專利名稱：：一種用于改變含有多酚的植物材料的方法以及經(jīng)過改變的含有多酚植物材料的醫(yī)學用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于改變一種或多種含有多酚的植物材料的方法并且涉及一種或多種不同的、經(jīng)過改變的含多酚植物材料的新穎的醫(yī)療用途。
背景技術(shù)：
：世界衛(wèi)生組織(WHO)預測在2025年3億人(目前人口的約5%)將發(fā)展成2型糖尿病。這意味著相當數(shù)量的人口將患有不同的代謝紊亂，如代謝性綜合征。術(shù)語"代謝性綜合征"作為一種臨床診斷并作為一種定義均受到爭議。然而，它表現(xiàn)為一組令人擔憂的代謝的危險因素，這些因素識別了發(fā)展成2型糖尿病和心血管疾病的高危險的受試者。目前，存在著通常被國際糖尿病聯(lián)合會(IDF)和世界衛(wèi)生組織(WHO)接受的三項主要指標，這些指標是對肥胖、血脂障礙、和胰島素抵抗的度量方式。這些危險因素中的每一個均是心血管疾病的良好的預測指標。然而，胰島素抵抗被認為為代謝性綜合征的一個關(guān)鍵因素，因為它預測了2型糖尿病和心血管疾病。胰島素分泌不僅對于維持葡萄糖代謝是必需的，而且對于控制脂類代謝和血管緊張度也是必不可少的。胰島素抵抗引起了對13細胞進行不精密調(diào)節(jié)以保持血糖正常，導致高胰島素血癥，這進而在主要的代謝組織和器官(像肌肉、脂肪組織和肝臟)中切斷胰島素抵抗的作用，并且在胰島素抵抗與高胰島素血癥之間形成一種惡性循環(huán)。胰島素抵抗的原因還沒有得到完全理解，并且存在著幾種遺傳易感性(基因遺傳、多態(tài)性)、分子因素(如氧化應激)、以及可能干擾胰島素信號傳導的不同的炎癥標志物。最后但同樣重要的是強烈的生活方式改變的主要影響，在干預性研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)強烈的生活方式改變延遲或者防止2型糖尿病的發(fā)展達40-58%。這些干預性研究中的飲食目的是通過減少從脂肪中(最重要的是從飽和的脂肪中)攝入能量(由單不飽和脂肪進行部分替換)而減輕體重，并且這種飲食額外富含纖維素、全谷粒、蔬菜、以及水果。這些飲食限制伴隨著每天30分鐘的體力活動。強烈的生活方式改變的生理益處是降低了體重和血壓，并且在胰島素敏感度和血脂方面得到改善。這將影響整個范圍的危險因素并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其延遲或者防止涉及到代謝性綜合征的疾病的形成。鑒于以上所述情況，并不出人意料的是已經(jīng)付出大量的努力來從事對于以上提及的患者背后的機制的研究連同尋找新的防止、減輕、或者治療這些疾病的途徑。造成低胰島素反應的食品被認為是有利的，因為餐后高胰島素水平(高胰島素血癥)是形成代謝性綜合征之內(nèi)的疾病(心血管疾病、2型糖尿病、以及肥胖)的危險因素。因此，對于世界的工業(yè)化地區(qū)中的人類而言，在人體內(nèi)造成較低的胰島素水平的食品是有益的，在這些地區(qū)中心血管疾病的問題(如2型糖尿病、肥胖、以及代謝性綜合征)正在增加。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了治療并防止此類疾病的新穎的方法。發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供了用于改變一種或多種含有多酚的植物材料的方法，其中所述方法包括a)將至少一種含有多酚的材料與至少一種溶劑進行混合以提供一種混合物；b)對這種混合物進行加熱以便除去存在的細菌種類來提供一種經(jīng)加熱的混合物；c)以可任選的順序或者同時地將至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株以及可任選地至少一種蛋白質(zhì)來源加至這種經(jīng)加熱的混合物中以提供一種發(fā)酵混合物；并且d)使這種發(fā)酵混合物經(jīng)受適宜于這種發(fā)酵混合物發(fā)酵的條件以提供一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物；并且a)可任選地除去這種改變多酚的乳酸菌的菌株以提供一種或多種不含活乳酸菌的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物或者一種或多種不含活乳酸菌的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物，用于制造預防或治療糖尿病、代謝性綜合征、以及心血管疾病的一種組合物的用途。附圖簡要說明圖l示出了由測試個體攝入不同的黑果越桔(blueberry)飲料之后所獲得的相對于一種葡萄糖參比飲料的餐后血漿葡萄糖曲線。圖2示出了與一種葡萄糖參比物相比在攝入了經(jīng)受不同的處理/添加劑的不同的黑果越桔產(chǎn)品之后的血清胰島素反應。圖3示出了與一種未處理的對照物(B-未處理)相比在攝入了經(jīng)受不同的處理/添加劑的不同的黑果越桔產(chǎn)品之后的胰島素反應。在30分鐘后，B-ferm給出了與對照物(B-未處理)相比顯著更低的胰島素反應(P<0.05，用B-未處理的作為對照物的丹內(nèi)特檢驗(Du騰t，stest))。圖4示出了在攝入一種具有活菌的經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔飲料以及此后通過巴氏消毒法將其中的細菌殺死的一種經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔飲料之后所獲得的餐后的血漿葡萄糖曲線。圖5示出了在攝入一種具有活菌的發(fā)酵的黑果越桔飲料以及此后通過巴氏消毒法將其中的細菌殺死的一種經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔飲料之后所獲得的胰島素反應。圖6示出了在發(fā)酵之前與發(fā)酵之后薔薇果濃漿、黑果越桔、黑果越桔果皮、以及紅豆越桔(lingonberry)果皮中的兒茶素(catechine)、表兒茶素(印icatechine)、原花色素二聚物苷元、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羥基苯基丙酸、3-苯基乳酸、原兒茶酸、矢車菊素_3-半乳糖苷/矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量。圖7示出了在用植物乳桿菌HEAL19、植物乳桿菌299v或者乳酸片球菌進行發(fā)酵之前和發(fā)酵之后黑果越桔中兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羥基苯基丙酸、卜(-)-3-苯基乳酸、原兒茶酸、以及矢車菊素_3-半乳糖苷/矢車菊素_3-葡萄糖苷的含量。本發(fā)明的實施方案的詳細說明在本發(fā)明的方法的一個實施方案中，該至少一種含有多酚的植物材料與至少一種溶劑的混合物是通過均化作用而獲得的。這種溶劑優(yōu)選是水、自來水、或者蒸餾水，但可以是另一種可食用的水性溶劑，如礦泉水、榨汁(如果汁和蔬菜汁)、乳類、以及其他飲料。為了消除在該至少一種含有多酚的材料與該至少一種溶劑的所制備的混合物中存在的任何一種何細菌種類(如細菌和/或微生物)，為了防止這些細菌種類的任何生長，步驟b)中的加熱發(fā)生在6(TC至10(TC的溫度，優(yōu)選8(TC至IO(TC，更優(yōu)選9(TC至IO(TC，即一個足以殺死細菌和微生物的溫度，例如，在9fC進行2s的巴氏消毒或者使用一種常規(guī)的高壓滅菌器來消除存在的細菌。在步驟b)中所提供的發(fā)酵應該只發(fā)生在當將乳酸菌的特定的菌株加至該混合物中時。因此，在發(fā)酵之前消除可能在加熱步驟b)中存在的任何其他種類的細菌是必需的?？紤]到所希望的結(jié)果而定(即，殺死存在的任何細菌和微生物)來確定加熱溫度和加熱的持續(xù)時間。在加熱步驟b)之后，(例如)可以通過加入KOH(因為含有多酚的材料可能是酸性的)將經(jīng)加熱的混合物的pH調(diào)節(jié)到在大約4.5至9、優(yōu)選5至7范圍內(nèi)的pH值。這是因為所加入的乳酸菌的菌株在這個pH區(qū)間會生長良好。該至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株所添加的量值是大約105至109cfu/ml混合物。優(yōu)選地，在至少一種蛋白質(zhì)來源(例如一種氨基酸來源)的存在下發(fā)生這種發(fā)酵，所述蛋白質(zhì)來源是選自但不限于下組，該組包括蛋白胨、胰蛋白胨(含奶肉湯)、酵母提取物、以及它們的組合。另一個例子是肉湯或者燕麥片，它們也包含這些細菌所必需的組分。在沒有加入蛋白質(zhì)來源(即，在僅存在所加入的含有多酚的一種或多種植物材料的組分，即在這些植物材料中存在蛋白質(zhì)以及碳水化合物)的情況下發(fā)生這種發(fā)酵也是可能的。該至少一種蛋白質(zhì)所加入的或存在的量值是按總混合物的重量計O.0001-0.1%。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株是選自下組，包括乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、乳球菌屬、以及系統(tǒng)發(fā)生意義上相關(guān)的屬。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株是選自下組，該組包括植物乳桿菌、類植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、以及Lactobacillusargentoratensis。優(yōu)選地，這種植物乳桿菌是選自下組的菌株，其構(gòu)成為于1991年7月2日在德國國家菌禾中保藏中心(DeutscheSammlimgvonMikroorganismenimdZellkulturenGmbH)保藏的植物乳桿菌299，DSM6595，于1995年3月16日在德國國家菌種保藏中心保藏的植物乳桿菌299v，DSM9843，于2002年11月27日在德國國家菌種保藏中心保藏的植物乳桿菌HEAL9，DSM15312，植物乳桿菌HEAL19，DSM15313，以及HEAL99，DSM15316，并接著給出了以上提到的登錄號。在加入特定的乳酸菌的菌株之后，這些發(fā)酵條件是在大概3(TC至5(TC的溫度、優(yōu)選大約35t:至45t:、尤其是大約37t:至4(rc、在大氣壓下的液體培養(yǎng)基中。這種發(fā)酵經(jīng)常進行到直至達到<5的pH值，優(yōu)選<4.如果對酸奶進行發(fā)酵，則這種發(fā)酵持續(xù)到pH<4.6至4.7。這種發(fā)酵發(fā)生了大概10至30小時，優(yōu)選大概15至25小時，例如大概20至24小時。發(fā)酵的持續(xù)時間應該是充足的，以便提供這種或這些有益的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料。在完成發(fā)酵之后，對該改變多酚的乳酸菌的菌株的可任選的清除步驟f)是通過加熱、紫外輻射、Y輻射、壓力、電流、放電、脈沖電場、電擊(electricchock)、或者無菌過濾。通過清除乳酸菌的菌株，在可由個體服用的任何組合物中使用所獲得不含乳酸菌的、經(jīng)6過改變的含有多酚的植物混合物的混合物，這將是可能的。例如，通過乳酸菌的菌株進行發(fā)酵而得到改變的一種或多種含有多酚的植物材料是選自下組，該組包括水果、蔬菜、漿果、茶、谷物、綠茶、咖啡、可可、巧克力、以及樹皮。例如，這些水果和槳果是選自下組黑果越桔、紅豆越桔、蔓越莓(cranberry)、蘋果、香蕉、黑醋栗、草莓、覆盆子、薔薇果、葡萄、柑橘、腺肋花楸(aronia)、日本木瓜(Japanesequince)、黑剌李、薔薇果和接骨木果、橄欖、剌山柑漿果、或者其他富含多酚的果實。樹皮優(yōu)選是選自肉桂。蔬菜是選自(例如)豆類。本發(fā)明并不限于以上提及的具體例子。考慮到所選定的一種或多種含有多酚的植物材料，重要的方面是有待使用的一種或多種含有多酚的植物材料應該受到用乳酸菌的菌株進行的發(fā)酵的影響，并且提供一種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料。在本背景中，短語"改變含有多酚的植物材料"是指一種所加入的乳酸菌的菌株的發(fā)酵已經(jīng)在一種含有多酚的植物材料的存在下發(fā)生。這種發(fā)酵發(fā)生并且影響存在的多酚基團以便提供一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料。在本背景中，術(shù)語"一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料"旨在表示在如此處指明的條件下含有多酚的植物材料在一種乳酸菌的菌株的存在下進行發(fā)酵之后所獲得的一種或多種產(chǎn)物。在實驗部分中，所測試的含有多酚的材料是黑果越桔、紅豆越桔、以及薔薇果，并且已顯示僅有經(jīng)發(fā)酵的含測試產(chǎn)物的黑果越桔、紅豆越桔和薔薇果造成了更低的胰島素反應的顯著性作用，這意味著最可能是含有多酚的材料的發(fā)酵造成了更低的胰島素反應。因此，根據(jù)本發(fā)明術(shù)語"一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料"是指在含有多酚的植物材料進行發(fā)酵之后所獲得的此類物質(zhì)。與攝入沒有用乳酸菌的菌株進行發(fā)酵的含有一種多酚的植物材料相比，在攝入此類"經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料"之后，它們應該提供所希望的降低胰島素反應的作用。通過攝入經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料(處于任何適宜的形式)，胰島素水平的降低應該是在大概1_50%的區(qū)間，優(yōu)選大概5_40%，更優(yōu)選大概10-30%，甚至更優(yōu)選大概15-25%，例如大概25%。本發(fā)明進一步涉及一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物或者一種或多種不含活乳酸菌的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物用于制造預防或治療糖尿病、代謝性綜合征、肥胖、以及心血管疾病的一種組合物的用途。這種組合物優(yōu)選是一種藥物組合物或者食品組合物。這種食品組合物例如是一種食物產(chǎn)品或者食品增補劑。這種食物產(chǎn)品可以選自下組，該組包括面包類、乳酪類、酸奶類、果汁類、健康飲料、健康食品棒類(healthbar)、涂抹醬類(spread)、餅干類、以及谷類食品。便利的是在一種食品組合物中包括一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物或者一種或多種不含活乳酸菌的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物，這是因為這種組合物容易被個體服用來保持健康，并且可以預防如以上所提及的心血管疾病。方法和材料測試產(chǎn)品為了顯示出本發(fā)明的作用，已經(jīng)進行測試來評價在攝入不同的基于含有一種多酚的植物材料(如黑果越桔和蔗糖)的組合物之后餐后血糖和胰島素反應的潛在差異，這取決于1)黑果越桔組合物的熱處理的類型和程度；2)在該組合物中產(chǎn)生乳酸的細菌(分別為植物乳桿菌299v和植物乳桿菌HEAL19)的存在，以及；3)用植物乳桿菌HEAL19對黑果越桔組合物進行的發(fā)酵。五種不同的測試飲料和一種參比飲料(Ref.)被包括在該研究之中。這些測試飲料包括一種未處理未發(fā)酵的黑果越桔飲料(B-皿tr)、一種基于經(jīng)巴氏消毒的未發(fā)酵的黑果越桔的飲料(B-past)、兩種經(jīng)巴氏消毒但沒有分別加入植物乳桿菌299v和HEAL19而進行發(fā)酵的飲料(B-299v和B-HEAL)、以及一種經(jīng)巴氏消毒并且用植物乳桿菌HEAL19進行發(fā)酵的飲料(B-ferm)。這種參比飲料包括溶于水中的葡萄糖。在儲存于_20°0之前，將黑果越桔(Vacciniummyrtillus)混合成濃槳。在解凍之后，用水(1:1)將這些黑果越桔稀釋并且使用家用混合器將其均勻化5分鐘。此后，對黑果越桔進行再一次稀釋(1:l)，獲得25%的黑果越桔溶液。然后，用高效能分散機(UltraTurraxT25，Janke&KunkelIKA，WerkeGmbH&Co.KG，Staufen，Germany)在25000rpm將黑果越桔溶液均勻化。取出未發(fā)酵的黑果越桔飲料樣本(B-未處理)，并且將其冷凍在-2(TC直到用于膳食研究中。將剩余的黑果越桔溶液進行巴氏消毒(94t:，2s)，并且儲存在-2(TC(B-經(jīng)巴氏消毒)。兩種具有分開加入的植物乳桿菌299v(B-299v)和植物乳桿菌HEAL19(B_HEAL19)的飲料是通過在研究前一天將這種B-經(jīng)巴氏消毒的飲料解凍并且加入各自的乳桿菌屬菌株而進行制備的，并且此后允許將這種飲料在冷藏箱中(+4°C)放置過夜直到供應時。在供應前大概一周，將600ml經(jīng)巴氏消毒的黑果越桔溶液在一個容器中進行發(fā)酵，加入K0H以便將pH調(diào)節(jié)至5。此后，使用植物乳桿菌HEAL19將這種黑果越桔溶液進行接種(lxl(f個菌落形成單位(cfu)/ml)。加入一克經(jīng)高壓滅菌的蠶豆花作為氮源。將這種黑果越桔溶液發(fā)酵20h直至達到lxl07ml(pH3，8)的最終cfu(B-經(jīng)發(fā)酵)。在發(fā)酵之后將這種黑果越桔溶液儲存在4t:。通過ProbiAB(Lund，Sweden)進行發(fā)酵。將一種葡萄糖飲料用作參比食品(在300ml水中包含30gD+葡萄糖(VWRinternationalLtd.Poole，England))。所有的膳食均貢獻了30g碳水化合物。在研究開始時向每位測試受試者提供一塊小麥白面包(麗B，DollarStorfranska，Lockarp，Sweden)。將在每次試驗之前的晚上攝入逐個選擇的切片量。表1示出了這些測試飲料和參比物的不同組成。表1飲料量來自漿果來自漿果來自漿果所加入的所加入的碳水化合(g)的低分子的果糖的葡萄糖葡萄糖蔗糖物的總量碳水化合(g)(g)(g)(g)(g)物的總量(g)Ref.3003030B-皿t.*3003.822.191.6326.18308<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>這些漿果含有<0.04的蔗糖。*所有黑果越桔飲料進一步含有72.8mg抗壞血酸，320.lmgtrecomex、291mgCNK。在供應72.8mg抗壞血酸之前，將320.lmgtrecomex(經(jīng)過改變的馬鈴薯淀粉)、291mgCNK(角叉菜聚糖E407)、以及26.18g蔗糖加至每種黑果越桔飲料中。此外，將l.18g葡萄糖加至B-經(jīng)發(fā)酵的飲料中來補償在發(fā)酵過程中碳水化合物的損失。最后，用32.0g水對所有黑果越桔飲料進行調(diào)節(jié)，這樣就獲得了含有20%黑果越桔以及30g碳水化合物的300g黑果越桔飲料。測試飲料的研究將所有飲料作為早餐來供應并且進行隨機提供，間隔至少五天。從所有受試者中獲取書面的知情同意書。他們也完全意識到以下事實，即他們可以在任何時間從該研究中撤出并且無需另外的解釋。隆德大學(LundUniversity)醫(yī)學系的倫理委員會批準了這項研究。測試受試者十五位健康的、不吸煙的志愿者(7女8男)參加了這項急性膳食研究。平均年齡是25士2.4(平均值士SD)歲，并且平均體重指數(shù)是在正常范圍之內(nèi)(22.4±2.0kg/m2;平均值±SD)。這些受試者沒有接受任何藥物治療。他們被要求在測試前一天避免酒精攝入、體力活動、以及富含纖維素的晚餐。這些受試者在每次試驗之前的晚上9點和IO之間食用了逐個選擇量的WWB。在整個研究中將逐個選擇的切片量保持相等。在WWB膳食之后，這些受試者被要求在到達實驗室之前不要攝入更多的東西。然而，若有必要，允許在10pm之后攝入少量的水。每位受試者參加四次試驗，間隔至少一周。研究設(shè)計和血液采樣這些受試者在早上07.45到達實驗室，并且肘前靜脈被插入一根外周導管。在每次試驗時，所有參與者都填寫了一份有關(guān)他們這一天身體狀況的調(diào)查表，包括壓力或焦慮的感覺。膳食在10分鐘的過程中以平穩(wěn)的方式被消耗掉。在禁食以及在膳食攝入后的15、30、60、90、120、180、240分鐘采集毛細血管血用于血清胰島素和血槳血糖(plasmabloodglucose)的分析。葡萄糖分析用B-GlucoseAnalyser(Hemocue201+，HemocueAB，Angelholm，Sweden)領(lǐng)lj定血糖。胰島素分析將血清胰島素樣本儲存在-2(TC。通過使用一種酶免疫測定試劑盒(MercodiaInsulinElisa;MercodiaAB，U卯sala，Sweden)在一個一體化的酶免疫測定分析儀(CODAOpenMicroplateSystem;Bio-RadLaborato:ries，HerculesCA)上進行分析。計算和統(tǒng)計分析針對每位參與者和每種測試飲料，通過使用GraphPdPRISM(version3.02;Gr即hPadSoftwareInc，SanDiego)計算出血糖和血清胰島素在0-45分鐘并且在0-120分鐘增加的曲線下面積(AUC)。將所有在基線以下的面積從計算結(jié)果中排除。在每個時間點對血糖和血清胰島素進行統(tǒng)計學分析。用MINITAB統(tǒng)計軟件(發(fā)行了13.l用于windows)進行統(tǒng)計計算。顯著性是由在廣義線性模型(AN0VA)之后跟隨接圖基多重比較檢驗(Tukey—smultiplecomparisonstest)或者丹內(nèi)特檢驗而進行確定。產(chǎn)生P<0.05的差異被認為是顯著性的。血漿葡萄糖與葡萄糖參比物相比，在攝入黑果越桔飲料之后，早期(0-45min)和晚期(0-90min)的葡萄糖曲線下面積都同樣是顯著更低的。在區(qū)間58-64中很好地收集了黑果越桔飲料的GI值并且它顯著低于葡萄糖參比(GI=100)。血漿葡萄糖反應示于圖1中。表2-在經(jīng)巴氏消毒、經(jīng)發(fā)酵的和/或補充有細菌的葡萄糖參比物和黑果越桔飲料之后的血漿葡萄糖。葡萄3瞎飲料ii禁食值(mmol/L)在30min的峰值(S)(mmol/L)0-45min的曲線下面積(mmolmin/L)GI(0-90min)葡萄糖155.2±0.14.1±0.3a115.6±8.2a100±0.0aB-untr145,2±0.13.0±0.2b80.8±7.2b58±4.6bB-past.135.2±0.13.0±0.3b82.4±7.1b64±5.5bB-ferm.155,2±0.12.8±0.3b76.6±8.0b61±6.9bB-299v145.3±0.13.2±0.2b81.1±6.9b60±4.7bB-HEAL19145.2±0.12.9±0.2b80.2±5.3b63±4.4b這些數(shù)字指出了平均值±SD，n=測試人員的數(shù)目。在同一欄中帶有不同字母的平均值是顯著不同的(P<0.05)。血清胰島素在攝入不同的黑果越桔飲料和參比物之后的胰島素反應示于圖2中。在區(qū)間30-60min中，與葡萄糖參比物相比，所有黑果越桔飲料引起了顯著更低的胰島素反應。在15min后，與葡萄糖參比物相比，攝入B-ferm之后胰島素水平顯著更低。在餐后的早期(表達為0-45minAUC)，與B-HEAL19相比，B-ferm引起了更低的胰島素反應。為了研究巴氏消毒法和發(fā)酵(用植物乳桿菌HEAL19)或?qū)⒅参锶闂U菌加至黑果越桔原料中的重要性，將B-past、B-ferm、B_299v、以及B-HEAL19的胰島素反應與未處理10的對照飲料(B-皿tr)進行比較。在攝入后30min，與B-未處理相比，B-ferm顯著更低。在120min，與B-未處理相比，B-299v和B-HEAL19顯示出顯著更低的胰島素反應。早期胰島素反應(0-45minAUC)的比較顯示，與未處理的黑果越桔飲料相比B-ferm給出了顯著更低的胰島素反應(25%)(P<0.05，表4)。巴氏消毒法或分別加入植物乳桿菌299v或植物乳桿菌HEAL19均沒有顯著性地影響有關(guān)未處理的黑果越桔飲料的餐后胰島素面積。表3-健康的測試受試者在攝入葡萄糖飲料和基于經(jīng)受巴氏消毒法、發(fā)酵和/或補充有細菌的黑果越桔原料的飲料之后的血清胰島素反應。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>這些圖指出了平均值±SD，n=測試人員的數(shù)目。在同一欄中具有不同字母的平均值是顯著不同的(P<0.05)。用植物乳桿菌HEAL19對黑果越桔進行的發(fā)酵對于降低的胰島素反應似乎是一個關(guān)鍵因素。這些結(jié)果提示這種發(fā)酵過程改進了胰島素的經(jīng)濟性。表4-將經(jīng)巴氏消毒和經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔飲料與作為對照物的未處理的黑果越桔飲料進行胰島素反應的比較。飲料<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>^旨出針對對照飲料B-未處理的顯著差異(P<0.05，用B-未處理作為對照飲料的丹內(nèi)特檢驗)。在攝入用植物乳桿菌HEAL19進行發(fā)酵的黑果越桔之后，降低25%的胰島素反應未見伴隨在血漿葡萄糖方面的類似的下降，這是因為在黑果越桔飲料之后餐后血漿葡萄糖反應處于相同的水平。然而，使用植物乳桿菌HEAL19對黑果越桔進行的發(fā)酵似乎是對于含有經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔的飲料所見到的降低的胰島素反應的一個關(guān)鍵因素。當在攝入之前將相同的細菌植物乳桿菌HEAL19加至黑果越桔飲料中時，沒有看到這種作用。因此，并不是細菌本身的存在引起了降低的胰島素反應，相反重要的卻是發(fā)酵其自身。造成這種有趣的作用的活性機制可能是因為通過這種發(fā)酵所產(chǎn)生或者經(jīng)過改變的組分，即在發(fā)酵之后在黑果越桔中可供使用的經(jīng)過改變的多酚組分?？傊?，可以得出結(jié)論，與未經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔飲料相比，經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔飲料使胰島素反應降低了25%。將來，以患有代謝紊亂的人們?yōu)槟繕说漠a(chǎn)品可呈現(xiàn)出一種額外的預防方式，并且也可以減少2型糖尿病和內(nèi)皮紊亂的發(fā)展。從更大的視角來觀察"代謝紊亂流行"，優(yōu)選通過整合問題的所有方面來進行，即不僅有營養(yǎng)的和臨床方面，而且還有文化和經(jīng)濟方面，人們能夠在西方國家和在發(fā)展中國家中引入一種全面的健康生活方式。所有消費者的知識的增加將有希望使工業(yè)界遵從市場的希望。將具有活菌的飲料的效應與消除了細菌的飲料的作用講行比較的測li式在一項研究中包括兩種不同的測試飲料以便評價一種飲料(其中在發(fā)酵之后植物乳桿菌HEAL19的培養(yǎng)物進行巴氏消毒)是否給出了與另一種飲料(其中在發(fā)酵之后植物乳桿菌HEAL19的培養(yǎng)物仍然存活)相同的低胰島素反應。這些測試飲料包括一種經(jīng)巴氏消毒并且用植物乳桿菌HEAL19進行發(fā)酵的飲料，以及一種經(jīng)巴氏消毒并且用植物乳桿菌HEAL19進行發(fā)酵并接著在發(fā)酵之后進行巴氏消毒的飲料。在儲存于-2(TC之前，將黑果越桔(Vacciniummyrtillus)混合成濃漿。在解凍之后，用水(l:1)將這些黑果越桔稀釋，并且用家用混合器將其均勻化5分鐘。此后，對黑果越桔進行再一次稀釋(1:1)，獲得25%的黑果越桔的溶液。然后，用高效能分散機(UltraTurraxT25，Janke&KunkelIKA，WerkeGmbH&Co.KG，Staufen，Germany)在25000rpm將黑果越桔溶液均勻化。服用未經(jīng)發(fā)酵的黑果越桔飲料的樣本(B-未處理)，并且將其冷凍于-2(TC直到用于膳食研究中。將剩余的黑果越桔溶液進行巴氏消毒(94t:，2s)，并且儲存在-2(TC(B-past)。在供應前大概一周，將600ml經(jīng)巴氏消毒的黑果越桔溶液在一個容器中進行發(fā)酵，加入K0H以便將pH調(diào)節(jié)到5。此后，用植物乳桿菌HEAL19對黑果越桔溶液進行接種(lx107個菌落形成單位(cfu)/ml)。加入一克經(jīng)高壓滅菌的蠶豆花作為氮源。將黑果越桔溶液發(fā)酵20h直至達到lxl07ml(pH3，8)的最終cfu。在發(fā)酵之后，將這種黑果越桔溶液儲存在4"C或再次進行巴氏消毒(94°C，2s)并且儲存在4t:。通過ProbiAB(Lund，Sweden)進行發(fā)酵。表5示出了測試飲料的不同組成。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>~~這些漿果含有<0.04的蔗糖。*所有黑果越桔飲料進一步含有72.8mg抗壞血酸、320.lmgtrecomex、291mgCNK。在供應72.8mg抗壞血酸之前，將320.lmgtrecomex(經(jīng)過改變的馬鈴薯淀粉)、291mgCNK(角叉菜聚糖E407)以及26.18g蔗糖加至每種黑果越桔飲料中。此外，將l.18g葡萄糖加至B-經(jīng)發(fā)酵的飲料中來補償在發(fā)酵過程中碳水化合物的損失。最后，用32.Og水對所有黑果越桔飲料進行調(diào)節(jié)，這樣就獲得了含有20%黑果越桔以及30g的碳水化合物的300g黑果越桔飲料。測試飲料的研究將所有飲料作為早餐來供應并進行隨機提供，相隔至少五天。從所有受試者獲取了書面的知情同意書。他們也完全意識到以下事實，即他們可以在任何時間從該研究中撤出并且無需另外的解釋。隆德大學醫(yī)學系的倫理委員會批準了這項研究。測試受試者十三位健康的、不吸煙的志愿者參加了這項急性膳食研究。平均年齡是25.5士1.34(平均值士SD)歲，并且平均體重指數(shù)是在正常范圍內(nèi)(20.8±0.24kg/m2;平均值士SD)。受試者之一在一次測試期之前患有胃性流行性感冒(gastricinfluenza)，并且因此被排除在這項研究之外。這些受試者沒有接受任何藥物治療。他們被要求在測試前一天避免酒精攝入、體力活動、以及富含纖維素的正餐。這些受試者在每次試驗之前的晚上9點和IO之間食用逐個選擇量的WWB。在整個研究中將逐個選擇的切片量保持相等。在WWB膳食之后，這些受試者被要求在到達實驗室之前不要攝入更多的東西。然而，若有必要，允許在10pm之后攝入少量的水。每位受試者參加四次試驗，間隔至少一周。研究設(shè)計和血液采樣這些受試者在早上07.45到達實驗室，并且肘前靜脈被插入一根外周導管。在每次試驗時，所有參加者都填寫了一個關(guān)于他們這一天身體狀況的調(diào)查表，包括壓力或者焦慮的感覺。膳食在10分鐘的過程中以平穩(wěn)的方式被消耗掉。在禁食以及在膳食攝入后的15、30、60、90、120分鐘采集毛細血管血用于血清胰島素和血漿血糖的分析。葡萄糖分析用B-GlucoseAnalyser(modelno.120401，HemocueAB，Angelholm，Sweden)測定血糖。胰島素分析將血清胰島素樣本儲存在-2(TC。通過使用一種酶免疫測定試劑盒(MercodiaInsulinElisa;MercodiaAB，U卯sala，Sweden)在一個一體化的酶免疫測定分析儀(CODAOpenMicroplateSystem;Bio-RadLaborato:ries，HerculesCA)上進行分析。計算和統(tǒng)計分析針對每位參加者和每種測試飲料，通過使用Gr即hPadPRISM(version3.02;Gr即hPadSoftwareInc，SanDiego)計算出血糖和血清胰島素在0-45分鐘和在0-120分鐘的增加的曲線下面積(AUC)。將所有在基線以下的面積從計算結(jié)果中排除。在每個時間點對血糖和血清胰島素進行統(tǒng)計學分析。用MINITAB統(tǒng)計軟件(發(fā)行了13.1用于windows)進行統(tǒng)計計算。顯著性是由在廣義線性模型(AN0VA)之后跟隨Tukey多重比較檢驗或者丹內(nèi)特檢驗而進行測定的。產(chǎn)生P<0.05的差異被認為是顯著性的。血漿葡萄糖與具有活菌的測試飲料相比，在攝入發(fā)酵之后進行巴氏消毒的測試飲料之后，早期(0-45min)和晚期(0-120min)的葡萄糖曲線下面積均輕微更低，如在圖4中所見。通過將血糖保持在血糖方面具有最大增加的禁食值之上的持續(xù)時間除以該禁食值來對葡萄糖曲線的特點進行分析。這一商值被稱為葡萄糖持續(xù)時間/峰值定額(min/AmM)。在葡萄糖持續(xù)時間/峰值定額上的高值意味著葡萄糖曲線是長而低的，而低值表明了具有短而高的曲線的不利的曲線特點。不能確定GI值，這是因為在此測試中不包括參比物。表6-具有活菌的經(jīng)發(fā)酵的飲料和經(jīng)發(fā)酵的并且經(jīng)巴氏消毒的飲料的AUC120min(血槳葡萄糖)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>這些圖指出了平均值士SD，n=測試人員的數(shù)目。表7-具有活菌的發(fā)酵飲料和經(jīng)發(fā)酵的并且經(jīng)巴氏消毒的飲料的AUC45min(血漿葡萄糖)和葡萄糖持續(xù)時間/峰值定額。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>這些圖指出了平均值士SD，n=測試人員的數(shù)目。血清胰島素在攝入這兩種黑果越桔飲料之后的胰島素反應示于圖5中。與具有活菌的測試飲料相比，在攝入發(fā)酵之后進行巴氏消毒的測試飲料之后AUC更低。不能確定NoII值，這是因為在此測試中不包括參比物。表8-具有活菌的經(jīng)發(fā)酵飲料和經(jīng)發(fā)酵的并且經(jīng)巴氏消毒的飲料的AUC120min(血清胰島素反應)。飲料AUC120minSEM(n=12)B_ferm.活的6.651.06B-ferm.并且經(jīng)巴氏消毒4.750.51這些值已經(jīng)在分析之前用BoxCox變換進行轉(zhuǎn)化。討論兩種飲料給出了針對葡萄糖的近似相同的反應。與具有活菌的飲料相比，經(jīng)巴氏消毒(即將細菌殺死)的飲料在胰島素反應上顯示出更好的結(jié)果。在更早的研究中，從單獨的巴氏消毒法中在胰島素反應上沒有見到作用，即經(jīng)巴氏消毒的黑果越桔給出了與非經(jīng)巴氏消毒的黑果越桔相同的結(jié)果。然而，本研究表明，在一個較大程度上，發(fā)酵之后的熱處理的程度可能影響胰島素反應。這種作用的機制需要進行進一步評價。一種理論是，一種更為強大的熱處理，通過對多酚類和其他黑果越桔中的生物活性組分的作用而給出一種胰島素降低的作用，這種效應是通過由于額外的熱處理步驟而具有熱滅活的細菌的飲料來進行闡述的。酚類化合物的分析為了提供發(fā)生了一種含有多酚的植物材料的改變的證據(jù)，進行了一項研究，這項研究比較了在發(fā)酵之前和發(fā)酵之后薔薇果濃漿、黑果越桔、黑果越桔果皮、以及紅豆越桔果皮中的兒茶素、表兒茶素、原花色素二聚物苷元、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羥基苯基丙酸丄-(_)-3-苯基乳酸、原兒茶酸以及矢車菊素_3-半乳糖苷/矢車菊素_3-葡萄糖苷。在發(fā)酵之前將所有水果部分進行巴氏消毒以避免其他微生物影響發(fā)酵。為了分析酚類化合物，將樣本稱重并且加入了用于進行萃取的溶液(在樣本中的濃度50%乙醇、0.05M磷酸，或可替代地50X甲醇，0.5%)。此后，在超聲浴中將這些樣本萃取10min并接著進行離心，之后將上清液轉(zhuǎn)移至小瓶中并且通過HPLC-MS分析法進行分析。如在以下文獻中所述通過API150EXTurboIonspray進行HPLC-MS分析Salminenetal.Characterisationofproanthocyanidinaglyconesandglycosidesfromrosehipsbyhigh_performancceliquidchromatogr即hy—massspectrometry"andtheirrapidquantificationtogetherwithVitaminC.JChromA2005;1077:170-180、以及Salminenetal.CharacterisationofhydrolysabletanninsfromleavesofBetul即ubescensbyhigh—performanceliquidchromatogr即hy-massspectrometry.JChromA1999;864:283-291。將該儀器設(shè)定在陰性模式中，即對陰離子進行分析。HPLC系統(tǒng)包括一個PerkinElmerLC-200MicroPump型的HPLC泵，并且還有一個PerkinElmer200自動進樣器。樣本的注射容積是8iU。對遍及90-1000m/z之間的質(zhì)量數(shù)進行掃描。用于檢測的具體的質(zhì)量數(shù)兒茶素，m/z289(M-H)表兒茶素，m/z289(M-H)原花青素B2，m/z577(M-H)原花色素二聚物苷元，m/z577(M-H)原花色素三聚物苷元，m/z865(M-H)原花色素四聚物苷元，m/z1153(M-H)3，4-二羥基苯基丙酸，m/z181(M_H)L-(-)-3-苯基乳酸，m/z165(M-H)原兒茶酸，m/z153(M-H)矢車菊素-3-半乳糖苷/矢車菊素_3-葡萄糖苷，m/z447(M_H)這項研究的結(jié)果可以在圖6中看到，它顯示出含有多酚的植物材料的改變在黑果越桔連同在紅豆越桔和薔薇果中均發(fā)生。表9-在黑果越桔、紅豆越桔以及薔薇果中含有多酚的植物材料的改變<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在一項關(guān)于大鼠的研究中，已經(jīng)顯示將如果消耗了薔薇果加上植物乳桿菌299v或植物乳桿菌HEAL19與如果僅消耗了薔薇果進行比較，則在盲腸中所選擇的酚類化合物的濃度是不同的(表IO)。這表明多酚成分在盲腸內(nèi)進行發(fā)酵的過程中被改變。表IO.在盲腸內(nèi)容物中所選擇的酚類化合物。峰l=yg兒茶素/g鮮重，峰2、3、4以及6=g兒茶素當量/gfw，峰5=g槲皮素-鼠李糖苷/gfw。峰1兒茶素Rtl3.8min，m/z289峰2Rtl6.1min，m/z291峰3Rtl7.1min，m/z385峰4Rtl8.6min，m/z291峰5Rt23.1min，m/z447峰6Rt29.3min，m/z289結(jié)腸炎對照1.65.301.70.69.3Lp299v0.95.803.31.08.2HEAL191.25.402.20.82.4薔薇果29.9122.7跳812.20.28.6薔薇果+Lp299v38.7119.851.511.30.218.2薔薇果+HEAL1940.9134.228.217.10.264.4對用棺物乳桿菌HEAL19、棺物乳桿菌299v、或者乳酸片球菌講行的發(fā)酵講行比綱則i式為了提供在用其他細菌進行發(fā)酵時發(fā)生了一種含有多酚的植物材料的改變的證據(jù)，進行了一項研究，該研究比較了用植物乳桿菌HEAL19、植物乳桿菌299v或乳酸片球菌在進行發(fā)酵之前和之后在黑果越橘中的兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羥基苯基丙酸、L-(-)-3-苯基乳酸、原兒茶酸、以及矢車菊素_3-半乳糖苷/矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量。這項研究的結(jié)果可以在圖7中看到，它顯示出含有多酚的植物材料的改變發(fā)生在用所有測試的細菌(即植物乳桿菌HEAL19、植物乳桿菌299v或乳酸片球菌)進行發(fā)酵之后。表11-在用植物乳桿菌HEAL19、植物乳桿菌299v或乳酸片球菌進行發(fā)酵之后含有多酚的植物材料的改變<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權(quán)利要求用于改變一種或多種含有多酚的植物材料的一種方法，其中所述方法包括a)將至少一種含有多酚的材料與至少一種溶劑進行混合以提供一種混合物；b)對該混合物進行加熱以消除存在的細菌種類來提供一種經(jīng)加熱的混合物；c)以可任選的順序或者同時地將至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株以及可任選地至少一種蛋白質(zhì)來源加至該經(jīng)加熱的混合物中來提供一種發(fā)酵混合物；并且d)使該發(fā)酵混合物經(jīng)受適宜于該發(fā)酵混合物的發(fā)酵的條件以提供一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的一種混合物；并且e)可任選地消除該改變多酚的乳酸菌的菌株以提供一種或多種不含活乳酸菌的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的一種混合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該含有多酚的至少一種植物材料與該至少一種溶劑的混合物是通過均化作用獲得的。3.根據(jù)權(quán)利要求l或者2所述的方法，其中在步驟b)中的加熱發(fā)生在6(TC至10(TC的溫度，優(yōu)選80°C至IO(TC，更優(yōu)選90°C至IO(TC。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中將該經(jīng)加熱的混合物的pH調(diào)節(jié)到在大約4.5至g、優(yōu)選5至7范圍內(nèi)的一個pH值。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中加入了該至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株，其量值是大約105至109cfu/ml混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中該至少一種蛋白質(zhì)來源是選自下組，該組包括蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、以及它們的組合。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中加入了該至少一種蛋白質(zhì)，其量值按該混合物的重量計是0.0001-0.1%。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株是選自下組，該組包括乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、乳球菌屬、以及系統(tǒng)發(fā)生意義上相關(guān)的屬。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株是選自以下系統(tǒng)發(fā)生的組，該組包括植物乳桿菌、類植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、以及Lactobacillusargentoratensis。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該植物乳桿菌是選自以下菌株的組，該組包括植物乳桿菌299、DSM6595、植物乳桿菌299v、DSM15316、植物乳桿菌HEAL9、DSM15312、植物乳桿菌HEAL19、DSM15313、以及植物乳桿菌HEAL99、DSM15316。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中這些發(fā)酵條件是在3(TC至5(TC的溫度、在大氣壓下的一種液體培養(yǎng)基中。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵進行到直至達到<5的一個pH值，優(yōu)選〈4。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中對該改變多酚的乳酸菌的菌株的消除是通過加熱、紫外輻射、Y輻射、壓力、電流、放電、脈沖電場、無菌過濾、或者電擊而發(fā)生的。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中該含有多酚的一種或多種植物材料是選自下組，該組包括水果、蔬菜、漿果、茶、綠茶、咖啡、可可、谷物、巧克力、以及樹皮。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中這些水果和漿果是選自下組黑果越桔、紅豆越桔、蔓越莓、蘋果、香蕉、黑醋栗、草莓、覆盆子、薔薇果、葡萄、柑橘、腺肋花楸、日本木瓜、黑剌李、薔薇果和接骨木果、剌山柑漿果、橄欖、或者其他富含多酚的果實。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該樹皮是選自肉桂。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中這些谷物是選自燕麥、大麥、小麥、高粱、粟類、水稻、以及玉米。18.—種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的一種混合物、或者一種或多種不含活乳酸菌的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的一種混合物用于制造預防或治療糖尿病、代謝性綜合征、肥胖、以及心血管疾病的一種組合物的用途。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中所述組合物是一種藥物組合物或者食品組合物。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，該食品組合物是一種食物產(chǎn)品或者食品增補劑。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中所述食物產(chǎn)品是選自下組，該組包括面包類、乳酪類、酸奶類、果汁類、健康飲料類、健康食品棒類、涂抹醬類、餅干類、以及谷類食品。全文摘要本發(fā)明涉及用于改變一種或多種含有多酚的植物材料的方法，其中所述方法包括將至少一種含有多酚的材料與至少一種溶劑進行混合以提供一種混合物；對該混合物進行加熱以消除存在的細菌種類來提供一個經(jīng)加熱的混合物；以可任選的順序或者同時地將至少一種改變多酚的乳酸菌的菌株以及可任選地至少一種蛋白質(zhì)來源加至該經(jīng)加熱的混合物中以提供一種發(fā)酵混合物；并且使該發(fā)酵混合物經(jīng)受適宜于該發(fā)酵混合物發(fā)酵的條件以提供一種或多種經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物；并且可任選地消除該改變多酚的乳酸菌的菌株以提供一種或多種不含活乳酸菌的、經(jīng)過改變的含有多酚的植物材料的混合物。文檔編號A61P3/08GK101715347SQ200880019313公開日2010年5月26日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日發(fā)明者A·伯格倫,J·阿倫法爾申請人:普羅比公司