專利名稱：：穩(wěn)定化的混懸劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有透明質(zhì)酸與蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的、自由基減少的膠體水性混懸劑，藥物組合物以及其制備方法。本發(fā)明涉及含有透明質(zhì)酸與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化的、自由基減少的膠體水性混懸劑，還涉及含有所述混懸劑的藥物組合物以及其制備方法。更具體而言，本發(fā)明涉及含有無定形透明質(zhì)酸(HA)與無定形蛋白質(zhì)藥物(例如胰島素、胰高血糖素樣肽-l、人生長激素、促紅細(xì)胞生成素或超氧化物歧化酶)之復(fù)合物的穩(wěn)定化的、膠體水性混懸劑。本發(fā)明的藥物組合物旨在口服和胃腸外施用。本發(fā)明的方法包括制備無定形透明質(zhì)酸和無定形蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：制藥工業(yè)一直關(guān)注于發(fā)現(xiàn)含有活性成分(例如蛋白質(zhì)或肽藥物)的運(yùn)輸和儲存上穩(wěn)定的藥物制劑。此外，與蛋白質(zhì)和肽的醫(yī)藥用途有關(guān)的研究的主要挑戰(zhàn)之一是發(fā)現(xiàn)適于口服施用的制劑。經(jīng)口服施用的蛋白質(zhì)通常在消化道中被蛋白酶、肽酶和/或胃酸迅速破壞。此外，消化道上皮是有效的屏障，其在物理上以及由于局部消化酶而防止蛋白質(zhì)被攝取到體循環(huán)中。因此，至今已開發(fā)的旨在供口服施用的含有蛋白質(zhì)的功能性藥物非常少。因此，目前蛋白質(zhì)和肽藥物優(yōu)選通過胃腸外施用，例如通過皮下注射或經(jīng)肺施用，這常給患者帶來不便。另外，供胃腸外施用的肽和蛋白質(zhì)仍遇到半衰期短和活性損失的問題。因此，除了保護(hù)含有蛋白質(zhì)或肽的藥物免受消化之外，還必須保證其在機(jī)體內(nèi)的吸收以及隨后向靶器官的轉(zhuǎn)運(yùn)。蛋白質(zhì)或肽還必須以活性形式遞送到靶器官和受體。有效的口服劑型能利用肝腸循環(huán)(EHC)影響藥物分布而使治療窗變寬。通常，進(jìn)入腸道的藥物被吸收進(jìn)入門脈循環(huán)，藥物在那里可通過被肝臟攝取而從體循環(huán)中除去，以獲得在人中改善的均勻分布。透明質(zhì)酸(也稱為透明質(zhì)素(hyaluronan))是一種內(nèi)源性天然糖胺聚糖，其為透明質(zhì)酸鈉的形式，有其體內(nèi)用作蛋白質(zhì)藥物載體的安全記錄。其由葡萄糖醛酸和N-乙?；?葡糖胺的重復(fù)單元的直鏈聚合物組成。根據(jù)來源不同，分子量可在較大范圍內(nèi)變化。透明質(zhì)酸存在于哺乳動(dòng)物的幾種組織中，在一些特殊組織(例如雄雞冠)中，其濃度較高，足以用于商業(yè)規(guī)模的提取。這樣的組織含有的透明質(zhì)酸的分子量范圍較寬。透明質(zhì)酸還可從細(xì)菌中獲得，例如重組透明質(zhì)素，并且可在一系列復(fù)雜的提取、純化和滅菌步驟中純化。這樣得到分子量范圍相當(dāng)窄的高分子量的最終產(chǎn)品。在W09005522中，透明質(zhì)酸作為緩釋載體與結(jié)合蛋白質(zhì)(例如生長激素(GH)或胰島素樣生長因子(IGF))—起皮下注射以得到緩釋貯庫效應(yīng)?；钚晕镔|(zhì)通過共價(jià)鍵與透明質(zhì)酸連接。透明質(zhì)酸還用于提高生物分子對生物膜的粘附，因此提高生物分子的內(nèi)化。然而，目前透明質(zhì)酸的主要醫(yī)學(xué)用途是直接在需要機(jī)械性功能屏障(例如眼科手術(shù)中的粘性手術(shù)(viscosurgery)、粘性保護(hù)(viscoprotection)、粘性分離(viscos印aration))或可補(bǔ)充機(jī)械性功能失調(diào)性組織(例如整容手術(shù)中的粘性補(bǔ)充、粘性填充)的部位施用純化透明質(zhì)酸(動(dòng)物來源的或利用重組細(xì)胞合成的)。在本發(fā)明之前，Jederstr6m等人在"FormulatingInsulinforOralAdministration-PreparationofHyaluronan—InsulinComplexPharmaceuticalResearch,Vol.21，No.11，November2004"的論文中描述了透明質(zhì)素和胰島素的復(fù)合物。此外，本發(fā)明人在EP1231926中描述了藥理活性生物分子與透明質(zhì)酸的復(fù)合物。這樣的復(fù)合物表明可有效透過生物膜，因此不需要胃腸外施用。所述復(fù)合物是這樣形成的將透明質(zhì)酸溶解在含有酸和電解質(zhì)溶液的溶液中，然后將生物分子溶解在溶解的透明質(zhì)酸和酸溶液中，然后對所得溶液透析至PH約中性。雖然上述復(fù)合物顯示具有良好的醫(yī)療性能，在2-8t:的低溫下具有可接受的儲存期，但是仍然需要儲存期更長(特別是在較高溫度下)的含有透明質(zhì)酸和蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑，尤其是用于可口服遞送的藥物組合物。
發(fā)明內(nèi)容與EP1231926中的復(fù)合物(其中用作起始材料的透明質(zhì)酸和生物分子是晶體形式)不同，本發(fā)明提供含有無定形透明質(zhì)酸(HA)與無定形蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑，其中含水量被過量HA降至盡可能低。本發(fā)明的具體特征是當(dāng)形成復(fù)合物時(shí)HA和蛋白質(zhì)藥物均是無定形形式并且降至盡可能低的水含量能穩(wěn)定所述膠體混懸劑，使得即使在升高的環(huán)境溫度下產(chǎn)品也獲得延長的儲存期。此外，根據(jù)本發(fā)明，復(fù)合物中無定形形式的透明質(zhì)素和蛋白質(zhì)藥物的熵值高，這將增加體內(nèi)吸收。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及穩(wěn)定化的、自由基減少的膠體水性混懸劑，其含有無定形透明質(zhì)酸(HA)和無定形蛋白質(zhì)藥物的復(fù)合物以及將水含量降至盡可能低的過量HA，其中無定形透明質(zhì)酸的平均分子量(平均麗)范圍是80-400kDa。應(yīng)當(dāng)理解，將水含量降至盡可能低的過量HA的平均分子量范圍也可是80-400kDa。術(shù)語"穩(wěn)定"包括混懸劑中穩(wěn)定的復(fù)合物或其自由流動(dòng)粉末。此外，術(shù)語穩(wěn)定還包括具有很好儲存穩(wěn)定性的穩(wěn)定的藥物制劑。術(shù)語"蛋白質(zhì)"在本發(fā)明中包括單體和多聚體多肽，例如激素和酶。"透明質(zhì)酸"或"透明質(zhì)素"意指質(zhì)子化和非質(zhì)子化形式的透明質(zhì)酸，而不論其來源如何。因此，本發(fā)明包括使用動(dòng)物來源和細(xì)菌來源的透明質(zhì)酸，例如基因改造生物產(chǎn)生的透明質(zhì)酸。一般而言，本發(fā)明包括使用不損害與透明質(zhì)酸相關(guān)之生理功能的所有透明質(zhì)酸衍生物。本發(fā)明中HA的平均麗值表示HA的大部分分子量在所示的最低值和最高值之間，而應(yīng)當(dāng)理解的是一些HA的麗可能更低或更高。在本文中，自由基減少的水性混懸劑應(yīng)當(dāng)理解為在部分過程或在整個(gè)過程中用惰性氣體(例如氮?dú)?對混懸劑進(jìn)行吹洗。此外，還利用本領(lǐng)域公知的方法有利地處理玻璃用具以除去自由基。本文所用的術(shù)語"惰性條件"是指對在惰性氣體氣氛下進(jìn)行的過程的描述。自由基減少能顯著延長所得產(chǎn)品的保存期。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述過量HA中的HA的平均麗范圍是6-15kDa。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，混懸劑還包含平均麗范圍為l-8kDa并且是冷凍干燥的自由流動(dòng)粉末形式的HA。在根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定化的、膠體水性混懸劑的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)藥物選自胰島素、胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)、人生長激素(hGH)、促紅細(xì)胞生成素(EP0)和超氧化物歧化酶(SOD)，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于這些實(shí)例，為本發(fā)明目的可使用無定形形式的任意蛋白質(zhì)藥物。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及含有本發(fā)明穩(wěn)定化的、膠體水性混懸劑以及可藥用載體的藥物組合物。在本發(fā)明的該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述可藥用載體是用于口服施用膠體水性混懸劑的可口服分配給藥裝置。這些裝置的實(shí)例包括obelate或可口服遞送的膠囊，其被配制成含有無定形蛋白質(zhì)(例如胰島素)與不同分子量的無定形透明質(zhì)素之復(fù)合物的自由流動(dòng)粉末，尤其是被設(shè)計(jì)成腸道內(nèi)遞送組合物的膠囊，但是用于口服施用的任意合適形式均是可能的，例如片劑或其它口服遞送形式，包括常用于口服制劑的載體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可藥用載體是用于口服施用所述膠體水性混懸劑的可口服分配給藥裝置。這些裝置的實(shí)例包括可口服遞送的膠囊，尤其是被設(shè)計(jì)成腸道內(nèi)遞送組合物的膠囊，但是供口服施用的任意合適形式均是可能的，例如混懸劑或其它口服遞送形式，包括常用于口服制劑的載體。在本發(fā)明此方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可藥用載體是供胃腸外施用所述膠體水性混懸劑的給藥裝置，例如瓶或注射器。因此，本發(fā)明的藥物組合物可以是不同的施用形式并且可包含通常包含在藥物組合物中的被批準(zhǔn)用于遞送給哺乳動(dòng)物(尤其是人)的添加劑和賦形劑，例如可見于歐洲藥典或美國藥典中的那些。本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及制備含有透明質(zhì)酸(HA)和蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的自由基減少的穩(wěn)定化的、膠體水性混懸劑的方法，所述方法包括以下步驟(a)將平均分子量(平均麗)范圍是80-400kDa的HA的水溶液冷凍干燥并在足夠的時(shí)間內(nèi)維持冷凍干燥，以得到無定形HA;(b)將蛋白質(zhì)藥物的水溶液冷凍干燥并在足夠的時(shí)間內(nèi)維持冷凍干燥，以得到無定形蛋白質(zhì)藥物；(c)將冷凍干燥的無定形HA與電解質(zhì)和水的混合物相混合，從而在所得均一混合物的HA上得到雙電層；(d)在短至不使蛋白質(zhì)變性的時(shí)間內(nèi)在例如pH1-2的低pH下加入所述冷凍干燥的無定形蛋白質(zhì)藥物，從而在所述無定形蛋白質(zhì)藥物上得到雙電層；(e)使水和離子含量降至最低，從而使疏水性表面彼此吸引而形成無定形HA與無定形蛋白質(zhì)藥物的復(fù)合物，從而復(fù)合物的pH升高；以及(f)在盡可能少量水中加入平均麗范圍是6-15kDa的過量HA以產(chǎn)生含有無定形HA和無定形蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體混懸劑。應(yīng)當(dāng)了解，由本發(fā)明含有HA與蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑中的過量HA來抑制蛋白質(zhì)聚集。就冷凍干燥而言，步驟(a)中的冷凍干燥可在-4(rC或更低的溫度下進(jìn)行，和/或步驟(b)中的冷凍干燥可在-3(TC或更低的溫度下進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(d)中的低pH的范圍是l-2，在步驟(f)中6pH值范圍升高至6-8。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)中HA的平均麗是150kDa，步驟(f)中HA的平均MW是8kDa。在本發(fā)明此方面的一個(gè)實(shí)例中，步驟(a)中的冷凍干燥在-5(TC或更低的溫度下進(jìn)行，步驟(b)中的冷凍干燥在-45t:或更低的溫度下進(jìn)行，步驟(d)中的pH是1.5，步驟(f)中的pH是6.5。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將(f)中得到的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑與所添加的平均麗是l-8kDa的HA—起冷凍干燥以得到自由流動(dòng)粉末。根據(jù)本發(fā)明所得的含有無定形HA和無定形蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑或其自由流動(dòng)粉末可分配在供口服施用的可分配劑量單位中?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明所得的含有無定形HA與無定形蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑或其無菌溶液可分配在供胃腸外施用的劑量單位中。另外，在本發(fā)明的此方面中，所述蛋白質(zhì)藥物可選自胰島素、胰高血糖素樣肽-l(GLPl)、人生長激素(hGH)、促紅細(xì)胞生成素(EP0)和超氧化物歧化酶(S0D)。就步驟a)和b)中用于制備無定形產(chǎn)品的冷凍而言，"足夠的時(shí)間"通常是10小時(shí)至幾天，例如，2-5天。本文上下文中所用的術(shù)語"疏水性表面彼此吸引以形成復(fù)合物"定義為本質(zhì)上具有疏水性質(zhì)并且受蛋白質(zhì)疏水性部分和HA疏水性部分之間的遠(yuǎn)程力和范德華力影響的結(jié)合。步驟c)中電解質(zhì)和水的混合物通常是含有陽離子例如NH4+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和陰離子例如硫酸根、氯離子和醋酸根的水溶液。步驟e)中所實(shí)現(xiàn)的將離子含量和分子內(nèi)結(jié)合水含量降至盡可能低通常通過透析或滲濾來實(shí)現(xiàn)。在所形成的復(fù)合物中含有盡可能少量的分子內(nèi)結(jié)合水。在下文中，游離水被定義為溶液或混懸液中所包含的非絡(luò)合結(jié)合水。因此，待冷凍干燥的水性混懸劑周圍的游離水含量與分子內(nèi)結(jié)合水無關(guān)。膠體混懸劑中復(fù)合蛋白質(zhì)(例如復(fù)合胰島素、復(fù)合促紅細(xì)胞生成素、復(fù)合生長激素或復(fù)合超氧化物岐化酶)的濃度通常為0.03-300mg/mL。在本發(fā)明方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，所得的無定形HA與可逆性壓縮的無定形蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑或其自由流動(dòng)粉末可分配在供口服施用的可分配劑量單位中。制備透明質(zhì)酸與生物分子之復(fù)合物的技術(shù)已描述在歐洲專利EP1231926中，其教導(dǎo)在此通過引用并入本文。在該出版物中，所述現(xiàn)有技術(shù)的復(fù)合物在2_8°C的低溫下的儲存期表明為3個(gè)月。本發(fā)明的可口服遞送藥物組合物在2-『C的低溫下的儲存期為至少3年?；鞈覄┑暮靠杀硎緸橛坞x水的摩爾濃度，為0.78-1.1摩爾每升。此摩爾濃度表示得到膠體混懸劑的區(qū)間，并且給出在4-15t:下所得產(chǎn)品的貨架期(shelflife)為至少3年。因此，此區(qū)間包括在本文所用術(shù)語"最少量的水"的范圍內(nèi)?？梢允褂媚柋榷豢紤]生產(chǎn)規(guī)模。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑冷凍干燥成自由流動(dòng)粉末，所述冷凍干燥的自由流動(dòng)粉末在3(TC的溫度下的儲存期為5年。此冷凍干燥的自由流7動(dòng)粉末的水含量比所述膠體混懸劑低很多，游離水的摩爾濃度為約0.07摩爾每升和更低。表面結(jié)合水在冷凍干燥過程中被除去。然而，足量的水滴通過偶極矩保持與復(fù)合物結(jié)合，從而保持分子運(yùn)動(dòng)性并保護(hù)蛋白質(zhì)藥物的活性位點(diǎn)免受破壞。分子運(yùn)動(dòng)性促進(jìn)蛋白質(zhì)藥物溶解。冷凍干燥的自由流動(dòng)粉末能顯著改善對含有蛋白質(zhì)藥物(例如胰島素)的藥物組合物的處理。其不但可將胰島素口服施用給有此需求的患者，還可在不需要冰箱的情形下于室溫下儲存含有胰島素的藥物組合物。蛋白質(zhì)中的水含量可通過升華或噴霧干燥除去，得到高熵形式的蛋白質(zhì)，即無定形相。受偶極引力的影響，水分子通過水分子自締合以高強(qiáng)度轉(zhuǎn)變形成水點(diǎn)(spotofwater)。與噴霧干燥相比，升華(即冷凍干燥)成無定形結(jié)構(gòu)使產(chǎn)品的儲存更穩(wěn)定。噴霧干燥中的熱易于破壞表面性能，即蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)。然而，蛋白質(zhì)的內(nèi)環(huán)境中一定量的水可能是噴霧干燥時(shí)防止與分子結(jié)構(gòu)(例如-s-s-橋)相關(guān)的表面被破壞所必需的。可通過氣相底物體外證明用于體內(nèi)使用的具有低水含量的超氧化物岐化酶的活性。就蛋白質(zhì)/酶而言，這樣的低水含量可通過將酶在液氮中冷凍并且隨后冷凍干燥來實(shí)現(xiàn)。利用<0.lg/g蛋白質(zhì)的最少的水獲得酶的全部活性。胰島素的結(jié)構(gòu)當(dāng)質(zhì)子化時(shí)很可能從六聚體結(jié)構(gòu)變?yōu)槎垠w和單體結(jié)構(gòu)。認(rèn)為單體結(jié)構(gòu)是胰島素的活性形式，其激活胰島素受體。在本發(fā)明中，透明質(zhì)素使單體形式的胰島素水環(huán)境中的酸性置換質(zhì)子化蛋白質(zhì)和質(zhì)子化透明質(zhì)素的疏水性表面，從而得到疏水性引力。水的損失降低電相互作用(使肽復(fù)合的第一作用力)的強(qiáng)度，但水偶極力和疏水性引力都將在復(fù)合狀態(tài)中配合，認(rèn)為蛋白質(zhì)中少量的水被透明質(zhì)素所替代。當(dāng)通過透析或滲濾以及相關(guān)的降低方法來減少水和離子時(shí)，水偶極力和疏水性引力配合使肽結(jié)構(gòu)與HA復(fù)合。由蛋白質(zhì)的冷凍干燥得到的無定形態(tài)的能量促進(jìn)與無定形透明質(zhì)素進(jìn)行快速復(fù)合反應(yīng)，而且構(gòu)成復(fù)合物中用于吸收過程(例如胰島素遞送到動(dòng)脈血液中)所必需的能量。另一個(gè)特征是透明質(zhì)素胰島素復(fù)合物對酶降解的穩(wěn)定性。在STZ大鼠中，當(dāng)反復(fù)皮下注射或口服施用復(fù)合胰島素下至賁門時(shí)，我們均沒有觀察到復(fù)合胰島素的任何降解(以使葡萄糖降低(decrement)的活性損失來表示)。膠體混懸劑的大于兩年的物理化學(xué)穩(wěn)定性由所添加的過量透明質(zhì)素來解釋，所述過量透明質(zhì)素有助于在空間上阻礙物理沉淀和在復(fù)合物的膠體混懸劑的容器中形成沉淀物。在遺傳性糖尿病GK大鼠實(shí)驗(yàn)中顯示了儲存兩年后透明質(zhì)素胰島素復(fù)合物的生物活性穩(wěn)定性，并且導(dǎo)致葡萄糖降低(見圖l-3)。胰島素復(fù)合物的體內(nèi)活性歸因于復(fù)合物的無定形狀態(tài)。在-30°〇或更低的低溫下冷凍干燥有助于維持蛋白質(zhì)活性。在復(fù)合步驟中表明水和離子被除去但是保留了透明質(zhì)素和蛋白質(zhì)(例如胰島素)之復(fù)合物的體內(nèi)功能。完全除水不應(yīng)當(dāng)排除蛋白質(zhì)活性的可能性，但是對除水的限制與發(fā)生分子間運(yùn)動(dòng)有關(guān)。蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)具有最小的水合水平，并且是對冷凍干燥的蛋白質(zhì)的限制。在復(fù)合步驟中表明，即使在水和離子被除去的情形下，透明質(zhì)素和蛋白質(zhì)(例如胰島素)之復(fù)合物的體內(nèi)功能仍然保留。完全除去水并不是理想的，因此為了維持活性位點(diǎn)的功能，應(yīng)當(dāng)存在最少量的水?，F(xiàn)在參照實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例以及附圖來舉例說明本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所公開的任意具體詳細(xì)描述，其保護(hù)范圍由所附權(quán)利要求所限定。圖1是顯示血液葡萄糖水平(mmol/L)對時(shí)間(分鐘)作圖的圖。在零時(shí)間點(diǎn)向遺傳性糖尿病大鼠(GK大鼠)皮下施用復(fù)合胰島素。所述復(fù)合胰島素已經(jīng)儲存兩年并且是由無定形胰島素和無定形HA制得的。所述注射是皮下注射儲存兩年的包含在等滲溶液(308m0smol/dm3)中的llOiig復(fù)合胰島素。圖2是顯示血液葡萄糖水平(mmol/L)對時(shí)間(分鐘)作圖的圖。在零時(shí)間點(diǎn)向遺傳性糖尿病大鼠(GK大鼠)口服施用復(fù)合胰島素。所述復(fù)合胰島素已經(jīng)儲存兩年并且是由無定形胰島素和無定形HA制得的?？诜┯脙Υ鎯赡甑陌诘葷B溶液(150m0smo1/dm3)中的3.7mg復(fù)合胰島素。圖3是顯示血液葡萄糖水平(mmol/L)對時(shí)間(分鐘)作圖的圖。在零時(shí)間點(diǎn)向遺傳性糖尿病大鼠(GK大鼠)口服施用復(fù)合胰島素。所述復(fù)合胰島素已經(jīng)儲存兩年并且是由無定形胰島素和無定形HA制得的。口服施用儲存兩年的包含在等滲溶液(150m0smo1/dm3)中的3.7mg復(fù)合胰島素。圖4顯示在燒杯中的30kDa的晶體透明質(zhì)素的照片。圖5顯示在燒杯中的150kDa的棉花樣無定形透明質(zhì)素的照片。圖6是顯示隨處理時(shí)間繪制的去垂體(H-x)大鼠的體重(BW)增加(以％表示)的圖，其中將口服施用由無定形rhGH和無定形透明質(zhì)素制備的復(fù)合rhGH1.5mg/ml(n=3)和0.5mg/ml(n=3)的去垂體大鼠與口服施用rhGH1.5mg/ml(n=2)以及對照組(n=10，n=3)的去垂體(H-x)大鼠進(jìn)行比較。圖7是顯示口服和皮下施用由無定形rhGH和無定形透明質(zhì)素制備的復(fù)合rhGH(高劑量和低劑量)的去垂體(H-x)大鼠、由未處理的H-x大鼠以及口服和皮下施用rhGH的大鼠組成的對照組的體重(BW)增加(以最初體重的百分率表示)的圖。w數(shù)據(jù)表示一只大鼠未充分切除垂體；99.7對應(yīng)于去掉此大鼠的數(shù)據(jù)。圖8是顯示通過AutoDelfia⑧測定的口服和皮下施用由無定形rhGH和無定形透明質(zhì)素制備的復(fù)合rhGH后的去垂體(H-x)大鼠、口服和皮下施用rhGH后的去垂體(H_x)大鼠和未處理的H-x大鼠(對照組)中rhGH的血清水平(yg/L)。低于0.3yg/L的值在檢測水平之下，可忽略不計(jì)。圖9是顯示制備用于注射目的的復(fù)合胰島素的脫鹽(透析)步驟中pH和摩爾滲透壓濃度的圖。圖10是顯示三種混懸劑的吸光度的圖，其中一種已經(jīng)過儲存，另外兩種是新制備的。實(shí)施例實(shí)施例1:冷凍干燥透明質(zhì)酸以制備無定形透明質(zhì)酸為進(jìn)行冷凍干燥，在干冰和乙醇上冷凍透明質(zhì)酸。在密閉環(huán)境中通過利用無氧氣氛、惰性氣氛(例如氬氣氛)保護(hù)冰泥不受周圍水和空氣的影響來保證產(chǎn)品的完整性。在整個(gè)冷凍干燥過程中使用這樣的無氧氣氛。通過稍微提高冰的溫度來得到產(chǎn)品的一些設(shè)定條件。在至少0.8的負(fù)壓下于低于_301:的溫度下冷凍干燥3-4天。借助目視檢驗(yàn)來觀察冷凍干燥塊以保證其未破裂。通過再次提供惰性氣體來結(jié)束冷凍干燥過程。通過所述方法，不必進(jìn)行二次干燥。起始原料透明質(zhì)素鈉平均分子量8X106Da水含量8.1%w/w蛋白質(zhì)含量<0.5mg/g透明質(zhì)素鈉含量92%w/w溶解將2.51mg透明質(zhì)素鈉溶解在500ml無氧蒸餾水中，可向其中加入0.05%疊氮化鈉補(bǔ)充物使得密閉瓶中的最終體積為1000ml，所述瓶已用惰性氣體吹洗過并且填滿惰性氣體。將所述瓶的內(nèi)容物攪拌20小時(shí)以上。將8000kDa的透明質(zhì)素水解成150kDa的透明質(zhì)素(平均麗)添加16ml1M鹽酸，然后用惰性氣體吹洗所述瓶，將內(nèi)容物攪拌2小時(shí)。內(nèi)容物的pH應(yīng)當(dāng)小于1并且對其連續(xù)檢查。通過加入0.5M氫氧化鈉將溶液中和至pH7.0。然后可添加25mg疊氮化鈉。透析步驟將被中和的pH7的溶液轉(zhuǎn)移到1升燒杯中，然后用惰性氣體充滿所述溶液和瓶并除去自由基。將截留分子量為12-14乂103道爾頓的透析管浸入所述溶液中。測量電導(dǎo)率，設(shè)置足夠的透析時(shí)間以達(dá)到3iiS/cm至0.8iiS/cm的透析區(qū)間。完成充分透析的時(shí)間為大約4天。冷凍干燥將600ml上述溶液分配到用惰性氣體吹洗過的三個(gè)不同瓶中。將溶液冷卻至-60°C以下的溫度，然后在排氣過程中將溫度保持在-55至-58°C。在至少約48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)最初排氣壓是8毫巴，或0.4atm。排氣過程中的最終壓力應(yīng)當(dāng)不超過3.2毫巴或《0.06atm。將重量不超過0.67g的棉花樣透明質(zhì)酸于不超過_20°C的溫度下儲存在含有惰性氣體的密閉容器中。參見圖5，其舉例說明了150kDa的棉花樣無定形透明質(zhì)素。實(shí)施例2.無定形人生長激素的制備將人生長激素(rhGH)稀釋在賴氨酸緩沖液中以得到pH約7.15、濃度約1081.U/ml的溶液。在此rhGH濃度或更高濃度下，rhGH溶液自身含有功能緩沖液。用惰性氣體吹洗濃溶液以保護(hù)二硫鍵。無定形狀態(tài)的溶液含有最少量的水，即0.01g水/grhGH。然而，更低的水含量破壞二硫鍵。需要維持一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)。因此在低溫下于更長的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥過程，由此發(fā)生升華。在2(TC的溫度下加載所述溶液。然后在30分鐘內(nèi)將溫度逐漸降至-l(TC。此冷凍在-l(TC持續(xù)1.5小時(shí)，然后在1.5小時(shí)內(nèi)將溫度降至-45t:。然后在-45t:冷凍干燥15小時(shí)。初次干燥是在-3(TC下于0.1巴壓力下進(jìn)行的，然后在2小時(shí)內(nèi)將溫度升至+25t:，然后在+25t:下任選進(jìn)行二次干燥5小時(shí)。利用此方案，二次干燥并不是必需的?；蛘?，可使用噴霧干燥。然而，盡管水含量應(yīng)當(dāng)盡可能低，但是必須小心不致在較高溫度下因灼燒而破壞二硫鍵。實(shí)施例3.制備無定形透明質(zhì)酸與無定形人生長激素的復(fù)合物使無定形狀態(tài)的冷凍干燥的rhGH與無定形透明質(zhì)素復(fù)合。將15mg無定形透明質(zhì)素溶解在12mLIM硫酸鈉(Na2S04)溶液中，用1MHC1將pH調(diào)節(jié)至1.51。將22mg無定形rhGH溶解在該透明質(zhì)素溶液中。加入1MHC1得到透明溶液。將所得的分散系用惰性氣體吹洗并轉(zhuǎn)移到體積為3ml的透析袋中，用約1.2L的pH6.5的氨基丁三醇(trometanol)緩沖液透析3次。將所得的透析袋中精確量出的體積轉(zhuǎn)移到用惰性氣體吹洗過的注射瓶中并密封。取樣用于分析含量、粒度，用體積排阻色譜和無菌試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。復(fù)合rhGH是在已被批準(zhǔn)后進(jìn)行貯存測試并用于臨床前研究。物理化學(xué)測試表明，在2-8t:的溫度下的儲存穩(wěn)定性超過36個(gè)月。儲存36個(gè)月后，rhGH制劑顯示了皮下和口服效果(見圖6、7和8)。這表明，在冷凍干燥的rhGH的儲存過程中，緩沖液與蛋白質(zhì)最小比摩爾比(minimalspecificmolarratio)足以提供抵抗聚集和降解的最佳穩(wěn)定性。在儲存期間聚集和脫酰胺化的減少與冷凍干燥期間對解折疊的抑制直接相關(guān)。因此，似乎蛋白質(zhì)必須在冷凍干燥過程中保持其一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)以確保冷凍干燥固體的儲存穩(wěn)定性。這可通過選擇相對于特定緩沖液的適當(dāng)高濃度(摩爾比)的蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。所述緩沖液應(yīng)當(dāng)是最小濃度。應(yīng)當(dāng)避免形成晶體以減少蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的移動(dòng)性。實(shí)施例4.制備無定形胰島素基本上根據(jù)實(shí)施例2進(jìn)行胰島素的冷凍干燥。壓縮后胰島素折疊的穩(wěn)定化歸因于布置和穩(wěn)定胰島素內(nèi)之折疊的透明質(zhì)素復(fù)合。實(shí)施例5.制備無定形透明質(zhì)酸和壓縮的無定形胰島素的復(fù)合物在瓶中對實(shí)施例1中所制備的無定形透明質(zhì)素稱重，將6.5ml1.(MNa2S04和小磁力攪拌棒置于所述瓶中，進(jìn)行溫和攪拌。在所有處理和制備中，所有容器和所有溶液均用惰性氣體進(jìn)行吹洗。所有容器還均在惰性氣體下進(jìn)行封閉。利用微型鉗(micropincers)打開透明質(zhì)素瓶。記錄起始時(shí)間和得到澄清溶液的時(shí)間。用1.0M的HC1和1.0M的NaOH將pH調(diào)節(jié)至1.5-1.6。當(dāng)pH達(dá)到1.5時(shí)，粘度應(yīng)該降低。通過將含有胰島素的注射瓶置于含有HA的瓶的頂部來添加無定形胰島素。測量并記錄pH。進(jìn)行溫和磁力攪拌1小時(shí)。用1.0M的NaOH和1.0M的HC1將pH調(diào)節(jié)至2.0-3.0。當(dāng)pH達(dá)到2.0時(shí)，粘度應(yīng)該增加。記錄最終pH、所加的NaOH和HC1的量。進(jìn)行溫和磁力攪拌2小時(shí)。記錄開始時(shí)間和結(jié)束時(shí)間。記錄視覺外觀(透明度、粘度)。將透析管切成10cmX3。在pH6.5的10mMTris緩沖液中開始透析或利用透濾法。就透析步驟而言，利用微量移液器將分散系分配在透析袋中。使0.5cm的管留在一側(cè)閉合夾的外面。用標(biāo)記的透析管閉合夾進(jìn)行密封。將所述袋置于透析緩沖液中。當(dāng)所有袋都已置于緩沖液中時(shí)記錄時(shí)間。按下述更換透析緩沖液。記錄更換介質(zhì)的時(shí)間。每次透析之后測量PH，檢驗(yàn)分散系和袋(分散系例如透明、渾濁、嚴(yán)重沉淀、輕微沉淀，白色沉淀帶；袋膨脹或松馳)。利用下述溶液進(jìn)行透析。2L100%Tris緩沖液(TB)含0.9%NaCl，1小時(shí)2L100%TB，1小時(shí)2L100%TB，1小時(shí)2L100%TB，18-24小時(shí)2L100%TB，20-28小時(shí)2L100%TB，18-20小時(shí)11就口服分散系而言，在此時(shí)停止透析步驟。就胃腸外制劑而言，將2L100%TB透析18-20小時(shí)更換為2L100%Tris緩沖液(TB)與0.9%NaCl，繼續(xù)透析得到含有復(fù)合胰島素的等滲溶液。打開透析袋，利用微量移液器將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到注射瓶中。記錄總體積。測量并記錄最終產(chǎn)品的pH。實(shí)施例6.含有復(fù)合胰島素的藥物制劑中游離水的量下文給出經(jīng)口服施用后具有全部生物作用并且具有3年的物理化學(xué)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)復(fù)合制劑中"最少量水"的實(shí)例。在胰島素和透明質(zhì)素的摩爾比為15:l并且水含量為14-20ml的八種不同制備物中的最終制劑中，復(fù)合胰島素組合物含有胰島素(Mw5812)、透明質(zhì)素(Mw160000)并含有最少量的水。由45mg無定形胰島素和82mg無定形透明質(zhì)素制備制劑。將含有此量胰島素和透明質(zhì)素(摩爾比15:1)的八種制劑在自由基減少的水性混懸劑中進(jìn)行復(fù)合，使最終水含量為14-20ml，這給出了就該配方而言使透明質(zhì)素-胰島素復(fù)合物的混懸劑達(dá)到3年的穩(wěn)定性(3年貨架期)并且在GK大鼠中證明保留全部生物活性的含水限度。最終制劑中此最少量的水是如下得到的在復(fù)合過程中在幾乎為零的離子濃度下使游離水脫鹽，并在透析步驟(透析過程)中在蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定過程中限制水含量。這些過程在下文圖8中舉例說明。最少量的游離水和游離水與胰島素和透明質(zhì)素之間的比例分別針對以下述摩爾每升范圍表示的復(fù)合蛋白質(zhì)(胰島素)的長期儲存混懸劑(在4-15t:的溫度下為4年)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>制備復(fù)合胰島素過程中的脫鹽步驟圖示在圖9中，其中制備用于注射目的的等滲混懸劑。在此，持續(xù)透析約60小時(shí)，其中每24小時(shí)更換介質(zhì)。在本實(shí)施例中，最初使用等滲溶液。然后在透析過程中使用低滲溶液，在2小時(shí)時(shí)達(dá)到接近于零的摩爾滲透壓濃度。隨后，再利用等滲溶液進(jìn)行透析。圖9中所用的術(shù)語"50%等滲"表示含有50%等滲溶液和50%低滲溶液的透析溶液。在透析步驟中，水量逐漸減少。透析后，低滲溶液的摩爾滲透壓濃度接近于零。離子數(shù)的減少降低了游離水含量，繼而提高了復(fù)合物的穩(wěn)定性。3000sm的最終摩爾滲透壓濃度適用于注射目的。就待冷凍干燥的混懸劑而言，用低滲溶液替代進(jìn)行最后的透析步驟。最后，通過添加過量的透明質(zhì)酸來限制藥物制劑中的游離水含量，所述過量的透明質(zhì)酸可用作清除劑以保證膠體分散系和膠囊中冷凍干燥的自由流動(dòng)粉末的儲存穩(wěn)定性。實(shí)施例7復(fù)合胰島素混懸劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性利用下文的標(biāo)準(zhǔn)通過幾種方法評價(jià)本發(fā)明的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑的穩(wěn)定性。就可用在冷凍干燥的自由流動(dòng)粉末的制劑中的復(fù)合物而言，混懸劑應(yīng)當(dāng)是均勻的并且沒有表現(xiàn)出任何結(jié)塊跡象。均勻性通過對混懸劑進(jìn)行目視檢查和濁度測量來測定批次的均勻性，從而測定混懸劑的時(shí)間依賴性均勻性。散射光的目視檢查根據(jù)藥典中已經(jīng)描述的藥學(xué)實(shí)踐，將復(fù)合胰島素混懸劑中散射光的目視檢查值定為1-4。當(dāng)搖動(dòng)本發(fā)明的混懸劑時(shí)，混懸劑易于分散，從而其外觀由瓶底的不透明外觀轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂卸∵_(dá)爾性質(zhì)的均勻膠體混懸劑。沒有觀察到顆粒絮凝，逐漸發(fā)生沉降。在3分鐘內(nèi)測定均勻性。濁度測量于360、540nm處監(jiān)測濁度(光散射)，在一種情形下，于820nm處監(jiān)測濁度。因?yàn)楣馍⑸湓谳^低的波長下更顯著，所以在360nm處監(jiān)測時(shí)所述方法的靈敏度最佳。就被看作是均勻的混懸劑而言，360nm處的吸光度應(yīng)當(dāng)在2.0_0.9之間，并且在10分鐘內(nèi)應(yīng)當(dāng)理想地保持在1.1-0.85范圍內(nèi)。將光散射顆粒的目視檢查與濁度測量值進(jìn)行了比較。所得的目視檢查(上述的1-4)與光散射之間的關(guān)系在表1中給出。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表1.復(fù)合胰島素的目視檢查讀值為l-4，并且等于所給出的在標(biāo)準(zhǔn)分光光度計(jì)上于360nm處讀出的濁度區(qū)間。可視顆粒在本發(fā)明混懸劑中，均勻膠體混懸劑中可視的顆粒(大小通常^5ym)數(shù)不超過10個(gè)/4ml(2.5個(gè)/ml)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1評分范圍為1-4，其中1是高濁度，4是低濁度。210ml混懸劑中估計(jì)的顆粒數(shù)。表2.穩(wěn)定性測量在制備時(shí)，混懸劑的pH范圍為6.4-6.7。在儲存期間(38_44個(gè)月)維持此pH。結(jié)塊將儲存期間顆粒變成一單位或多單位顆粒塊定義為結(jié)塊。當(dāng)搖動(dòng)這樣的混懸劑時(shí)，出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)塊。在本發(fā)明的復(fù)合胰島素組合物中未觀察到結(jié)塊現(xiàn)象。實(shí)施例8可通過測量本發(fā)明混懸劑中的自由基來舉例說明在惰性氣體、自由基減少的環(huán)境中制備的復(fù)合物的儲存性能。在此，如下所述來評價(jià)穩(wěn)定性首先測量在自由基減少的環(huán)境中制備的兩種新制備復(fù)合胰島素混懸劑(Cl15:1-071130C和C115:1-071130D)的自由基含量，并將它們的自由基含量與同樣制備的于5-8t:的溫度下儲存2年9個(gè)月(33個(gè)月)的復(fù)合胰島素混懸劑(050216-7)進(jìn)行比較。通過比較實(shí)驗(yàn)清楚地顯示本發(fā)明的儲存穩(wěn)定性，其中利用Bloomfield在"thespectrophotometricdeterminationofhydroperoxideandperoxideinalipidpharmaceuticalproductbyflowinjectionanalysis,Analyst1999，124，1865-1871中"所述的化學(xué)反應(yīng)。圖IO舉例說明，所比較的溶液中自由基含量保持相同。這表明，與新制備的制劑相比，長期儲存(33個(gè)月)的本發(fā)明自由基減少的混懸劑中存在的自由基量并不增加。自由基測定為由碘化物轉(zhuǎn)化的游離碘在350nm處的吸光度?？瞻兹芤?g乙酸，用80%2-丙醇20%Milli-Q稀釋至100ml碘化鉀溶液10gKI，溶解在15mlMilli-Q水中并用2-丙醇稀釋至100ml測試樣品2.5ml空白溶液0.5mlKI溶液樣品2.0ml空白溶液0.5mlKI溶液0.5ml樣品(分別為Cl15:1-071130D;Cl15:1-071130C以及050216-7)UV測量，350nm吸光度時(shí)間(分鐘)測試樣品CI15:1"07"30DCI15:1-071130C050216-700.1270.7050.6360.69710.2020.7860.7170.79120.2560.8280.7640.84750.3900.9520.9150.980100.5591.0881.0321.146150.6671.1781.1251.254300.8271.2731.3551,4肪吸光度/時(shí)間0.0230.0180.0230.025注C115:1-071130D:新制備的復(fù)合胰島素混懸劑C115:1-071130C:新制備的復(fù)合胰島素混懸劑050216-7:儲存(33個(gè)月)的復(fù)合胰島素混懸劑表3.儲存穩(wěn)定性實(shí)施例9.藥物組合物注射溶液注射劑是無菌的溶液、乳液或混懸液。它們是通過將活性物質(zhì)和所添加的任意賦形劑溶解、乳化或混懸在注射用水、合適的無菌非水性液體或這些載體的混合物中而制得的。在合適的可視條件下檢查時(shí)，注射溶液是澄清的并且基本上不含顆粒。注射混懸液可顯示出沉淀物，當(dāng)搖動(dòng)時(shí)所述沉淀物很容易分散，以得到保持足夠穩(wěn)定性從而能抽取正確劑量的混懸劑。在含有分散顆粒的注射劑的制備中，采取措施來保證與意欲用途有關(guān)的合適且可控的粒徑。單劑量容器中的注射體積足以允許利用常規(guī)技術(shù)抽取和施用標(biāo)稱劑量。供胃腸外施用的濃度為3mg/ml的復(fù)合胰島素被容納于10ml多劑量容器中，其中考慮與其施用有關(guān)的注意事項(xiàng)，更尤其是與連續(xù)抽取期間的儲存有關(guān)的注意事項(xiàng)。本實(shí)施例涉及混懸劑形式的3.0mg/ml的胰島素和透明質(zhì)素(15:1)復(fù)合物。批量大小達(dá)到45mg。制備通過飼管施用的在lmL單容器(安瓿)或10mL單劑量或多劑量容器中的3mg/mL的復(fù)合胰島素混懸劑。將混懸劑在5-8t:的溫度下儲存36個(gè)月，使用前搖動(dòng)。打開的容器中的內(nèi)容物應(yīng)當(dāng)在10天內(nèi)使用，并在連續(xù)抽取期間儲存在5-『C的溫度下。復(fù)合胰島素是用氯化鈉配制成無菌等滲水性混懸劑的摩爾比為9-20:l的人重組(rh)胰島素和平均麗為150kDa的透明質(zhì)素的復(fù)合物；對口服應(yīng)用而言，不加氯化鈉。當(dāng)搖動(dòng)時(shí)沉積的沉淀物很容易分散以得到保持穩(wěn)定性從而能抽取正確劑量的均勻混懸劑。用于胃腸外應(yīng)用的混懸劑和步驟是在無菌條件下進(jìn)行的。最后在無菌條件下將含有復(fù)合胰島素的分散系分配在適于胃腸外應(yīng)用的I型玻璃容器中。根據(jù)歐洲藥典測試玻璃容器。15利用DynaPro801測量分散顆粒的大小。200微米的聚集體含有小于20nm的顆粒。用于胃腸外應(yīng)用的I型玻璃容器或單劑量容器的填充體積為1.5±0.5ml。多劑量容器的填充體積為11.5±1.5ml，并根據(jù)歐洲藥典將用于胃腸外水性制劑、粉末和冷凍干燥粉末的容器用橡膠密封物進(jìn)行密封。在氨基酸分析中沒有檢測到由-S-S-橋的斷裂和氧化產(chǎn)生的半胱氨酸。胰島素和透明質(zhì)素的摩爾比是9-20:1。復(fù)合胰島素的含量測定為天然胰島素2.5士0.5mg/ml。透明質(zhì)素的濃度為3.5-6.6mg/ml。摩爾滲透壓濃度是290-320mmol/kg，就注射目的而言，摩爾滲透壓濃度是180,l/kg，pH為5.0-7.0。在糖尿病大鼠中皮下注射組合物后進(jìn)行生物測定以確定血液葡萄糖濃度。就STZ糖尿病大鼠而言，在1小時(shí)內(nèi)的降低應(yīng)當(dāng)^15mM。根據(jù)Jederstrom等人的PharmRes.2004，21(11):2040-7進(jìn)行測定。供口服應(yīng)用的混懸劑在配有給藥分配裝置的單劑量容器或多劑量容器中口服施用。胃不溶性硬殼膠囊制備旨在供口服施用的在胃不溶性膠囊中的復(fù)合胰島素，所述膠囊含有3mg復(fù)合胰島素，其是通過無定形胰島素和無定形透明質(zhì)素復(fù)合而得到的并且以天然胰島素形式測定。所述膠囊為具有胃不溶性硬殼的固體制劑(即腸溶膠囊)。將所述胃不溶性膠囊制成延遲釋放膠囊以抵抗胃液并在腸液中釋放復(fù)合胰島素，所述胃不溶性膠囊是利用本發(fā)明的自由流動(dòng)粉末填充膠囊制得的。自由流動(dòng)粉末在離開胃后60秒鐘內(nèi)釋放復(fù)合胰島素。測試1+1用水稀釋的胃不溶性軟殼膠囊和硬殼膠囊氨基酸分析顯示-在氨基酸分析中未檢測到由-S-S-橋的斷裂和氧化產(chǎn)生的半胱氨酸；_胰島素和透明質(zhì)素的摩爾比是9-20:1;-所檢測的復(fù)合胰島素的含量為天然胰島素2.5±0.5mg/ml。-透明質(zhì)素的濃度為3.5-6.6mg/ml。權(quán)利要求一種穩(wěn)定化的、自由基減少的膠體水性混懸劑，所述混懸劑含有平均分子量(平均MW)范圍為80-400kDa的無定形透明質(zhì)酸(HA)與無定形蛋白質(zhì)藥物的復(fù)合物以及用于將含水量降至盡可能低的過量HA。2.權(quán)利要求l的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑，其中所述過量HA的HA的平均麗范圍是6-15kDa。3.權(quán)利要求1或2的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑，其中所述混懸劑還包含平均麗范圍為l-8kDa的HA，并且所述混懸劑是冷凍干燥的自由流動(dòng)粉末形式。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑，其中所述蛋白質(zhì)藥物選自胰島素、胰高血糖素樣肽-l(GLPl)、人生長激素(hGH)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和超氧化物歧化酶(SOD)。5.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑以及可藥用載體。6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述可藥用載體是用于口服施用所述膠體狀水性混懸劑的可口服分配給藥裝置。7.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述可藥用載體是可口服遞送的膠囊。8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述膠囊被設(shè)計(jì)成用于腸道內(nèi)遞送所述組合物。9.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述可藥用載體是用于胃腸外施用所述膠體水性混懸劑的給藥裝置。10.—種制備透明質(zhì)酸(HA)與蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的、自由基減少的膠體水性混懸劑的方法，包括在惰性條件下進(jìn)行下述步驟(a)將平均分子量(平均麗)范圍是80-400kDa的HA的水溶液冷凍干燥并在足夠的時(shí)間內(nèi)維持所述冷凍干燥，以得到無定形形式的HA;(b)將所述蛋白質(zhì)藥物的水溶液冷凍干燥并在足夠的時(shí)間內(nèi)維持所述冷凍干燥，以得到無定形形式的蛋白質(zhì)藥物；(c)將所述冷凍干燥的無定形HA與電解質(zhì)和水的混合物相混合，從而在所得均一混合物的HA上得到雙電層；(d)在短至不使蛋白質(zhì)變性的時(shí)間內(nèi)在低pH下加入冷凍干燥的無定形蛋白質(zhì)藥物，從而在所述無定形蛋白質(zhì)藥物上得到雙電層；(e)使水和離子含量降至最低，從而使疏水性表面彼此吸引而形成所述無定形HA與所述無定形蛋白質(zhì)藥物的復(fù)合物，并且從而升高復(fù)合物的PH值；以及(f)在盡可能少量水中加入平均麗范圍是6-15kDa的過量HA，以產(chǎn)生含有所述無定形HA與所述無定形蛋白質(zhì)藥物的復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體混懸劑。11.權(quán)利要求IO的方法，其中步驟(a)中的所述冷凍干燥在-4(TC或更低的溫度下進(jìn)行。12.權(quán)利要求IO的方法，其中步驟(b)中的所述冷凍干燥在-3(TC或更低的溫度下進(jìn)行。13.權(quán)利要求10的方法，其中步驟(d)中所述低pH的范圍是l-2，并且在步驟(f)中所述pH值范圍升高至6-8。14.權(quán)利要求10的方法，其中步驟(a)中所述HA的平均麗是150kDa，步驟(f)中所述HA的平均MW是8kDa。15.權(quán)利要求IO的方法，其中步驟(a)中的所述冷凍干燥在-5(TC或更低的溫度下進(jìn)行，步驟(b)中的所述冷凍干燥在-45t:或更低的溫度下進(jìn)行，步驟(d)中的所述pH是l.5，步驟(f)中的所述PH是6.5。16.權(quán)利要求10的方法，其中所述方法還包括將(f)中得到的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑與所添加的平均麗是l-8kDa的HA—起冷凍干燥，以得到自由流動(dòng)的粉末。17.權(quán)利要求10或16的方法，其中所得的含有無定形HA和無定形蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑或其自由流動(dòng)粉末被分配為供口服施用的可分配劑量單位。18.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的方法，其中所得的含有無定形HA和無定形蛋白質(zhì)藥物之復(fù)合物的穩(wěn)定化的膠體水性混懸劑或其無菌溶液被分配為供胃腸外施用的劑量單位。19.權(quán)利要求10-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)藥物選自胰島素、胰高血糖素樣肽-l(GLPl)、人生長激素(hGH)、促紅細(xì)胞生成素(EP0)和超氧化物歧化酶(S0D)。全文摘要本發(fā)明描述了一種穩(wěn)定化的、自由基減少的膠體水性混懸劑，所述混懸劑含有平均分子量(平均MW)范圍為80-400kDa的無定形透明質(zhì)酸(HA)與無定形蛋白質(zhì)藥物(例如胰島素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、人生長激素(hGH)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)或超氧化物歧化酶(SOD))的復(fù)合物以及過量HA，其中所述過量HA例如是平均MW范圍6-15kDa的HA，從而將含水量降至盡可能低。當(dāng)所述組合物是冷凍干燥的自由流動(dòng)粉末形式時(shí)，其可額外包含平均MW范圍為1-8kDa的HA。此外，還公開了含有所述混懸劑的藥物組合物以及制備所述混懸劑的方法，所述方法包括制備無定形透明質(zhì)酸和無定形蛋白質(zhì)。所述藥物組合物旨在用于口服和胃腸外施用。文檔編號A61K38/27GK101743021SQ200880023721公開日2010年6月16日申請日期2008年5月7日優(yōu)先權(quán)日2007年5月7日發(fā)明者古斯塔夫·耶德斯特倫,米卡埃爾·耶德斯特倫申請人:耶德斯特倫制藥有限公司