專利名稱：：與腫瘤轉(zhuǎn)移的新生血管相關(guān)的纖維蛋白原的ed-a抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肺癌的檢測和治療。本發(fā)明還涉及淋巴瘤的檢測和治療。本發(fā)明包括結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，尤其是結(jié)合纖連蛋白的ED-A結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血管發(fā)生描述從已有的血管生長新的血管，在成人中很少發(fā)生，但是是多種疾病，包括實體瘤的生長，的典型特征。對于腫瘤來說，血管發(fā)生必須是直徑生長超過幾毫米，腫瘤可以通過分泌各種生長因子，例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)來誘導(dǎo)血管發(fā)生。由血管發(fā)生導(dǎo)致形成的新血管被稱為腫瘤新生血管，旺盛的新生血管是惡性腫瘤的特征。纖連蛋白(FN)是在各種正常組織和體液中廣泛表達(dá)的糖蛋白。它是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的成分，在多種生物進(jìn)程中起作用，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、瘀血、血栓癥、傷口愈合、組織分化和致癌性轉(zhuǎn)化。通過初級轉(zhuǎn)錄本FNpre-iriRNA的三個區(qū)(ED_A、ED_B、HICS)的選擇性剪接產(chǎn)生不同的FN同種型，一個通過細(xì)胞因子和胞外pH調(diào)節(jié)的過程(Balza1988;Carnemo11a1989;Borsi1990;Borsi1995)。纖連蛋白包含可進(jìn)行選擇性剪接的兩種類型III球狀額夕卜結(jié)構(gòu)域ED—A禾口ED—B(ffrench—Constant1995、Hynes1990、Kasparetal.2006)。小鼠纖連蛋白和人纖連蛋白的ED-A是96.7%相同的(在兩個90個氨基酸的序列中只有3個氨基酸不同，見圖2)。已報道了纖連蛋白ED-A在腫瘤細(xì)胞和實體腫瘤中的表達(dá)，在乳腺癌(Jacobsetal.2002、Matsumotoetal.1999)和肝癌(Oyamaetal.1989、Tavianetal.1994)中以mRNA水平，和在纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和黑素瘤中以分離蛋白質(zhì)的水平(Borsietal.1987)。在免疫組織化學(xué)水平上，已在牙源性腫瘤(Heikinheimoetal.1991)和肝細(xì)胞癌(Koukoulisetal.1995)的細(xì)胞外基質(zhì)中檢測到了ED_A的存在。相比之下，在惡性乳腺腫瘤(Koukoulisetal.1993)的基質(zhì)中，在分化良好的腎細(xì)胞癌(Lohietal.1995)的血管和基底膜中檢測到了ED-A。但是，在分化較少的腎細(xì)胞癌(Lohietal.1995)和甲狀腺乳頭狀癌(Scarpinoetal.1999)中，在血管中、基底膜和腫瘤基質(zhì)中檢測到了ED_A。也已報道了ED-A在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的脈管系統(tǒng)中的存在(Borsietal.1998)。因此，不同類型腫瘤的ED-A的表達(dá)形式是高度可變的。本文中顯示了ED-A在肺腫瘤，包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的腫瘤，的新生血管中選擇性表達(dá)。因為對于靜脈給藥的治療劑，腫瘤血管是容易接觸的(NeriandBicknell2005，Rybaketal.2006，Thorpe2004，TrachselandNeri2006)，結(jié)合分子，如結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的抗體分子，代表了新型制劑，其可以被用于治療肺癌，包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的藥物的制備。此外，在本文中顯示了ED-A在淋巴瘤的新生血管中選擇性表達(dá)。因為，對于靜脈給藥的治療劑，血管是容易接觸的(NeriandBicknell2005，Rybaketal.2006，Thorpe2004，TrachselandNeri2006)，結(jié)合分子，如結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的抗體分子代表了新型制劑，其可以被用于治療淋巴瘤的藥物的制備。腫瘤新生血管(腫瘤血管靶向)治療是用于治療腫瘤的有前途的方法。腫瘤細(xì)胞靶向的目的在于在腫瘤自身內(nèi)部破壞血管，減少血流從而剝奪腫瘤的氧氣和營養(yǎng)，造成腫瘤細(xì)胞死亡。
發(fā)明內(nèi)容本文中提供了抗-ED-A抗體，其選擇性地識別肺腫瘤(包括小細(xì)胞肺腫瘤和非小細(xì)胞肺腫瘤)的新生血管。本文還提供了抗ED-A抗體，其選擇性地識別淋巴瘤的新生血管。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白(或稱"纖維連接蛋白")的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型(A-FN)的結(jié)合成員例如抗體分子在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制備治療肺癌的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型(A-FN)的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制備治療淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制備治療淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到肺腫瘤的新生血管。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到肺腫瘤的新生血管。該結(jié)合成員可被用于制造用于遞呈這種分子的藥物。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到淋巴瘤的新生血管。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子的應(yīng)用，用于將結(jié)合到該結(jié)合成員的分子遞呈到淋巴瘤的新生血管。該結(jié)合成員可被用于制造用于遞呈這種分子的藥物。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制造在肺癌診斷中使用的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子在制造用于肺癌診斷的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子在用于制造在淋巴瘤斷中使用的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，在制造用于淋巴瘤診斷的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了檢測和診斷人和動物的肺癌的方法，其包含以下步驟(a)將結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人和動物，禾口(b)確定該結(jié)合成員在人和動物體的肺中是否存在；其中該結(jié)合成員在肺中的定位顯示了肺癌的存在。本發(fā)明還提供了檢測和診斷人和動物的淋巴瘤的方法，其包含以下步驟(a)將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人和動物，和(b)確定該結(jié)合成員在人和動物體的淋巴系統(tǒng)中是否存在；其中該結(jié)合成員在淋巴系統(tǒng)中的定位顯示了淋巴瘤的存在。本發(fā)明提供了治療個體的肺癌的方法，包括將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的藥物給藥于個體。本發(fā)明還提供了治療個體的肺癌的方法，包含將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，的藥物給藥于個體。本發(fā)明提供了治療個體的淋巴瘤的方法，包括將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員例如抗體分子的藥物給藥于個體。本發(fā)明還提供了治療個體的淋巴瘤的方法，包括將治療有效量的包含了結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員例如抗體分子的藥物給藥于個體。本發(fā)明提供了將分子遞呈給人或動物的肺腫瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動物，其中該結(jié)合成員連接該分子。本發(fā)明還提供了將分子遞呈給人或動物的肺腫瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動物，其中該結(jié)合成員連接(conjugate)該分子。本發(fā)明提供了將分子遞呈給人或動物的淋巴瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動物，其中該結(jié)合成員連接該分子。本發(fā)明還提供了將分子遞呈給人或動物的淋巴瘤新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，給藥于人或動物，其中該結(jié)合成員連接該分子。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9或其變異體的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9或其變異體的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含抗體F8或其變異體的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的一組H和/或LCDR，或抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的一組H和/或LCDR，并且在公開的H和/或LCDR組中具有10個或更少，如一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員包含抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9的一組H和/或LCDR，并且在所公開的H和/或LCDR組中具有10個或更少，如一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員包含抗體F8的一組H和/或LCDR，并且在所公開的H和/或LCDR組中具有10個或更少，如一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代?？赡茉贑DR組中的任何殘基上潛在地進(jìn)行取代，可能在CDR1、CDR2和/或CDR3中。例如，本發(fā)明中使用的結(jié)合成員可以包含如本文所描述的一個或多個CDR，例如CDR3，并且可選地還有CDR1和CDR2從而形成一組CDR。用于本發(fā)明的結(jié)合成員還包含抗體分子，例如，人抗體分子。該結(jié)合成員通常包含抗體VH和/或VL域。還提供結(jié)合成員的VH域用于本發(fā)明。在每個VH和VL域中是互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和構(gòu)架區(qū)(FR)。VH域包含一組HCDR，V1域包含一組LCDR?？贵w分子可以包含含有VHCDR1、CDR2和CDR3和構(gòu)架的抗體VH域。它可替換地或者還包含含有VLCDRl、CDR2和CDR3和構(gòu)架的抗體VL域。在本文描述了抗體1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8和G9的VH和VL域和CDR。本文中公開的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR組和HCDR組和LCDR組代表了用于本發(fā)明的結(jié)合成員的實施例。如本文中所描述的，"CDR組"(或稱"一組CDR")包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一組HCDR(或稱"HCDR組")是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，一組LCDR(或稱"LCDR組")是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有說明，"CDR組"包括HCDR和LCDR。在本發(fā)明中使用的結(jié)合成員可包括包含了互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3和構(gòu)架的抗體VH域，其中HCDR1是SEQIDNO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，其中可選地，HCDR2是SEQIDNO:4禾P/或HCDR3是SEQIDNO:5。優(yōu)選，HCDR1是SEQIDNO:23、33、43、53、73、83或103。最優(yōu)選，HCDR1是SEQIDNO:83。通常，VH域與VL域配對從而提供抗體抗原結(jié)合位點，盡管如下文中進(jìn)一步討論的可單獨使用VH或VL域來結(jié)合抗原。因此，用于本發(fā)明的結(jié)合成員還可以包括包含了互補(bǔ)決定區(qū)LCDRl、LCDR2和LCDR3和構(gòu)架的抗體VL域，其中LCDR1是SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，其中可選地，LCDR2是SEQIDNO:7和/或LCDR3是SEQIDNO:8。優(yōu)選，LCDRl是SEQIDNO:26、36、46、56、76、86或106。最優(yōu)選，LCDRl是SEQIDNO:86。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以為纖連蛋白的ED-A的分離的抗體分子，包含VH域和VL域，其中VH域包含構(gòu)架和一組互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中VL域包含互補(bǔ)決定區(qū)LCDRl、LCDR2和LCDR3和構(gòu)架，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4，HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5，LCDRl具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116;LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7;禾口LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8?？贵w的一個或多個CDR或一組CDR可以被移植到一個構(gòu)架中(例如，人構(gòu)架)從而產(chǎn)生用于本發(fā)明的抗體分子。構(gòu)架區(qū)可以包含人種系基因片段序列。因此，構(gòu)架可以為種系，由此構(gòu)架中的一個或多個殘基可以被改變從而匹配最相似的人種系構(gòu)架中的等效位置的殘基。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可為具有包含在人種系構(gòu)架(例如DP47)中的一組HCDR的VH域的分離的抗體分子。通常，該結(jié)合成員還具有包含在人種系構(gòu)架中的一組LCDR的VL域的分離的抗體分子。VL域的人種系構(gòu)架可以為DPK22。用于本發(fā)明的VH域可以具有氨基酸序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。優(yōu)選，用于本發(fā)明的VH域具有氨基酸序列SEQIDNO:21、31、41、51、71、81或IOI。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的VH域具有氨基酸序列SEQIDNO:81。用于本發(fā)明的VL域可以具有氨基酸序列SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。優(yōu)選，用于本發(fā)明的VL域具有氨基酸序列SEQIDN0:22、32、42、52、72、82或102。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的VL域具有氨基酸序列SEQIDNO:82。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以為單鏈Fv(scFv)，包含通過連接肽(或肽連接子)連接的VH域和VI域。技術(shù)人員可以選擇合適長度和序列的連接(子)，例如至少5或10個氨基酸的長度，達(dá)到約15、20或25個氨基酸的長度。該連接(子)可以具有氨基酸序列GSSGG(SEQIDNO:28)。scFv可以由氨基酸序列SEQIDNO:9組成或包含氨基酸序列SEQIDNO:9?；蛘?，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可在非抗體分子中包含抗原結(jié)合位點，通常通過在非抗體蛋白質(zhì)支架中的一個或多個CDR，例如一組CDR來提供。在本文的其它地方更詳細(xì)的描述了包括非抗體和抗體分子的結(jié)合成員。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以連接具有生物殺滅活性或細(xì)胞毒素活性的分子?；蛘?，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以連接放射性同位素。作為另外一個選擇，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以用可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的這些和其它方面。圖1:顯示了用scFv抗ED-A抗體D5的原發(fā)肺腫瘤切片的免疫組織化學(xué)染色。1縱欄顯示了肺癌的分類A:小細(xì)胞肺癌，B:非小細(xì)胞肺癌，C:鱗狀細(xì)胞癌，D:腺癌，E:細(xì)支氣管肺泡癌和F:大細(xì)胞癌。2和3縱欄顯示了不同亞類型的肺腫瘤的組織切片中的ED-A的免疫組織化學(xué)檢測?？v欄2和3中顯示的每一亞類型的組織切片從相同的腫瘤樣品獲得。免疫組織化學(xué)染色(暗線)顯示出在A:小細(xì)胞肺癌和B:非小細(xì)胞肺癌中的原發(fā)腫瘤切片中染色的強(qiáng)烈(strong,濃)的血管圖案(C:鱗狀細(xì)胞癌，D:腺癌，E:細(xì)支氣管肺泡癌和F:大細(xì)胞癌)。圖2:顯示了A:人ED_A(上部的序列)和B:小鼠ED_A(下部序列)之間的比對。星號顯示人ED-A和小鼠ED-A的氨基酸相同的氨基酸位置。圖3A:顯示了抗ED-A抗體H1的重鏈(VH)的核苷酸序列(SEQIDNO:12)。抗ED-A抗體H1的重鏈CDR1的核苷酸序列是有下劃線的。抗ED-A抗體H1重鏈CDR2的核苷酸序列以斜體和下劃線表示?？笶D-A抗體H1重鏈CDR3的核苷酸序列以粗體和下劃線表示。B:顯示了抗ED-A抗體H1連接(子)序列的核苷酸序列(SEQIDNO:14)。C:顯示了抗ED-A抗體H1的輕鏈(VL)的核苷酸序列(SEQIDNO:13)?？笶D_A抗體HI的輕鏈CDR1的核苷酸序列以下劃線表示。抗ED-A抗體H1的輕鏈CDR2的核苷酸序列以斜體和下劃線表示。抗ED-A抗體HI的輕鏈CDR3的核苷酸序列以粗體和下劃線表示。圖4A:顯示了抗ED-A抗體HI重鏈(VH)的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。抗ED-A抗體H1重鏈CDR1的氨基酸序列(SEQIDNO:3)以下劃線表示?？笶D-A抗體H1重鏈CDR2的氨基酸序列(SEQIDNO:4)以斜體下劃線表示?？笶D-A抗體H1重鏈CDR3的氨基酸序列(SEQIDNO:5)以粗體下劃線表示。B:顯示了抗ED-A抗體H1連接(子)序列的氨基酸序列(SEQIDNO:11)。C:顯示了抗ED-A抗體H1的輕鏈(VL)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)?？笶D-A抗體H1的輕鏈CDR1的氨基酸序列(SEQIDNO:6)是有下劃線的?？笶D-A抗體H1的輕鏈CDR2的氨基酸序列(SEQIDNO:7)是以斜體和下劃線表示的?？笶D_A抗體HI的輕鏈CDR3的氨基酸序列(SEQIDNO:8)是以粗體和下劃線表示的。具體實施方式專用術(shù)語纖連蛋白纖連蛋白是進(jìn)行選擇性剪接的抗原，已知數(shù)種可選的纖連蛋白同種型，如在本文其它部分所描述的。額外結(jié)構(gòu)域-A(EDA或ED-A)還被稱為ED，額外類型III重復(fù)A(EIIIA)或EDI。Kornblihtt等(1984)，NucleicAcidsRes.12，5853-5868和Paolella等(1988)，NucleicAcidsRes.16,3545-3557已經(jīng)公布了人ED-A的序列。還可以從SwissProt數(shù)據(jù)庫以登陸號為P02751存儲的氨基酸序列的氨基酸1631-1720(纖連蛋白類型-III12;額外結(jié)構(gòu)域2)獲得人ED-A序列?？梢詮腟wissProt數(shù)據(jù)庫以登陸號為P11276存儲的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(纖連蛋白III型13;額外結(jié)構(gòu)域2)獲得小鼠ED-A序列。纖連蛋白的ED-A同種型(A-FN)包含額外結(jié)構(gòu)域_A(ED_A)。人A_FN的序列可以從相應(yīng)的人纖連蛋白前體序列(其可以登陸號P092751從SwissProt數(shù)據(jù)庫獲得)推導(dǎo)出。小鼠A-FN的序列可以從相應(yīng)的小鼠纖連蛋白前體序列(其可以登陸號P11276從SwissProt數(shù)據(jù)庫獲得)推導(dǎo)出。A-FN可為人纖連蛋白的ED-A同種型。ED-A可以為人纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A。ED-A是90個氨基酸序列，其通過選擇性剪接插入纖連蛋白(FN)并且位于FN的結(jié)構(gòu)域11和12之間(Borsietal.1987，J.CelIBiol.，104，595-600)。在多數(shù)情況下，ED-A不存在于血漿形式的FN，但是在胚胎發(fā)生、組織重塑、纖維化、心臟移植和實體瘤生長過程中大量存在。選擇性剪接選擇性剪接是指DNA的初級RNA轉(zhuǎn)錄本發(fā)生不同剪接形式從而產(chǎn)生不同的mRNA。在切除內(nèi)含子之后，可以確定選擇哪一個外顯子被剪接在一起從而形成mRNA。選擇性剪接導(dǎo)致包含不同外顯子和/或不同數(shù)量外顯子的不同的同種型的產(chǎn)生。例如，一種同種型可以包含對應(yīng)于一個或多個外顯子的額外的氨基酸序列，其可包含一個或多個結(jié)構(gòu)域。^林巴瘤這描述了一種涉及被稱為淋巴細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的癌癥類型，并且其特征在于這些細(xì)胞的異常增殖。有多種淋巴瘤亞型，它們可以被分為兩種主要類別霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤?；羝娼鹆馨土鍪怯商禺愋援惓淋巴細(xì)胞系發(fā)展形成，而非霍奇金淋巴瘤可能來源于異常的B、T或NK細(xì)胞，并且可通過獨特的基因標(biāo)記進(jìn)行區(qū)別。Burkitt淋巴瘤是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的實例。本文中提到的淋巴瘤可以為原發(fā)性淋巴瘤。本文中提到的淋巴瘤可以為霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。優(yōu)選，本文中提到的淋巴瘤為原發(fā)性霍奇金淋巴瘤或原發(fā)性非霍奇金淋巴瘤。肺癌這描述了肺組織的惡性變形和增大。肺癌可以被分為兩種主要類別小細(xì)胞肺癌(小細(xì)胞癌)和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌的亞類型為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。細(xì)支氣管肺泡癌是腺癌的亞類型。本文中提到的肺癌可以為原發(fā)性肺癌。肺腫瘤是動物(例如，人)的肺中的腫瘤，其是肺癌的結(jié)果。本文中提到的肺腫瘤可以為原發(fā)性肺腫瘤。原發(fā)性腫瘤這描述了位于腫瘤最初形成的位點上(原發(fā)位點)的腫瘤。原發(fā)性腫瘤有時候從它們的初始位點(原發(fā)位點)散布從而在動物體的其它位點形成繼發(fā)腫瘤(轉(zhuǎn)移)，該散布被稱為轉(zhuǎn)移。結(jié)合成員這描述了互相結(jié)合的一對分子中的一個成員。結(jié)合對的成員可以源于自然，或部分或全部合成產(chǎn)生。分子對的一個成員在其表面上具有結(jié)合于并且因此互補(bǔ)于分子對的另外一個成員的特殊空間或極性組織的表面區(qū)域或空穴。結(jié)合對類型的實例為抗原_抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發(fā)明關(guān)注的是抗原-抗體類型的反應(yīng)。結(jié)合成員通常包含具有抗原_結(jié)合位點的分子。例如，結(jié)合成員可以為包含抗原結(jié)合位點的抗體分子或非抗體蛋白?？梢酝ㄟ^在非抗體蛋白質(zhì)支架，如纖連蛋白或細(xì)胞色素B等上安排互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)來產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(Haan&Maggos，2004;Koide1998;Nygren1997)，或通過隨機(jī)排列或突變蛋白質(zhì)支架內(nèi)的環(huán)的氨基酸殘基來產(chǎn)生抗原結(jié)合位點以提供對需要的目標(biāo)的結(jié)合特異性。Nygren等已詳細(xì)綜述了用于在蛋白質(zhì)中設(shè)計新型結(jié)合位點的支架(1997)。在專利W0/0034784中公開了用于抗體模擬的蛋白質(zhì)支架，其全文通過引用結(jié)合到本文中作為參考，其中發(fā)明者描述了包括具有至少一個隨機(jī)環(huán)的纖連蛋白類型III域的蛋白質(zhì)(抗體模擬)?？梢酝ㄟ^免疫球蛋白超基因族中的任意域成員來提供適合于移植入一個或多個CDR，例如一組HCDR的支架。支架可以為人或非人蛋白質(zhì)。非抗體蛋白質(zhì)支架的優(yōu)勢在于其可以在與至少一些抗體分子相比更小和/或更易制造的支架分子中提供抗原結(jié)合位點。小尺寸的結(jié)合成員可以提供有用的生理特性，如進(jìn)入細(xì)胞的能力，深入組織或接觸其它結(jié)構(gòu)中的靶，或結(jié)合靶抗原的蛋白質(zhì)空穴的能力。在Wess，2004中綜述了抗原結(jié)合位點在非抗體蛋白質(zhì)支架中的應(yīng)用。一般為具有穩(wěn)定骨架和一個或多個可變的環(huán)的蛋白質(zhì)，其中一個或多個環(huán)的氨基酸序列被特異性或隨機(jī)地突變從而產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的抗原結(jié)合位點。這樣的蛋白質(zhì)包括金黃色釀膿葡萄球菌S.aureus的蛋白質(zhì)A、鐵傳遞蛋白、四聯(lián)蛋白、纖連蛋白(例如，第10纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域)和脂籠蛋白的IgG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其它的方法包括合成"微體(細(xì)胞)(SelecoreGmbH)，其是基于具有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白質(zhì)-環(huán)蛋白。除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，如折疊結(jié)構(gòu)域，或者從而提供分子除了結(jié)合抗原能力的其它功能特性。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以具有可檢測標(biāo)記，或可以連接毒素或靶定部分targetingmoiety或酶(例如，通過肽鍵或連接子)。例如，結(jié)合成員可以包含催化部位(例如，在酶結(jié)構(gòu)域中)以及抗原結(jié)合位點，其中抗原結(jié)合位點結(jié)合抗原并且因此將催化部位靶定于抗原。催化部位可以抑制抗原的生物功能，例如通過裂解。盡管已知CDR可以被非抗體支架所附載，附載CDR或一組CDR的結(jié)構(gòu)通常為抗體重鏈或輕鏈或其主要部分substantialportion,其中CDR或CDR組位于對應(yīng)于由重組免疫球蛋白基因編碼的自然產(chǎn)生的VH和VL抗體可變域的CDR或CDR組的位置。通過參考Kabat1987和其現(xiàn)在互聯(lián)網(wǎng)上可獲得的更新(immuno.bme.nwu.edu或通過任何搜索引擎查找〃Kabat")，可以確定免疫球蛋白可變域的結(jié)構(gòu)和位置。通過CDR或CDR區(qū)，希望顯示如Kabat等所定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)(1987)，(Kabat1991a，和較新的版本)?？贵w一般包含3個重鏈CDR和3個輕鏈CDR。這里使用的術(shù)語CDR是為了表示，根據(jù)該情況，包含大部分的負(fù)責(zé)通過抗體對其識別CN101754978A的抗原或抗原決定基的親和力進(jìn)行結(jié)合的氨基酸殘基的這些區(qū)域中的一個或多個，甚至整個。在六個短CDR序列中，重鏈的第三個CDR(HCDR3)具有更大的尺寸可變性(主要是由于生成基因的基因排列機(jī)制的更大的多樣性)。它可以短到2個氨基酸，雖然最長的尺寸已知是26。功能上，HCDR3在確定抗體的特異性上起到部分作用(Segal1974;Amit1986;Chothia1987;Chothia1989;Caton1990;Sha皿1990a;Sha皿1990b;Kabatetal.，1991b)?？贵w分子這里描述了自然產(chǎn)生或部分或完全合成的免疫球蛋白。該術(shù)語還涵蓋了包含抗體抗原結(jié)合位點的多肽或蛋白質(zhì)。在這里必須理解本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，即它們不是在它們天然的環(huán)境中，而是已經(jīng)能夠通過從天然來源純化來分離或獲得，或通過基因重組，或通過化學(xué)合成來獲得，因此它們能夠包含非天然的氨基酸殘基，如此后描述的。包含抗體抗原結(jié)合位點的抗體片段包括，但是不限定于如Fab、Fab'、Fab'_SH、scFv、Fv、dAb、Fd的抗體分子和雙體抗體。采用單克隆或其它抗體，使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的其它抗體或嵌合分子是可能的。這樣的技術(shù)可包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)或抗體CDR的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)及構(gòu)架區(qū)。例如，見EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400，以及大量的后續(xù)資料。產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞可以進(jìn)行基因突變或其它改變，其可能會或不會改變抗體產(chǎn)生的結(jié)合特異性?？贵w可以以多種方法改進(jìn)，術(shù)語"抗體分子"應(yīng)該被理解為涵蓋具有需要的特異性和/或結(jié)合抗原的抗體抗原結(jié)合位點的任何結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語包括抗體片段和衍生物，包括包含抗體抗原結(jié)合位點的多肽，無論是天然或完全或部分合成。因此包括與其它的多肽(例如，來源于其它物種或?qū)儆谄渌贵w類或亞類)融合的包含抗體抗原結(jié)合位點的嵌合分子，或等效物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023和大量后續(xù)的文獻(xiàn)中描述了嵌合抗體的克隆和表達(dá)?？贵w工程
技術(shù)領(lǐng)域：
中的其它可用技術(shù)已使分離人或人源化抗體成為可能。例如，可根據(jù)Kontermann&Dubel(2001)所描述的制造人雜種瘤。在許多公開文獻(xiàn)如W092/01047(后面進(jìn)一步討論)和美國專利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404和Kontermann&Dubel(2001)中已經(jīng)詳細(xì)描述了噬菌體展示，一種其它的已建立的產(chǎn)生結(jié)合成員的技術(shù)。其中小鼠抗體基因被失活并且被功能性地以人抗體基因取代，但是小鼠免疫系統(tǒng)的其他組成保持完整的基因改造小鼠可以被用于分離人抗體(Mendez1997)?？赏ㄟ^以合成寡核苷酸并且與合適的表達(dá)載體組裝的方法產(chǎn)生的基因的表達(dá)來產(chǎn)生合成抗體分子，例如Knappik等(2000)或Krebs等(2001)所描述的。已顯示完整抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實例為(i)由VL、VH、CL和CHl域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的VL和VH域組成的Fv片段；(iv)由VH和VL域組成的dAb片段(Ward1989;McCafferty1990;Holt2003);(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab')2片段，包含兩個連接的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域與VL域通過肽連接子連接，其可使兩個域相聯(lián)合從而形成抗原結(jié)合位點(Bird1988;Huston1988);(viii)雙特異單鏈Fv二聚物(PCT/US92/09965)和(ix)"雙體抗體(diabody)"，通過基因融合構(gòu)建的多價或多特異片段(W094/13804;Holliger1993a)。可通過整合連接VH和VL域的二硫鍵來穩(wěn)定Fv、scFv或雙體抗體分子(Reiter1996)。還可以制造包含結(jié)合到CH3域的scFv的微抗體(minibody)(Hu1996)。結(jié)合片段的其它實例為Fab'，其由于在重鏈CHI域的羧基末端加入幾個殘基而與Fab片段不同，包括一個或多個抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸，和Fab'_SH，其為其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基具有自由硫醇基團(tuán)的Fab'片段。用于本發(fā)明的抗體片段可從本文描述的任意抗體分子，例如，包含本文描述的任意抗體的VH和/或VL域或CDR出發(fā)，通過如酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通過化學(xué)還原來裂解二硫鍵的方法來獲得。以另外一種方式，本發(fā)明的抗體片段可以通過所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的基因重組技術(shù)等，或通過借助于例如肽自動合成儀(如AppliedBiosystems公司等提供的肽自動合成儀)的肽合成，或通過核酸合成和表達(dá)來獲得。本發(fā)明的功能抗體片段包括任何通過化學(xué)修飾，尤其是通過聚乙二醇修飾，或通過整合入脂質(zhì)體來提高其半衰期的功能片段。dAb(域抗體)是抗體的小的單體抗原結(jié)合片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)(Holt2003)。VHdAb在駱駝(例如，駱駝、美洲駝)中天然產(chǎn)生，可以通過以耙抗原來免疫駱駝，分離抗原特異性B細(xì)胞，直接從單個B細(xì)胞中克隆dAb基因來獲得。在細(xì)胞培養(yǎng)物中也可產(chǎn)生dAb。它們較小的尺寸，良好的可溶性和溫度穩(wěn)定性使它們尤其在生理上適合用于篩選和親和力成熟。本發(fā)明的結(jié)合成員可以為包含VH或VL域(基本如本文所列出的)或包含一組CDR(基本如本文所列出的)的VH或VL域的dAb。如本文中所使用的，短語"基本如列出(setout，示出)的"是指本文所描述的結(jié)合成員的VH或VL域的相關(guān)的CDR與本文所顯示的序列的特定區(qū)域相同或高度相似的特性。如本文中所描述的，短語相對于一個或多個可變區(qū)的特定區(qū)域的"高度相似"，被認(rèn)為是可在CDR和/或VH或VL域進(jìn)行1至約5，例如，1至4，包括1至3，或1或2，或3或4個的氨基酸取代。雙特異或雙功能抗體形成了單克隆抗體的第二代，其中兩個不同的可變區(qū)結(jié)合到同一分子中(Holliger1999)。由它們募集新效應(yīng)物功能或靶定腫瘤細(xì)胞表面上幾個分子的能力，在診斷和治療領(lǐng)域都證明了它們的用途。在要使用雙特異抗體的情況下，它們可以為傳統(tǒng)的雙特異抗體，其可以以多種方法制造(Holliger1993b)，例如化學(xué)制備或從雜交雜種瘤，或可以為以上所提到的任意的雙特異抗體片段?？梢酝ㄟ^化學(xué)方法(Gle皿ie1987;R印p1995)或動物體方法(Staerz1986;Suresh1986)獲得這些抗體，但是也可以通過基因工程技術(shù)，其可強(qiáng)制進(jìn)行異二聚作用(heterodimerization)，因此有利于所需要的抗體的純化過程(Merchand1998)。雙特異抗體的實例包括BiTE技術(shù)的那些，其中可以使用具有不同特異性的兩個抗體的結(jié)合域，并且通過短的柔性肽連接。這將兩個抗體結(jié)合在一個短的多肽鏈上?？梢灾皇褂每勺儏^(qū)域構(gòu)建沒有Fc區(qū)的雙體抗體和scFv，可能會減少抗獨特型反應(yīng)的影響。雙特異抗體可被構(gòu)建為完整IgG、雙特異Fab'2、Fab'PEG、雙體抗體或也可為雙特異scFc。此外，可以使用所屬領(lǐng)域已知的常規(guī)方法將兩個雙特異抗體連接從而形成四價抗體。與雙特異整體抗體相反，雙特異雙抗體(bispecificdiabodies)還是尤其有用的，因為它們?nèi)菀妆粯?gòu)建及在E.coli中被表達(dá)?？赏ㄟ^使用噬菌體展示(W094/13804)從文庫方便地篩選合適的結(jié)合特異性的雙體抗體(和許多其它的多肽，如抗體片段)。如果雙體抗體的一個臂保持，例如針對靶抗原的特異性的恒定，則可制造一個文庫，其中其它臂是可變的，選擇合適特異性的抗體?？赏ㄟ^Ridgeway1996描述的可選擇的工程方法來制造雙特異整體抗體。所屬領(lǐng)域中具有多種方法來獲得抗靶抗原的抗體。該抗體可為單克隆抗體，尤其是人的、鼠科的、嵌合的或人源化的，其可以根據(jù)所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法來獲得?！銇碚f，對于單克隆抗體或其功能片段(尤其是鼠源的)的制備，可能是指尤其是手冊"Antibodies〃(HarlowandLane1988)中描述的技術(shù)或是指Kohler和Milstein描述的從雜交瘤制備的技術(shù)(1975)。單克隆抗體可從例如針對A-FN或它的包含所述的單克隆抗體識別的抗原決定基的片段之一(例如包含ED-A或由ED-A構(gòu)成的片段、或ED-A的肽片段)免疫了的動物細(xì)胞來獲得。特別是可以根據(jù)常規(guī)的工作方法來產(chǎn)生A-FN或其片段之一，通過從包含在編碼A-FN或其片段的cDNA序列中的核酸序列出發(fā)的基因重組，通過從包含在A-FN和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列出發(fā)的肽合成?？梢岳缭谟H和柱上純化單克隆抗體，在親和柱上A-FN或它的包含被所述的單克隆抗體識別的抗原決定基的片段之一(例如包含ED-A或由ED-A組成的片段或ED-A肽片段)先被固定。通過在蛋白A和/或G上的色譜層析可以純化單克隆抗體，隨后進(jìn)行或不進(jìn)行旨在去除其自身的殘余的蛋白質(zhì)污染物以及DNA和LPS的離子交換層析，隨后進(jìn)行或不進(jìn)行用于去除由于二聚物或其它的多聚體的存在產(chǎn)生的可能的聚合體的在瓊脂糖凝膠上的排阻層析。所有這些技術(shù)可以同時使用或者依次使用?？乖Y(jié)合位點這描述了結(jié)合并且與整個或部分靶抗原互補(bǔ)的分子部分。在抗體分子中，它被稱為抗體抗原結(jié)合位點，包含結(jié)合并且與整個或部分靶抗原互補(bǔ)的抗體部分。當(dāng)抗原為大抗原時，抗體可能只結(jié)合到抗原的特定部分，該部分被稱為抗原決定基?？赏ㄟ^一個或多個抗體可變區(qū)來提供抗體抗原結(jié)合位點?？贵w抗原結(jié)合位點可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。分離的這表示用于本發(fā)明的結(jié)合成員或編碼這樣的結(jié)合成員的核酸的狀態(tài)，會基本與本發(fā)明一致。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員、VH和/或VL域可以以被分離的和/或被純化來被提供，例如從它們的天然環(huán)境，以基本純化或均質(zhì)的形式，或在核酸的情況下，除了編碼具有所需功能的多肽的序列，沒有或基本沒有源核酸或基因。分離的成員或分離的核酸沒有或基本沒有它們天然相聯(lián)的物質(zhì)，如在其天然環(huán)境中或在其被制備的環(huán)境(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物)(當(dāng)這樣的制備是通過體外或體內(nèi)操作的重組DNA技術(shù))中發(fā)現(xiàn)與其在一起的其它的多肽和核酸。成員和核酸可以與稀釋劑或佐劑配制，仍然是基于被分離的操作目的_例如如果用于涂覆免疫測定用的微量滴定板，成員通常會與凝膠或其它載體混合，或當(dāng)用于診斷或治療時，會與藥物可接受載體或稀釋劑混合。結(jié)合成員可以為糖基化的，天然的或通過異源真核細(xì)胞系統(tǒng)(例如，CH0或NS0(ECACC85110503)細(xì)胞)，或它們可以為非糖基化的(例如，如果通過在原核細(xì)胞中表達(dá)來產(chǎn)生)。包含抗體分子的非均質(zhì)制備也可以被用于本發(fā)明中。例如，這樣的制備可以為具有完整長度的重鏈和缺少c-末端賴氨酸的重鏈，具有各種程度的糖基化和/或具有衍生化氨基酸，如N-末端谷氨酸的環(huán)化從而形成焦谷氨酸殘基的抗體的混合物。抗原(例如A-FN或纖連蛋白的ED-A)的一個或多個結(jié)合成員可以通過將本發(fā)明的結(jié)合成員的庫與抗原或其片段(例如包含ED-A或由ED-A組成的片段或ED-A的肽片段)進(jìn)行接觸，并且選擇一個或多個能夠結(jié)合該抗原的庫的結(jié)合成員來獲得?？梢酝ㄟ^重復(fù)菌落過濾篩選(IterativeColonyFilterScreening)(ICFS)來篩選抗體庫。在ICFS中，在液體培養(yǎng)基中生長包含編碼幾種結(jié)合特異性的DNA的細(xì)菌，一旦達(dá)到對數(shù)生長期，數(shù)十億的細(xì)菌被分布到由適當(dāng)預(yù)處理的膜過濾器(其被孵育直到完全融合的細(xì)菌菌落出現(xiàn))構(gòu)成的生長支持物上。由另外一個膜過濾器構(gòu)成第二捕獲培養(yǎng)基，預(yù)先濕潤并且被所需的抗原覆蓋。然后，該捕獲膜過濾器被放置在含有合適的培養(yǎng)基并且被具有覆蓋了指向向上的細(xì)菌菌落的表面的生長過濾器覆蓋的板上。將這樣獲得的夾層結(jié)構(gòu)在室溫中孵育約16小時。由此可能獲得表達(dá)編碼具有散布作用的抗體片段scFv的基因，因此那些在捕獲膜上存在的特異性結(jié)合抗原的片段被捕獲。然后處理該捕獲膜從而以通常基于此目使用的比色方法來找出被結(jié)合的抗體片段scFv。捕獲膜上的有色點的位置使得能夠返回于對應(yīng)的細(xì)菌菌落，該細(xì)菌菌落存在于生長膜上并且產(chǎn)生被捕獲的抗體片段。收集并培養(yǎng)這樣的菌落，將數(shù)百萬該細(xì)菌分布到新的培養(yǎng)膜上重復(fù)以上所描述的程序。進(jìn)行相似的循環(huán)，直到捕獲膜上的陽性信號對應(yīng)于單一陽性菌落，單一陽性菌落中的每一個代表了針對篩選中使用的抗原的單克隆抗體片段的潛在源。在例如W00246455中描述了ICFS，其通過弓|用結(jié)合到本文中作為參考。也可以在微粒上或分子配合物上顯示庫，例如可重復(fù)遺傳包裝，如噬菌體(例如，T7)粒子，或其它的體外展示系統(tǒng)，在其上展示包含編碼抗體VH可變區(qū)的核酸的每一種微粒或分子配合物，或可選的還展示VL域(如果存在的話)。在W092/01047和例如，美國專利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404描述了噬菌體展示，其每一個的全部內(nèi)容都結(jié)合于此作為參考。在選擇了能夠結(jié)合抗原的結(jié)合成員并且在噬菌體或其它的庫粒子或分子配合物上展示之后，可從展示了所選的結(jié)合成員的噬菌體或其它的庫粒子或分子配合物獲得核酸。通過具有從展示了所選的結(jié)合成員的噬菌體或其它的庫粒子或分子配合物獲得的核酸序列的核酸的表達(dá)，這樣的核酸可被用于隨后生產(chǎn)結(jié)合成員或抗體VH或VL可變區(qū)。可以以被分離的形式提供具有所選的結(jié)合成員的抗體VH可變區(qū)的氨基酸序列的抗體VH可變區(qū)，因為結(jié)合成員包含這樣的VH域?？蛇M(jìn)一步試驗結(jié)合A-FN或纖連蛋白的ED-A或其它的耙抗原或同種型的能力，例如，與例如抗ED-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9中的任意一個競爭結(jié)合A-FN或A-FN片段(例如，纖連蛋白的ED-A)的能力。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以特異性地結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。本發(fā)明的結(jié)合成員可以以與抗ED-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9相同的親和力，例如以scFv形式，或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以3x10—8M的KD或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白蛋白的ED_A。優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以2x10—8M的KD或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。更優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以1.7X1—8的K?；蚋叩挠H和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。仍然更優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以1.4x10—8M的KD或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。最優(yōu)選，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以以3x10—9M的KD或更高的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。本發(fā)明的結(jié)合成員可以結(jié)合到與抗ED-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9相同的A-FN和/或纖連蛋白的ED_A的抗原決定基。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以不顯示對A-FN和/或纖連蛋白的ED-A以外的分子的顯著結(jié)合。尤其是，該結(jié)合成員可以不結(jié)合纖連蛋白的其它同種型，例如纖連蛋白的ED-B同種型和/或IIICS同種型。本文所公開的抗體分子的變體可以由本發(fā)明產(chǎn)生并且用于本發(fā)明中。在CDR、抗體Vh或VL域和結(jié)合成員的氨基酸序列中進(jìn)行取代所需的技術(shù)在所屬領(lǐng)域中一般是可獲得的?？赏ㄟ^取代來制造變體序列，預(yù)測該取代對活性可具有或不具有最小或有利的影響，并且試驗變體序列結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力和/或任何其它需要的特性。根據(jù)本發(fā)明可以使用任意VH和VL域的可變區(qū)氨基酸序列變體(其序列在本文進(jìn)行了特別的公開)，如討論。特殊變體可以包括一個或多個氨基酸序列的改變(氨基酸殘基的增加、缺失、取代和/或插入)，可少于約20個的改變，少于約15個的改變，少于約10個的改變，少于約5個的改變，可以為5、4、3、2或1(個的改變)?？梢栽谝粋€或多個構(gòu)架區(qū)和/或一個或多個CDR中進(jìn)行改變。該改變通常不會導(dǎo)致功能喪失，因此包含這樣改變了的氨基酸序列的結(jié)合成員會保持結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力。例如，其可能保持了與其中不進(jìn)行改變的結(jié)合成員相同數(shù)量的結(jié)合，例如，如在本文所描述的試驗中測量的。包含這樣改變了的氨基酸序列的結(jié)合成員可能提高了結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力?？梢允褂秒S機(jī)誘變一個或多個選擇的VH和/或VL基因在整個可變區(qū)內(nèi)產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生用于本發(fā)明的新型的具有CDR源序列的VH或VL區(qū)。在某些實施例中，在整個可變區(qū)或CDR組中進(jìn)行一個或兩個氨基酸取代。另外可用的方法是定向誘變VH或VL基因的CDR區(qū)。如上所知，基本上根據(jù)本文顯示的CDR氨基酸序列可以作為CDR被攜帶在人抗體可變區(qū)或其主要部分(substantialportion,實質(zhì)部分)?；救绫疚牧谐龅腍CDR3序列代表本發(fā)明的實施例，例如其每一個可以作為HCDR3被攜帶在人(抗體)重鏈可變區(qū)或其主要部分。本發(fā)明中使用的可變區(qū)可以獲自或來源自任何種系或重新設(shè)計的人可變區(qū)，或者可以為基于已知的人可變區(qū)的共有序列或?qū)嵲谛蛄械暮铣煽勺儏^(qū)?？勺儏^(qū)可來源于非人抗體。用于本發(fā)明的CDR序列(例如，CDR3)可使用重組DNA技術(shù)被引入到缺乏CDR(例如，CDR3)的全套可變區(qū)中。例如，Marks等(1992)描述了產(chǎn)生全套抗體可變區(qū)的方法，其中位于或接近可變區(qū)區(qū)域的5'末端的共有引物與人VH基因的第三構(gòu)架區(qū)的共有引物聯(lián)合使用從而產(chǎn)生缺乏CDR3的全套VH可變區(qū)。Marks等還表述了這樣的全套可變區(qū)怎樣與特殊抗體的CDR3結(jié)合。使用相似的技術(shù)，本發(fā)明的CDR3源序列可以與缺乏CDR3的全套VH或VL區(qū)改組，改組后的完整的VH或VL區(qū)與同源VL或VH區(qū)結(jié)合從而提供用于本發(fā)明的結(jié)合成員。然后該全套可變區(qū)可在合適的宿主體系進(jìn)行展示，如W092/01047的噬菌體展示系統(tǒng)，其全文通過引用結(jié)合到本文中作為參考，或任何此后大量的資料，包括Kay，Winter&McCafferty(1996)，因此可以選擇合適的結(jié)合成員。全套可變區(qū)可由104以上的任何值的單獨成員組成，例如至少105，至少106，至少107，至少108，至少109或至少l(T成員。與此相似，一個或多個或全部的三個CDR可以移植入全套VH或VL域，然后篩選A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員?？梢允褂每贵wH1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個或多個，或HCDR組，和/或可以使用抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8或G9的LCDR1、LCDR2或LCDR3中的一個或多個，或抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的LCDR組。與此相似，可以使用本文公開的其它VH和VL域、CDR組和HCDR組和/或LCDR組。A-FN和/或纖連蛋白的ED-A可被用于篩選用于制備治療肺癌的藥物的結(jié)合成員，例如抗體分子。該篩選可以為本文其它處公開的全套的篩選。A-FN和/或纖連蛋白的ED-A還可以被用于篩選用于制備治療淋巴瘤的藥物的結(jié)合成員，例如抗體分子。該篩選可以為本文其他處公開的全套的篩選。免疫球蛋白可變區(qū)的主要部分(substantialportion,重要部分)可包含至少三個CDR區(qū)，以及它們其間的構(gòu)架區(qū)。該部分還包括第一和第四框架區(qū)的任意一個或兩個的至少約50%，該50%為第一框架區(qū)的C末端50%和第四框架區(qū)的N末端50%?？勺儏^(qū)的主要部分的N末端和C末端的其它殘基可以為那些通常與自然產(chǎn)生的可變區(qū)不相關(guān)的。例如，通過重組DNA技術(shù)制造的本發(fā)明的結(jié)合成員的構(gòu)建可以導(dǎo)致為方便克隆和其它操作步驟而引入的連接子編碼的N-和C-末端殘基的引入。其它的操作步驟包括引入連接子從而將本文其他處公開的可變區(qū)連接起來成為包括抗體恒定區(qū)、其它的可變區(qū)(例如在雙體抗體的產(chǎn)生中的)或可檢測/功能標(biāo)記的其它蛋白質(zhì)序列，如本文其它處更詳細(xì)討論的。雖然結(jié)合成員可包含一對VH和VL域，基于VH或VL域序列的單一結(jié)合域也可以被用于本發(fā)明中。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是VII域，能夠以特殊的形式結(jié)合靶抗原。例如，見以上對dAb的討論。在任一單一結(jié)合域的情況下，這些域可以被用于篩選能夠形成可結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的雙域結(jié)合成員的互補(bǔ)域。這可以通過使用如W092/01047中公開的所謂的分級雙組合法(hierarchicaldualcombinatoriala卯roach)(其全文通過引用結(jié)合到本文中作為參考)的噬菌體展示篩選方法來實現(xiàn)，其中包含H或L鏈克隆的單個菌落被用于感染編碼另外一條鏈(L或H)的克隆的完整庫，根據(jù)噬菌體展示技術(shù)(如參考文獻(xiàn)中描述的)來選擇得到的雙鏈結(jié)合成員。在Marks1992中也公開了該技術(shù)。用于本發(fā)明的結(jié)合成員還可包含抗體恒定區(qū)或其部分，例如人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL域可在其C-末端連接到包括人Ck或CA鏈的抗體輕鏈恒定區(qū)，例如C入。與此相似，基于VH域的結(jié)合成員可以以其C-末端連接到來源于任何抗體同種型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任意同種型亞類，尤其是IgGl和IgG4，的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(例如，CH1域)。具有這些特性并且穩(wěn)定可變區(qū)的任何合成的或其它的恒定區(qū)變體也可使用在本發(fā)明的實施例中。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可使用可檢測標(biāo)記或功能標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記可為產(chǎn)生或能被誘導(dǎo)產(chǎn)生信號的任何分子，包括但是不限定于熒光劑、放射性標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光敏劑。因此，結(jié)合可以被檢測，和/或通過檢測熒光或冷光、放射性、酶活性或光吸收率來被測量。使用所屬領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)，可檢測標(biāo)記可以被連接到用于本發(fā)明的抗體。這里有多種通過其標(biāo)記可產(chǎn)生被外部裝置檢測到的信號的方法，例如，通過表觀檢查、電磁輻射、熱和化學(xué)試劑。標(biāo)記還可以結(jié)合于另外的結(jié)合用于本發(fā)明的抗體的結(jié)合成員，或結(jié)合于支持物。被標(biāo)記的結(jié)合成員，例如標(biāo)記了可檢測標(biāo)記的scFv，可以在體內(nèi)或體外診斷中使用，和/或治療使用。例如，放射標(biāo)記的結(jié)合成員(例如，連接放射性同位素的結(jié)合成員)可以用于放射性診斷和放射性治療?？梢赃B接于用于本發(fā)明的結(jié)合成員的放射性同位素包括如94mTc、99mTC、186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、47SC、mIn、97RU、62CU、64CU、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、123I、124I、125I和1311的同位素。例如，用于本發(fā)明的標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的結(jié)合成員可用于檢測、診斷或監(jiān)控人或動物的肺癌?；蛘?，用于本發(fā)明的標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的結(jié)合成員可用于檢測、診斷或監(jiān)控人或動物的淋巴瘤。本發(fā)明的結(jié)合成員可用于制造用于診斷肺癌的診斷產(chǎn)品。本發(fā)明的結(jié)合成員還可用于制造用于診斷淋巴瘤的診斷產(chǎn)品。本發(fā)明提供了檢測或診斷人或動物的肺癌的方法，包含以下步驟(a)將本發(fā)明的結(jié)合成員，例如標(biāo)記了可檢測標(biāo)記的結(jié)合成員，給藥于人或動物，該結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A，禾口(b)確定該結(jié)合成員在人或動物身體的肺中是否存在；其中結(jié)合成員定位到人或動物肺顯示了肺癌的存在。本發(fā)明還提供了檢測或診斷人或動物的淋巴瘤的方法，包含以下步驟(a)將本發(fā)明的結(jié)合成員，例如標(biāo)記了可檢測標(biāo)記的結(jié)合成員，給藥于人或動物，該結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A，禾口(b)確定該結(jié)合成員在人或動物身體的淋巴系統(tǒng)中是否存在；其中結(jié)合成員定位至人或動物淋巴系統(tǒng)顯示了淋巴瘤的存在。在標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的結(jié)合成員中，可通過檢測出標(biāo)記來確定可檢測標(biāo)記是否存在。用于本發(fā)明的結(jié)合成員和對損傷中的靶細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用(細(xì)胞毒性作用)的分子和針對這樣的損傷中的細(xì)胞外基質(zhì)成分的抗體的之間的連接或融合可以被用于本發(fā)明中。例如，殺滅或細(xì)胞毒素分子可以為白細(xì)胞介素-2(IL-2)、阿霉素、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素-Y(IFN-Y)、腫瘤壞死因子a(TNFa)或組織因子(優(yōu)選截短的)。這樣的結(jié)合物可以被治療性使用，例如本文提到的淋巴瘤的治療?；蛘?，這樣的結(jié)合物可以治療性使用，用于本文提到的肺癌的治療。在例如W001/62298(其通過引用結(jié)合到本文中作為參考)中描述了結(jié)合成員與殺滅或毒性分子的融合或連接的產(chǎn)生和應(yīng)用。本發(fā)明提供了治療肺癌的方法，該方法包含將治療有效量的包含用于本發(fā)明的結(jié)合成員的藥物給藥于個體。本發(fā)明還提供了治療淋巴瘤的方法，該方法包含將治療有效的包含用于本發(fā)明的結(jié)合成員的藥物給藥于個體。該結(jié)合成員可以為(i)通過細(xì)胞相互作用對靶細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用的分子和(ii)纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員的結(jié)合物。本發(fā)明提供了用于本發(fā)明的結(jié)合成員在制備用于治療肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的結(jié)合成員在制備治療淋巴瘤的藥物中的用途。該結(jié)合成員可以與本文所描述的施加殺滅或細(xì)胞毒性作用的分子連接或融合。該結(jié)合成員可以為(i)通過細(xì)胞相互作用對靶細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用的分子和(ii)本發(fā)明的人纖連蛋白的結(jié)合成員的結(jié)合物。本文中還描述的是(i)通過細(xì)胞相互作用對靶細(xì)胞具有殺滅或細(xì)胞毒素作用的分子和(ii)根據(jù)用于本發(fā)明的人纖連蛋白的結(jié)合成員的結(jié)合物。這樣的結(jié)合物優(yōu)選包含含有殺滅或細(xì)胞毒素分子和所述的結(jié)合成員的融合蛋白質(zhì)，或者其中該結(jié)合成員為雙鏈或多鏈，包含殺滅或細(xì)胞毒素分子和所述的結(jié)合成員的多肽鏈成分的融合蛋白質(zhì)。優(yōu)選，該結(jié)合成員是單鏈多肽，例如單鏈抗體分子，如scFv。包含殺滅或細(xì)胞毒素分子和單鏈Fv抗體分子的融合蛋白質(zhì)可以用于本發(fā)明。通過細(xì)胞相互作用對靶細(xì)胞起作用的殺滅或細(xì)胞毒素分子，可以直接與靶細(xì)胞相互作用，可以與靶細(xì)胞上的膜結(jié)合受體相互作用，或干擾細(xì)胞膜的電化學(xué)勢。與膜結(jié)合受體相互作用的分子包括趨化因子、細(xì)胞因子和激素。干擾細(xì)胞膜電化學(xué)勢的化合物包括溶血素、離子載體、作用于離子通道的藥物。在示例性優(yōu)選的實施例中，該分子是白細(xì)胞介素-2、組織因子(優(yōu)選為截短的)或阿霉素。另一個實施例可使用白細(xì)胞介素-12、干擾素-Y、IP-IO和腫瘤壞死因子_a(TNF-a)。如下文中進(jìn)一步討論的，特異性的結(jié)合成員優(yōu)選為抗體或包含抗體抗原結(jié)合位點。方便地，特異性結(jié)合成員可以為單鏈多肽，如單鏈抗體。這可以方便生產(chǎn)包含單鏈抗體和殺滅或細(xì)胞毒素分子(例如，白細(xì)胞介素-2或組織因子)的融合蛋白。可通過將不同多肽的抗體VH域和抗體VL域聯(lián)合的方法來產(chǎn)生抗體抗原結(jié)合位點，例如在完整抗體中或如Fab的抗體片段或雙體抗體中。當(dāng)特異性結(jié)合成員是雙鏈或多鏈分子(例如，分別為Fab或完整抗體)，殺滅或細(xì)胞毒素分子可以結(jié)合為與特異性結(jié)合成員的一個或多個多肽鏈結(jié)合的融合多肽。結(jié)合成員可以通過肽鍵與殺滅或細(xì)胞毒素分子結(jié)合，即在包含所述分子和特異性結(jié)合成員或其多肽鏈成分的融合多肽中。參見Taniguchietal.(1983)Nature302，305-310;MaED-Aetal.Q983)Biochem.Biophys.Res.Comm.115:1040-1047;Devosetal.(1983)Nucl.AcidsRes.11:4307-4323中在制備包含IL-2的融合多肽中有用的IL-2序列信息。Scarpatietal.(1987)Biochemistry26:5234—5238和Rufetal.(1991)J.Biol.Chem.226:15719-15725提供了截短組織因子的序列信息。用于連接的其它方法包括化學(xué)連接，尤其是使用雙功能試劑的交聯(lián)(例如使用DOUBLE-REAGENTS交聯(lián)劑選擇指導(dǎo)，Pierce)。當(dāng)需要緩釋時，例如當(dāng)該殺滅或細(xì)胞毒素分子是阿霉素或其它的干擾細(xì)胞膜的電化學(xué)勢的分子時，化學(xué)連接可以為通過特異性結(jié)合成員(如抗體或抗體片段的多肽)的伯胺基與如阿霉素的殺滅或細(xì)胞毒素分子的氧化糖部分(六碳氨糖)之間形成席夫堿(亞胺)的方法。本文還描述的是編碼用于本發(fā)明的結(jié)合成員的分離的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。核酸可以編碼如上所定義的CDR或CDR組或VH域或VL域或抗體抗原結(jié)合位點或抗體分子，例如scFv或IgG，例如IgGl。該核酸序列可編碼本文公開的VH和VL域。本文還描述的是以包含至少一個如上所述的多核苷酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的結(jié)構(gòu)物。還描述了包含一個或多個以上所述結(jié)構(gòu)物的重組宿主細(xì)胞。描述了編碼任意CDR或CDR組或VH域或VL域或抗體抗原結(jié)合位點或抗體分子，例如如提供的scFv或IgGl或IgG4，的核酸，以及被編碼產(chǎn)品的產(chǎn)生方法，該方法包含編碼核酸的表達(dá)。通過在合適的條件下培養(yǎng)含有該核酸的宿主細(xì)胞可以方便的實現(xiàn)表達(dá)。在通過VH或VL域的表達(dá)來產(chǎn)生之后，或可使用任何合適的技術(shù)來分離和/或純化結(jié)合成員，然后根據(jù)情況使用。核酸可以包含DNA或RNA，可以為完全或部分合成。參考本文中所顯示的核酸序列，包含具有規(guī)定序列的DNA分子，并且包含其中U取代T的具有規(guī)定序列的RNA分子，除非環(huán)境另有所需。還描述了產(chǎn)生抗體VH可變區(qū)的方法，該方法包括使編碼核酸進(jìn)行表達(dá)。這樣的方法還包含在產(chǎn)生所述的抗體VH可變區(qū)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。產(chǎn)生方法可包含分離和/或純化產(chǎn)品的步驟。產(chǎn)生方法可包含將該產(chǎn)品配置到包括至少一種附加成分，如藥物可接受的賦形劑的組合物中。用于在各種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是熟知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、絲狀真菌、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物和動物。所屬領(lǐng)域中已經(jīng)很好的建立了抗體和抗體片段在原核細(xì)胞中的表達(dá)。對于綜述，見，例如Pluckthun1991。一般的細(xì)菌宿主是E.coli。對于所述的領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，作為產(chǎn)生結(jié)合成員的一個選擇，在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的表達(dá)也是可利用的(能得到的)，例如Chadd&Chamow(2001)，Andersen&Krummen(2002)，Larrick&Thomas(2001)。在所屬領(lǐng)域中可獲得的用于表達(dá)異源多肽的哺乳動物細(xì)胞系包括中華倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、NS0小鼠黑素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞和許多其它細(xì)胞。可以選擇或構(gòu)建合適的載體，包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子序列、多聚腺苷酸序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因或其它合適的序列。載體可以為合適的質(zhì)粒，例如噬粒，或病毒，如噬菌體('phage)。例如，從Sambrook&Russe11(2001)可知更多的細(xì)節(jié)。在Ausubel1999中詳細(xì)描述了許多已知的核酸操作的技術(shù)和方法，例如制備核酸構(gòu)建、突變、測序、在細(xì)胞中引入DNA和基因表達(dá)，和蛋白質(zhì)分析。宿主細(xì)胞可包含本文所描述的核酸。這樣的宿主細(xì)胞可在體外并且可以進(jìn)行培養(yǎng)。這樣的宿主細(xì)胞可在體內(nèi)。宿主細(xì)胞在體內(nèi)的存在可以允許用于本發(fā)明的結(jié)合成員作為"內(nèi)抗體(intrabody)"或細(xì)胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。內(nèi)抗體可被用于基因治療。還描述了包含將本文公開的核酸引入宿主細(xì)胞的方法。該引入可使用任意現(xiàn)有的方法。對于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒(例如牛痘，或?qū)τ诶ハx細(xì)胞，桿狀病毒)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。將核酸引入到宿主細(xì)胞，尤其是真核細(xì)胞中，可使用病毒或質(zhì)粒系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以游離存在于或整合到宿主細(xì)胞內(nèi)或到人工染色體中。結(jié)合可以是通過在單一或多位點的單拷貝或多拷貝的隨機(jī)或定點整合。對于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。在引入之后，可使該核酸表達(dá)，例如通過在該基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。通過所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法來實現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)品的純化。該核酸可以被整合到宿主細(xì)胞的基因組(例如，染色體)中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過插入促進(jìn)與基因組的再結(jié)合的序列來提高整合。還描述了包含使用在表達(dá)系統(tǒng)中的如上所述的構(gòu)建物從而表達(dá)如上的結(jié)合成員或多肽的方法。用于本發(fā)明的結(jié)合成員被設(shè)計用于人或動物主體，例如人，中的診斷或治療方法。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可用于淋巴瘤的診斷和治療?；蛘撸糜诒景l(fā)明的結(jié)合成員可用于肺癌的診斷和治療。因此，本發(fā)明提供了治療方法，其包含將所提供的結(jié)合成員，包含這樣的結(jié)合成員的藥物組合物進(jìn)行給藥，和這樣的結(jié)合成員在給藥藥物的生產(chǎn)中的應(yīng)用，例如在包含將該結(jié)合成員與藥物可接受賦形劑配制的藥物或藥物組合物的制造方法中。藥物可接受的載體是熟知的，并且可被所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員根據(jù)被選的活性化合物的特性和給藥模式進(jìn)行改變。用于本發(fā)明的結(jié)合成員通常以藥物組合物的形式被給藥，其可包含除了該結(jié)合成員之外的至少一個成分。因此，本發(fā)明的和根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可包含(除了活性成分)藥物可接受賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)。這樣的物質(zhì)應(yīng)該是無毒的，并且不應(yīng)干擾活性成分的效力。載體和其它物質(zhì)的準(zhǔn)確性質(zhì)會取決于給藥途徑，其可以為口服的、吸入的或通過注射，例如靜脈注射。用于口服給藥的藥物組合物，如，例如納米體等也可以考慮在本發(fā)明中。這樣口服配方可以為藥片、膠囊、粉末、液體或半固體的形式。藥片可包含固體載體，如凝膠或佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}溶液、葡萄糖或其它的糖溶液或二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對于靜脈注射，或在疾病位點的注射，活性成分是注射用藥物可接受的水溶液形式，其是無熱原的并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。所述領(lǐng)域中相關(guān)的一般技術(shù)人員能夠使用例如等壓媒介，如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液來制備合適的溶液。根據(jù)需要，可以使用防腐齊U、穩(wěn)定齊U、緩沖齊U、抗氧化劑和/或其它添加齊IJ。對于所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員，制備藥物配方的多種方法是已知的。見，例如Robinson，1978。根據(jù)治療條件，組合物可以單獨給藥或與其它治療組合同時或依次地給藥，或與另外的治療劑一起作為組合制劑。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以作為與其它的藥物成分結(jié)合的組合治療的部分。組合治療可被用于產(chǎn)生顯著的協(xié)同效應(yīng)，尤其是用于本發(fā)明的結(jié)合成員與一種或多種其它藥物的組合。用于本發(fā)明的結(jié)合成員可與另外的治療劑同時給藥或依次給藥或作為組合制劑，用于治療本文所列出的一種或多種病癥。例如，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以與現(xiàn)有的治療淋巴瘤的治療劑組合使用?，F(xiàn)有的治療非霍奇金淋巴瘤的治療劑包括利妥昔單抗(Rituximab);和組合的環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、Hydroxyrubicin(阿霉素(Adriamycin))、長春新堿(Oncovin)(長春新堿)和強(qiáng)的松(CHOP化學(xué)療法方案)?，F(xiàn)有的治療霍奇金淋巴瘤的治療劑包括組合的阿霉素、博來霉素、長春堿和氮烯唑胺(ABVD化學(xué)療法方案)?；蛘?，用于本發(fā)明的結(jié)合成員可以與現(xiàn)有的治療肺癌的治療劑組合使用?，F(xiàn)有的治療非小細(xì)胞肺癌的治療劑包括順鉑(cisplatin)或卡鉑(carbop1atin)，與吉西他濱(gemcitabine)、紫杉醇、多烯紫杉醇、依托泊苷或長春瑞濱(Vinorelbine)的組合?，F(xiàn)有的治療小細(xì)胞肺癌的治療劑包括順鉑或依托泊苷，單獨或與卡鉑、吉西他濱、紫杉醇、長春瑞濱、拓?fù)涮婵?Topotecan)、或依立替康(irinotecan)的組合。用于本發(fā)明的結(jié)合成員和一種或多種以上的另外的藥物成分可以用于制造藥物。該藥物可以為用于個體的單獨或組合給藥，因此可包含結(jié)合成員和作為組合制劑或獨立制劑的附加成分。獨立制劑可被用于方便獨立的和依次的或同時的給藥，并允許通過不同途徑進(jìn)行多種成分給藥，例如口服或腸胃外給藥。根據(jù)本發(fā)明，提供的組合物可以給藥于哺乳動物。給藥可以以"治療有效量"，這是充分顯示對患者有效的量。這樣的有效性可為至少改善了至少一種癥狀。給藥的實際量和給藥的速率和時間過程會取決于被治療的(病癥)特性和嚴(yán)重程度，被治療的特定的哺乳動物，個體患者的臨床情況，病癥的起因，遞呈組合物的位點，結(jié)合成員的類型，給藥的方法，給藥的時序安排和執(zhí)業(yè)醫(yī)生已知的其他因素。處方治療，例如劑量的確定，是在一般從業(yè)者和其他的醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)的，并且取決于癥狀的嚴(yán)重程度和/或被治療疾病的發(fā)展?？贵w的合適劑量在所屬領(lǐng)域中是熟知的(Ledermann1991和Bagshawe1991)?？墒褂帽疚闹酗@示的，或Physician'sDeskReference(2003)中的適合于給藥藥物類型的確切劑量。可通過比較動物模型中用于本發(fā)明的結(jié)合成員的體外和體內(nèi)的活性來確定結(jié)合成員的治療有效量或合適的劑量。從小鼠或其它實驗動物的有效劑量推斷出對人的有效劑量的方法是已知的。精確的劑量取決于多種因素，包括該抗體是用于診斷、預(yù)防還是治療，治療區(qū)的尺寸和位置，抗體的準(zhǔn)確性質(zhì)(例如完整抗體、片段或雙體抗體)和連接于該抗體的任意可檢測標(biāo)記或其它分子的性質(zhì)。對于全身應(yīng)用，一般抗體的劑量在lOOiig至lg的范圍內(nèi)，對于局部應(yīng)用在1Pg至lmg的范圍內(nèi)?？梢砸猿跏驾^高的負(fù)荷劑量，隨后一個或多個降低的劑量來給藥?？贵w可為完整抗體，例如IgG1或IgG4同種型。這是對成人患者的單次治療的劑量，對于小孩和嬰兒其可以按比例進(jìn)行調(diào)整，或者還可對于其它抗體形式根據(jù)分子量按比例調(diào)整。治療可以以每天、一周兩次、每周或每個月的間隔時間重復(fù)，根據(jù)醫(yī)生自由決定。治療可以為每二至四周的皮下給藥，和每四至八周的靜脈給藥。在本發(fā)明的某些實施例中，治療是周期性的，兩次給藥之間的時間為約二周或更多，例如，約三周或更多，CN約四周或更多，或約一月一次。在本發(fā)明的其它實施例中，可在手術(shù)之前和/或之后提供治療，可以直接在手術(shù)治療的解剖位點進(jìn)行給藥或應(yīng)用。提供了包括以下實驗示例的本說明書，所述領(lǐng)域的一般技術(shù)人員會明白本發(fā)明的其它方面和實施例。材料和方法抗體之前已經(jīng)描述了抗ED-B抗體片段scFv(L19)的分離(Pinietal.1998)。使用公開發(fā)表的方法從ETH-2庫分離母源抗ED-A抗體(Giovannoni，Nucleic.AcidResearch,2001,29(5):E27)。在以下的部分中描述了母源抗ED_A抗體的親和力成熟，產(chǎn)生高親和力抗ED-A抗體。母源抗ED-A抗體的親和力成熟母源抗ED-A抗體(ETH-2-源抗體)被用作構(gòu)建親和力成熟庫的模板。使用部分簡并引物，對于VH的5'-CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3'(SEQIDNO:17)和對于VL的5'-CCAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAMNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3'(所有的寡核苷酸購自O(shè)peronBiotechnologies,Cologne,Germany)，在VHCDRl的31、32和33的位置以及VLCDRl的31、31a和32的位置產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法中，通過PCR引入庫的VHCDR1(DP47種系)和VLCDRl(DPK22種系)的序列可變性。使用引物L(fēng)MB31ong(5'-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3')(SEQIDNO:19)和fdseqlong(5'-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3')(SEQIDNO:20)以凝膠純化的VH和VL片段作為模板，通過PCR拼接將VHVL組合拼接成scFv形式。以Ncol/Notl雙消化該拼接的VH-VL片段，并且克隆到Ncol/Notl消化pHENl噬粒載體(Hoogenboometal.，1991)。根據(jù)(Vitietal.，2000)，得到的連接產(chǎn)物被電穿孔進(jìn)入到電感受態(tài)E.coliTG-l細(xì)胞，產(chǎn)生包含1.5xl(f單獨抗體克隆的庫，其被用于篩選具有提高的親和力的結(jié)合ED-A的抗體?？?ED-A抗體的選擇使用BIAcore分析，在以上所述的抗體庫篩選以比母源抗ED_A抗體更高的親和力結(jié)合ED-A的抗體。該BIAcore分析中使用的抗原(11A12)包含人纖連蛋白的ED_A域，并且具有以下的氨基酸序列(SEQIDNO:120):VVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH抗原(11A12)的核苷酸序列(SEQIDNO:121)如下3tg3g3tCCteCCg朋C3g3朋ttg3C333CC3tCCC3g3tgC33gtg3CCg3tgttC3gg3C33C3gcattagtgtcaagtggctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaattgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctctggttC3g3CtgC3gt33CC33C3ttg3tCgCCCte朋gg3CtggC3ttC3Ctg3tgtgg3tgtCg3ttccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgacctactcgagccctg3gg3tgg朋tcc3tg3gctettccctgc3cctg3tggtg33g33g3C3ctgc3g3gctgc朋ggcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgatatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagttcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggatatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgacagctcatccgtggttgtatc3gg3cttetggtggcc3cc3朋tetg朋gtg3gtgtctetgctctte3gg3C3ctttg3C33gc3g3ccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaecatcaccatcactaa使用分別在5'和3'含有BamHI和BglII限制性內(nèi)切酶位點的引物通過PCR來擴(kuò)增該抗原的核苷酸序列。用BamHI和BglII限制性內(nèi)切酶消化得到的PCR產(chǎn)物和載體pQE12(QIAGEN)，隨后以具有插入載體率為3:1的反應(yīng)被連接。得到的載體被測序從而檢查該序列是否正確?？乖闹苽淙缦?0ml2TY、Amp、l^葡萄糖中的TGI電感受態(tài)預(yù)培養(yǎng)物在有1的11A12的DNA微量提取的存在下被電穿？L。然后預(yù)培養(yǎng)物被稀釋1:100(8ml加入到800ml的2TY、Amp、1%葡萄糖中)，并且生長至0D600為0.4-0.6，然后以IPTG誘導(dǎo)過夜。第二天，破碎細(xì)胞，上清液被過濾(微孔過濾器，0.22m)。在離心和澄清培養(yǎng)液之后，使用FPLC的Hitr即柱純化11A12。再生Ni/柱如下以5倍柱體積(CV)的H20沖洗該柱，隨后通過用3CV的0.5MEDTA/0.2MTrispH8將老化的鎳沖洗出柱外。此后，用5CV的H20沖洗柱子。然后用2CV的lOOmM的NiS04裝柱，然后用幾CV的H20沖洗柱子。然后用5CV的裂解液(20mM咪唑/250mMNaCl/PBSpH7.4)來平衡柱子。然后過濾細(xì)胞裂解物(微孔過濾器，0.45ym)，并且將其負(fù)載在柱子上(手工)。然后該柱子被放回FPLC，流動裂解液(大約3CV)直至UV信號穩(wěn)定(恒定)。然后開始洗脫程序5CV的級數(shù)為0%至100%的洗脫液(400mM咪唑/250mMNaCl/PBSpH7.4)。收集含有被洗脫抗原的部分，并且在PBS中滲析過夜?？笶D-A抗體的表達(dá)和純化抗ED-A抗體的表達(dá)和純化如下10ml2TY、Amp、1%葡萄糖中的TG1電感受態(tài)預(yù)培養(yǎng)物在有1Pi的抗ED-A抗體之一的DNA微量提取物的存在下被電穿孔。然后預(yù)培養(yǎng)物被稀釋l:100(8ml加入到800ml的2TY、Amp、l^葡萄糖)，并且生長至0D600為0.4-0.6，然后以IPTG誘導(dǎo)過夜。第二天，破碎細(xì)胞，過濾上清液(微孔過濾器，0.22iim)。以蛋白質(zhì)A-瓊脂糖柱來純化scFv，三乙胺(Triethylemmine)被用于從柱上洗脫scFv。含有被洗脫scFv的部分于4t:在PBS中滲析過夜。然后將該scFv部分裝上Supcrdex75柱，以0.5ml/min流動的PBS，收集0.25ml部分。單體部分被用于進(jìn)行BIAcore分析。BIAcore分析l用HBS-EP緩沖液BIACORE，O.01MH印espH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，O.005%表面活性劑P20(試驗使用同樣的緩沖液)，以5ii1/min的流速沖洗BIAcore芯片過夜?？乖?11A12)在醋酸緩沖液(pH4.0)中被稀釋到50iig/ml的濃度，通過注入50的N_羥基丁二酰亞胺(NHS)和乙基-N-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的混合物使芯片上的COOH基團(tuán)活化。將40ill的11A21抗原注入到芯片上，以30ill的乙醇胺來封閉殘余的游離COOH基團(tuán)。在以O(shè).22iim過濾之后，將20ii1的每種細(xì)菌的上清液注入到芯片上并且監(jiān)控與抗原的實時相互作用。BIAcore分析2使用表面等離子共振來測量母源抗ED-A抗體和抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9的k。n，k。ff和KD。使用與實驗中相同的緩沖液以51/min的緩沖液流速平衡芯片過夜。以該流速進(jìn)行完全覆蓋程序。用醋酸鹽緩沖液pH4.00(BIAC0RE提供)將抗原11A12稀釋1:25至終濃度20iig/ml。然后混合NHS和EDC，并且注入50y1從而活化CM5芯片上的COOH基團(tuán)。然后注入40ii1的抗原(持續(xù)約40〃)。然后注入30y1的乙醇胺從而封閉可能存在的游離COOH的反應(yīng)。以201/min的流速試驗每個樣品。注入20的未稀釋的單體蛋白質(zhì)(如其從凝膠過濾中出來的)。瓦解時間持續(xù)約200"。然后注入10iU的HC110mM從而再生芯片。以不同稀釋程度，即l:2稀釋(在PBS中)重復(fù)注入單體蛋白質(zhì)，然后以HC1再生。此之后第三次注入以l:4稀釋的蛋白質(zhì)，再次進(jìn)行以HC1再生。使用BIAevaluation軟件測試每個抗ED-A抗體的k。n、k。ff和KD值。淋巴瘤切片的免疫組織化學(xué)在低溫丙酮(-200C)中固定Ramos淋巴瘤切片(section)10分鐘，載玻片(slide,切片)于室溫(RT)干燥30分鐘。然后將該載玻片侵入TBS5至10分鐘，用紙弄干載玻片的背面而不碰觸切片。然后以>lOOiil的TBS(50mMTRIS、100mMNaCl、調(diào)節(jié)到pH7.4，0.01%抑肽酶)中的20%胎牛血清(FCS)來封閉切片30分鐘。倒掉封閉液，載玻片浸沒在TBS5分鐘。100ii1攜帶有myc-標(biāo)記的一抗scFvF8(20ng/y1)，以及10y1的生物素化的抗myc抗體9E10(OD0.25，l:20稀釋)在TBS/3%BSA中稀釋，然后加入到載玻片。作為陰性對照，以相同的方法進(jìn)行Ramos淋巴瘤切片免疫組織化學(xué)染色，但是省略掉一抗，即myc-標(biāo)記scFv抗ED-A抗體F8。該載玻片在保濕室中孵育1小時。用TBS清洗載玻片，然后加入在TBS/3%BSA中1:150稀釋的鏈霉親和素-堿性磷酸酶，在保濕室中孵育30分鐘。然后用TBS清洗載玻片兩次達(dá)5分鐘，用紙干燥載玻片的背面。500iU的堅牢紅底物(5mg的堅牢紅粉末加入到5ml的堅牢紅溶液中[49mlTRIS-HC1，0.1M，pH8.2;1.0mlN，N-二甲基甲酰胺；10mg萘酚AS-MX-磷酸鹽和50yl左旋咪唑溶液(lml0.1MTRIS-HC1pH8.2，240.8mg左旋咪唑粉末)]并且用孔徑0.45ym的過濾器過濾)加入到每個載玻片，載玻片在保濕室中孵育15分鐘。通過以塑料巴氏吸管直接將去離子水施加到每個切片上的方式用去離子水清洗載玻片兩次，然后放在水中。然后將載玻片轉(zhuǎn)移到GillisHematoxilin溶液中50分鐘，然后快速轉(zhuǎn)移到水中，并且用水沖洗6次。最后，用Glycergel(DakoCytomation，Glostrup，丹麥)封固劑來封固載玻片，用使用Axiovision軟件(CarlZeiss)的AxiovertS100TV顯微鏡(CarlZeiss，F(xiàn)eldbach，瑞士)來進(jìn)行分析。肺癌切片的免疫組織化學(xué)染色小細(xì)胞肺癌(小細(xì)胞癌)的切片和幾個非小細(xì)胞肺癌(鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、細(xì)支氣管肺泡癌和大細(xì)胞癌)的切片以攜帶了myc-標(biāo)記的scFv抗ED-A抗體來進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，如前所述(見，例如Bracketal.2006)。簡單來說，切片與scFv抗ED-A抗體D5(終濃度2-15iig/mL)和二抗(單克隆抗-myc抗體9E10)同時一起孵育。用兔抗小鼠免疫球蛋白抗體(Dakocytomation，Glostrup，丹麥)，然后通過小鼠單克隆堿性磷酸酶_抗堿性磷酸酶復(fù)合體(Dakocytomation)檢測結(jié)合的抗體。堅牢紅(Sigma)被用作磷酸酶底物，切片用蘇木精(Sigma)復(fù)染。最后，用Glycergel(DakoCytomation，Glostrup，丹麥)封固劑來封固切片，用使用Axiovision軟件(CarlZeiss)的AxiovertS100TV顯微鏡(CarlZeiss,Feldbach，Switzerland)來進(jìn)行分析。題篩選抗ED-A抗體BIAcore分析lBIAcore分析產(chǎn)生了每個抗ED_A抗體的圖，分析其從而推導(dǎo)出抗體對抗原的親合力，如下每個圖的X軸對應(yīng)于時間，Y軸對應(yīng)于共振單位(顯示試驗抗體對覆蓋在BIAcore芯片上的抗原的結(jié)合親和力的測量)。每個圖顯示了3個峰值和1個谷值，其對應(yīng)于緩沖液的變換，因此與結(jié)果分析無關(guān)。每個圖的上升部代表結(jié)合階段。圖中該部分的曲線越陡，抗體與抗原的結(jié)合越快。每個圖中的下降部分代表了抗體從抗原解離的階段。圖中該部分的曲線越平緩，抗體從抗原的解離就越慢?？笶D-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8和G9都顯示了比它們所起源的母源抗ED-A抗體更平緩的解離曲線，說明它們以比母源抗ED-A抗體更高的親和力結(jié)合ED-A，A-FN也是同樣。抗體E5、Fl、F8和HI的圖顯示出所有被試驗的抗ED_A抗體中最平緩的解離曲線?？贵wH1、C5、D5、E5、C8、F8和F1的結(jié)合曲線比從母源抗ED_A抗體觀察到的要平緩，而抗體B2、B7、E8和G9的結(jié)合曲線的陡度與從母源抗ED_A抗體觀察到的一樣。但是，因為IPTG-誘導(dǎo)的E.coliTG-1細(xì)胞的細(xì)菌上清液被用于抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8和G9的BIAcore分析，所試驗的抗體樣品的濃度未知，但是很可能低于用于比較的母源抗-ED-A抗體樣品的濃度。因此，由于用于BIAcore分析的樣品中抗體的濃度低，抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8和G9的結(jié)合曲線可能人為地低。但是，因為濃度不顯著影響B(tài)IAcore分析中抗體從其靶抗原的解離，從抗體HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8和G9觀察到的平緩的解離曲線表示這些抗體至少以與母源抗_ED_A抗體相等，或可能更高的親和力結(jié)合ED-A。BIAcore分析2使用BIAevaluation軟件評價了每個抗ED-A抗體的k。n、k。ff和KD值。表2中詳細(xì)表示了母源抗ED-A抗體和抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9對抗原11A12的k。n、k0ff和KD值?？笶D-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7和G9都具有比它們起源的母源抗ED-A抗體更好的對抗原11A12的K。值，顯示這些抗原以比母源抗ED-A抗體更高的親和力結(jié)合ED-A，A-FN也是同樣。淋巴瘤切片的免疫組織化學(xué)人原發(fā)性Romas淋巴瘤(非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤(博基特氏淋巴瘤))切片以抗ED-AscFvF8抗體的免疫組織化學(xué)染色顯示了新生血管的強(qiáng)烈和特異性染色。相比之下，在陰性對照中，其中除了省略了抗ED-AscFvF8抗體，原發(fā)性Romas淋巴瘤在相同的條件下染色，未觀察到原發(fā)性Romas淋巴瘤包括新生血管的染色。這表明本發(fā)明的抗ED-AscFv抗體特異性地靶定于淋巴瘤的新生血管。因此，ED-A可作為淋巴瘤中基于結(jié)合成員(例如抗體)的靶定方法的一般目標(biāo)。肺癌切片的免疫組織化學(xué)[O230]—般在某些類別的癌癥中發(fā)現(xiàn)"泛腫瘤抗體(pant咖oralantibodies)"是困難的，例如赫賽汀(Herc印tin)僅染色20%的乳腺癌。圖1顯示了抗ED-A抗體F8特異性地定位于肺癌的新生血管。尤其是，抗ED-A抗體F8在小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的新生血管都特異性定位。非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的75%_85%，而小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的15%-25%。圖1還表明抗ED-A抗體特異性地定位于所試驗的所有非小細(xì)胞肺癌亞型，即鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、細(xì)支氣管肺泡癌和大細(xì)胞癌。因此圖1的結(jié)果令人驚奇地表明抗ED-A抗體，F(xiàn)8，染色所試驗的肺癌的所有組織學(xué)類型。因此，ED-A可以作為肺癌中基于結(jié)合成員(例如，抗體)的靶定方法的一般目標(biāo)。測序抗ED-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8和G9都是scFv抗體，使用常規(guī)的方法進(jìn)行測序。圖3中顯示了抗ED-A抗體Hl的核苷酸序列。圖4中顯示了抗ED-A抗體H1的氨基酸序列。優(yōu)選的編碼抗ED-A抗體B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8禾PG9的VH禾P/或VL的核苷酸序列與編碼抗ED-A抗體Hl的VH和/或VL的核苷酸序列是一致的，除了編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)的H1CDR1的核苷酸序列被表1中示出的各個抗體的編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDR1的核苷酸序列所取代。優(yōu)選的編碼抗ED-AscFvF8雙體抗體的VH和/或VL的核苷酸序列與編碼抗ED-A抗體H1的VH和/或VL的核苷酸序列是一致的，除了編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)的H1CDR1的核苷酸序列被表1中列出的抗ED-A抗體F8的編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDR1的核苷酸序列所取代。優(yōu)選的編碼連接抗ED-AscFvF8雙體抗體的VH和VL的連接子的核苷酸序列是gggtccagtggcggt(SEQIDNO:29)?？笶D-A抗體B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8和G9與抗ED-A抗體Hl具有相同的氨基酸序列，除了輕鏈(VL)和重鏈(VH)的H1CDR1的氨基酸序列被表1中列出的(顯示的)各個(respective，相應(yīng))抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDR1的氨基酸序列所取代?？笶D-AscFvF8雙體抗體的氨基酸序列與抗ED-A抗體H1的氨基酸序列是一致的，除了輕鏈(VL)和重鏈(VH)的H1CDR1的氨基酸序列被表1中列出的抗ED-AF8的輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDRI的氨基酸序列所取代，H1中的連接子的氨基酸序列被連接子氨基酸序列GSSGG(SEQIDNO:28)取代?？笶D-A抗體B2VH域(SEQIDN0:21)的氨基酸序列與抗ED-A抗體Hl的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:23取代了HI的VHCDR1?？笶D-A抗體C5VH域(SEQIDNO:41)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:43取代了HI的VHCDRl?？笶D-A抗體D5VH域(SEQIDNO:51)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:53取代了HI的VHCDRl。抗ED-A抗體E5VH域(SEQIDNO:61)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:63取代了HI的VHCDRl?？笶D-A抗體C8VH域(SEQIDNO:71)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:73取代了HI的VHCDRl?？笶D-A抗體F8VH域(SEQIDNO:81)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:83取代了H1I的VHCDR1?？笶D-AF8雙體抗體的VH域與抗ED-A抗體F8的VH域具有相同的氨基酸序列(即SEQIDNO:81)?？笶D-A抗體FlVH域(SEQIDNO:91)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:93取代了HI的VHCDRl?？笶D-A抗體B7VH域(SEQIDNO:101)的氨基酸序列與抗ED-A抗體H1的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:103取代了HI的VHCDRl?？笶D-A抗體E8VH域(SEQIDNO:111)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:113取代了HI的VHCDRl。抗ED-A抗體G9VH域(SEQIDNO:31)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VH域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:33取代了HI的VHCDRl。抗ED-A抗體B2VL域(SEQIDNO:22)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:26取代了HI的VLCDRI?？笶D-A抗體C5VL域(SEQIDNO:42)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:46取代了HI的VLCDRl?？笶D-A抗體D5VL域(SEQIDNO:52)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:56取代了HI的VLCDRl?？笶D-A抗體E5VL域(SEQIDNO:62)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:66取代了HI的VLCDRI。抗ED-A抗體C8VL域(SEQIDNO:72)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:76取代了HI的VLCDRl?？笶D-A抗體F8VL域(SEQIDNO:82)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:86取代了H1的VLCDR1。抗ED-AF8雙體抗體的VL域與抗ED-A抗體F8具有相同的氨基酸序列(即SEQIDNO:82)?？笶D-A抗體FlVL域(SEQIDNO:92)的氨基酸序列與抗ED_A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:96取代了HI的VLCDRl?？笶D-A抗體B7VL域(SEQIDNO:102)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:106取代了HI的VLCDRl?？笶D-A抗體E8VL域(SEQIDNO:112)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:116取代了HI的VLCDRl?？笶D-A抗體G9VL域(SEQIDNO:32)的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的VL域的氨基酸序列一致，除了SEQIDNO:36取代了HI的VLCDRl?？蛇x地，抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、F1、B7、E8、G9和scFvF8雙體抗體的VH域的位置5的氨基酸可以為亮氨酸殘基(L)而不是纈氨酸殘基(V)，如圖4A所示。此外，或者抗ED-A抗體HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8、G9和scFvF8雙體抗體的VL域的位置18的氨基酸可以為精氨酸殘基(R)而不是賴氨酸殘基(K)，如圖4C所示。參考文獻(xiàn)本說明書任何地方列出的所有的文獻(xiàn)，包括在上文的任何地方列出的，通過引用其全文而結(jié)合于本文中，用于所有的目的。Amitetal.(1986)，Science,233:747—753.ffrench-Andersenetal.(2002)CurrentOpinioninBiotechnology13:117Ausubeletal.(1999)4theds.，ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons.BagshaweK.D.etal.(1991)Antibody，ImmunoconjugatesandRadiopharmaceuticals4:915-922Balzaetal.(1988)，F(xiàn)EBSLett.，228:42—44.Birchleretal.(1999)，J.Immunol.Methods,231，239-248.Birdetal.(1988)Science,242，423-426etal.(1987)etal.(1990)etal.(1995)etal.(1998)etal.(2006)11:4307_4323Carnemollaetal.(1989)，J.Cell.Biol.，108:1139-1148.Catonetal.(1990)，J.Immunol.，144:1965-1968.Chaddetal.(2001).CurrentOpinioninBiotechnology12:188_194Chothiaetal.(1987)，J.Mol.Biol.，196:901-917.Chothiaetal.(1989)，Nature,342:877-883.Devoseta1.(1983)，Nuc1.AcidsResConstant(1995)，Exp.CellRes.，221,261-271.Giovannoni，Nucleic.AcidResearch,2001，29(5):E27.etal.，1987J.Immunol.139,2367-2375(2004)，BioCentury，12(5):A1-A6.al.(2000)，Cell100，57-70.Lane，Antibodies:ALaboratoryMa皿a1，ColdSpringGlennicMJHaanetal,HanahanetHarlowandHarborKornbli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以及構(gòu)架的VL域。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7，和LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或其中所述VL域包含具有在所述互補(bǔ)決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3內(nèi)10個或更少的氨基酸取代的一組互補(bǔ)決定區(qū)。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的應(yīng)用，其中所述VL域構(gòu)架是人種系構(gòu)架。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所述VL域具有氨基酸序列SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。22.根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員是單鏈Fv。23.根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員是雙體抗體。24.結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員在制造用于診斷肺癌的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。25.結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員在制造用于診斷淋巴瘤的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。27.根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員結(jié)合所述纖連蛋白的ED-A。28.—種在人或動物中檢測或診斷肺癌的方法，其包含以下步驟(a)將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員給藥于所述人或動物，禾口(b)確定所述結(jié)合成員是否在所述人或動物體的肺中存在；其中所述結(jié)合成員在所述人或動物的肺中的定位顯示肺癌的存在。29.—種在人或動物中檢測或診斷淋巴瘤的方法，包含以下步驟(a)將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員給藥于所述人或動物，禾口(b)確定所述結(jié)合成員是否在所述人或動物體的淋巴系統(tǒng)中存在；其中所述結(jié)合成員在所述人或動物的淋巴系統(tǒng)中的定位顯示淋巴瘤的存在。30.根據(jù)權(quán)利要求28至29中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員結(jié)合所述纖連蛋白的ED-A。31.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員連接可檢測標(biāo)記。32.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員連接放射性同位素。33.—種治療個體中肺癌的方法，其包含將治療有效量的包含結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員的藥物給藥于所述個體。34.—種治療個體中淋巴瘤的方法，其包含將治療有效量的包含結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員的藥物給藥于所述個體。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。36.根據(jù)權(quán)利要求33至35中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員結(jié)合所述纖連蛋白的ED-A。37.根據(jù)權(quán)利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員連接可檢測標(biāo)記。38.根據(jù)權(quán)利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員連接具有殺滅或細(xì)胞毒素活性的分子。39.根據(jù)權(quán)利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員連接放射性同位素。40.—種將分子遞呈至人或動物的肺腫瘤新生血管的方法，其包含將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員給藥于所述人或動物，其中所述結(jié)合成員連接所述分子。41.一種將分子遞呈至人或動物的淋巴瘤新生血管的方法，其包含將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員給藥于所述人或動物，其中所述結(jié)合成員連接所述分子。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。43.根據(jù)權(quán)利要求40至42中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員結(jié)合所述纖連蛋白的ED-A。44.根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項所述的方法，其中所述分子是可檢測標(biāo)記。45.根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項所述的方法，其中所述分子具有殺滅或細(xì)胞毒素活性。46.根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項所述的方法，其中所述分子是放射性同位素。47.根據(jù)權(quán)利要求28至46中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員包含VH域，其中所述VH域包含構(gòu)架和一組互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4，和HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5;或其中所述VH域包含具有在所述互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3中10個或更少的氨基酸取代的一組互補(bǔ)決定區(qū)。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述VH域構(gòu)架是人種系構(gòu)架。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述VH域具有氨基酸序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。50.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合成員進(jìn)一步包含含有一組互補(bǔ)決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3和構(gòu)架的VL域。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，LCR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7，和LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或其中所述VL域包含具有在所述互補(bǔ)決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3內(nèi)10個或更少的氨基酸取代的一組互補(bǔ)決定區(qū)。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述VL域構(gòu)架是人種系構(gòu)架。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述VL域具有氨基酸序列SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。54.根據(jù)權(quán)利要求50至53中任一項所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員是單鏈Fv。55.根據(jù)權(quán)利要求50至53中任一項所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)合成員是雙體抗體。全文摘要本發(fā)明涉及一種結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域(ED-A)同種型的結(jié)合成員，用于檢測和治療肺癌和淋巴瘤。文檔編號A61P35/00GK101754978SQ200880025253公開日2010年6月23日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日發(fā)明者亞歷山德拉·維拉,伊夫林·特拉赫塞爾,達(dá)里奧·內(nèi)里,雅舍-尼古拉·雷巴克申請人:菲洛根股份公司