專利名稱：：用于腫瘤治療的均質(zhì)疫苗制劑的獲得的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)，更特別地涉及人類健康領(lǐng)域。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明描述了保護(hù)性和/或治療性的癌癥疫苗，特別是提供了疫苗組合物，其允許針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的免疫應(yīng)答的顯著增強(qiáng)。對(duì)于腫瘤(主要是上皮起源的腫瘤)的生長(zhǎng)，EGF的腫瘤學(xué)相關(guān)性已被廣泛證實(shí)。
背景技術(shù)：
：EGF受體(EGFR)及其配體的系統(tǒng)是這樣的分子復(fù)合物，其相互作用特異性地調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)并且顯示出其對(duì)于上皮起源的腫瘤的不受控制的生長(zhǎng)的影響。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，關(guān)于EGFR的活化的旁分泌和自分泌過(guò)程的失調(diào)牽涉生長(zhǎng)因子的過(guò)表達(dá)以及其受體的合成增加和/或突變。EGF為53個(gè)氨基酸的多肽，其具有6045Da的表觀分子量。該多肽由CohenS.(J.Biol.Chem.20(1962)237，1.555)首次分離和純化。EGF是EGFR配體家族的成員；該家族包括在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)。該家族的其他成員為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin)(AR)、criptol(CR1)、肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子、P細(xì)胞素(betacellulin)和表皮調(diào)節(jié)素(印iregulin)。另一方面，痘病毒家族包括與EGF相關(guān)的蛋白質(zhì)，其中經(jīng)最多表征的是痘苗病毒生長(zhǎng)因子(VGF)。所有這些分子都能夠結(jié)合并活化EGFR，因此它們被稱為EGFR的配體并且在正常細(xì)胞和贅生性細(xì)胞的生長(zhǎng)中或多或少地起作用。EGFR是大約170kDa的糖蛋白，其基因已經(jīng)被克隆和測(cè)序。該受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與顯示出與癌基因v-erb-B的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)同源性的酪氨酸激酶活性相關(guān)，所述癌基因v-erb-B的產(chǎn)物牽涉惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程(HeldinC.H.(1984)，Cell37，9-20)。近年來(lái)所積累的關(guān)于EGFR/EGFR配體系統(tǒng)與癌癥之間的關(guān)系的所有證據(jù)使其成為用于癌癥的免疫療法的頗具吸引力的靶標(biāo)。先前的結(jié)果已證明了用基于EGF的疫苗進(jìn)行癌癥的主動(dòng)免疫療法的可能性。事實(shí)上，已經(jīng)獲得了關(guān)于用與載體蛋白相連接的hrEGF進(jìn)行疫苗接種而引起的免疫原性和低毒性的臨床前和臨床證據(jù)(Gonzalez等人，(1996)，VaccineResearch5(4)，233-243)。EP0657175描述了包含與載體蛋白相偶聯(lián)的自身EGF的疫苗組合物，所述復(fù)合物通過(guò)自身免疫效應(yīng)來(lái)抑制依賴于EGF的腫瘤的生長(zhǎng)。EP0657175中所描述的疫苗組合物是綴合疫苗，其包含與載體蛋白(rP64k蛋白，霍亂毒素B鏈，破傷風(fēng)類毒素蛋白和/或單克隆抗體)相偶聯(lián)的EGF，并因此獲得綴合物種類的異質(zhì)的且低重復(fù)性的混合物。本發(fā)明所描述的新型疫苗制劑包含作為活性成分的自身EGF，其特征在于具有均一的化學(xué)組分、確定的純度、強(qiáng)有力的免疫原性、大幅提高的臨床活性，并且使得能夠顯著減少為了達(dá)到治療作用所需的免疫接種次數(shù)。在本發(fā)明的疫苗制劑中自身抗原含量的降低令人驚訝地沒(méi)有減少而是引起人體中抗EGF抗體滴度的顯著增加。疫苗組合物中EGF及其衍生物的含量的降低是通過(guò)開(kāi)發(fā)出通過(guò)膜的純化方法而獲得的，這也是本發(fā)明的組成部分之一。此外，本發(fā)明提供了均質(zhì)的且可重復(fù)的疫苗制劑，其使得能夠通過(guò)減少免疫接種次數(shù)而提高臨床效果，這相比于先前所描述的疫苗組合物而言在癌癥治療方面和對(duì)于患者來(lái)說(shuō)提供了巨大的好處。本發(fā)明的疫苗組合物可以包含合適的佐劑，例如氫氧化鋁或Montanide。在另一方面，本發(fā)明涉及用于獲得疫苗制劑的符合衛(wèi)生的方法，所述疫苗制劑適合于通過(guò)腸胃外途徑施用給患者。所述方法包括用于將hrEGF與載體蛋白rP64k共價(jià)綴合的適宜的程序，以及使用50-100kDa的范圍內(nèi)的超濾膜來(lái)進(jìn)行純化以去除在生物學(xué)上無(wú)活性(缺乏免疫原性活性)的綴合物種類和其他化學(xué)雜質(zhì)。發(fā)明詳述本發(fā)明提高了基于自身EGF的新型疫苗制劑，其特征在于具有均一的化學(xué)組分和確定的純度、強(qiáng)有力的免疫原性、以及大幅提高的臨床活性。此外，在本發(fā)明中所描述的疫苗呈遞提高了當(dāng)需要提高治療劑量時(shí)顯著減少患者所需的施用次數(shù)的可能性，這是因?yàn)樵撘呙缃M合物是通過(guò)使得能夠達(dá)到綴合物種類hrEGF-rP64k的各種不同濃度/毫升(稱為效價(jià))的方法而獲得的。該新型疫苗制劑是由令人驚訝的發(fā)現(xiàn)而獲得的，即通過(guò)新的純化方法來(lái)降低疫苗組合物中自身抗原的含量，并沒(méi)有減少免疫應(yīng)答，而是使得能夠相比于作為基于EGF的疫苗而使用的異質(zhì)組合物而言顯著增加針對(duì)自我EGF的免疫應(yīng)答。經(jīng)由通過(guò)超濾膜純化方法來(lái)降低自身抗原含量而獲得的疫苗制劑具有均一的組成，其中在免疫學(xué)上有活性的種類(綴合物種類hrEGF-rP64k)顯示出大于60kDa的分子量。該疫苗制劑顯示出其特征如下的分子排阻色譜法分離圖譜該疫苗制劑的具有治療活性的種類占相應(yīng)于整個(gè)疫苗制劑的色譜圖總面積的90%以上，如圖4中所顯示的。為了深入研究該疫苗制劑的結(jié)構(gòu)特征而進(jìn)行的質(zhì)譜法分析，提供了兩個(gè)不同批次的疫苗制劑的肽圖譜，其中注意到在所出現(xiàn)的肽的位置和比例方面的高度相似性(參見(jiàn)圖5)。這一在由兩次重復(fù)的疫苗制劑而獲得的肽圖譜之間的相似性是也在本發(fā)明中描述的進(jìn)行化學(xué)綴合和純化程序的條件的控制的指示。該研究使得能夠鑒定出構(gòu)成本發(fā)明疫苗制劑的主要肽的序列(參見(jiàn)表3)。此夕卜，該疫苗制劑的特征還在于，蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k之間的化學(xué)綴合比例為1:2，這意味著2個(gè)分子的hrEGF/l個(gè)分子的rP64k。用于獲得疫苗制劑的方法用于降低自身EGF含暈的純化程序基于證實(shí)了疫苗制劑中hrEGF含量的降低增強(qiáng)了其免疫原性作用的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，開(kāi)發(fā)出了一種用于降低綴合物的異質(zhì)混合物中hrEGF含量的方法；使該疫苗制劑富含高分子量的綴合物種類(在免疫學(xué)上有活性的種類)并且不含戊二醛。在本發(fā)明中所開(kāi)發(fā)并描述的使用50-100kDa的范圍內(nèi)的超濾膜的純化程序包括兩個(gè)步驟在初始步驟中，連續(xù)更換緩沖液(滲濾)以去除戊二醛并清除過(guò)量的自身蛋白，所述過(guò)量的自身蛋白是游離的或者形成具有不同大小的hrEGF-hrEGF綴合物。在這個(gè)步驟期間，進(jìn)行10至15次緩沖液的更換。第二步驟是濃縮經(jīng)純化的化學(xué)綴合物，其中其組成的590X以上相應(yīng)于免疫原性種類hrEGF-rP64k。在所述濃縮步驟期間，化學(xué)綴合物的最初體積減小，直至達(dá)到在l-12mg/mL的范圍內(nèi)的最終蛋白質(zhì)濃度(綴合物種類hrEGF-rP64k)。關(guān)于所述疫苗制劑在活性成分濃度范圍(hrEGF-rP64k綴合物的總毫克數(shù)/毫升)方面的這一多面性在癌癥治療方面提供了巨大的好處。這使得能夠增加治療劑量，而對(duì)于患者來(lái)說(shuō)并不意味著增加免疫接種的頻率和/或增加免疫接種位點(diǎn)的數(shù)目。為了監(jiān)測(cè)化學(xué)綴合物純化的質(zhì)量，評(píng)估了截留物和滲透物的pH和電導(dǎo)率。還使用LowryD.H.等人，J.BiolChem191:495-498，1951中所描述的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以及通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法分析(HPLC-FG)來(lái)確定均一性百分比。這種方法的獨(dú)特性確保了，所獲得的疫苗制劑具有均一的組成和確定的純度，其特征在于主要存在的是在免疫學(xué)上有活性的種類綴合物種類hrEGF-rP64k。令人驚訝地，游離或聚合的過(guò)量的自身蛋白(hrEGF)的去除并沒(méi)有引起抗EGF抗體濃度的減少，而是使得能夠?qū)⒖笶GF抗體的濃度(1/1000稀釋度)顯著增加至相對(duì)于在用hrEGF的聚合物和用游離的hrEGF免疫小鼠時(shí)得到的抗體濃度而言的10倍。疫苗制劑中自身蛋白含量的減少在患者中引起抗EGF抗體的最大滴度增加到至少兩倍。相比于接受了4.8mg/劑的在EP0657175中所描述的疫苗制劑的患者而言，甚至在接受了一半的免疫接種劑量(2.4mg)的患者中也觀察到抗體滴度的這種增加。這些結(jié)果表明，相比于其他疫苗制劑而言，本發(fā)明中所描述的疫苗制劑具有更高的免疫原性活性/毫克在免疫學(xué)上有活性的蛋白質(zhì)。獲得在重組P64k蛋白(rP64k)和人重組表皮生長(zhǎng)因子(hrEGF)之間的化學(xué)綴合您基于對(duì)用于蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k之間的化學(xué)綴合反應(yīng)的條件所進(jìn)行的評(píng)估和優(yōu)化，開(kāi)發(fā)出了一種化學(xué)綴合方法，其要求高摩爾比例的自身蛋白，即10摩爾hrEGF/摩爾rP64k，以在綴合過(guò)程中保證兩者之間高的綴合效率。在化學(xué)綴合過(guò)程中為保證綴合效率所必需的過(guò)量的自身蛋白隨后通過(guò)如前文所描述的超濾膜純化方法而被除去，這使得能夠獲得具有高均一性的疫苗制劑。本發(fā)明中所描述的用于保證這兩種蛋白質(zhì)之間適宜的化學(xué)綴合的程序由單一步驟組成，并且開(kāi)始于在綴合反應(yīng)器中混合事先經(jīng)濃縮的hrEGF蛋白(>6mg/mL)和rP64k蛋白(>lmg/mL)。然后，向該蛋白質(zhì)混合物中添加PBS/MgCl2溶液(pH6.8-7.2)和0.5%戊二醛的綴合溶液。該混合物于22°C±2°C的溫度下在連續(xù)攪拌下維持2小時(shí)。反應(yīng)混合物中最終的蛋白質(zhì)濃度對(duì)于hrEGF來(lái)說(shuō)為0.82mg/mL，和對(duì)于rP64k蛋白來(lái)說(shuō)為0.89mg/mL。在綴合反應(yīng)期間總蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL，和反應(yīng)混合物中最終的戊二醛濃度為O.05%。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可以與合適的佐劑例如氫氧化鋁或Montanide—同使用。另一方面，本發(fā)明涉及用于獲得通過(guò)腸胃外途徑施用的疫苗制劑的符合衛(wèi)生的方法，在其他優(yōu)點(diǎn)中，該方法尤其將在其獲得過(guò)程中疫苗制劑的微生物污染的機(jī)會(huì)降到最低，允許在數(shù)小時(shí)內(nèi)實(shí)施化學(xué)綴合物的純化方法，并且促進(jìn)待獲得的疫苗制劑的體積增加。提供了下面的實(shí)施例以更詳細(xì)地闡明本發(fā)明。實(shí)施例1描述了本發(fā)明中所描述的疫苗制劑的分子表征。所述分子表征包括在綴合反應(yīng)過(guò)程中形成的綴合物種類的通過(guò)HPLC-FG的色譜法鑒定，蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k6之間的綴合比率的測(cè)定，以及對(duì)于該新型疫苗制劑來(lái)說(shuō)特征性的肽圖譜的解析。實(shí)施例2描述了為了評(píng)估本發(fā)明中所描述的新型疫苗制劑的免疫原性而實(shí)施的在小鼠中的生物測(cè)定法。實(shí)施例3描述了在治療上皮起源的肺腫瘤中本疫苗制劑的臨床應(yīng)用的功效。實(shí)施例4描述了通過(guò)使用與本發(fā)明中所描述的相同的綴合和純化方法來(lái)獲得調(diào)整至各種不同效價(jià)(hrEGF-rP64k綴合物的總毫克數(shù)/瓶)的疫苗制劑。實(shí)施例5顯示了借助于通過(guò)50kDa的超濾膜來(lái)進(jìn)行的化學(xué)綴合物的純化方法，來(lái)去除在綴合反應(yīng)中所使用的戊二醛。實(shí)施例實(shí)施例1:本發(fā)明中所描述的疫苗制劑(疫苗制劑A)的分子表征1.1.本發(fā)明中所描述的疫苗制劑的色譜法表征為了對(duì)于通過(guò)超濾進(jìn)行純化的疫苗制劑進(jìn)行色譜法表征，使用同寡聚綴合物hrEGF-hrEGF和rP64k-rP64k作為指示齊U。將由同寡聚綴合物(hrEGF-hrEGF和rP64k-rP64k)所顯示的色譜法特性譜與由通過(guò)蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k之間的化學(xué)綴合反應(yīng)而獲得的未純化的化學(xué)綴合物所顯示的色譜法特性譜進(jìn)行比較。在圖1中顯示了同寡聚綴合物rP64k-rP64k的特性譜以及在進(jìn)行蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k之間的化學(xué)綴合時(shí)所獲得的特性譜(化學(xué)綴合物未經(jīng)超濾純化)。所圈出的區(qū)帶構(gòu)成了其中出現(xiàn)綴合物種類hrEGF-rP64k的區(qū)域。rP64k-rP64k綴合物的特性譜沒(méi)有顯示出與hrEGF-rP64k化學(xué)綴合物的特性譜完全一致，這是由于與rP64k相綴合的hrEGF分子的貢獻(xiàn)。在圖2中顯示了在施行經(jīng)超濾純化的疫苗制劑的在還原條件下的變性電泳和Western印跡后獲得的結(jié)果。使用與堿性酸酶相綴合的抗EGF抗體進(jìn)行揭示。EGF是表觀分子量為6kDa的蛋白質(zhì)，所以位于凝膠的下方區(qū)域。在相應(yīng)于表觀分子量大于6kDa的蛋白質(zhì)的區(qū)域處借助于使用抗EGF抗體的免疫檢測(cè)所作出的鑒定確證了，在相應(yīng)于綴合物種類hrEGF-rP64k的凝膠區(qū)域中存在有與rP64k相結(jié)合的hrEGF分子。當(dāng)將未純化的化學(xué)綴合物hrEGF-rP64k的特性譜與由同寡聚綴合物hrEGF-hrEGF而獲得的特性譜相比較時(shí)，可察覺(jué)到在這兩個(gè)特性譜之間存在有對(duì)應(yīng)性。這個(gè)證據(jù)確證了，在谷部之后，存在有相應(yīng)于自身之間綴合的hrEGF種類(hrEGF的聚合物)和游離的hrEGF分子的區(qū)域(圖3)。本發(fā)明的目標(biāo)疫苗制劑的分子排阻色譜法特性譜(參見(jiàn)圖4)顯示，相應(yīng)于綴合物種類hrEGF-rP64k的面積占色譜圖總面積的90%以上(陰影區(qū)域)，這證明了所描述的疫苗組合物的高的均一性。1.2.在本發(fā)明中所描述的疫苗制劑中蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k之間的綴合比率的測(cè)定為了測(cè)定疫苗制劑中hrEGF與rP64k的綴合比率，測(cè)定了每一種構(gòu)成性蛋白質(zhì)的存在的摩爾數(shù)。為此，采用由使用50kDa的超濾膜的純化過(guò)程而獲得的疫苗制劑并收集相應(yīng)于綴合物種類hrEGF-rP64k的色譜法級(jí)分。對(duì)這些級(jí)分進(jìn)行氨基酸分析。通過(guò)兩種方法來(lái)測(cè)定綴合比率。1.—種方法基于疫苗制劑中苯丙氨酸(Phe)和蘇氨酸(Thr)的量的估計(jì)(僅存在于rP64k分子中的氨基酸)。使用這些氨基酸的量來(lái)確定rP64k的量?；谏弦徊讲⒖紤]混合物的氨基酸的總量，即可確定出EGF的量。2.另一種方法基于直接測(cè)定每種蛋白的相對(duì)量，其中使用氨基酸序列并且基于下列氨基酸的定量天冬酰胺+天冬氨酸(Asx)，谷氨酰胺+谷氨酸(Glx)，甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)(對(duì)于酸水解高度穩(wěn)定并且在蛋白質(zhì)定量中普遍使用的殘基)。下面在表1和表2中顯示了通過(guò)每種方法而獲得的結(jié)果。表1:基于測(cè)定苯丙氨酸(Phe)和蘇氨酸(Thr)的量的方法，通過(guò)實(shí)施經(jīng)超濾純化的疫苗制劑的氨基酸組成的確定來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k之間的綴合比率rP64k的平均量hrEGF的平均量綴合的平均比率12.07納摩爾23.13納摩爾1.92表2:基于測(cè)定天冬酰胺+天冬氨酸(Asx)，谷氨酰胺+谷氨酸(Glx)，甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)這些氨基酸的相對(duì)量的方法，通過(guò)實(shí)施經(jīng)超濾純化的疫苗制劑的氨基酸組成的確定來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)hrEGF和rP64k之間的綴合比率蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的量綴合比率rP64k12.04納摩爾2.00hrEGF24.05納摩爾通過(guò)這兩種方法所獲得的結(jié)果顯示出在估計(jì)本發(fā)明中所描述的疫苗制劑的蛋白質(zhì)hrEGF:rP64k之間的綴合比率方面的對(duì)應(yīng)性。計(jì)算出的綴合比率為l:2，這意味著2個(gè)分子的hrEGF/1個(gè)分子的rP64k。1.3.對(duì)于本發(fā)明中所描述的疫苗制劑來(lái)說(shuō)特征性的肽圖譜的解析為了在結(jié)構(gòu)上表征本發(fā)明中所提及的疫苗制劑并證實(shí)獲得該疫苗制劑的可重復(fù)性，形成并表征在用內(nèi)切蛋白酶Glu-C消化綴合物級(jí)分hrEGF-rP64k后獲得的肽圖譜。通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)鑒定所獲得的圖譜中的每一個(gè)級(jí)分并進(jìn)行測(cè)序。圖5顯示了由獨(dú)立地獲得的兩種疫苗制劑而獲得的肽圖譜，其中可以看出在所出現(xiàn)的肽以及相互之間的存在比例方面具有極大的相似性。在由這兩種疫苗制劑獲得的肽圖譜之間的可重復(fù)性是對(duì)于也在本發(fā)明中描述的進(jìn)行化學(xué)綴合和純化程序的條件所存在的控制的指示。通過(guò)使用MALDI法(基質(zhì)輔助激光解吸電離(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization))禾口使用ESI-MS法(電噴霧電離質(zhì)譜法(Electrospraylonization-MassSpectrometry))分析它們中的每一個(gè)而獲得在圖譜的每一級(jí)分中所包含的肽的鑒定。在表3中顯示了主要肽的序列。表3:在用內(nèi)切蛋白酶Glu-C消化EGF-P64k綴合物級(jí)分后獲得的主要肽的氨基酸組成。通過(guò)MALDI和ESI-MS來(lái)測(cè)定所述氨基酸組成。8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>峰肽HG22ARVIPGVAYTSPEGLKVAIVEHG23AAAAPAQEAPKAAAPAPQAAQFGGSADAEYDMGCDAADIGKTIHPHPTLGEPKEPQRYDAVLVAAGRHG24誦IIAVEYDVVVLGHG25AVLVAAGRAPNGKLISAEMGCDAADIGKTIHPHPTLGETGRIIGGGIVGPNGGDMIGEHG26TGRIIGGGIVGPNGGDMIGEVRHLAANGIKYPEPELDHG27TGRIIGGGIVGPNGGDMIGERCQYRDL麗EHG28GGLIVVVEHG29GGLIVVVETGRIIGGGIVGPNGGDMIGEYRFDN頂VNTKTVAVEPKEDHG30AIGDIVGQPMLAHKAVHEAIGDIVGQPMLAHKAVHEHG31ALDKYACNCVVGYIGEALDKYACNCVVGYIGEHG32ARVIPGVAYTSPELDIDMLRAYMDVPAEVAGVVKE10峰肽HG33TGRIIGGGIVGPNGGDMIGEALDKYACNCVVGyIGEGYCLHDGVCMYIERCQYRDL麗EHG34NCAGHKAYFDARVIPGVAYTSPEHG35GANAPKEPQRYDAVLVAAGRAPNGKLISAEHG36GANAPKEPQRYDAVLVAAGRAPNGKLISAENCAGHKAYFDARVIPGVAYTSPEVIDEVRHLAANGIKYPEHG37MGTVYSTLGSRLDVVBHG38IIGGGIIGLEMDVPABVAGVVKEVKNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEHG39VVVLGGGPGGYSAAFAAADEHG40MGTVYSTLGSRLDVVEHG41LKVPDIGGHE誦IIAVEHG42RCQYRDL麗ELHG43VDKQMRTNVPHIYAIGDIVGQPMLAHKAVHEASGRAIANGCDNGFTKLIFDAEHG44VDKQMRTNVPHIYAIGDIVGQPMLAHKAVHEHG47YRFDNMVNTKTVAVEPKEDGVYVTFEAIANGCDNGFTKLIFDAEHG48RYKTLGGVCLNVGCIPSKALLHNAAVIDE11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例2:本發(fā)明中所描述的疫苗制劑的免疫原性在本實(shí)施例中描述了生物學(xué)活性測(cè)定法，其是為了相比于EP0657175中所描述的疫苗制劑(稱為疫苗制劑B)而言來(lái)評(píng)估前面所描述的疫苗制劑(疫苗制劑A)的免疫原性而進(jìn)行的。為了所述分析，用單劑量的200L免疫原(通過(guò)透析而獲得的常規(guī)疫苗制劑，通過(guò)用超濾膜進(jìn)行純化而獲得的疫苗制劑，和由通過(guò)UF/DF的純化過(guò)程而獲得的滲透物，其中存在有綴合物種類hrEGF-hrEGF)的油包水(50/50%v/v)乳劑(具有佐劑MontanideISA51)對(duì)IO只小鼠進(jìn)行接種。關(guān)于每種免疫原所施加的蛋白質(zhì)劑量參見(jiàn)表4。在接種后14天，從動(dòng)物中抽取血清并借助于ELISA來(lái)評(píng)估抗EGF抗體的滴度。該測(cè)定法的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為，在405nm處測(cè)量的光密度必須為關(guān)于平板空白所獲得的平均值的兩倍以上。所述平板空白是當(dāng)向孔中添加封閉緩沖液以代替抗EGF血清樣品時(shí)而獲得的。通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)程序，應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。表4:所評(píng)估的免疫原和待根據(jù)相應(yīng)的生物學(xué)活性測(cè)定法來(lái)接種給動(dòng)物的蛋白質(zhì)的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在圖6中，顯示了生物學(xué)活性測(cè)定法的結(jié)果，其作為每種所評(píng)估的免疫原的免疫原性活性的證據(jù)。相應(yīng)于hrEGF的聚合綴合物和游離的hrEGF的免疫原組分沒(méi)有顯示出相關(guān)的生物學(xué)活性，因?yàn)樗鼈兊膽?yīng)答處于該測(cè)定法的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的水平上或者低于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。這些結(jié)果驗(yàn)證了EGF本身不誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的假說(shuō)。在應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)時(shí)，所有結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見(jiàn)表5)顯示了相對(duì)于由接種了疫苗制劑B的動(dòng)物組所達(dá)到的滴度而言，對(duì)于接種了疫苗制劑A的動(dòng)物組的抗EGF抗體的滴度1/1000(p=0.0004)來(lái)說(shuō)以及對(duì)于滴度1/100(p=0.0006)來(lái)說(shuō)均具有高度顯著的不同。這表明，相比于通過(guò)基于透析膜的純化方法而獲得的疫苗制劑B而言，借助于超濾膜來(lái)純化的疫苗制劑A具有更高的免疫原性活性/毫克蛋白質(zhì)。與使用相應(yīng)于hrEGF的聚合物的綴合物和游離的hrEGF進(jìn)行免疫接種所達(dá)到的相比，疫苗制劑A導(dǎo)致抗EGF抗體的濃度(在1/1000稀釋度處)增加至10倍。與先前在EP0657175中所描述的疫苗制劑相比，本發(fā)明中所描述的疫苗制劑導(dǎo)致抗EGF抗體的濃度增加至兩倍。表5:用于通過(guò)小鼠血清中抗EGF抗體滴度來(lái)評(píng)估所述兩種疫苗制劑的免疫原性的Ma皿-Whitney檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)報(bào)告<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例3:評(píng)估在治療上皮起源的肺腫瘤中本發(fā)明中所描述的疫苗制劑的臨床應(yīng)用的功效本實(shí)施例的目的在于，在患者中評(píng)估相比于由通過(guò)透析純化方法獲得的疫苗制劑B所達(dá)到的免疫原性而言由疫苗制劑A所產(chǎn)生的免疫原性。在該研究中，治療了具有晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤的患者。為了該研究，定義了兩個(gè)組的患者(用疫苗制劑B進(jìn)行疫苗接種的患者，和用本發(fā)明中描述的疫苗制劑A進(jìn)行疫苗接種的患者)。對(duì)于每個(gè)組，每位患者所施加的疫苗制劑的劑量如下用疫苗制劑B進(jìn)行疫苗接種的患者接受1.2mg總蛋白質(zhì)/個(gè)免疫接種位點(diǎn)，用疫苗制劑A進(jìn)行疫苗接種的患者接受0.6mg總蛋白質(zhì)/個(gè)免疫接種位點(diǎn)。對(duì)于這兩組來(lái)說(shuō)，免疫接種位點(diǎn)都是4個(gè)。在開(kāi)始該試驗(yàn)之前至少4周，所有患者接受癌特異性療法。通過(guò)肌內(nèi)途徑來(lái)進(jìn)行免疫接種，并且以每月1次的方式繼續(xù)。通過(guò)獲得血清來(lái)評(píng)估這兩組患者的體液免疫應(yīng)答。結(jié)果的主要評(píng)階變量是針對(duì)EGF的特異性抗體的滴度。該參數(shù)借助于ELISA系統(tǒng)來(lái)測(cè)定。陽(yáng)性值是為陰性對(duì)照值的兩倍的那些光密度讀數(shù)。所報(bào)告的抗體滴度是陽(yáng)性血清的最大稀釋度。表6中所呈現(xiàn)的對(duì)于每組中的患者的免疫應(yīng)答所進(jìn)行的分析證明，在用疫苗制劑A進(jìn)行免疫接種的患者組中最大抗體滴度的幾何平均值為l:56421，而在用疫苗制劑B進(jìn)行免疫接種的患者組中最大抗體滴度的幾何平均值為1:23515。這意味著，與用疫苗制劑B所達(dá)到的滴度相比，本發(fā)明中所描述的疫苗制劑導(dǎo)致最大抗EGF抗體滴度的幾何平均值增加至兩倍。在歷史上，未經(jīng)免疫接種的患者顯示出1:500的抗自身EGF抗體的滴度。因此，相比于在未經(jīng)免疫接種的受試者中的抗EGF抗體滴度而言，本發(fā)明中所描述的疫苗制劑(疫苗制劑A)導(dǎo)致抗EGF抗體滴度增加到至少100倍。表6:通過(guò)患者血清中抗EGF抗體滴度來(lái)測(cè)量的兩種疫苗制劑的免疫原性的幾何平均值的分析結(jié)果患者總數(shù)賄平均值疫苗制劑A1156421疫苗制劑B923515重要的是強(qiáng)調(diào)，用本發(fā)明中所描述的疫苗制劑A進(jìn)行免疫接種的患者組顯示出更優(yōu)異的抗EGF抗體滴度的幾何平均值，因?yàn)槠涿看蚊庖呓臃N所接受的總蛋白量為用疫苗制劑B進(jìn)行免疫接種的患者組所接受的總蛋白量(4.8mg總蛋白質(zhì))的一半(2.4mg)，這構(gòu)成了令人驚訝的結(jié)果。這些結(jié)果證明，過(guò)量的自身蛋白hrEGF(聚合物的形式或者游離的形式)并沒(méi)有給疫苗制劑提供更強(qiáng)的免疫原性，而是減弱了化學(xué)綴合物hrEGF-rP64k的免疫原性作用。實(shí)施例4:調(diào)整至各種不同效價(jià)(總蛋白濃度/瓶)的本發(fā)明中所描述的疫苗制劑的獲得為了證明獲得具有各種不同效價(jià)(總蛋白濃度/瓶)的疫苗制劑的能力，施行了如下面所描述的純化方法試驗(yàn)1:在滲濾結(jié)束時(shí)，濃縮經(jīng)純化的化學(xué)綴合物，直至2mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度。試驗(yàn)2:在滲濾結(jié)束時(shí)，濃縮經(jīng)純化的化學(xué)綴合物，直至5mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度。試驗(yàn)3:在滲濾結(jié)束時(shí)，濃縮經(jīng)純化的化學(xué)綴合物，直至12mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度。在所有試驗(yàn)中，所使用的化學(xué)綴合物的總體積為1500mL，在滲濾過(guò)程中在1.5巴14的跨膜壓力下進(jìn)行操作并且更換7次緩沖液。為了實(shí)施所述評(píng)估，建立了兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)。第一個(gè)是達(dá)到>80%的疫苗制劑的均一性百分比。第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在純化操作過(guò)程中不存在蛋白質(zhì)沉淀物。表7中所呈現(xiàn)的結(jié)果顯示了調(diào)整至各種不同的"蛋白濃度/毫升"的疫苗制劑的獲得，其中保證了高水平的均一性(90.92%、96.79%和95.50%的綴合物種類hrEGF-rP64k)并且沒(méi)有在其中產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀。表7:相應(yīng)于調(diào)整至各種不同的最終蛋白質(zhì)濃度的疫苗制劑的均一性百分比的值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例5:在本發(fā)明中所描述的疫苗制劑之中的戊二醛的去除為了評(píng)估綴合劑(戊二醛)的去除情況，借助于使用C-8柱的反相色譜分離方法(HPLC-RP)來(lái)對(duì)疫苗制劑B中和疫苗制劑A中殘留的戊二醛的含量進(jìn)行定量。該方法首先需要用高氯酸來(lái)使樣品中所包含的蛋白質(zhì)沉淀，而后與苯肼反應(yīng)。圖7顯示了，在所述兩種疫苗制劑中所存在的這種雜質(zhì)的殘留量小于0.2ug/mL或小于0.002ppm(為這種雜質(zhì)而設(shè)定的上限濃度)，而最初的深度為530mg/mL或530ppm。即使當(dāng)所述兩種制劑都符合為這種雜質(zhì)而設(shè)定的規(guī)范時(shí)，圖7也圖解說(shuō)明了，由應(yīng)用通過(guò)超濾膜來(lái)進(jìn)行的化學(xué)綴合物的純化方法而獲得的疫苗制劑A具有較低的戊二醛含量，這為使用所述疫苗制劑的患者提供了極高的安全性。附圖簡(jiǎn)述圖1:顯示了同寡聚綴合物rP64k-rP64k的色譜圖與未經(jīng)純化的化學(xué)綴合物EGF-P64k的色譜圖的疊置。圈中所顯示的是這兩張色譜圖之間特性譜的重合部分。X軸表示樣品中的每種組分的洗脫時(shí)間，和Y軸表示樣品中的每種組分在216nm處的強(qiáng)度值，作為樣品中蛋白質(zhì)濃度的指示。圖2:在對(duì)通過(guò)超濾獲得的疫苗制劑進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離之后，用與堿性磷酸酶相綴合的抗EGF抗體進(jìn)行的免疫檢測(cè)。泳道1:分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物；泳道2:疫苗制劑。圖3:顯示了相應(yīng)于同寡聚綴合物hrEGF-hrEGF的色譜圖與未經(jīng)純化的化學(xué)綴合物hrEGF-rP64k的色譜圖的疊置。圈中所顯示的是這兩張色譜圖之間種類的重合部分。X軸表示樣品中的每種組分的洗脫時(shí)間，和Y軸表示樣品中的每種組分在216nm處的強(qiáng)度值，作為樣品中蛋白質(zhì)濃度的指示。圖4:相應(yīng)于本發(fā)明中所描述的疫苗制劑的色譜法特性譜。陰影區(qū)域相應(yīng)于綴合物種類hrEGF-rP64k。X軸表示每種級(jí)分的洗脫時(shí)間，和Y軸表示樣品中的每種組分在216nm處的強(qiáng)度值，作為樣品中蛋白質(zhì)濃度的指示。圖5:相應(yīng)于hrEGF-rP64k綴合物的色譜法級(jí)分的肽圖譜。呈現(xiàn)了對(duì)于兩種獨(dú)立地通過(guò)超濾膜來(lái)純化的疫苗制劑而獲得的結(jié)果。X軸表示時(shí)間，和Y軸表示毫強(qiáng)度單位。圖6:在用不同的免疫原進(jìn)行免疫接種的小鼠中的抗EGF抗體滴度常規(guī)疫苗制劑、通過(guò)超濾進(jìn)行純化的疫苗制劑和源自疫苗制劑的超濾純化方法的滲透物。X軸相應(yīng)于從每種動(dòng)物獲得的血清的稀釋度，和Y軸表示每個(gè)樣品的在405nm處的光密度值，作為樣品中蛋白質(zhì)濃度的指示。圖7:關(guān)于由使用50kDa超濾膜的純化方法而獲得的疫苗制劑(疫苗制劑A)和關(guān)于采用通過(guò)透析膜的純化方法而獲得的疫苗制劑(疫苗制劑B)，在殘留的戊二醛含量的定量過(guò)程中獲得的HPLC-RP色譜法特性譜。權(quán)利要求其活性成分包括hrEGF-rP64k蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其特征在于，每個(gè)rP64K蛋白分子連接至兩個(gè)hrEGF分子。2.根據(jù)權(quán)利要求l的疫苗組合物，其特征在于，所述hrEGF-rP64k蛋白質(zhì)綴合物以12.04納摩爾rP64k蛋白/24.05納摩爾hrEGF的比例。3.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于，所述組合物是hrEGF-rP64k的均質(zhì)混合物，其不含諸如hrEGF聚合物或游離的hrEGF的分子種類。4.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于，所述hrEGF-rP64k的均質(zhì)混合物不含戊二醛。5.根據(jù)權(quán)利要求l的疫苗組合物，其特征在于，另外還包含合適的佐劑，所述佐劑選自氫氧化鋁或Montanide。6.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其特征在于，包含Montanide作為佐劑。7.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其特征在于，包含氫氧化鋁作為佐劑。8.根據(jù)權(quán)利要求l的疫苗組合物，其特征在于，其引起在經(jīng)免疫接種的哺乳動(dòng)物的血清中抗EGF抗體的滴度增加到至少10倍。9.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于，其引起在人血清中抗EGF抗體的滴度增加到至少10倍。10.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其特征在于，其引起在人血清中抗EGF抗體的滴度增加到至少100倍。11.用于以符合衛(wèi)生的方式獲得權(quán)利要求l的疫苗組合物的方法，其特征在于，包括用于將EGF與載體蛋白rP64k共價(jià)綴合的適宜的程序，以及使用超濾膜來(lái)進(jìn)行純化以去除在生物學(xué)上無(wú)活性的綴合物種類和其他化學(xué)雜質(zhì)。12.根據(jù)權(quán)利要求11的用于獲得疫苗組合物的方法，其特征在于，所述綴合反應(yīng)開(kāi)始于在綴合反應(yīng)器中混合事先經(jīng)濃縮的hrEGF蛋白(>6mg/mL)和rP64k蛋白(>lmg/mL)，向所述蛋白質(zhì)混合物中添加PBS/MgCl2溶液(pH6.8-7.2)和0.5%戊二醛的綴合溶液，最后使所述混合物于22°C士2t:的溫度下在連續(xù)攪拌下維持2小時(shí)。13.根據(jù)權(quán)利要求12的用于獲得疫苗組合物的方法，其特征在于，蛋白質(zhì)hrEGF與rP64k之間的綴合條件確保了每rP64k分子與兩個(gè)hrEGF分子進(jìn)行綴合反應(yīng)。14.根據(jù)權(quán)利要求ll的用于獲得疫苗組合物的方法，其特征在于，共價(jià)綴合反應(yīng)產(chǎn)物的純化步驟通過(guò)超濾/滲濾方法來(lái)進(jìn)行，所述超濾/滲濾方法使用處于50至100kDa的范圍內(nèi)的膜。15.根據(jù)權(quán)利要求14的用于獲得疫苗組合物的方法，其特征在于，化學(xué)綴合反應(yīng)產(chǎn)物的純化步驟通過(guò)超濾/滲濾方法來(lái)進(jìn)行，所述超濾/滲濾方法使用50kDa的膜。16.根據(jù)權(quán)利要求14的用于獲得疫苗組合物的方法，其特征在于，化學(xué)綴合反應(yīng)產(chǎn)物的純化步驟通過(guò)超濾/滲濾方法來(lái)進(jìn)行，所述超濾/滲濾方法使用100kDa的膜。17.其活性成分為hrEGF-rP64k蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求15的方法進(jìn)行純化。18.其活性成分為hrEGF-rP64k蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求16的方法進(jìn)行純化。19.活性成分為hrEGF-rP64k蛋白質(zhì)綴合物的疫苗組合物，其特征在于，將疫苗制劑的最終的總蛋白濃度調(diào)整在l-12mg/mL的范圍內(nèi)。20.權(quán)利要求17的疫苗組合物的用途，所述用途為用于制備對(duì)于引發(fā)針對(duì)人EGF的免疫應(yīng)答來(lái)說(shuō)有用的試劑。21.權(quán)利要求18的疫苗組合物的用途，所述用途為用于制備對(duì)于引發(fā)針對(duì)人EGF的免疫應(yīng)答來(lái)說(shuō)有用的試劑。22.權(quán)利要求17的疫苗組合物的用途，所述用途為用于制備在治療上皮起源的腫瘤中有用的試劑。23.權(quán)利要求18的疫苗組合物的用途，所述用途為用于制備在治療上皮起源的腫瘤中有用的試劑。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更特別地涉及人類健康。具體地，本發(fā)明描述了用于在癌癥患者中進(jìn)行治療使用的疫苗組合物。本發(fā)明中所描述的疫苗組合物具有作為活性成分的人重組表皮生長(zhǎng)因子(hrEGF)和重組P64K蛋白之間的化學(xué)綴合物。此外，還描述了用于實(shí)施綴合反應(yīng)的特定條件，所述綴合反應(yīng)使得能夠以受控的且可重復(fù)的方式獲得所述化學(xué)綴合物。在其他方面，本發(fā)明涉及用于純化所述化學(xué)綴合物的方法，所述化學(xué)綴合物不僅提供了更高的用于治療性疫苗組合物的純度，并且驚人地增加了免疫原性活性，從而引起人體中抗EGF抗體滴度的顯著增加。另外，本發(fā)明提供了用于獲得具有超過(guò)一種類型的劑量(EGF-P64K綴合物的總毫克數(shù)/瓶)呈遞的疫苗制劑的方法。疫苗制劑呈遞的多面性允許增加每個(gè)患者的免疫接種劑量，而不增加免疫接種的頻率和/或免疫接種位點(diǎn)的數(shù)目。最后，本發(fā)明涉及用于獲得通過(guò)腸胃外途徑施用的用于治療癌癥的疫苗制劑的符合衛(wèi)生的方法。文檔編號(hào)A61K39/385GK101790383SQ200880021856公開(kāi)日2010年7月28日申請(qǐng)日期2008年6月26日優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日發(fā)明者A·B·拉格達(dá)維拉,A·庫(kù)瓦斯菲亞羅,A·阿爾比薩諾瓦,E·奇科維利茲,G·M·岡扎雷茲馬丁內(nèi)羅,G·M·羅德里格茲馬丁內(nèi)茲,L·卡爾沃岡扎雷茲,L·維納羅德里格茲,T·克羅姆貝特拉莫斯申請(qǐng)人:分子免疫中心