專(zhuān)利名稱(chēng)：使用γ抑制劑化合物減輕疼痛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)內(nèi)容涉及調(diào)節(jié)不同類(lèi)型的疼痛的化合物，其中所述化合物包括一種或多種 與至少一種載體部分偶聯(lián)的YPKC(YPKC)抑制肽，且所述抑制肽、載體部分、或二者已從 原型序列被修飾，以增加由此產(chǎn)生的化合物的穩(wěn)定性、效力、或二者。
背景技術(shù)：
蛋白激酶C( “PKC”)是參與各種各樣的細(xì)胞功能(包括細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)的調(diào) 節(jié)、和離子通道活性)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵酶。PKC同工酶家族包括至少11種不同的蛋白 激酶，基于它們的同源性和對(duì)激活劑的敏感性可分為至少三個(gè)亞家族。所述家族是經(jīng)典的、 新型的、和非典型的亞家族。每種同工酶包括許多同源(“保守的”或“C”)結(jié)構(gòu)域，其間 散布有同工酶-獨(dú)特的(“可變的”或“V”)結(jié)構(gòu)域。YPKC，連同a、(也稱(chēng)為化)、和 β π{也稱(chēng)為B1DPKC,都是所述“常規(guī)”亞家族的成員。多種疾病狀態(tài)的機(jī)制中涉及了 PKC的單獨(dú)同工酶。已經(jīng)生成了源自ε PKC的ε PKC 抑制肽，并顯示出影響傷害感受。例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，376，467和6，686，334。美國(guó)公 開(kāi)號(hào)20030223981中也公開(kāi)了 YPKC來(lái)源的Y PKC抑制肽，于此將其作為參考引入。這種方法的一個(gè)問(wèn)題是切除的片段的“裸露的”末端與它們?cè)诘鞍踪|(zhì)中的情境不 同，在該片段與蛋白質(zhì)其余部分附著的位置顯示出自由的胺基和羧基。這些外部部分可以 致使所述肽對(duì)蛋白酶更敏感。作為這些傾向的結(jié)果，所述肽的效力可能不太理想，且體內(nèi)半 衰期可能顯著縮短?，F(xiàn)有技術(shù)的第二個(gè)領(lǐng)域利用類(lèi)似的策略，其中將“載體”肽設(shè)計(jì)為HIV-Tat和其他 蛋白的片段。這些肽片段模擬親本蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜的能力。特別感興趣的是，“貨物”肽可 以附著于這些載體肽從而將貨物和載體肽通過(guò)這些載體肽片段運(yùn)載到細(xì)胞中的特性。認(rèn)識(shí)到載體肽是片段，類(lèi)似的缺陷可以如上所示地適用于所述貨物肽。即，暴露的 末端可以使其具有不理想的特性，包括蛋白酶易感性?，F(xiàn)有技術(shù)的貨物/載體肽構(gòu)建體在貨物和載體之間使用了 Cys-Cys 二硫鍵，其在 所述肽進(jìn)入細(xì)胞時(shí)可以通過(guò)許多試劑、諸如谷胱甘肽還原而裂解。該特性已被認(rèn)為對(duì)生物 活性很重要，因?yàn)樨浳锖洼d體的物理分離容許這兩個(gè)部分在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮它們獨(dú)立的作用。 然而，該假說(shuō)尚未得到有說(shuō)服力的檢驗(yàn)，且不可裂解的類(lèi)似物事實(shí)上可以具有良好的活性。 此外，二硫鍵的組裝很麻煩，并傾向于化學(xué)降解?，F(xiàn)有技術(shù)的貨物/載體肽的某些設(shè)計(jì)是基于來(lái)自該蛋白的連續(xù)氨基酸序列。然 而，該肽的最佳長(zhǎng)度尚未得到充分定義，這是基于理想序列的序列比較分析和理論預(yù)測(cè)而 不是基于類(lèi)似物測(cè)試的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此，由前述貨物肽的類(lèi)似物可以預(yù)測(cè)增加的效力，所述 類(lèi)似物包含與其來(lái)源的YPKC結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)的另外的殘基。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示用YPKC抑制蛋白處理的樣品的蛋白質(zhì)印跡，其顯示出該抑制劑對(duì)細(xì)胞 溶膠中和膜級(jí)分上的酶水平的影響。
圖2顯示線(xiàn)圖，其描繪在使用2克von Frey絲的研究中的爪縮回次數(shù)對(duì)比L5橫 斷后天數(shù)。圖3顯示線(xiàn)圖，其描繪在使用12克von Frey絲的研究中的爪縮回次數(shù)對(duì)比L5橫 斷后天數(shù)。圖4A和4B顯示兩幅線(xiàn)圖，其描繪在使用2和12克von Frey絲的兩項(xiàng)研究中的 平均爪縮回次數(shù)對(duì)比橫斷后天數(shù)和在橫斷后第7. 5天時(shí)的交叉事件。圖5顯示線(xiàn)圖，其描繪在熱痛覺(jué)過(guò)敏研究中以秒為單位的爪縮回潛伏時(shí)間對(duì)比L5 橫斷后天數(shù)。圖6顯示線(xiàn)圖，其描繪在第7. 5天時(shí)具有交叉事件的熱痛覺(jué)過(guò)敏研究中以秒為單 位的爪縮回潛伏時(shí)間對(duì)比L5橫斷后天數(shù)。圖7顯示線(xiàn)圖，其描繪在熱痛覺(jué)過(guò)敏研究中以秒為單位的爪縮回潛伏時(shí)間對(duì)比時(shí) 間，其中在橫斷后第1-7天，用一定劑量抑制肽攻擊動(dòng)物，所述抑制肽是在通過(guò)泵接受所述 肽后第14天皮下施用的。圖8顯示線(xiàn)圖，其描繪在熱痛覺(jué)過(guò)敏研究中以秒為單位的爪縮回潛伏時(shí)間對(duì)比時(shí) 間，其中在橫斷后第7-14天，用一定劑量抑制肽攻擊動(dòng)物，所述抑制肽是在通過(guò)泵接受所 述肽后第14天皮下施用的。圖9顯示線(xiàn)圖，其描繪在熱痛覺(jué)過(guò)敏研究中以秒為單位的爪縮回潛伏時(shí)間對(duì)比時(shí) 間，其中用一定劑量抑制肽攻擊動(dòng)物，所述抑制肽是在橫斷后第14天皮下施用的。

發(fā)明內(nèi)容
本文中的公開(kāi)內(nèi)容涉及修飾的Y PKC抑制肽，產(chǎn)生所述肽的方法，和利用YPKC抑 制肽治療疼痛的方法。從以下的詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員應(yīng)該清楚其他方面和 實(shí)施方案。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及修飾的肽，其抑制Y蛋白激酶(YPKC)同工酶。典型地，本文中討論的 Y PKC抑制肽與載體部分偶聯(lián)，從而促進(jìn)該抑制肽向靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)?？梢韵鄬?duì)于原型對(duì)照而 修飾貨物抑制肽、載體肽、或二者，以增加由此產(chǎn)生的貨物/載體肽構(gòu)建體的穩(wěn)定性。本發(fā) 明的修飾的YPKC肽有效用于預(yù)防和治療多種類(lèi)型的疼痛，諸如急性疼痛、慢性疼痛和炎 性疼痛。定義
用于本說(shuō)明書(shū)中時(shí)，下列詞語(yǔ)和短語(yǔ)通常意欲具有如下所示的含義，除非在使用 它們的上下文中作出另外的指示。"PKC抑制肽”指能夠抑制或滅活Y PKC酶的肽。術(shù)語(yǔ)“封端的”指已經(jīng)被化學(xué)修飾以改變氨基末端、羧基末端、或二者的肽。與未 修飾的貨物肽通過(guò)二硫鍵結(jié)合的封端的載體肽顯示在圖2中。術(shù)語(yǔ)“載體”指促進(jìn)細(xì)胞攝取的部分，諸如陽(yáng)離子聚合物、肽和抗體序列，包括聚賴(lài) 氨酸、聚精氨酸，觸角足(Antermapedia)-來(lái)源的肽，HIVTat-來(lái)源的肽等，如例如美國(guó)專(zhuān)利 和公開(kāi)號(hào) 4，847，240,5, 888，762,5, 747，641,6, 593，292,US2003/0104622,US2003/0199677 和US2003/0206900中所述。載體部分的實(shí)例是“載體肽”，其為促進(jìn)細(xì)胞攝取Y PKC抑制肽的肽，所述Y PKC抑制肽與轉(zhuǎn)運(yùn)肽化學(xué)聯(lián)合或結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”指作為“治療”的要素意欲包括如本文中定義的“預(yù)防”和“抑制”。本 領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員應(yīng)該理解，在人類(lèi)醫(yī)學(xué)中，不總是可能區(qū)分“預(yù)防”和“抑制”，因?yàn)橐?件或多件最終的誘導(dǎo)事件可能是未知的、潛在的，或患者直到該一件或多件事件完全發(fā)生 后才確定。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性” 一般指改善保存期(shelf-life)的修飾，例如，延遲基于保存期的 cys-cys交換，通過(guò)延遲蛋白水解降解，或二者。術(shù)語(yǔ)“效力”涉及獲得特定結(jié)果所需要的特 定肽組合物的量。當(dāng)可以減少一種肽組合物的劑量以獲得理想終點(diǎn)時(shí)，該肽組合物比另一 種更有效力。可以對(duì)給定的肽組合物進(jìn)行某些修飾，以改善該組合物的效力。Y蛋白激_ C(YPKC)抑制肽多種Y PKC抑制劑記述在本文中，并可以通過(guò)本文公開(kāi)的方法使用。抑制肽可以 源自任何結(jié)構(gòu)域，無(wú)論是可變的還是恒定的結(jié)構(gòu)域。因此，抑制肽可以源自V1，V2，V3，V4，或 V5。抑制肽還可以源自恒定區(qū)Cl (Cla，Clb)，C3，C4，或C5。還預(yù)期肽與這些區(qū)域中的一個(gè)或 多個(gè)重疊。貨物肽源自各種結(jié)構(gòu)域且長(zhǎng)度在5-30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。更具體地，源自 PKC 結(jié)構(gòu)域的肽的長(zhǎng)度是 5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24， 25，26，27，28，29，或30個(gè)殘基。原型肽的另一種來(lái)源可以在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/011，557， feH^j"Isozyme-specific antagonists ofprotein kinase C(胃自C 白勺|1]工_ _ · 異性拮抗劑)”中找到，其采用激活劑肽并將其轉(zhuǎn)化為抑制肽，將該專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容引 入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，貨物肽是YPKC的Y PKC抑制肽衍生物，其包括氨基酸序列 R-L-V-L-A-S(SEQ ID NO :1)，位于該肽的氨基或羧基末端、或位于中間的半胱氨酸殘基，和 與所述貨物肽連接的載體肽。上述貨物肽還可以包括一種或多種另外的貨物肽，其彼此連 接且最終連接于載體肽。對(duì)載體肽和貨物肽均進(jìn)行了修飾，其目的在于提高效力，在生物流體/組織中的 穩(wěn)定性，和化學(xué)穩(wěn)定性。這些改變提供了具有增強(qiáng)特性的YPKC抑制劑，以用于多種臨床適 應(yīng)證。已經(jīng)應(yīng)用的一些修飾包括1.對(duì)貨物和/或載體肽講行封端,從而阻礙體內(nèi)蛋白水解，并由此提高效力和/或 功效持續(xù)時(shí)間；2.生成重ft!太，引入親本蛋白的另外的連續(xù)區(qū)，從而提高效力；3.制備皿肽，其在單一肽鏈中具有貨物和載體，從而提高藥物產(chǎn)品的化學(xué)穩(wěn)定 性和保存期；4.制備多聚體肽,其具有兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的活件肽，從而提高蛋白酶抗件和效 力；5.制備肽的逆反(retro-inverso)類(lèi)似物，從而阻礙蛋白水解和6.引入二硫化物類(lèi)似物，從而提供改善的化學(xué)穩(wěn)定性。本文中所述的修飾改進(jìn)了被修飾的YPKC抑制肽的效力、血漿穩(wěn)定性、和化學(xué)穩(wěn) 定性。通過(guò)選擇原型YPKC抑制肽和將這些肽修飾為用于治療疼痛的貨物肽來(lái)確定對(duì) YPKC抑制肽的有效修飾。作為YPKC抑制肽，原型肽可以是目前已知的肽或是尚未確
6定的肽。盡管任何抑制性YPKC肽可以作為起始貨物序列使用，但是優(yōu)選的原型序列是 R-L-V-L-A-S (SEQ IDNO :1)，其中肽是未修飾的并通過(guò)位于貨物和載體肽氨基末端的Cys 殘基與載體綴合?？紤]了多種修飾的或類(lèi)似物肽。一些所述類(lèi)似物包括重疊并超過(guò)原型序 列延伸的氨基酸序列。其他類(lèi)似物肽相對(duì)于原型是截短的。另外，原型序列的類(lèi)似物相對(duì) 于原型序列可以具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其中被取代的氨基酸是丙氨酸殘基或天冬氨 酸殘基。所述包含丙氨酸或天冬氨酸的肽的系統(tǒng)生成稱(chēng)為“掃描”。還預(yù)期生成包括所述類(lèi) 似物和修飾的載體肽的線(xiàn)性肽。對(duì)原型序列的另外的修飾是針對(duì)修飾一種或多種貨物肽、一種或多種載體肽、或 二者中的特定降解位點(diǎn)，并引入氨基酸取代或其他化學(xué)修飾，這些修飾阻斷這些位點(diǎn)的降解。下述表格列出為了作為原型序列在本發(fā)明中使用的許多例舉性YPKC抑制肽。表 1
權(quán)利要求
γ蛋白激酶C(γPKC)抑制肽組合物，包含與胞內(nèi)載體肽共價(jià)連接的γPKC抑制肽，其中所述胞內(nèi)載體肽、所述抑制肽、或二者在N 末端被修飾。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述pkc抑制肽通過(guò)二硫鍵與所述胞內(nèi)載體肽連接。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述胞內(nèi)載體肽是修飾的tat肽，其包括 ygrkkrrqrrr(seq id no:)。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述胞內(nèi)載體肽是修飾的tat肽，其包括 cygrkkrrqrrr(seq id no )。
5.權(quán)利要求3或4的組合物，其中所述修飾的tat肽在其n-末端被?；?、烷基、或磺酰 基取代。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述修飾的tat肽在其n-末端被?；?。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述tat肽還在其c-末端被修飾。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制肽包括氨基酸序列R-L-V-L-A-S和末端Cys。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述末端Cys位于所述抑制肽的C-末端。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制肽包括氨基酸序列R-L-V-L-A-S-G-G和末端Cys0
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述末端Cys位于所述抑制肽的C-末端。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述tat肽通過(guò)在其c-末端形成酰胺而被進(jìn)一步修飾。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述pkc抑制肽與所述修飾的tat肽的氨基酸的側(cè)鏈共 價(jià)連接。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述pkc抑制肽與選自半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、賴(lài)氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的一個(gè)殘基的側(cè)鏈共價(jià)連接。
15.權(quán)利要求13的組合物，其中所述pkc抑制肽與n-末端半胱氨酸殘基的側(cè)鏈共價(jià)連接。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述tat肽的n-末端半胱氨酸是被?；摹?br> 17.權(quán)利要求15的組合物，其中所述tat肽的c-末端精氨酸是伯羧酰胺。
18.權(quán)利要求15的組合物，其中所述pkc抑制肽通過(guò)其n-末端的酰化、或其c-末端的 酰胺化、或其n-末端的?；推鋍-末端的酰胺化二者而被修飾。
19.權(quán)利要求ι的組合物，其中所述tat肽是Ac-ygrkkrrqrrrc-nh2。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述pkc抑制肽與所述tat肽通過(guò)所述tat肽的半胱 氨酸殘基的巰基基團(tuán)共價(jià)連接。
21.權(quán)利要求1的組合物，其還包括第二膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
22.線(xiàn)性治療肽，其包括載體肽和y pkc抑制性貨物肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過(guò)肽鍵連接。
23.權(quán)利要求22的線(xiàn)性治療肽，其還包括位于所述載體肽和所述貨物肽之間的連接 肽，其中所述載體肽和所述貨物肽通過(guò)肽鍵與所述連接肽連接。
24.治療疼痛的方法，其包括將有效量的修飾的y蛋白激酶c(ypkc)抑制性構(gòu)建體施用于患有疼痛的受試者，其 中所述修飾的ypkc肽與原型序列相比更穩(wěn)定、更有效力、或既更穩(wěn)定又更有效力。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述受試者患有的疼痛選自由急性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng) 性疼痛、和炎性疼痛組成的組。
26.權(quán)利要求24的方法，其中增加的效力是由比所述原型序列更快開(kāi)始作用或更長(zhǎng)的 活性持續(xù)時(shí)間導(dǎo)致的。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述修飾的YPKC抑制肽在受試者接受疼痛刺激之前、過(guò) 程中、或之后施用于所述受試者。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抑制肽在所述疼痛刺激前5，10，15，20，25，30，35， 40，45，50，55，一小時(shí)，數(shù)小時(shí)，一天，數(shù)天，一周，或數(shù)周施用。
全文摘要
本文中的公開(kāi)內(nèi)容涉及修飾的γPKC抑制肽，產(chǎn)生所述肽的方法，和使用γPKC抑制肽治療疼痛的方法。
文檔編號(hào)A61K39/21GK101969960SQ200880018867
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月6日
發(fā)明者斯蒂芬·D·哈里森 申請(qǐng)人:凱制藥公司