國際動物試驗指南(WHOChronicle,39(2):51-56,1985;ACIOMSEthicalCodeforAnimalExperimentation)中包括的原則，通過納瓦拉大學倫理學委員會認可的方案進行研究。樣品的預處理通過液-液萃取方法，使用叔丁基曱基醚作為萃取溶劑，從血漿中萃取紫杉醇。為了該目的，取血漿等份(O.lml),用水將其調節(jié)至lml的體積，并向其中添加0.2pg多西紫杉醇作為內(nèi)標物。然后添加4ml叔丁基曱基醚并攪拌l分鐘。然后將樣品在10,000rpm下離心10分鐘，收集上清液(有機相)并將其在離心蒸發(fā)器(Savant，Barcelona,Spain)中蒸發(fā)。將獲得的萃取液通過渦流攪拌l分鐘，在200itil乙腈與磷酸調節(jié)溶液(pH-2;0.01M)的混合物(50/50v/v)中重建。將所得溶液轉移至進樣瓶中。分析方法HPLC通過具有紫外-可見檢測的高效液相色譜(HPLC)進行紫杉醇的定量。使用多西紫杉醇作為內(nèi)標物。在1100系列LC型色譜儀(Agilent，Waldbornn,Germany)中進行分析。通過Chem-StationG2171程序在惠普計算機中分析數(shù)據(jù)。為了分離紫杉醇，使用加熱至30。C的150mmx3mm;5pm的GeminiC18反相色i普柱(Phenomenex)。流動相由磷酸調節(jié)溶液&11=2;0.01M)與乙腈的混合物(50/50的體積比)形成，并以0.5ml/min的流量驅動其通過色語柱。在228nm下進行檢測。驗證了分析方法，證實了在40ng/ml至3，200ng/ml的濃度范圍內(nèi)，檢測器的響應與紫杉醇的血漿濃度之間的線性關系。藥代動力學分析<吏用WiNNonlin1.5藥代動力學調節(jié)程序(PharsightCorporation,35MountainView,UnitedStates)的非房室調節(jié)方法對紫杉醇給藥后血漿濃度數(shù)據(jù)隨時間的變化進行藥代動力學分析。計算了如下的藥代動力學參數(shù)最大濃度(Cmax)、達到C匪的時間(tmax)、血漿水平曲線下面積(AUCO-inf)、平均停留時間(MRT)以及末端消除相中的生物學半衰期(t1/2z)、清除率(Cl)和穩(wěn)態(tài)分布容積。通過AUMC(—次矩血漿濃度的曲線下面積)的值與AUC的值的比計算平均停留時間(MRT)。清除率(C1)被計算為劑量x生物利用度/AUC，穩(wěn)態(tài)分布容積(Vss)被計算為清除率與被計算為1/MRT的末端清除常數(shù)(k)的比。F.統(tǒng)計學分4斤為了進行生物粘附和藥代動力學研究，使用非參數(shù)"Mann-Whitney"測試來分析制劑。P<0.05的值被認為是顯著的。使用SPSS⑧統(tǒng)計學軟件程序(SPSS⑧10，Microsoft,UnitedStates)進行所有的計算。實施例l間的締合過程的優(yōu)化通過修改先前描述的方法[Arbos&a/.,J.Control.Release,83(2002)321-330]后的可控去溶劑化制備納米顆粒。為了該目的，在磁力攪拌下，將曱基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物和一定量的/3-環(huán)糊精(jS-CD)、2-羥丙基-j8-環(huán)糊精(OH-i8-CD)或6-—脫氧-6-單氨基-|3-環(huán)糊精(1^11-/3《0)在丙酮中孵育。孵育后，在i茲力攪拌下，向該相中添加可混溶的有機溶劑(乙醇)和類似體積的去離子水，在出現(xiàn)乳狀懸浮時形成納米顆粒。在使納米顆粒懸浮液均勻后，將其減壓蒸發(fā)(BtichiR-144rotaryevaporator,Switzerland)直至除去這兩種有才幾溶劑。然后用超速離心(Sigma3k30,rotorNo.-12150,Germany)純化該懸浮液。將一部分獲得的納米顆粒冷凍于-80。C以用于其隨后的凍干和長期保存(VirtisGenesis,NewYork,UnitedStates)。圖l示出制備納米顆粒時，根據(jù)孵育時間，與具有生物可降解的聚合物(PVM/MA)的納米顆粒締合的環(huán)糊精的量。在所有的情況下，觀察到了CD和聚合物之間最優(yōu)的孵育時間。該孵育時間是30分鐘。最后，必須強調的是，j3-CD比其羥基化(OH-^CD)或氨基化(NH-j8-CD)衍生物更有效地與PVM/MA納米顆粒締合。根據(jù)獲得的結果，選擇如下的試驗條件用于隨后的研究-環(huán)糊精PVM/MA共聚物的比例為1:4;和-孵育時間為30分鐘。實施例2含有環(huán)糊精的納米顆粒的制備2.1含有環(huán)糊精的納米顆粒的制備通過》務改先前描述的方法[ArbosWa/.,J.Control.Release,83(2002)321-330]后的可控去溶劑化制備納米顆粒。為了該目的，借助于超聲(MicrosonTM或在冷卻下在超聲浴中l(wèi)分鐘)，將25mg/3-CD、OH-j3-CD或NH-j8-CD分散于2ml丙酮中。將該懸浮液添加至100mg曱基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物[Gantrez⑧AN119]在3ml丙酮中的溶液中，并將混合物孵育30分鐘。然后，在磁力攪拌下，向該相中添加10ml乙醇和10ml去離子水。將所得混合物均勻化5分鐘。然后減壓蒸發(fā)納米顆粒懸浮液(BiichiR-144,Switzerland)直至除去這兩種有機溶劑并用水將最終體積調節(jié)至10ml。然后通過超速離心純化懸浮液(27,000xg，20分鐘)(Sigma3k30,rotorNo,12150,Germany)。除去上清液，并將殘余物重懸浮于水或5%蔗糖水溶液中。可能地，將部分獲得的納米顆粒冷凍于-80。C,用于其隨后的凍干和長期保存(VirtisGenesis,NewYork,UnitedStates)。2.2獲得的不同的基于PVM/MA的、含有環(huán)糊精的納米顆粒的物理化學表征物理化學特征的測定允許證實納米顆粒如何具有與使用的CD無關的、類似的大小和表面電荷。而且，該電荷類似于未處理的納米顆粒的電荷，因此，能認為大部分的CD位于納米顆粒內(nèi)部，而不吸附于其表面。表2概括了所分析的納米顆粒的主要物理化學特征。表2基于PVM/MA的、含有環(huán)糊精的不同納米顆粒制劑的物理化學特征<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>數(shù)據(jù)示出平均值士標準偏差(SD)(n=12)。試驗條件PVM/MA:100mg;環(huán)糊精25mg;孵育時間30min。數(shù)據(jù)示出平均值土標準偏差(SD)(n=12)。NP:基于PVM/MA的、不含有環(huán)糊精的納米顆粒。從表2中可見，與使用的環(huán)糊精無關，納米顆粒具有類似的大小和表面電荷。而且，該電荷類似于未處理的納米顆粒的電荷，因此，能認為大部分的CD位于納米顆粒內(nèi)部，而不吸附于其表面。環(huán)糊精與基于PVM/MA的納米顆粒之間的締合允許獲得大小小于常規(guī)納米顆粒(NP)的納米顆粒。如表2所示，基于PVM/MA的、含有環(huán)糊精的納米顆粒所顯示的大小接近150nm。這種大小的減少能與制備納米顆粒的方法的高收率有關。通過在過程的末尾和在其凍干后測定其重量獲得這些收率。制備收率被表示為百分數(shù)，其相對于PVM/MA共聚物和環(huán)糊精的初始質量來計算。與納米顆粒締合的環(huán)糊精的量根據(jù)使用的低聚糖的類型而變化，對于j8-CD為約90pg/mg,并且對于OH-j8-CD和NH-j8-CD為70pg/mg。在對不同制劑進行元素分析后，對與基于PVM/MA的納米顆粒締合的CD的存在進行證實。由于與對照納米顆粒(NP)相比，含有締合的CD的制劑中氧比例的重要升高以及碳百分比的降低，獲得的結果(表3)證實存在締合的CD。表3對照(NP)制劑和基于PVM/MA的、與CD締合的納米顆粒制劑的元素<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>NP:基于PVM/MA的、不含有CD的對照納米顆粒(空)；/3-CD-NP:基于PVM/MA的、含有]8-CD的納米顆粒；OH-i3-CD-NP:基于PVM/MA的、含有OH-j8-CD的納米顆粒；NH-/3-CD-NP:基于PVM/MA的、含有NH-jS-CD的納米顆粒。通過掃描電子顯微法(Zeiss,Germany)觀察納米顆粒的形態(tài)學，其后7見察到均勻的、大小為80nm至200nm的、納米顆并立通常的3求形形狀。圖2示出將基于PVM/MA的、含有|3-CD的納米顆粒(j8-CD-NP)的凍干樣品進行掃描電子顯微的結果。實施例3含有環(huán)糊精和RBITC的納米顆粒的制備通過修改先前描述的方法[ArbosWa/.，J.Control.Release,83(2002)321-330]后的可控去溶劑化制備納米顆粒。為了該目的，借助于超聲(MicrosonTM或在冷卻下在超聲浴中1分鐘)，將25mgjS-CD、OH-jS-CD或NH-/3-CD分散于2ml丙S同中。將該懸浮液添加至100mg曱基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物[Gantrez⑧AN119]在3ml丙酮中的溶液中，并將混合物孵育30分鐘。然后，在磁力攪拌下，向該相中添加10ml乙醇和10ml去離子水。將所得混合物均勻化5分鐘。然后減壓蒸發(fā)納米顆粒懸浮液(BiichiR-144,Switzerland)直至除去這兩種有機溶劑并用水將最終體積調節(jié)至10ml。然后向納米顆粒添加羅丹明B異石克氰酸酯(RBITC)的水溶液，并將其在石茲力攪拌下于室溫孵育5分鐘。然后通過超速離心純化懸浮液(27,000xg,20分鐘)(Sigma3k30，rotorNo.-12150,Germany)。除去上清液，并將殘余物重懸浮于水或5%蔗糖水溶液中?？赡艿?，將部分獲得的納米顆粒冷凍于-80°C用于其隨后的凍干和長期保存(VirtisGenesis,NewYork,UnitedStates)。將一定量的納米顆粒在0.1NNaOH中完全水解(24h，37°C),將RBITC的量估計為初始添加的量和與完全水解后發(fā)現(xiàn)的量的差。表4示出對于不同的被分析制劑的RBITC的值(pgRBITC/mg納米顆粒)。表4與納米顆粒締合的RBITC(|ag/mg)制劑大小(nm)RBITC(|xg/mg)NP179±210.9±0.3iS誦CD國NP144±613.3±2.1OH-j3-CD-NP140±712.4±1.3NH-i8-CD畫NP151±711.8士0.7數(shù)據(jù)示出平均值±標準偏差(11=8)。試驗條件PVM/MA:100mg;環(huán)糊精25mg;孵育時間30min。NP:基于PVM/MA的、不含有CD的對照納米顆粒(空)；/3-CD-NP:基于PVM/MA的、含有j8-CD的納米顆粒；OH-/3-CD-NP:基于PVM/MA的、含有OH-/3-CD的納米顆粒；NH-jS-CD-NP:基于PVM/MA的、含有NH-jS-CD的納米顆粒。圖3示出37士1。C下，在模擬的胃介質(0h至1h)和模擬的腸介質(1h至24h)中，RBITC從納米顆粒中釋放的動力學。在所有的情況下，證實了孵育24小時后釋放的RBITC的百分比總是小于與納米顆粒締合的量的10%。因此，能假定在隨后的生物粘附研究以及熒光顯微法中獲得的結果中，熒光強度對應于與納米顆粒締合的RBITC。實施例4含有環(huán)糊精的納米顆粒在大鼠胃腸道中的生物粘附特征的評價圖4示出被分析的制劑的生物粘附語，其表示根據(jù)前述的方法學，口服給藥后30分鐘、lh、3h和8h粘附于不同的胃腸道部分(胃、小腸11-14、盲腸)的納米顆粒部分。在所述圖中能觀察到，與環(huán)糊精締合的納米顆粒顯示與對照納米顆粒不同的生物粘附語。在最近的工作中，證明了PVM/MA共聚物當被并入納米顆粒中時，比以簡單水溶液形式給藥時的生物粘附潛力高得多(Arbos"fl/.，J.Control.Release,89(2003)19-30)。該事實與以前提出納米顆粒的形狀將促進與粘膜成分的初始接觸和粘附相互作用的工作是一致的。給藥30分鐘后，所有被分析的制劑都顯示在胃和空腸(圖4中的12部分)中的生物粘附最大值。在任何情況下，似乎都觀察到了與締合了OH-/3-CD的納米顆粒的更強的相互作用。因此，給藥后30分鐘，能夠說明制劑給藥劑量的約12%-20%粘附至胃并且約14%-22%粘附至小腸。所述值與對于不含有CD的常規(guī)納米顆粒(基于PVM/MA)所發(fā)現(xiàn)的值明顯不同，其中不到10%和不超過12%的給藥劑量分別粘附至胃和小腸。給藥1小時后，能觀察到含有粘附至胃腸粘膜的環(huán)糊精的納米顆粒部分如何減少并轉移至道的末梢部分。在任何情況下，能觀察到所述分布是均勻的并且沒有任何制劑對胃腸道的任何區(qū)域顯示出特異性。為了比較不同制劑的粘附潛力，研究了生物粘附的動力學和曲線。為了該目的，將粘附的納米顆粒部分相對于時間作圖，從而獲得生物粘附曲線。這些曲線示于圖5?；诤笳?，并使用WinNonlinl.5計算機應用(PharsightCorporation,UnitedStates)，測定了如下的動力學生物粘附參數(shù)Qmax、AUCadh、Tmax、MRTadh和Kadh(Arbos"a/.,J.Control.Release,89(2003)19-30)。表5示出這些參數(shù)。表5不同納米顆粒制劑的生物粘附參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>結果示出平均值±標準偏差(11=3)。*p<0.05OH-j8-CD-NP和/3-CD-NPvs,NP。**p<0.01OH-i8-CD-NP和/3-CD-NPvs.NP。Qmax(mg):粘附至粘膜的納米顆粒的最大量。AUCadh(mg.h):生物粘附曲線下面積。Kadh(h"):粘附部分的消除速率。MRTadh(h):粘附的納米顆粒部分的平均停留時間。OH-jS-CD-NP:基于PVM/MA的、含有OH-)8-CD的納米顆粒。/5-CD-NP:基于PVM/MA的、含有OH-Z3-CD的納米顆粒。NP:基于PVM/MA的、不含有CD的對照納米顆粒(空)。能觀察到，締合了OH-Z3-CD的納米顆粒的特征是，AUCadh(測量生物粘附相互作用強度的參數(shù))比對照納米顆粒(NP)觀察到的AUCadh大1.5倍。同樣地，與環(huán)糊精締合的制劑的粘附部分表現(xiàn)出明顯低于對照NP的消除速率(Kadh)和約3.5小時的平均停留時間(MRTadh)。這些結果允許假定環(huán)糊精(尤其是OH-CD)的存在能促進與胃腸粘膜的相互作用并發(fā)展比NP強的與粘膜成分的粘附相互作用。實施例5對胃腸粘膜中含有環(huán)糊精的納米顆粒的觀察通過熒光顯微法觀察與環(huán)糊精締合的納米顆粒在胃腸粘膜中的分布。為了該目的，向實驗室動物給予用RBITC標記的不用制劑。給藥2小時后，處死動物并檢查小腸的不同部分。圖6示出允許觀察納米顆粒在回腸樣品中分布的某些照片。根據(jù)體內(nèi)生物粘附研究，與羥丙基-/3-環(huán)糊精締合的納米顆粒具有比對照納米顆粒更強的建立與粘膜的生物粘附相互作用的能力。常規(guī)的納米顆粒不能到達腸細胞，盡管其能滲透沿粘膜排列的粘液層。相反地，與環(huán)糊精締合的納米顆粒粘附至小腸的腸細胞。實施例6含有包含紫杉醇的環(huán)糊精的納米顆粒制備含有包含紫杉醇的環(huán)糊精的納米顆粒的方法分成兩個不同的42步驟1)紫杉醇-環(huán)糊精復合體的制備，其包括形成的復合體的形成和純化；和2)含有紫杉醇-環(huán)糊精復合體的納米顆粒的制備。紫杉醇-環(huán)糊精復合體的制備為了該目的，制備環(huán)糊精(i8-CD、OH-/3-CD或NH-Z3-CD)的水溶液，將該溶液以80:20(v:v)的比率以及1:1的藥物環(huán)糊精的摩爾比添加到紫杉醇(PTX)藥物的乙醇溶液中。將混合物在黑暗中于室溫下保持i茲力攪拌(300rpm)直至達到平衡(至少72小時)。然后減壓蒸發(fā)除去乙醇并過濾(0.45pm)懸浮液以除去未溶解的藥物晶體。最后，通過減壓蒸發(fā)從最終水溶液中完全除去水，而紫杉醇-環(huán)糊精復合體保留下來，其外觀為白色粉末。包含紫杉醇-環(huán)糊精復合體的納米顆粒的制備通過修改先前描述的方法(Arbos"a/.，上文所述)后的可控去溶劑化獲得納米顆粒。為了該目的，將一定量的先前在紫杉醇和環(huán)糊精(/3-CD、OH-jS-CD或NH-jS-CD)之間形成的復合體分散于2ml丙酮中。將該懸浮液添加至100mg曱基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物[Gantrez⑧AN119]在3ml丙酮中的溶液，并將該混合物孵育30分鐘。然后，在磁力攪拌下，向該相中添加10ml乙醇和10ml去離子水。將所得混合物均勻化5分鐘。然后減壓蒸發(fā)納米顆粒懸浮液(BtichiR-144,Switzerland)直至除去這兩種有機溶劑并用水將最終體積調節(jié)至10ml。然后通過超速離心純化懸浮液(27，000xg，20分鐘)(Sigma3k30,rotorNo.-12150，Germany)。除去上清液，并將殘余物重懸浮于水或5%蔗糖水溶液中。將部分獲得的納米顆粒冷凍于-80。C用于其隨后的凍干和長期保存(VirtisGenesis,NewYork,UnitedStates)。對將紫杉醇-環(huán)糊精復合體封裝于納米顆粒中的方法的優(yōu)化圖7示出根據(jù)使用的環(huán)糊精的量和類型，含有環(huán)糊精和PTX的納米顆粒中PTX含量的變化。首先必須強調的是，PTX自身，即沒有與CD形成復合體，不能被包含在納米顆粒中，從而在通過過濾純化納米顆粒的過程中被清除。因此，必須形成紫杉醇-環(huán)糊精(PTX-CD)復合體。對于使用的不同環(huán)糊精，觀察到當PTX與OH-jS-CD形成復合體時，如何獲得最佳的封裝效率，其次是NH-]8-CD和沒有取代的/8-CD。同樣地，還分析了不同量的一直與相應的環(huán)糊精保持1:1的摩爾比的PTX(5mg、7.5mg、10mg和25mg)，并觀察到對于高于10mg量的PTX[PTX:PVM/MA(1:10)]，沒有獲得較大量的被封裝的藥物，因此，觀察到NP中PTX-CD復合體的封裝效率的下降。這些分析后，確定在分析條件下，包含于不同制劑中PTX的最優(yōu)量是10mg，從而獲得最佳的收率。表7示出根據(jù)用于形成復合體的不同環(huán)糊精初始添加10mg時，被封裝的PTX的量。表7根據(jù)使用的環(huán)糊精的類型，與不同納米顆粒制劑締合的PTX的量<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>結果示出平均值±標準偏差(11=6)。PTX-NP:含有紫杉醇的常規(guī)PVM/MA納米顆粒；PTX-jS-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和/3-CD納米顆粒；PTX-OH-^-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和OH-0-CD納米顆粒；以及PTX-NH-j8-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和NH-/3-CD納米顆粒。實施例7口服給予不同紫杉醇制劑后的藥代動力學研究紫杉醇是藥物，其特征是具有劑量依賴的藥代動力學譜。因此，對于其在納米顆粒中的制劑，需要事先測定商業(yè)紫杉醇制劑在以選擇的劑量(10mg/kg)口服或靜脈內(nèi)給藥后的藥代動力學譜。根據(jù)納瓦拉大學倫理學委員會的規(guī)章以及試驗動物歐洲法規(guī)(86/609/EU),進行藥代動力學。為了該目的，在給予制劑前12小時，將平均體重為225g的雄性Wistar大鼠(Harlan，Spain)隔離于代謝籠中，不讓其進食，但是允許其隨意飲水。表8藥代動力學研究中使用的含有紫杉醇-環(huán)糊精復合體的不同制劑的藥代動力學特征<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>結果示出平均值士標準偏差(n-8)。PTX-NP:含有紫杉醇的常規(guī)PVM/MA納米顆粒；PTX-/3-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和/3-CD納米顆粒；PTX-OH-j3-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和OH-i8-CD納米顆粒；以及TX-NH-^-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和NH-/3-CD納米顆粒。表8概括了藥代動力學研究中所分析的納米顆粒的主要物理化學特征。對照納米顆粒(PTX-NP)的大小接近200nm，其負表面電荷是-38mV。另外，含有被封裝的PTX-CD復合體的納米顆粒明顯更大(接近300nm)并在所有的情況下表現(xiàn)出類似的^電勢。最后，應該強調的是，PTX-CD復合體的存在對納米顆粒的制備收率不施加任何影響，該收率在50%至60%之間變化。藥代動力學研究分為三個階段。在第一研究中，將10mg商業(yè)紫杉醇制劑(Taxol⑧)向兩組雄性Wistar大鼠(11=6)靜脈內(nèi)(i.v.)和口服給藥。第二研究包括向由6只動物形成的大鼠組口服給予紫杉醇(10mg/kg)與(i)/5-CD、(ii)OH-/3-CD或(iii)NH-/5-CD的溶液。最后，為了進行不同制劑的藥代動力學研究，向不同組的動物口服給予納米顆粒(i)PTX-OH陽/3-CD-NP、(ii)PTX匿/3-CD-NP、(iii)PTX-NH國/5-CD陽NP或(iv)PTX-NP的不同制劑。所選的紫杉醇劑量是10mg/kg。給藥后，使用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑，在不同的時間(O分鐘、IO分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、180分鐘、360分鐘、480分鐘、24小時和30小時)提取約300iil體積的血液，并用等體積的生理鹽水通過腹膜內(nèi)(i.p.)途徑恢復動物(大鼠)的血液體積。使用WiNNonlin1.5藥代動力學調節(jié)程序(PharsightCorporation,MountainView,UnitedStates)的非房室調節(jié)方法對紫杉醇給藥后獲得的結杲進行藥代動力學分析。圖8示出獲得的結果。能觀察到，常規(guī)制劑(商業(yè)紫杉醇)的i.v.給藥在第一次取樣中顯示血漿濃度的峰值，然后顯示隨時間的兩相下降。所述鐠類似于其它作者描述的譜(YehWa/.,PharmRes22(6):867-74,2005)。當所述商業(yè)制劑被口服給藥時(圖8B)，紫杉醇的血漿濃度是零。當給予PTX:CD復合體時獲得了類似的結果，它們均不能檢測或定量紫杉醇隨時間的顯著水平。相反地，當含有環(huán)糊精和紫杉醇的納米顆粒中的紫杉醇制劑被口服給藥時，能證明這些制劑引起至少24小時的隨時間的持續(xù)血漿水平。在所述納米顆粒給藥后4小時至高達24小時的時間段內(nèi)，對于三種制劑能觀察到以0級動力學釋放藥物的制劑通常的血漿濃度平穩(wěn)狀態(tài)。在任何情況下，PTX-j3-CD-NP和PTX-OH-j3-CD-NP制劑允許獲得比PTX-NH-/3-CD-NP制劑獲得的血漿水平高得多的血漿水平(3-4倍)。而且，應當有趣地強調，常規(guī)納米顆粒中紫杉醇的給藥不允許吸收藥物。表9示出對給予不同的納米顆粒紫杉醇制劑后獲得的試驗數(shù)據(jù)進行非房室分析后獲得的藥代動力學參數(shù)的值。從所述表中能觀察到，根據(jù)制劑中使用的環(huán)糊精的類型，AUC和MRT的值變化非常明顯。在口服PTX-OH-/3-CD-NP和PTX-j8-CD-NP制劑的情況下，獲得了類似的AUC值。在這兩種口服制劑(PTX-OH-j8-CD-NP和PTX-/5-CD-NP)中，分別在6小時和5小時的時間段內(nèi)達到的最大濃度明顯高于其余制劑中達到的最大濃度。對于三種含有環(huán)糊精的制劑，藥物在有機體中的平均停留時間(MRT)類似。這些值比口服給予商業(yè)制劑(Taxol)46后達到的值高3至5倍。同樣地，對于含有環(huán)糊精和紫杉醇的納米顆粒的制劑，藥物在末期的清除半衰期OV2z)類似，并且，在任何情況下，其小于靜脈內(nèi)給予商業(yè)制劑(Taxol⑧)所獲得的清除半衰期。表9被分析的不同制劑的藥代動力學參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*p<0.05PTX-OH-j8-CD-NP、PTX-j3-CD-NP和PTX-NH/3陽CD-NPvs.商業(yè)制劑(Taxol)MannWhitneyU測i式。AUC0-inf:血漿水平曲線下面積；Cmax:最大濃度；Tmax:達到Cmax的時間；MRT:平均停留時間；T1/2z:末端清除期的生物學半衰期Cl/F:清除率(Cl=劑量x生物利用度/AUC);Vss:穩(wěn)態(tài)分布容積(Vss=劑量xAUMC/AUC2)。相對于每一制劑的口服生物利用度值對清除率和分布容積的值進行標準化。PTX-OH-/3-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和OH-/3-CD納米顆粒；PTX-jS-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和|8-CD納米顆粒；PTX-NH-/3-CD-NP:含有紫杉醇的PVM/MA和NH-(8-CD納米顆粒；以及PTX-NP:含有紫杉醇的常規(guī)PVM/MA納米顆粒。權利要求1.包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物以及生物活性分子的納米顆粒。2.如權利要求1所述的納米顆粒，其中所述生物可降解的聚合物是曱基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物。3.如權利要求1所述的納米顆粒，其中所述環(huán)糊精或其衍生物選自^-環(huán)糊精、2-羥丙基-/3-環(huán)糊精、6-—脫氧-6-單氨基-/5-環(huán)糊精及其混合物。4.如權利要求1所述的納米顆粒，其包含兩種或更多種生物活性分子。5.如權利要求1所述的納米顆粒，其中所述生物活性分子是小化學分子、蛋白質、肽、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多聚核苦酸或核酸。6.如權利要求1所述的納米顆粒，其中所述生物活性的分子是藥物、i;t原或變應原。7.如權利要求1所述的納米顆粒，其中所述生物活性分子是疏水物質或P-糖蛋白酶的底物物質。8.如權利要求7所述的納米顆粒，其中所述生物活性分子選自放線菌素D、阿苯達唑、阿密曲替林、安普那韋、阿伐他汀、布尼洛爾、喜樹堿、卡維地洛、塞利洛爾、環(huán)孢菌素、克霉唑、秋水仙堿、可的松、道諾霉素、異會胍、地塞米松、洋地黃毒戒、地高辛、地爾硫卓、多西紫杉醇、多潘立酮、阿霉素、表柔比星、紅霉素、雌二醇、依托泊苷、苯妥英、非索芬那定、FK506、氟尿嘧啶、慶大霉素、灰黃霉素、伊馬替尼、印地那韋、伊曲康唑、左氧氟沙星、氯沙坦、洛伐他汀、甲苯噠唑、曱基強的松龍、曱氨喋呤、咪拉地爾、嗎啡、奈非那韋、恩丹西酮、紫杉醇、吡喹酮、氫化潑尼松、潑尼松、奎納定、雷帕霉素、利福平、沙奎那韋、西羅莫司、磺胺曱二唑、利托那韋、他克莫司、他林洛爾、替尼泊苷、特非那定、拓樸替康、去炎松、戊脈安、長春堿、長春新》成及其混合物。9.藥物組合物，其包含至少權利要求1至8中任一權利要求所述的包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物以及生物活性分子的納米顆粒和藥物可接受的賦形劑、載體或佐劑。10.制備權利要求1至8中任一權利要求所述的納米顆粒的方法，其包括在用水醇溶液使所述生物可降解的聚合物去溶劑化之前，將所述生物可降解的聚合物和(環(huán)糊精或其衍生物)(生物活性分子)復合體，(CD:BAM復合體)，在有機溶劑中同時孵育的步驟；或者，將所述生物可降解的聚合物的納米顆粒與包含所述[CD:BAM]復合體的水溶液孵育的步驟。11.藥物組合物，其包含至少權利要求1至8中任一權利要求所述的包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物以及生物活性分子的納米顆粒和藥物可接受的賦形劑、載體或佐劑，其中所述生物活性分子是紫杉醇。12.如權利要求11所述的藥物組合物，其中所述生物可降解的聚合物是PVM/MA共聚物。13.如權利要求11或12中任一權利要求所述的藥物組合物，其中所述環(huán)糊精選自/3-環(huán)糊精、2-羥丙基-/3-環(huán)糊精、6-—脫氧-6-單氨基-/-環(huán)糊精及其混合物。14.如權利要求11所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒包含:成分甲基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物/3-環(huán)糊精紫杉醇與總量相比的重量％75.00%-95.00%10.00%-24.99%0.01%-15.00%或者，成分曱基乙烯基醚與馬來酸酐(PVM/MA)的共聚物2-羥丙基-/3-環(huán)糊精紫杉醇與總量相比的重量％70.00%-95.00%5.00%-24.99%0.01%-20.00%或者,成分曱基乙烯基醚與馬來酸肝(PVM/MA)的共聚物6-—脫氧-6-單氨基-i3-環(huán)糊精紫杉醇與總量相比的重量％75.00%-95.00%5.00%-24.99%0.01%-20.00%全文摘要本發(fā)明涉及包含生物可降解的聚合物、環(huán)糊精或其衍生物以及生物活性分子的納米顆粒。所述納米顆粒能締合大量的生物活性分子，特別是疏水的生物活性分子，并且當它們被口服給藥或通過有機體的任何其它粘膜給藥時，其釋放生物活性分子，從而提供該生物活性分子持續(xù)和恒定的血漿水平。文檔編號A61K9/51GK101686949SQ200880017440公開日2010年3月31日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權日2007年4月20日發(fā)明者米格爾·安赫爾·坎波尼羅馬丁尼茲,胡安·馬奴埃爾·伊拉切爾賈立塔,赫斯曼·H·A·沙爾曼,麥特·阿古羅斯巴佐申請人:納瓦拉公司科學與技術研究所