專利名稱：用于調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的RNA拮抗劑化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其靶向細(xì)胞中的β-聯(lián)蛋白mRNA，導(dǎo)致β-聯(lián) 蛋白的表達(dá)減少。聯(lián)蛋白表達(dá)的減少有利于一系列醫(yī)學(xué)疾病，如過度增生性疾病 (hyperproliferative disease)，包括癌癥。本發(fā)明提供了包含寡聚物的治療組合物和和 使用所述寡聚物調(diào)節(jié)β _聯(lián)蛋白的表達(dá)的方法，包括治療方法。
背景技術(shù)：
聯(lián)蛋白(也稱為鈣黏著蛋白-相關(guān)蛋白和β-聯(lián)蛋白)為聯(lián)蛋白家族胞質(zhì)蛋 白的成員，且為Wnt蛋白引發(fā)的信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵參與者，該Wnt蛋白為多個發(fā)展過程的 介體。聯(lián)蛋白由于生長因子刺激經(jīng)歷磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞粘附的減少。已顯示聯(lián)蛋白在癌癥發(fā)展中的作用通過APC(結(jié)腸腺瘤性息肉病)基因的表達(dá)產(chǎn)物而調(diào)節(jié)。該APC腫瘤抑制蛋白質(zhì)與β-聯(lián)蛋白結(jié)合，而β-聯(lián)蛋白顯示與Tcf和Lef 轉(zhuǎn)錄因子相互作用。Morin等人報道了 APC蛋白質(zhì)下調(diào)(down-regulates)結(jié)腸癌中β-聯(lián) 蛋白和Tcf-4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。其結(jié)果表明聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)對APC的腫瘤抑制作用是關(guān) 鍵的，且該調(diào)節(jié)可伴隨APC或聯(lián)蛋白中的突變。多個研究報道了在多種癌細(xì)胞株中檢 測聯(lián)蛋白突變，且在黑素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)異常高的量的聯(lián)蛋白。Morin等人顯示影響磷酸化位點的β -聯(lián)蛋白的突變使得細(xì)胞對APC-介導(dǎo)的 β _聯(lián)蛋白的下調(diào)不敏感，且該破壞的機(jī)理對結(jié)腸直腸腫瘤發(fā)生是關(guān)鍵的(Morin等人， Science,1997，275，1787-1790)。Bennett等人的美國專利號6，066，500描述了調(diào)節(jié)β -聯(lián)蛋白的表達(dá)的反義化合 物、組合物和方法?？紤]到聯(lián)蛋白在癌癥發(fā)展中的效果，仍然需要能夠有效抑制聯(lián)蛋白功能 的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供長度為10-50個核堿基的寡聚物，其包含總共為10-50個核堿基的連 續(xù)(contiguous)核堿基序列，其中所述連續(xù)核堿基序列與編碼哺乳動物β-聯(lián)蛋白的核酸 的對應(yīng)區(qū)至少80%同源。本發(fā)明提供長度為10-50個核堿基的寡聚物，其包含總共為10-50個核堿基的連 續(xù)核堿基序列，其中所述連續(xù)核堿基序列與選自SEQ ID NO 173和SEQ ID NOs 174-193的 核酸序列的對應(yīng)區(qū)至少80%同源。本發(fā)明提供長度為10-50個核堿基的寡聚物，其包含總共為10-50個核堿基的連 續(xù)核堿基序列，其中所述連續(xù)核堿基序列與選自SEQ ID No 1-132的核酸序列的對應(yīng)區(qū)至 少80%同源。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含根據(jù)本發(fā)明的寡聚物的綴合物，如以下綴合物，其除了包 含寡聚物的核堿基序列外還包含至少一個共價連接至本發(fā)明的寡聚物的非核苷酸(即非核堿基)或非多核苷酸部分。該非核苷酸或非多核苷酸部分可由以下組成或包含以下固醇基團(tuán)如膽固醇，或促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞的其它部分。本發(fā)明提供包含根據(jù)本發(fā)明的寡聚物的綴合物，如以下綴合物，其除了包含寡聚 物的核堿基序列外還包含含帶正電部分的聚合綴合物，如聚乙二醇(PEG)-即根據(jù)本發(fā)明 的寡聚物可任選被聚乙二醇化。本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的寡聚物或所限定的綴合物，和藥學(xué)可接 受的稀釋劑、載體、鹽或佐劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)本發(fā)明的寡聚物，其用于醫(yī)藥。本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的寡聚物在制備用于治療本文涉及的一種或多種疾病 的藥物中的用途，如選自以下的疾病過度增生性疾病如本文涉及的那些，如癌癥。本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)本發(fā)明的寡聚物，其用于治療本文涉及的一種或多種疾 病，如癌癥。本文還提供包含本發(fā)明的寡聚物或綴合物的藥物和其它組合物。進(jìn)一步提供了下 調(diào)細(xì)胞或組織內(nèi)聯(lián)蛋白的表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織，體外或體內(nèi)，與本發(fā) 明的一種或多種寡聚物、綴合物或組合物接觸。同樣公開的為治療疑似具有或易患有與聯(lián)蛋白的表達(dá)或過度表達(dá)相關(guān)的疾 病或癥狀的動物或人的方法，該方法通過向所述動物或人給藥治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明 的一種或多種寡聚物、綴合物或組合物。而且，本文提供了使用寡聚物抑制聯(lián)蛋白的表達(dá)的方法，和治療與聯(lián)蛋白 的活性相關(guān)的疾病的方法。本發(fā)明提供治療疾病或病癥，如本文涉及的那些，如過度增生性疾病如癌癥的方 法，所述方法包括向需要的患者給藥本發(fā)明的寡聚物、綴合物或藥物組合物。本發(fā)明提供抑制或減少細(xì)胞或組織中聯(lián)蛋白的表達(dá)的方法，該方法包括使所 述細(xì)胞或組織與本發(fā)明的寡聚物、綴合物或藥物組合物接觸的步驟以使β “聯(lián)蛋白的表達(dá) 被抑制或減少。本發(fā)明提供引起細(xì)胞(如癌細(xì)胞)凋亡的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織 與本發(fā)明的寡聚物、綴合物或藥物組合物接觸的步驟以使聯(lián)蛋白的表達(dá)被抑制或減少 和/或引起凋亡。本發(fā)明進(jìn)一步提供寡聚物，其包含以下連續(xù)核堿基序列或由以下連續(xù)核堿基序列 組成該連續(xù)核堿基序列與對應(yīng)于選自SEQ ID NOs 1-132和SEQID NOs 174-193的序列 (如選自SEQ ID NO 189，192，58和103的序列)的區(qū)域至少80%同源。本發(fā)明進(jìn)一步提供寡聚物，其包含以下連續(xù)核堿基序列或由以下連續(xù)核堿基序列 組成該連續(xù)核堿基序列對應(yīng)于選自SEQ ID NO 174-193的序列(如SEQ ID NO 189或192) 中存在的等效序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供寡聚物，其包含以下序列或由以下序列組成選自SEQ ID NO 133-174的序列，如SEQ ID NO 168或171，或該寡聚物包含以下序列或由以下序列組成對 應(yīng)于所述序列的連續(xù)核堿基序列。相關(guān)案件以下相關(guān)申請在此引入作為參考US 60/915, 371和US 61/023, 244。
附圖簡述

圖1 分別對應(yīng)于寡核苷酸序列 SEQ ID NOs :1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、73、88、103和118的β -聯(lián)蛋白靶序列用粗體和下劃線表示，表明它們 在β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的位置(Genbank登記號NM_001904-SEQ ID N0:173)。圖2 轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞24小時后標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的β -聯(lián)蛋白表達(dá)。圖3 通過蛋白質(zhì)印跡測量用1和5ηΜ濃度的寡核苷酸轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞中β -聯(lián) 蛋白蛋白質(zhì)的含量。微管蛋白染色用作負(fù)載對照(loading control)且SEQ ID N0:194用 作亂序?qū)φ?scrambled control)寡核苷酸。圖4 使用MTS測試在25nM濃度的寡核苷酸轉(zhuǎn)染的HCTl 16細(xì)胞中測量細(xì)胞增殖， 其在轉(zhuǎn)染后在不同時間點測量0D490。模擬品(mock)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和用SEQ ID N0:194(亂 序?qū)φ?轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對照。圖5 用3x25mg/kg寡核苷酸靜脈內(nèi)治療后通過QPCR測量的相對于鹽水治療對照 的小鼠肝中β-聯(lián)蛋白mRNA表達(dá)。β-聯(lián)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH且結(jié)果相對鹽水治療的 對照繪圖。發(fā)明詳述寡聚物本發(fā)明使用寡聚化合物(本文稱為寡聚物)調(diào)節(jié)編碼哺乳動物聯(lián)蛋白的核酸 分子的功能，如SEQ ID NO 173中顯示的β-聯(lián)蛋白核酸，和天然存在的該編碼哺乳動物 β-聯(lián)蛋白的核酸分子的等位變體(allelic variants) 0本發(fā)明中的術(shù)語“寡聚物”是指共價連接兩個或多個核堿基(即寡核苷酸)形成的 分子。在此，各個單一核堿基也可稱為單體或單元。該寡聚物由以下序列組成或包含以下序 列長度為10-50個核堿基的連續(xù)核堿基序列。寡聚物可由以下組成天然核苷酸單元，例 如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)，或核酸類似物，或其本文涉及的混合物，優(yōu)選包 括鎖核酸(LNA)。因此其包括由天然存在的核堿基、糖和核堿基間連接組成的寡聚物，還包 括具有非天然存在的核堿基的寡聚物，所述非天然存在的核堿基起類似作用或具有特別改 善的功能。完全或部分修飾的或取代的寡聚物通常優(yōu)于天然形式，因為該寡聚物具有多種 需要的特性，如穿透細(xì)胞膜的能力、對細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)核酸酶良好的抵抗性和對核酸 靶的高親和力和特異性?？紤]到上述特性，例如，特別優(yōu)選LNA類似物。因此，在一個特別優(yōu) 選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由核苷酸和核苷酸類似物單元(如LNA單元)構(gòu)成， 或由不同類核苷酸類似物單元的構(gòu)成，以形成10-50，優(yōu)選10-25個核堿基，更優(yōu)選10-16個 核堿基，且還更優(yōu)選12-16個核堿基的寡核苷酸。在多種實施方案中，本發(fā)明的寡聚物不包含RNA(單元)。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的化合物為鏈狀分子或合成為鏈狀分子。該寡聚物為單鏈分子，且優(yōu)選不包含例如，至少3，4或5 個連續(xù)核堿基的短區(qū)，該短區(qū)與相同寡聚物內(nèi)的等效區(qū)(即雙鏈體)互補(bǔ)-在這點上，該 寡聚物不為(實質(zhì)上)雙鏈的。在多個實施方案中，該寡聚物實質(zhì)上不為雙鏈的，如不為 siRNA。該寡聚物包含連續(xù)核堿基序列或由連續(xù)核堿基序列組成。在多個實施方案中，本發(fā) 明的寡聚物可整個由連續(xù)核堿基區(qū)組成。在多個實施方案中，寡聚物的核堿基序列由連續(xù) 核堿基序列組成。革巴
本文使用的術(shù)語“靶核酸”是指編碼哺乳動物聯(lián)蛋白多肽，如人聯(lián)蛋白DNA，如SEQ ID NO 173。編碼β -聯(lián)蛋白的核酸或其天然存在的變體，和從其衍生的RNA核 酸，優(yōu)選mRNA，如前mRNA，優(yōu)選成熟mRNA。在多種實施方案中，例如當(dāng)在研究或診斷中使用 時，“靶核酸”可為cDNA或從上述DNA或RNA核酸靶衍生的合成寡核苷酸。本發(fā)明的寡聚物 優(yōu)選能與靶核酸雜交。在多種實施方案中，術(shù)語“靶核酸”可為例如，登記號為X89579，X89593，X89592， X89591, X89588, X89585, X89584和X89578的人基因外顯子)，或哺乳動物β -聯(lián)蛋白mRNA 如SEQ ID NO 173。其它哺乳動物β -聯(lián)蛋白mRNA的實例包括，但不限于，以下登記號的 那些ΝΜ_001098209，ΝΜ_0010987210 (人 β -聯(lián)蛋白 mRNA) ；NM_007614 (小鼠 β -聯(lián)蛋白 mRNA) ；NM_053357(大鼠 β-聯(lián)蛋白 mRNA) ；NM-001122762，DQ267491 (馬 β-聯(lián)蛋白 mRNA)； NM_214367 (豬 β -聯(lián)蛋白 mRNA) ；BCl 19949，BT030683 (牛 β -聯(lián)蛋白 mRNA)。當(dāng)然應(yīng)認(rèn)識 到上述登記號是指cDNA序列而不是mRNA序列本身-當(dāng)然成熟mRNA序列可直接從cDNA序 列衍生-胸腺嘧啶(T)殘基被尿嘧啶(U)殘基替換。如本文所述，“雜交”是指氫鍵合，其可為互補(bǔ)核苷酸/核堿基間的Watson-Crick， Hoogsteen，反向Hoogsteen氫鍵合等。在大約50年以前Watson和Crick顯示脫氧核糖核 酸(DNA)由兩個鏈組成，這兩個鏈通過在兩個鏈中相對的互補(bǔ)核堿基間形成的氫鍵而一起 保持為螺旋構(gòu)型。在DNA中常見的4個核堿基為鳥嘌呤(G)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶⑴和 胞嘧啶(C)，其中G核堿基與C配對，且A核堿基與T配對。在RNA中核堿基胸腺嘧啶被核 堿基尿嘧啶(U)代替，該核堿基尿嘧啶(U)類似于T核堿基與A成對。核堿基中參與標(biāo)準(zhǔn) 雙鏈體形成的化學(xué)基團(tuán)構(gòu)成Watson-Crick面。Hoogsteen在幾年后顯示嘌呤核堿基(G和 A)除了它們的Watson-Crick面還具有可從雙鏈體外辨別的Hoogsteen面，且用于通過氫鍵 合結(jié)合嘧啶寡核苷酸，從而形成三螺旋結(jié)構(gòu)。尤其優(yōu)選本發(fā)明的化合物能與靶核酸雜交，如mRNA。合適地，本發(fā)明的寡聚物或綴合物能抑制如下調(diào)聯(lián)蛋白基因的表達(dá)。在多種 實施方案中，本發(fā)明的寡聚物與靶核酸結(jié)合，且相對正常表達(dá)水平抑制至少10 %或20 %的 表達(dá)，更優(yōu)選相對正常表達(dá)水平至少30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %或95 %抑制。 在一些實施方案中，當(dāng)使用1至25ηΜ本發(fā)明的寡聚物或綴合物時觀察到該調(diào)節(jié)。在相同或 不同實施方案中，表達(dá)的抑制少于100%，如少于98%抑制，少于95%抑制，少于90%抑制， 少于80%抑制，如少于70%抑制。表達(dá)水平的調(diào)節(jié)通過測定蛋白質(zhì)水平而確定，例如通過 以下方法，如SDS-PAGE，然后使用針對靶蛋白質(zhì)產(chǎn)生的合適抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡?；蛘弑?達(dá)水平的調(diào)節(jié)，如抑制，可通過測量mRNA水平而確定，例如通過RNA印跡法或定量RT-PCR。 當(dāng)使用合適劑量如1至25nM通過mRNA水平測量時，抑制或下調(diào)的水平在多種實施方案中 通常達(dá)到?jīng)]有本發(fā)明的化合物時的正常水平的10-20%的水平。因此本發(fā)明提供下調(diào)或抑制β-聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)和/或mRNA在表達(dá)β-聯(lián)蛋白蛋 白質(zhì)和/或mRNA的細(xì)胞中表達(dá)的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞給藥本發(fā)明的寡聚物或綴 合物以下調(diào)或抑制β-聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)和/或mRNA在所述細(xì)胞中的表達(dá)。適合地該細(xì)胞為 哺乳動物細(xì)胞如人細(xì)胞。在多種實施方案中，給藥可發(fā)生于體外。在多種實施方案中，給藥 可發(fā)生于體內(nèi)。本文使用的術(shù)語“靶核酸”是指編碼哺乳動物聯(lián)蛋白多肽，如人聯(lián)蛋白的DNA，如SEQ ID NO :173。編碼β -聯(lián)蛋白的核酸或其天然存在的變體，和從其衍生的RNA核酸，優(yōu)選mRNA，如前mRNA，優(yōu)選成熟mRNA。在多種實施方案中，例如當(dāng)在研究或診斷中使用 時，“靶核酸”可為cDNA或從上述DNA或RNA核酸靶衍生的合成寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的寡 聚物優(yōu)選能與靶核酸雜交。術(shù)語“其天然存在的變體”是指β -聯(lián)蛋白多肽或核酸序列的變體，其天然存在于 限定的分類群中，如哺乳動物，如小鼠、猴，且優(yōu)選人。通常，當(dāng)涉及多核苷酸的“天然存在的 變體”時，該術(shù)語還可包括任何編碼β "聯(lián)蛋白的基因組DNA (其通過染色體易位或復(fù)制存 在于染色體Chr 3 41. 22-41. 26Mb)和RNA (如其衍生的mRNA)的等位變體。當(dāng)涉及具體多 肽序列時，例如，該術(shù)語還包括天然存在形式的蛋白質(zhì)，因此其可進(jìn)行加工，例如通過共翻 譯_或翻譯后修飾，如信號肽裂解、蛋白酶剪切、糖基化等。術(shù)語〃至少一個(種)"包括大于或等于1的整數(shù)，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10， 11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 等。在多種實施方案中，如當(dāng)涉及本發(fā)明化合物的核酸或蛋白質(zhì)靶時，術(shù)語"至少一 個(種)〃包括術(shù)語"至少兩個(種)"和"至少三個(種)"和"至少四個(種)"，類 似的術(shù)語"至少兩個(種)“可包括術(shù)語"至少三個(種)“和“至少四個(種)〃。序列本發(fā)明的寡聚物可靶向人β -聯(lián)蛋白mRNA，因此它們包含以下序列或由以下序列 組成對應(yīng)于SEQ ID NO 173中存在的核苷酸序列的連續(xù)核堿基序列，或選自SEQ ID NOS 1-132的序列，其中所述寡聚物(或其連續(xù)核堿基部分)可任選包含1個、2個或3個相對于 所述選擇的序列的錯配。在多種實施方案中，該寡核苷酸序列包含以下序列或由以下序列 組成10-16個(連續(xù))核堿基的序列。包含16個核堿基的寡核苷酸序列的實例示于SEQ IDNOS :1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118。較短的序 列可從它們衍生。較長的序列可包括所有、或至少10個源自各SEQ ID NO的核堿基。
本發(fā)明進(jìn)一步提供β-聯(lián)蛋白基因中的靶序列，特別是對應(yīng)于(即它們的反向補(bǔ) 體(reverse complement)) SEQ ID NOs 1-132的那些，其中對應(yīng)于所述靶序列的反義寡核 苷酸(寡聚物)能下調(diào)β-聯(lián)蛋白。例如，分別對應(yīng)于反義寡核苷酸序列SEQ ID NOs :1、16、 17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103和 118 的靶序列示于圖 1 (粗體 且有下劃線，且對應(yīng)上述寡SEQ ID NOs)。本發(fā)明的寡聚物可適當(dāng)?shù)匕韵滦蛄谢蛴梢韵陆M成或衍生自以下序列(如包 含所述SEQ ID中的對應(yīng)的連續(xù)核堿基序列)，選自SEQ ID NOS 174-193的序列。優(yōu)選地， 該序列包括10-16個核堿基的序列。包含16個核堿基的序列的實例示于選自SEQ ID NOS 1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118 的 SEQ ID。因此 具有較少核堿基(如10，11，12，13，14或15個)的序列可具有以下連續(xù)核堿基序列，其對 應(yīng)于子序列，例如至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14或15個SEQ ID NOS :1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118 中的連續(xù)核 堿基。因此，較短的序列可從它們衍生。較長的序列可包括所有、或至少10個源自示例的SEQ ID NOs的核堿基。通常如果僅有部分寡核苷酸的序列存在于選自SEQ ID NOS 1,16, 17，18，33，34，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，73，88，103 和 118 的 SEQ ID 中，則剩余部 分的寡核苷酸序列與位于所述SEQ ID側(cè)翼的對應(yīng)核苷酸同源。兩個感興趣的序列基序為 SEQ ID NO 58 和 SEQ IDNO 103。還公開了本發(fā)明的寡聚物的具體設(shè)計，例如示于SEQ ID NOS 133-152的那些，特 別是 SEQ ID NOs :133，134，135，136，138，141，148，149，150，151 和 152。還公開了 LNA 寡核 苷酸的具體設(shè)計，例如示于SEQ ID NOS :153-172的那些，特別是SEQ ID NOS 153，154，155， 156，158，161，168，169，170，171和172。在優(yōu)選實施方案中，認(rèn)為本發(fā)明的寡聚物為β-聯(lián) 蛋白mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的有效抑制劑。在某些實施方案中，該寡聚物可包含以下連續(xù)核堿基序列或由以下連續(xù)核堿基序 列組成該連續(xù)核堿基序列與編碼哺乳動物聯(lián)蛋白的核酸的等效區(qū)完全互補(bǔ)(完美互 補(bǔ))。然而，在一些實施方案中，當(dāng)寡聚物與靶序列雜交至且還足以與靶結(jié)合以顯示所 需作用(即下調(diào)靶)時，該寡聚物可包括1，2，3，或4(或更多)個錯配。錯配可通過，例如， 增加寡聚物核堿基序列的長度和/或增加核堿基序列中存在的核苷酸類似物(如LNA)的 數(shù)量而補(bǔ)償。在多種實施方案中，該連續(xù)核堿基序列包含不超過3個，例如不超過2個相對于靶 序列的錯配，如相對于編碼哺乳動物β “聯(lián)蛋白的核酸的對應(yīng)區(qū)的錯配。在多種實施方案中，該連續(xù)核堿基序列包含不超過1個相對于靶序列(如編碼哺 乳動物β-聯(lián)蛋白的核酸的對應(yīng)區(qū))的錯配。本發(fā)明的寡聚物的核堿基序列或該連續(xù)核堿基序列優(yōu)選與選自SEQ IDNOS :1_132 的對應(yīng)序列至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，同源，如100%同源(相同)。本發(fā)明的寡聚物的核堿基序列或該連續(xù)核堿基序列優(yōu)選與SEQ ID Ν0:173中存在 的對應(yīng)序列至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，同源，如100%同源(相同)。本發(fā)明的寡聚物的核堿基序列或該連續(xù)核堿基序列優(yōu)選與SEQ ID Ν0:173中存 在的子序列至少80%互補(bǔ)，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94 %，至少95 %，至少96 %互補(bǔ)，至少97 %，至少98 %，至少99 %，如100 %互補(bǔ)(完美互 補(bǔ))。在多種實施方案中，該寡聚物(或其連續(xù)核堿基部分)選自，或包含，選自SEQ ID NOS :1-132或SEQ ID NOS 174-193的序列之一，或其至少10個連續(xù)核堿基的子序列，其中 所述寡聚物(或其連續(xù)核堿基部分)可任選包含1個、2個或3個相對于所述選擇的序列的 錯配。在多種實施方案中，該子序列可由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28或29個連續(xù)核堿基組成，如10-15，12-25，12-22，如12-18個核堿基。合 適地，在多種實施方案中，該子序列的長度與本發(fā)明寡聚物的連續(xù)核堿基序列的長度相同。然而，認(rèn)識到在多種實施方案中寡聚物的核堿基序列可包含附加的5’或3’核堿 基，如，獨立地，1，2，3，4或5個附加的核堿基5’和/或3’，它們不與靶序列互補(bǔ)。多種實施方案中，在這方面，本發(fā)明的寡聚物在可包含在5’和或3’側(cè)翼有附加的核堿基的連續(xù)核 堿基序列。在多種實施方案中，連續(xù)核堿基序列的3’端的側(cè)翼為1，2或3個DNA或RNA單 元。在固態(tài)合成寡聚物過程中經(jīng)常使用3’DNA單元。在多種實施方案中，其可相同或不同， 連續(xù)核堿基序列的5’端的側(cè)翼為1，2或3個DNA或RNA單元。在多種實施方案中，附加的 5’或3’核堿基為天然存在的核苷酸，如DNA或RNA。在多種實施方案中，附加的5’或3’ 核堿基可表示本文的缺口聚物(gapmer)寡聚物涉及的D區(qū)。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO 1的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO 16的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO: 17的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO 18的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :33的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :34的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :49的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :50的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO 51的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :52的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :53的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :54的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :55的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :56的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :57的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :58的核堿基序列或其子序列。 在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù)SEQ ID NO :73的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO :88的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO 103的核堿基序列或其子序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由以下序列組成或包含以下序列根據(jù) SEQ ID NO 118的核堿基序列或其子序列。當(dāng)確定本發(fā)明的寡聚物(或連續(xù)核堿基序列)和編碼哺乳動物β _聯(lián)蛋白(如本 文公開的那些)的核酸之間的“同源性”或“互補(bǔ)性”時，同源性可用本發(fā)明化合物的對應(yīng)核 堿基序列和編碼哺乳動物聯(lián)蛋白的核酸(或靶核酸)的對應(yīng)區(qū)或其補(bǔ)體通過簡單比對 (alignment)而確定，且同源性通過計數(shù)對齊(align)的堿基數(shù)并除以本發(fā)明的化合物(寡 聚物)中的連續(xù)核堿基的總數(shù)，再乘以100而確定。在該比較中，如果存在缺口(gaps)，優(yōu) 選該缺口僅為錯配而不是下述區(qū)域，其中缺口內(nèi)核堿基數(shù)在本發(fā)明的核堿基序列和靶核酸 之間不同。氨基酸和多核苷酸同源性可使用ClustalW算法使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置確定參見httD:// www, ebi. ac. uk/emboss/aliRn/index, html, Tffe EMBOSS /jC (局部)Gap Open(缺口 產(chǎn)生)=10.0，Gap extend(缺口延伸)=0· 5，使用Blosum 62 (蛋白質(zhì))，或用于核苷酸 /核堿基序列的DNAful 1。該比對也可用于從人和不同哺乳動物種類(如猴、小鼠和/或大 鼠)識別編碼聯(lián)蛋白的核酸的區(qū)，在該區(qū)有足夠的長度核酸互補(bǔ)性，以允許設(shè)計靶向人 β-聯(lián)蛋白靶核酸和不同哺乳動物種類中存在的對應(yīng)核酸的寡核苷酸，如由以下區(qū)域組成 或包含以下區(qū)的寡聚物至少10，如至少12，如至少14，如至少16，如至少18，如11，12，13， 14，15，16，17或18個連續(xù)核堿基的區(qū)域，該連續(xù)核堿基與編碼人β _聯(lián)蛋白的核酸和編碼 不同哺乳動物種類聯(lián)蛋白的核酸的等效區(qū)100%互補(bǔ)。在多種實施方案中，本發(fā)明的寡聚物包含以下連續(xù)核堿基序列或由以下連續(xù)核 堿基序列組成該連續(xù)核堿基序列與編碼人聯(lián)蛋白的核酸和編碼不同哺乳動物種類 β-聯(lián)蛋白的核酸(如編碼小鼠β-聯(lián)蛋白的核酸)的對應(yīng)區(qū)至少80%，如至少85%，如 至少90%，如至少95%，如至少98%，如至少99%，或100%同源-(即與人和小鼠序列的 等效區(qū)80% -100%互補(bǔ))。優(yōu)選寡聚物的連續(xù)核堿基序列與人β _聯(lián)蛋白mRNA的等效區(qū) 100%互補(bǔ)。術(shù)語"對應(yīng)于"和"相應(yīng)于"是指寡聚物的核堿基序列或連續(xù)核堿基序列與等 效核苷酸序列的比較，該等效核苷酸序列為i)核酸靶的反向補(bǔ)體，如編碼β-聯(lián)蛋白蛋白 質(zhì)的mRNA，如SEQ ID NO 173，和/或ii)本文提供的核苷酸的序列，如選自SEQ ID NOS 1-132或SEQ ID Nos 174-193。核苷酸類似物直接與它們的等效或?qū)?yīng)核苷酸比較。術(shù)語"對應(yīng)核苷酸類似物"和"對應(yīng)核苷酸"是指核苷酸類似物和天然存在的核苷酸中的核堿基是相同的。例如，當(dāng)核苷酸的2-脫氧核糖單元連接至腺嘌呤時，該"對 應(yīng)核苷酸類似物"包含連接至腺嘌呤的戊糖單元(不同于2-脫氧核糖)。長度該寡聚物包含以下序列或由以下序列組成總共為10-50個核堿基，如10，11，12， 13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 個連續(xù)核堿基長度的連續(xù)核堿基序列。在多種實施方案中，該寡聚物包含以下序列或由以下序列組成總共為10-25，10-24，12-25，12-24，或 10-22，如 12-18，如 13-17 或 12-16，如 13，14，15，16 個連續(xù)核堿基 長度的連續(xù)核堿基序列。在多種實施方案中，該寡聚物包含以下序列或由以下序列組成總共為10，11， 12，13，或14個連續(xù)核堿基長度的連續(xù)核堿基序列。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物由不超過22個核堿基組成，如不超過20 個核堿基，如不超過18個核堿基，如15，16或17個核堿基。在多種實施方案中，本發(fā)明的寡聚物包含少于20個核堿基。核苷酸和核苷酸類似物本文所用的術(shù)語“核苷酸”是指包含糖部分、堿基部分和共價連接的磷酸基的糖苷，且包括天然存在的核苷酸，如DNA或RNA，優(yōu)選DNA。包含修飾的糖和/或堿基部分的非天然存在的核苷酸在此稱為“核苷酸類似物”。術(shù)語“核堿基”用于包括天然(DNA-或 RNA-型)核苷酸以及核苷酸類似物。非天然存在的核苷酸包括具有修飾的糖部分的核苷酸，如雙環(huán)核苷酸或2’修飾的 核苷酸，如2’取代的核苷酸。“核苷酸類似物”為通過在糖和/或堿基部分修飾而得到的天然核苷酸，如DNA或 RNA核苷酸的變體。在寡核苷酸的情況下類似物可以原則上僅僅“沉默(silent)”或“等效 (equivalent)，，于天然核苷酸，即對于寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的作用方式?jīng)]有功能上的 影響。如果例如，它們更容易制備或制備更廉價，或?qū)Υ婊蛑苽錀l件更穩(wěn)定，或表示標(biāo)簽 或標(biāo)記，這種“等效”類似物還是可以使用的。然而，優(yōu)選地，該類似物將對寡聚物抑制表達(dá) 的作用方式有功能上的影響；例如通過產(chǎn)生增加的對靶的結(jié)合親和力和/或增加的對細(xì)胞 內(nèi)核酸酶的抗性和/或更方便性地轉(zhuǎn)運至細(xì)胞。術(shù)語“核堿基”是用作集合術(shù)語，其包括核苷酸和核苷酸類似物兩者。核堿基序列 是包括至少兩個核苷酸或核苷酸類似物的序列。在多種實施方案中，該核堿基序列可僅包 括核苷酸，如DNA單元，在另一實施方案中，該核堿基序列可僅包括核苷酸類似物，如LNA單 元，或在多種實施方案中，該核堿基序列可包含核苷酸和核苷酸類似物單元兩者。術(shù)語"核酸"定義為通過共價連接兩個或更多個核苷酸形成的分子。本文中術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"可互換使用。核堿基的“堿基部分”包括天然存在的以及非天然存在的核堿基的堿基。因此，該 堿基部分不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，而且還包括雜環(huán)類似物及其互變異構(gòu)體。該堿基部分的實例包括，但不限于腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷嘧啶、尿 嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶(isocytosine)、假異胞嘧啶 (pseudoisocytosine)、5_溴尿嘧啶、5_丙炔基尿嘧啶、6_氨基嘌呤、2_氨基嘌呤、肌苷、二 氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在多種實施方案中，寡聚物中存在的至少一個核堿基包括修飾的堿基，如選自 5_甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基 嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。核苷/核苷酸類似物的具體實例描述于例如Freier & Altmann ；Nucl. AcidRes.，1997，25，4429-4443 禾口 Uhlmann ;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2), 293-213，和示例 1
示例 1因此該寡聚物可包含以下序列或由以下序列組成天然存在的核苷酸的簡單序 列-優(yōu)選2’ -脫氧核苷酸(在此通常稱為“DNA”)，但也可能為核糖核苷酸(在此通常稱 為“RNA”)，或該天然存在的核苷酸和一種或多種非天然存在的核苷酸，即核苷酸類似物的 組合。該核苷酸類似物可適當(dāng)?shù)卦鰪?qiáng)寡聚物對靶序列的親和力。合適和優(yōu)選的核苷酸類似物的實例描述于W02007/031091，在此引入作為參考，或 在其中參考。核苷酸的一個優(yōu)選修飾包括其中糖部分被修飾以提供2’-取代基或產(chǎn)生橋接 的(鎖核酸-LNA)結(jié)構(gòu)的核苷酸，該橋接的(鎖核酸-LNA)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)結(jié)合親和力且很可能還 提供一些增加的核酸酶抗性；將核苷酸間連接從其正常磷酸二酯修飾為對核酸酶侵襲更有 抗性的那些，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯-這兩個可被RNase H裂解，也產(chǎn)生調(diào)節(jié)β -聯(lián)蛋 白表達(dá)中反義抑制的途徑。在寡聚物中摻入增強(qiáng)親和力的核苷酸類似物，如LNA或2’ -取代的糖，可使得特異結(jié)合的寡聚物的尺寸減小，也可在非特異或異常結(jié)合發(fā)生前將上限減 小至寡聚物的尺寸。在多種實施方案中，該寡聚物包含至少2個核苷酸類似物。在一些實施方案中，該寡聚物包含3-8個核苷酸類似物，例如6或7個核苷酸類似物。在一些優(yōu)選的實施方案中， 所述核苷酸類似物的至少一個為鎖核酸(LNA)；例如至少3或至少4，或至少5，或至少6，或 至少7，或8個核苷酸類似物可為LNA。在一些實施方案中所有核苷酸類似物可為LNA。應(yīng)認(rèn)識到當(dāng)涉及優(yōu)選的核苷酸序列基序或核苷酸序列(其僅由核苷酸組成)時， 由該序列限定的本發(fā)明的寡聚物可包含對應(yīng)的核苷酸類似物代替一個或多個所述序列中 存在的核苷酸，如LNA單元或其它核苷酸類似物，其增加寡聚物/靶雙鏈體的雙鏈體穩(wěn)定性 /Tffl (即增強(qiáng)親和力的核苷酸類似物)。在多種實施方案中，寡聚物的核苷酸序列和靶序列之間的任何錯配優(yōu)選在增強(qiáng)親 和力的核苷酸類似物(例如A和C區(qū))之外的區(qū)域，如在本文所述的B區(qū)內(nèi)，和/或在本文 所述的D區(qū)內(nèi)，和/或在非修飾的位點如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在相對連續(xù)核堿 基序列的5’或3’的區(qū)。核苷酸的這些修飾的實例包括修飾糖部分以提供2’_取代基或產(chǎn)生橋接的(鎖核 酸)結(jié)構(gòu)，其增強(qiáng)結(jié)合親和力且也可提供增加的核酸酶抗性。優(yōu)選的核苷酸類似物為LNA，如氧基-LNA(如β-D-氧基-LNA，和α-L-氧 基-LNA)，和/或氨基_LNA(如β -D-氨基-LNA和α -L-氨基-LNA)和/或硫基 (thio)-LNA (如 β -D-硫基-LNA 和 α -L-硫基-LNA)和 / 或 ENA (如 β -D-ENA 和 α -L-ENA)。 在多種實施方案中，該LNA單元為0-0-氧基-1^·。在一些實施方案中，本發(fā)明的寡聚物中存在的核苷酸類似物(如在本文提及的A 和C區(qū)中)獨立地選自，例如2，-0-烷基-RNA單元，2，-氨基-DNA單元，2，-氟-DNA單元， LNA 單元，阿糖核酸(ANA)單元，2，-氟-ANA 單元，HNA 單元，INA (intercalating nucleic acid-Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30 :4918_4925，在此引入作為參考)單元 和2’ MOE單元。在多種實施方案中，僅有一個上述類型的核苷酸類似物存在于本發(fā)明的寡 聚物或其連續(xù)核堿基序列中。在多種實施方案中，該核苷酸類似物為2’ -0-甲氧基乙基_RNA(2’ Μ0Ε)， 2’ -氟-DNA單體或LNA核苷酸類似物，因此本發(fā)明的寡核苷酸可包括獨立地選自這三種 類型類似物的核苷酸類似物，或可包括選自這三種類型類似物中的僅一種類型。在多種 實施方案中，所述核苷酸類似物的至少一種為2，-MOE-RNAjB 2，3，4，5，6，7，8，9或10個 2’-MOE-RNA核苷酸單元。在多種實施方案中，所述核苷酸類似物的至少一種為2’-氟DNA， 如2，3，4，5，6，7，8，9或10個2，-氟-DNA核苷酸單元。在多種實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡聚物包含至少一個鎖核酸(LNA)單元，如1， 2，3，4，5，6，7，或8個LNA單元，如3_7或4至8個LNA單元，或3，4，5，6或7個LNA單元。在 多種實施方案中，所有核苷酸類似物為LNA。在一些實施方案中，該寡聚物可包含β-D-氧 基-LNA和一種或多種以下LNA單元β -D或α -L構(gòu)型的硫基-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、 和/或ENA或其組合。在多種實施方案中，所有LNA胞嘧啶單元為5’甲基-胞嘧啶。在本 發(fā)明多種實施方案中，該寡聚物可包含LNA和DNA單元。優(yōu)選LNA和DNA單元的組合總共 為10-25，優(yōu)選10-20，甚至更優(yōu)選12-16。在本發(fā)明多種實施方案中，寡聚物的核堿基序列，如連續(xù)核堿基序列由至少一個LNA組成，且剩余核苷酸單元為DNA單元。在多種實施方案 中，該寡聚物僅包含LNA核苷酸類似物和天然存在的核苷酸(如RNA或DNA，最優(yōu)選DNA核 苷酸)，任選具有修飾的連接基如硫代磷酸酯(phosphorothioate)。在多種實施方案中，寡聚物中存在的至少一個核堿基具有選自以下的修飾的堿 基5-甲基胞嘧啶，異胞嘧啶，假異胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤， 2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。 LNA術(shù)語“LNA”是指雙環(huán)核苷酸類似物，稱為“鎖核酸(Locked Nucleicacid) ”。其可 表示LNA單體，或當(dāng)在“LNA寡核苷酸”或LNA “寡聚物”的環(huán)境中使用時是指包含一種或多 種該雙環(huán)核苷酸類似物的寡聚物。本發(fā)明的寡聚物中使用的LNA優(yōu)選具有通式I的結(jié)構(gòu)，及其堿鹽(basicsalts)和
酸加成鹽 其中X 選自-0-、-S-、-N(Rn*) _、-C (R6R6*)-；B選自氫、任選取代的Cy-烷氧基、任選取代的CV4-烷基、任選取代的Cy-?；?氧基、核堿基、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、報道基(import groups) 和配體；P表示與在后的單體之間的核苷酸間連接(internucleotide linkage)的基團(tuán)位 置，或5'-末端基團(tuán)，該核苷酸間連接或5'-末端基團(tuán)任選包括取代基R5或等同適用取 代基R5、P*表示與在前的單體的核苷酸間連接，或3'-末端基團(tuán)；R4*和R2* —起表示由1-4個選自下列的基團(tuán)/原子組成的二價基團(tuán) (biradical) -C (RaRb)-、-C (Ra) = C (Rb)-、-C (Ra) = N-、-0-、-Si (Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-禾口> C = Z，其中Z選自-0-、-S-和-N (Ra) _，且Ra和Rb各自獨立地選自氫、任選取代的CV12-烷基、任選取代的C2_12_烯基、任選取代的C2_12_炔基、羥基、C1^12-烷 氧基、C2_12-烷氧基烷基、c2_12-烯基氧基、羧基、C1^12-烷氧基羰基、C1^12-烷基羰基、甲?；?、 芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳 基羰基、氨基、單和二(Cu-烷基)氨基、氨基甲?；魏投達(dá)6-烷基)-氨基-羰基、氨 基-Ch6-烷基-氨基羰基、單和二(Cu-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、Ch6-烷基-羰 基氨基、脲基、CV6-烷?；趸?、磺基(sulphono)、(^_6-烷基磺?；趸⑾趸?、疊氮基、硫基 (SUlphanyH6-烷基硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、報道 基和配體，其中芳基和雜芳基可任選被取代，且其中兩個成對的(geminal)取代基Ra和Rb一起可表示任選取代的亞甲基(=CH2)，和存在的取代基R1*、R2、R3、R5、R5*, R6和Rw各自獨立地選自氫、任選取代的C^12-烷 基、任選取代的C2_12-烯基、任選取代的c2_12-炔基、羥基、CV12-烷氧基、c2_12-烷氧基烷基、 c2_12-烯基氧基、羧基、CV12-烷氧基羰基、CV12-烷基羰基、甲?；⒎蓟?、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、氨基、單和二 ((V6-烷基)氨基、氨基甲?；?、單和二((V6-烷基)-氨基-羰基、氨基-Cu-烷基-氨基 羰基、單和二(Cp6-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、(V6-烷基-羰基氨基、脲基、Cp6-烷 ?；趸?、磺基、CV6-烷基磺?；趸?、硝基、疊氮基、硫基(sulphanyl)、Cp6-烷基硫基、 鹵素、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué)活性基、螯合基、報道基和配體、其中芳基和雜芳 基可任選被取代，且其中兩個成對的取代基一起可表示氧代、硫代、亞氨基或任選取代的亞 甲基，或一起可形成由1-5個碳原子亞烷基鏈組成的螺環(huán)二價基團(tuán)，所述亞烷基鏈任選插 入一個或多個雜原子/基團(tuán)和/或被一個或多個雜原子/基團(tuán)終止，所述雜原子/基團(tuán)選 自-0-、-S-和-(NRn)-，其中Rn選自氫和Cy-烷基，且其中兩個相鄰的(非成對的)取代 基可表示另一鍵，導(dǎo)致形成雙鍵；且Rw，當(dāng)存在且不涉及二價基團(tuán)時，選自氫和CV4-烷基；在多種實施方案中，R5*選自 H，-CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3 和 _CH = CH2。在多種實施方案中，R4*和R2*—起表示二價基團(tuán)，其選自-C(RaRb)-0-、-C(RaRb)-C (RcRd) -0-、-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) _0_、-C (RaRb) -O-C (RcRd) -、-C (RaRb) -O-C (RcRd) _0_、-C (RaR b) -C (RcRd) -、-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) -、-C (Ra) = C (Rb) -C (RcRd) -、-C (RaRb) -N (Rc) -、-C (RaR b) -C (RcRd) -N (Re) -、-C (RaRb) -N (Rc) -0-和-C (RaRb) -S-、-C (RaRb) -C (RcRd) _S_，其中 Ra、Rb、Rc、 Rd、Re和Rf各自獨立地選自氫、任選取代的Ch2-烷基、任選取代的C2_12-烯基、任選取代 的C2_12-炔基、羥基、C1^12-烷氧基、C2_12-烷氧基烷基、C2_12-烯基氧基、羧基、C1^12-烷氧基羰 基、Ch2-烷基羰基、甲?；?、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧 基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、氨基、單和二((V6-烷基)氨基、氨基甲?；?、單和二 ((V6-烷基)_氨基-羰基、氨基-Ch-烷基-氨基羰基、單和二沁_(dá)6-烷基)氨基-Cu-烷 基_氨基羰基、C1^6-烷基-羰基氨基、脲基、C1^6-烷酰基氧基、磺基、CV6-烷基磺酰基氧基、 硝基、疊氮基、硫基(sulphanyl)、C^6-烷基硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基、熱化學(xué) 活性基、螯合基、報道基和配體，其中芳基和雜芳基可任選被取代，且其中兩個成對的取代 基Ra和Rb —起可表示任選取代的亞甲基(=CH2)，在另一實施方案中R4*和R2*—起表示二價基團(tuán)，其選自-CH2-0-、-CH2-S-、-CH2-NH -、-CH2-N (CH3) _、-CH2-CH2-0-、-CH2-CH (CH3) -、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C H2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH (CH3) -,-CH = CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N (CH3) -0-、 -CH2-O-CH2-、-CH (CH3) -0-、-CH (CH2-O-CH3) -0-。對于所有手性中心，不對稱的基團(tuán)可為R或S取向。優(yōu)選地，本發(fā)明的寡聚物中使用的LNA包括至少一個根據(jù)任一下式的LNA單元 其中Y為-0-、-O-CH2-, -S-、-NH-或N(Rh) ；Z和t獨立地選自核苷酸間連接、末 端基團(tuán)或保護(hù)基；B構(gòu)成天然或非天然核苷酸堿基部分，且Rh選自氫和Cy-烷基。特別優(yōu)選的LNA單元示于示例2 示例 2術(shù)語〃硫基-LNA〃包括其中上述通式中的Y選自S或-CH2-S-的鎖核堿基(locked nucleobase) (LNA)。硫基-LNA 可為 β -D 和 α -L-構(gòu)型。術(shù)語〃氨基-LNA 〃包括其中上述通式中的Y選自-N(H)-、N(R)-, CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-,其中R選自氫和C^4-烷基的鎖核堿基(LNA)。氨基-LNA可為β -D 和α-L-構(gòu)型。術(shù)語〃氧基-LNA 〃包括其中上述通式中的Y表示-0-或-CH2-O-的鎖核堿基 (LNA)。氧基-LNA可為β -D和α -L-構(gòu)型。術(shù)語〃 ΕΝΑ"包括其中上述通式中的Y為-CH2-0-(其中-CH2-O-的氧原子連接至 相對堿基B的2’ -位)的鎖核堿基(LNA)。在優(yōu)選實施方案中LNA選自β -D-氧基-LNA、α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和β -D-硫基-LNA，特別是β -D-氧基-LNA。在本文中，術(shù)語"Cy-烷基"是指直鏈或支鏈的飽和烴鏈，其中該鏈具有1至4個 碳原子，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。RNAse H 募集
應(yīng)認(rèn)識到寡聚化合物可通過非RNase介導(dǎo)的靶mRNA的降解起作用，如通過翻譯的 位阻，或其它方法，然而，本發(fā)明優(yōu)選的寡聚物能募集核糖核酸內(nèi)切酶(RNase) ^RNase H。
在多種實施方案中，該寡聚物或連續(xù)核堿基序列，包含至少6個，如至少7個連續(xù) 核苷酸或核堿基單元，如至少8或至少9個相連核堿基單元(殘基)，包括7，8，9，10，11， 12，13，14，15或16個連續(xù)核苷酸或核堿基的區(qū)域，當(dāng)其與互補(bǔ)靶RNA形成雙鏈體時能募集 RNase。能募集RNAse的連續(xù)序列可為本文所述的缺口聚物(gapmer)涉及的B區(qū)。在多種 實施方案中，能募集RNAse的連續(xù)序列(如B區(qū))的尺寸可更大，如10，11，12，13，14，15， 16，17，18，19或20個核堿基單元。EP 1 222 309提供了體外測定RNaseH活性的方法，其可用于測定募集RNaseH的 能力。使用EP 1 222 309的實施例91-95提供的方法，如果當(dāng)提供互補(bǔ)RNA靶時，具有的 初始速率(以pmol/1/min測量)，為等效DNA(equivalent DNA)的至少1 %，如至少5%，如 至少10%或少于20%，該等效DNA僅為寡核苷酸，沒有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核 苷酸間具有硫代磷酸酯連接基，則認(rèn)為該寡聚物能募集RNase H。在多種實施方案中，使用EP 1 222 309的實施例91_95提供的方法，如果當(dāng)提供 互補(bǔ)RNA靶和RNaseH時，該RNaseH初始速率(以pmol/1/min測量)，少于使用等效DNA測 定的初始速率的1 %，如少于5%，如少于10%或少于20%，該等效DNA僅為寡核苷酸，沒有 2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸間具有硫代磷酸酯連接基，則認(rèn)為該寡聚物基本不 能募集RNase H。在其它實施方案中，使用EP 1 222 309的實施例91_95提供的方法，如果當(dāng)提供 互補(bǔ)RNA靶和RNaseH時，該RNaseH初始速率(以pmol/1/min測量)，為使用等效DNA測定 的初始速率的至少20 %，如至少40 %，如至少60 %，如至少80 %，該等效DNA僅為寡核苷酸 (即具有相同的堿基序列，但僅含有DNA單元)，沒有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷 酸間具有硫代磷酸酯連接基，則認(rèn)為該寡聚物能募集RNase H。通常，形成連續(xù)核堿基序列的寡聚物的區(qū)域，當(dāng)與互補(bǔ)靶RNA形成雙鏈體時，能募 集由核苷酸單元(其與RNA靶形成DNA/RNA狀的雙鏈體)組成的RNase-且可包括α -L構(gòu) 型的DNA單元和LNA單元，特別優(yōu)選為α -L-氧基LNA。本發(fā)明的寡聚物可包含核堿基序列，其包括核苷酸和核苷酸類似物，且可為缺口 聚物(gapmer)、頭聚物(headmer)或混合聚物(mixmer)的形式。頭聚物如下定義在5’ -端的連續(xù)的一段非_募集RNase的核苷酸類似物，接著 直到3’ -端的連續(xù)的一段可由RNAse識別和裂解的DNA或修飾的核苷酸(類似物)單元 (如至少7個該核苷酸)，而尾聚物(tailmer)如下定義在5’-端的連續(xù)的一段可由RNAse 識別和裂解的DNA或修飾的核苷酸(類似物)(如至少7個該核苷酸)，接著直到3’-端的 連續(xù)的一段非-募集RNase的核苷酸類似物。其它根據(jù)本發(fā)明的“嵌合”寡聚物，稱為“混 合聚物”，其由下述交替組分構(gòu)成i)可由RNAse識別和裂解的DNA或修飾的核苷酸，和ii) 非-募集RNase的核苷酸類似物。一些核苷酸類似物也能介導(dǎo)RNase (如RNaseH)，結(jié)合和 裂解。因為α -L-LNA募集RNase活性到一定程度，可能需要可由RNAse識別和裂解的DNA 或修飾的核苷酸的較小區(qū)域(例如缺口-或B區(qū))用于缺口聚物構(gòu)建體，且混合聚物構(gòu)建 中會引入更多的柔性。缺口聚物設(shè)計
優(yōu)選地，本發(fā)明的寡聚物是缺口聚物。缺口聚物寡聚物是包含一段連續(xù)的核苷酸 或核堿基的寡聚物(該核苷酸或核堿基能募集RNAse，如RNAseH)，如至少6或7個DNA核 苷酸的區(qū)域，在本文涉及的為B區(qū)，其中B區(qū)的5’和3’的側(cè)翼均為核苷酸類似物的區(qū)域， 如增強(qiáng)親和力的核苷酸類似物，如1-6個核苷酸類似物，5’和3’連接至一段連續(xù)的能募集 RNAse的核苷酸-涉及的這些區(qū)分別稱為A區(qū)和C區(qū)。優(yōu)選該缺口聚物包含下式的(聚)核苷酸序列(5’至3’)A-B_C，或任選A-B-C-D 或D-A-B-C，其中；A區(qū)(5’區(qū))由以下組成或包含以下至少一個核苷酸類似物，如至少一 個LNA單元，如1-6個核苷酸類似物，如LNA單元，和；B區(qū)由以下組成或包含以下至少5 個能募集RNAse (當(dāng)與互補(bǔ)RNA分子，如mRNA靶形成雙鏈體時)的連續(xù)核苷酸或核堿基，如 DNA核苷酸，和；C區(qū)(3’區(qū))由以下組成或包含以下至少一個核苷酸類似物，如至少一個 LNA單元，如1-6個核苷酸類似物，如LNA單元，和；D區(qū)，當(dāng)存在時由以下組成或包含以下 1，2或3個核苷酸單元，如DNA核苷酸。在多種實施方案中，A區(qū)由1，2，3，4，5或6個核苷酸類似物(如LNA單元)組成， 如2-5個核苷酸類似物，如2-5個LNA單元，如3或4個核苷酸類似物，如3或4個LNA單 元；和/或C區(qū)由1，2，3，4，5或6個核苷酸類似物(如LNA單元)組成，如2_5個核苷酸類 似物，如2-5個LNA單元，如3或4個核苷酸類似物，如3或4個LNA單元。在多種實施方案中，B由以下組成或包含以下5，6，7，8，9，10，11或12個能募集 RNAse的連續(xù)核苷酸或核堿基，或6-10，或7_9，如8個能募集RNAse的連續(xù)核苷酸或核堿 基。在多種實施方案中，B區(qū)由以下組成或包含以下至少一個DNA核苷酸單元，如1-12個 DNA單元，優(yōu)選4-12個DNA單元，更優(yōu)選6_10個DNA單元，如7_10個DNA單元，最優(yōu)選8，9 或10個DNA單元。在多種實施方案中，A區(qū)由3或4個核苷酸類似物(如LNA)組成，B區(qū)由7，8， 9或10個DNA單元組成，且C區(qū)由3或4個核苷酸類似物(如LNA)組成。這些設(shè)計包括 (A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3—9—3，3—9—4，4—9—3，3—8—3，3—8—4，4—8—3，3—7—3，3—7—4， 4-7-3，且可進(jìn)一步包括D區(qū)，其可具有1個或2個核苷酸單元，如DNA單元。其它缺口聚物設(shè)計公開于W02004/046160且在此引入作為參考。美國臨時申請，60/977409，在此引入作為參考，涉及‘短聚物(shortmer)，缺口聚物寡聚物，在多種實施方案中，其可為本發(fā)明的缺口聚物寡聚物。在多種實施方案中，該寡聚物由總共10，11，12，13或14個核堿基單元的連續(xù)核堿 基序列組成，其中該連續(xù)核堿基序列為式(5’ -3’)，A-B-C，或任選A-B-C-D或D-A-B-C，其 中；A由1，2或3個核苷酸類似物單元(如LNA單元)組成；B由7，8或9個連續(xù)核苷酸或 核堿基單元組成，當(dāng)與互補(bǔ)RNA分子(如mRNA靶)形成雙鏈體時，所述核苷酸或核堿基單 元能募集RNAse;且C由1，2或3個核苷酸類似物單元(如LNA單元)組成。當(dāng)存在時，D 由單一 DNA單元組成。在多種實施方案中，A由1個LNA單元組成。在多種實施方案中，A由2個LNA單 元組成。在多種實施方案中，A由3個LNA單元組成。在多種實施方案中，C由1個LNA單 元組成。在多種實施方案中，C由2個LNA單元組成。在多種實施方案中，C由3個LNA單 元組成。在多種實施方案中，B由7個核苷酸單元組成。在多種實施方案中，B由8個核 苷酸單元組成。在多種實施方案中，B由9個核苷酸單元組成。在多種實施方案中，B包含1-9個DNA單元，如2，3，4，5，6，7或8個DNA單元。在多種實施方案中，B由DNA單元組 成。在多種實施方案中，B包含至少一個α-L構(gòu)型的L NA單元，如2，3，4，5，6，7，8或9個 α-L-構(gòu)型的LNA單元。在多種實施方案中，B包含至少一個α-L-氧基LNA單元或其中所 有α -L-構(gòu)型的LNA單元為α -L-氧基LNA單元。在多種實施方案中，A-B-C中存在的核 苷酸數(shù)選自(核苷酸類似物單元-B區(qū)-核苷酸類似物單元)1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2， 3-8-3，2-8-3，3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4，或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3， 3-9-2，1-9-3，3-9-1，4-9-1，1—9—4，或；1-10-1,1_10_2，2-10—1，2-10—2，1-10-3,3-10-1。 在多種實施方案中，A-B-C中的核苷酸數(shù)選自2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2， 3-7-4和4-7-3。在多種實施方案中，A和C各自都由兩個LNA單元組成，且B由8或9個 核苷酸單元，優(yōu)選DNA單元組成。
其它缺口聚物設(shè)計包括以下那些其中A區(qū)和或C區(qū)由3，4，5或6個核苷酸類似 物組成，如選自2’-0-甲氧基乙基-RNA(2’ Μ0Ε)和2’ -氟-DNA單體的核苷酸類似物，且B 區(qū)由8，9，10，11或12個核苷酸，如DNA單元(或核堿基)組成，如5_10_5和4_12_4缺口 聚物設(shè)計。其它缺口聚物設(shè)計公開于WO 2007/146511Α2，在此引入作為參考。連接基術(shù)語〃連接基〃或“核苷酸間連接(internucleotide linkage) ”是指能將兩個核 苷酸或核堿基、兩個核苷酸類似物、以及核苷酸和核苷酸類似物等共價結(jié)合在一起的基團(tuán)。 具體且優(yōu)選的實例包括磷酸基(phosphate group)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate)。本發(fā)明的寡聚物或其連續(xù)核堿基序列的核堿基通過連接基結(jié)合在一起。合適地， 各核堿基通過連接基連接至3’鄰近(adjacent)的核堿基。合適的連接基包括列于W02007/031091的那些，例如列于W02007/031091的第34
頁第一段的連接基(在此引入作為參考)。也就是說，在多種實施方案中，優(yōu)選將連接基從其正常磷酸二酯修飾為對核酸酶 攻擊更有抗性的基團(tuán)，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)-這兩個可被RNase H裂解，也產(chǎn)生在減少靶基因的表達(dá)中反義抑制的途徑。本文提供的合適的含硫(S)連接基可為優(yōu)選的。硫代磷酸酯連接基也是優(yōu)選的， 尤其對于缺口聚物的缺口(gap)區(qū)(B)。硫代磷酸酯連接也可用于側(cè)翼區(qū)(A和C，且用于 將A或C連接至D，且在D區(qū)內(nèi)，視情況而定)。然而A、B和C區(qū)可包含除硫代磷酸酯外的其它連接基，如磷酸二酯連接，特別地， 例如當(dāng)使用核苷酸類似物防止A和C區(qū)內(nèi)的連接基進(jìn)行內(nèi)切核酸酶降解-如當(dāng)A和C區(qū)包 含LNA核苷酸時。寡聚物中的連接基可為磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯以使得RNase H裂解 靶向的RNA。優(yōu)選硫代磷酸酯，這是由于改善的核酸酶抗性和其它原因，如易于制造。在本發(fā)明的寡聚物的一方面，該核苷酸和/或核苷酸類似物通過硫代磷酸酯基彼 此連接。應(yīng)認(rèn)識到將磷酸二酯連接，如一個或兩個連接，加入到其它硫代磷酸酯寡聚物，特 別是介于核苷酸類似物單元之間或相鄰于核苷酸類似物單元(典型地在A區(qū)和或C區(qū))可 修飾寡聚物的生物利用度和/或生物分布_參見W02008/053314，在此引入作為參考。在一些實施方案中，如上述實施方案，其中適當(dāng)且非特異表明，所有剩余的連接基為磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些實施方案中所有核苷酸間連接基為硫代磷酸酯。當(dāng)涉及具體的缺口聚物寡核苷酸序列，如那些在此提供的，應(yīng)理解在多種實施方 案中，當(dāng)該連接為硫代磷酸酯連接時，可使用如那些在此公開的其它連接，例如可使用磷酸 酯(磷酸二酯)連接，特別是用于核苷酸類似物，如LNA單元之間的連接。同樣，當(dāng)涉及具 體缺口聚物寡核苷酸序列時，如在此提供的那些，當(dāng)C殘基注釋為5’甲基修飾的胞嘧啶時， 在多種實施方案中，寡聚物中存在的一個或多個C可為未修飾的C殘基。寡聚化合物本發(fā)明的寡聚物可選自SEQ ID NO 133-152，如表2所示。表2寡聚物設(shè)計SEQ ID NOS 133-152，大寫字母表示核苷酸類似物單元而下標(biāo) “S”表示硫代磷酸酯連接。小寫字母表示核苷酸(DNA)單元?！癝”缺失(若有的話)指示 磷酸二酯連接。
綴合物在本文中術(shù)語"綴合物(conjugate)“是表示通過將本文所述的寡聚物共價連接 (“綴合”)至一個或多個非核苷酸/非核苷酸_類似物(即非核堿基)，或非多核苷酸部分 形成的異源(heterogenous)分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的實例包括大分子試劑如 蛋白質(zhì)、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物或其組合。典型的蛋白質(zhì)可為靶蛋白的抗體。典 型聚合物可為聚乙二醇。因此，在多種實施方案中，本發(fā)明的寡聚物可包含多核苷酸區(qū)和非核苷酸區(qū)，該多 核苷酸區(qū)即為核苷酸/核堿基區(qū)，其通常由核堿基的連續(xù)序列組成。當(dāng)涉及本發(fā)明的由連 續(xù)核堿基序列組成的寡聚物，該化合物可包含非核苷酸/非核堿基組分，如綴合物組分。在本發(fā)明多種實施方案中，該寡聚化合物連接至配體/綴合物，其可用于例如增 加寡聚化合物的細(xì)胞吸收。W02007/031091提供了合適的配體和綴合物，其在此引入作為參 考。本發(fā)明還提供綴合物，其包含本文所述的根據(jù)本發(fā)明的化合物和至少一種共價連 接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在多種實施方案中，其中本發(fā)明的化 合物由特定的核酸或核堿基序列組成，如本文所公開，該化合物也可包含至少一種非核苷 酸或非多核苷酸部分(例如不包含一種或多種核苷酸或核苷酸類似物)共價連接至所述化 合物。綴合物可增強(qiáng)本發(fā)明的寡聚物的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞吸收。這些部分包括，但不 限于，抗體、多肽、脂質(zhì)部分如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫膽固 醇(thiocholesterol)、脂肪鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂，例如，二-十六烷 基-rac-甘油或1，2- 二 _o_十六烷基-rac-甘油_3_h_膦酸三乙基銨、聚胺或聚乙二醇鏈、 金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八烷基胺或己基氨基_羰基-氧基膽固醇部分。本發(fā)明的寡聚物也可綴合至活性藥物，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺藥物，抗糖尿 藥，抗菌藥或抗生素。在某些實施方案中該綴合的部分為固醇，如膽固醇。在多種實施方案中，該綴合的部分包含或由以下組成帶正電荷的聚合物，如帶正 電荷的肽，例如長度為1-50，如2-20如3-10個氨基酸殘基，和/或聚環(huán)氧烷如聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇-參見WO 2008/034123，在此引入作為參考。合適地該帶正電荷的聚合 物，如聚環(huán)氧烷可通過連接基連接至本發(fā)明的寡聚物，如描述于WO 2008/034123的可釋放的連接基。
活化的寡聚物本文所用的術(shù)語“活化的寡聚物”，是指共價連接(即，官能化)至至少一個官能 部分(functional moiety)的本發(fā)明的寡聚物，該官能部分允許寡聚物共價連接至一個或 多個綴合的部分(即本身不為核酸或單體的部分)，以形成本文描述的綴合物。典型地，官 能部分將包含能通過以下連接共價連接至寡聚物的化學(xué)基團(tuán)例如，3’ -羥基或腺嘌呤堿 基的環(huán)外NH2基，優(yōu)選親水性間隔基(spacer)和能結(jié)合至綴合的部分的末端基團(tuán)(例如， 氨基、巰基或羥基)。在一些實施方案中，末端基團(tuán)未被保護(hù)，例如，為NH2基團(tuán)。在其它 實施方案中，末端基團(tuán)被保護(hù)，例如，被任何合適的保護(hù)基，如描述于Theodora WGreene和 Peter G M Wuts,第三版(John Wiley & Sons, 1999)的"ProtectiveGroups in Organic Synthesis"的那些保護(hù)。合適的羥基保護(hù)基的實例包括酯如乙酸酯，芳烷基如芐基，二苯 基甲基，或三苯基甲基和四氫吡喃基。合適的氨基保護(hù)基的實例包括芐基，α-甲基芐基，二 苯基甲基，三苯基甲基，芐基氧基羰基，叔丁氧基羰基和酰基如三氯乙?；蛉阴；?。 在一些實施方案中，該官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它實施方案中，該官能 部分為生物可降解的。參見例如，美國專利號7，087，229，其以其整體在此引入作為參考。在一些實施方案中，本發(fā)明的寡聚物在5’端官能化以使綴合的部分共價連接至寡 聚物的5’端。在其它實施方案中，本發(fā)明的寡聚物可在3’端官能化。在其它實施方案中， 本發(fā)明的寡聚物可沿著主鏈或在雜環(huán)堿基部分上官能化。在其它實施方案中，本發(fā)明的寡 聚物可在多于一個位置官能化，所述位置獨立地選自5’端、3’端、主鏈和堿基。在一些實施方案中，本發(fā)明的活化的寡聚物通過在合成過程中摻入一個或多個共 價連接至官能部分的單體而合成。在其它實施方案中，本發(fā)明的活化的寡聚物使用未被官 能化的單體合成，且該寡聚物在合成完成后立即官能化。在一些實施方案中，該寡聚物使 用含氨基烷基連接基的位阻酯官能化，其中該烷基部分具有式(CH2)w，其中w為1至10 的整數(shù)，優(yōu)選約6，其中烷基氨基的烷基部分可為直鏈或支鏈的，且其中該官能團(tuán)通過酯基 (-O-C(O)-(CH2)wNH)連接至寡聚物。在其它實施方案中，該寡聚物使用含(CH2)w_巰基(SH)連接基的位阻酯官能化， 其中w為1至10的整數(shù)，優(yōu)選約6，其中烷基氨基的烷基部分可為直鏈或支鏈的，且其中該 官能團(tuán)通過酯基(-O-C(O)_(CH2)wSH)連接至寡聚物。在一些實施方案中，巰基-活化的寡核苷酸與聚合物部分如聚乙二醇或肽綴合 (通過二硫鍵的形成)。上述包含位阻酯的活化的寡聚物可通過任何本領(lǐng)域已知的方法合成，且特別是通 過公開于PCT公開號WO 2008/034122和其實施例中的方法，其以其整體在此引入作為參考。在其它實施方案中，本發(fā)明的寡聚物通過使用官能化試劑(functionalizing reagent)向寡聚物引入巰基、氨基或羥基而官能化，該官能化試劑基本上描述于美國 專利號4，962，029和4，914，210，S卩，為基本上鏈狀的試劑，其在一端具有亞磷酰胺 (phosphoramidite)通過親水性間隔基鏈連接至相對的端，該相對的端包含保護(hù)的或未保 護(hù)的巰基、氨基或羥基。這些試劑主要與寡聚物的羥基反應(yīng)。在一些實施方案中，該活化的 寡聚物具有官能化試劑結(jié)合至寡聚物的5’ -羥基。在其它實施方案中，該活化的寡聚物具有官能化試劑結(jié)合至3’ -羥基。在其它實施方案中，本發(fā)明的活化的寡聚物具有官能化試 劑結(jié)合至寡聚物的主鏈上的羥基。在其它實施方案中，本發(fā)明的寡聚物使用多于一種官能 化試劑官能化，該官能化試劑描述于美國專利號4，962，029和4，914，210中，以其整體在此 引入作為參考。合成該官能化試劑和將它們加入單體或寡聚物的方法公開于美國專利號 4，962，029 和 4，914，210。在一些實施方案中，固相結(jié)合的寡聚物的5’-端使用二烯基亞磷酰胺衍生物官能 化，然后將脫保護(hù)的寡聚物與例如氨基酸或肽通過Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)而綴合。在多種實施方案中，將含2’ _糖修飾的單體，如2’ _氨基甲酸酯取代的糖或 2' -(0-戊基-N-鄰苯二甲酰亞氨基)_脫氧核糖的糖摻入寡聚物促進(jìn)綴合的部分與寡聚 物的糖的共價連接。在其它實施方案中，一個或多個單體的2'-位具有含氨基的連接基 的寡聚物使用以下試劑制備例如，5' -二甲氧基三苯甲基-2' -0-(e-鄰苯二甲酰亞氨 基氨基戊基)_2'-脫氧腺苷-3' -N，N-二異丙基-氰基乙氧基亞磷酰胺。參見，例如， Manoharan，等人，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。在其它實施方案中，本發(fā)明的寡聚物可在核堿基上具有含胺的官能部分，包括在 N6嘌呤氨基上，在鳥嘌呤的環(huán)外N2上，或在胞嘧啶的N4或5位上。在一個實施方案中，該 官能化可通過使用已在寡聚物合成中官能化的商業(yè)試劑實現(xiàn)。一些官能部分是可商購的，例如，異雙官能(heterobifunctional)和同雙官 能(homobifunctional)連接部分可購自 Pierce Co. (Rockford, 111·)。其它可商購的 連接基為5'-氨基-修飾體(Modifier)C6和3'-氨基-修飾體試劑，均可購自Glen Research Corporation (Sterling，Va.)。5'-氨基-修飾體 C6 也可作為 Aminolink-2 購 自 ABI (Applied Biosystems Inc. ,Foster City，Calif.)，且 3‘-氨基-修飾體也可購自 Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)。組合物本發(fā)明的寡聚物可用于藥物制劑和組合物。合適地，該組合物包含藥學(xué)可接受的 稀釋劑、載體、鹽或佐劑。W02007/031091提供了合適和優(yōu)選的藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體和 佐劑-其在此引入作為參考。合適的劑量、制劑、給藥途徑、組合物、劑型、與其它治療劑的 組合，前藥制劑也提供于W02007/031091-其也在此引入作為參考。如本文所述，術(shù)語"藥學(xué)可接受的鹽"是指保持本文鑒別的化合物的所需生物活 性且顯示最小的不希望有的毒理學(xué)作用的鹽。這些鹽的非限制性實例可通過與有機(jī)氨基酸 形成，以及與金屬陽離子形成的堿加成鹽，該金屬陽離子如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、 鎘、鈉、鉀等，或與由氨形成的陽離子，N, N-二芐基乙二胺，D-葡糖胺，四乙基銨，或乙二胺 形成的堿加成鹽；或(c) (a)和(b)的組合；例如，鞣酸鋅鹽等。
應(yīng)用本發(fā)明的寡聚物可用作研究試劑，用于例如，診斷、治療和預(yù)防。在研究中，該寡聚物可用于特異抑制細(xì)胞和實驗動物中β-聯(lián)蛋白的表達(dá)或合成 (通常通過降解或抑制mRNA從而防止蛋白質(zhì)形成)，從而促進(jìn)該靶的功能分析或評估其作 為治療干預(yù)的靶的有用性。在診斷中該寡聚物可用于通過RNA印跡法、原位雜交或類似技術(shù)檢測和定量細(xì)胞 和組織中的β-聯(lián)蛋白表達(dá)。
對于治療，疑患疾病或病癥的動物或人(其可通過調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的表達(dá)治療) 通過給藥本發(fā)明的寡聚化合物，如有效量的寡聚物(或其綴合物)而治療。本文進(jìn)一步提 供了治療哺乳動物的方法，如治療人，其疑患疾病或癥狀或易患疾病或癥狀，該疾病或癥狀 與聯(lián)蛋白的表達(dá)相關(guān)，該方法通過給藥治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的一種或多種寡聚 物或組合物。本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的化合物或綴合物在制備用于治療本文涉及的疾病的 藥物中的用途，或提供治療本文所述的疾病的方法。本發(fā)明還涉及本文所述的寡聚物、組合物或綴合物用作藥物。合適地，當(dāng)涉及本發(fā) 明的方法時，本發(fā)明的寡聚物或綴合物的給藥通過給藥有效量的寡聚物或綴合物進(jìn)行，例 如能有效提供治療的量或有效抑制或下調(diào)細(xì)胞中β“聯(lián)蛋白表達(dá)的量。本發(fā)明還提供治療本文涉及的疾病的方法，所述方法包括向需要的患者給藥本發(fā) 明的化合物，和/或本發(fā)明的綴合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物。在多種實施方案中，該寡聚物或其綴合物，通過例如氫鍵合至靶核酸而結(jié)合，在人 體內(nèi)引起所需的治療效果。該寡聚物或其綴合物，通過氫鍵合(雜交)至靶的mRNA導(dǎo)致基 因表達(dá)減少，引起靶的表達(dá)減少(抑制)。還可看出本文公開的寡聚化合物和綴合物可具有 非治療應(yīng)用，如診斷應(yīng)用。醫(yī)藥適應(yīng)癥在多種實施方案中，本文涉及的疾病選自過度增生性疾病，如癌癥，如選自以下的 癌癥結(jié)腸直腸癌，肝細(xì)胞癌，子宮內(nèi)膜癌，惡性黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌，垂體癌，食管癌，肺 癌，乳腺癌，腎癌，造血系統(tǒng)癌，子宮頸癌，CNS癌，骨癌，膽道癌和腎上腺癌。在多種實施方案中，本文涉及的疾病為選自以下的癌癥結(jié)腸直腸癌、肝細(xì)胞癌、 子宮內(nèi)膜癌和惡性黑素瘤。在多種實施方案中，本文涉及的疾病為選自以下的癌癥肝癌和腎癌。根據(jù)本發(fā)明的寡聚物和其它組合物可用于治療與β _聯(lián)蛋白的過表達(dá)或β _聯(lián)蛋 白的突變體的表達(dá)相關(guān)的疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的化合物在制備或制造用于治療本文提及的疾病、病癥 或癥狀的藥物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本文定義的化合物、組合物或綴合物在制備用于治療異常水平的聯(lián)蛋白或突變體形式的聯(lián)蛋白(如等位變體，如與本文提及的疾病之一相關(guān)的 那些)的表達(dá)的藥物中的用途。本發(fā)明一個方面涉及治療患有以下疾病或?qū)σ韵录膊∶舾械牟溉閯游锏姆椒ǎ?所述疾病與異常水平的聯(lián)蛋白相關(guān)，該方法包括向哺乳動物給藥治療有效量的靶向 β _聯(lián)蛋白的寡聚物，如包括一個或多個LNA單元的寡聚物。因此本發(fā)明的方法可用于治療 或預(yù)防異常水平的聯(lián)蛋白引起的疾病?；蛘?，在多種實施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及治 療異常水平的聯(lián)蛋白的方法，所述方法包括向需要的患者給藥本發(fā)明的寡聚物，或本 發(fā)明的綴合物或本發(fā)明的藥物組合物。在多種實施方案中，本文涉及的疾病或病癥與β-聯(lián)蛋白基因或其蛋白產(chǎn)物與 聯(lián)蛋白相關(guān)或與聯(lián)蛋白相互作用的基因的突變相關(guān)。因此，在多種實施方案中，該
靶mRNA為β-聯(lián)蛋白序列的突變形式。
本發(fā)明一個感興趣的方面涉及本文定義的寡聚物(化合物)或本文定義的綴合物 在制備用于治療本文提及的疾病、病癥或癥狀的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及本文定義的寡聚物、組合物或綴合物，其用作藥物。而且，本發(fā)明涉及治療患有如本文涉及的那些疾病或癥狀的患者的方法，所述方 法包括向需要的患者給藥如本文所述的本發(fā)明化合物，和/或本發(fā)明的綴合物，和/或本發(fā) 明的藥物組合物。合適的劑量、制劑、給藥途徑、組合物、劑型、與其它治療劑的組合，前藥制劑也在 W02007/031091中提供-其在此引入作為參考。本發(fā)明還提供包含本文描述的化合物或綴 合物和藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或佐劑的藥物組合物。W02007/031091提供合適和優(yōu)選的 藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體和佐劑-其在此引入作為參考。本發(fā)明的方法優(yōu)選用于治療或預(yù)防異常水平的聯(lián)蛋白引起的疾病。而且，本文描述的發(fā)明包括預(yù)防或治療疾病的方法，包括向需要該治療的人給藥 治療有效量的調(diào)節(jié)聯(lián)蛋白的寡聚物。本發(fā)明進(jìn)一步包括短期給藥調(diào)節(jié)聯(lián)蛋白的寡 核苷酸化合物(寡聚物或綴合物)的用途?；蛘撸诙喾N實施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療異常水平的聯(lián)蛋白的方法， 所述方法包括向需要的患者給藥本發(fā)明的寡聚物、或本發(fā)明的綴合物或本發(fā)明的藥物組合 物，且進(jìn)一步包括給藥其它藥物或其它活性成分。所述進(jìn)一步給藥可為以下情況該其它藥 物或其它活性成分綴合至本發(fā)明的化合物、存在于藥物組合物中或以單獨制劑給藥。本發(fā)明還涉及本文定義的寡聚物、組合物或綴合物，其用作藥物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本文定義的化合物、組合物或綴合物在制備用于治療異常水平 的聯(lián)蛋白或表達(dá)聯(lián)蛋白突變體形式(如等位變體，如與本文提及的疾病之一相關(guān) 的那些)的藥物中的用途。而且，本發(fā)明涉及治療患有如那些本文涉及的疾病或癥狀的患者的方法。需要治療的患者為患有或很可能患有疾病或病癥的患者。在多種實施方案中，本文使用的術(shù)語‘治療’是指治療存在的疾病(例如本文涉及 的疾病或病癥)，或預(yù)防疾病，即預(yù)防(prophylaxis)。因此應(yīng)認(rèn)識到在多種實施方案中，本 文涉及的治療可為預(yù)防的。在多種實施方案中，本發(fā)明涉及的疾病或病癥可與β-聯(lián)蛋白基因或其蛋白產(chǎn)物 與β-聯(lián)蛋白相關(guān)或與β-聯(lián)蛋白相互作用的基因(如APC基因)的突變相關(guān)。因此，在 多種實施方案中，該靶mRNA為β-聯(lián)蛋白序列的突變形式，例如其可包括一個或多個單點 突變，如與癌癥相關(guān)的SNPs。這些疾病的實例(其中聯(lián)蛋白或APC基因中的突變導(dǎo)致異常水平的β-聯(lián)蛋 白活性)為⑴結(jié)腸直腸癌，所有情況中多于70%的APC和β-聯(lián)蛋白互相突變(Powell 等人，Nature, 1992 ；Morin 等人，Science, 1997 ；Sparks 等人，Cancer Res, 1998) ； (2)肝 細(xì)胞癌，多于25%的情況下β-聯(lián)蛋白突變(de LaCoste A，PNAS, 1998) ； (3)子宮內(nèi)膜 癌，β-聯(lián)蛋白突變> 10% ；和(4)惡性黑素瘤，B-聯(lián)蛋白突變> 10% (Rubinfeld等人， Science,1997)。這些疾病的其它實例為以下癌癥卵巢癌，胰腺癌，垂體癌，食道癌，肺癌，乳腺癌， 腎癌，造血系統(tǒng)癌，子宮頸癌，CNS癌，骨癌，膽道癌和腎上腺癌。已顯示β-聯(lián)蛋白或APC基因中的突變與這些疾病相關(guān)(Catalogue ofSomatic Mutations in Cancer available from the Sanger Institute (UnitedKingdom) homepage http://www· Sanger· ac· uk/)0本發(fā)明涉及的癌癥可選自上述形式的癌癥之一。
進(jìn)一步的實施方案以下實施方案也涉及說明書和發(fā)明內(nèi)容，且可與本發(fā)明的實施方案(包括權(quán)利要 求中涉及的實施方案)組合1.反義寡核苷酸(如寡聚物)，其能結(jié)合至SEQ ID NO :173的β-聯(lián)蛋白基因或其 等位基因的靶序列，且能下調(diào)聯(lián)蛋白的表達(dá)，所述寡核苷酸包含對應(yīng)于靶序列的10-50 個核堿基的序列。2.實施方案1的反義寡核苷酸，其中該靶序列選自SEQ ID N0S:1_132表示的 β-聯(lián)蛋白基因或其等位變體的區(qū)域。3.實施方案1或?qū)嵤┓桨?的寡核苷酸，其包含10-16個示于SEQ IDNOS :1、16、 17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118 的核堿基序列或其等位變體。4.根據(jù)實施方案1-3中任一項的寡核苷酸，其包含示為SEQ ID NOS :1_132的序 列。5.前述實施方案任一項的寡核苷酸，其由SEQ ID NOS 133-172所表示。6.根據(jù)前述實施方案任一項的寡核苷酸，其中所述核堿基序列包含獨立地選自磷 酸二酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯的核堿基間連接。7.前述實施方案任一項的寡核苷酸，其中所述核堿基中的至少兩個為核苷酸類似 物。8.根據(jù)實施方案5的寡核苷酸，其中所述核堿基的序列沿5’至3’的方向包含(i) A區(qū)一段2-4個核苷酸類似物，接著(ii)B區(qū)不同于A區(qū)的一段6-11個核苷酸或核苷酸 類似物，接著(iii)C區(qū)一段2-4個核苷酸類似物，和任選接著(iv)D區(qū)1個或2個核苷酸。9.根據(jù)實施方案8的寡核苷酸，其中A區(qū)在兩個核苷酸類似物單元之間和/或在 核苷酸類似物單元和B區(qū)的核堿基單元之間包括至少1個磷酸二酯連接。10.根據(jù)實施方案8或?qū)嵤┓桨?的寡核苷酸，其中C區(qū)在兩個核苷酸類似物單元 之間和/或在核苷酸類似物單元和B區(qū)的核堿基單元之間包括至少1個磷酸二酯連接。11.根據(jù)實施方案1-6中任一項的寡核苷酸，其中所有核堿基間連接為硫代磷酸 酯。12.根據(jù)實施方案7-11中任一項的寡核苷酸，其中所述核苷酸類似物單元獨立 地選自2，-0-烷基-RNA、2，-氨基-DNA、2，-氟-DNA、鎖核酸(LNA)、阿糖核酸(ANA)、 2，_ 氟-ANA、HNA、INA 禾口 2，Μ0Ε。13.根據(jù)實施方案12的寡核苷酸，其中該核苷酸類似物獨立地選自2’ -M0E-RNA、 2，_ 氟-DNA 禾口 LNA014.根據(jù)實施方案13的寡核苷酸，其中所述核苷酸類似物的至少一個為鎖核酸 (LNA)。15.根據(jù)實施方案14的寡核苷酸，其中所有核苷酸類似物為LNA。
16.根據(jù)實施方案12-15中任一項的寡核苷酸，其中LNA選自β-D-氧基-LNA、 α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和 β -D-硫基-LNA。17.綴合物，其包含根據(jù)前述實施方案任一項的寡核苷酸和共價連接至所述寡核 苷酸的至少一個非核苷酸或非多核苷酸部分。18.根據(jù)實施方案17的綴合物，其中所述非核苷酸或非多核苷酸部分由固醇基團(tuán) 如膽固醇組成或包含固醇基團(tuán)如膽固醇。19.藥物組合物，其包含根據(jù)實施方案1-16中任一項的寡核苷酸或根據(jù)實施方案 17或?qū)嵤┓桨?8的綴合物，以及藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或佐劑。20.根據(jù)實施方案1-18中任一項的寡核苷酸或綴合物，其用作藥物。21.根據(jù)實施方案1-18中任一項的寡核苷酸或綴合物在制備用于治療異常水平 的β-聯(lián)蛋白或需要(indicated) β-聯(lián)蛋白表達(dá)的下調(diào)的疾病或癥狀的藥物中的用途。22.根據(jù)實施方案21的用途，其中所述疾病或癥狀為癌癥。23.治療患有癌癥的患者的方法，該方法包括向需要的患者給藥根據(jù)實施方案 1-19中任一項的藥物組合物、寡核苷酸或綴合物的步驟。24.實施方案21-23中任一項的用途或方法，其中所述癌癥選自結(jié)腸直腸癌、肝細(xì) 胞癌、子宮內(nèi)膜癌、惡性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂體癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、造血 系統(tǒng)癌、子宮頸癌、CNS癌、骨癌、膽道癌和腎上腺癌。25. β-聯(lián)蛋白基因中的靶序列，其中對應(yīng)于所述靶序列的反義寡核苷酸能下調(diào) β-聯(lián)蛋白的表達(dá)。26.實施方案25的靶序列，其中該靶序列選自與SEQ ID NOs 1_132互補(bǔ)的β-聯(lián) 蛋白基因或其等位變體的區(qū)域。27.下調(diào)細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白的表達(dá)的方法，包括將細(xì)胞與根據(jù)實施方案1-16中任 一項的寡核苷酸接觸。
實施例實施例1 單體合成該LNA單體構(gòu)件(building blocks)和衍生物按照公開的方法和其中引用的文獻(xiàn) 制備-參見W007/031081和其中引用的文獻(xiàn)。實施例2 寡核苷酸合成寡核苷酸根據(jù)描述于W007/031081的方法合成。表1顯示本發(fā)明的反義寡核苷酸 基序的實施例。實施例3 寡核苷酸的設(shè)計根據(jù)本發(fā)明，一系列寡核苷酸使用公開的序列(GenBank登記號NM_001904)設(shè)計 為靶向人β-聯(lián)蛋白的不同區(qū)域，所述序列在本文中為SEQID Ν0:173。表2顯示本發(fā)明的寡聚物設(shè)計。表3顯示24聚物(24mer)序列基序，從該基序可設(shè)計本發(fā)明的寡聚物_粗體表示如表1所示的16聚物(16mer)序列基序。
實施例4 體外模型細(xì)胞培養(yǎng)反義寡核苷酸對靶核酸表達(dá)的作用可以在多種細(xì)胞類型的任一種中測試，條件是 該靶核酸以可檢測的水平存在。靶可內(nèi)源性表達(dá)或通過對編碼所述核酸的核酸進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn) 染或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染而表達(dá)。靶核酸的表達(dá)水平可常規(guī)地使用，例如，RNA印跡分析、實時PCR、 核糖核酸酶保護(hù)測試而確定。為了例示，提供以下細(xì)胞類型，但可常規(guī)使用其它細(xì)胞類型， 條件是該靶在所選的細(xì)胞類型中表達(dá)。細(xì)胞如下所述在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并保持在37°C和95-98%濕度和5% CO2下。細(xì)胞每周常規(guī)傳代2-3次。SW480 將人結(jié)腸盲腸癌細(xì)胞株SW480在L_15培養(yǎng)基(Leibovitz)+10%胎牛血清 (FBS) +Glutamax 1+青霉素 / 鏈霉素(pen/strep)中培養(yǎng)。HCTl 16 將人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株HCTl 16在McCoy，s 5a改良培養(yǎng)基(Sigma)+10% 胎牛血清(FBS)+Glutamax 1+青霉素/鏈霉素中培養(yǎng)。實施例5 體外模型用反義寡核苷酸處理將細(xì)胞用寡核苷酸處理，使用陽離子脂質(zhì)體制劑LipofectAMINE 2000 (Gibco)作 為轉(zhuǎn)染載體。將細(xì)胞接種于6-孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC)并當(dāng)鋪滿75-90%時進(jìn)行處理。使用的 寡核苷酸濃度范圍為InM至25nM終濃度。寡核苷酸-脂質(zhì)復(fù)合物的配制基本上按照制造商 的說明進(jìn)行，其使用無血清OptiMEM(Gibco)且最終脂質(zhì)濃度為10 μ g/mL的LipofectAMINE 2000。將細(xì)胞在37°C培養(yǎng)4小時且通過去除含寡核苷酸的培養(yǎng)基終止處理。清洗細(xì)胞且添 加含血清的培養(yǎng)基。寡核苷酸處理后，使細(xì)胞恢復(fù)20小時，然后將其收集用于RNA分析。實施例6 體外模型RNA的提取和cDNA合成為從細(xì)胞株分離RNA，根據(jù)制造商提供的方案使用RNeasy小量試劑盒(Qiagen cat. no. 74104)。根據(jù)制造商的說明使用Ambion的逆轉(zhuǎn)錄酶試劑(Reverse Transcriptasereagents) iH^fT^I一Iil。對于每種樣品用無RNase的H2O將0. 5 μ g總RNA調(diào)節(jié)至(10. 8 μ 1)，并與2 μ 1十 堿基的隨機(jī)引物(random decamers) (50 μ Μ)和4 μ 1 dNTP混合物(2. 5mM每dNTP)混合， 且加熱至70°C保持3分鐘，然后將樣品在冰上快速冷卻。樣品在冰上冷卻后，將2μ1 IOx 緩沖液RT, 1 μ 1 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(100U/ μ 1)和0. 25 μ 1 RNase抑制劑(10U/ μ 1)添加至各 樣品中，然后在42°C培養(yǎng)60分鐘，在95°C將酶熱滅活10分鐘，然后將樣品冷卻至4°C。實施例7 體外模型通過實時PCR分析β -聯(lián)蛋白表達(dá)的寡核苷酸抑制β-聯(lián)蛋白表達(dá)的反義調(diào)節(jié)可在多種本領(lǐng)域已知的方式中測試。例如，β-聯(lián)蛋白 mRNA水平可通過例如，RNA印跡分析、競爭性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或?qū)崟rPCR定量。實 時定量的PCR目前是優(yōu)選的。RNA分析可對總細(xì)胞RNA或mRNA進(jìn)行。RNA分離的方法和 RNA分析方法如RNA印跡分析是本領(lǐng)域中常規(guī)的，且在例如John Wiley和Sons的Current Protocols inMolecular Biology 中教導(dǎo)。實時定量(PCR)可方便地使用可商購的獲自Applied Biosystem的Multi-Color 實時 PCR Detection System 而實現(xiàn)。β -聯(lián)蛋白mRNA水平的實時定量PCR分析人β-聯(lián)蛋白mRNA的樣品含量使用人β-聯(lián)蛋白ABI PrismPre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat. no. Hs00170025_ml)卞艮據(jù)制造商的說明定量。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA的量用作內(nèi)源性對照用于標(biāo)準(zhǔn)化樣品制劑中 的任何變量。人GAPDHmRNA的樣品含量使用人GAPDH ABI Prism Pre-DevelopedTaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat. no. 4310884E)根據(jù)制造商的說明定量。實時定量的PCR是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，且在例如Heid等人Realtimequantitative PCR, Genome Research (1996)，6 :986_994 帛。實時PCR將源自第一鏈合成的cDNA (按實施例8中的描述進(jìn)行)稀釋2_20倍，且通過實時 定量 PCR 使用 Applied Biosystems 的 Taqman 7500FAST 分析。將引物和探針與 2x Taqman Fast Universal PCR 主、混合物(master mix) (2x) (Applied Biosystems Cat. #4364103) 混合，并添加至4μ1 cDNA至最終體積為10ul。各樣品一式三份進(jìn)行分析。測試2倍稀釋 的cDNA得到該測試的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該cDNA從表達(dá)感興趣的RNA的細(xì)胞株純化的物質(zhì)制備。 使用無菌H2O代替cDNA用于無模板對照。PCR程序95°C保持30秒，然后進(jìn)行40個循環(huán)， 95°C，3 秒，60°C，30 秒。靴 mRNA 序列的相對量使用 AppliedBiosystems Fast System SDS Software Version 1. 3. 1. 21從計算的閾值循環(huán)確定。實施例8 體外分析通過寡核苷酸反義抑制人β -聯(lián)蛋白表達(dá)評估表2的寡核苷酸在SW480細(xì)胞中以濃度1、5和25ηΜ破壞β -聯(lián)蛋白mRNA的潛能(參見圖2)。數(shù)據(jù)以相對5nM的模擬品(mock)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的β-聯(lián)蛋白mRNA的下調(diào) 百分比示于表4。小寫字母表示DNA單元，粗體的大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元。所 有LNA C為5'甲基C。下標(biāo)“S”表示硫代磷酸酯連接。 如表4 所示，在這些實驗中 SEQ ID NOs :153、154、155、156、158、161、168、169、 170、171和172的寡核苷酸在5nM顯示對β -聯(lián)蛋白mRNA表達(dá)約74%或更大的抑制，因此是優(yōu)選的。同樣優(yōu)選的為基于所示反義寡序列的寡核苷酸，例如改變長度(更短或更長)和 /或核堿基含量(例如類似物單元的類型和/或比例)，其也提供對聯(lián)蛋白表達(dá)的良好 抑制。實施例9:體外分析蛋白質(zhì)印跡分析β-聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)水平在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中寡聚化合物對β-聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)水平的體外作用通過蛋白質(zhì)印 跡法測定。收集如實施例5所述用寡核苷酸轉(zhuǎn)染的200.000SW480細(xì)胞且在補(bǔ)充有蛋白酶抑 制劑混合物(Roche)的 RIPA裂解緩沖液(50mMTris_HCl pH7. 4,150mM NaCl, ImM EDTA, 1% Triton Χ-100,0. 1% SDS，1%脫氧膽酸鈉)中裂解。使用BCA蛋白質(zhì)測試試劑盒(Pierce) 測量總蛋白濃度。根據(jù)制造商的說明(Invitrogen)，將50 μ g總蛋白質(zhì)在3-8% Tris Acetate凝膠上進(jìn)行且印跡在PVDF膜上。在封閉緩沖液(補(bǔ)充有5%低脂奶粉的PBS-T) 中過夜溫育后，將膜與抗-β-聯(lián)蛋白抗體(BD Transduction實驗室)一起溫育過夜。作 為對照，負(fù)載微管蛋白使用Neomarker的單克隆抗體檢測。然后將膜與二抗一起溫育，且 β-聯(lián)蛋白或微管蛋白用化學(xué)發(fā)光ECL+檢測試劑盒(Amersham)顯像。參見圖3。實施例10 增殖的活細(xì)胞的測量(MTS測試)在轉(zhuǎn)染前一天將HCT116結(jié)腸直腸癌細(xì)胞以密度為200，000細(xì)胞/孔在McCoy，s 5a 改良的培養(yǎng)基(Sigma M8403) +2mM Glutamax I (Gibco35050_038)+10 % FBS (Brochrom#193575010) +25 μ g/ μ 1 Gentamicin (SigmaG1397 50mg/ml)中接種于 6 孔 板。第二天去除培養(yǎng)基,然后添加 1. 2ml 含 7. 5 μ g/ml LipofectAMINE2000 (Invitrogen) 的OptiMEM。將細(xì)胞溫育7分鐘然后添加0.3ml在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸。最終寡 核苷酸濃度為25nM。處理4小時后，去除培養(yǎng)基且將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并以5000細(xì)胞 / 孔的密度在 100μ1 McCoy，s 5a 改良的培養(yǎng)基(Sigma M8403) +2mM GlutamaxI (Gibco 35050-038)+10 % FBS(Brochrom#193575010)+25 μ g/μ IGentamicin(Sigma G1397 50mg/ ml)中接種于透明的96孔板(ScientificOrange no. 1472030100)。在添加10μ1四唑 鐺化合物[3-(4，5- 二甲基-2-基)-5-(3_羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2Η_四 唑鐺，內(nèi)鹽；MTS]和電子偶合試劑(吩嗪硫酸乙酯；PES) (CellTiter 96 AQueous One Solution CellProliferation Assay，Promega)所指示的時間測量活細(xì)胞?；罴?xì)胞在 Powerwave (Biotek Instruments)中在490nm測量。將0D490nm相對于時間/小時繪圖(參 見圖4)。實施例11 抑制小鼠肝中的β _聯(lián)蛋白mRNA連續(xù)三天在匪RI小鼠靜脈內(nèi)給藥25mg/kg寡核苷酸(SEQ ID NO :156，158，168， 169，171)(每組5只小鼠)。將反義寡核苷酸溶于0. 9%鹽水(NaCl)。最后一次給藥24小 時后將動物處死，且將肝組織取樣并儲存于RNA之后直到RNA提取和QPCR分析。提取總RNA 且通過QPCR按實施例7的描述測量肝樣品中的β -聯(lián)蛋白mRNA表達(dá)，其使用小鼠β -聯(lián)蛋 白 QPCR測試(cat. Mm00483033_ml，Applied Biosystems)。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為小鼠 GAPDH(cat. no. 4352339E，Applied Biosystems)，且相對鹽水處理的對照作圖，參見圖5。實施例12 =SEQ ID NO 161和聚乙二醇的綴合物的制備具有SEQ ID NO 161的寡聚物通過使用常規(guī)亞磷酰胺化學(xué)品(phosphoramidite chemistry)將氨基烷基連接至寡聚物的5’磷酸基從而在5’端官能化，該氨基烷基如具有阻斷基(如Fmoc)的己-1-胺，氧化所得化合物，將其脫保護(hù)且純化以得到官能化的式(I)
的寡聚物 其中SEQ ID NO 161中的粗體大寫字母和下標(biāo)“S”具有與上述相同的含義?；罨腜EG，如式(II)所示物質(zhì) 其中該PEG部分的平均分子量為12，000，和式(I)化合物在PBS緩沖液中的溶液 在室溫攪拌12小時。將該反應(yīng)溶液用二氯甲烷萃取三次且合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過 濾且溶劑在減壓下蒸發(fā)。將殘余物溶于雙蒸水并加載至離子交換柱上。未反應(yīng)的PEG連接 基用水洗脫且產(chǎn)物用NH4HCO3溶液洗脫。匯集含純產(chǎn)物的級分并凍干以得到式(III)的綴
合物 其中SEQ ID NO 161的寡聚物通過可釋放的連接基連接至平均分子量為12，000 的PEG聚合物。以下為SEQ ID NO 168和171的綴合物的實例
權(quán)利要求
長度為10-25個核堿基的寡聚物，其包括總共10-24個核堿基的連續(xù)核堿基序列，其中；i)所述連續(xù)核堿基序列與選自SEQ 192和SEQ ID NO89的序列的對應(yīng)區(qū)100％同源；或，ii)所述連續(xù)核堿基序列相對于選自SEQ192和SEQ ID NO 189的序列的對應(yīng)區(qū)包含不超過1個錯配。
2.長度為10-50個核堿基的寡聚物，其包含總共10-50個核堿基的連續(xù)核堿基序列，其 中所述連續(xù)核堿基序列與對應(yīng)于哺乳動物β-聯(lián)蛋白基因或mRNA JnSEQ ID NO 173或其 天然存在的變體的區(qū)域至少80%同源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的寡聚物，其中該連續(xù)核堿基序列與對應(yīng)于選自SEQID NOs 1-132和SEQ ID NOs 174-193的序列，如選自SEQ ID NO 189、192、58和103的序列的區(qū)域 至少80%同源。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的寡聚物，其中該連續(xù)核堿基序列不包含錯配或與SEQ ID NO 173的對應(yīng)區(qū)相比包含不超過1個或2個錯配。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的寡聚物，其中寡聚物的核堿基序列由連續(xù)核堿基序列 組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的寡聚物，其中該連續(xù)核堿基序列的長度為10-18個核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的寡聚物，其中該連續(xù)核堿基序列包含核苷酸類似物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的寡聚物，其中該核苷酸類似物為糖修飾的核苷酸，如選自以下 的糖修飾的核苷酸鎖核酸(LNA)單元；2’ -0-烷基-RNA單元、2’ -OMe-RNA單元、2’ -氨 基-DNA單元和2，-氟-DNA單元。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的寡聚物，其中該核苷酸類似物為LNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項的寡聚物，其為缺口聚物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的寡聚物，其抑制表達(dá)β-聯(lián)蛋白基因或mRNA的細(xì)胞 內(nèi)β-聯(lián)蛋白基因或mRNA的表達(dá)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的寡聚物，其中所述寡聚物選自SEQIDNO 133-174， 如 SEQ ID NO 168 和 SEQ ID NO 171。
13.綴合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的寡聚物，且至少一種非核苷酸或非 多核苷酸部分與所述寡聚物共價連接。
14.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的寡聚物，或根據(jù)權(quán)利要求13的 綴合物，和藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體、鹽或佐劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的寡聚物，或根據(jù)權(quán)利要求13的綴合物，其用作藥物， 如用于治療過度增生性疾病，如癌癥。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的寡聚物，或根據(jù)權(quán)利要求13的綴合物，在制備用于 治療過度增生性疾病，如癌癥的藥物中的用途。
17.治療過度增生性疾病，如癌癥的方法，所述方法包括向患有或可能患有過度增生性 疾病，如癌癥的患者給藥根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的寡聚物，或根據(jù)權(quán)利要求13的綴合 物，或根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物。
18.在表達(dá)β-聯(lián)蛋白的細(xì)胞內(nèi)抑制β-聯(lián)蛋白的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞給藥 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的寡聚物，或根據(jù)權(quán)利要求13的綴合物以抑制所述細(xì)胞內(nèi)的β-聯(lián)蛋白 。
全文摘要
本發(fā)明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其靶向細(xì)胞內(nèi)的β-聯(lián)蛋白mRNA，導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白的表達(dá)減少。β-聯(lián)蛋白表達(dá)的減少有利于一系列醫(yī)學(xué)疾病，如過度增生性疾病，包括癌癥。本發(fā)明提供包含寡聚物的治療組合物和使用所述寡聚物調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的表達(dá)的方法，包括治療方法。
文檔編號A61K31/7088GK101842483SQ200880022871
公開日2010年9月22日 申請日期2008年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月1日
發(fā)明者杰斯珀·沃姆 申請人:桑塔里斯制藥公司;安佐制藥股份有限公司