專利名稱：可水解的聚合fmoc-連接體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可水解連接體的制備，該連接體與至少一個(gè)半合成聚合物結(jié)合。這些可水解 的連接體適用于延長蛋白質(zhì)和多肽藥物的體內(nèi)循環(huán)。
背景技術(shù)：
大多數(shù)蛋白質(zhì)或多肽藥物在體內(nèi)是短壽命的并且通常具有較短的循環(huán)半衰期?？紤]到蛋 白質(zhì)或多肽藥物不能口服吸收，故治療性活性藥物在循環(huán)中的長期保持是具有明顯臨床意義 的優(yōu)選特征。
用于提高蛋白質(zhì)或多肽藥物的臨床性能的有吸引力的策略是用聚合物比如聚亞烷基氧化 物(Roberts等，Advan Drug Rev. 54， 459-476 (2002))或多糖比如聚唾液酸(Fernandes等， BiochimBiophys Acta 1341， 26-34 (1997))、葡聚糖或羥烷基淀粉修飾藥物。(將說明書 中引用的所有文獻(xiàn)引入本文以作參考)。
目前已知的有用聚(乙二醇)(PEG)修飾。然而，用PEG修飾蛋白質(zhì)通常導(dǎo)致蛋白質(zhì) 活性的降低。
聚唾液酸(PSA)，又稱多聚乙酸神經(jīng)氨酸(colominicacid， CA)，是天然存在的多糖。 其是N-乙酰神經(jīng)氨酸與a (2—8)酮苷鍵的均聚物并且在其非還原端處包含鄰二醇基。PSA 帶負(fù)電荷，并且是人體的天然組成物。由細(xì)菌可容易地大量制備具有預(yù)定物理特性的PSA(US 5,846,951)。由于與人體中的聚唾液酸具有化學(xué)上以及免疫學(xué)上的一致性，故即使與蛋白質(zhì) 偶聯(lián)時(shí)，細(xì)菌的聚唾液酸也是非免疫原性的。與其他聚合物(比如PEG)不同，聚唾液酸是 可生物降解的。
8然而，迄今為止，還沒有可商業(yè)使用的包含結(jié)合了酸性單糖例如PSA的多肽的治療性化 合物。
僅具有l(wèi)-4個(gè)唾液酸單元的較短PSA聚合鏈也已被合成(Kang等，ChemCommun， 227-228 (2000) ; Ress等，Current Organic Synthesis 1， 31-46 (2004))。 幾種包含PEG部分的可水解的或可生物降解的連接體也已被建議。 US 6,515, IOQ描述了具有較弱的、水解不穩(wěn)定的鍵的PEG以及相關(guān)的聚合物衍生物。 US 7，122，189描述了基于二-N-2-羥乙基甘氨酸基(N-二 (羥乙基)甘氨酸)的可釋放 的PEG連接體。
WO 04/089280和WQ 06/138572描述了可水解芴基PEG結(jié)構(gòu)。
在將這些連接體與蛋白質(zhì)藥物結(jié)合之后，可將蛋白質(zhì)-聚合物結(jié)合物作為前體藥物，并且 蛋白質(zhì)的活性可經(jīng)由可控的釋放機(jī)制由結(jié)合物中釋放出來。使用該原理，可獲得藥物動(dòng)力學(xué) 性能得到改善的藥物(趙等，Bioconjugate Chem. 17， 341-351 (2006))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可水解的連接體，該連接體與至少一個(gè)半合成生物聚合物結(jié)合， 其中該可水解的連接體被結(jié)合到蛋白質(zhì)或多肽藥物上以提高其體內(nèi)性能比如體內(nèi)循環(huán)。
本發(fā)明提供了一種通式1的化合物
(通式1)
其中Z為離去基團(tuán)，并且位置l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8中的至少一個(gè)與自由基Y結(jié)合。 Y是包含半合成生物聚合物的自由基，其與N-琥珀酰亞胺部分結(jié)合。
9除了與自由基Y結(jié)合之外，通式l的化合物在可用位置l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8中的 至少一個(gè)處可選地與自由基X結(jié)合。 X為-S。3-R3。
R3選自于由氫、(CVCs)-烷基和(d-C8)-垸基-R4構(gòu)成的組。 R"為聚合物。


圖1所示為FVIIa-PSA結(jié)合物在pH 8.3處的體外水解。FVIIa活性的釋放用Staclot分析 (Diagnostica Stago公司，Asni6res,法國)領(lǐng)!l定。
圖2所示為FVIIa-三聚物PSA結(jié)合物在pH 8.3處的體外水解。FVIIa活性的釋放用Staclot 分析(DiagnosticaStago公司，Asni^res,法國)測定。
圖3所示為用凝血分析(Staclot， Diagnostica Stago公司，Asnidres,法國)測定的血漿中 的FVIIa活性(圖中SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差)。至于FVIIa凝血活性，調(diào)整劑量的曲線下面積(AUC)， 對于未修飾的rFVIIa為0.014，對于rFVIIa-結(jié)合物則增加到0.015 (0為無窮大)。最終半衰 期從2.3小時(shí)增加到4.4小時(shí)，并且平均滯留時(shí)間(MRT)從1.4小時(shí)增加到2.4小時(shí)。
圖4所示為通過ELISA用多克隆的抗人FVII抗體測定FVIIa抗原。對于抗原，調(diào)整劑 量的AUC，從0.010 (未修飾的rFVIIa)增加到0.014 (rFVIIa-結(jié)合物)(0為無窮大)，最 終半衰期從1.4小時(shí)增加到2.3小時(shí)，并且MRT從1.5小時(shí)增加到2.2小時(shí)。
圖5所示為用凝血分析(Staclot， DiagnosticaStago公司，Asnidres,法國)測定的血漿中 的FVIIa活性。與天然rFVIIa (_△-)相比，rFVIIa-三聚物-PSA結(jié)合物(-O-)的藥物動(dòng)力 學(xué)性能得到提高。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種可水解的連接體，該連接體與至少一個(gè)半合成生物聚合物結(jié)合， 其中該可水解的連接體能夠被進(jìn)一步結(jié)合到蛋白質(zhì)或多肽藥物上，以提高它們的體內(nèi)性 能比如體內(nèi)循環(huán)。蛋白質(zhì)或多肽藥物的活性可經(jīng)由受控的釋放機(jī)制而由結(jié)合物中釋放出來。
下述段落對構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的化合物的各種化學(xué)部分進(jìn)行了一般的定義，并且除非以其 他方式明確進(jìn)行的定義提供了更寬的定義，否則在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中均一致地使用"(d-C8)-垸基"是指具有l(wèi)-8個(gè)碳原子的一價(jià)垸基。其例子包括比如甲基、乙基、丙基、 丁基、己基等基團(tuán)。直鏈烷基和支鏈烷基被包括。
"離去基團(tuán)"是指能與形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)或多肽藥物上的親核基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)。其例 子包括比如N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑、鹵化物、N-羥基苯鄰二甲酰亞胺、對硝基
苯氧基、咪唑基、噻唑烷基硫酮、o-?；宓幕鶊F(tuán)或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他合適的
離去基團(tuán)。于是，為了本發(fā)明的目的，蛋白質(zhì)或多肽藥物包含一個(gè)以上用于置換的基團(tuán)，比 如胺。蛋白質(zhì)或多肽藥物是血漿蛋白質(zhì)或凝血因子比如FVin、 VWF、 FVIIa以及FIX。
"半合成生物聚合物"是指基于天然存在的聚合物而制造的有機(jī)聚合物。半合成生物聚 合物也可通過反應(yīng)基團(tuán)被功能化，以使這些功能化的半合成生物聚合物結(jié)合到其他化合物上。 "半合成生物聚合物"的例子包括直鏈聚合物或支鏈聚合物比如碳水化合物，特別地比如是 多糖。多糖的例子為PSA (聚唾液酸)和HAS (羥垸基淀粉)。
"可水解的"連接體是指其中蛋白質(zhì)以天然形式被釋放的連接體系。蛋白質(zhì)被釋放并且 連接體完全分離。用于可水解的同義詞為"可降解的"或"可釋放的"連接體。 本發(fā)明提供了一種根據(jù)通式1的化合物
通式1)
其中Z為離去基團(tuán)，并且位置l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8中的至少一個(gè)與自由基Y結(jié)合。 Y是包含半合成生物聚合物的自由基，其與N-琥珀酰亞胺部分結(jié)合。 除了與自由基Y結(jié)合之外，通式l的化合物在可用位置l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8中的 至少一個(gè)處可選地與自由基X結(jié)合。 X為-S03-R3。
11基和(d-C8)-烷基-R4構(gòu)成的組。 R"為聚合物。其例子為親水性聚合物比如聚(乙二醇)(PEG)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種根據(jù)通式1的化合物，其中Z為N-琥珀酰亞胺酯，
并且位置l、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8中的至少一個(gè)與自由基Y結(jié)合，其中Y為
其中POLYMER為半合成生物聚合物，優(yōu)選具有1,000 Da至300,000 Da的分子量。 在一個(gè)實(shí)施方式中，分子量為5,000-25,000，優(yōu)選為5,000-10，000。
在另一實(shí)施方式中，所述半合成生物聚合物為碳水化合物，優(yōu)選為多糖，該多糖優(yōu)選包 括至少3個(gè)單元的單糖。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多糖包括2-200個(gè)單元、優(yōu)選10-100個(gè)單元的單糖。 在一個(gè)實(shí)施方式中，半合成生物聚合物為PSA衍生物。
在另一實(shí)施方式中，半合成生物聚合物經(jīng)由硫醚鍵被結(jié)合到琥珀酰亞胺部分上。 R1在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為(CVQ)-烷基。
在一個(gè)實(shí)施方式中，R!在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自于由甲基、乙基、丙基、丁基和己基構(gòu) 成的組。
R2獨(dú)立地選自于由-C(O)NR-、 -C(0)NR-(C廣C8)-烷基-NR-、 -NRC(O)-和-NRC(O)-(C,-Q)-垸基-NR構(gòu)成的組，其中R獨(dú)立地為氫或(Q-C8)-烷基。 在一個(gè)實(shí)施方式中，R2為-C(0)NH-。 在另一實(shí)施方式中，R2為-NHC(0)-。
在一個(gè)實(shí)施方式中，通式l的化合物在位置l、 2、 3或4中的至少一個(gè)處與自由基Y結(jié)合。
在另一實(shí)施方式中，通式l的化合物在位置l、 2、 3或4中的至少一個(gè)處與自由基Y結(jié) 合，并在位置5、 6、 7或8中的至少一個(gè)處進(jìn)一步與自由基X結(jié)合。
在另一實(shí)施方式中，通式1的化合物在位置2或3中的至少一個(gè)處與至少一個(gè)自由基Y 結(jié)合，并在位置7或8中的至少一個(gè)處進(jìn)一步與自由基X結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，通式l的化合物在位置2和7處與自由基Y結(jié)合。 在另一實(shí)施方式中，通式1的化合物在位置2和7處分別與自由基Y和自由基X結(jié)合。 在另一實(shí)施方式中，通式1的化合物為
13<formula>formula see original document page 14</formula><formula>formula see original document page 15</formula>在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)通式1的化合物的制備。
Tsubery等(J Biol Chem.279， 38118-38124 (2004))描述了基于Fmoc (9-芴基-甲氧基羰基)部分的用于蛋白質(zhì)衍生物的可水解PEG連接體的合成。MAL-FMS-OSU (9-羥甲基-2-(氨基-3-馬來酰亞胺-丙酸酯)-7-硫代芴-N-羥基琥珀酰亞胺碳酸酯)的合成被描述。如下的合成方案作為例子說明了由MAL-FMS-OSU衍生物開始制備根據(jù)通式1的化合物的合成步驟。
(通式2)
其中POLYMER為半合成生物聚合物；R！在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為(C,-Cs)-垸基；
R2獨(dú)立地選自于由-C(O)NR-、 -C(0)NR-(C廣C8)-烷基-NR-、 -NRC(0)-和-NRC(0)-(d-C8)-烷基-NR構(gòu)成的組，其中R獨(dú)立地為氫或(d-C8)-垸基。
R獨(dú)立地為氫或(C,-C8)-烷基；
16X為-S。3-R3;
R3獨(dú)立地選自于由氫、(C!-Q)-烷基和(d-C8)-烷基-R4構(gòu)成的組;R"為聚合物；
n為選自于O、 1、 2、 3或4的整數(shù)；以及
m為選自于l、 2、 3或4的整數(shù)。
HS-POLYMER為硫醇衍生的半合成生物聚合物，比如
或者
PSA—SH 。
通式2的化合物可容易地與包含一個(gè)以上用于置換的基團(tuán)比如胺的蛋白質(zhì)或多肽藥物反應(yīng)。優(yōu)選蛋白質(zhì)或多肽藥物為凝血因子比如FVIII、 VWF、 FVIIa、 FIX。
根據(jù)上述方案修飾的蛋白質(zhì)和多肽藥物具有明顯提高的體內(nèi)循環(huán)。連接體的可水解性允許通過釋放天然形式的蛋白質(zhì)而使活性在水解后被恢復(fù)。其例子如圖1和2所示。蛋白質(zhì)結(jié)合物的生物活性的恢復(fù)如圖3和4所示。
本發(fā)明通過如下實(shí)施例被說明，但本發(fā)明并不限于此。實(shí)施例1
包含末端SH基團(tuán)的PSA的制備。
聚唾液酸(Sigma)用Nal04氧化(Fernandes等，Biochim BiophysActa 1341,26-34(1997))，并且末端醛基被形成。然后如WO 05/016973所述，用NH4C1進(jìn)行還原性胺化步驟，并且用NaCNBH3還原希夫堿，以形成包含末端氨基的PSA-NH2。隨后，根據(jù)制造商的指導(dǎo)手冊進(jìn)行與2-亞氨基硫羥垸(2-iminothi。lane) (Pierce 26101)的反應(yīng)，以制備包含末端SH基團(tuán)的改性PSA。使用Ellmans試劑確定產(chǎn)生的SH基團(tuán)的摩爾含量。此外，使用同樣的步驟在N-乙?；窠?jīng)氨酸三聚物(由TimTec (LLC公司，內(nèi)瓦克，美國)獲得)中引入SH基團(tuán)。實(shí)施例2:
使用MAL-FMS-OSU連接體的rFVIIa與PSA的結(jié)合
向15 ml的50mM磷酸緩沖液、pH 7.2中rFVIIa (0.7 mg/ml)的溶液中添加雙功能連接體MAL-FMS-OSU (按照Tsubery等(J Biol Chem.279， 38118-38124 (2004))所述的方法制備)(濃度0.5mg/mg蛋白質(zhì))，并在室溫下保溫30分鐘。然后根據(jù)實(shí)施例1，制備包含末端SH基團(tuán)的衍生的PSA。將PSA衍生物添加到混合物中(濃度10 mg PSA-SH/mg蛋白質(zhì))，并另外保溫2小時(shí)。然后，通過添加0.1M甘氨酸(最終濃度IO mM)和5 mM半胱氨酸(最終濃度O. 5mM)的水溶液來停止反應(yīng)。使用QHyperD F 5(Him樹脂(BioS印ra)和PharmaciaXK-10柱(Pharmacia XK 10;高度h=10 cm)，通過離子交換色譜法從rFVIIa-PSA結(jié)合物中分離出游離試劑。將包含PSA-rFVIIa的溶液加載到柱子上，隨后用10 CV平衡緩沖液(20 mM檸檬酸鈉，20mMNaCl， pH6.5)洗滌柱子。然后用洗脫緩沖液(20 mM檸檬酸鈉，500mMNaCl，pH 6.1)洗脫聚唾液酸化的rFVIIa。洗脫液包含0. 06 mg/ml蛋白質(zhì)，通過間苯二酚測定(Sve騰rholm; Biochim Biophys Acta 24: 604-11 (1957))證實(shí)結(jié)合物中結(jié)合了 PSA。為了釋放結(jié)合物中的rFVIIa的活性，將450 |il洗脫液添加到50 ^ 1MTRIS緩沖液(pH 8.3)中，并測定FVIIa活性的釋放(Staclot， Diagnostics Stago公司，Asn化res,法國)。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3:
使用MAL-FMS-OSU連接體的rFVIIa與三聚物PSA的結(jié)合
向15 ml的50mM磷酸緩沖液、pH 7.2中rFVIIa (0.7 mg/ml)的溶液中添加雙功能連接體MAL-FMS-OSU (按照Tsubery等(J Biol Chem.279， 38118-38124 (2004))所述的方法制備)(濃度0.07mg/mg蛋白質(zhì))，并在室溫下保溫30分鐘。然后按照實(shí)施例1所述的方法衍生得到三聚物PSA (TimTec, I丄C公司，內(nèi)瓦克，美國)，以引入游離的SH基團(tuán)。將三聚物PSA-SH衍生物添加到混合物中(濃度0.43 mg三聚物PSA-SH/mg蛋白質(zhì))并另外保溫2小時(shí)。然后通過添加0.1 M甘氨酸(最終濃度10 mM)和5 mM半胱氨酸(最終濃度0. 5 mM)的水溶液來停止反應(yīng)。使用QHyperD F 50|nm樹脂(BioS印ra)和Pharmacia XK-10柱(PharmaciaXK 10;高度h40 cm),通過離子交換色譜法從rFVIIa-PSA結(jié)合物中分離出游離試劑。將包含PSA-rFVIIa的溶液加載到柱子上，隨后用10 CV平衡緩沖液(20 mM檸檬酸鈉，20 mM NaCl ，pH 6.5)洗滌柱子。然后用洗脫緩沖液(20 mM檸檬酸鈉，500 mM NaCl， pH 6. 1)洗脫聚唾液酸化的rFVIIa。洗脫液包含0.06 mg/ml蛋白質(zhì)，通過間苯二酚測定(Svennerholm等；Biochim Biophys Acta 24: 604-11 (1957))證實(shí)結(jié)合物中結(jié)合了 PSA。為了釋放結(jié)合物中的rFVIIa的活性，將450 (il洗脫液添加到50 ^ 1M TRIS緩沖液(pH 8.3)中并測定FVIIa活性的釋放(Staclot， Diagnostics Stago公司，Asni6res,法國)。結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例4:
使用MAL-FMS-OSU連接體的人血清白蛋白與PSA的結(jié)合在25mM醋酸鈉緩沖液、pH6.2中，將人血清白蛋白(HSA)與雙功能連接體MAL-FMS-OSU (按照Tsubery等(J Biol Chem.279， 38118-38124 (2004))所述的方法制備)一起保溫l小時(shí)。然后使用Sephadex Cj-25 (GE-Healthcare公司)，用相同的緩沖體系通過凝膠過濾分離過量的連接體。包含蛋白質(zhì)的部分被收集，并且添加PSA-SH (根據(jù)實(shí)施例l制備)?；旌衔镌谑覝叵卤?小時(shí)。然后使用DEAE-Sepharose FF (GE Healthcare公司)，通過離子交換色譜法提純結(jié)合物。用25mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)洗脫蛋白質(zhì)-PSA結(jié)合物。使用IOK濾膜，通過超濾法匯集并濃縮包含結(jié)合物的部分。然后，溶液在25mM醋酸鈉緩沖液(pH6.2)中進(jìn)行滲濾。實(shí)施例5:
普通大鼠中的rFVIIa-PSA結(jié)合物的藥物動(dòng)力學(xué)
使用蛋白質(zhì)濃度為0.05 mg/mg的MAL-FMS-OSU，根據(jù)實(shí)施例2制備rFVIIa-PSA結(jié)合物。對8個(gè)普通大鼠(4個(gè)公的，4個(gè)母的)進(jìn)行麻醉，并通過靜脈注射將緩沖液(1.3 g/L雙甘氨酸，3g/L氯化鈉，30g/L甘露醇，1.5g/LCaCl2X2H20， 0. 1 g/L Tween 80， pH5.5)中的rFVIIa-PSA-結(jié)合物以10ml/kg的體積劑量(1200嗎蛋白質(zhì)/kg)注入尾部靜脈中。劑量為1200 ng蛋白質(zhì)/kg的未修飾rFVIIa用作8個(gè)普通大鼠(4個(gè)公的，4個(gè)母的)中的對照物。在注入上述物質(zhì)后5分鐘、l小時(shí)、2、 4、 7、 10和24小時(shí)，從尾部動(dòng)脈中抽取血樣，并且制備和冰凍含枸櫞酸鹽的血漿用于進(jìn)一步的分析。
血漿中的FVIIa活性用凝血分析(Staclot， Diagnostics Stago公司，Asni6res,法國)測定，F(xiàn)VII抗原用ELISA (多克隆的抗人FVII抗體)確定。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的評估。至于FVIIa凝血活性，調(diào)整劑量的曲線下面積(AUC)對未修飾的rFVIIa為0.014，對rFVIIa-結(jié)合物則增加到0.015(0為無窮大)。最終半衰期從2.3小時(shí)增加到4.4小時(shí)，并且平均滯留時(shí)間(MRT)從1.4小時(shí)增加到2.4小時(shí)。對于抗原，調(diào)整劑量的AUC從0.010 (未修飾的rFVIIa)增加到0.014 (rFVIIa-結(jié)合物)(0為無窮大)，最終半衰期從1.4小時(shí)增加到2.3小時(shí)，并且MRT從1.5小時(shí)增加到2.2小時(shí)。所用的計(jì)算利用統(tǒng)計(jì)學(xué)程序(程序R:用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算的語言和環(huán)境，F(xiàn)oundation for Statistical Computing,維也納，奧地利，ISBN 3-900051-07-0， URLhttp:〃www.R-OToiect.org)進(jìn)行。藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖3和4所示。
實(shí)施例6:
普通大鼠中的rFVIIa-三聚物-PSA-結(jié)合物的藥物動(dòng)力學(xué)
使用蛋白質(zhì)濃度為0.05 mg/mg的MAL-FMS-OSU，根據(jù)實(shí)施例3制備rFVIIa-三聚物-PSA
結(jié)合物。對6個(gè)普通大鼠(3個(gè)公的，3個(gè)母的)進(jìn)行麻醉，并通過靜脈注射將緩沖液(1.3 g/L雙甘氨酸，3g/L氯化鈉，30g/L甘露醇，1.5g/LCaCl2X2H20， 0.1 g/L Tween 80， pH 5.5)中的rFVIIa-三聚物-PSA結(jié)合物以10 ml/kg的體積劑量(1200嗎蛋白質(zhì)/kg)注入尾部靜脈中。劑量為1200ng蛋白質(zhì)/kg的未修飾rFVIIa用作6個(gè)普通大鼠(3個(gè)公的，3個(gè)母的)中的對照物。在注入上述物質(zhì)后5分鐘、l小時(shí)、2、 4、 7、 10和24小時(shí)，從尾部動(dòng)脈中抽取血樣，并且制備和冰凍含枸櫞酸鹽的血漿用于進(jìn)一步的分析。
血漿中的FVIIa活性用凝血分析(Staclot， Diagnostics Stago公司，Asnidres,法國)測定，并且繪制消除曲線。rFVIIa-三聚物-PSA結(jié)合物的改善的藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例7:
使用MAL-FMS-OSU連接體的rFIX與PSA的結(jié)合
向0.6 ml的20 mM Hepes緩沖液、pH 7.4中重組體FIX (8 mg/ml)溶液中添加雙功能連
接體MAL-FMS-OSU (按照Tsubery等(J Biol Chem.279， 38118-38124 (2004))所述的方法
制備)(濃度0.07mg/mg蛋白質(zhì))，并在室溫下保溫30分鐘。然后根據(jù)實(shí)施例1制備包含
末端SH基團(tuán)的衍生的PSA。將PSA衍生物添加到混合物中(濃度32 mg PSA-SH/mg蛋白
質(zhì)一過量100倍摩爾)，并在室溫下另外保溫2小時(shí)。然后通過添加0.1M甘氨酸(最終濃度
10 mM)和5 niM半胱氨酸(最終濃度0.5 mM)的水溶液來停止反應(yīng)。使用預(yù)先裝有丁基瓊脂
糖的柱子(HiTrap Butyl FF 5 ml， GE Healthcare公司)，通過疏水作用色譜法從rFIX-PSA
結(jié)合物中分離出游離試劑。將包含5M NaCl的緩沖液(50 mM H印es緩沖液，5M NaCl， 0.01
% Tween 80， 6.7 mM CaCl2， pH 6.9)添加到包含PSA-rFIX的溶液中，以獲得3M NaCl的最
終濃度。將混合物加載到柱子上，隨后用IOCV平衡緩沖液(50mMH印es緩沖液，3MNaCl，
0. 01%Tween80， 6. 7 mM CaCl2, pH 6. 9)洗滌柱子，并用50mM的包含6. 7 mM CaCl2的Hepes
緩沖液(pH 7.4)進(jìn)行rFIX-PSA結(jié)合物的洗脫。在洗脫結(jié)合物后，將pH調(diào)整到pH 6.9。通
過BCA分析測定洗脫液包含0.24 mg/ml蛋白質(zhì)，通過間苯二酚測定(Sv匿rholni; Biochim
Bi叩hys Acta 24: 604-611 (1957))證實(shí)結(jié)合物中結(jié)合了 PSA。在最后的步驟中，在20 mM
H印es、 50mMNaCl、 lmMCaCl2、 pH6. 9中，使用30 kD濾膜(再生纖維素/Milliporc公司)，
通過超濾法/滲濾法(UF/DF)，將洗脫液濃縮10倍。
實(shí)施例8:
使用MAL-FMS-OSU連接體的rFVIII與PSA的結(jié)合
為了制備rFVIII-PSA結(jié)合物，向6 ml的20 mM Hepes緩沖液、pH 7.4中重組體FVIIK4.5
mg/ml)(來自Advate制造工藝)溶液中添加雙功能連接體MAL-FMS-OSU (按照Tsubery等
(JBiolChem.279， 38118-38124 (2004))所述的方法制備)(濃度:0.315 mg/mg蛋白質(zhì))，
20并在室溫下保溫30分鐘。然后根據(jù)實(shí)施例1制備包含末端SH基團(tuán)的衍生的PSA。將PSA 衍生物添加到混合物中(濃度27.8 mg PSA-SH/mg蛋白質(zhì)一過量450倍摩爾)，并在室溫下 另外保溫2小時(shí)。然后通過添加Q.1M甘氨酸(最終濃度IO mM)和5 mM半胱氨酸(最終濃 度0.5 mM)的水溶液來停止反應(yīng)。使用預(yù)先裝有丁基瓊脂糖的柱子(HiTrap Butyl FF 5 ml， GE Healthcare公司)，通過疏水作用色譜法從rFVIII-PSA結(jié)合物中分離出游離試劑。將包 含5MNaCl的緩沖液(50mMH印es緩沖液，5MNaCl， 0.01% Tween80， 6. 7 mM CaCl2, pH 6. 9 ) 添加到包含PSA-rFVIII的溶液中以獲得3MNaCl的最終濃度。將該混合物加載到柱子上，隨 后用IOCV平衡緩沖液(50mMH印es緩沖液，3MNaCl， 0. l%Tween80， 5 mM CaCl2， pH 6. 9) 洗滌柱子，并用檸檬酸緩沖液(pH 7.4， 13.6 mM檸檬酸鈉，20 mM CaCl2， 20mM組氨酸， 0.01% Tween 80)進(jìn)行rFVIII-PSA結(jié)合物的洗脫。在洗脫結(jié)合物后，將pH調(diào)整到pH 6.9。 洗脫液包含2. 5 mg/ml蛋白質(zhì)(BCA測定)。
權(quán)利要求
1.一種通式1的化合物(通式1)其中Z為離去基團(tuán)，位置1、2、3、4、5、6、7或8中的至少一個(gè)與自由基Y結(jié)合；Y是包含半合成生物聚合物的自由基，其與N-琥珀酰亞胺部分結(jié)合；可用位置1、2、3、4、5、6、7或8中的至少一個(gè)可選地與自由基X結(jié)合；X為-SO3-R3；R3獨(dú)立地選自于由氫、(C1-C8)-烷基和(C1-C8)-烷基-R4構(gòu)成的組；以及R4為聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，Z為N-琥珀酰亞胺酯；Y為<formula>formula see original document page 2</formula>其中POLYMER為半合成生物聚合物；R,在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為(d-C8)-烷基；以及R2獨(dú)立地選自于由-C(O)NR-、 -C(0)NR-(C廣C8)-烷基-NR-、 -NRC(O)-和-NRC(O)-(C廣Q)-烷基-NR構(gòu)成的組；其中R獨(dú)立地為氫或(CVC8)-垸基。
3. 如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，R2為-C(0)NR-或-NRC(0)-，其中R獨(dú)立地為氫或(d-C8)-垸基。
4. 如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，所述POLYMER經(jīng)由硫醚鍵被結(jié)合。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，所述半合成生物聚合物為碳?xì)?化合物。
6. 如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，所述半合成生物聚合物為多糖。
7. 如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，所述多糖為聚唾液酸(PSA)。
8. 如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，所述多糖包括至少3個(gè)單元的單糖。
9. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物選自于由I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII、 IX、 X和XI構(gòu)成的組 <formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>
10. —種用于制備如權(quán)利要求1所述的化合物的工藝，所述工藝包括使中間化合物發(fā)生 偶聯(lián)反應(yīng)的步驟其中POLYMER為半合成生物聚合物； R,在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為(C!-C8)-烷基；R2獨(dú)立地選自于由-C(O)NR-、 -C(0)NR-(C1-C8)-烷基-NR-、 -NRC(0)-和-NRC(OHC廣C8)-烷基-NR構(gòu)成的組，其中R獨(dú)立地為氫或(CVC8)-垸基； X為-SOrR3;R3獨(dú)立地選自于由氫、(C,-C8)-烷基和(d-C8)-垸基-R4構(gòu)成的組； 114為聚合物；n為選自于0、 1、 2、 3或4的整數(shù)；以及 m為選自于1、 2、 3或4的整數(shù)。
11. 如權(quán)利要求8所述的工藝，其特征在于，HS-POLYMER為；<formula>formula see original document page 6</formula>
12. 如權(quán)利要求9所述的工藝，其特征在于，R2為-C(0)NR-或-NRC(0)-，其中R獨(dú)立地 為氫或(d-Q)-垸基。
13. 如權(quán)利要求10所述的工藝，其特征在于，所述化合物被結(jié)合到包含一個(gè)以上用于置 換的基團(tuán)的蛋白質(zhì)或多肽藥物上。
14. 一種結(jié)合物，包括如權(quán)利要求l-7中任一項(xiàng)所述的化合物和蛋白質(zhì)或多肽藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于Fmoc(9-芴基-甲氧羰基)的聚合結(jié)合物。這些結(jié)合物適用于延長蛋白質(zhì)和多肽藥物的體內(nèi)循環(huán)。
文檔編號A61K47/48GK101687048SQ200880021877
公開日2010年3月31日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日
發(fā)明者于爾根·西克曼, 皮特·圖雷切克 申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司