專利名稱：：包含來自脂肪組織干細胞的治療缺血性肢體疾病的組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于治療缺血性肢體疾病的細胞治療組合物，具體涉及用于治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其含有來自脂肪組織的間充質(mesenchymal)干細胞和賦形劑。
背景技術：
：缺血性肢體疾病包括由于血管內血栓癥、栓塞、血管內發(fā)炎、高血壓、高血脂和糖尿病綜合癥引起的動脈和靜脈閉塞而導致的外周循環(huán)障礙糖尿病足(diabeticfoot);如燒傷或者凍瘡等外部因素引起的血管損傷導致的癥狀；以及在煙癮極大的中年男子中表現為血炎癥和血栓的血栓閉塞性血管炎(Buerger'sdisease)，其典型例子是閉塞性動脈硬化癥、血管閉塞性脈管炎以及類似疾病。目前治療所述疾病的方法包括優(yōu)選治療引起血栓或者栓塞的疾病，例如心律不齊、心房粘液瘤和紅細胞增多癥以及使用溶解血栓劑暫時減輕癥狀或者為了增大腔的直徑給藥例如右旋糖酐、抗凝血劑、苯基丁氮酮、潘生丁、腎上腺皮質激素、免疫抑制劑或者前列腺素E1等血管擴張劑和循環(huán)改善試劑。手術療法包括通過交感神經切除術、硬膜外阻斷和交感神經阻斷來解除痛苦的方法，減少交感神經過度緊張以誘導改善血管舒張和血液循環(huán)效果的方法，使用人造血管諸如Gortex的支路移植外禾斗手術和病灶切除術(lesionectomy)。但是，上面描述的藥物治療或者手術治療方法具有的問題在于，它們暫時減輕了缺血性疾病癥狀或者顯示了高度復發(fā)的風險。由于這種原因，需要開發(fā)能夠根本上治療缺血性疾病的方法。干細胞指的是不僅具有自我復制而且具有分化成至少兩種細胞的能力的細胞，并且可被分成全能干細胞、多功能干細胞(pluripotentstemcells)和多潛能干細胞(multipotentstemcells)。近來發(fā)現脂肪組織是多潛能干細胞的新來源(Cousin等人，BBRC.，301:1016，2003;Miranville等人，Circulation,110:349，2004;Gronthos等人，J.CellPhysiol.，189:54,2001;Seo等人，BBRC.，328:258,2005)。也就是說，據報導，通過抽脂術得到的人脂肪組織中包含未分化細胞組并具有分化成脂肪細胞、成骨細胞、成肌細胞和成軟骨細胞的能力(Zuk等人，TissueEng.，7:211，2001;Rodriguez等人，BBRC.，315:255，2004)。這禾中脂肪組織具有的優(yōu)點在于其能夠大量提取，其可以通過組織培養(yǎng)大量增殖，并且由于其為自體同源組織，因此不存在免疫排斥反應的風險，因而其可以重復注射。因此，其作為新的干細胞來源受到關注，克服來自骨髓或者臍帶血所存在諸如難以收集、成本高以及必須通過組織相容性驗證發(fā)現合適匹配的缺陷。而且，近來使用動物模型實驗的研究表明，來自脂肪組織的細胞具有能夠再生肌肉和剌激神經血管分化的能力。因此，來自脂肪組織的細胞作為新的干細胞來源受到關注。到目前為止已知的來自脂肪組織的干細胞包括可分化成上皮細胞的來自人脂肪組織的成人干細胞(Brzoska等人，BBRC，330:142，2005)，可分化成成骨細胞和脂肪細胞的來自人脂肪組織的成人干細胞(Cao等人，BBRC，332:370，2005)，可分化成神經細胞的來自人脂肪組織的成人干細胞(Safford等人，BBRC，294:371，2002)，可分化成脂肪細胞的來自鼠脂肪細胞的干細胞(0gawa等人，BBRC，319:511，2004)，可分化成成骨細胞和成軟骨細胞的來自鼠脂肪細胞的干細胞(0gawa等人，BBRC，313:871，2004)，可分化成軟骨細胞的來自人脂肪組織的干細胞(Biomaterials，25:3211，2004)，可分化成神經細胞的來自鼠脂肪細胞的干細胞(Fujimura等人，BBRC，333:116，2005)，以及可分化骨細胞、軟骨細胞、神經細胞或肌肉細胞的來自脂肪細胞的干細胞(US6，777，231)。為了治療缺血性疾病，韓國專利公開號2003-0034177公開了使用其分化已經由G-CSF誘導的造血干細胞治療缺血性疾病的方法，韓國專利公開號2005-0111593公開了使用具有其中引入了血管蛋白(angiopoietin)基因的間充質干細胞治療缺血性疾病的方法。但是，現有方法具有的問題在于干細胞被輔助使用，或者含有干細胞的細胞治療劑的儲存不穩(wěn)定。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了許多努力來開發(fā)使用更穩(wěn)定的干細胞來治療缺血性疾病的方法，結果發(fā)現，當將賦形劑諸如蔗糖加入到其中的來自脂肪組織的脂肪干細胞引入到缺血性疾病的鼠模型中時，有效地產生了新的血管，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其含有來自脂肪組織的間充質干細胞作為活性成分，并在冷藏或者凍藏儲存時顯示很高的穩(wěn)定性。為了實現上述目的，本發(fā)明提供了治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其含有作為活性成分的來自脂肪組織的間充質干細胞和賦形劑，其中來自脂肪組織的間質細胞的濃度為1X1051X108個細胞/mL，并且賦形劑為蔗糖或者甘露糖。在本發(fā)明中，用于組合物的基質優(yōu)選選自下組，該組包括生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)和Hartman-D⑧。在本發(fā)明中，組合物優(yōu)選另外包括白蛋白或者人血清作為賦形劑。另外，組合物優(yōu)選另外包括EDTA或者匿S0作為賦形劑。在本發(fā)明中，組合物優(yōu)選另外包括藥物學上可接受量的至少一種選自下組的添加劑，該組包括懸浮劑、溶解劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑、防吸收劑、表面活性劑、稀釋劑、載色劑、PH調節(jié)劑、鎮(zhèn)痛劑、緩沖劑、含硫還原劑和抗氧化劑。通過下列詳細描述和所附的權利要求書，本發(fā)明的其他特征和實施方式將是容易想到的。圖l顯示了以100X放大倍數攝取的根據本發(fā)明的來自人脂肪組織的多潛能干細胞的照片。圖2顯示了根據本發(fā)明的來自人脂肪的多潛能干細胞的免疫性質。圖3顯示了根據本發(fā)明的來自人脂肪組織的多潛能干細胞相對于球形形成能力的穩(wěn)定性。4圖4顯示了根據本發(fā)明的來自人脂肪組織的間充質干細胞的體外血管形成(angiogenic)會g力。圖5顯示了患有誘導的缺血性下肢疾病并注射有本發(fā)明的來自人脂肪組織間充質干細胞的裸鼠中的肢體切除程度，并顯示了使用激光多普勒灌成象觀察的裸鼠中的血管形成程度。圖6顯示了由激光多普勒灌流比表示的本發(fā)明的來自人脂肪組織的多潛能干細胞的血管形成能力。具體實施例方式本發(fā)明涉及治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其含有濃度為IX105IX108個細胞/mL的來自脂肪組織的間質細胞的和作為賦形劑的蔗糖或者甘露糖。在本發(fā)明中，來自脂肪的干細胞通過經抽脂收集的細胞脂肪組織和粘附于培養(yǎng)皿并體外生長的來自脂肪的間充質干細胞得到。在本發(fā)明的實施方式中，來自脂肪組織的間質細胞可通過如下步驟得到使用抽脂管或者連接有導管的一次性注射器注入腫脹溶液和含脂肪材料，將得到的材料進行支原體檢測和無菌檢測，通過質量管理標準從受測材料中選取樣品，將所選樣品離心成脂肪層和水層，使用膠原酶溶液預處理水層樣品，然后在含有10%FBS以及抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細胞。同時從上面得到的來自人脂肪組織的干細胞培養(yǎng)液中得到表達所需表面抗原的方法包括使用具有分選功能(Int.Immunol.，10(3):275,1998)的流式細胞計數器的FACS方法，使用磁珠的方法，以及使用特異性識別多潛能干細胞的抗體的淘盤洗選法(panning,J.Immunol.，141(8):2797，1998)。而且，從大量培養(yǎng)液中得到多潛能干細胞的方法包括其中在細胞表面上表達以特異性識別分子(此后稱為"表面抗原")的抗體被單獨使用或者組合成柱使用。流式細胞計數分選法可包括水滴電荷法和細胞捕獲法。在這些方法的任一種中，特異性識別細胞表面上的抗原的抗體被熒光標記，由與細胞表面上表達的分子結合的抗體發(fā)出的熒光強度被轉化成電信號，從而可對抗原的表達量進行定量。還能夠通過將所使用的熒光類型進行組合來分離表達多種表面抗原的細胞。在這種情況下可使用的熒光的粒子包括FITC(熒光異硫氰酸酯)、PE(藻紅蛋白)，APC(異藻青蛋白，allo-phycocyanin)、TR(TexasRed)、Cy3、CyChrome、Red613、Red670、TRI-Color、QuantumRed等等。使用流式細胞計數器的FACS法包括其中上述干細胞培養(yǎng)液被收集的方法，細胞通過該方法分離，例如離心并直接使用抗體進行染色；以及其中細胞在適當的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并生長然后使用抗體染色的方法。細胞的染色通過將識別表面抗原的初級抗體與靶細胞樣品混合并將混合物在冰上孵化30分鐘到1小時來進行。當初級抗體被熒光標記時，洗滌后將細胞使用流式細胞計數器分離。當初級抗體沒有被熒光標記時，將細胞與初級抗體反應，并且將具有與初級抗體結合活性的熒光標記的次級抗體在洗滌后混合，并在冰上孵化30分鐘到1小時。洗滌后，將使用初級抗體和次級抗體染色的細胞使用流式細胞計數器分離。而且，分離的根據本發(fā)明的間充質干細胞可使用流式細胞計數器分析它們的免疫學性質。在本文中，術語"缺血性疾病"指的是因到組織的血液供應減少或者中斷而引起的功能不正常、組織變性或壞死，特別包括缺血性心臟病，諸如心肌梗死和心絞痛、末端局部缺血、與損壞性循環(huán)有關的損傷、外傷性損傷諸如截肢和骨折。特別是，本發(fā)明中的缺血性疾病不僅包括缺血性疾病，而且包括由于損傷或傷害導致的缺血性狀態(tài)。本發(fā)明的細胞治療組合物可直接或者通過載體引入。載體應當是生理上可接受的，其例子包括諸如生物聚合物的有機物質，和諸如羥磷灰石的無機物質。其特定例子包括膠原基質，多聚乳酸聚合物或者共聚物，聚乙烯甘油集合物或者共聚物，以及它們的化學衍生物。此外，載體可以使兩種或者多種上述生理上可接受的材料的混合物。本發(fā)明的組合物例如可在圍繞缺血部位的殘余肌肉(骨骼肌、心肌等等)中的一個或多個部位(例如250個部位)給藥。組合物的計量優(yōu)選例如在1.0X1()S1.0X108個細胞/kg(重量)的范圍，更優(yōu)選1.0X1061.0Xl()7個細胞/kg(重量)。但是，組合物的計量可基于患者體重、年齡、性別和癥狀、待給藥組合物的劑型、組合物的給藥方法等等而變化。本領域技術人員可適當調節(jié)劑量。給藥頻率可在臨床可接受的副作用限制內從一次到數次的范圍內變化?？梢杂幸粋€或多個給藥部位。對于非人動物而言每kg的劑量可以與人的相同，或者可通過上面描述的計量轉換，例如基于人的缺血性器官(諸如心臟)與動物對象之間的體積比(例如平均值)來轉換。根據本發(fā)明待治療的動物包括人和其他需要的哺乳動物，其特定例子包括人、猴、小鼠、大鼠、兔子、綿羊、牛和狗。本發(fā)明的治療方法可單獨或者與其他標準或者先進方法結合進行。例如，本發(fā)明的用于治療缺血性疾病的方法優(yōu)選可與手術血管再生成諸如經皮冠狀動脈成形術(PTCA)和/或冠狀動脈旁路移植(CABG)結合。本發(fā)明的方法與其他方法結合使用可有效改善心臟功能并縮短臥床(confinedtobed)時間。本發(fā)明的細胞治療劑可包括藥物學上可接受的載體和/或添加劑。它們的粒子包括無菌水、生理鹽水、標準緩沖液(例如磷酸、檸檬酸或者其他有機酸)、穩(wěn)定劑、鹽、抗氧化劑(例如抗壞血酸)、表面活性劑、懸浮劑、等滲劑或者防腐劑。對于局部給藥來說，本發(fā)明的組合物優(yōu)選與有機物質諸如生物聚合物、無機物質諸如羥基磷灰石結合，它們的特定例子包括膠原基質、聚乳酸的聚合物或者共聚物，聚乙烯甘油的聚合物或者共聚物，以及它們的化學衍生物。在本文中使用的術語"基質"指的是細胞治療組合物中的間充質干細胞被懸浮在其中的基質溶液。作為基質，生理鹽水、磷酸緩沖液或者Hartman-D(ChoongwaePharmaCorp.)優(yōu)選被使用。在優(yōu)選實施方式中，細胞治療組合物以適于注射的劑型制備。出于這種目的，本發(fā)明的脂肪干細胞優(yōu)選被溶解在藥物學上可接受的水溶液中，或者以溶液狀態(tài)冷凍。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括可被使用以懸浮或稀釋脂肪干細胞的所需藥物學上可接受的載體。這樣的載體的粒子包括蒸餾水、生理鹽水、PBS以及類似物。本發(fā)明的組合物可含有藥物學上可接受的載體或者賦形劑，或者任何所需穩(wěn)定劑或者防吸收劑，以提供適于給人或動物給藥的藥物學制劑。本發(fā)明的組合物可被制成注射液(例如用于皮下、真皮內、肌肉、靜脈內和腹膜腔注射的注射液)的形式。當注射本發(fā)明的組合物時，可使用可減輕痛苦的鎮(zhèn)痛劑，在需要時，還可使用合適裝置。本發(fā)明的細胞治療組合物可被填充到細胞可在其中冰凍的注射器、裝置、冷凍管中，或者含有液體藥物的包括橡皮塞和鋁蓋的無熱源玻璃瓶中。作為裝置，可使用注射器或者多頭注射器(multi-syringe)，并且在肢體缺血疾病的情況下，考慮到細胞被給藥的部位或者肌肉的深度，在細胞給藥過程中可使痛苦最小化而不會由于細胞剪切而引起細胞損傷的2030號針(gaugeneedle)被使用。而且，注射器或裝置由不影響細胞活力的材料制成。如果需要，根據給藥模式以及制劑，本發(fā)明的細胞治療組合物可含有至少一種選自下面的物質懸浮劑、溶解劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑、防吸收劑、表面活性劑、稀釋劑、載色劑、PH調節(jié)劑、鎮(zhèn)痛劑、緩沖劑、含硫還原劑和抗氧化劑。懸浮劑的例子可包括甲基纖維素，聚山梨醇酯80，羥甲基纖維素，阿拉伯膠，黃蓍膠粉，羧甲基纖維素鈉，聚氧乙烯去水山梨醇月桂酸酯等等。溶解劑包括聚氧乙烯氫化蓖麻油，聚山梨醇酯80，煙堿，聚氧乙烯去水山梨醇月桂酸酯，Macrogol和蓖麻油脂肪酸乙酯。穩(wěn)定劑包括右旋糖酐40，甲基纖維素，白明膠，亞硫酸鈉，焦亞硫酸鈉等等。等滲劑的例子是D-甘露醇和山梨醇。保護劑的例子包括甲基對羥基苯甲酸，乙基對羥基苯甲酸，山梨酸，苯酚，甲苯酚以及氯甲酚。防吸收劑的例子包括人血清蛋白，卵磷脂，右旋糖酐，環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烯共聚物，羥丙烯纖維素，甲基纖維素，聚氧乙烯氫化蓖麻油和聚乙烯甘油。含硫還原劑包括N-乙酰半胱氨酸，N-乙?；甙腚装彼?，硫辛酸，硫二甘醇，硫代乙醇胺，硫代甘油，硫代山梨醇，硫代羥基乙酸以及其鹽，硫代硫酸鈉，谷胱甘肽和含巰基化合物諸如具有1到7個碳原子的硫代烷醇酸?？寡趸瘎┌ɡ绠惪箟难?，二丁羥基甲苯，丁羥基苯甲醚，a-生育酚，醋酸生育酚，L-抗壞血酸及其鹽，L-抗壞血酸軟脂酸酯，L-a抗壞血酸硬脂酸酯，亞硫酸氫鈉，硫酸鈉，沒食子酸三戊酯，沒食子酸丙酯或者螯合劑諸如乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，焦磷酸鈉和偏磷酸鈉。低溫防腐劑包括例如匿SO、甘油等。此外，本發(fā)明的組合物可包括常規(guī)添加劑，諸如無機鹽，包括氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀和碳酸氫鉀，以及有機鹽，包括檸檬酸鈉、檸檬酸鉀和醋酸鈉。特別是，目前的細胞治療劑在冷藏條件下懸浮并儲存在生理鹽水中的情況下，當它們儲存48小時或者更久時，難以顯示超過70%的細胞活性；但是，在本發(fā)明的含有人脂肪組織來源的間充質干細胞的細胞治療組合物的情況下，當將蔗糖或者白蛋白加入到組合物中時，顯示超過70%的細胞活性，甚至當其儲存4872小時時也是如此，表明其具有改善的穩(wěn)定性。而且，在本發(fā)明的組合物的情況下，觀察到甚至當使用Hartman-D或者PBS而不是生理鹽水作為基質時，細胞活性也沒有明顯差別，蔗糖或者白蛋白的加入改善了治療組合物的穩(wěn)定性。此外，當本發(fā)明的含有來自脂肪組織的干細胞的細胞治療組合物在冷凍儲藏條件下儲存時，含有生理鹽水、蔗糖、白蛋白和低溫保護劑匿SO的組合物在融化時顯示最高活性，并且觀察到白蛋白和糖成分加入到細胞治療組合物中在冷凍和融化過程中保護了細胞，以改善細胞活性。實施例7下面，將參照實施例進一步詳細描述本發(fā)明。對本領域技術人員來說容易想到的是，這些實施例僅僅是用于說明的目的，而不解釋為對本發(fā)明的范圍的限制。實施例1:來自脂肪組織的多潛能干細胞的分離通過腹部抽脂術得到脂肪組織，并使用PBS洗滌然后進行微細切割。切割的組織在添加了l型膠原酶(lmg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中在37t:下消解2小時。消解的組織使用PBS洗滌然后1000rpm離心5分鐘。吸去上清液，并使用PBS洗滌保留在底部的微團，然后1000rpm離心5分鐘。將得到的微團經100ym篩過濾以除去碎片，接著使用PBS洗滌。得到的細胞在DMEM培養(yǎng)基(10%FBS，2mMNAC，0.2mM抗壞血酸)中孵化。經過一夜的時間之后，使用PBS洗去未附著的細胞，并在角化細胞-SFM培養(yǎng)基(含有2mMNAC，0.2mM抗壞血酸，0.09mM牽丐，5ng/mlrEGF，50iig/mlBPE，5iig/ml月夷島素和74ng/ml氫化可的松)中培養(yǎng)，同時以兩天為間隔更換培養(yǎng)基，從而分離多潛能干細胞(圖1)。圖1顯示了以100X放大倍數攝取的上述分離的來自人脂肪組織的多潛能干細胞的照片。實施例2:來自脂肪組織的多潛能干細胞的免疫性質使用PBS洗滌并使用酪蛋白處理在實施例1中得到的來自脂肪組織的多潛能干細胞。收集處理的細胞并1000rpm離心5分鐘。棄去上清液，然后使用2%FBS和PBS的混合物洗滌，1000rpm離心5分鐘。棄去上清液，將細胞懸浮在PBS中，并對于每個樣品將1X105細胞分散到細胞板中。將抗體(R-藻紅蛋白-結合的鼠抗人單克隆抗體)放置到每個孔中并在冰上孵化40分鐘。孵化之后，將培養(yǎng)基1000rpm離心5分鐘。除去上清液并使用PBS洗滌細胞兩次。洗滌后，將細胞使用1%多聚甲醛固定，然后使用流式細胞計數器分析多潛能干細胞的表面抗原(表1和圖2)。表1:來自脂肪的干細胞的表面抗原的FACS分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結果，如表1所示，根據本發(fā)明的來自脂肪組織的成人干細胞顯示了對CD7391X、對CD9097X、對CD2996X、對CD4483X和對CD10580%的陽性應答。而且，本發(fā)明的干細胞顯示了對所有CD33，CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR的陰性免疫應答。實施例3:來自人脂肪組織的多潛能干細胞球制劑將在實施例1中得到的來自人脂肪組織的多潛能干細胞儲存在鹽溶液、鹽溶液+蔗糖、鹽溶液+蔗糖+50%白蛋白和PBS+蔗糖條件下，然后檢查它們的球形成能力。將5X1041X105/ml在實施例1中得到的來自人脂肪組織的多潛能干細胞接種到含有添加了10iiMC0RM-2，5ml抗菌素抗真菌素溶液(100X)，1yg/ml皮質醇，5yg/ml胰島素，20ng/mlEGF，40ng/mlFGF、B27和P_巰基乙醇的無血清MEBM培養(yǎng)基的6孔板的每個孔中。結果，接種37天之后細胞開始形成球形，如圖3所示，甚至在接種710天后細胞增殖形成球形。實施例4:來自脂肪組織的干細胞的體外血管形成效果檢查使用暴露或未暴露于5達因/cm2剪切應力(血管內剪切應力)的細胞通過體外管形成測定檢查來自脂肪組織的間充質干細胞是否形成血管。出于該目的，將Matrigel(Chemicon，USA)加熱并溶解，然后將溶解的凝膠加入到96-孔板并在室溫下固化大約1小時。然后，將在實施例1中得到的來自人脂肪組織的多潛能干細胞以1X104個細胞/孔的濃度分散在多孔板中，并使用EGM-2MV(Clonetics，USA)孵化5天，檢查孵化的細胞是否分化成血管內皮細胞。結果，如圖4所示，觀察到當暴露于剪切應力時，本發(fā)明的來自脂肪組織的間充質干細胞分化成血管內皮細胞，形成類似于血管網絡的結構。實施例5:來自脂肪組織的體內血管形成效果的檢查5-1:鼠缺血性模型的構建通常將8周大之后的裸鼠麻醉，切割左腿的中線，分離并結扎股動脈以及它們的側枝。然后，完全除去左側股動脈，從而形成缺血性下肢模型。5-2:鼠缺血性模型中來自脂肪組織干細胞的血管形成效果在實施例5-1中構建的鼠缺血性模型形成之后24小時，根據細胞濃度將鼠模型分成3組LD組(lXl()6個細胞/kg)，MD組(5Xl()6個細胞/kg)和HD組(1乂107個細胞/kg)。然后，將細胞肌肉注射到鼠的缺血性部位。下肢去除是否發(fā)生被連續(xù)觀察，細胞治療之后4周通過激光多普勒灌流成像來評估鼠中血流的改進程度。結果，在僅僅注射鹽溶液的陰性對照組中，下肢去除發(fā)生，并且在激光多普勒灌流圖像中能夠觀察到注射細胞的濃度越高，血流越平緩(圖5)。當依據激光多普勒灌流比分析血流的改進程度時，與注射鹽溶液作為對照組相比，注射了來自脂肪組織的干細胞的組在血流方面顯示了劑量依賴性改進。實施例6:用于冷藏的干細胞治療組合物的制劑例子在用于大約4t:下冷藏直到它們被注射給藥的制劑中，根據生理鹽水、Hartman-D溶液、PBS和蔗糖作為用于保持細胞活力的等滲溶液的細胞活力被檢查。而且，為了建立在冷藏過程中其中的細胞不凝集或沉淀的條件，EDTA和人血清白蛋白的含量增加和降低對細胞活力的影響被檢查(表2)。結果，與其中細胞被單獨儲存在生理鹽水、Hartman-D溶液或者PBS中的情況相比，在包括蔗糖作為等滲劑、血清白帶白作為放吸收劑或者EDTA的制劑的情況下現實更高的細胞活力，并且細胞不發(fā)生凝集。表2:冷藏條件下的細胞活力<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例7:用于凍藏的干細胞治療組合物的制劑例子在包括除生理鹽水作為基質之外的各種添加劑包括低溫防腐劑的各種制劑中的細胞活性被檢查以便確保本發(fā)明的干細胞治療組合物在干細胞治療組合物的冷藏過程中的凍融穩(wěn)定性。通過添加了生理鹽水、Hartman-D溶液或者PBS作為賦形劑、蔗糖或者甘露糖作為用于保持細胞活力的等滲溶液、在細胞低溫保藏中使用的人血清白蛋白和匿S0得到的細胞活力在凍融后被觀察。結果觀察到，在包括作為基質的生理鹽水、PBS或者Hartman-D溶液，2%的蔗糖和5%的白蛋白的制劑中和除了這些物質之外還包括低溫保護器匿S0的制劑中，冷凍儲存條件下的細胞活力進一步增加(表3)。表3:冷凍儲存條件下的細胞活力<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其含有來自人脂肪組織的間充質干細胞作為活性成分。根據本發(fā)明的細胞治療劑誘導了在缺血性病變中封閉血管周圍的血管形成以加速血流，因此對于治療缺血性疾病是有效的。雖然已經參照特定特征對本發(fā)明進行了詳細描述，但對于本領域技術人員來說顯而易見的是，該描述僅僅用于優(yōu)選實施方式，而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實際范圍由所附的權利要求書及其等同物來限定。權利要求一種治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其含有作為活性成分的來自脂肪組織的間充質干細胞和賦形劑，其中來自脂肪組織的間質細胞的濃度為1×105～1×108個細胞/mL，并且賦形劑為蔗糖或者甘露糖。2.根據權利要求1所述的用于治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其特征在于，用于組合物的基質選自下組，該組包括生理鹽水、磷酸鹽緩沖液和Hartman-D⑧。3.根據權利要求1所述的用于治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其特征在于，另外包括白蛋白或者人血清作為賦形劑。4.根據權利要求1-3中任一項所述的用于治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其特征在于，另外含有EDTA或者匿SO作為賦形劑。5.根據權利要求1所述的用于治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其特征在于，另外含有藥物學上可接受量的至少一種選自下組的添加劑，該組包括懸浮劑、溶解劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑、防吸收劑、表面活性劑、稀釋劑、載色劑、PH調節(jié)劑、鎮(zhèn)痛劑、緩沖劑、含硫還原劑和抗氧化劑。全文摘要本發(fā)明公開了用于治療缺血性肢體疾病的細胞治療組合物，更具體地說，本發(fā)明公開了用于治療缺血性疾病的細胞治療組合物，其含有來自人脂肪組織的間充質干細胞作為活性成分和蔗糖或者甘露糖作為賦形劑。該組合物誘導了在缺血性肢體病變中封閉血管周圍的血管形成，因此對于治療缺血性疾病是有效的。文檔編號A61P25/02GK101711160SQ200880017490公開日2010年5月19日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權日2007年5月25日發(fā)明者李恒永,金孝恩,韓惠晶申請人:Rnl生物技術株式會社;羅正燦