專利名稱：：抗Muc17抗體的制作方法
技術領域：
：本申請要求基于日本專利申請2007-176319(2007年7月4曰申請)的優(yōu)先權，將其內容作為參照引入本說明書。本發(fā)明涉及抗癌劑及癌癥的i貪斷方法。
背景技術：
：Mucl7是屬于膜型粘蛋白家族的新型粘蛋白，正常組織中的表達限于小腸、大腸[非專利文獻l]。胞外域的大部分，包含富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸的59mer的共有序列串聯重復，一般認為通過4妻受了糖鏈修飾的粘蛋白結構參與細胞防御。另外，細胞外具有SEA結構域，預測通過切割存在分泌型Muc17[非專利文獻l]。另外，有報道指出，不含跨膜結構域的分泌型Mucl7以剪接變體形式存在[非專利文獻2]。關于在癌中的表達，已經確認在胰腺癌細胞4朱AsPc-1、大腸癌林NCI-H498、Caco-2、LS174T中，Mucl7基因以RNA水平進行表達。另外，制作針對相當于串聯重復序列的Pro-Thr-Thr-Ala-Glu—Gly—Thr—Ser—Met—Pro—Thr—Ser—Thr—Pro—Ser—Glu(序列號38)的多克隆抗體，通過臨床胰腺癌組織的免疫染色，確認Mucl7以蛋白水平進行表達[非專利文獻2]。本說明書中引用的參考文獻如下所示。這些文獻中記載的內容全部作為參照引入本說明書。申請人認為這些文獻中的任意一篇都不構成本發(fā)明的現有技術。非專利文獻l:J.R.Gum，Jr.，S.C.Crawley,J.W.Hicks，D.E.Szymkowski，andY.S.Kim，MUC17,anovelmembrane-tetheredmucin.Biochem.Biophys.Res.Commun.，291(2002)466-75.非專利文豸失2:N.Nioniaux，W.M.Junker,A.P.Singh,A.M.Jones,andS.K.Batra，CharacterizationofhumanmucinMUC17.Completecodingsequenceandorganization.J.Biol,Chem.,281(2006)23676-85.
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種新型抗體及使用其的抗癌劑以及癌癥的i貪斷方法。本發(fā)明人等獲得了一種針對Mucl7胞外近膜區(qū)的單克隆抗體，發(fā)現此抗體顯示ADCC活性，具有通過與毒素綴合而產生的抗腫瘤效果。本發(fā)明4是供一種與Mucin17(Mucl7)結合的抗體。優(yōu)選本發(fā)明的抗體不與分泌型Mucl7結合。另外，優(yōu)選本發(fā)明的抗體與序列號3的肽(4176-4390)結合、且與序列號4的肽(4244-4390)及序列號5的肽(4115-4243)不結合。在優(yōu)選方案中，本發(fā)明的抗體具有ADCC活性。另外優(yōu)選本發(fā)明的抗體為嵌合抗體或人源化抗體。另外優(yōu)選本發(fā)明的抗體為低巖藻糖基化抗體。在其它的優(yōu)選方案中，本發(fā)明的抗體識別與具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體(MQ155)識別的抗原決定部位相同的抗原決定部位，所述重鏈可變區(qū)具有序列號23所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有序列號25所示的氨基酸序列。另外，本發(fā)明提供一種含有上述本發(fā)明的抗體的抗癌劑，優(yōu)選針對胰腺癌的抗癌劑。另外，本發(fā)明提供一種癌癥的診斷方法，其特征在于使用上述本發(fā)明的抗體，優(yōu)選使用不與分泌型Mucl7結合的抗體。圖l表示正常組織及癌細胞抹中的Mucl7mRNA量。圖2表示通過ELISA對嵌合抗Mucl7抗體的結合活性進行的評價。圖3表示利用流式細胞儀對嵌合抗Mucl7抗體的結合活性進行的評價。圖4表示由對胰腺癌細胞抹的抗Mucl7抗體產生的ADCC活性。圖5表示由使用Hum-ZAP的抗Mucl7抗體產生的抗腫瘤效果。圖6表示抗Mucl7抗體的抗原決定部位解析。具體實施方式Mucl7Mucl7(AccessionNo.NM—001040105)是包含4，493氨基酸的1型膜蛋白質。編碼Mucl7的基因序列如序列號l所示，Mucl7的氨基酸序列如序列號2所示。Mucl7屬于膜型的粘蛋白家族，胞外域的大部分包含富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸的59mer的串聯重復序列的重復單元，被糖鏈修飾。另外，由具有SEA結構域(4182Glu-4287Asn)預測出蛋白質斷裂，一般認為一部分可能以分泌蛋白形式存在。另夕卜，有報道指出存在分泌型的剪接變體(1Met-4241Arg為同一序列)(非專利文獻2)?？筂ucl7抗體本發(fā)明的抗Mucl7抗體只要與Mucl7結合即可，無論其來源(小鼠、大鼠、人、等)、種類(單克隆抗體、多克隆抗體)及形狀(改變抗體、低分子化抗體、修飾抗體、等)等如何。本發(fā)明中使用的抗Mucl7抗體優(yōu)選特異性地與Mucl7結合。另外，本發(fā)明中使用的抗Mucl7抗體優(yōu)選為單克隆抗體。本發(fā)明的抗Muc17抗體優(yōu)選識別并結合Muc17蛋白質的胞外域。Muc17蛋白質的胞外域相當于序列號1的氨基酸序列中的第1-4389個。更優(yōu)選本發(fā)明的Mucl7抗體為與Mucl7蛋白質的胞外域結合、且與分泌型Mucl7不結合的抗體。分泌型Mucl7相當于在序列號2的氨基酸序列中的第l-4241個。本發(fā)明的優(yōu)選方案中，抗Mucl7抗體為與包含序列號3的氨基酸序列的肽(4176-4390)結合、與包含序列號4的氨基酸序列的肽(4244-4390)及包含序列號5的氨基酸序列的肽(4115-4243)不結合的抗體?？贵w是否與目標的肽結合可以通過公知的方法測定(AntibodiesALaboratoryManual.EdHarlow，DavidLane，ColdSpringHarborLaboratory,1988)。例如，可以使用ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、EIA(酶免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或者熒光免疫法等。更具體而言，可以通過下述實施例記載的方法確認抗體是否與目標的肽結合。作為本發(fā)明的抗Muc17抗體的具體例，例如可以舉出以下抗體。(1)包含重鏈可變區(qū)的抗體(MQ128),所述重《連可變區(qū)具有包含序列號6所示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號7所示的氨基酸序列的CDR2及包含序列號8所示的氨基酸序列的CDR3;(2)包含輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號9所示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號10所示的氨基酸序列的CDR2及包含序列號11所示的氨基酸序列的CDR3;(3)包含(1)的重鏈可變區(qū)和(2)的輕鏈可變區(qū)的抗體；(4)包含重鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列號19所示的氨基酸序列；(5)包含輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含序列號21所示的氨基酸序列；(6)包含(4)的重鏈可變區(qū)和(5)的輕鏈可變區(qū)的抗體；(7)包含重鏈可變區(qū)的抗體(MQ155),所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號12所示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號13所示的氨基酸序列的CDR2及包含序列號14所示的氨基酸序列的CDR3;(8)包含輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號15所示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號16所示的氨基酸序列的6CDR2及包含序列號17所示的氨基酸序列的CDR3;(9)包含(7)的重鏈可變區(qū)和(8)的輕鏈可變區(qū)的抗體；(10)包含重鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含序列號23所示的氨基酸序列；(11)包含輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含序列號25所示的氨基酸序列；(12)包含(10)的重鏈可變區(qū)和(11)的輕鏈可變區(qū)的抗體；(13)識別與(1)至(12)任一項所述的抗體識別的抗原決定部位相同的抗原決定部位的抗體。被檢抗體與某抗體共有抗原決定部位，可以通過兩者對相同抗原決定部位的竟爭來確認?？贵w間的竟爭可以通過交叉阻斷測定(cross-blockingassay)等檢測。例如竟爭ELISA測定優(yōu)選為交叉阻斷測定(cross-blockingassay)。具體而言，在交叉阻斷測定中，在候選竟爭抗體存在下或不存在下將涂布在微量滴定板的孔上的Mucl7蛋白質預培養(yǎng)后，添加本發(fā)明的抗Mucl7抗體。與孔中的Muc17蛋白質結合的本發(fā)明的抗Muc17抗體的量，與對相同抗原決定部位的結合發(fā)生竟爭的候選竟爭抗體(被檢抗體)的結合能間接相關。即，被沖全抗體對同一抗原決定部位的親和性越大，本發(fā)明的抗Mucl7抗體對涂布了Mucl7蛋白質的孔的結合量越低，被檢抗體對涂布了Mucl7蛋白質的孔的結合量越高與孔結合的抗體量可以通過預先標記抗體而容易地測定d例如，生物素標記的抗體，可以通過使用親和素過氧化物酶綴合物和適當的基質進行測定。將利用過氧化物酶等酶標記的交叉阻斷測定特別地稱為竟爭ELISA測定?？贵w可以用能夠4全測或者測定的其它標記物進行標記。具體而言，公知的有放射標記或者熒光標記等。進而，當被檢抗體具有來自與本發(fā)明抗Muc17抗體不同的種的恒定區(qū)時，與孔結合的抗體的量也可以通過識別此抗體的恒定區(qū)的標記抗體進行測定。或者，為來自相同種的抗體，但類別不同時，通過識別各類別的抗體，可以測定與孔結合的抗體的量。7如果與在不存在候選竟爭抗體的條件下實施的對照試驗中得到的結合活性相比，候選抗體能夠以至少20%、優(yōu)選至少20-50%、更優(yōu)選至少50%阻斷抗Mucl7抗體結合，則該候選竟爭抗體是結合與本發(fā)明抗MUC17抗體實質相同的抗原決定部位的抗體、或者是對向相同的抗原決定部位的結合產生竟爭的抗體。本發(fā)明中，抗原決定部位可以為任意的抗原決定部位，可以舉出立體抗原決定部位、線狀抗原決定部位等。細胞毒性作為本發(fā)明的抗體的優(yōu)選方案，可以舉出具有細胞毒性的抗體。作為本發(fā)明中的細胞毒性，例如可以舉出依賴抗體的細胞介導細胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity:ADCC)、補體依賴'l"生纟田月包毒'l"生(complement—dependentcytotoxicity:CDC)等。本發(fā)明中，所謂CDC活性，是指由補體體系導致的細胞毒性。另一方面，所謂ADCC活性，是指在靶細胞的細胞表面抗原上附著特異性抗體時，存在Fcy受體的細力包(免疫細胞等)通過Fcy受體與其Fc部分結合，對靶細胞賦予毒性的活性。本發(fā)明中，可以通過乂/^知方法測定抗體是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活小生(例V,CurrentprotocolsinImmunology,Chapter7.Immunologicstudiesinhumans，Editor,JohnE，Coliganetal.,JohnWiley&Sons,Inc.,(1993)等)。具體而言，首先，配制效應細力包、補體;;容液、i巴細月包。(1)效應細力包的配制從CBA/N小鼠等中摘出脾臟，在RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)中分離脾臟細胞。用含有10%胎牛血清(FBS、HyClone公司制)的相同培養(yǎng)基清洗后，將細胞濃度配制成5x106/1111,由此可以配制效應細月包。(2)補體溶液的配制可以將BabyRabbitComplement(CEDARLANE公司制)用含有10。/。FBS的培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)稀釋10倍，配制補體溶液。(3)靶細胞的配制將表達Mucl7蛋白質的細胞與0.2mCi的51Cr-鉻酸鈉(GEHealthcareBiosciences公司制)一起在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中于37。C下培養(yǎng)1小時，由此可以將該靶細胞進行放射性標記。作為表達Muc17蛋白質的細胞，可以使用用編碼Muc17蛋白質的基因轉化的細胞、癌細胞(胰腺癌細胞、大腸癌細胞等)等。放射性標記后，將細胞用含有10。/。FBS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗3次，將細胞濃度配制成2xl()S/m1,可以配制該靶細胞。ADCC活性、或者CDC活性可以根據下述方法測定。測定ADCC活性時，在96孑LU底培養(yǎng)板(Becton,DickinsonandCompany制)中加入耙細胞和抗Mucl7抗體各50p1,在冰上使其反應15分鐘。然后，加入100iil效應細胞，在二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4小時。使抗體的最終濃度為0或10叫/ml。培養(yǎng)后，回收100nl的上清液，用y計數器(COBRAIIAUTO-GAMMA、MODELD5005、PackardInstrumentCompany公司制)測定放射活性。使用所得的值根據計算式(A-C)/(B-C)x100,計算細胞毒性(％)。A表示各試樣的放射活性(cpm),B表示力口入l%NP—40(nacalaitesque,^司制)的i式才羊的力丈射活性(cpm),C表示只含靶細胞的試樣的放射活性(cpm)。另一方面，測定CDC活性時，在96孔平底培養(yǎng)板(Becton,DickinsonandCompany命j)中力口入草巴纟田月包^^元Mucl7^元體各50ji1,在冰上使其反應15分鐘。然后，加入100^補體溶液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4小時。抗體的最終濃度為0或3(ig/ml。培養(yǎng)后，回收100(il的上清液，用y計數器測定放射活性。可以與ADCC活性測定相同地計算細胞毒性。糖鏈^奮飾抗體作為本發(fā)明的抗體的優(yōu)選方案，可以舉出被糖鏈修飾的抗體。已知通過修飾抗體的糖鏈能夠增強抗體的細胞毒性。作為被糖鏈修飾的抗體的例子，例如，可以舉出經糖基化修飾的抗體(WO99/54342等)、糖鏈中附加的巖藻糖缺失的抗體(WO00/61739、WO02/31140、WO2006/067847、WO2006/067913等)、具有含有截開型GlcNAc的糖鏈的抗體(WO02/79255等)等。作為本發(fā)明的優(yōu)選糖鏈修飾抗體，可以舉出巖藻糖缺失的抗體。的N-糖基結合糖鏈、和與抗體分子的絲氨酸或蘇氨酸的側鏈羥基結合的O-糖基結合糖鏈，本發(fā)明中，巖藻糖是否存在與N-糖基結合糖鏈相關。本發(fā)明中，所謂巖藻糖缺失的抗體，是指組合物中的抗體的N-糖基結合糖鏈中，20%以上、優(yōu)選50%以上、較優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選90%以上的N-糖基結合糖鏈中巖藻糖缺失。巖藻糖缺失的抗體可以通過本領域技術人員公知的方法制作，例如，可以通過在不具有附著a-1,6核心巖藻糖(a-1,6corefucose)的能力或此能力低的宿主細胞中使抗體表達，進行制造。不具有附著巖藻糖的能力或此能力低的宿主細胞沒有特殊的限定，例如，可以舉出大鼠骨髓瘤YB2/3HL.P2,Gil.16Ag.20細胞(簡稱YB2/0細胞)(以ATCCCRL1662保存)、FTVIII敲除CHO細胞(WO02/31140)、Lecl3細胞(WO03/035835)、巖藻^f唐轉運蛋白缺失細胞(WO2006/067847、WO2006/067913)等。糖鏈的解析可以采用本領域技術人員公知的方法進行。例如，使N-糖苷酶F(Roche)等作用于抗體，使糖鏈與抗體分離。然后，通過使用纖維素柱體的固相提取(ShimizuY.etal.,CarbohydrateResearch332(2001),381-388)進行除鹽后，濃縮干固，用2-氨基p比口定進4亍熒光才示"i己(KondoA.etal.,AgriculturalandBiologicalChemistry54:8(1990),2169-2170)。通過4吏用纖維素柱體的固相提取將所得的PA化糖鏈脫去試劑后，離心濃縮，形成純化PA化糖鏈。然后，進行利用ODS柱的反相HPLC分析，由此可以測定。另外，也可以在配制PA化糖鏈后，將利用ODS柱的反相HPLC分析及利用胺柱的正相HPLC分析組合進行二維作圖，由此進行測定。嵌合抗體及人源化抗體作為本發(fā)明的抗體的其它優(yōu)選方案，可以舉出嵌合抗體或人源化抗體。嵌合抗體是指來源不同的區(qū)域之間相互連接的抗體。一般的C區(qū)域構成。例如，包含小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)、和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體，為小鼠-人異種嵌合抗體。區(qū)i或(CDR:complementaritydeterminingregion)、禾口來自人#元體的構架區(qū)(FR:frameworkregion)及來自人抗體的C區(qū)構成。由于人源化抗體在人體內的抗原性低，所以作為本發(fā)明的治療劑的有效成分有用。人源化抗體也稱作重構(reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動物、例如小鼠抗體的CDR移植到人抗體中的人源化抗體等是公知的。用于得到人源化抗體的一般的基因重組方法也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法，例如公知重疊延伸PCR(OverlapExtensionPCR)。在重疊延伸PCR中，將編碼應移植的小鼠抗體CDR的堿基序列附著在用于合成人抗體FR的引物上。針對4個FR分別準備引物。一般情況下，在將小鼠CDR向人FR的移植中，選擇與小鼠FR同源性高的人FR有利于維持CDR功能。即，一般情況下優(yōu)選利用下述人FR，該人FR包含與應移植的小鼠CDR鄰接的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列。另外，連結的堿基序列被設計成框內相互連接。利用各個引物，分別地合成人FR。結果得到了編碼小鼠CDR的DNA附著在各FR上的產物。各產物的編碼小鼠CDR的堿基序列被設計成相互重疊。接下來，以人抗體基因作為模板合成產物，使該產物的重疊CDR部分相互退火，進行互補鏈合成反應。利用此反應，人FR通過小鼠CDR的序列連結。最終，3個CDR和4個FR連結的V區(qū)基因，通過在5，末端和3，末端退火且附著適當的限制酶識別序列的引物，將其全長擴增。將如上所述得到的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA插入表達載體中使其框內ii融合，由此可以制作人型抗體表達用載體。將該重組載體導入宿主，建立重組細胞后，培養(yǎng)該重組細胞，通過使編碼該人源化抗體的DNA表達，在該培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中產生該人源化抗體(參見歐州專利公開EP239400、國際公開W096/02576)。定性或者定量地測定、評價如上所述制作的人源化抗體與抗原的結合活性，由此能夠適當地選擇出在通過CDR連結時該CDR形成良好的抗原結合部位的人抗體FR。根據需要，也可以取代FR的氨基酸殘基使重構人抗體的CDR形成適當的抗原結合部位。例如，應用在將小鼠CDR向人FR中移植時使用的PCR法，能夠向FR中導入氨基酸序列的突變。具體而言，能夠向使FR退火的引物中導入部分的堿取代氨基酸的突變型抗體與抗原的結合活性采用上述方法進行測定、評價，由此能夠選擇具有所期望的性質的突變FR序列(Sato，K.etal.，CancerRes,1993，53，851-856)。二價抗體、低分子化抗體、修飾抗體本發(fā)明的抗Mucl7抗體只要與Mucl7蛋白質結合即可，不僅包括以IgG為代表的二價抗體，也包括一價抗體、或以IgM為代表的多價抗體。本發(fā)明的多價抗體中包括具有全部相同的抗原結合部位的多價抗體、或、具有部分或全部不同的抗原結合部位的多價抗體。另外，本發(fā)明的抗體不限于全長分子的抗體，只要與Mucl7蛋白質結合即可，也可以為低分子化抗體或其修飾物。低分子化抗體包括全長抗體(wholeantibody、例如wholeIgG等)的部分缺失的抗體片段。只要具有與Mucl7抗原的結合能力即可，允許抗體分子部分缺失。本發(fā)明的抗體片段優(yōu)選含有重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)中的任一個、或兩者。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、缺失、添加及/或者插入。并且只要具有與Muc17抗原的結合能力即可，也可以使VH及VL中的任一個或兩者的一部分缺失。另外，可變區(qū)也可以嵌合化或人源化。作為抗體片段的具體例，例如，可以舉出Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv等。另夕卜，作為低分子^1^元體的具體例，伊H口，可以舉出Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv(單鏈Fv)、雙鏈抗體(Diabody)、sc(Fv)2(單鏈(Fv)2)等。上述抗體的多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體、聚合物)也包含在本發(fā)明的低分子化抗體中?？贵w的片段可以通過用酶處理抗體使抗體片段生成而獲得。作為產生抗體片段的酶，例如公知木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、或者纖溶酶等?；蛘?，可以構筑編碼上述抗體片段的基因，將其導入表達載體后，使其在適當的宿主細胞中表達(例如，參見Co,M.S.etal.,J,Immunol,(1994)152,2968—2976、Better,M.&Honvitz,A.H.MethodsinEnzymology(1989)178,476-496、Plueckthun,A.&Skerra,A.MethodsinEnzymology(1989)178，476-496、Lamoyi,E.,MethodsinEnzymology(1989)121，652-663、Rousseaux,J.etal.，MethodsinEnzymology(1989)121,663-669、Bird,R.E.etal.,TIBTECH(1991)9,132-137)。雙鏈抗體是指通過基因融合構筑的二價(bivalent)的抗體片段(HolligerPetal.，Pro"Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)、EP404，097號、W093/U161號等)。雙鏈抗體是由2條多肽鏈構成的二聚體。通常，構成二聚體的多肽鏈分別在相同的鏈中VL及VH通過連接體結合。一般情況下，雙鏈抗體中的連接體在VL和VH不能相互結合的部位很短。具體而言，構成連接體的氨基酸殘基例如為5個殘基左右。因此，在同一多肽鏈上編碼的VL和VH,不能形成單鏈可變區(qū)片段，與其它單鏈可變區(qū)片段形成二聚體。結果雙鏈抗體具有2個抗原結合部位。scFv通過將抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)連結而得到。scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)通過連接體、優(yōu)選通過肽連接體連結(Huston,J.S.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,1988，85，5879-5883.)。scFv中的H鏈V區(qū)及L鏈V區(qū)雖然在本說明書中記載為抗體，但也可以來自任意的抗體。連結V區(qū)的肽連接體，沒有特殊的限制。例如可以使用包含3至25個殘基左右的任意的單鏈肽作為連接體。13sc(Fv)子化抗體(Hudsonetal、JImmunol.Methods1999;231:177-189)。sc(Fv)2可以通過例如將scFv用連接體連4妄來制作。并且，本發(fā)明的抗體也可以以與聚乙二醇(PEG)或細胞毒性物質等各種分子結合的抗體修飾物的形式使用。上述抗體修飾物可以通過對本發(fā)明的抗體實施化學修飾而得到?？贵w的修飾方法在本領域中已經確立。作為與本發(fā)明的抗體結合的細胞毒性物質，可以舉出毒素、放射性物質、化療劑(chemotherapeuticagents)等。細胞毒性物質包括在生物體內變?yōu)榛钚缘募毎拘晕镔|的前體藥物。前體藥物的活性4匕可以為酶轉^f匕(enzymaticconversion)，也可以為非酶壽爭4b(non-enzymaticconversion)。本發(fā)明中,所謂毒素,是指來自微生物、動物或者植物的顯示細胞毒性的多種蛋白質或多肽等。另外，本發(fā)明中所謂放射性物質是指含有放射性同位素的物質。放射性同位素沒有特殊的限定，可以使用任意的放射性同位素。另外，本發(fā)明中所謂化療劑是指除上述毒素、放射性物質以外的具有細胞毒性的物質?；焺┌毎蜃印⒖鼓[瘤劑、酶等。并且，本發(fā)明的抗體也可以為雙特異性抗體(bispecificantibody)。所謂雙特異性抗體，是指在同一抗體分子內具有識別不同抗原決定部位的可變區(qū)的抗體，該抗原決定部位可以存在于不同的分子中、也可以存在于同一分子中。即，在本發(fā)明中，雙特異性抗體可以具有識別Mucl7蛋白質上的不同抗原決定部位的抗原結合部位。上述雙特異性抗體中，相對于l分子的Muc17,可以結合2分子的抗體分子。結果能夠期待更強的細胞毒性。本發(fā)明中的"抗體"也包i舌上述抗體。另外，在本發(fā)明中，也可以包含識別Mucl7以外的抗原的雙特異性抗體。例如，可以包含識別與Mucl7不同的抗原的雙特異性抗體，所述抗原是與Mucl7相同地在靶癌細胞的細胞表面特異性表達的抗原。用于制造雙特異性抗體的方法是公知的。例如，使識別抗原不同的2種抗體結合，可以制作雙特異性抗體。結合的抗體可以分別為具有H鏈和L鏈的1/2分子、也可以為僅具有H鏈的1/4分子?；蛘撸部梢允巩a生不同的單克隆抗體的雜交瘤融合，制作產生雙特異性抗體的融合細胞。并且，可以利用基因工程學方法制作雙特異性抗體。抗體的制造方法
技術領域：
：本發(fā)明的抗Muc17抗體可以采用公知的方法獲得。作為本發(fā)明的抗Mucl7抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體，包括由雜交瘤產生的單克隆抗體、以及由宿主產生的單克隆抗體等，所述宿主采用基因工程學方法用含有抗體基因的表達載體進行了轉化。產生單克隆抗體的雜交瘤可以使用公知技術、例如如下所示地制作。首先，使用Mucl7蛋白質作為敏化抗原，按照通常的免疫方法將其免疫。采用通常的細胞融合法使從免疫動物中得到的免疫細胞與公知的親細胞融合，得到雜交瘤。進而，利用通常的篩選法，從此雜交瘤中篩選產生目標抗體的細胞，由此可以選擇出產生抗Muc17抗體的雜交瘤。具體而言，單克隆抗體的制作例如可以如下所示進行。首先，通過表達Mucl7基因，可以得到Mucl7蛋白質，用作獲得抗體的敏化抗原。人Muc17基因的石咸基序列被以GenBank注冊號NM—001040105(序列號l)等公開。即，將編碼Mucl7的基因序列插入公知的表達載體中，轉化適當的宿主細胞后，可以采用公知的方法從此宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中純化目標人Mucl7蛋白質。另外，純化的天然的Muc17蛋白質也可以同樣地使用?？梢酝ㄟ^組合或者單獨使用1次或者多次通常的離子層析或親和層析等多種層析法進行生成。另外，也可以如本發(fā)明中所用，將融合蛋白質用作免疫原，所述融合蛋白質是將Muc17蛋白質的所期望的部分多肽與不同的多肽融合得到的。為了制備為免疫原的融合蛋白質，例如可以使用抗體的Fc片段或肽15標記等。表達融合蛋白質的載體，可以通過使編碼所期望的二種或者二種以上的多肽片段的基因框內融合，并如上所述地將該融合基因插入表達載體中，進行制作。融合蛋白質的制作方法記載于MolecularCloning2nded.(Sambrook,J.etal.,MolecularCloning2nded.,9.47-9.58,ColdSpringHarborLab.Press，1989)。如上所示純化的Mucl7蛋白質可以用作對哺乳動物進行免疫時使用的敏化抗原。另外，Mucl7的部分肽也可以用作敏化抗原。例如，可以將如下所述的肽用作敏化抗原。通過化學合成由人Mucl7的氨基酸序列獲得的肽；通過將人Mucl7基因的一部分參入表達載體使其表達而獲得的肽；通過用蛋白質分解酶分解人Mucl7蛋白質而獲得的肽。作為部分肽使用的Muc17的區(qū)域及大小沒有限定。優(yōu)選區(qū)域可以選自構成Muc17的胞外域的氨基酸序列(序列號2的氨基酸序列中第1-4389)。構成形成敏化抗原的肽的氨基的數量優(yōu)選至少3以上、例如5以上、或者6以上。更具體而言，可以將8~50、優(yōu)選1030殘基的肽用作敏化抗原。用該敏化抗原免疫的哺乳動物沒有特殊的限定。為了通過細胞融合法得到單克隆抗體，考慮到與細胞融合中使用的親細胞的相容性，優(yōu)選選擇免疫動物。一般情況下，作為免疫動物優(yōu)選嚙齒動物。具體而言，可以將小鼠、大鼠、倉鼠、或者家兔用作免疫動物。此外，也可以將猴等用作免疫動物。上述動物可以-接照^^知的方法通過^:化抗原免疫。例如，作為一般的方法，可以通過腹腔內或皮下注射敏化抗原對哺乳動物進行免疫。具體而言，每隔4至21日向哺乳動物多次給與該敏化抗原。敏化抗原可以用PBS(Phosphate-BufferedSaline)或生理鹽水等以適當的稀釋倍率稀釋，用于免疫。并且，可以與佐劑一起給與敏化抗原。例如可以與弗式完全佐劑(Freund，scompleteadjuvant)混合、乳化，形成敏化抗原。另外，用敏化抗原免疫時可以使用適當的載體。特別是分子量小的部分肽用作敏化抗原的情況下，優(yōu)選使該敏化抗原肽與白蛋白、匙孑L血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin)等載體蛋白質結合進行免疫。如上所述將哺乳動物免疫，確認血清中的所期望的抗體量升高后，從哺乳動物中采取免疫細胞，進行細胞融合。作為免疫細胞，特別優(yōu)選使用脾細胞。作為與上述免疫細胞融合的細胞，使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞優(yōu)選具備用于篩選的適當的選擇標記。所謂選擇標記，是指在特定的培養(yǎng)條件下能夠生存(或者不能生存)的特性。選擇標記中公知有次黃嘌呤-鳥噤呤轉磷酸核糖激酶缺失(以下簡稱HGPRT缺失)、或者胸苷激酶缺失(以下簡稱TK缺失)等。HGPRT或TK缺失的細胞，具有次黃。票呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下簡稱HAT敏感性)。HAT敏感性的細胞在HAT選擇培養(yǎng)基中不能進行DNA合成，而死亡，但如果與正常的細胞融合，則可以利用正常細胞的補救途徑(salvagepathway)繼續(xù)DNA的合成，因此在HAT選擇培養(yǎng)基中也可以增殖。HGPRT缺失的細胞可以用含有6-巰基鳥噪呤、8-氮鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)的培養(yǎng)基進行選擇，而TK缺失的細胞可以用含有5，-溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基進行選擇。正常的細胞因將這些嘧啶類似物參入DNA中而死亡，但是缺失這些酶的細胞由于不參入上述嘧啶類似物，所以能夠在選擇培養(yǎng)基中生存。另外一個稱為G418耐性的選擇標記，由于存在新霉素耐性基因而賦予對2-脫氧鏈霉胺(2-deoxystreptamine)類抗生素(慶大霉素類似物)的耐性。7>知有多種適合細胞融合的骨髓瘤細胞。例如，可以使用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology(1978)81,1-7)，NS國l(Kohler,G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519),MPC-11(Margulies,D.H.etal.，Cell(1976)8,405-415),SP2/0(Shulman,M.etal.，Nature(1978)276，269-270)，FO(deSt.Groth,S.F.etal.,J.Immunol.Methods(1980)35,1-21),S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323),R210(Galfre，G.etal.，Nature(1979)277，131-133)等之類的骨髓瘤細胞。上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合可以按照公知的方法、例^口Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G.andMilstein，C.、MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等進行。更具體而言，例如可以在細胞融合促進劑的存在下在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行上述細胞融合。作為融合促進劑，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等。進而，根據期望也可以加入二曱基亞砜等輔助劑來提高融合效率。免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設定。例如，優(yōu)選使免疫細胞為骨髓瘤細胞的1至10倍。作為上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如，可以使用適用于上述骨髓瘤細胞抹的增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、以及此類細胞培養(yǎng)中使用的常用培養(yǎng)液。并且，可以向培養(yǎng)液中加入胎牛血清(FCS)等血清補液(serumsupplement)。細胞融合是將規(guī)定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，混合預先加熱至37。C左右的PEG溶液，由此形成為目標的融合細胞(雜交瘤)。細胞融合法中，例如可以以通常30至60%(w/v)的濃度添加平均分子量1000至6000左右的PEG。接下來，添加上述舉出的適當的培養(yǎng)液，離心，除去上清，重復上述操作，由此除去在雜交瘤的培育中不優(yōu)選的細胞融合劑等。如上所述得到的雜交瘤，可以利用適合細胞融合中使用的骨髓瘤具有的選4奪標記的選4奪培養(yǎng)液進行選擇。例如HGPRT或TK缺失的細胞可以通過在HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤及胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來進行選擇。即，將HAT敏感性的骨髓瘤細胞用于細胞融合時，在HAT培養(yǎng)液中，可以選擇性地使成功地與正常細胞進行細胞融合的細胞增殖。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)繼續(xù)進行足以使目標雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的時間。具體而言，一般情況下，通過數日至數周的培養(yǎng)，可以選擇出目標雜交瘤。接下來，通過實施常用的有限稀釋法，可以進行產生目標抗體的雜交瘤的篩選及單克隆?；蛘撸部梢园凑諊H公開W003/104453所述的方法制作識別Muc17的抗體。目標抗體的篩選及單克隆優(yōu)選采用基于公知的抗原抗體反應的篩選方法實施。例如，使抗原與用聚苯乙烯等制成的小球或市售96孔微量滴定板等載體結合，與雜交瘤的培養(yǎng)上清液反應。接著，清洗載體后，使酶標記的二次抗體等反應。如果培養(yǎng)上清液中含有與敏化抗原反應的目標抗體，則二次抗體通過此抗體與載體結合。最終通過檢測與載體結合的二次抗體，能夠確定在培養(yǎng)上清液中是否存在目標抗體?？梢酝ㄟ^有限稀釋法等克隆產生具有抗原結合能力的所期望的抗體的雜交瘤。此時，作為抗原，可以優(yōu)選使用用于免疫的蛋白質以及實質相同的Mucl7蛋白質。例如包含Mucl7的胞外域、或者構成該區(qū)域的部分氨基酸序列的寡肽可以作為抗原使用。另外，除了用抗原對人以外的動物進行免疫由此得到上述雜交瘤的方法之外，也可以用抗原將人淋巴細胞敏化得到目標抗體。具體而言，首先在體外將人淋巴細胞用Mucl7蛋白質敏化。然后，使免疫敏化的淋巴細胞與適當的融合配偶體(fusionpartner)融合。融合配偶體可以使用例如來自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞(參見特公平l-59878號公報)。利用此方法得到的抗Mucl7抗體，是對Mucl7蛋白質具有結合活性的人抗體。并且，通過向具有人抗體基因的全部基因譜的轉基因動物給與作為抗原的Muc17蛋白質也可以得到抗Muc17人抗體。通過與適當的融合配偶體細胞融合或用EB病毒(Epstein-Barrvirus)感染等處理，可以使免疫動物的抗體生成細胞無限增殖化?？梢詮娜缟纤龅玫降臒o限增殖化細胞中分離出針對Muc17蛋白質的人抗體(參見國際公開W094/25585、W093/12227、W092/03918、W094/02602)。并且，通過對無限增殖化細胞進行克隆，也能夠克隆產生具有目標反應特異性的抗體的細胞。將轉基因動物作為免疫動物使用時，該動物的免疫系統將人Mucl7識別為異物。所以，能夠容易地得到針對人Mucl7的人抗體。如上所述制作的產生單克隆抗體的雜交瘤可以在常用的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。另外，該雜交瘤也可以在液氮中長期保存。另外，也已知有使用人抗體庫，通過淘選得到人抗體的技術。例如，將人抗體的V區(qū)作為單鏈抗體(scFv),通過噬菌體展示法使其在噬菌體的表面表達，能夠選擇與抗原結合的噬菌體。通過對選擇的噬菌體的基因進行解析，可以確定編碼與抗原結合的人抗體的V區(qū)的DNA序列。確定與抗原結合的scFv的DNA序列后，使該V區(qū)序列與所期望的人抗體C區(qū)的序列框內融合，然后，插入適當的表達載體，由此可以制作表達載體。通過將該表達栽體導入如上述舉出的優(yōu)選的表達細胞中，使編碼該人抗體的基因表達，由此可以獲取該人抗體。上述方法已經7>知(國際公開W092/01047，WO92/20791,W093/06213，W093/11236,W093/19172，W095/01438,W095/15388)。將該雜交瘤按照通常的方法進行培養(yǎng)，可以從其培養(yǎng)上清液中得到目標單克隆抗體?；蛘咭部梢詫㈦s交瘤給與與其具有相容性的哺乳動物使其增殖，從其腹水中得到單克隆抗體。前者的方法適于得到高純度的抗體。重組抗體本發(fā)明的抗體也可以是能夠利用由抗體生成細胞克隆得到的抗體基因制成的重組抗體。通過將克隆的抗體基因參入適當的載體、導入宿主，可以使抗體進行表達。用于抗體基因的分離、向載體的導入、以及宿主細胞轉化的方法已經確立(例如，參見Vandamme,A.M.etal.，Eur.J.Biochem.(1990)192,767-775)。例如，可以由產生抗Mucl7抗體的雜交瘤細力包，得到編碼抗Mucl7抗體的可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。為此，通常情況下首先乂人雜交瘤中沖是取總RNA。作為用于從細胞中提取mRNA的方法，例如，可以采用胍超離心法(Chirgwin，J.M.etal.,Biochemistry(1979)2018,5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.etal.，Anal.Biochem.(1987)162，156—159)等。提取得到的mRNA可以使用mRNAPurificationKit(GEHealthcareBiosciences制)等進行純化?；蛘撸袌錾弦蹭N售用于從細胞中直接提取總mRNA的試劑盒，如QuickPrepmRNAPurificationKit(GEHealthcareBiosciences制)等。使用如上所述的試劑盒，也能夠從雜交瘤中得到總mRNA。使用逆轉錄酶由所得的mRNA可以合成編石馬^t體V區(qū)的cDNA。cDNA可以利用AMVReverseTranscriptaseFirst-strandcDNASynthesisKit(生化學工業(yè)社制)等合成。另夕卜，為了cDNA的合成及擴增，可以采用5，-AmpliFINDERRACEKit(Clontech制)及使用PCR的5，-RACE法(Frohman,MA.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998-9002、Belyavsky,A.etal.，NucleicAcidsRes.(1989)17，2919-2932)。進而，在上述cDNA的合成過程中，可以在cDNA的兩末端導入下述的適當的限制酶切位點。從所得的PCR產物中純化目標cDNA片段，然后，與載體DNA連結。如上所述地制作重組載體，導入大腸菌等中，選擇菌落后，由形成了該菌落的大腸菌可以配制所期望的重組載體。接下來，可以通過公知方法、例如雙脫氧核糖核酸鏈終止法等確認該重組載體是否具有目標cDNA的堿基序列。為了得到編碼可變區(qū)的基因，也可以采用使用可變區(qū)基因擴增用引物的PCR法。首先，以提取得到的mRNA作為模板合成cDNA,得到cDNA庫。為了方便，在cDNA庫的合成中使用市售的試劑盒。實際上，只從少數的細胞中得到的mRNA極其微量，因此將其直接純化時收率低。所以，通常情況下在添加明確知道不含抗體基因的載體RNA后進行純化?；蛘撸谀軌蛱崛∫欢康腞NA的情況下，即使僅為抗體生成細胞的RNA也可以高效地提取。例如從10以上、或者30以上、優(yōu)選50以上的抗體生成細胞中提取RNA時，有時不需要添加載體RNA。21以所得的cDNA庫為模板，通過PCR法擴增抗體基因。用于通過PCR法擴增抗體基因的引物是公知的。例如，根據論文(J.Mol.Biol.(1991)222,581-597)等么、開的內容，可以"i殳計出乂、抗'體基因擴增用引物。上述引物隨免疫球蛋白的亞類不同而具有不同的堿基序列。所以，以亞類不明的cDNA庫作為模板時，進行PCR法需要考慮到所有的可能性。具體而言，例如為了獲取編碼人IgG的基因時，可以利用能夠擴增編碼yl~y5作為重鏈、K鏈和X鏈作為輕鏈的基因的引物。為了擴增IgG的可變區(qū)基因，一般情況下3，側的引物利用在與鉸鏈區(qū)相當的部分退火的引物。另一方面，5，側的引物可以利用適合各亞類的引物。由重鏈和輕鏈的各亞類的基因擴增用引物產生的PCR產物，分別形成獨立的基因庫。利用上述合成的基因庫，能夠重構包含重鏈和輕鏈的組合的免疫球蛋白。以重構的免疫球蛋白對MUC17的結合活性作為指標，能夠篩選出目標抗體。更優(yōu)選本發(fā)明的抗體與Mucl7的結合具有特異性。與Mucl7結合的抗體，例如可以如下所示地進行篩選。(1)步驟使包含V區(qū)的抗體與Mucl7接觸，所述V區(qū)被由雜交瘤得到的cDNA編碼；(2)步驟檢測Mucl7和抗體的結合；及(3)步驟選擇與Mucl7結合的抗體。檢測抗體和Mucl7的結合的方法是公知的。具體而言，使受試抗體與固定在載體上的Mucl7反應，然后，^吏識別抗體的標記抗體反應。在清洗后，如果檢測出載體上的標記抗體，則能夠證明該受試抗體與Mucl7結合。標記可以使用過氧化物酶或p-半乳糖苷酶等酶活性蛋白質、或者FITC等熒光物質。為了評價抗體的結合活性，也可以利用表達Mucl7的細胞的固定標本。作為以結合活性為指標的抗體的篩選方法，也可以采用利用噬菌體載體的淘選法。如上所述作為重鏈和輕鏈的亞類的基因庫獲取抗體基因時，利用噬菌體載體的篩選方法是有利的。編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因，通過用適當的連接體序列連結可以形成單鏈Fv(scFv)。如果將編碼scFv的基因插入噬菌體載體，則能夠得到在表面表達scFv的噬菌體。使此噬菌體與目標抗原接觸，回收與抗原結合的噬菌體時，能夠回收編碼具有目標結合活性的scFv的DNA。通過根據需要重復此操作，能夠將具有目標結合活性的scFv濃縮。得到編碼目標抗Mucl7抗體的V區(qū)的cDNA后，該cDNA一皮識別插入該cDNA兩末端的限制酶切位點的限制酶消化。優(yōu)選的限制酶識別、消化在構成抗體基因的堿基序列中出現的可能性低的堿基序列。進而，為了將消化片段的l個拷貝以準確的方向插入栽體中，優(yōu)選提供粘端的限制酶。通過將如上所述被消化的編碼抗Muc17抗體的V區(qū)的cDNA插入適當的表達載體中，可以得到抗體表達栽體。此時，通過使編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的基因、和編碼上述V區(qū)的基因框內融合，能夠得到嵌合抗體。此處，所謂嵌合抗體，是指恒定區(qū)和可變區(qū)的來源生物不同的產品。所以，除小鼠-人等異種嵌合抗體之外，人-人同種嵌合抗體也包含在本發(fā)明的嵌合抗體中。預先向具有恒定區(qū)的表達載體中插入上述V區(qū)基因，也可以構筑嵌合抗體表達載體。具體而言，例如，在保持編碼所期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達載體的5，側，可以配置消化上迷V區(qū)基因的限制酶的限制酶識別序列。將兩者用相同組合的限制酶消化，使其框內融合，由此構筑嵌合抗體表達載體。為了制造本發(fā)明的抗Mucl7抗體，可以將抗體基因參入表達載體使其在表達控制區(qū)的控制下進行表達。所謂用于表達抗體的表達控制區(qū)，例如包括增強子和啟動子。然后，通過用此表達載體轉化適當的宿主細胞，可以得到表達編碼抗Muc17抗體的DNA的重組細胞?？贵w基因表達時，編碼抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)的DNA可以分別參入不同的表達載體中。通過將參入H^連和I^連的載體在相同宿主細胞中同時轉化(co-tmnsfect),可以4吏具有H鏈和L鏈的抗體分子表達?；蛘撸部梢詫⒕幋aH鏈及L鏈的DNA參入單一表達載體，使宿主細胞轉化(參見國際公開W094/11523)。已經公知多種宿主和表達載體的組合用于將抗體基因暫時分離、導入適當的宿主制作抗體。上述表達體系均可以用于本發(fā)明。使用真核細胞作為宿主時，可以使用動物細胞、植物細胞、或者真菌細胞。具體而言，作為可以用于本發(fā)明的動物細胞，例如可以使用哺乳類細胞(CHO、COS、骨髓瘤、BHK(babyhamsterkidney)、Hela、Vero等)、兩棲動物類細胞(爪蟾卵母細胞(Xenopuslaevisoocytes)等)、昆蟲細胞(sf9、sf21、Tn5等)等?；蛘咦鳛橹参锛毎?，公知有由來自煙草(Nicotianatabacum)等煙草(Nicotiana)屬的細胞產生的抗體基因的表達體系。植物細胞的轉化可以利用進行了愈傷組織培養(yǎng)的細胞。進而，作為真菌細胞，可以〗吏用酵母(釀酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母菌(Saccharomyces)屬、曱酉享畢赤酵母(Pichiapastoris)等Pichia屬)、絲狀真菌(黑曲霉(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)屬)等?；蛘?，利用原核細胞的抗體基因的表達體系也是公知的。例如，使用細菌細胞時，本發(fā)明可以使用大腸桿菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。使用哺乳類細胞時，可以構筑表達載體，所述表達載體功能性地結合常用的有效啟動子、表達的抗體基因、其3，側下游的polyA信號。例如作為啟動子/增強子，可以舉出人巨細胞病毒立即早期啟動子/土曾強子(humancytomegalovirusimmediateearlypromoter/enhancer)。另外，除此之外作為在本發(fā)明的抗體的表達中可以4吏用的啟動子/增強子，可以舉出病毒啟動子/增強子、或者來自人延伸因子la(HEFlot)等哺乳類細胞的啟動子/增強子等。作為能夠利用啟動子/增強子的病毒，具體而言可以給出逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴腎病毒40(SV40)等。使用SV40啟動子/增強子時，可以利用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)。另外，HEFla啟動子/增強子按照Mizushima等的方法(NucleicAcidsRes.(1990)18,5322)可以容易地用于目標基因表達。大腸桿菌的情況下，功能性地結合常用的有效啟動子、用于抗體分泌的信號序列及表達的抗體基因，可以表達該基因。作為啟動子，例如可以舉出lacZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ啟動子時，可以采用Ward等的方法(Nature(1989)341,544-546;FASEBJ.(1992)6,2422-2427)?；蛘?，araB啟動子通過Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)可以用于目標基因的表達。作為用于抗體分泌的信號序列，在大腸菌的周質中產生時可以使用pe舊信號序列(Lei,S.P.etal.,J.Bacteriol.(1987)169，4379)。然后，將在周質中產生的抗體分離后，使用如尿素的鹽酸胍之類的蛋白質變性劑，由此改組(重折疊)抗體的結構使其具有所期望的結合活性。作為插入表達載體的復制起源，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復制起源。進而，為了在宿主細胞體系中擴增基因拷貝數，可以向表達載體中插入選擇標記。具體而言，可以使用氨基糖普轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥。票呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等選擇標記。將上述表達載體導入宿主細胞，將轉化的宿主細胞在體外或體內培養(yǎng)，產生目標抗體。宿主細胞的培養(yǎng)可以按照公知的方法進行。例如，作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清補液。如上所述表達、產生的抗體可以通過單獨使用或者適當地組合使用在通常的蛋白質的純化中采用的公知方法進行純化。例如，通過對A蛋白柱等親和柱、色譜柱、過濾、超濾、鹽析、透析等進行適當選一奪、組合，可以分離、純4匕抗體(AntibodiesALaboratoryManual.EdHarlow,DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,251988)。另外，重組型抗體的生成過程中，除了上述宿主細胞之外，也可以使用轉基因動物。即，由導入了編碼目標抗體的基因的動物可以得到該抗體。例如，抗體基因通過框內插入到編碼在乳汁中固有產生的蛋白質的基因的內部，構筑成融合基因。作為乳汁中分泌的蛋白質，例如，可以使用山羊p酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚中，將該注入胚導入雌性山羊中。由接受該胚的山羊生出轉基因山羊(或其子孫)，從該轉基因山羊產生的乳汁中能夠作為與乳汁蛋白質的融合蛋白質得到所期望的抗體。另外，為了使由轉基因山羊產生的含有所期望抗體的乳汁量增加，可以適當對轉基因山羊使用激素(Ebert，K.M.etal.，Bio/Technology(1994)12,699-702)。作為本發(fā)明的重組抗體的C區(qū)，可以使用來自動物抗體的C區(qū)。例如作為小鼠抗體的H鏈C區(qū)，可以使用Cyl、Cy2a、Cy2b、C"、C|i、C5、Cal、Ca2、Ce,作為L鏈C區(qū)可以使用Ck、CX。另夕卜，作為除小鼠抗體以外的動物抗體，可以使用大鼠、家兔、山羊、綿羊、駱駝、猴子等的動物抗體。上述序列是公知的。另外，為了改善抗體或其生成的穩(wěn)定性，可以對C區(qū)進行修飾。藥物組合物本發(fā)明揭—供一種含有上述抗Mucl7抗體作為有效成分的藥物組合物。另外，本發(fā)明涉及一種含有上述抗Mucl7抗體作為有效成分的抗癌劑。本發(fā)明的抗癌劑，優(yōu)選給與患有癌癥的對象或可能復發(fā)的對象。另外，本發(fā)明中，除了含有抗Mucl7抗體作為有效成分的抗癌劑之外，還提供了一種包含向治療對象給與抗Mucl7抗體的步驟的預防或治療癌癥的方法，或在抗癌劑的制造中抗Muc17抗體的應用。利用本發(fā)明的抗癌劑治療的癌癥的種類沒有特殊的限制，通常、為Mucl7蛋白質表達的癌癥，優(yōu)選為胰腺癌或大腸癌。本發(fā)明中，所謂"含有抗Mucl7抗體作為有效成分"，是指含有26抗MUC17抗體作為主要的活性成分，并不限制單克隆抗體的含有率。并且，本發(fā)明的藥物組合物、或者抗癌劑中，根據需要可以配合多種抗體。例如，通過制成多種抗Mucl7抗體的混合物，可能能夠增強對Mucl7表達細胞的細胞毒性?；蛘?，除抗Mucl7抗體之外，通過配合識別其它肺瘤相關抗原的抗體，也可以提高治療效果。另夕卜，也可以為含有抗Mucl7抗體和識別抗人IgG抗體等抗Mucl7抗體的抗體的藥物組合物。優(yōu)選毒素、放射性物質、化療劑等細胞毒性物質與識別抗人IgG抗體等抗Muc17抗體的抗體結合。本發(fā)明的藥物組合物、或者抗癌劑可以通過口服、非口服給藥中的任一種方式給與患者。優(yōu)選非口服給藥。作為相關的給藥方法，具體而言，可以舉出注射給藥、經鼻給藥、經肺給藥、經皮給藥等。作為注射給藥例，例如，可以通過靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等全身或局部地給與本發(fā)明的藥物組合物。另夕卜，可以根據患者的年齡、癥狀選擇適當的給藥方法。作為給藥量，例如，在每一次給藥每lkg體重為0.0001mg至1000mg的范圍內選擇給藥量?；蛘?，例如，在每位患者為0.001至100000mg/body的范圍內選擇給藥量。但是，本發(fā)明的藥物組合物并不限定于上述給藥量。本發(fā)明的藥物組合物可以按照常用方法進行制劑化(例如，Remington'sPharmaceuticalScience,Latestedition,MarkPublishingCompany,Easton，U.S.A)，也可以同時含有藥物中允許的載體或添加物。例如可以舉出表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐齊'J、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。并且，并不限定于此，可以適當地使用其它常用的載體。具體而言，作為載體可以舉出輕質無水硅酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、淀粉、羧甲基纖維素鈣、羧曱基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮乙醛二乙氨基乙酸酉旨(polyvinylacetaldiethylaminoacetate)、聚乙烯吡口各步克酮、明月交、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氬化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽類等。另外，本發(fā)明提供一種通過使Mucl7表達細胞和抗Mucl7抗體接觸來破壞Muc17表達細胞的方法或者抑制細胞增殖的方法。抗Muc17抗體如上所述?？筂ucl7抗體結合的細胞只要是Mucl7表達的細胞即可，沒有特別的限制。本發(fā)明的優(yōu)選Mucl7表達細胞為癌細胞。作為優(yōu)選的癌細胞可以舉出胰腺癌細胞或大腸癌細胞等。本發(fā)明中，"接觸"可以在體外進行，也可以在體內進行。例如，通過向在試驗管內培養(yǎng)的Mucl7表達細胞的培養(yǎng)液中添加抗體進行接觸。在此情況下，作為添加的抗體的形狀，可以適當地使用溶液或者通過凍結干燥等得到的固體等形狀。在以水溶液形式添加時，可以是單純地僅含抗體的水溶液，也可以是含有例如如上所述的表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等的溶液。添加的濃度沒有特殊的限制，但作為培養(yǎng)液中的最終濃度，優(yōu)選為lpg/ml至lg/ml的范圍，較優(yōu)選為lng/ml至lmg/ml，更優(yōu)選為l(ig/ml至lmg/ml。另外，在本發(fā)明中，"接觸"在其它方案中還可以如下進行，即，給與將Mucl7表達細胞移植到體內的非人動物、或內在地具有表達Mucl7的癌細胞的動物。給藥方法可以通過口服、非口服給藥中的任意一種實施。特別優(yōu)選為通過非口服給與的給藥方法，作為相關的給藥方法，具體而言，可以舉出注射給藥、經鼻給藥、經肺給藥、經皮給藥等。作為注射給藥的例子，例如，可以通過靜脈內注射、筋肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等全身或局部地給與本發(fā)明的藥物組合物細胞增殖抑制劑及抗癌劑。另外，可以根據受試動物的年齡、癥狀選擇適當的給藥方法。以水溶液形式給藥時，可以為單純地僅含有抗體的水溶液，也可以是例如含有如上所述的表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等的溶液。作為給藥量，例如，可以在每次給藥每lkg體重0.0001mg至1000mg的范圍內選一奪給藥量?；蛘?，例如，在每位患者為0.001至100000mg/body的范圍內選擇給藥量。但是，本發(fā)明的抗體給藥量并不限定于上述給藥量。診斷方法進而，本發(fā)明纟是供一種^f吏用抗Mucl7抗體的癌癥的"^斷方法。利用本發(fā)明的方法診斷的癌癥只要表達Mucl7即可，沒有特殊的限制，但優(yōu)選為胰腺癌或大腸癌。本發(fā)明的診斷方法可以在體外進行，也可以在體內進行，4旦優(yōu)選在體外進行。4吏用本發(fā)明的抗Mucl7抗體的癌癥的診斷方法，例如，為包含如下步驟的方法。(a)步驟，提供從受試者采取的試樣；(b)步驟，檢測(a)的試樣中所含的Mucl7蛋白質。在本發(fā)明中，所謂檢測，包括定量的或定性的檢測。定性的檢測，包括例如是否存在Mucl7蛋白質的測定、Mucl7蛋白質是否存在一定量以上的測定、將Mucl7蛋白質的量與其它試樣(例如，對照試樣等)比較的測定等。定量的檢測，包括例如Mucl7蛋白質的濃度的測定、Mucl7蛋白質的量的測定等。本發(fā)明的被檢試樣只要是可能含有Mucl7蛋白質的試樣即可，沒有特殊的限制。具體而言，優(yōu)選從哺乳類等生物的身體采取的試樣。更優(yōu)選試樣為從人體采取的試樣。作為被檢試樣的具體例，例如，可以舉出血液、間質液(interstitialfluid)、血漿、血管夕卜液、月S脊液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿、組織等。優(yōu)選的試樣是由從生物的身體采取的組織或細胞固定化的標本或者細胞培養(yǎng)液等被檢試樣得到的試樣。Muc17蛋白質的檢測可以通過本領域技術人員公知的方法進行，例如，可以通過》文射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)、熒光免疫測定(FIA)、發(fā)光免疫測定(LIA)、免疫沉淀法(IP)、免疫比濁法(TIA)、蛋白質印跡法(WB)、免疫組織化學(IHC)法、免疫擴散法(SRID)等進行。為參考引用本說明書。實施例以下，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。實施例l.使用Real-timePCR的mucinl7(Mucl7)的mRNA表達解析胰腺癌細胞才朱AsPcl、Panel、Capanl、BxPC3細月包購自ATCC。按照隨附資料所示的條件進行培養(yǎng)，回收與lxlO相當的細胞，使用Trizol(InvitrogerH^司)配制totalRNA。乂寸ljag的totalRNA進行DNaseI(Invitrogen公司)處理后，使用SuperscriptIIIFirstStrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen公司)，以oligo(dT)為引物，合成cDNA。對于表l所示的各種正常組織totalRNA,也采用相同的方法合成cDNA。使用上述所得物，通過使用SYBRGreenI的嵌入法(intercalationmethod)進行Real-timePCR。即,以來自相當于3.3ng的totalRNA的cDNA為模板，對含有SYBR(注冊商標)PremixExTaq(Takara社)、正義引物(序列號30)、反義引物(序列號31)的20pl反應液進行33次包含95。C下5秒、60。C下30秒的循環(huán)。以將預先純化的PCR產物為模板的樣品為基礎，制作標準曲線，由此定量值換算樣品的cDNA量。如圖l所示，Mucl7的mRNA在為胰腺癌抹的AsPcl內顯示高值，正常組織中的表達限于小腸內。[表l]表l.Mucl7基因表達解析中使用的組織<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例2.抗Muc17抗體的制作2-1.編碼人Mucl7部分序列的cDNA的克隆Mucl7(AccessionNo.NM—001040105)是包含4，493個氨基酸的l型膜蛋白質(序列號1及2)。Mucl7屬于膜型的粘蛋白家族，胞外域的大部分包含富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸的59mer的串聯重復序列的重復單元，被糖鏈修飾。另外，根據具有SEA結構域(4182Glu-4287Asn)推測蛋白質被切斷，一部分可能以分泌蛋白形成存在。另外，有報道指出存在分泌型的剪接變體(1Met-4241Arg為相同序列)(Maniaux等、J.Biol.Chem.(2006)281,23676-23685)。一般認為對Mucl7具有特異性且與分泌型Mucl7不結合的抗體有可能是胰腺癌的新型治療藥，并著手制作抗Muc17抗體。為了制作在Mucl7的胞外域(lMet-4389Ser)中與Mucl7特異性高的針對C末端部分序歹'J(Mucl7ct,4115Thr-4390Leu)的抗體，克隆該序列。即，以AsPcl的cDNA為模板，將包含在5，端添加了EcoRI識別序列、小鼠抗體的信號序列的正義引物(序列號32)、添加了CpoI識別序列的反義引物(序列號33)、10xKOD-Plus緩沖液、2mMdNTPs、25mMMgS04、KOD-Plus(Takara公司制)的反應液進行5次包含在98。C下10秒、72。C下5秒、68。C下4分鐘的循環(huán)，進行5次包含在98。C下10秒、7(TC下5秒、68。C下4分鐘的循環(huán)，進行25次包含在98。C下10秒、68。C下4分鐘的循環(huán)。經PCR反應生成的擴增產物使用pGEM-TEasyVectorSystemI(Promega公司)插入pGEM-Teasy中。序列通過ABI3730DNAAnalyzer進行確認。2-2.可溶型人Mucl7ct/小鼠IgG2aFc融合蛋白的制作克隆到pGEM-Teasy載體中的Muc17ct基因被EcoRI、Cpol消化，克隆到pMCDN—mlgG2aFc中。pMCDN—mlgG2aFc來自作為哺乳細胞用表達載體的pMCDN,在小鼠CMV啟動子(AccessionNo.U68299)下可以誘導表達，參入新霉素耐性基因、DHFR基因。pMCDN—mlgG2aFc中，小鼠H鏈IgG2a的鉸鏈以下的Fc序列插入pMCDN載體的EcoRI,Notl識別部位，Mucl7ct和mlgG2aFc序列通過CpoI識別序列連結。序列號34表示的序列表示Mucl7ct—mlgG2aFc的堿基序列，序列號35表示的序列表示Mucl7ct—mlgG2aFc的氨基酸序列。采用電穿孔法將pMCDN/Mucl7ct—mlgG2aFc導入DG44細胞(Invitrogen乂^司)中，用500(ig/mLGeneticin進4亍選才奪，由jt匕石角立Mucl7ct—mlgG2aFc連續(xù)表達CHO細胞。大量培養(yǎng)連續(xù)表達細胞，由培養(yǎng)上清液純化Mucl7ct—mlgG2aFc蛋白。將培養(yǎng)上清液填充到HiTraprProteinA(GE社制)柱中，用結合緩沖液(20mM磷酸鈉(pH7.0))清洗后，用洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸-HC1(pH2.7))洗脫。洗脫液通過直接轉移到加入中和緩沖液(1MTris-HC1(pH9.0))的試管中來進行中和。然后，利用Superdex200HR26/60(GE公司)進行凝膠過濾，置換為PBS。純化蛋白的定量使用DCproteinassay(BIO-RAD公司)，以添加的牛IgG為標準進行換算。2-3.抗Mucl7抗體的制作32使用Balb/c小鼠、或者MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr小鼠(以下、MP、L/lpr小鼠、購自日本CharlesP、iver)作為免疫動物。從6周齡開始免疫，初此免疫時配制Mucl7ct—mlgG2aFc使其為100pg/head，使用弗式完全佐齊'J(FCA、Becton,DickinsonandCompany)乳化，將其皮下給藥。2周后，將配制為50嗎/head的抗體用弗式不完全佐劑(FIA、Becton，DickinsonandCompany)享W匕，并一尋其通過皮下給藥。以后每間隔1周進行2至5次追加免疫。最終免疫的4日后，摘出脾臟細胞，與小鼠骨髓瘤細胞P3-X63Ag8Ul(P3U1,購自ATCC)以2l進行混合，通過緩緩地力口入PEG1500(RocheDiagnostics公司)進行細胞融合。小心地加入RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCOBRL公司)，稀釋PEG1500，進行離心操作，由此除去PEG1500,然后，懸浮在含有10。/oFBS的RPMI1640中，將其以100(JL/well播種到96孔培養(yǎng)板中。第二天，添加含有10。/。FBS、1xHATmediasupplement(SIGMA公司)、0.5xBM-CondimedHIHybridomacloningsupplement(RocheDiagnostics公司)的RPMI1640(以下稱為HAT培養(yǎng)基)使其為100piL/we11。2、3日后，將一半的培養(yǎng)液置換為HAT培養(yǎng)基，7日后使用培養(yǎng)上清液進行篩選。通過將Mucl7ct—mlgG2aFc固相化的ELISA進行篩選。利用有限稀釋法將陽性克隆單克隆化。通過將不含Muc17ct序列的對照Fc融合蛋白質固相化的ELISA進行評價，由此確立與Mucl7特異性結合的抗體(MQ016、MQ128、MQ155、MQ169)?？贵w的同種型使用Isostrip(Roche公司制)確定，均為IgGlkappa?？贵w的純化如下進行在將FBS(UltralowIgG)(GIBCOBRL公司)用作血清的HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤，與上述相同地使用HiTrapProteinGHP由該雜交瘤的培養(yǎng)上清液純化抗體。使用PD-10柱(Amersham公司)將洗脫成分的緩沖液置換為PBS后，在4。C下保存。純化抗體的定量使用DCproteinassay(BIO-RAD公司)，以隨附的牛IgG為標準進行換算實施例3.抗Mucl7抗體可變區(qū)基因序列的確定針于MQ128及MQ155,確定抗體可變區(qū)基因的序列。TotalRNA使用RNeasyPlantMiniKits(QIAGEN公司)從l乂107細胞的雜交瘤中提取。使用ling的TotalRNA,利用SMARTRACEcDNAAmplificationKit(CLONTECH公司)、與小鼠IgGl恒定區(qū)序列相補的合成寡核苷酸MHC-IgG1(序列號36)或與小鼠K鏈恒定區(qū)堿基序列相補的合成寡核苷酸kappa(序列號37)，擴增5，末端側基因片段。逆轉錄反應在42。C下反應1小時30分種。50(iLPCR溶液包含5^iL的10xAclvantage2PCR緩沖液、5(^L的lOxUniversalPrimerAMix、0.2mMdNTPs(dATP，dGTP,dCTP,dTTP)、1iaL的Advantage2PolymeraseMix(以上，CLONTECH公司制)、2.5^L的逆轉錄反應產物、10pmole的合成寡核苷酸MHC-IgGl或kappa，該PCR溶液在94。C的初期溫度下反應30秒，接下來將在94。C下反應5秒、72。C下反應3分鐘的循環(huán)重復5次，將在94。C下反應5秒、70。C下反應10秒、72。C下反應3分鐘的循環(huán)重復5次，進而，將在94。C下反應5秒、68。C下反應10秒、72。C下反應3分鐘的循環(huán)重復25次。最后，將反應產物在72。C下加熱7分鐘。各PCR產物使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN公司制)，從瓊脂糖凝膠純化后，克隆到pGEM-TEasy載體中，確定石咸基序列。MQ128的H鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號18所示，氨基酸序列如序列號19所示，L鏈可變區(qū)的i咸基序列如序列號20所示，氨基酸序列如序列號21所示。MQ155的H鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號22所示，氨基酸序列如序列號23所示，L鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號24所示，氨基酸序列如序列號25所示。實施例4.抗Mucl7小鼠-人嵌合抗體的制作將各抗體的H鏈及L鏈可變區(qū)序列與人H鏈及人L鏈恒定區(qū)序列連結。對于H鏈，使用與可變區(qū)的5，末端側堿基序列相補、且具有Kozak序列、Hindm部位的合成寡核苷酸、及具有NheI部位且與3，末端側堿基序列相補的合成寡核苷酸，進行PCR。對于L鏈，使用與可變區(qū)的5，末端側堿基序列相補且具有Kozak序列、BamHI部位的合成寡核香酸、及具有BsiWI部位且與3，末端側;成基序列相補的合成寡核苷酸，進行PCR。在抗體表達質粒pMCDN-Glk中克隆所得PCR產物。pMCDN—Glk具有如下結構在pMCDN載體中克隆人IgGl恒定區(qū)，小鼠H鏈可變區(qū)和人H鏈(yl鏈)恒定區(qū)通過NheI部位連結。另外，其還具有下述結構插入另外的含有小鼠CMV啟動子的表達單元、及人K鏈恒定區(qū)，小鼠L鏈可變區(qū)和人L鏈(K鏈)恒定區(qū)通過BsiWI部位連結。該質粒在動物細胞內表達新霉素耐性基因、DHFR基因、抗Mucl7小鼠-人嵌合化抗體基因。嵌合化MQ155的H鏈的堿基序列如序列號26所示，氨基酸序列如序列號27所示，嵌合化MQ155的L鏈的堿基序列如序列號28所示，氨基酸序列如序列號29所示。通過電穿孔將pMCDN—G1k—MQ128、pMCDN_G1k—MQ155導入DG44細胞中。通過用500pg/mLGeneticin進行選擇，確立抗Mucl7嵌合抗體連續(xù)表達CHO細胞。然后，使用HiTraprProteinA柱從培養(yǎng)上清液中純化。使用PD-IO柱將緩沖液置換為PBS,通過DCProteinAssay將純化抗體(chi.MQ128(DG)、chi.MQ155(DG))定量，在4。C下保存。實施例5.低巖藻糖抗Mucl7小鼠-人嵌合抗體的制作作為增強抗體的ADCC活性的方法，已知有改變抗體的糖鏈的方法。例如，WO99/54342中公開了通過進行抗體糖基化來改良ADCC活性。另外，WO00/61739中公開了通過抗體的糖鏈中是否存在巖藻糖來調節(jié)ADCC活性。WO02/31140中公開了通過在YB2/0纟田月包中產生抗體，配制具有不含a-1，6核心巖藻糖的糖鏈的抗體。WO2005/017155中，記載有關于敲除了巖藻糖轉運蛋白基因的CHO細胞(CHO—FTKO)的實施例，通過使用同樣的方法可能產生具有不含a-1，6核心巖藻糖的糖鏈的抗體。通過電穿孔法將上述構筑的抗Mucl7小鼠-人嵌合抗體表達質粒導入CHO—FTKO細胞(WO2005/017155)中，用500|ig/mLGeneticin進行選4奪，由此確立抗Muc17嵌合抗體連續(xù)表達CHO—FTKO細胞。然后，使用HiTraprProteinA柱從培養(yǎng)上清液中純化。使用PD35-IO柱將緩沖液置換為PBS,通過DCProteinAssay對純化抗體(chi.MQ128(FTKO)、chi.MQ155(FTKO))進行定量，在4。C下保存。實施例6.通過ELISA對抗Muc17抗體的結合活性的評價將Mucl7ct—mlgG2aFc蛋白質用包被緩沖液(coatingbuffer)(0.1mol/LNaHCO3(pH9.6),0.02%(w/v)NaN3)稀釋成l)ag/mL,加入酶標板(immunoplate)中，在4。C下放置一晚，進行包被(coating)。用稀釋緩沖液(50mMTris-HCl(pH8.1)，ImMMgCl2,150mMNaCl，0.05%(v/v)Tween20,0.02%(w/v)NaN3,1%(w/v)BSA)進行阻斷處理后，加入抗Mucl7抗體，在室溫下放置1小時。用漂洗緩沖液(Rinsebuffer)(0.05%(v/v)Tween20，PBS)清洗后，加入堿性磷酸酶標記的抗人K鏈抗體(Sigma公司、CAT#A3813),在室溫下放置l小時。用漂洗緩沖液清洗后，加入用基質緩沖液(50mMNaHCO3(pH9.8)，10mMMgCl2)稀釋成1mg/mL的SIGMA104(Sigma公司)，在室溫下使其顯色l小時，然后，使用BenchmarkPlus(BIO-RAD公司)測定吸光度(405nm，參照655nm)。如圖2所示chi.MQ128、chi.MQ155相對于Mucl7ct—mlgG2aFc顯示出濃度依賴性的較強的結合活性。由對照的Fc融合蛋白未顯示結合活性可以判定其與Mucl7特異性結合。實施例7.通過流式細胞儀進行抗Mucl7抗體的結合活性的評價通過流式細胞4義評價對胰腺癌細胞抹AsPcl的結合。將以5x105細月包/mL懸浮于FACS緩沖液(1%FBS/PBS)中的細胞分配至Multiscreen—HVFilterPlates(Millipore公司)中，通過離心操作除去上清液。加入稀釋至適當濃度的抗Mucl7抗體，在冰上4吏其反應30分鐘。用FACS緩沖液將細胞清洗1次，添加FITC標記抗人IgG抗體，在冰上使其反應30分鐘。反應后，通過離心除去上清液，懸浮在100pLFACS緩沖液中，用于流式細胞儀。流式細胞儀使用FACSCalibur(Becton，DickinsonandCompany)。用前向散射(forwardscatter)及側向散射(sidescatter)的柱狀圖在活細胞群中設門(gate)。如36圖3所示，chi.MQ128、chi.MQ155與AsPcl細胞牢固地結合。根據不與未表達Mucl7的HepG2細胞結合，推斷是與Mucl7特異性的結合。實驗例8.抗Mucl7抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的測定8-1)全長人CD16恒定表達細胞的確立將全長的人CD16(RefS叫ID、NM—000569)克隆到哺乳細胞表達用載體(pMCDN)中(pMCDN/CD16)。通過電穿孔法將pMCDN/CD16導入NK-92細胞(購自ATCC,CRL-2407),用500|ig/mlgeneticin進行選擇，確立了連續(xù)表達全長人CD16的NK-92細胞抹(CD16-NK92)。CD16-NK92細胞培養(yǎng)時使用a-MEM(AlphaMinimumEssentialMedium)(無核苷酸及脫氧核苷酸，含有L-谷氨酰胺)(Invitrogen公司)，所述a-MEM含有500jig/mlgeneticin、青霉素/鏈霉素(Invitrogen公司)、0.2mM肌醇(Sigma公司)、O.lmM2—疏基乙酉孚(InvitrogeiK^司)、0.02mM葉酸(Sigma乂/^司)、100U/ml重組人白細胞介素-2(Peprotech^〉司)、10%馬血清(Invitrogeiy^司)、10%月臺牛血5青(Invitrogen7^司)。8-2)抗Mucl7抗體的ADCC活性的測定向96孔平底培養(yǎng)板的各孔中各力口入50iul的8><104細胞/ml的AsPC-l細胞，在5。/。二氧化碳培養(yǎng)箱中于37。C下培養(yǎng)2天。向各孔中分別加入10iil溶液，所述溶液在含有10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(以下，稱為培養(yǎng)基。)中加入240(iCi/mlCr51(CodeNo.CJS4、GEHealthcareBiosciences公司)，繼續(xù)培養(yǎng)l小時。將各孔用30(V1培養(yǎng)基清洗后，添加100)il培養(yǎng)基。然后，加入抗Mucl7抗體或對照的人IgGl抗體(Cat.No.PHP010、Serotec公司)各50iaL。通過從10pg/ml開始以公比為10連續(xù)3階段稀釋來調節(jié)抗體的最終濃度。接著，各添加50jil以lxl(^細胞/ml懸浮在培養(yǎng)基中的CD16-NK92細胞。該培養(yǎng)板在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中于37。C下培養(yǎng)4小時后，用y計數器(1480WIZARD3"、Wallac公司)測定100)lU上清液的放射活性。根據下式確定特異性鉻釋放率。特異性鉻釋放率(％)=(A-C)xl00/(B-C)A表示各孔的放射活性(cpm),B表示添加了100i!l的2。/。NonidetP-40溶液(CodeNo.252-23、NacalaiTesque公司)的孔的放射活t.l畫/、,T,L人八士一—.Vfr丄-"，八八，t"iit4H"",/—2_:2-ALL,L/"、'r王、cpmj日、j"T》J1且，l恭不《、v力yj丄介丞曰'、j《l>日'、j刀人潛^百'i王、cpm,的平均值。試驗進行兩次，計算出特異性鉻釋放率的平均值及標準偏差。測定Chi.MQ128(DG)、chi.MQ155(DG)、chi.MQ128(FTKO)、chi.MQ155(FTKO)的ADCC活性，結果僅chi.MQ155(FTKO)顯示ADCC活性(圖4)。實施例9.由使用Hum-ZAP的抗Muc17抗體產生的抗肺瘤效果接下來，使用Hum-ZAP對以Mucl7為靶的免疫毒素是否能夠顯示抗腫瘤效果進行評價。Hum-ZAP是使作為蛋白合成抑制毒素的皂草素與抗人IgG抗體結合的物質，使用AdvancedTargetingSystems社制的H畫-ZAP。在前一日，將表達Mucl7的癌細胞抹AsPcl細胞以2000細月包/100pL/孑l^番種到96孑Li咅養(yǎng)才反中，力口入100ng的Hum—ZAP和0、1、10、100ng抗Mucl7嵌合化抗體(chi.MQ155)的混合物。i告養(yǎng)72小時后，力口入10jiL的Ce11CountReagentSF(NacalaiTesquV^司)，2小時后測定450nm的吸光度。如圖5所示，單獨使用Hum-Zap未呈現增殖抑制，抗Muc17抗體的濃度依賴性地呈現抗腫瘤效果。[實施例IO]抗Mucl7抗體的抗原決定部位解析為了對制作的抗Mucl7抗體的抗原決定部位進行解析，制作Mucl7部分序列和GST的融合蛋白質。進行PCR擴增，在Mucl7基因的4115Thr-4390Leu的區(qū)域的上游附加EcoRI識別序列、下游附加Sall識別序列，克隆到pGEX4T-3(TAKARA社)中。將其導入BL21,制作轉化體。用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在對數增殖期內添加IPTG使其為lmM，在室溫下培養(yǎng)4小時。然后，回收菌體，用B-PER(PIERCE社)溶解，配制包含體級分。用變性緩沖液(8M尿素，300mMNaCl，50mMTris-HC1(pH8.0),5mMDTT)溶解后，置換為重折疊緩沖液(50mMTris-HC1(pH8.0)，300mMNaCl，lmMEDTA,5mMDTT),由此進行重折疊。溶解的GST融合蛋白質使用GlutathioneSepharoseFF柱(GE社)進行親和純化。使用PD-10柱(GE社)交換為PBS后，通過DCProteinAssay進行定量。按照相同的方法，制作GST—Mucl7ct—dell(4176Ile-4390Leu)，GST—Muc17ct—del2(4244Ser-4390Leu)，GST—Muc17ct—del3(4115Thr-4243Gly)(圖6)。將純化的GST融合蛋白質以l|ag/mL固定在酶標板上。阻斷處理后，添加3pg/mL濃度的抗Mucl7抗體，按照上述方法實施ELISA,進行抗原決定部位解析。雖然顯示抗腫瘤效果的MQ155與GST—Mucl7ct、GST—Muc17ct—dell牢固結合，但GST—Mucl7ct—del2、GST—Mucl7ct—del3不顯示結合活性(圖6)。據此認為MQ155的抗原決定部位位于包圍SEA結構域內的切斷預測部位的區(qū)域。預測Muc17的分泌型以SEA結構域的切割或者剪接變體的形式存在。由于預測MQ155不與分泌型Mucl7結合，所以預測作為治療用抗體給與時，不會被分泌型捕獲，到達癌細胞。一般認為具有上述抗原決定部位的抗體有望成為治療用抗體。通過同樣的解析，判定MQ016的抗原決定部位存在于4115-4243的區(qū)域，MQ169的抗原決定部位存在于4244-4390的區(qū)域。權利要求1、一種與Mucin17(Muc17)結合的抗體。2、如權利要求l所述的抗體，其特征在于，所述抗體不與分泌型Mucl7結合。3、如權利要求1或2所述的抗體，其特征在于，所述抗體與序列號3的肽(4176-4390)結合、且不與序列號4的肽(4244-4390)及序列號5的肽(4115-4243)結合。4、如權利要求13中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體具有ADCC活性。5、如權利要求14中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體為嵌合抗體或人源化抗體。6、如權利要求15中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體為低巖藻糖基化抗體。7、一種抗體，所述抗體識別與具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體識別的抗原決定部位相同的抗原決定部位，所述重鏈可變區(qū)具有序列號23所示的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)具有序列號"所示的氨基酸序列。8、一種抗癌劑，含有權利要求17中任一項所述的抗體。9、如權利要求8所述的抗癌劑，其特征在于，所述癌癥為胰腺癌。10、一種癌癥的診斷方法，其特征在于，使用與Mucl7結合的抗體。11、如權利要求10所述的診斷方法，其特征在于，所述癌癥為胰腺癌。12、如權利要求10或11所述的診斷方法，其特征在于，抗體為不與分泌型Mucl7結合的抗體。全文摘要本發(fā)明公開了一種與Mucin17(Muc17)結合的抗體。優(yōu)選本發(fā)明的抗體與序列號3的肽結合、且不與序列號4的肽及序列號5的肽結合。本發(fā)明還公開了一種抗癌劑、優(yōu)選為針對胰腺癌的抗癌劑，其中含有本發(fā)明的抗體，并且公開了一種癌癥的診斷方法，其特征在于使用本發(fā)明的抗體，優(yōu)選使用不與分泌型Muc17結合的抗體。文檔編號A61K39/395GK101687924SQ200880023060公開日2010年3月31日申請日期2008年7月3日優(yōu)先權日2007年7月4日發(fā)明者中野清孝申請人:株式會社未來創(chuàng)藥研究所