專利名稱：：利用g蛋白偶聯(lián)受體和相關組合物的篩選方法利用G蛋白偶聯(lián)受體和相關組合物的篩選方法關于聯(lián)邦政府資助研究的陳述本發(fā)明是在美國政府支持下在由國家衛(wèi)生研究所授予的資助號DK11794下作出的。政府對本發(fā)明具有一定權利。
背景技術：
：通常，本發(fā)明涉及一種具有長或短壽命活性(prolongedorshort-livedactivity)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的激動劑(agonists)的篩選方法。更具體地說，本發(fā)明涉及甲狀旁腺(PTH)激素或PTH相關蛋白(PTHrP)配體類似物，與PTH(1_34)相比，其對于PTH受體(PTHR)具有更長或更短壽命的活性。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的方法鑒定的PTHR配體以及這樣的配體在治療疾病中的應用。GPCR是較大組的膜受體，其響應于通過激動劑進行的激活作用來激活G蛋白，其本身接著引起至少一種信號級聯(lián)的激活，如環(huán)AMP/蛋白激酶A級聯(lián)。該較大組的受體存在于從細菌到人類的生物中，并且涉及，例如，激素、神經(jīng)元、以及嗅覺信號轉導。甲狀旁腺激素受體(PTHR)是PTH和PTH相關蛋白(PTHrP)的內(nèi)源性受體，然而每種配體具有不同的生物學功能。PTH調(diào)節(jié)鈣和磷酸鹽穩(wěn)態(tài)(體內(nèi)穩(wěn)態(tài))并作為腺分泌的內(nèi)分泌激素作用于骨和腎臟中的耙細胞。PTH還主要通過它對位于腎近端小管(PT)細胞中的鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白(NaPi-IIa和NaPi-IIc)的作用來減少無機磷酸鹽(P》的重吸收。PTHrP調(diào)節(jié)在發(fā)育組織中的細胞增殖和分化程序，以及被分泌并以旁分泌方式在組織原基中起作用(Kronenberg，H.M.Ann.N.Y.Acad.Sci.1068:1-13(2006))。[OOOS]PTH和PTHrP在它們的氨基末端(殘基1-14)信號區(qū)(signalingdomains)是最同源的(8個氨基酸同一性)，并且在它們的14-34個結合域呈現(xiàn)中等同源性(3個同一性)。通常推測，PTH和PTHrP的完全活性(殘基1-34)部分經(jīng)由基本相同的機制與PTHR相互作用(Caulfieldetal.，Endocrinology127:83-87(1990);Abou-Samraetal.，Endocrinology125:2215-2217(1989))。認為該機制包括兩個主要成分(components):配體的羧基末端結合域與受體的氨基末端胞外(N)域之間的相互作用，以及配體的氨基末端信號區(qū)(signalingdomains)與受體的近膜(J)區(qū)之間的相互作用，其包含胞內(nèi)環(huán)和7個跨膜螺旋(Hoareetal.，J.Biol.Chem276:7741-7753(2001);Castroetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:16084-16089(2005);Witelsbergeretal.，Biochemistry45:2027-2034(2006);Shimizuetal.，J.Biol.Chem.280:1797-1807(2005);Gensureetal.，Biochem.Biophys.Res.Co匪n.328:666-678(2005))。然而，兩種配體所使用的結合的確切機制不同的程度(如果有的話)仍有待確定。在人類中，PTH(1-34)具有有力的骨合成代謝效應，并且誘導骨礦質(zhì)密度(bonemineraldensity)和骨強度的顯著增加。確實，現(xiàn)在重組人PTH(1_34)被認為是用于骨質(zhì)疏松癥的最有效的治療方法之一(TashjianandGagel，J.BoneMiner.Res21:354-365(2006))。重要的是，必須以脈沖(搏動)方式(例如，每日一次皮下注射)來給予hPTH(l-34)，以便實現(xiàn)它的成骨效應(骨形成效應，bone-formingeffects)。在更長期給8予的情況下，與持續(xù)輸液泵機制一樣，PTH(l-34)會對骨施加凈分解代謝效應，這是由于相對于由成骨細胞介導的成骨反應，由破骨細胞介導的骨吸收(骨再吸收)反應具有更大的激活作用。因此在骨中PTH受體暴露于PTH配體的持續(xù)時間是由所述配體實現(xiàn)的總的骨形成反應的關鍵決定因素，因而是其治療骨質(zhì)疏松癥的效力的關鍵決定因素。臨床研究已表明，PTHrP(l-36)在人類中還可以增加骨礦質(zhì)密度，并且可以達到與PTH(l-34)大約相同的程度，雖然需要更高的劑量(Horwitzetal.，J.Endocrinol.Metab.88:569-575(2003))。重要的是，甚至在這樣的更高劑量下，PTHrP(l-36)也并不剌激有害的骨吸收和高血鈣反應，而相同劑量的PTH(l-34)則預期會發(fā)生這種情況(Horwitzetal.，J.Endocrinol.Metab.88:569-575(2003);Horwitzetal.，J.BoneMiner..Res.20:1792-1803(2005);Horwitzetal.，OsteoporosisInt.17:225-230(2006))。兩種肽的生物活性的差異并不僅是由于藥物代謝動力學(pharamacokinetics)的差異。利用穩(wěn)態(tài)輸注法進行的兩種肽的直接比較表明，就剌激1，25-(0Hh維生素D3的腎合成而言，與PTH(l-34)相比，PTHrP(l-36)是顯著更少有效的(Horwitzetal.，J.Bone.Mineral-Research.20:1792-1803(2005))。除骨質(zhì)疏松癥以外，hPTH(l-34)還顯示出可以有效治療PTH缺乏的病癥，即甲狀旁腺功能減退。因而，PTH(l-34)顯示為是骨化三醇治療的安全和有效的備選方案并且能夠保持正常的血清鈣水平而沒有在甲狀旁腺功能減退患者中的高鈣尿癥(Wineretal.，J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220(2003))。該肽必須被每日注射至少兩次，并且作者認識到該疾病需要長效PTH(l-34)類似物(Wineretal.，J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220(2003))。因此，本
技術領域：
需要這樣的PTH或PTHrP類似物，與PTH(l-34)相比，其對PTH受體具有更長或更短效的作用。還需要這樣的測定(分析)，其使得可以區(qū)分長效與短效的PTH肽。
發(fā)明內(nèi)容按照經(jīng)典的GPCR理論，可以區(qū)分兩種形式的G蛋白偶聯(lián)受體形式(RG)，其結合于G蛋白，以及形式(R)，其未結合于G蛋白。GPCR信號需要受體直接激活G蛋白，S卩，必須形成RG狀態(tài)，并且通過激動劑配體(agonistligand)的結合可以誘導這種RG形成。激動劑配體的結合可以誘導或穩(wěn)定RG狀態(tài)，并且相互地，RG狀態(tài)可以穩(wěn)定激動劑的高親和結合。在結合GTP或非水解的GTP類似物(如GTPyS)以后，受體偶聯(lián)G蛋白將從該受體解離，引起該受體回復到低親和狀態(tài)?，F(xiàn)在認識到，一些GPCR如PTHR可以形成新的狀態(tài)(R,，其甚至在有GTPYS存在的情況下，由此甚至當G蛋白很可能未結合受體時也可以以高親合力結合某些激動劑配體。通常，在細胞中GPCR處于RG、R、或W狀態(tài)的比例可以根據(jù)細胞類型和條件而變化。由于這些原因，先前關于評估配體與GPCR的結合的工作通常并不明確區(qū)分RG、R、或R°狀態(tài)。本發(fā)明的發(fā)明人研究了PTH受體，一種示例性的GPCR，已發(fā)現(xiàn)，與以較低親和力結合于R°的配體相比，以高親和力結合于R°狀態(tài)(除RG狀態(tài)以外)的配體具有更長的活性半衰期，并且這種長期活性并不依賴于配體體內(nèi)的生物利用度或藥代動力學。因此，短期作用的激動劑對于受體的R°形式具有更低的親和力?；谠摪l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了用于鑒定長效或短效GPCR激動劑的方法，以及利用本發(fā)明的方法鑒定的肽激動劑。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定候選化合物是否是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的長效激動劑的方法。該方法包括(a)使GPCR與該化合物接觸，其中GPCR具有RG形式，(b)測量該化合物對于GPCR的RG形式的親和力，(c)使GPCR與該化合物接觸，其中GPCR具有r0形式，以及(d)測量該化合物對于GPCR的RO形式的親和力，其中以下化合物被鑒定為GPCR的長效激動劑，所述化合物(i)具有的對于GPCR的RG形式的親和力是對GPCR的內(nèi)源性激動劑的親和力的至少1%(例如，5%、10%、25%、30%、50%、60%、75%、90%、100%、125%、150%、200%、150%、300%、400%、500%、750%、或1000%)，以及(ii)與內(nèi)源性激動劑相比，對于GPCR的R°形式具有更大的親和力(例如，1%、5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%、1000%、2000%、5000%、或10，000%)。該方法可以進一步包括以下步驟(e)將候選化合物給予動物，以及(f)測量動物對所述化合物的至少一種生理反應。受體可以是人類受體。GPCR可以是促胰液素家族受體(例如，PTH/PTHrP受體如人PTH/PTHrP受體)。當受體涉及鈣穩(wěn)態(tài)或轉運時，測量步驟(b)或(f)可以通過測量細胞內(nèi)或血鈣水平來進行。對于任何GPCR，可以利用競爭性結合測定(結合分析)來進行親和測量步驟(b)或步驟(d)。競爭性結合測定可以使用這樣的配體，其對于GPCR的RG形式是特異性的或對于GPCR的R°形式是特異性的?？梢岳醚舆tcAMP測定來進行測量步驟(b)(例如，如本文描述的)?？梢岳梅撬夂塑账犷愃莆?例如，GTPyS)來富集GPCR的W形式?？梢岳蔑@性負G蛋白來富集GPCR的RG形式。受體可以在細胞上或在膜中。候選化合物可以包括肽或可以來自化學庫或天然產(chǎn)物庫。在另一個方面，本發(fā)明還涉及一種用于確定候選化合物是否是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的短效激動劑的方法。該方法包括(a)使GPCR與該化合物接觸，其中GPCR具有RG形式，(b)測量該化合物對GPCR的RG形式的親和力，(c)使GPCR與該化合物接觸，其中GPCR具有RO形式；以及(d)測量該化合物對GPCR的ro形式的親和力，其中以下化合物被鑒定為GPCR的短效激動劑，所述化合物(i)具有的對于GPCR的RG形式的親和力是對GPCR的內(nèi)源性激動劑的親和力的至少1%(例如，5%、10%、25%、30%、50%、60%、75%、90%、100%、125%、150%、200%、150%、300%、400%、500%、750%、或1000%)，以及(ii)與內(nèi)源性激動劑相比，對于GPCR的R。形式具有更低親和力(例如，99%、95%、90%、85%、75%、65%、55%、50%、40%、30%、25%、15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、或0.0001%)。該受體可以是人類受體。該方法可以進一步包括以下步驟(e)將候選化合物給予動物，以及(f)測量動物對該化合物的至少一種生理反應。GPCR可以是促胰液素家族受體(例如，PTH/PTHrP受體如人PTH/PTHrP受體)。當受體涉及鈣穩(wěn)態(tài)或轉運時，可以通過測量細胞內(nèi)鈣水平來進行測量步驟(b)。對于任何GPCR，可以利用競爭性結合測定(例如，利用對于GPCR的RG形式是特異性的或對于其R°形式是特異性的配體)來進行測量步驟(b)或步驟(d)?？梢岳醚舆tcAMP測定來進行測量步驟(b)。在某些實施方式中，可以利用非水解核苷酸類似物(例如，GTPyS)來富集GPCR的W形式?？梢岳蔑@性負G蛋白來富集GPCR的RG形式。受體可以在細胞上或在膜中。候選化合物可以包括肽或可以來自化學庫或天然產(chǎn)物庫。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種對于PTHW具有低親和力(例如，以及對于RG具有高親和力)的多肽。該多肽可以是短效激動劑或者可以是RG選擇性性的。相對于野生型PTH或PTHrP序列，該多肽可以具有通過取代、缺失和/或添加一個或多個(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個)氨基酸加以修飾的氨基酸序列。該多肽可以具有在位置5處的組氨酸或在位置20、23、24、或28處的丙氨酸。該多肽可以是Ala23-PTH(l-34)、Ala23-PTHrP(l-36)、His5-PTH(1_34)、His5_PTHrP(1-36)、或其片段。該多肽可以選自由在圖26B的表中那些鑒定為RG選擇性的任何多肽組成的組。該多肽可以被配制用于藥物給予(例如，如本文中所描述的)或可以被純化。本發(fā)明還涉及一種用于在受治療者中治療骨質(zhì)疏松癥的方法，該方法包括以足以治療骨質(zhì)疏松癥的量將前述方面的多肽、RG選擇性多肽(例如，那些本文描述的多肽)、本文描述的作為長效激動劑的多肽、或本文描述的任何多肽、或其藥用形式給予需要其的受治療者。本發(fā)明還涉及一種用于在受治療者中治療骨折修復、骨軟化、關節(jié)炎、血小板減少、甲狀旁腺功能減退或高磷酸鹽血癥或增加干細胞轉移(stemcellmobilization)的方法，該方法包括以足以治療疾病或病癥或增加干細胞轉移的量將先前方面的多肽或本文描述的任何多肽、或其藥用形式給予受治療者。多肽或其藥用形式可以皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)肺(transpulmonarily)、經(jīng)皮、或口服給予。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種多肽(PTH類似物或PTH衍生物)，其結合PTH受體并且對于PTH受體R°形式具有高親和力。相對于野生型PTH或PTHrP序列，該多肽可以具有通過取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸而修飾的氨基酸序列。該多肽還可以在位置19處具有精氨酸或在位置5處具有異亮氨酸。該多肽可以是Al^-AiW[M]PTH(l-28)、Ala^Aib3[M]PTH(l-34)、或Ile5_PTHrP(1-36)。該多肽可以選自由圖26B中的具有小于或等于2.9nM或7.9nM的IC5。的任何肽、以及I5_hPTHrP(1-36)(#1208)(基于圖26B的數(shù)據(jù))組成的組。該多肽可以被配制用于藥物給予(例如，如本文描述的)或者可以被純化。本發(fā)明還涉及一種通過以足以治療疾病或病癥的量將先前方面的多肽、本文描述的R°選擇性多肽、本文描述的作為長效激動劑的多肽、或本文描述的任何多肽、或其藥用形式給予需要其的受治療者而用于在該受治療者中治療選自由甲狀旁腺功能減退、高磷酸鹽血癥、瘤樣f丐質(zhì)沉著(瘤樣f丐化癥，tumoralcalcinosis)、以及骨質(zhì)疏松癥組成的組中的疾病或病癥的方法。本發(fā)明還涉及一種用于治療需要骨折修復，或患有骨軟化、關節(jié)炎、血小板減少，或需要干細胞轉移的受治療者的方法受治療者，所述方法包括以足以修復骨折、治療疾病、或轉移干細胞的量將先前方面的多肽或本文描述的任何多肽、或其藥用形式給予所述受治療者。該多肽或其藥物組合物可以皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)肺、經(jīng)皮、以及口服給予。本發(fā)明還涉及一種PTH或PTHrP多肽，相對于野生型PTH或PTHrP序列，其具有通過取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸而修飾的氨基酸序列。該多肽可以具有在位置19處的精氨酸或在位置5處的異亮氨酸。該多肽可以選自由以下組成的組AVAEIQLMHQRGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI:M-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)0H;AVAEIQLMHQRAKWIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI:M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)0H;AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRRFFLHHLIAEIHTAEI:M-PTH(1-18)/PTHrP(19-36)0H;SVSEHQLMHNLGKHIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI:[H5]-hPTH(1-14)/PTHrP(15—36)0H;AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRVEWLRKKLQDVHNF:[R19]，M-hPTH(1-34)OH;SVSEIQLMHNLGKHIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[E19]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH;AVAEIQLMHQRAKWIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[E19]，M-hPTH(1-14)/PTHrP(15—36)OH;以及AVAEIQLMHQRAKWLNSMERVEWLRKKLQDVHNF:[E19]，M-hPTH(l_34)0H。該多肽可以具有在位置5處的組氨酸。該多肽可以由以下化學式之一來表示Ala1，Aib3[M]PTH(l-28)、Ala23PTH、以及Ile5_PTHrP。該多肽可以選自由下述組成的組AVAEHQLMHQRAKWLNSMERVEWLRKKLQDVHNF:[H5，E19]，M-PTH(l-34);AVAEHQLMHQRAKWIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[H5，E19]，M-hPTH(1-14)/PTHrP(15—36);SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEFLHHLIAEIHTAEI:hPTH(1-22)/PTHrP(23-36);SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDIHTAEI:PTH(l-30)/PTHrP(31-36);AVAEIQLMHQRAKWLNSMERVEALRKKLQDVHNF:[A23，E19]，M-PTH(1-34);以及AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRVEALRKKLQDVHNF[A23]，M-PTH(l-34)。該多肽可以用于任何治療方法或任何組合物(例如，本文描述的藥物組合物)中。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種這樣的多肽，其中所述多肽包括具有以下化學式的氨基酸序列或包括基本上相同于由以下化學式限定的氨基酸序列的氨基酸序列Xl-Val-X2-Glu-His-Gln-Lys-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7，其中XI是Ser、Ala、Gly、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(穩(wěn)定化殘基，stabilizingresidue)(例如，Aib);X2是Ser、Ala、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);X3是Asn、Ala、Glu、Val、Asp、或Gln;X4是Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、Leu、或Har;X5是Gly、His、Arg、Ala、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);X6是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala、Arg、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);以及X7是Arg、Leu、Phe、Trp、His、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);或其包含氨基酸1-10、1-11、1-12、或1-13的片段，或其藥用鹽。a-螺旋穩(wěn)定殘基可以是，例如，非編碼氨基酸如(2-氨基異丁酸)、ACPC(1-氨基環(huán)丙基羧酸)、DEG(二乙基甘氨酸)、或1-氨基環(huán)戊烷羧酸。在一些實施方式中，相對于對應的野生型PTH序列，氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、或8個取代。在一些實施方式中，多肽包括在XI處的Ala、Gly、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);在X2處的Ala或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);在X3處的Ala、Glu、Val、Asp、或Gin;在X4處的Val、Ala、Trp、11e、Met、Lys、Arg、或Har;在X5處的His、Arg、Ala、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);在X6處的Gln、Leu、His、Trp、Ala、Arg、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);在X7處的Arg、Leu、Phe、Trp、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);或其組合。在任何這些實施方式中，該多肽可以具有長度少于100、50、36、34、30、25、或20(例如，10-14個氨基酸)的氨基酸序列。在一些實施方式中，該多肽的長度為21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、或10個氨基酸。該多肽可以是包括藥用載體的組合物的一部分。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種這樣的多肽，其包括以下化學式的氨基酸序列或包括基本上相同于由以下化學式限定的氨基酸序列的氨基酸序列Xl-Val-X2-Glu-X3-Gln-Leu-Met-His-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-X9-Val-Glu-X10-Xll-Arg-Lys-Lys-X12，其中XI是Ser、Ala、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);X2是Ser、Ala、或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);X3是Ile或His;X4是Asn、Glu、Val、Asp、或Gln;X5是Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、Leu、或Har;X6是Gly、His、Arg、或Ala;X7是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala或Arg;X8是Arg、Leu、Phe、Trp、His、或Ser;X9是Arg或Ala;X10是Trp、Ala或Phe;Xll是Leu或Ala;以及X12是Leu或Ala;并且其中氨基酸序列包括選自由位置X3處的His、位置X9處的Ala、位置X10處的Ala、位置XI1處的Ala、以及位置X12處的Ala組成的組中的氨基酸中的至少一種；包括所述氨基酸序列的氨基酸l-24、l-25、l-26、或1-27的片段，或其藥用鹽。該多肽可以以低親和力結合于PTH受體的R°形式(例如，以高親和力結合于PTH受體的RG形式)。該多肽可以是RG選擇性的或可以是受體的短效激動劑。相對于對應的野生型序列，該多肽可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個取代。在一些實施方式中，該多肽包括在XI處的Ala或a-螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);在X2處的Ala或a_螺旋穩(wěn)定殘基(例如，Aib);在X3處的His;在X4處的Glu、Val、Asp、或Gln;在X5處的Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、或Har;在X6處的His、Arg、或Ala;在X7處的Gln、Leu、His、Trp、Ala、或Arg;在X8處的Arg、Leu、Phe、Trp、或Ser;在X9處的Ala;在X10處的Ala或Phe;在Xll處的Ala;在處X12的Ala;或其組合。該多肽的長度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28個氨基酸。該多肽的長度可以是24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個氨基酸(例如，長度為24-28個氨基酸)。在一些實施方式中，X9、X10、X11、或X12中的至少一個(例如，2、3、或4個)是丙氨酸。13在另一個方面，本發(fā)明涉及一種這樣的多肽，其包括以下化學式的氨基酸序列，或基本上相同于由以下化學式限定的氨基酸序列Xl-Val-X2-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7-Leu-Asn-Ser-Met-Arg-Arg_Val_Glu_Trp_Leu_Arg_Lys_Lys_Leu，其中XI是Ser、Ala、或Aib;X2是Ser、Ala、或Aib;X3是Asn、Glu、Val、Asp、或Gln;X4是Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、或Leu;X5是Gly、His、Arg、或Ala;X6是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala、或Arg;以及X7是Arg、Leu、Phe、Trp、His、或Ser，或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、或1_27的片段，或其藥用鹽。該多肽可以是W選擇性的或可以是長效PTH激動劑。上述氨基酸序列可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個取代(例如，相對于野生型PTH序列，在上述任何位置)。在一些實施方式中，該多肽包括在XI處的Ala或Aib;在X2處的Ala或Aib;在X3處的Glu、Val、Asp、或Gin;在X4處的Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、或Arg;在X5處的His、Arg、或Ala;在X6處的Gln丄eu、His、Trp、Ala、或Arg;在X7處的Arg丄eu、Phe、Trp、或Ser;或它們的組合。該多肽的長度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28個氨基酸。該多肽的長度可以是24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個氨基酸(例如，長度為24-28個氨基酸)。該多肽可以是在具有藥用載體的組合物中。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種這樣的多肽，其包括具有下式的氨基酸序列或基本上相同于由該式限定的多肽的氨基酸序列Ala_Val_Ser_Glu_His_Glu_Leu_Leu_His_Asp_Lys_Gly_Lys_Ser_Ile_Gln_Asp_Xl-Arg-Arg-Arg-X2-Phe-Leu-X3-X4-Leu-Ile-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Glu-Ile其中XI是Leu、Ala、SerX2是Phe、Ala、SerX3是His、Leu、ArgX4是His、Ala、SerX5是Ala、Gly、SerX6是Glu、Gly、SerX7是11e、Leu、ValX8是His或Ala;X9是Thr、Asn、或Ala;以及X10是Ala或Phe，或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、1-27、1-28、1-29、1-30、l-31、l-32、l-33、l-34、或l-35的片段，并且其中所述多肽包括至少一個氨基酸取代(與對應的野生型PTHrP序列或其片段相比)；或其藥用鹽。該多肽可以以低親和力結合于PTH受、Met、Phe、或Glu;、Leu、Asn、Trp、Glu、或Lys;、Lys、Trp、11e、或Phe;、Asn、Lys、或Arg;、Asn、Gln、Trp、Glu、或Lys;、Leu、Asn、Asp、Lys、或Ala;、Lys、或Ala;體的W形式(例如，以高親和力結合于PTH受體的RG形式)。該多肽可以是RG選擇性的或可以是PTH受體的短效激動劑。相對于對應的野生型PTHrP序列，該多肽可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個取代。在一些實施方式中，該多肽具有在X1處的Ala、Ser、Met、Phe、或Glu;在X2處的Ala、Ser、Leu、Asn、Trp、Glu、或Lys;在X3處的Leu、Arg、Lys、Trp、11e、或Phe;在X4處的Ala、Ser、Asn、Lys、或Arg;在X5處的Gly、Ser、Asn、Gln、Trp、Glu、或Lys;在X6處的Gly、Ser、Leu、Asn、Asp、Lys、或Ala;在X7處的Leu、Val、Lys、或Ala;在X8處的Ala;在X9處的Asn或Ala;在X10處的Phe;或它們的組合。在特定實施方式中，該多肽具有在XI處的Ala或Glu、在X2處的Ala、在X3處的Leu、在X4處的Lys、或它們的組合。該多肽的長度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28個氨基酸。該多肽的長度可以是24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個氨基酸(例如，長度為28-36個氨基酸)。該多肽可以具有自由羥基或在其C端被酰胺化。該多肽可以包括選自表l的氨基酸序列，或基本上相同于這樣的序列的序列。該多肽可以在具有藥用載體的組合物中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在另一個方面，本發(fā)明涉及一種PTH或PTHrP多肽(例如，任何上述方面或本文描述的多肽)，其中N端被龐大的(bulky)殘基(例如，Trp)取代。這樣的多肽包括Trp^PTH(l-34)、Trp^M-PTH(1-34)、以及TRP^PTHrP(1-36)、或它們的片段，其包含所述序列的氨基酸1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24、1-25、1-26、1-27、1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、l-34、或1-35。與缺少龐大的殘基取代的多肽相比，該多肽在PTH受體處可以具有減少的(例如，至少1%、5%、10%、25%、50%、75%、90%、95%、99%、99.5%、99.9%、99.95%、或99.99%)PLC信號活性。其它龐大的殘基包括Phe、Tyr、以及對苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)。在一些實施方式中，該多肽包括在M或Mc修飾中陳述的任何一個(例如，2、3、4、5、6、或7個)突變，其中M表示[Ala1'12，Aib3，Gln10，高精氨酸"，Trp14，Arg19]，而Mc表示Ala1'3'12,Gln10，Arg11，Trp14，Arg19PTH序列、或它們的任何組合。雜合肽可以進一步包括在位置5處的取代(例如，在位置5處的組氨酸)。示例性的多肽包括Trp^PTH(l-28)和Trp^M-PTH(1-28)。在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明涉及一種包括雜合PTH/PTHrP多肽的多肽，或一種包括基本上相同于雜合PTH/PTHrP多肽的氨基酸序列的多肽。該多肽可以由式PTH(l-X)/PTHrP(Y-36)來表示，其中X是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34并且Y二X+1。在一些實施方式中，雜合多肽包含在M或Mc修飾中陳述的任何一個(例如，2、3、4、5、6、或7個)突變，其中M表示[Ala1'12，Aib3，Gln10，高精氨酸"，Trp14，Arg19]，而Mc表示Ala1'3'12,Gln10，Arg11，Trp14，Arg19PTH序列、或它們的任何組合。雜合肽可以進一步包括在位置5處的取代(例如，在位置5處的組氨酸)。在上面描述的任何多肽中，該多肽可以是生物活性的，例如，具有的對于GPCR的RG形式的親和力是對GPCR的內(nèi)源性激動劑的親和力的至少1%(例如，5%、10%、25%、30%、50%、60%、75%、90%、100%、125%、150%、200%、150%、300%、400%、500%、750%、或1000%)，并且與對照(例如，GPCR的內(nèi)源性配體)相比，對R°形式具有更低的親和力(例如，99%、95%、90%、85%、75%、65%、55%、50%、40%、30%、25%、15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、或0.0001%)。在其它實施方式中，該多肽具有的對于GPCR的RG形式的親和力是對GPCR的內(nèi)源性激動劑的親和力的至少1%(例如，5%、10%、25%、30%、50%、60%、75%、90%、100%、125%、150%、200%、150%、300%、400%、500%、750%、或1000%)，以及(ii)與內(nèi)源性激動劑相比，對于GPCR的RQ形式具有更大的親和力(例如，1%、5%、10%、25%、50%、100%、200%、500%、1000%、2000%、5000%、或10，000%)，或被鑒定為GPCR的長效激動劑。在上述方面，該多肽可以是RG選擇性的、W選擇性的、短效激動劑、或長效激動劑。在一些實施方式中，該多肽可以被修飾(例如，在N端被乙?；?、在C端被酰胺化、或包含本文描述的任何修飾)。本發(fā)明還涉及一種核酸，其包括編碼本文描述的多肽(例如，上述那些多肽)的序列。該核酸可以操作性地連接于啟動子和/或載體的一部分。本發(fā)明還涉及一種包括載體的細胞(例如，原核細胞如細菌細胞或真核細胞如酵母或哺乳動物細胞，例如，人細胞)。本發(fā)明還涉及一種通過在誘導所述核酸表達的條件下生長上述細胞以及可選地純化多肽來制備多肽的方法。17"GPCR"是指包括G蛋白偶聯(lián)受體的任何多肽或其功能片段。期望地，GPCR與天然存在的GPCR具有至少70%、80%、90%、95%、99%、或100%的序列同一性。本文描述了示例性的GPCR。GPCR的"RG形式"是指G蛋白-結合的受體構象。例如，可以通過GPCR的增加的G蛋白結合來誘導GPCR的RG形式。在本發(fā)明的測定中，當測量對于RG形式的親和力時，至少1%、5%、10%、25%、50%、75%、90%、95%、或99%的受體具有RG形式。GPCR的"R°形式"是指當GPCR未結合于G蛋白但能夠結合受體的至少一些配體時所發(fā)生的受體構象?？梢岳缤ㄟ^防止或減少G蛋白結合于GPCR來促進GPCR的R°形式(相對于RG)。在本發(fā)明的測定中，當測量對于W形式的親和力時，至少0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、90%、95%、或99%的受體可以具有1°形式。"親和力"是指化合物與目標受體(靶受體，targetrec印tor)相互作用的能力。在本發(fā)明的測定和多肽中，可以通過結合(例如，競爭性結合測定或FRET)來直接測量親和力，或通過活性測定(例如，cAMP信號或細胞內(nèi)鈣的變化)來間接測量親和力。期望地，化合物對于受體具有至少10umol、lumol、500翻l、100翻l、50翻l、25翻l、10翻l、5翻l、lnmo1、500pmo1、200pmo1、1OOpmo1、50pmo1、25pmo1、Opmo1、或lpmo1的親和力，如通過GPCR的RG形式或R°形式的EC5。所測得的。"長效激動劑"是指這樣的激動劑，與相同受體的內(nèi)源性激動劑相比，其活性(例如，體內(nèi)或體外測得的)具有至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、500%、1000%、或5000%更長的半衰期。"短效激動劑"是指這樣的激動劑，與相同受體的內(nèi)源性激動劑相比，其活性(例如，利用本文描述的測定體內(nèi)或體外測得的)的半衰期小于95%、90%、75%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、或1%。"RG選擇性激動劑"是這樣的激動劑，與對照激動劑(例如，內(nèi)源性激動劑)相比，其呈現(xiàn)出與受體的RG形式的增加的結合(相對于受體的W形式)。受體選擇性可以表示為每種受體形式之間的結合常數(shù)的比率，例如，R°/RG比，其中該比率的增加表明更強地結合于RG形式。如圖26A和圖26B所示，PTH(l-34)的R°/RG比是67，并且在結合表達在C0S-7細胞膜上的人PTH受體中相對更多的RG選擇性PTHrP(l-36)是260。在該系統(tǒng)中，RG選擇性激動劑可以具有至少100、150、200、250、300、400、500、1000、2000、3000、5000、7000、10，000、15，000、20，000、或50，000的R。/RG比。R。/RG比可以是對照激動劑的R。/RG比的至少1.5、2、3、4、5、10、15、25、50、75、或100倍。"W選擇性激動劑"是這樣的激動劑，與對照激動劑(例如，內(nèi)源性激動劑)相比，其呈現(xiàn)出與受體的RG形式的減少的結合(相對于受體的R°形式)。受體選擇性可以表示為每種受體形式之間的結合常數(shù)的比率，例如，R7RG比，其中該比率的降低表明更強地結合于R。形式。如圖26A和圖26B所示，PTH(l-34)的R°/RG比是67，并且在結合表達在C0S-7細胞膜上的人PTH受體中相對更多RG選擇性PTHrP(l-36)是260。在該系統(tǒng)中，R0選擇性激動劑可以具有小于60、50、40、30、25、20、25、10、5、2、1、0的R。/RG比。因此R。/RG比可以小于對照激動劑的R。/RG比的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08、0.05、0.03、0.01、0.008、0.005、0.003、或0.001倍。GPCR的"內(nèi)源性激動劑"是指由生物產(chǎn)生的化合物、或所述化合物的合成擬表型18(syntheticphenocopy)，即具有與內(nèi)源性激動劑相同的藥理活性的化合物。例如，天然PTH肽是l-84，而PTHrP是約1-140個氨基酸；這些配體的擬表型(phenocopies)分別包括PTH(l-34)和PTHrP(l-36)。內(nèi)源性激動劑涉及或調(diào)節(jié)GPCR的正常生理活性。某些GPCR具有多種內(nèi)源性激動劑(例如，用于PTHR的內(nèi)源性激動劑包括PTH和PTHrP);對本發(fā)明來說，任何內(nèi)源性激動劑可以用來確定候選化合物是短效或長效的。"肽"或"多肽"是指至少4、6、10、25、50、100、150、200、500、或1000個氨基酸的氨基酸鏈。多肽的"片段"是指長度至少為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35個氨基酸的序列的一部分。"受治療者"是指人或非人動物(例如，哺乳動物)。"足以治療的量"是指足以減少、預防、或消除與疾病或病癥有關的至少一種癥狀的量。"純化的多肽"或"分離的多肽"是指已分離自其它成分(components)的多肽。通常，當多肽按重量計為至少30%，沒有其它成分時，則多肽基本上是純的。在一些實施方式中，所述多肽按重量計是至少50%、60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%，沒有其它其它成分?？梢岳缤ㄟ^提取自天然來源；通過表達編碼這樣的多肽的重組多核苷酸；或通過化學合成所述多肽來獲得純化的多肽?？梢酝ㄟ^任何適當?shù)姆椒?，例如，柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、或通過HPLC分析來測量純度。"生物活性"是指，在給予細胞或動物(例如，人或非人哺乳動物)以后，化合物或組合物(例如，本文描述的多肽)具有至少一種生物顯著效應。PTH、PTHrP、以及其類似物的生物活性(例如，本文描述的那些)包括受體結合，cAMP或n^生產(chǎn)，蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C、磷脂酶D、以及磷脂酶A2的激活，細胞內(nèi)、血漿、或尿鈣或磷酸鹽水平的變化(例如，增加或減少)，以及體內(nèi)或體外骨代謝或分解代謝的變化。與適當?shù)膶φ?例如，野生型肽或其擬表型如PTH(l-34)或PTHrP(l-36))相比，本發(fā)明的生物活性肽(例如，本文描述的任何肽)，例如，可以呈現(xiàn)任何生物活性的增加(例如，至少5%、10%、25%、50%、100%、500%、1000%、10，000%)或任何生物活性的減少(例如，95%、90%、75%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、或0.001%)。"基本相同的"是指這樣的核酸或氨基酸序列，當例如利用以下描述的方法進行最優(yōu)化序列對比時，其與第二核酸或氨基酸序列，例如，PTH或PTHrP序列或其片段，共享至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。"顯著同一性(substantialidentity)"可以用來指不同類型和長度的序列，如全長序列、表位或免疫原性肽、功能域、編碼和/或調(diào)節(jié)序、外顯子、內(nèi)含子、啟動子、以及基因組序列。兩個多肽或核酸序列之間的百分比同一性可以以本領域技術人員已知的各種方式來確定，例如，利用可公開獲得的計算機軟件如SmithWatermanA1ignment(Smithetal.，J.Mol.Biol.147:195-7(1981));"BestFit"(SmithandWaterman,AdvancesinAppliedMathematics,482—489(1981))如結合至ljGeneMatcherPlusTM，SchwarzandDayhof(1979)AtlasofProteinSequenceandStructure,Dayhof，M.0.，Edpp353_358;BLAST程序(BasicLocalAlignmentSearchTool;(Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403_10(1990))，BLAST-2，B1JVST-P，B1JVST-N，B1JVST-X，WU-BLAST-2，ALIGN，A1JGN-2，CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)軟件。此外，本領域技術人員可以確定用于測量序列對比的適當?shù)膮?shù)，包括在待比較序列的長度上獲得最大序列對比所需要的任何算法。通常，對于蛋白質(zhì)，比較序列的長度將是至少6或8個氨基酸，優(yōu)選9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、或500個氨基酸，或多達蛋白質(zhì)的整個長度。對于核酸，比較序列的長度將通常是至少18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、或至少1500個核苷酸或多達核酸分子的整個長度。應當明了，當比較DNA序列與RNA序列時，對于確定序列同一性來說，胸腺嘧啶核苷酸等效于尿嘧啶核苷酸。保守取代通常包括以下組內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。"龐大的氨基酸"是指分子量大于100Da(例如，大于125、150、175、200、225、250、300、或400)的任何氨基酸。每種編碼氨基酸的分子量如下。Ala:71.09，Arg:156.19，Asp:115.09，Asn:114.11，Cys:103.15，Glu:129.12，Gln:128.14，Gly:57.05，His:137.14，lie:113.16，Leu:113.16，Lys:128.17，Met:131.19，Phe:147.18，Pro:97.12，Ser:87.08，Thr:101.11，Trp:186.12，Tyr:163.18，以及Val:99.14。根據(jù)以下詳細描述、附圖、以及權利要求，本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將是顯而易見的。圖1A-1C是示出了PTH和PTHrP類似物與人PTH受體(PTHR)的解離以及GTPyS的影響的圖。將放射性配體125I-[Nle8'21，Tyr34]rPTH(1-34)NH2(圖1A)、125I_[Tyr36]PTHrP(1-36)NH2(圖IB)以及125I_[Ile5，Tyr36]PTHrP(1-36)NH2(圖1C)預結合于在由HKRK-B7細胞制備的膜中的人PTHR90分鐘；然后開始解離(t=0)，其中通過添加過量的未標記類似物(5X10—7M)，單獨添加(實心圓)或連同GTPyS—起添加(5X10—5M，空心圓(開圓))。在每個時間點，從反應管移走等分部分(aliquots)并立即利用96孔真空過濾板進行快速真空過濾以分離結合放射性與自由放射性。在預溫育和解離階段均在包含未標記配體(5X10—7M)的管中確定非特異性結合。然后將在每個時間點的特異性結合的放射性(SB)表示為在1=0時觀測到的特異性結合的百分比。示出了來自四個(圖1A)、五個(圖1B)、或三個(圖1C)實驗的綜合數(shù)據(jù)(aggregatedata)。利用兩相(圖IA和圖IB)或單相(圖1C)指數(shù)衰減方程將曲線擬合于數(shù)據(jù)。圖2A和2B是示出了結合于人和大鼠PTHR的PTH和PTHrP類似物的GTPyS敏感性的圖。在沒有或存在不同濃度的GTPYS的情況下并在近平衡條件下，評估了結合于由HKRK-B7細胞(圖2A)或ROS17/2.8細胞(圖2B)制備的膜中的PTHR的放射性配體類似物。數(shù)據(jù)表示為在沒有GTPYS存在的情況下的放射性特異性結合的(SB)的百分比。圖2A中的數(shù)據(jù)是來自三個(PTH(1-34))或五個(PTHrP(1-36)類似物)實驗的平均值(士s.e.m.)，而圖2B中的數(shù)據(jù)來自六個實驗，每個實驗重復進行兩次。研究的放射性配體是^I-[Nle8'21，Tyr34]PTH(l-34)NH2;[Tyr36]PTHrP(1—36)NH2;[Ile5，Tyr36]PTHrP(1—36)NH2以及[Aib1,3，20Nle8，Gln1。，Har11，Ala12，Trp14，Tyr15]hPTH(l_15)NH2。圖3A-3D是示出了PTH和PTHrP類似物與hPTHR的G蛋白偶聯(lián)和G蛋白未偶聯(lián)構象的結合的圖。通過競爭方法，利用由瞬時轉染的C0S-7細胞制備的膜評估了未標記PTH和PTHrP類似物與G蛋白偶聯(lián)PTHR構象(RG)和G蛋白未偶聯(lián)PTHR構象(R°)的結合。為了評估與RG的結合，用hPTHR和負顯性Gas亞單位(GaND)共轉染細胞；并且使用^I-[Aib1，3，M]PTH(1-15)NH2作為示蹤放射性配體。為了評估與R°的結合，僅用hPTHR來轉染細胞，使用125I_[Nle8'21，Tyr34]rPTH(l-34)NH2作為示蹤放射性配體，并且在有GTPyS存在的情況下進行結合反應。使用的未標記配體是[Nle8'21，Tyr34]rPTH(l-34)NH2(圖3A);[Tyr36]hPTHrP(l-36)NH2(圖3B);[His5，Nle8'21,Tyr34]rPTH(l-34)NH2(圖3C);以及[Ile5，Tyr36]hPTHrP(l-36)NH2(圖3D)。盡管每種配體以相對較高親和力結合于RG，但與PTH(1-34)和Ile5-PTHrP(l-36)相比，PTHrP(1-36)以及His5-PTH(l-34)以顯著更低的親和力結合于R°，因而呈現(xiàn)更強的RG選擇性。數(shù)據(jù)是三至七個實驗的平均值(±s.e.m.)，每個實驗一式兩份進行(還參見表5)。圖4A-4D是示出了在HEK-293細胞中結合于PTHR的配體的熒光共振能量轉移(FRET)分析的曲線圖。用PTHR構建物(PTHR-cam)(其包含在第三胞內(nèi)環(huán)中的青色熒光蛋白(CFP)和在羧基末端尾部中的黃色熒光蛋白(YFP))穩(wěn)定轉染的HEK-293細胞用來評估配體結合于、以及解離自PTHR的動力學。借助于PTHR-cam，用紫外光(Aexe=436nm)激發(fā)CFP會產(chǎn)生分子內(nèi)FRET至YFP，其可以觀測為來自YFP(Aemm=535nm)的光發(fā)射的增加以及來自CFP(A^二480nm)的光發(fā)射的減少。這種FRET信號發(fā)生在基態(tài)受體中并在激動劑結合以后減少。在每個圖中，跡線(trace)示出了在澆蓋(傾注，superfused)有單獨的緩沖液或包含PTH肽配體的緩沖液的細胞中隨時間獲得的熒光信號(FYFP(535)/FcFP(48。)，針對通道溢出加以歸一化)的比率(肽加入的時間由每個跡線上方的黑條表示)。使用的配體是hPTH(l-34)(圖4A);[Aib1,3，Gln1。，Har11，Ala12，Trp14]rPTH(1-14)NH2(圖4B);[Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2(圖4C);以及[Ile5，Tyr36]hPTHrP(1—36)NH2(圖4D)。由PTHrP(l-36)誘導的FRET信號的發(fā)生慢于由三種其它類似物誘導的FRET信號的發(fā)生。由PTH(1-14)和PTHrP(1-36)類似物誘導的信號在除去配體以后會衰減，而那些由PTH(1-34)和IleS-PTHrP(l-36)類似物誘導的信號仍然是穩(wěn)定的。數(shù)據(jù)來自單個實驗，并且在至少三個其它實驗中獲得相同的結果。圖5A和圖5B是示出了在穩(wěn)定表達人PTHR的細胞中由PTH和PTHrP類似物誘導的cAMP信號反應的持續(xù)時間的曲線圖。通過時間過程實驗(timecourseexperiments)評估了在HKRK-B7細胞中由PTHrP(1-36)或Ile5_PTHrP(1-36)(950，OOOhPTHR/細胞)誘導的cAMP反應的持續(xù)時間(圖5A)。用單獨的緩沖液(基底(basal))或包含配體(lOOnM)的緩沖液預處理細胞10分鐘；在t=0時，洗滌細胞，在緩沖液中溫育指定時間(洗出期(wash-outphase))，用3-異丁基-1_甲基黃嘌呤(IBMX)處理5分鐘，然后評估細胞內(nèi)cAMP。通過同時用肽和IBMX溫育細胞并省略洗出期所評估的對于每種肽的最大響應對于PTHrP(l-36)和Ile5-PTHrP(l-36)分別是185116和198118pmo1/孔。在沒有配體存在的情況下，在用IBMX處理的細胞中cAMP水平是2.0±0.3pmo1/孑L。數(shù)據(jù)是三個實驗的平均值(±s.e.m.)，每個實驗一式兩份進行。在這些實驗中，還分析了PTH(l-34)并在每個時間點誘導反應，其不是不同于那些由PTHrP(1-36)誘導的反應。在單個時間點，在配體洗出后60分鐘，在HKRK-B64細胞中(90，000hPTHR/細胞)類似地評估類似物(圖5B)。對于每種肽，數(shù)據(jù)表示為在同時用所述配體和IBMX處理IO分鐘并省略洗出期的細胞中產(chǎn)生的最大cAMP反應的百分比(表示在側圖中)。數(shù)據(jù)是4個實驗的平均值(±s.e.m)，每個實驗一式三份進行。星號表示成對反應的統(tǒng)計分析PTHrP(l-36)與Ile5-PTHrP(l-36)(圖5A)，或通過括號表示(圖5B):*，P《0.05;**，P《0.003。圖6A-6D是示出了PTH和PTHrP類似物與hPTHR的G蛋白偶聯(lián)和G蛋白未偶聯(lián)構象的結合的曲線圖。如上面針對圖3A-3D所描述的，進行結合反應。使用的未標記配體是hPTH(l-34)叫(圖6A);[AibU，Nle8，Gln"，Har"，Ala。，Trp"，Ty5]rPTH(l-15)NH2(圖6B);[His5]hPTH(1-34)NH2(圖6C);hPTHrP(1-36)NH2(圖6D)。數(shù)據(jù)是3或5個實驗的平均值(±s.e.m.)，每個實驗一式兩份進行(表6)。圖7A和圖7B示出了類似物信號效力的劑量反應分析。在HKRK-B64細胞中評估了PTH和PTHrP配體剌激cAMP形成的能力(圖7A)。在有IBMX存在的情況下，在室溫下，用不同濃度的配體處理細胞30分鐘。在用hPTHR瞬時轉染的C0S-7細胞中評估了配體剌激肌醇磷酸(IP)生產(chǎn)的能力(圖7B)。在室溫下，用不同濃度的配體處理細胞30分鐘。使用的配體是[Nle8,21，Tyr34]rPTH(l-34)NH2;[His5，Nle8,21，Tyr34]rPTH(l-34)NH2;[Tyr36]hPTHrP(l-36)NH2以及[Ile5，Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2。數(shù)據(jù)是4個(圖7A)或5個(圖7B)實驗的平均值(±s.e.m.)，每個實驗一式兩份進行。EC5。和Emax值列在表6中并且在肽之間不是顯著不同的，除tf-PTH(l-34)和PTH(l-34)類似物的cAMPEC5。值之外(P=0.02)。圖8是示出了在大鼠細胞中的cAMP劑量反應的曲線圖。用hPTH(l-28)M^;Ala"12，Aib3，Gln10，Har11，Trp14，Arg19_hPTH(1-28)NH2;hPTH(1-34)NH2;或r(大鼠)PTH(1-34)NH2處理大鼠成骨細胞。通過放射免疫測定來量化所得到的細胞內(nèi)cAMP。EC50值列在圖下方。通過非線性回歸分析來獲得曲線擬合。圖9A-9D是示出了在用PTH類似物處理的小鼠中的體內(nèi)血槳cAMP水平的圖。以10至1，OOOnmol肽/kg體重的劑量水平對野生型小鼠皮下注射載體(0.9%NaCl/0.05%吐溫-20)、或包含PTH肽的載體，并在注射后的指定時間，從尾靜脈抽出血液，然后通過放射免疫測定來量化在所得的血漿中cAMP的量。每條曲線對應于限定濃度的肽，如圖例所指明的。以pmol/iil血漿對血漿cAMP濃度作圖。數(shù)據(jù)表明，在50nmol/kg下，Ala1'12,Aib3，Gln10，Har11，Trp14，Argl9-hPTH(l_28)NH2(Aib_50，圖9A)和hPTH(1-34)NH2((1-34)-50，圖9B)可以產(chǎn)生血漿cAMP濃度的可比較的增加，而1，OOOnmol/kg的hPTH(l_28)NH2需要達到相同的增加((1-28)-1000，圖9C，以及圖9D)。圖IOA和圖IOB是示出了在用PTH類似物處理的小鼠中的體內(nèi)血槳磷酸鹽和血清離子化鈣水平的曲線圖。對野生型小鼠皮下注射載體(0.9%NaCl/0.05%吐溫-20)、或包含Ala1'12,Aib3，Gln1Q，Har11，Trp14，Arg19_hPTH(1-28)NH2或hPTH(1-34)NH2的載體(劑量水平為50nmol/kg體重)，或hPTH(1-28)NH2(劑量水平為1，OOOnmol/kg體重)，然后在指定的時間，確定血漿磷酸鹽(圖10A)和血清離子化鈣(圖10B)的濃度。利用ChironDiagnosticsModel634Ca+7pH分析儀來確定血清離子化鈣濃度。圖A中的數(shù)據(jù)是一個實驗的平均值(士s.e.m.)，其中對于每種注射條件使用e只小鼠(n=6);在三個其它實驗中獲得了類似結果。圖B中的數(shù)據(jù)是兩個實驗的平均值(±8.6.!11.)，對于每種注射條件，使用3只小鼠(n=3)進行每個實驗。圖ll是示出了在負鼠(opossum)腎細胞中PTH(1-34)、PTHrP(1-36)以及長效PTH(l-28)類似物Ala1，12，Aib3，Gln10，Har11，Trp14，Arg19-hPTH(l_28)NH2的磷酸鹽攝取抑制的時間過程。對在每個時間點的數(shù)據(jù)作圖，作為在細胞裂解液中32P放射性的量的百分比，其中僅用載體處理細胞相同的時間；這些對照水平在5，864士338cpm(12h)至3，429士224cpm(0h)的范圍內(nèi)。數(shù)據(jù)是兩個實驗的平均值(±s.e.m.)，每個實驗一式兩份進行。圖12示出了在正常大鼠中PTHrP(l-36)和[I5]-PTHrP(1-36)的藥物動力學分布(pharmacokineticprofile)。通過放射免疫測定(RIA)測量了肽的血漿濃度。在PTHrP(l-36)中的His5—lie取代并沒有顯著改變藥物動力學分布(pharmokineticprofile)。圖13A-13C是示出了在正常大鼠中PTHrP(l-36)和[I5]-PTHrP(1-36)的影響的一組圖。圖13A示出了在正常大鼠中PTHrP(l-36)和[I5]-PTHrP(1-36)的瞬時血鈣作用(transientcalcemicaction)。在PTHrP(1-36)中His5—lie取代，其增加對于R°的親和力9倍(參見插表(Tableinset))，導致更長期的血鈣效應(calcemiceffect)。圖13B和圖13C示出了在用每種這些配體治療的細胞中延遲(60分鐘；圖13B)和最大(圖13C)cAMP反應。圖14A-14C是示出了Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(Mc=Ala1'3'12,Gln10，Arg11，Trp14，Arg19)在TPTX大鼠中的長期血f丐效應(圖14A)以及在ROS17/2.8細胞中的長期cAMP信號(圖14B和圖14C)的圖。圖14B和14C示出了在用hPTH(l-34)或Mc-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)治療的細胞中延遲(60分鐘；圖14B)和最大(圖14C)cAMP反應。插表示出了體外測量的類似物對R°和RG受體構象的結合親和力。圖15A和圖15B是示出了在正常大鼠中修飾PTH/PTHrP雜交體的瞬時血f丐作用的圖。對于Mc-PTH(1-11)/PTHrP(15-36)和Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)觀測到長期血f丐效應。插表示出了體外測量的類似物對R°和RG受體構象的結合親和力。圖16A-16C是示出了在正常大鼠中Mc-修飾PTH(l-34)類似物(具有或沒有l(wèi)ie5—His和Arg19—Glu取代)的血f丐作用(圖16A)以及在ROS17/2.8細胞中的延遲和最大cAMP反應(圖16B和圖16C)的圖。插表示出了體外測量的類似物對R°和RG受體構象的結合親和力。lie5—His和Arg19—Glu取代減小了對于R°的親和力，并且減少了體外cAMP信號的持續(xù)時間和體內(nèi)血f丐效應。圖17A-17C是示出了在正常大鼠中Mc-修飾PTH(l-34)/PTHrP(1-36)類似物(沒有l(wèi)le5—His和Arg19—Glu取代)的瞬時血鈣作用以及在ROS17/2.8細胞中的延遲cAMP和最大反應(圖17B和圖17C)的圖。插表示出了體外測量的類似物對RO和RG受體構象的結合親和力。lie5—His和Arg19—Glu取代降低了對于R°的親和力，并且減少了體外cAMP信號的持續(xù)時間和體內(nèi)血鈣效應。圖18A和18B是示出了在正常大鼠中(圖18A)以及在R0S17/2.8細胞中(圖18B)，E19，Mc-修飾PTH(1-34)類似物(具有或沒有Trp23—Ala取代)的血f丐和cAMP作用的圖。插表示出了體外測量的類似物對于R°和RG受體構象的結合親和力。Trp23—Ala取代降低了[E19，Mc]PTH(1-34)對W的結合親和力lO倍，減少了細胞中cAMP信號的持續(xù)時間，并且減小了該肽的體內(nèi)高血鈣效應(hypercalcemiceffect)。23圖19A和圖19B是示出了在表達人PTH1受體的細胞中天然PTH/PTHrP雜合類似物的cAMP信號的圖。該類似物在急性劑量反應測定中顯示出類似效力。圖20A和圖20B是示出了具有人PTH1受體的Mc-修飾PTH/PTHrP雜合類似物的cAMP信號的圖。該類似物在急性劑量反應測定中顯示出類似效力。圖21A和圖21B是示出了在R0S17/2.8細胞中hPTH(1-34)NH2、hPTH(1-28)NH2以及[A、Aib3，M]-PTH(l-28)NH2([A1.12，Aib3，Q1。，高精氨酸"，W14，R19]hPTH(l_28)NH2)的急性(圖21A)和延遲(圖21B)cAMP分析的圖。在圖21A中，在有IBMX存在的情況下用肽溫育細胞10分鐘，并測量cAMP。ECs。值分別為0.32、7.6、以及0.33nM。在圖21B中，用10—7M的hPTH(l-34)、[A1，Aib3，M]-PTH(l-28)、或10—6M的hPTH(1-28)處理細胞10分鐘，洗滌三次，在單獨的緩沖液中溫育指定時間，用IBMX處理最后5分鐘，然后測量cAMP。圖21B中的數(shù)據(jù)表示為對于每種配體觀測到的最大響應的百分比，其是通過在有IBMX存在的情況下用配體溫育細胞10分鐘(沒有配體洗出)而確定的。這些值分別為67±6、68±3、以及71士lpmol/孔。基底(載體)cAMP值是3.7士0.4pmol/孔。圖22A-22C是示出了利用用PTHR轉染的C0S-7細胞(圖22A和圖22C)，通過生物測定程序加以評估(用于讀出活性)的注射到小鼠中的PTH配體的藥代動力學分析(pharmacokineticanalysis)的圖。用pCDNAl載體轉染的C0S-7細胞用作對照(圖22B)。對小鼠注射載體、注射hPTH(l-34)(50nmol/kg)、hPTH(l-28)(1，000nmol/kg)、或[A、Aib3，M]-PTH(l-28)(50nmol/kg)，并在注射后的指定時間，從尾靜脈收集血液，在有EDTA和蛋白酶抑制劑存在的情況下制備血漿，將血漿稀釋50倍，然后將45iU的稀釋樣品施加于在96孔板中的COS細胞。然后，在15分鐘溫育以后，測量在COS細胞中的細胞內(nèi)cAMP。每個跡線(tracing)表示來自6只相同處理小鼠的數(shù)據(jù)(平均值+SE)。圖23是示出了在小鼠中血液離子化鈣的變化。示出的是在注射以后(連同圖22A-22C的研究一起進行研究)用hPTH(l-34)(50nmol/kg)、hPTH(1-28)(1，000nmol/kg)、或[A、AibM]-PTH(l-28)(50nmol/kg)治療的小鼠中血液離子化f丐(iCa++)的變化。相對于注射前從每只小鼠抽出的血液中的1&++，對數(shù)據(jù)進行歸一化。每條跡線示出了來自6只相同處理小鼠的數(shù)據(jù)(平均值+SE)。圖24A和圖24B是示出了在用PTH配體長期處理以后在小鼠中骨形成和骨吸收標記的變化的圖。示出的是在用hPTH(l-34)(50nmol/kg)、以及[A1，Aib3，]M-PTH(1-28)(50nmol/kg)處理的小鼠中骨形成標記骨鈣蛋白(圖24A)和骨吸收標記、膠原I型C端片段(CTX)(圖24B)的血清水平。利用MouseOsteocalcinEIA試劑盒(BiomedicalTechnologies)禾PRatLapsCTXELISA(NordicBioscience)試齊U盒領lJ量標記。每條跡線示出了來自6只相同處理小鼠的數(shù)據(jù)(平均值+SE)。圖25是示出了在HKRK-B7細胞中PTH/PTHrP雜合類似物對人PTH受體的cAMP信號效力的表格。圖26A是示出了PTH/PTHrP類似物與表達在C0S-7細胞膜上的人PTH受體的W和RG結合的競爭分析的表格。圖26B是示出了與圖26A相同的通過R°結合值加以分類的數(shù)據(jù)的表格。圖27A-27D是示出了PTHrP(l-28)的丙氨酸掃描和類型取代的圖。在腎小管LLCPK1-B64(圖27A)和ROS17/2.8(圖27B)細胞中，檢查了在PTHrP(1-28)的15-28區(qū)中丙氨酸取代對cAMP活性的影響。在位置18、22、25以及26處的丙氨酸取代會增加在至少一種細胞類型中的活性。這些位置被進一步取代成各種類型的氨基酸，并在LLCPK1-B64細胞(圖27C)或Sa0S-2細胞(圖27D)中分析cAMP活性。在室溫下、在有IBMX存在的情況下用3X10—9M的類似物處理細胞30分鐘。相對于對親代(天然)PTHrP(l-28)肽的反應，對于每種類似物的反應加以歸一化。圖28A和圖28B是示出了在PTHrP(l-28)腳手架中具有取代的肽的體外(圖28A)和體內(nèi)(圖28B)cAMP活性。在SaOS細胞中代表性的修飾PTHrP(1-28)類似物的cAMP活性的劑量反應曲線示在(圖28A)中。圖28B示出了體內(nèi)cAMP誘導，來自C57BL/6小鼠(3月齡，雄性)，其被靜脈內(nèi)注射有載體、PTHrP(1-36)、PTHrP(1-28)、A18'22,L25，K26(AALK)-PTHrP(1-28)或E18，A22，L25，K26(EALK)-PTHrP(1-28)(n=3)。注射后10分鐘，抽取血液，并通過RIA測量cAMP的血漿水平。圖29A和圖29B是示出了在小鼠中R°和RG選擇性PTH類似物對血漿cAMP和鈣的影響的圖。圖29A和圖29B示出了在小鼠(C57BL/6，雄性，3月齡)中的血漿cAMP濃度，其中上述小鼠被靜脈內(nèi)給予載體、rPTH(l-34)、M-PTH(l-34)(M=A1，Aib3，Q10，Har11，A12，W14，R19)、或E18，A22，L25，K26-(EALK)-PTHrP(1-30)(5nmol/kg;對于cAMP，n=7，對于f丐，n=4)。圖29B示出了在用相同肽處理的小鼠中的離子鈣水平。在該鈣實驗中，在注射前以及在注射后的1、2、4以及6小時抽取血液，并利用Ca+7pH分析儀測量離子化鈣。圖30A-30F是示出了在小鼠中PTH類似物對血漿骨標記的影響的圖。每日對小鼠(C57BL/6，雄性，3月齡)靜脈內(nèi)注射載體、rPTH(l-34)、M-PTH(1-34)、或(EALK)-PTHrP(l-30)(5nmol/kg;n=7組)14天。在第6天(分別為圖30A、圖30C、以及圖30E)和第13天(分別為圖30B、圖30D、以及圖30F)，通過ELISA評估了血液中骨轉換(boneturnover)(PINP、CTX以及骨f丐蛋白)的標記。圖31是一組示出了在小鼠中兩周每日W和RG配體處理對小梁和皮質(zhì)骨結構的影響的圖像。每日用載體、rPTH(l-34)、M-PTH(l-34)、或E化，A22，L25，K26(EALK)PTHrP(l-30)(5nmol/kg;n=7組)處理(i.v.)小鼠(C57BL/6，雄性，3月齡)14天，并通過yCT對股骨進行分析。圖32A和圖32B是示出了在MC3T3-E1細胞中在EALK-PTHrP(1-31)的29-31區(qū)(圖32A)和EALK-PTHrP(l-34)的29-33區(qū)(圖32B)中的氨基酸取代對cAMP活性的誘導的影響的圖。圖33是示出了在TPTX大鼠中從時間零至24小時PTH(l-34)禾PM-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(SP-PTH)的血f丐作用的圖。圖34是示出了在TPTX大鼠中在單次注射SP-PTH或PTH(l-34)以后0_6小時的尿鈣的圖。圖35是示出了在TPTX大鼠中PTH(1_34)和SP-PTH的低磷酸鹽血癥作用(hypophosphatemicaction)的圖。圖36是示出了在TPTX大鼠中在單次注射SP-PTH或PTH(l-34)以后0-6小時的尿磷的圖。圖37是示出了Mc-PTH(l-34)、[A1'3,A23，Q1。，R11]-hPTH(1—34)、[A1'3,A23]-hPTH(l-34)、以及[A18，A22，L25，K26]-PTHrP(1-28)的cAMP信號效力的劑量反應分析的25圖。為了比較，還示出了hPTH(l-34)和PTHrP(l-36)。評估了在HKRK-B7細胞中這些肽在人PTH1受體上剌激cAMP形成的能力。這些PTH類似物顯示可與hPTH(l-34)比較的cAMP信號。具體實施例方式我們已發(fā)現(xiàn)了下述之間的相關性(i)當未偶聯(lián)于G蛋白(1°狀態(tài))時，GPCR配體結合GPCR的能力，以及(ii)配體激活受體的時間長度。特別地，與PTH或PTHrP相比，配體體外與示例性的GPCR，PTH/PTHrP受體(PTHR)，未偶聯(lián)于G蛋白(R°形式)相互作用的增強能力與其施加體內(nèi)更長期活性的能力密切相關。反過來也是如此，即，對于GPCR的G蛋白偶聯(lián)形式(RG形式)具有選擇性的配體，與天然配體相比，具有活性的更短持續(xù)時間。該發(fā)現(xiàn)提供了用于確定化合物對于GPCR是否具有長效或短效體內(nèi)活性的新方式的基礎。在該基礎上，利用本文描述的方法，可以鑒定具有治療上期望性能的配體(例如，長效或短效配體)。本文描述了具有長效或短效活性的示例性配體。取決于待治療的疾病，長效或短效療法是期望的。利用注射在人類中的PTHrP(l-36)的最近研究表明，骨礦質(zhì)密度增加至與PTH(l-34)(用于骨質(zhì)疏松癥的標準療法)大約相同的程度，但沒有誘導骨吸收反應，而對于等效劑量的PTH(l-34)將預期是如此(Horwitzetal.，J.Endocrinol.Metab.88:569-575(2003))。來自該小組的相關石開究表明，差異不可能僅基于藥代動力學，因為急性安全性研究表明，可以以幾乎20倍高于PTH(l-34)的正常劑量的劑量給予PTHrP(1-36)，而沒有產(chǎn)生高血鈣效應(Horwitzetal.，Osteoporosislnt.17:225-230(2006))。雖然PTHrP(1-36)和PTH(1-34)均呈現(xiàn)與PTHR的RG形式的類似的受體結合，但我們的發(fā)現(xiàn)，即PTHrP較少有力地結合于PTHR的R°形式并相應地呈現(xiàn)較少長期的體內(nèi)活性(與PTH相比)，可以解釋該差異。因此，我們認為，PTHR的RG選擇性配體(即，具有相對較低W親和力)將證明可用于治療骨質(zhì)疏松癥。在其他情況下，更長效配體可以是期望的。例如，與PTH(l-34)相比，在剌激腎生產(chǎn)1，25，(0H)2維生素D方面，PTHrP是較少有效的(Horwitzetal.，J.BoneMineral.Res.20:1792-1803(2005))，這表明，PTH(1-34)可以更有效地治療其中期望長效PTHR信號的疾病。這樣的疾病包括由在鈣敏感受體中激活突變所引起的某些形式的甲狀旁腺功能減退。目前，治療這種疾病需要每日兩次注射PTH(1-34)(Wineretal.，J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220(2003))。通過利用本發(fā)明的篩選方法，使得可以鑒定更長效的PTHR配體，其可以證明高度有利于治療這樣的疾病并且可以允許較少頻繁地給予藥物。與PTHrP相比，PTH(1-34)，借助于其穩(wěn)定結合于R°的更大能力，能夠在目標骨(targetbone)和腎臟細胞中誘導累積性更大的信號反應，于是這種R°選擇性差異導致生物反應的趨異(divergence)，如在成骨細胞中誘導與剌激破骨細胞性骨吸收(osteoclasticboneresorption)有關的因子(RANK配體)，以及在腎近端小管細胞中剌激1-a_羥化酶mRNA合成。根據(jù)這些考慮因素，特別高選擇性結合于RG(相對于R°)PTHR構象的配體可以高度有效地剌激骨形成反應，因而可用于治療骨質(zhì)疏松癥。因此，兩種配體優(yōu)先穩(wěn)定不同的受體構象。在GPCR領域，目前存在許多關于用于給定受體的結構變化配體對于不同的受體構象呈現(xiàn)改變的選擇性并因而產(chǎn)生不同的生物效應的能力的討論(Kenakin，T.SciSTKE342:pe29(2006))。本文進行的動力學與平衡結26合測定的結果表明，盡管PTH(l-34)和PTHrP(l-36)以類似親和力結合于G蛋白偶聯(lián)PTHR構象，RG，但與PTHrP(l-36)相比，PTH(1_34)呈現(xiàn)出更大的能力來結合于G蛋白未偶聯(lián)構象，R其被定義為受體構象，該受體構象具有在存在GTPYS(5，14)的情況下以高親和力結合配體的能力。本文提供的延遲cAMP測定說明了，對于不同的PTHR構象的改變的選擇性可以導致在表達PTHR的細胞中改變的信號反應。因此，在表達PTHR的細胞中，PTH(l-34)和Ile5-PTHrP(l-36)誘導更長時期的、以及累積性更大的cAMP信號反應。PTH(1-34)和Ile5-PTHrP(l-36)(其還具有比PTHrP(1-36)更大的穩(wěn)定R°的能力)可以誘導更長時期的信號反應，這是由于LI^復合物最終偶聯(lián)于異三聚體G蛋白(LR°-LRG)以及相應信號級聯(lián)的激活。穩(wěn)定的LI^結合的另一個潛在的機制性后果是，它可以允許多次(催化)G蛋白激活，借此在G蛋白偶聯(lián)、激活以及釋放的連續(xù)循環(huán)以后保存LR°復合物(Rodbel，M.Adv.EnzymeRegul，37:427-435(1997);HeckandHofmann，J.Biol.Chem.276:10000-10009(2001))。當在常規(guī)劑量反應，在單時間點細胞中進行的cAMP和肌醇磷酸剌激反應，評估配體時，幾乎沒有檢測到效力差異，借助上述效力PTH(l-34)和PTHrP(l-36)配體剌激cAMP和肌醇磷酸反應(圖7)。這些結果與兩種配體經(jīng)由相同或類似機制與PTHR相互作用的觀點一致。因此時間延遲的cAMP測定鑒定先前未意識到的兩種配體的第二信使信號特性的差異，明顯的作為累計信號輸出隨時間的差異。雖然已知激動劑激活的PTHR會經(jīng)受脫敏過程，該脫敏過程涉及受體磷酸化、P-抑制蛋白補充、以及受體內(nèi)在化(Biselo，A.etal.，(2002);Tawfeeketal.，Mol.Endocrinol.(2002);Castroetal.，Endocrinology143:3854-3865(2002);Chauvinetal.，Mol.Endocrinol.16:2720-2732(2002))，但并不預期這樣的過程將對具有W構象的受體起作用，因為按照定義這些過程是功能無效的，至少就G蛋白偶聯(lián)而論。然而，不能排除這樣的可能性，即在圖5的我們的延遲cAMP測定中觀察到的效應在一定程度上涉及配體對這樣的受體脫敏機制的不同影響。通常，穩(wěn)定的LI^結合能力可以在表達低水平關聯(lián)(同源)異三聚體G蛋白(相對于目標受體)的靶細胞中促進或增加配體的信號潛力。它還可以促進偶聯(lián)于"第二"G蛋白，與第一G蛋白相比，該"第二"G蛋白很可能對于配體-受體復合物具有更低的親和力。對于PTHR，這可以涉及偶聯(lián)于Gaq/11、Ga^。、或Ga12/13，其每一種已顯示出響應于PTH(1_34)被PTHR激活。雖然PTHrP具有至少某些結合R°(圖3A-3D)和激活延遲的cAMP信號(圖5A和圖5B)的能力，但該結合小于PTH(l-34)的結合。確實，形成穩(wěn)定LR°復合物的某些能力可以是B類GPCR的內(nèi)在屬性，因為其中的許多種，包括用于降鈣素的受體(Hiltonetal.，J.Endocrinol.166:213-226(2002))、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(corticortropin-releasinghormone)(Hoareetal.，P印tides24:1881-1897(2003))以及胰高血糖素(Postetal.，J.Biol.Chem.267:25776-25785(1992))已顯示出在有非水解鳥嘌呤核苷酸類似物存在的情況下可以與它們的關聯(lián)肽配體形成穩(wěn)定的復合物。本文描述的發(fā)現(xiàn)還可以涉及這樣的機制，借此PTH和PTHrP在正常生理機能中發(fā)揮作用。PTH，作為一種內(nèi)分泌激素，作用于遠離它的分泌部位(甲狀旁腺)的靶細胞(在骨和腎臟中)。在血清中PTH的濃度，雖然當&++水平波動時會輕微地變化，但通常在低皮摩爾范圍內(nèi)，遠低于PTH結合于其受體的親和力。PTH穩(wěn)定地結合于受體(甚至在未偶聯(lián)的W構象中)的能力可以是一種進化適應，其有助于確保對甚至配體濃度的最小增加的反應。相反，PTHrP，作為一種旁分泌因子，作用于相同組織內(nèi)的細胞(其中它被產(chǎn)生)(例如，發(fā)展長骨的生長板軟骨細胞)。在這樣的組織中PTHrP的濃度還未被直接量化，但它們似乎形成穿過正分化細胞的區(qū)域的梯度并且在生產(chǎn)部位附近較高(Chenetal.，J.BoneMiner.Res.21:113-123(2006))?？赡艿氖?，作為適應于其在控制分化事件(其發(fā)生在這些細胞中)中的作用，PTHrP演化成僅瞬時結合于受體，使得誘導相對較短壽命的、并且更容易定時的信號反應。G蛋白偶聯(lián)受體本發(fā)明可以使用任何G蛋白偶聯(lián)受體。長效和短效配體可以如本文描述的加以測定并鑒定有用的治療候選物。數(shù)百種這樣的受體在本領域是已知的；參見，例如，F(xiàn)redrikssonetal.，Mol.Pharmacol.63:1256-1272，2003，其以引用方式結合于本文?；谛蛄型葱院凸δ?，該參考文獻已表征了人GPCR。人GPCR可以分為5類促胰液素(胰泌素)、視紫紅質(zhì)、谷氨酸鹽(或酯)、frizzled/Tas2、以及黏附素(adhesion)。可替換地，受體可以按照它們的配體加以分類，例如，肽激素或小分子(例如，生物胺)。其它分類方案包括A-F分類，其中A類表示與視紫紅質(zhì)和腎上腺素能受體有關的受體，B類是與降鈣素和甲狀旁腺激素受體有關的受體，C類是與代謝性受體有關的受體，以及D-F類表示在真菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的受體。利用Fredriksson分類，促胰液素受體具有4個主要亞組CRHR/CALCRL、PTHR、GLPRs/GCGR/GIPR以及包括促胰液素和4種其它受體的亞組。促胰液素受體包括PTHR、以及降鈣素受體(CALCR)、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素受體(CRHR)、胰高血糖素受體(GCGR)、腸抑胃肽受體(gastricinhibitorypolyp印tiderec印tor)(GIPR)、胰高血糖素樣肽受體(GLPR)、生長激素釋放激素受體(GHRHR)、垂體腺苷酰(基)環(huán)化酶激活蛋白(PACAP)、促胰液素受體(SCTR)、以及血管活性腸肽受體(VIPR)。粘附受體(adhesionrec印tors)的特點在于(feature)GPCR樣跨膜-跨越區(qū)，該區(qū)與一個或多個功能域融合在一起，其中功能域在N端具有粘附樣基序，如EGF樣重復單位、粘蛋白樣區(qū)、以及保守的半胱氨酸富集基序。該家族的成員包括CELSR(EGFLAG七通G型受體)、大腦特異性血管生成抑制受體(BAI)j丐非依賴a蛛毒素(lectomedin)受體(LEC)以及包含(EMR)的EGF樣組件。其它受體包括CD97抗原受體(CD97)以及EGF-TMVII-蜘蛛毒素親和蛋白-相關(latrophi1in-related)(ETL)。這些受體還包括HE6(TMVIILN2)和GPR56(TMVIIXN1或TMVIILN4)以及最近發(fā)現(xiàn)的一組受體，與GPR56和HE6有關，稱作GPR97和GPR110至GPR116。谷氨酸鹽受體由8種代謝型谷氨酸鹽受體(GRM)，兩種GABA受體(例如，GAB-AbRl，其具有兩種剪接變異體，a和b，以及GAB_AbR2)，單f丐敏感受體(CASR)，以及被認為是味覺受體(TAS1)的5種受體組成。其它GPCR包括阿片樣受體、毒蕈堿性(muscarinic)受體、多巴胺受體、腎上腺素能受體、cAMP受體、視蛋白受體、血管緊張素受體、血清素受體、促甲狀腺素受體、促性腺素受體、K物質(zhì)受體、P物質(zhì)受體和R物質(zhì)受體、褪黑激素(melanocortin)受體、代謝型谷氨酸鹽受體。最大組是視紫紅質(zhì)受體家族，其包括至少701種人受體，其中241種是非嗅受體。該組中的受體包括各種乙酰膽堿(毒蕈堿性)受體、腎上腺素能受體、多巴胺受體、組胺受28體、血清素受體、以及章魚胺受體；肽受體，例如，血管緊張素受體、鈴蟾肽受體、舒緩激肽受體、內(nèi)皮素受體、白介素8受體、趨化因子受體、褪黑激素受體、神經(jīng)肽Y受體、神經(jīng)降壓肽(neurotensin)受體、阿片樣受體、促生長素抑制素受體、速激肽受體、凝血酶受體、加壓素受體、甘丙肽(galanin)受體、蛋白酶激活受體、增食因子(orexin)受體、以及趨化激素/趨化因子受體；蛋白質(zhì)激素受體，例如，F(xiàn)SH受體、黃體生成素(促黃體素，lutropin)-絨毛膜促性腺激素受體、以及促甲狀腺素受體；視紫紅質(zhì)受體；嗅受體；前列腺素類受體；核苷酸樣受體，包括腺苷和嘌呤受體；大麻受體；血小板活化因子受體；促性腺素釋放激素受體；褪黑激素受體、溶鞘脂(lysosphingolipid)和LPA(EDG)受體、以及各種孤兒受體。候選化合物在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何類型或來源的化合物。例如，天然存在的化學物質(zhì)(例如，來自化學庫)、肽、修飾肽激素、抗體、納米體(nanobodies)、嵌合肽、以及內(nèi)源性配體(例如，肽配體)的片段均可以用于本發(fā)明。涉及隨機篩選的方式，如化合物的天然文庫、或設計的配體(例如，基于PTH序列的配體)，可以用于本發(fā)明的篩選方法中。在一些實施方式中，相對于GPCR或GPRC的配體結合片段，利用本領域已知的方法可以產(chǎn)生抗體或納米體。修飾受體激動劑用于鑒定新受體激動劑的一種策略是修飾現(xiàn)有的激動劑。可以通過點突變、截短、插入、以及嵌合肽的產(chǎn)生來修飾肽激素。利用PTH受體，例如，許多修飾PTH和PTHrP序列在本領域是已知的?？梢砸灾亟M或合成方式來制備肽，如本領域已知的。參見，例如，美國專利第7，057，012、7，022，815、6，417，333、6，495，662號，其以引用方式結合于本文，其描述了各種PTH序列、以及本文描述的任何PTH序列。這些序列可以包括嵌合肽。在一個具體實施例中，可以將任何激動劑融合于抗體或抗體片段(如Fc片段)以產(chǎn)生候選治療藥物(therapeutic)?？贵w和納米體(nanobodies)結合GPCR的抗體或納米體還可以用于本發(fā)明的方法中并且可以相對于GPCR或其片段(例如，GPCR的配體結合部分)來產(chǎn)生，其中利用本領域已知的任何方法。在一個實施例中，利用純化蛋白，可以在新西蘭白兔中產(chǎn)生針對GPCR或其片段的IgG。初次免疫方案(initialimmunizationprotocol)包括最初肌內(nèi)注射10-20yg純化蛋白，接著在21天以后加強免疫。如果檢測不到或檢測到很少抗體，則可以使用另外的加強(boost)和/或添加佐劑?？梢酝ㄟ^ELISA來量化抗體，其類似于(Siberetal.，J.Infect.Dis.152:954-964，1985;Warrenetal.，J.Infect.Dis.163:1256-1266，1991)中所描述的。IgG可以純化自兔抗血清，例如，通過在50%硫酸銨中進行沉淀，接著在G蛋白瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)上進行親和層析?？梢岳秒s交瘤技術來產(chǎn)生GPCR的單克隆抗體?？梢酝ㄟ^對產(chǎn)生納米體的動物(例如，駱駝或美洲駝)進行免疫來產(chǎn)生納米體，然后可以利用標準技術對其加以純化。如本文描述的對這些抗體或納米體進行篩選，以獲得產(chǎn)生長期或短期效應的激動性分子(agonisticmolecules)。測試化合物和提取物通常，按照本領域已知的方法，從天然產(chǎn)物或合成(或半合成)提取物的較大文庫或化學品文庫鑒定能夠結合GPCR(例如，PTHR)的化合物。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領域的技術人員將明了，測試提取物或化合物的確切來源對于本發(fā)明的篩選程序來說并不是關鍵的。因此，實質(zhì)上，利用本文描述的方法可以篩選任何數(shù)目的化學提取物或化合物。這樣的提取物或化合物的實例包括但不限于基于植物、真菌、原核或動物的提取物、發(fā)酵液體培養(yǎng)基、和合成化合物、以及現(xiàn)有化合物的修飾。還可以獲得許多方法來隨機或定向合成(例如，半合成或全合成)任何數(shù)目的化合物，其包括但不限于基于糖、脂質(zhì)、肽、以及多核苷酸的化合物。可商業(yè)上獲得合成化合物庫?？商鎿Q地，可商業(yè)上獲得具有細菌、真菌、植物、以及動物提取物的形式的天然化合物庫。此外，如果需要的話，按照本領域已知的方法，可以產(chǎn)生天然和合成產(chǎn)生的庫，例如，通過標準提取和分餾方法(fractionationmethods)。另外，如果需要的話，利用標準的化學、物理、或生化方法，可以容易地修飾任何庫或化合物。此外，藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領域的技術人員容易明了，應盡可能采用這樣的方法，其用于去重復(der印lication)(例如，分類去重復、生物去重復、以及化學去重復、或它們的任何組合)或消除已知在治療代謝紊亂中具有活性的物質(zhì)的復制或重復。當發(fā)現(xiàn)粗提取物結合RG狀態(tài)的GPCR時，或當受體處于其R°狀態(tài)時，與內(nèi)源性配體相比，呈現(xiàn)改變的結合(例如，更高親和力或更低親和力)時，則需要進一步分餾陽性前導提取物(leadextract)以分離負責觀測到的效應的化學成分。因此，提取、分餾、以及純化過程的目的是表征和鑒定粗提取物中的化學實體，該化學實體具有可以用于治療代謝紊亂(例如，糖尿病和肥胖癥)的活性。分餾和純化這樣的異質(zhì)提取物的方法在領域是已知的。如果需要的話，按照本領域已知的方法，可以對可用于本發(fā)明的篩選方法的藥劑的化合物加以化學修飾。這樣的測試化合物包括天然存在的化合物或合成化合物(包括小分子)以及氨基酸或核酸適體(aptamer)。任何這些化合物可以包括合成或修飾的氨基酸或核酸。使受體與候選化合物接觸在本發(fā)明的篩選方法中，使候選化合物與GPCR接觸。受體可以存在于細胞上(例如，在生物中)、或存在于膜標本(membran印r印aration)中?？商鎿Q地，可以以功能形式來分離受體(Shimadaetal.，J.Biol.Chem.277:31，774-31780，2002)。在本發(fā)明的方法中可以使用這樣的細胞，其自然表達感興趣的GPCR(例如，PTHR)或重組表達受體?？商鎿Q地或另外，細胞可以被轉染(例如，利用本領域已知的任何方法)以表達編碼GPCR的重組基因。還可以例如從Millipore(ChemiScreenTM細胞系)商業(yè)上獲得表達特定GPCR的細胞。在其它實施方式中，受體存在于膜標本(例如，無細胞)中，其包含感興趣的GPCR。這樣的標本(pr印aration)可商業(yè)上獲得；參見，例如，可獲自Millipore的ChemiSCREEN受體標本。還可以利用本領域已知的方法來制備膜標本(參見，例如，Millsetal.，J.Biol.Chem.263:13-16，1988)。如果采用經(jīng)純化的受體成分，則體外使候選化合物與受體或受體復合物接觸。測定讀數(shù)(assayreadout)-測量配體結合或活性在本發(fā)明的方法中可以使用用于分析配體結合或配體活性的任何方法；特定讀數(shù)并不是關鍵的。在一些實施方式中，結合于GPCR的配體通過用非標記化合物替換放射性標記配體并在用非標記化合物進行處理前后測量細胞或膜標本的放射性而測量。通常，該方式涉及溫育膜和放射性配體以便于復合物形成。可以通過添加過量的未標記化合物來引發(fā)解離階段。在添加前(t=O)，以及在其后的連續(xù)時間點，可以抽出等分部分并立即通過真空過濾加以處理。在預溫育和解離階段，在包含未標記化合物的平行反應管中確定非特異性結合。在每個時間點的特異性結合的放射性可以計算為在t=0時的放射性特異性地結合的百分比。這樣的解離方法非常適合于大規(guī)模篩選(例如，候選化合物庫)。如在以下實施例1中描述的，其它方法如FRET也可以用來測量結合于受體的配體。在一種應用中，將兩個熒光分子共軛(conjugated)于受體，使得配體結合導致受體的構象變化，其可以通過FRET信號的變化加以檢測。FRET便于配體結合的實時測量，因而可用于本發(fā)明的測定。其它讀數(shù)包括cAMP活性的測量結果，其包括本文描述的延遲cAMP活性測定，該測定間接測量化合物與受體的RG形式的結合?？梢岳梅派涿庖邷y定來測量細胞內(nèi)cAMP水平，例如，如Shimizuetal.(J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001))所描述的。簡單地說，這種方法包括用候選化合物處理，用O.5ml的結合緩沖液(50mMTris-HCl、100mMNaCl、5mMKCl、2mMCaCl2、5X熱滅活馬血清、0.5%胎牛血清，用HC1調(diào)節(jié)至pH7.7)沖洗，以及用200ii1的cAMP測定緩沖液(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，其包含2mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、lmg/ml牛血清白蛋白、35mMH印es-Na0H，pH7.4)和100y1的結合緩沖液(包含不同量的候選化合物)(最終容積=300iU)加以處理。然后可以在室溫下溫育30-60分鐘以后除去培養(yǎng)基。然后可以凍結細胞，用0.5ml的50mMHCl溶解，并再冷凍(在-8(TC下)?？梢酝ㄟ^放射免疫測定來確定稀釋裂解液的cAMP含量?？梢岳梅蔷€性回歸來計算EC5。響應值。影響GPCR活性的任何適宜的生理變化可以用來評估測試化合物對GPCR活性的影響。當利用完整細胞或動物來確定功能結果時，還可以測量各種效應如遞質(zhì)釋放，激素釋放，已知和未表征遺傳標記(例如，northern印跡)的轉錄的變化，細胞代謝的變化如細胞生長或PH變化，以及細胞內(nèi)第二信使如Ca++、IP^或cAMP的變化。在一種實施方式中，可以利用免疫測定來測量細胞內(nèi)cAMP的變化。在OffermannsandSimon，J.Biol.Chem.270:15175-15180(1995)中描述的方法可以用來確定cAMP的水平。還可以使用用于測量cAMP的測定試劑盒，如在美國專利第4，115，538號中所描述的，將其以引用方式結合于本文?？梢允褂玫钠渌鼫y定包括體內(nèi)測量血清/尿鈣、磷酸鹽、以及骨周轉(bone-turnover)的標記(例如，脫氧膠原吡啶交聯(lián)(deoxypridonolinecrosslinks))的變化，在尿中血清相互變化的減少。測量W或RG結合本發(fā)明的方法涉及測量候選化合物與GPCR(例如，PTHR)的RG或R°形式的結合。因此，可以區(qū)分化合物對于受體的每種形式的親和力之間的測定讀數(shù)。一種可能的方式是使用其中有利于一種受體構象的系統(tǒng)或條件。例如，通過GPCR強制解離自它的G蛋白、或利用缺乏G蛋白的系統(tǒng)，可以有利于R°?？梢詫崿F(xiàn)GPCR解離自G蛋白的一種方式是通過用防止G蛋白結合于它的GPCR的化合物加以處理。這樣的化合物包括核苷酸類似物如非水解的核苷酸類似物(包括GTPyS)。gtpys結合g蛋白，但因為它不能水解該化合物，所以G蛋白本身不能本身反向循環(huán)至GPCR。因此，通過在添加候選化合物以前使細胞或細胞膜與GTPyS接觸，可以產(chǎn)生其中高度有利于GPCR的R°狀態(tài)的系統(tǒng)。為了穩(wěn)定GPCR的RG形式，可以使用顯性負G蛋白。這些蛋白以穩(wěn)定方式結合31GPCR，因而富集RG構象。用來調(diào)節(jié)R°與RG之間的比率的其它方式包括利用來自動物的細胞，其中一種或多種G蛋白的表達已被負調(diào)節(jié)或消除?；蚯贸夹g在本領域是眾所周知的并且可以用來耙向特定的G蛋白(參見，例如，Deanetal.，Mol.Endocrinol.20:931-943(2006))。在其它實施方式中，RNAi技術(例如，將siRNA給予細胞)可以用來"擊倒(降低)"G蛋白的表達，從而有利于受體的『狀態(tài)?？商鎿Q地，可以通過過度表達適當?shù)腉蛋白或細胞中的G蛋白來有利于RG形式。用于測量化合物結合R°或RG狀態(tài)的能力的第二種方式涉及替換已知對特定狀態(tài)具有選擇性的配體。在PTH受體的情況下，先前的工作已表明，^I-[AibU，M]PTH(l-15)對于RG狀態(tài)是選擇性的。通過測量這樣的配體的候選化合物的配體替換，可以特異性地測量化合物與該狀態(tài)的結合，即使受體在測定中以RG和R°狀態(tài)存在。在本發(fā)明的方法中鑒定的化合物通常結合于受體的RG形式，其中對于長效或短效激動劑具有至少5%(例如，至少10%、20%、50%、100%、500%、1000%、10，000%)的內(nèi)源性受體的活性。例如，人PTH以約0.13nmol的EC50結合人PTHR。因此期望的化合物通常以這種親和力的至少10X結合hPTHR，即，至少1.3nmolEC50。利用本發(fā)明的方法鑒定的配體利用本文描述的篩選方法，我們已鑒定了各種配體，用于示例性的GPCR，PTH受體，其表示任何類型的肽的不同組合(PTH/PTHrP雜合體)，其選擇是基于它們對短效配體或長效配體的相對R7RG選擇性(圖26A和圖26B)?；谖覀兊暮Y選測定的結果，然后我們測試了這些肽的體外和體內(nèi)活性，以說明在確定配體的生物活性中R7RG選擇性的重要性的概念。鑒定的肽說明了，對于PTH受體和其它GPCR來說，R°/RG選擇性確定了體內(nèi)生物作用。這些肽包括5種不同的類型。第一類的典型代表是Ile5-PTHrP，一種類似物，其將PTHrP轉化成具有高R°選擇性和長期作用的形式。第二類包括具有高R7RG選擇性的雜合妝，其由與PTHrP(12-36)結合的MPTH(l-ll)或與PTHrP(15-36)結合的MPTH(1-14)組成。這些肽具有很長時間的體內(nèi)生物活性。第三類是[HisS，Arg，PTH，其顯示更短期的生物活性，這是由于其降低的R°親和力。第四類化合物的典型代表是Ala1，Aib3-M-PTH(l-28)，其具有有力的R°激活活性、以及引人注目的活性，以促進尿磷酸鹽排泄，一種在治療與高磷酸鹽保留有關的疾病中期望的性能。第五類的典型代表是A1尸-PTH，其具有更低的W親和力，因而更期望用于治療骨質(zhì)疏松癥。對于PTH受體配體，我們已鑒定了具有各種R°和RG結合親和力和不同R°/RG選擇性的配體。按照W親和力加以分類的示例性的肽示在圖26B中。對于受體的『形式的親和力可以是至少2000、1000、750、500、250、150、100、90、75、50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.2、0.1、或0.05nmo1。對于受體的RG形式的親和力可以是至少100、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.75、1.5、0.125、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.025nmol。R°/RG的選擇性可以是(其中更高的值表示更大的RG選擇性)至少0.5、1、2、3、4、5、8、10、15、20、25、30、40、50、60、75、100、150、200、250、400、500、750、1000、1250、1500、2000、2500、或5000。本發(fā)明的配體可以具有本文描述的任何RG或R°親和力、或它們的任何組合。32RG和R°選擇性配體利用本文描述的篩選方法，我們已開發(fā)了新的RG選擇性和W選擇性配體。在一個實施例中，我們使用了PTHrP(l-28)作為起點，因為與PTH相比，PTHrP以更大的選擇性結合于RG受體構象。表2總結了特定類似物的體外活性；另外的類似物示于表3中。在以下實施例3中描述了關于這些類似物的更詳細的信息。這些類似物，A(E)18、A22、(L25)、K26-PTHrP(l-28)或(1_30)，通常呈現(xiàn)對于cAMP產(chǎn)生的增強的效力，以及與PTHrP(l_36)相比以相對高選擇性結合于RG構象(表2)。表2.代表性PTHrP類似物的體外活性類似物SaOScAMPEC50(nM)MC3T3-E1cAMPEC50(nM)RG結合親和力hFTHRIC50(nM)_R°結合親和力hPTHRIC50(nM)_RO/RG選擇性PTHrP(l-36)PTHrP(l-28)A18，22，K26-PTHrP(l-28)E18，A22，K26隱PTHrP(l-28)A18，22，L25，K26-PTHrP(l-28)E18，A22，L25，K26-PTHrP(l-28)A18，22，L25，K26-PTHrP(l-30)E18，A22，L25，K26-PTHrP('l-30)0.19020.30.0240.2410.0020.0100.0080.0630.3224.090.0910.2510.0540.0830.0670.0590.330.660,100.240.040.100.050.0874.820449181592373101741144945229310691807938327697118317302511169另外的肽和這樣的肽的結合/活性數(shù)據(jù)示于下面的表3中,表3:PTHrP類似物的結合/活性序列(親代，以粗體示出)篩選cAMP人PIR人PIR(%RG(%R0(%親代)'親代)2親代)2劑重M在SaOS在人PIR人P1R大鼠大鼠中的MC3T3-R^!RPIRPIRcAMPEl中的fTrsf)nrf《nRGR0(EC50，cAMP(E:、(=(IC50(IC50nM)C50,nM)',nM)nM)nM)PTHrP(1-28)NHA18-PTHrP(1-28)NHS18-PTHrP(l-28)NHM18-PTHrP(l-28)NHF18-PTHrP(l-28)NHE18-PTHrP(l-28)NHA22-PTHrP(l-28)NH16412111310914018533S22-PTHrP(l-28)NHL22-PTHrP(l-28)NHN22扁PTHrP(l-28)NHW22-PTHrP(l-28)NHE22-PTHrP(l-28)NHK22-PTHrP(l-28)NHA26-PTHrP(l-28)NHS26-PTHrP(1-28)NHN26-PTHrP(l-28)NHK26-PTHrP(1-28)NHR26-PTHrP(l-28)NHL25-PTHrP(l-28)NHW25-PTHrP(l-28)NHiK25-PTHrP(1陽28)NHR25-PTHrP(l-28)NHA18,22,26-PTHrP(l-28)NHA18,22,K26-PTHrP(1-28)NHA18,26，S22-PTHrP(1-28)NHA18，S22，K26-PTHrP(卜28)NHA18,26,N22-PTHrP(1-28)NHA18,N22,K26-PTHrP(l-28)NHA18,26,L22-PTHrP(卜28)NHA18，L22，K26-PTHrP(l-28)NHA18，26，W22-PTHrP(卜28)NHA18,W22,K26-PTHrP(l-28)NHE18,A22，K26-PTHrP(l-28)NHE18,S22，A26-PTHrP(l-28)NHE18，N22,A26-PTHrP(l-28)NH14114213812912115014210711314214332527016320434316716040519317822914813337217515526516113632617213925216313335017716018812012626711513630114568.811913231.917114053.70.0240.0910.1018150.0380.2410.2510.24923734<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>A18,22,L25,K26-PTHrP(l-31)NHE18，A22，L25，K26-PTHrP(l-31)NHE18，A22，L25，K26-PTHrP(l鄰OHE18,A22,L25,K26,G29隱PTHrP(l-31)OHE18，A22,L25,K26，529-PTHrP(l-31)OHE18,A22,L25，K26,N29-PTHrP(l-31)OHE18，A22，L25,K26,(J29-PTHrP(l-31)OHE18,A22,L25,K26,W29-PTHrP(l-31)OHE18,A22山25,K26，E29-PTHrP(l-31)OHE18,A22,L25,K26,K29-PTHrP(l-31)OHE18,A22,L25，K26,G30-PTHrP(l-31)OHE18，A22,L25，K26,530-PTHrP(l-3)OHE18，A22，L25，K26，L30-PTHrP(l-31)OHE18，A22山25，K26,N30-PTHrP(l-31)OHE18,A22，L25，K26,D30-PTHrP(l-31)OHE18，A22,L25，K26，K30-PTHrP(l-31)OHE18，A22，L25,K26,531-PTHrP(1-31)OHE18,A22,L25,K26，L31-PTHrP(l-31)OHE18，A22，L25，K26，V31-PTHrP(l-31)OH100206209210226142100227286331185189251245'991981810.200.1120.780.410.590.280.120.320.200.2536<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>我們還生產(chǎn)了肽A2。，Mc-PTH(1-34)0H、F23，Mc-PTH(1-34)0H、[A1，A3，A23，Q10，R11]-PTH(1-34)0H、[A1，A3，A23]-PTH(1-34)0H、以及E18，A22，L25，K26_PTHrP(1-30)。這些肽與人PTH1受體的R°和RG結合示于以下表4中。表4.示例性肽的RG和R°結合<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>Mc=Al，3，12，Q10，Rll，W14，R19多肽修飾本文描述的任何多肽可以包含一個或多個修飾如N端或C端修飾。修飾包括乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol)的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、Y-羧化、糖基化、GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、十四烷酰化、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒基化(selenoylation)、硫酸鹽化、轉移RNA介導添加氨基酸到蛋白質(zhì)如精氨?；?aiginylation)、以及遍在蛋白化。參見，例如，Proteins-StructureandMolecularProperties,2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany,NewYork,1993andWold，F(xiàn).，PosttranslationalProteinModifications-PerspectivesandProspects,pgs.1_12inPosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson,Ed.，AcademicPress,NewYork,1983;Seifteretal，MethodsEnzymol182:626646(1990)andRattanetal，A皿NYAcadSci663A&62(1992)。本發(fā)明的任何多肽可以進一步包括異源序列(融合的蛋白伙伴(伙伴，partner))，因而形成融合蛋白。融合蛋白可以包括融合的蛋白伙伴如純化或檢測標記，例如，可以直接或間接檢測的蛋白質(zhì)(如綠色熒光蛋白、血凝素、或堿性磷酸酶)，DNA結合域(例如，GAL4或LexA)，基因激活域(例如，GAL4或VP16)，純化標記，或分泌信號肽(例如，前胰蛋白酶(pr印rotyrypsin)信號序列)。在其它實施方式中，融合的蛋白伙伴可以是標記，如c-myc、聚組氨酸、或FLAG。每種融合的蛋白伙伴可以包含一個或多個域，例如，前胰蛋白酶(pr印rotrypsin)信號序列和FLAG標記。在其它情況下，融合的蛋白伙伴是Fc蛋白(例如，小鼠Fc或人Fc)。治療疾病的方法可以用本文描述的任何肽來治療與PTH功能不良、或鈣或磷酸鹽失衡有關的任何疾病，其中上述肽包括圖26A和圖26B中的那些肽、表1中的那些肽、或利用本發(fā)明的方法鑒定的那些肽。這些肽可以用來治療骨質(zhì)疏松癥、骨折修復、骨軟化、關節(jié)炎、血小板減少、甲狀旁腺功能減退或高磷酸鹽血癥，或可以用來在受治療者中增加干細胞轉移。在本發(fā)明的治療方法中可以使用任何給予方式(例如，口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、眼、局部、皮膚、皮下、以及直腸)。醫(yī)師將確定對于待治療患者的適當?shù)膭┝?，其將部分取決于患者的尺寸、疾病或病癥的嚴重性、以及待治療的特定疾病或病癥。藥物組合物的劑型(formulation)本文描述的(例如，PTH-衍生肽)或利用本發(fā)明的方法鑒定的任何化合物的給予可以通過任何適宜方式進行，該方式導致可以治療受治療者的病情的化合物濃度?；衔锟梢砸匀魏芜m當?shù)牧堪谌魏芜m宜的載體物質(zhì)中，并且通常以按組合物總重量的重量計為1-95%的量存在?？梢砸詣┬托问教峁┙M合物。其中劑型適合于口服、腸外(例如，靜脈內(nèi)或肌內(nèi))、直腸、皮膚、鼻、陰道、吸入、皮膚貼劑)、眼、或顱內(nèi)給予途徑。因此，組合物可以具有例如以下形式片劑、安瓿劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液、凝膠(包括水凝膠)、糊劑、軟膏劑、乳膏劑、硬膏劑、獸用頓服藥、滲透遞送裝置、栓劑、灌腸劑、可注射物、植入物、噴霧劑、或氣霧劑?？梢园凑諅鹘y(tǒng)醫(yī)藥實踐來配制藥物組合物(參見，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thedition，2000，ed.A.R.Ge皿aro，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia,以及EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology,eds.J.SwarbrickandJ.C.Boylan，1988-1999，MarcelDekker，NewYork)?？梢耘渲扑幬锝M合物以在給予以后立即或在給予以后的任何預定時間或時期釋放活性化合物。后者類型的組合物通常稱作控釋劑型(formulations)，其包括(i)在體內(nèi)并在較長時期內(nèi)產(chǎn)生基本上恒定濃度的本發(fā)明的藥劑的劑型；(ii)在體內(nèi)并在較長時期內(nèi)在預定滯后時間以后產(chǎn)生基本上恒定濃度的本發(fā)明的藥劑的劑型；(iii)在預定時期維持藥劑作用的劑型，其中通過保持體內(nèi)相對恒定、有效水平的藥劑并伴隨最小化與藥劑的血漿水平的波動有關的不期望的副作用(鋸齒動力學模式)。(iv)使藥劑的作用局部化的劑型，例如，相鄰于或在患病組織或器官中空間布置控釋組合物；(v)實現(xiàn)方便劑量給藥的劑型，例如，每周給予組合物一次或每兩周一次；以及(vi)標靶藥劑作用的劑型，其中通過利用載體或化學衍生物來將化合物遞送到特定靶細胞類型。對于在胃腸道具有窄吸收窗或相對較短生物半衰期的化合物來說，特別優(yōu)選以控釋劑型的形式來給予化合物。可以致力于許多策略中的任一種以便獲得控釋，其中釋放率大于所考慮化合物的代謝率。在一個實施例中，控釋通過適當選擇各種配制參數(shù)和組分，包括，例如，各種類型的控釋組合物和涂層來獲得。因此，用適當?shù)馁x形劑將化合物配制成藥物組合物，在給予以后，其以受控方式釋放化合物。實例包括單或多單位片劑或膠囊劑組合物、油溶液、混懸劑、乳劑、微膠囊、分子復合物、微球、納米顆粒、貼劑、以及脂質(zhì)體。腸外組合物可以以劑型、配方(制劑，formulations)形式，通過注射、輸注、或植入(皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)等)腸外給予，或借助于適宜的遞送裝置或植入物(包含常規(guī)、非毒性藥用載體和佐劑)來給予包含本文描述的或利用本發(fā)明的方法鑒定的化合物的組合物。這樣的組合物的配方和制劑(pr印aration)是藥物劑型(pharmaceuticalformulation)領域的技術人員眾所周知的。用于腸外應用的組合物可以以單位劑型(例如，在單劑量安瓿中)提供，或提供在包含多個劑量的小瓶中，并且其中可以添加適宜的防腐劑(參見下文)。組合物可以具有以下形式溶液、懸浮液、乳濁液、輸注裝置、或用于植入的遞送裝置，或它可以作為干粉提供以在使用前用水或另一種適宜載體加以重組。除了活性劑以外，組合物還可以包括適宜的腸外用載體和/或賦形劑。可以將活性劑加入用于控釋的微球、微膠囊、納米顆粒、脂質(zhì)體等中。此外，組合物可以包括懸浮劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、滲透性(張性)調(diào)節(jié)劑、和/或分散劑。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以具有適合于無菌注射的形式。為了制備這樣的組合物，將適宜的活性劑溶解或懸浮在腸外用液體載體中。在可以采用的可接受的載體和溶劑中有水、通過添加適量鹽酸、氫氧化鈉或適宜緩沖劑調(diào)節(jié)到適宜pH的水、1，3-丁二醇、林格氏液、葡萄糖溶液、以及等滲氯化鈉溶液。含水配方還可以包含一種或多種防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、或對羥基苯甲酸正丙酯)。在化合物之一僅微溶或略溶于水的情況下，可以添加溶解增強劑或增溶劑，或溶劑可以包括10-60%w/w的丙二醇等。以下實施例用來說明而不是限制本發(fā)明。實施例1短效和長效PTH肽的鑒定利用競爭性結合測定對配體的表征。為了鑒定PTHR配體，首先進行動力學解離實驗以檢查在PTH與PTHrP放射性配體類似物和人PTHR之間形成的復合物的穩(wěn)定性，其中人PTHR表達在由HKRK-B7細胞制備的膜中。對于每種放射性配體，在有和沒有GTPyS存在的情況下檢查解離，以評估來自異三聚體G蛋白的功能上未偶聯(lián)受體的影響(圖IA-IC)。對于125I-PTH(l-34)禾P125I-PTHrP(l-36)(分別為圖1A和圖IB)，在沒有和有GTPyS存在的情況下的解離數(shù)據(jù)(分別為實心和空心符號)，通過兩相衰減方程比通過單相方程被更好地擬合。對于^I-PTH(l-34)并在沒有GTPYS存在的情況下，17X的復合物是不穩(wěn)定的并且快速衰減(t1/2<1分鐘)，而剩余的83%則是穩(wěn)定的并且緩慢衰減(t1/2約4h)。在添加GTPyS以后，快速、不穩(wěn)定的成分增加到21%，使得77%的復合物仍然是穩(wěn)定的(^/2約2h)(圖lA)。關于^I-PTH(l-34)的這些發(fā)現(xiàn)緊密地與對該放射性配體進行的先前的解離研究一致，并且強調(diào)了PTH(l-34)以高親和力結合于G蛋白未偶聯(lián)PTHR構象(R°)的能力(Shimizuetal.，J.Biol.Chem.280:1797-807(2005);Deanetal.，Mol.Endocrinol.20:931-43(2006))。125I_PTHrP(1-36)和PTHR形成的復合物在沒有GTPyS存在的情況下再次是最穩(wěn)定的(68%衰減，其中t力為約3h)。相反，在添加GTPYS以后，大多數(shù)復合物變得不穩(wěn)定(72%衰減，其中t1/2為約1分鐘；圖IB)。通過添加GTPYS所誘導的125I-PTHrP(l-36)與PTHR的這種快速解離反映了，先前針對^I-[AibU，M]PTH(l-15)所觀測到的結果(Deanetal.，Mol.Endocrinol.20:931-43(2006));因而這些放射性配體的每一種似乎主要結合于G蛋白偶聯(lián)構象(RG)中的PTHR。于是鑒定了PTH(l-34)和PTHrP(1_36)的結構差異，其構成在上述解離研究中對于兩種配體所看到的功能差異的基礎。在PTH和PTHrP中位置5處的不同的殘基(分別為lie和His)已顯示出在確定親和力(Shimizuetal.，J.Biol.Chem.280:1797-807(2005);Gardellaetal.，J.Biol.Chem.270:6584-6588(1995))和亞型選擇性中(Gardellaetal.，J.Biol.Chem.271:19888_19893(1996);Beharetal.，Endocrinology137:4217-4224(1996))起重要作用，借此這些配體結合于受體。再次在沒有和有GTPyS存在的情況下，檢查了125I-Ile5-PTHrP(l-36)的受體解離性能。在有和沒有GTPyS存在的情況下，這種放射性配體均緩慢地解離自受體，并且，在每種情況下，具有單相動力學(t1/2>2h;圖1C)。因此，HisSlle取代顯著增強了穩(wěn)定性，借此PTHrP結合于PTHR，其處于G蛋白偶聯(lián)狀態(tài)，并且尤其處于G蛋白未偶聯(lián)狀態(tài)。GTPYS對平衡結合的影響。在沒有或存在不同濃度的GTPYS的情況下，通過用細胞膜溫育90分鐘，評估了在近似平衡條件下GTPyS對這些放射性配體與PTHR的結合的影響。125I-PTH(1-34)和125I-Ile5-PTHrP(1-36)與由HKRK-B7細胞制備的膜的結合在很大程度上不受GTPyS的影響(<約20%抑制，在1乂10—4MGTPyS下)，而1251-PTHrP(1-36)的結合受到gtpys強烈的抑制(約70%抑制，在1x10—7mgtpys;ic5。=1x10—9m;圖2A)。為了評估與大鼠PTHR的結合，利用由大鼠成骨細胞細胞系R0S17/2.8(其內(nèi)源性地表達大鼠PTHR)制備的膜進行了平行研究。與在HKRK-B7細胞膜中人PTHR—樣，125I_11e5_PTHrP(1_36)與大鼠PTHR的結合同樣在很大程度上對GTPyS不敏感(圖2B)。125I-PTH(1-34)與大鼠PTHR的結合似乎比它與人PTHR的結合對GTPyS更敏感(圖2A與圖2B)，雖然大部分的結合耐核苷酸類似物。關于人PTHR，GTPyS強烈抑制125I-PTHrP(1_36)與大鼠PTHR的結合，其對40于核苷酸類似物和^-[Aib1'3,M]PTH(1-15)的結合同樣敏感(圖2B)。因此，PTH(l-34)和Ile5-PTHrP(l-36)比PTHrP(1-36)或[AibU，M]PTH(H5)更有力地結合于PTHR的G蛋白未偶聯(lián)構象(R°)。相反，后面兩種肽優(yōu)先結合于G蛋白偶聯(lián)構象，RG。然后競爭方法用來分析相對親和力，借此PTH和PTHrP配體結合于PTHR的RG和R°受體構象。為了評估與RG的結合，使用^I-[AibU，M]PTH(l-15)作為示蹤放射性配體，因為這種肽主要結合于RG。膜制備自用hPTHR和負顯性Gc^亞單位(GasND)共轉染的C0S-7細胞(其富集有RG，相對于R和R,，如先前描述的(Deanetal.，Mol.Endocrinol.20:931-943(2006);Berlot，C.H.，J.Biol.Chem.277:21080-21085(2002);Deanetal.，J.Biol.Chem.281:32485-32495(2006))。為了評估與R°的結合，使用125I_PTH(l-34)作為放射性配體(主要結合于R°)。膜由僅用hPTHR轉染的C0S-7細胞制備。將GTPyS(1X10—5)加入到結合反應中，以便功能上未偶聯(lián)受體-異三聚體G蛋白復合物，因而富集R、和R)構象，相對于RG。然后在這兩種測定中，比較相對于多個未標記PTH和PTHrP配體所獲得的相對表觀親和力，以評估每種配體結合于R°與RGPTHR構象的選擇性。與結合于RG構象相比，PTH(l-34)以5倍更弱的親和力結合于R°構象(IC5。=4.2nM與0.86nM，P=0.0002;圖3A、表5)。PTHrP(1-36)呈現(xiàn)更大的選擇性，因為與結合于RG相比，它以66倍更弱的親和力結合于R°(P=0.04;圖3B;表5)。因此，它對于RG(相對于R"的選擇性比PTH(1-34)的選擇性大13倍。在配體中殘基5的相互交換會顛倒構象選擇性的這種模式；因而，與結合于RG相比，HisS-PTH(l-34)以750倍更弱的親和力結合于R°，并且與結合于RG相比，Ile5-PTHrP(l-36)以僅3倍更弱的親和力結合于R°(P<0.002;圖3C和圖3D;表5)。表5.與人PTH受體的RG和W構象的競爭結合<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在人PTH(1-34)和大鼠PTH(l-34)肽中，其缺乏我們的對照PTH(1_34)類似物的蛋氨酸8'21—正亮氨酸和Phe34Tyr34取代，lie5—His取代還強有力地減小對于R°的親和力而沒有大大影響對于RG的親和力(圖6A、圖6B、圖6D、和圖6E以及表4)。因此，與PTHrP(1-36)相比，PTH(1-34)以更高親和力結合于R°，而PTH(1-34)和PTHrP(1-36)均以高親和力結合于RGPTHR構象。在配體中殘基5在調(diào)節(jié)配體結合于W與RG構象的能力中起重要作用。此外，在PTH(l-34)中位置15處的殘基羧基末端有助于配體強有力地結合于W的能力，如[Aib1'3,M]PTH(1-15)所顯示的，其僅無力地結合于RM旦保持對于RG的強親和力(圖6C和表4)。PTHR激活的直接記錄。熒光共振能量轉移(FRET)方式最近已用來實時和在完整細胞中評估對于PTHR的配體結合和受體激活的過程。因此這種方式用作獨立的方式來比較PTH和PTHrP配體與PTHR相互作用的時間過程。所使用的方式利用了分子內(nèi)FRET信號，其發(fā)生在人PTHR構建物、PTHR-CFPie3/YFPCT中(前者稱作PTHR-cam)。這種構建物包含在第三胞內(nèi)環(huán)中的青色熒光蛋白(CFP)和在羧基末端尾部的黃色熒光蛋白(YFP)。通過處于基底狀態(tài)的PTHR-CFPie3/YFPCT來產(chǎn)生FRET信號，并且該信號在激動劑結合以后減弱，可能是由于在激活以后發(fā)生的構象變化。hPTH(l-34)誘導由表達PTHR_CFPira/YFPCT的細胞產(chǎn)生的FRET信號的快速(t1/2=0.7秒)減弱(13%)(圖4A)。在配體施加的15秒期間、以及在含配體的緩沖液與無配體緩沖液交換以后的至少60秒期間，F(xiàn)RET信號仍然受到抑制(配體施加時間由圖4A-4C中的圖上方的黑色水平線標出)。針對hPTH(l-34)所獲得的FRET反應輪廓(profile)相同于(r印licate)在先前FRET研究中針對該配體所觀察到的輪廓(Vilardagaetal.，Nat.Biotechnol.21:807-812(2003))。氨基末端肽，[Aib1'3,M]PTH(1—14)，與由hPTH(1—34)產(chǎn)生的相比(圖4B)，誘導這樣的FRET反應，其具有稍微更快的動力學(t1/2=0.5秒)并具有較淺的幅度(約5%)。此外，由[AibU，M]PTH(l-15)產(chǎn)生的FRET反應在緩沖液交換無配體緩沖液以后立即開始衰減(圖4B)。PTHrP(l-36)誘導相對緩慢的FRET反應(t1/2=約2至5秒)，并且信號在與無配體緩沖液交換以后立即開始衰減(圖4C)。IleS-取代的配體Ile5-PTHrP(l-36)誘導FRET信號，其顯著類似于PTH(1-34)誘導的FRET信號，因為反應是快速的(t1/2=0.5-0.7秒)，并且在配體除去以后是穩(wěn)定的(圖4D)。這些動力學數(shù)據(jù)(來源于光譜方法)完全與在上述結合放射性配體解離測定中獲得的那些動力學數(shù)據(jù)一致，因而表明PTH(l-34)和PTHrP(l-36)主要結合于PTHR的不同構象。它們還證實了配體中的殘基5在有助于這種構象選擇性方面的重要作用。在HKRK-B7細胞中cAMP的測量。假定LR°復合物可以異構化成LRG復合物，相對于僅不良地穩(wěn)定R°的配體，配體與R°的穩(wěn)定結合的潛在后果是由該配體誘導的信號反應的延長。為了檢查這種可能性，評估了在表達PTHR的細胞中PTH和PTHrP配體產(chǎn)生持續(xù)的cAMP反應的能力。因此用配體處理細胞10分鐘，洗滌以除去游離配體(unboundligand)。在洗滌后的不同時間，施加IBMX五分鐘，然后測量所得的細胞內(nèi)cAMP。利用這種方式，僅在最后5分鐘IBMX溫育時期產(chǎn)生的cAMP是可測量的。圖5A的實驗比較了在HKRK-B7細胞中由PTHrP(1-36)和Ile5-PTHrP(l-36)產(chǎn)生的cAMP反應的時間過程。緊接著在洗出步驟以后，用任何一種配體處理的細胞產(chǎn)生大約相同量的cAMP，其比在未處理細胞中的基底cAMP水平高約100倍。在洗出步驟后兩小時，用Ile5-PTHrP(l-36)處理的細胞保持cAMP信號能力，其是在配體洗出后立即觀測到的信號能力的約50%(圖5A)。相反，用PTHrP(1-36)處理的細胞的信號能力在兩小時時是初始反應的約19%，因而比針對Ile5-PTHrP(l-36)在兩小時時所觀測到的反應(P《0.003)小約65%。在每個時間點PTH(l-34)產(chǎn)生反應，其幾乎相同于由Ile5-PTHrP(l-36)產(chǎn)生的那些反應(P=>0.05，數(shù)據(jù)未示出)。因此，由PTH(l-34)禾PIle5-PTHrP(l-36)誘導的cAMP信號反應的衰減比PTHrP(1-36)誘導的cAMP信號反應的衰減慢約兩倍(t1/2=約2h與約lh)。針對PTH和PTHrP類似物所觀測到的在cAMP信號能力的持續(xù)時間方面的這些差異相似于在有GTPYS存在的情況下解離自PTHR的相應放射性配體的速率方面所觀察到的差異(圖IA-IC)。在HKRK-B64細胞中的cAMP測量。在HKRK-B64細胞中進一步檢查了配體產(chǎn)生持續(xù)(或延遲)cAMP信號反應的能力，其中HKRK-B64細胞在比HKRK-B7細胞更生理水平上表達hPTHR(90，000/細胞與950，000/細胞)。時間過程實驗表明，在這些細胞中在配體洗出后的60分鐘，可以最好地決定配體誘導信號反應的持續(xù)時間方面的差異(數(shù)據(jù)未示出)。在這些實驗中，通過同時用配體和IBMX溫育細胞10分鐘(沒有洗出期)來確定對于每種肽的最大響應；然后在配體洗出后60分鐘觀測到的cAMP反應表示為相應最大響應的百分比。如在HKRK-B7細胞中，在洗出后的60分鐘，PTH(1-34)禾PIle5_PTHrP(1-36)產(chǎn)生cAMP反應，其分別是在HKRK-B64細胞中它們的相應最大反應的47%和40%(圖5B)。在60分鐘時，類似物HisS-PTH(l-34)和PTHrP(1-36)產(chǎn)生反應，其是它們的最大反應的34%和19%。在兩小時時由[Aib1'3,M]PTH(1-15)誘導的反應是其最大反應的23%，因而可比于PTHrP(1-36)誘導的反應(P=0.7)。當用急性劑量反應信號測定(圖7;表6)評估時，呈現(xiàn)相同或可比較活性的不同PTH和PTHrP配體類似物可以在細胞中產(chǎn)生定量上不同累積的信號反應，其很可能是由于配體與受體形成穩(wěn)定復合物的能力。表6.PTH和PTHrP配體的cAMP和IP信號性能43<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>a數(shù)據(jù)是來自四個實驗的平均值(士s.e.m.);b基底camp(未減去)是5.2±0.9pmo1/孑Lc數(shù)據(jù)是來自五個實驗的平均值(士s.e.m.);d基底IP值(未減去)是330±8cpm/孑Le，P與.[Nle8'21，Tyr34]rPTH(l-34)NH2=0.02.在大鼠成骨細胞中cAMP的測量。利用大鼠成骨細胞(R0S17/2.8細胞系；圖8)進一步體外檢查了某些配體產(chǎn)生cAMP信號反應的能力。在室溫和在有IBMX存在的情況下用hPTH(1-28)NH2、Ala1'12,Aib3，Gln10，Har11，Trp14，Arg19-hPTH(l_28)NH2;hPTH(l_34)NH2、或r(大鼠)PTH(1-34)NH2處理ROS17/2.8細胞10分鐘，然后通過放射免疫測定來量化所得到的細胞內(nèi)cAMP。各種肽的EC5。值，對于hPTH(l-28)NH2是7.39nM;對于Ala1'12,Aib3，Gln1。，Har11，Trp14，Arg19-hPTH(1-28)NH2是0.37nM;對于hPTH(l_34)NH2是0.31nM;以及對于r(rat)PTH(1-34)NH2是0.021nM。在小鼠中cAMP的體內(nèi)血槳測量。對野生型小鼠皮下注射載體(0.9%NaCl/0.05%吐溫-20)、或包含PTH肽的載體，以達到10至1000nmol/kg體重的濃度。在注射后的指定時間，從尾靜脈抽出血液，并通過放射免疫測定來量化在所得的血漿中cAMP的量(圖9A-9D)。對小鼠進一步分析血槳磷酸鹽和血清離子化f丐濃度的變化。對野生型小鼠皮下注射載體(0.9%NaCl/O.05%吐溫-20)，或包含Ala1'12,Aib3，Gln10，Har11，Trp14，Argl9-hPTH(l-28)NH2或hPTH(l-34)NH2的載體，劑量為50nmol/kg體重。在注射后的指定時間，從尾靜脈抽出血液并確定血漿磷酸鹽(圖10A)和血清離子化鈣(圖10B)的濃度。利用ChironDiagnosticsModel634Ca+7pH分析儀來確定血清離子化鈣濃度。利用PhosphorousLiqui-UV測定試劑盒(StanBioLaboratory,Boerne，TX)測量血漿磷酸鹽濃度。兩種肽導致類似的血清鈣的最大增加和類似的血漿磷酸鹽的最大減少，但對A1^'12，Aib3，Glnlcl，Har11，Trp14，Arg19-hPTH(l_28)NH2的反應比對hPTH(l_34)NH2的反應更長久。在負鼠腎細胞中的磷酸鹽攝取抑制。利用來自腎近端小管的負鼠腎(OK)細胞系評估了磷酸鹽攝取的抑制。這些細胞介導由PTH受體配體調(diào)節(jié)的鈉依賴性磷酸鹽轉運功能。因此，用PTH(l-34)處理OK細胞可抑制它們從培養(yǎng)基攝取磷酸鹽。細胞短暫(10分鐘)暴露于A1，Aib3，M-PTH(l-28)導致對磷酸鹽攝取的顯著延長的抑制效應，而PTH(l-34)和hPTHrP(l-36)肽呈現(xiàn)磷酸鹽攝取抑制的非常短的持續(xù)時間(圖11)。在正常大鼠中PTHR配體的藥代動力學和高血鈣作用。在正常大鼠中研究了iv注射PTHrP(l-36)和[I5]-PTHrP(l-36)的藥物動力學分布(圖12)。PTHrP(1-36)和[I5]-PTHrP(l-36)均從循環(huán)中快速消失，并且[I5]-PTHrP(l-36)的藥物動力學分布可比于PTHrP(l-36)的藥物動力學分布。我們還測量了在正常大鼠中靜脈內(nèi)注射PTHrP(l-36)和[I5]-PTHrP(1_36)的血鈣作用(圖13)。在20和80nmol/kg下，PTHrP(1-36)禾P[I5]-PTHrP(1-36)在1小時時將血液離子化鈣水平增加至相同程度。在注射PTHrP(1-36)后兩小時，血液離子化鈣水平下降，但在注射[I5]-PTHrP(1-36)后兩小時則維持在高水平。因此，[I5]-PTHrP(1-36)和PTHrP(l-36)呈現(xiàn)出可比較的藥物動力學分布(圖12)，但[I5]-PTHrP(1_36)呈現(xiàn)出對RGPTHR構象更高的結合親和力(圖3和圖6)。因此，體內(nèi)觀測到的[I5]-PTHrP(1-36)的長45期血鈣作用可以通過其高R°結合親和力來最好解釋。借助于人PTH受體體外和體內(nèi)篩選PTH或PTHrP類似物。我們設計并合成了天然PTH-PTHrP雜合類似物，和[AU'"，Q"，R"，W14](M修飾)PTH-PTHrP雜合類似物，然后在表達hPTH受體的HKRK-B7細胞中測試了它們的cAMP信號能力。每種天然和M修飾的PTH/PTHrP雜合類似物顯示可比于hPTH(l-34)的cAMP信號活性(圖25)。我們評估了在C0S-7細胞膜中天然或M修飾的PTH和PTHrP雜合類似物對人PTH受體的R°和RG狀態(tài)的親和力(圖26A和圖26B)。在正常和TPTX大鼠中PTH和PTHrP類似物的高血鈣作用。利用PTH(1-34)和PTHrP(1-36)作為對照，在正常和TPTX大鼠中，評價了天然和M修飾的PTH-PTHrP雜合類似物的瞬時血鈣作用(圖13A、圖14A、圖15A、圖15B、圖16A、圖17A、以及圖18A)。I5_PTHrP(l_36)、MPTH(H4)/PTHrP(15_36)、PTH(1_14)/PTHrP(15_36)、PTH(1-18)/PTHrP(19-36)、M_PTH(1_34)顯示比PTH(1-34)更高的血f丐作用；相反，PTH(1-22)/PTHrP(23-36)和PTH(1-26)/PTHrP(27-36)顯示出比PTH(l-34)或PTHrP(1-36)對照肽更弱的血鈣作用。還體外測量了與大鼠PTHR的結合。利用延遲cAMP測定證實了信號活性的長度(圖13B-13C、圖14B-14C、圖15B、圖16B_16C、圖17B_17C、以及圖18B)，其清楚地表明了來自體外所示的結合數(shù)據(jù)的R°/RG選擇性與體內(nèi)高血鈣作用以及體外延遲cAMP反應之間的相關性。所有這些肽的cAMP信號并沒有顯著變化(圖19A、圖19B、圖20A、以及圖20B)。材料和方法以下材料和方法用來進行上述實驗。肽。在圖1-3、以及圖5-11中所使用的肽由M.G.H.BiopolymerCorefacility合成，如在Shimizuetal.，J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001)中所描述的。這些肽包括[Nle8'21，Tyr34]大鼠(r)PTH(1-34)NH2(PTH(1-34);[Aib1，3，Nle8，Gln1。，高精氨酸"，Ala12，Trp14，Tyr15]rPTH(l_15)NH2([Aib1,3，M]PTH(H5);[Ala1,12，Aib3，Gln10，高精氨酸11，Trp14，Arg19]人(h)PTH(1-28)NH2{[Ala1，Aib3，M]PTH(1_28)};[Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2{(PTHrP(1-36)};[Ile5，Tyr36]hPTHrP(1-36)NH2{Ile5_PTHrP(1-36)};hPTH(1-34)NH2;[His5]hPTH(1-34)NH2;rPTH(l_34)NH2以及[His5]rPTHrP(l_36)NH2。在FRET分析中使用的hPTH(l-34)C00H肽(自由羧基)(圖4)購買自BachemCalifornia(Torrance,CA)。大鼠研究使用了由AmericanP印tideCompany,Inc.(California,USA)合成的人PTHRP(1-36)。人PTH(1-34)購買自P印tideInstituteInc(Osaka,日本)。PTH或PTHrP類似物由SigmaAldrichJ即an(Tokyo，日本)合成。將大鼠研究中所用的肽以lmM溶解在lOmM乙酸中，然后貯存在-S(TC冰箱中。在圖12-16中所使用的肽購買自AmericanP印tideCompany,Inc.，California,USA(hPTHrP(1-36)COOH)，P印tideInstituteInc.，Osaka,日本(hPTH(1-34)C00H)、或Sigma-AldrichJ即an，Tokyo,日本(PTH/PTHrP雜合類似物)。將所有肽溶解在10mM乙酸中至0.ImM到4mM之間的肽濃度；然后存儲在_80°C。通過分析高效液相色譜法(HPLC)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)質(zhì)譜來證實肽純度和質(zhì)量。通過氧化氯胺-T程序并利用Na^I(特異性活性:2，200Ci/,1，PerkinElmer/NENLifeScienceProducts,Boston,MA)來制備放射性標記的肽變體，然后通過反相HPLC加以純化。細胞培養(yǎng)。在37。C下在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中并在包含5%C02的加濕氣氛中培養(yǎng)細胞，其中上述培養(yǎng)基補充有10%胎牛血清(HyClone，LoganUT)、100單位/ml青霉素G、以及100iig/ml硫酸鏈霉素(InvitrogenCorp.Carlsbad,CA)。所使用的表達PTHR的細胞系是HKRK-B7、HKRK-B64、R0S17/2.8、以及HEK-PTHR-cam。借助于用編碼人PTHR的質(zhì)粒DNA(pCDNAl載體，InvitrogenCorp.)的穩(wěn)定轉染，HKRK-B7和HKRK-B64系衍生自豬腎細胞系，LLC-PK1，并且分別以950，000和90，000個PTH結合位點/細胞的近似表面密度表達PTHR(Takasuetal.，J.BoneMiner.Res.14:11-20(1999))。R0S17/2.8細胞是大鼠骨肉瘤細胞(Majeskaetal.，Endocrinology107:1494-1503(1980))并且以70，000個PTH結合位點/細胞的近似表面密度表達內(nèi)源性大鼠PTHR(Yamamoto，I.etal.，Endocrinology122:1208-1217(1988))。通過穩(wěn)定DNA轉染，HEK-PTHR-cam細胞源自HEK-293細胞并且表達人PTHR衍生物(PTHR-cam)，其包含插入在第三胞內(nèi)環(huán)中的Gly395處的青色熒光蛋白(CFP)和插入在羧基末端尾部的黃色熒光蛋白(YFP)(Vilardagaetal.，Nat.Biotechnol.21:807-812(2003))。在T75燒瓶中增殖細胞，然后分到24孔板中用于用完整細胞進行測定，6孔板中用于膜標本，或分到玻璃蓋片上用于FRET研究。在6孔板中利用Fugene-6(RocheDiagnostics,Indian即olisIN)和編碼PTHR的CsCl純化的質(zhì)粒DNA(3ii1Fugene，1y1DNA，每孔)瞬時轉染C0S-7細胞，或用編碼PTHR的質(zhì)粒和負顯性Gas亞單位GasND(6illFugene，1iig每種DNA/孔)共轉染C0S-7細胞。該GasND亞單位比野生型Gas更有效但非生產(chǎn)性地結合于受體(Berlot，C.H.J.Biol.Chem.277:21080-21085(2002))，并且已發(fā)現(xiàn)可以增強^I-[Aib1，3，M]PTH(1_15)NH2放射性配體與細胞膜中PTHR的結合(參見下文)(Dean，T.etal.，J.Biol.Chem.(2006))。結合研究。利用細胞膜進行結合研究，如在(Deanetal.，MolEndocrino120(4):931-43(2006))中所描述的。簡單地說，在室溫下并在膜測定緩沖液(20mMHEPES，pH7.4，0.1MNaCl，3mMMgS04，20X甘油，3mg/ml牛血清白蛋白，蛋白酶抑制劑混合物_最終濃度ImMAEBSF，0.8iiM抑肽酶(Aprotonin)，20iiM亮肽素，40iiM倍司他汀，15iiM胃酶抑素A，14iiME-64—Sigma-AldrichInc.，St.Louis,M0)中溫育反應。反應包含20至100iig/mL的總膜蛋白濃度、以及大約150，000cpm/ml的總放射性濃度。如指出的，將未標記肽配體和/或GTPyS(Sigma-AldrichInc.St.Louis,M0)加入到反應中。在反應結束時，利用96孔真空過濾板和真空過濾裝置(Multi-Screen系統(tǒng)，具有DuraporeHV、0.65yM過濾器；MilliporeCorp.，Milford，MA)，通過真空過濾來分離結合和自由的放射性配體；然后使空氣干燥過濾器與平板脫離，并利用Y計數(shù)器來計數(shù)Y放射性。放射性配體解離。在15mL圓底聚苯乙烯保護帽蓋管(sn即-c即tubes)(Falcon)(總反應容積=5.0ml)中作為本體反應(bulkreaction)進行這些研究。預溫育膜和放射性配體90分鐘以便于復合物形成；然后在有或沒有GTPyS(5X10—5M)的條件下，通過添加過量放射性配體的未標記類似物(5X10—^最終濃度)來引發(fā)解離階段。在上述添加以前(t=0)、以及在其后的連續(xù)時間點，抽出0.2ml等分部分(約30，OOOcpm)并立即通過真空過濾加以處理(如上所述)。在預溫育和解離階段，在包含放射性配體的未標記類似物(5X10—7M)的平行反應管中，確定非特異性結合。在每個時間點，特異性結合的放射性被計算為在t=0時特異性地結合的放射性的百分比。平衡競爭結合和GTPYS抑制。在96孔Multi-Screen真空過濾板的孔中裝配和溫育用^I-[AibU，M]PTH(l-15)放射性配體進行的結合反應。在上述孔中溫育膜、示蹤放射性配體、以及各種濃度的未標記配體和/或GTPyS90分鐘，其后，通過快速真空過濾來處理反應板以與自由的放射性配體分離(如上所述)。在96孔聚苯乙烯微量滴定板(Falcon，總反應容積=230iU)中，裝配和溫育用125I_PTH(l-34)放射性配體進行的結合反應，然后在溫育結束時被轉移到96孔、Multi-Screen真空過濾板的孔中并加以處理(如上所述)。對包含125I-PTH(l-34)的反應進行該轉移操作以最小化放射性配體與Multi篩選濾膜的非特異性結合。對于兩種放射性配體，在包含飽和濃度的放射性配體的未標記類似物的反應中確定非特異性結合。特異性地結合的放射性被計算為在沒有競爭配體或GTPyS的條件下特異性地結合的放射性的百分比。為了評估各種未標記肽配體結合于G蛋白未偶聯(lián)和G蛋白偶聯(lián)PTHR構象(分別為W和RG)的能力，膜制備自瞬時轉染的C0S-7細胞和以下測定條件。為了評估與W的結合，膜制備自用PTHR轉染的細胞，其中125I-PTH(l-34)作為示蹤放射性配體，然后將GTPyS(1X10—5M)加入到結合反應中。這種結合格式(bindingformat)基于以下前提通過存在GTPyS，125I-PTH(1-34)主要結合于PTHR的R°構象，并且這種構象被富集在膜中(相對于RG)(Hoareetal.，J.Biol.Chem.276:7741-53(2001);Deanetal.，MolEndocrinol(2006))。為了評估與RG的結合，使用了由用PTHR和負顯性Gas亞單位(GasND)共轉染的細胞制備的膜，并且使用^I-[AibU，M]PTH(1-15)作為示蹤放射性配體。該結合格式是基于以下前提通過存在Ga，,5l-[AibU，M]PTH(1-15)主要結合于PTHR的RG構象，并且這種構象被富集在膜中(相對于R或R°)(Hoare，S.J.Biol.Chem.(2001);Berlot，C.H.J.Biol.Chem.(2002);Dean，T.etal.，JBiol.Chem.(2006))。通過在反應中的低濃度(約25pM)的示蹤放射性配體，與存在于膜標本中的任何低親和力PTHR構象(R)的結合的分析被排除。熒光共振能量轉移(FRET)。如所描述的，使穩(wěn)定表達HEK_PTHR-CFPie3/YFPCT的HEK-293細胞(先前稱作HEK-PTHR-Cam細胞(Vilardagaetal.，Nat.Biotechnol.21:807-812(2003))生長在蓋玻片上并加以處理用于FRET分析。借助于這些細胞，用紫外光(入隨.《=436nm;入max.em.=480nm)激發(fā)PTHR_CFPIC3/YFPCT中的CFP(供體)會產(chǎn)生分子內(nèi)FRET至YFP(受體)，從而導致來自該YFP的發(fā)射(入隨.ex.=480nm，入隨.em.=535nm)。這種FRET反應可觀測為在480nm處CFP光發(fā)射強度的降低，以及在535nm處YFP光發(fā)射強度的增加。FRET信號由在基態(tài)受體中的PTHR-CFPIC3/YFPCT產(chǎn)生并在激動劑的結合以后降低。將PTH配體加入細胞中，然后利用計算機輔助、電磁閥控制的快速過熔裝置(ALAScientificInstruments,Westbury，NY)從細胞加以洗滌；溶液交換時間為5ms至10ms。利用Zeiss倒置顯微鏡來監(jiān)測熒光，其中倒置顯微鏡裝備有l(wèi)OOx物鏡和雙發(fā)射光度系統(tǒng)(TilPhotonics)，并連接于雪崩光電二極管檢測系統(tǒng)和模擬數(shù)字轉換器(Axonlnstr咖ents)。在激發(fā)以后在436nm處檢測的FRET信號被計算為歸一化FRET比^^535)/&^48。)，其中FYFP(535nm)是在535nm處的發(fā)射，校正CFP信號進入YFP通道的溢出，以及F^^^)是在480nm處的發(fā)射，校正YFP發(fā)射進入CFP通道的溢出(最小)。減去由光致褪色引起的熒光發(fā)射的變化。細胞內(nèi)cAMP的剌激。在用配體處理細胞以后，通過放射免疫測定來測量細胞內(nèi)cAMP水平，如在(Shimizuetal.，J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001))中所描述的。如48下評估了在短暫暴露于配體以后在細胞中配體產(chǎn)生延遲cAMP反應的能力。在24孔板中用結合緩沖液(50mMTris-HCl、pH7.7、100mMNaCl、5mMKCl、2mMCaCl2、5X熱滅活馬血清、0.5%熱滅活胎牛血清)沖洗細胞然后在室溫下并在有或沒有肽配體(1X10—7或3X10—7M)的結合緩沖液中溫育10分鐘；然后除去緩沖液，用結合緩沖液洗滌細胞三次，進一步在結合緩沖液中溫育不同時間(1至120分鐘)；然后用包含IBMX(2mM)的結合緩沖液更換上述緩沖液，并在另外溫育5分鐘以后，量化細胞內(nèi)cAMP。通過這種方式，其先前已用于PTH受體(Tawfeek，H.，andAbou-Samra，A.，J.BoneMiner.Res.14:SU444(1999);Biseloetal.，J.Biol.Chem.277:38524-38530(2002))，僅在最后的包含IBMX的溫育階段產(chǎn)生的cAMP是可測量的，因為在IBMX添加以前產(chǎn)生的cAMP被細胞磷酸二酯酶降解。在圖14的cAMP實驗中，以1X105個細胞/孔將HKRK-B7接種在96孔板中并溫育過夜。第二天，用200ii1的結合緩沖液(50mMTris-HCl、pH7.7、100mMNaCl、5mMKCl、2mM0^12、5%熱滅活馬血清、0.5%熱滅活胎牛血清)洗滌細胞一次，接著在冰上添加100ill的cAMP測定緩沖液(DMEM、2mMI腿、lmg/ml牛血清白蛋白、35mMH印es-NaOH、pH7.4)。然后，將50iU的包含不同量的人PTH(1-34)、人PTHRP(1-36)、或PTH類似物(最終容積=150iU)的結合緩沖液加入到每個孔中，并置于37t:的水浴中，然后溫育15分鐘。在除去培養(yǎng)基以后，將平板置于粉狀干冰上以凍結細胞，然后從干冰去除。用50iU的50mMHC1融化細胞，然后在干冰上再次凍結。借助于商業(yè)上可獲得的cAMPEIA試劑盒(BiotrackcAMPEIA系統(tǒng)，GEHealthcare)來測量細胞內(nèi)cAMP的水平。肌醇磷酸的剌激。在預標記(16小時)有3H-myo-D-肌醇(2yCi/ml)的瞬時轉染COS-7細胞中測量細胞內(nèi)肌醇磷酸(IP)的剌激。用在包含胎牛血清(10%)禾PLiCl(30mM)的DMEM中的配體處理細胞30分鐘；用冰冷三氯乙酸(5%)溶解細胞并通過離子交換過濾從酸裂解液提取IP，如在(Shimizuetal.，J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001))中所描述的。OK細胞方法。在37t:下，用培養(yǎng)基(載體)或包含肽配體(1X10—7M)的培養(yǎng)基處理細胞10分鐘；然后(t=0)，用培養(yǎng)基沖洗細胞三次并在37t:下單獨溫育不同時間。然后在每個時間點，將32P04加入到培養(yǎng)基中，并在溫育5分鐘以后，對細胞進行洗滌，溶解，然后通過液體閃爍計數(shù)來計數(shù)裂解液的"PP放射性。這些實驗的結果示在圖11中，作圖為在僅用載體處理相同時間的細胞的裂解液中32P放射性的量的百分比。體外結合和信號測定的數(shù)據(jù)計算。處理數(shù)據(jù)以進行曲線擬合和參數(shù)測定，其中利用MicrosoftExcel和GraphPadPrism4.0軟件包。利用雙指數(shù)衰減方程來分析解離時間過程數(shù)據(jù)，除非F檢驗分析表明單指數(shù)方程能提供更好的擬合(Palpha>0.02)。利用具有可變斜率的sigmoidal劑量反應方程來分析來自平衡結合、cAMP和IP劑量反應測定的數(shù)據(jù)。該分析產(chǎn)生數(shù)據(jù)的曲線和EC5。、ICs。(產(chǎn)生一半最大效應的配體濃度)以及E^(通過配體獲得的最大響應)的值。利用"學生"t檢驗(雙尾)統(tǒng)計上比較了成對數(shù)據(jù)集，其中假設兩個集具有不等方差。在正常大鼠中PTHrP(1-36)和15-PTHrP(1-36)的藥代動力學分析。通過用25mmol/L磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液/100mmol/LNaC1/0.05%吐溫80(pH.5.0)(PC緩沖液)進行稀釋來調(diào)節(jié)原液中人PTHRP(1-36)和[I5]-PTHrP(1-36)的濃度。緊接著在給予以前，使兩種肽靜置在冰上。49測量8周齡的雌性SD-IGS大鼠(CharlesRiverJapan,Inc.)的體重。大鼠以10nmol/lml/kg的劑量接受靜脈內(nèi)給予人PTHRP(l-36)和[I5]-PTHrP(1-36)。對于每個肽劑量和/或時間點，將肽給予3只大鼠的組。在給予后的2.5、5、7.5、10、15、30、60、120分鐘，通過尾靜脈將血液收集在包含EDTA(最終O.2%)和抑肽酶(最終O.6TIU/ml)的管中，以監(jiān)測在大鼠血槳中人PTHRP(l-36)和[I5]-PTHrP(l-36)的濃度的時間過程。對樣品進行離心以收集血槳并存儲在-8(TC下，直到測定人PTHRP(l-36)和[I5]-PTHrP(1_36)水平。禾U用PTH-RP1-34(人，大鼠)EnzymeImmunoassay試齊U盒(PeninsulaLaboratoriesInc.)，通過EIA分析來確定人PTHRP(1-36)和[I5]-PTHrP(1-36)的水平。[I5]-PTHrP(1-36)與PTHrPEIA試劑盒交叉反應，并且使用[I5]-PTHrP(1-36)作為用于測量血槳中[I5]-PTHrP(1-36)水平的標準。在正常大鼠中人PTH(l-34)、PTHrP(1-36)以及PTH或PTHrP類似物的高血鈣作用。如下在正常大鼠中研究了人PTH(1-34)、PTHrP(1-36)、以及PTH或PTHrP類似物的高血鈣效應。通過用25mmol/L磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液/100mmol/LNaCl/0.05X吐溫80(pH.5.0)(PC緩沖液)進行稀釋來調(diào)節(jié)原液中肽的濃度。在緊接著給予以前，使所有肽靜置在冰上。測量8周齡的雌性SD-IGS大鼠(CharlesRiverJ即an，Inc.)的體重。通過尾靜脈將血液收集到肝素化毛細管中并利用Ca+7pH分析儀(Model634/BayerMedicalLtd.)來測量血液離子化鈣和pH值的基線水平，以給出在pH7.4時每種樣品的離子化鈣的校正水平。大鼠以lml/kg的劑量接受靜脈內(nèi)給予每種肽。分別將每種肽給予6只大鼠的組。在給予后1、2、4、或6小時，通過尾靜脈來收集血液，以監(jiān)測經(jīng)校正的血液離子化鈣水平的時間過程。與載體相比，經(jīng)校正的離子化鈣水平的變化的時間過程被表示為平均值+/_標準誤差。統(tǒng)計分析。利用SAS軟件通過分析方差(ANOVA)來進行統(tǒng)計分析。利用"學生"t-檢驗或Dimnett多重檢驗來確定差異顯著性。P<0.05被認為是統(tǒng)計顯著的。在甲狀腺甲狀旁腺切除術(thyroparathyroidectomy)大鼠中[A1'3'12,Q1、R11，W14]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)(MPTH14)的血f丐作用。五周齡雄性Crl:CD(SD)大鼠獲自CharlesRiverLaboratoriesJapan,Inc.(Kanagawa，日本)并在20-26。C禾口35-75%濕度的標準實驗室條件下被馴化1周。大鼠可以隨意獲得自來水和標準嚙齒動物chow(CE-2)，其包含1.1%|丐、1.0%磷酸鹽以及250IU/100g的維生素D3(CleaJ即an，Inc.，Shizuoka，日本)。對6周齡大鼠進行甲狀腺甲狀旁腺切除術(TPTX)。所用TPTX大鼠的選擇是基于在利用電極法進行操作以后的24小時或72小時在獲自尾靜脈放血的樣品中的血清離子化牽丐(iCa)水平(<l.OmM)?；谠谑中g以后48小時的iCa水平，TPTX大鼠被分為6組，每組5只動物。TPTX-載體組靜脈內(nèi)僅接受載體(10mM乙酸溶液)，以lml/kg體重的劑量給予尾靜脈。將人甲狀旁腺激素(1-34)(hPTH(l-34))和M-PTH(1-14)/rP(15-36)(MPTH14)分別以1.25、5、20nmol/kg(3組)和1.25、5nmol/kg(2組)的劑量靜脈內(nèi)注射到TPTX大鼠中。從尾靜脈獲得血液，用于檢測每次注射以后1、2、4、6、以及24小時的iCa。利用自動分析儀(M-634,ChibaCorningDiagnosticsCo.Ltd.，Tokyo,日本)通過電極法來確定離子化鈣水平。小鼠研究。對野生型小鼠以10至1000nmol/kg體重的劑量水平皮下注射載體(0.9%NaCI/0.05%吐溫-20)、或包含PTH肽的載體。在注射后的指定時間，從尾靜脈抽出血液，然后通過放射免疫測定來量化在所得的血漿中的cAMP量。如上述測量血清中的離子化鈣并通過U.V.光譜試劑盒測定來測量磷酸鹽。動物研究的統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差(SE)。利用SAS(Ver.5.00.010720，SASInstituteJ即an，Tokyo,日本)確定了統(tǒng)計顯著性。<0.05的P值被認為是統(tǒng)計顯著的。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，與TPTX-載體水平，通過D皿nett多重比較檢驗。實施例2在PTH和PTHrP中丙氨酸取代的表征如上所示，PTH(1-34)具有比PTHrP(1-36)(其偏愛RG構象)更大的結合于R。受體構象的能力。為了探索這種差異結合和構象選擇性的分子基礎，我們比較了在PTH和PTHrP肽的N端和C端區(qū)的取代對配體與PTHR的相互作用的影響。不同于在PTH(1-14)中，其中，在位置1、3、10、11、12以及14處的丙氨酸取代會增加cAMP活性，在PTHrP(l-14)中的每個丙氨酸取代會消除在表達PTHR的細胞中的活性。因此，PTH和PTHrP的(1-14)區(qū)不同地與PTHR的膜并列(juxtamembrane)(J)區(qū)相互作用。PTHrP(1-14)和PTHrP(1-36)，與它們各自的PTH(1-14)和PTH(l-34)配對物相比，對于在表達PTHR(缺少細胞外N端(N)域(delNT))的細胞中的cAMP活性均是更少有效的。因此，與PTH(l-34)活性相比，PTHrP(l-36)活性更主要取決于C端配體區(qū)與PTHRN域之間的相互作用。因此我們研究了PTHrP序列的C端區(qū)，如在實施例3中所描述的。實施例3在PTH(l-28)和PTHrP(1-28)中的C端取代利用丙氨酸掃描和類型取代策略，我們能夠產(chǎn)生這樣的肽，與天然PTHrP(l-28)序列相比，其對于RG受體構象具有更大的選擇性。我們集中研究了PTHrP序列的C端區(qū)，因而對PTH(l-28)(數(shù)據(jù)未示出)和PTHrP(l-28)的15-28區(qū)進行了丙氨酸掃描。PTH(1-28)和PTHrP(1-28)的C端區(qū)的Ala掃描分析表明在位置Arg2°、Trp/Phe23、Leu24、以及Leu/Ile28處每種肽的活性很大程度上減小，已知在PTH中形成核心N結構域結合基序。在每種腳手架的多個但不同位置發(fā)現(xiàn)了活性的增強在PTHrP(l-28)中的Leu，Ph,、以及His^以及在PTH(l-28)中的Asn16、GhA以及Ala22。在PTH中的位置16、19、以及22處的丙氨酸取代增加了與delNT(失去N端配體結合域的PTH受體)的結合，而在PTHrP中的位置18、22、26處的那些丙氨酸取代減小了與delNT的結合。因此，在PTH的位置16、19、以及22處的Ala取代的增強效應是經(jīng)由PTHRJ域加以介導的，而在PTHrP的位置18、22、26處的那些Ala取代的增強效應則需要PTHRN域。在PTHrP(l-28)中的位置16、19、22、以及25(對于Ala取代是中性的)處的進一步的類型取代分析導致類似物[Ala18'22,Leu25，LyS26]-PTHrP(1-28)，與PTH(1-34)以及所觀測到的任何PTH或PTHrP肽的最高的cAMP效力和RG結合親和力相比，該類似物呈現(xiàn)更大的cAMP效力和RG結合親和力。這種掃描表明了，在位置18、22、25、以及26處的丙氨酸取代均增強了在表達人和大鼠PTHR的細胞中的cAMP活性(圖27A和圖27B)。在丙氨酸掃描以后，單獨用各種氨基酸進一步取代這些位置；發(fā)現(xiàn)其中一些會增51加cAMP活性(圖27C和圖27D)。然后我們以不同組合來結合這些突變，從而獲得多種具有顯著增強活性的PTHrP類似物，如本文描述的。實施例4示例性的取代的PTHrP(1_28)肽的表征使用PTHrP(1-36)、PTHrP(1-28)、A18'22,K26-PTHrP(1-28)、A18,22，L25，K26(AALK)-PTHrP(l-28)、E18，A22，K26_PTHrP(1-28)、或E18，A22，L25，K26(EALK)-PTHrP(1—28)，產(chǎn)生了在SaOS細胞中cAMP生產(chǎn)的劑量反應曲線(圖28A)。與親代PTHrP(l-28)相比，發(fā)現(xiàn)了A(E)18'22，L25，K26-PTHrP(l-28)(AALK或EALK)具有顯著增強的cAMP誘導活性。通過對C57BL/6小鼠(3月齡，雄性)靜脈內(nèi)注射載體、PTHrP(1-36)、PTHrP(1-28)、AALK-PTHrP(l-28)、或EALK-PTHrP(1-28)(n=3)，體內(nèi)研究證實了這些增強效應(圖28B)。在注射以后10分鐘抽出血液并通過RIA來測量cAMP的血漿水平。與wtPTHrP(l-28)相比，在針對AALK-PTHrP(l-28)和EALK-PTHrP(1-28)的小鼠測定中也觀測到顯著增強。在這些測定中PTHrP(l-36)肽的更大的明顯的效力可以反映從血液中更長的肽的更慢的清除。實施例5RG選擇性肽EALK-PTHrP(l-30)的表征我們還表征了EALK-PTHrP(1-30)肽對cAMP生產(chǎn)的影響。對三月齡雄性C57BL/6小鼠靜脈內(nèi)注射載體、rPTH(l-34)、M-PTH(l-34)(M=A1，Aib3，Q1Q，Har11，A12，W14，R19)、或E18，A22，L25，K26-(EALK)-PTHrP(l-30)(5nmol/kg)。在cAMP實驗中(圖29A)，在注射以后10分鐘抽出血液并通過RIA來測量cAMP的血槳水平。在f丐實驗中(圖29B)，在注射前和注射以后1、2、4、以及6小時抽出血液。利用Ca+7pH分析儀來測量離子化鈣。配體誘導大約相同水平的血槳cAMP，但RQ選擇性配體，M-PTH(l-34)誘導比PTH(l-34)顯著更有力和更持久的離子化鈣反應。相相反，RG選擇性配體，EALK-PTHrP(l-30)誘導的離子化鈣反應類似于(如果不低于)PTH(l-34)誘導的離子化*丐反應。進行了第二組實驗，其中小鼠每日接受5nmol/kg的rPTH(1-34)、M-PTH(1-34)、或EALK-PTHrP(l-30)的靜脈內(nèi)處理14天。在第6和第13天獲取血液樣品，并通過ELISA來評估骨轉換(PINP、骨鈣蛋白以及CTX)的標記。早在第6天，W選擇性配體，M-PTH(l-34)強烈誘導骨形成(PINP，圖30A和圖30B;骨鈣蛋白，圖30D)和骨吸收(CTX，圖30E和圖30F)的標記的增加。相反，RG選擇性配體，EALK-PTHrP(l-30)增加骨形成標記，并對吸收標記具有相對更小的影響，如在第6天所明顯看到的(圖30A、圖30C、以及圖30E)。在所分析的劑量和時間條件下，PTH(l-34)對骨標記僅具有輕微影響。與對骨標記的影響一致，M-PTH(l-34)強勁增加小梁骨，但還可察覺地減弱皮質(zhì)骨(圖31)，與它的嚴重的高血鈣作用一致(圖29B)。相反，EALK-PTHrP(l-30)增加了皮質(zhì)骨厚度，其中在遠端股骨(遠端干骺端)中是顯著的(圖30和表xx)，而沒有誘導嚴重的高鈣血癥。這些發(fā)現(xiàn)說明了，具有不同R7RG選擇性的修飾配體對骨代謝具有不同的影響。該發(fā)現(xiàn)還表明，RG選擇性類似物，如EALK-PTHrP(l-30)，優(yōu)先剌激骨形成(相對于骨吸收)，并對皮質(zhì)骨具有有益影響，其中對血液鈣水平具有最小影響。M-PTH(l-34)大大增加了在遠端股骨干骺端處的小梁骨，但誘導在中股骨骨干處的皮質(zhì)骨吸收，如通過骨內(nèi)表面的侵蝕所指明的。52表7示出了在每日用上述肽進行治療兩周以后骨結構參數(shù)的量化。如上所述，每日靜脈內(nèi)用載體、rPTH(l-34)、M-PTH(l-34)、或EALK-PTHrP(1-30)對小鼠進行治療14天。所有類似物顯著增加在股骨和腰椎處的骨礦質(zhì)密度。對于M-PTH(l-34)來說，在遠端和中股骨區(qū)，皮質(zhì)壁厚度均顯著更低。相反，EALK-PTHrP(l-30)增加了皮質(zhì)骨厚度，其中在遠端股骨中是顯著的。表7.在每日治療兩周以后在小鼠中的骨結構參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>實施例6EALK-PTHrP肽的最優(yōu)化為了最優(yōu)化EALK-PTHrP肽的活性，我們借助于在29-33區(qū)中的取代產(chǎn)生了EALK-PTHrP(1-30)和PTHrP(1-34)變體。在1-30腳手架中，在位置29處Gly、Ser、Leu、Asn、Gln、Trp、Glu、以及Lys被取代；在位置30處Gly、Ser、Leu、Asn、Asp、Trp、以及Lys被取代；以及在位置31處Ser、Leu、Asn、Val、Trp、Glu、以及Lys被取代。在EALK-PTHrP(1-34)中，30-33區(qū)被丙氨酸取代，或C端6個氨基酸被PTH(l-34)的對應的區(qū)替換。這些更長的肽的預測優(yōu)點(相對于PTHrP(l-30)腳手架)在于，它們在循環(huán)中由于更慢的清除將具有更長的半衰期。因此C端取代被設計成提供增加的鏈長度，但避免增加R°結合親和力，當安裝天然PTHrP(29-34)區(qū)時其會發(fā)生。測試這些肽在MC3T3-E1細胞中的cAMP活性。如圖32A和圖32B所示，這些肽中的多個呈現(xiàn)比未取代C端序列更大的活性。實施例7在腎磷酸鹽轉運中Trp^M-PTH的表征為了有助于進一步闡明PTH配體調(diào)節(jié)腎磷酸鹽轉運的信號機制，我們開發(fā)了M-PTH(l-28)的衍生物，，其對于PLC/PKC信號來說是有缺陷的，然而保留有力的cAMP/PKA信號活性。這樣的肽便于研究PKA和PKC信號途徑在近端小管(PT)細胞中調(diào)節(jié)Pi轉運蛋白NaPi-IIa和NaPi-IIc的功能和表面表達中的相對作用。類似物M-PTH(l-28)(M=Ala、Aib3，GlrAHar"，Ala12，Trp14，Arg19)，一種有力的用于cAMP和IP3信號途徑的激動劑，當被注入到小鼠中時，會誘導延長的低磷酸鹽血癥和高血鈣效應。該類似物還在經(jīng)注射的小鼠的腎PT細胞的刷狀緣膜和細胞質(zhì)室中誘導NaPi-IIa免疫反應性的延長的減小。為了損害PLC信號，我們在M-PTH(l-28)的位置1處用色氨酸替換丙氨酸，這是根據(jù)Bisello以及同事的發(fā)現(xiàn)(JBiolChem277:38524-30，2002)，其表明在該位置這樣的龐大的取代會選擇性地損害PLC信號。在用大鼠PTHR瞬時轉染的HEK-293細胞中，Trp^M-PTH(l-28)和M_PTH(1_28)大約同樣有力地剌激cAMP形成，但與親代肽相比至少100倍較小有力地剌激IP3形成。Trp^M-PTH(l-28)保留在MC3T3-E1細胞中在配體洗出后產(chǎn)生延長的cAMP反應的能力，如在MPTH(l-28)的情況下所看到的。當被注入到小鼠(20nmol/kg)中時，與PTH(1-34)的影響相比，W普PTH(1-28)，與M-PTH(1-28)一樣，會誘導血漿磷酸鹽水平的延長的抑制對于每種類似物，在2h具有最大抑制；恢復到載體對照水平，對于PTH(l-34)為4h，以及對于M-PTH(l-28)和W普PTH(l-28)為6h。在經(jīng)每種肽治療的小鼠中在2h時，在腎PT細胞中的尖端和細胞質(zhì)NaPi-IIa染色被減少，但在6h時染色恢復到載體對照水平(借助于PTH(l-34))的情況下，在用M-PTH(l-28)或Trp'-M-PTH(1-28)治療的小鼠中，它仍然減少至少6小時。在用M-PTH(1-28)治療的小鼠中，在4至6h的間隔期間，在腎PT細胞中NaPi-IIc的免疫染色被減少，但在用Trp^M-PTH(l-28)或PTH(l-34)治療的小鼠中則沒有變化。M_PTH(1_28)抑制在早期通道LLC-PK1細胞(NHERF-l/ezrin陽性)中的32P攝取，其中上述細胞被病毒性轉導以表達NaPi-IIc轉運蛋白和大鼠PTHR(Mahon，AmJPhysiolRenalPhysiol.294:F667-75(2008))，但Trp^M-PTH(l-28)未能抑制這種活性。該發(fā)現(xiàn)表明，腎Pi轉運的PTHR介導調(diào)節(jié)涉及，作為一種成分，NaPi-IIa向下調(diào)節(jié)(downregulation)的cAMP/PKA依賴性控制，以及，作為另一種成分，也許更慢和次要的成分，NaPi-IIc向下調(diào)節(jié)的PLC依賴性控制。實施例8在TPTX大鼠中M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)對血清和尿鈣和磷酸鹽的影響的表征我們還研究了M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)雜合肽(SP-PTH)對血清和尿f丐和磷酸鹽的影響。將PTH(l-34)以1.25nmol/kg單次靜脈內(nèi)注入經(jīng)受甲狀腺甲狀旁腺切除術的(TPTX)大鼠中會在1小時時瞬時增加血清f丐(sCa)并降低血清磷(sPi)水平，但當?shù)?小時時水平恢復到注射前條件時，不會達到正常范圍(分別為圖33和圖35)。PTH(l-34)并沒有在0-6小時內(nèi)改變尿鈣(圖34)或尿磷酸鹽水平(圖36)。相比之下，以1.25nmol/kg給予SP-PTH會在6小時內(nèi)增加sCa和降低sPi至正常水平，并且這些水平會保持24小時。在0-6小時，SP-PTH會降低尿鈣并增加尿磷酸鹽水平。這些結果表明，SP-PTH可以在TPTX大鼠中使低鈣血癥正?；鴽]有引起高鈣尿癥，因而表明，該肽可以用來治療甲狀旁腺功能減退并具有腎并發(fā)癥的降低風險。實施例9利用PTH或PTHrP類似物進行cAMP剌激HKRK-B，其是以9.5X107細胞的水平過度表達人PTH1受體的LLC-PK1細胞，用于cAMP信號測定。在37。C下，在Dulbecco良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中并在包含5%C02的加濕氣氛中，培養(yǎng)這些細胞，其中上述培養(yǎng)基補充有10%胎牛血清(Hyclone)、100單位/ml青霉素G、以及100iig/ml硫酸鏈霉素(InvitrogenCorp)。人PTHRP(1-36)由AmericanP印tideCompany,Inc.(California,USA)力卩以合成，人PTH(1—34)購買自P印tideInstituteInc.(Osaka,日本)，并且通過Sig腿AldrichJ即an(Tokyo,日本)來合成PTH或PTHrP類似物(Mc-PTH(l-34)、[A1，A3，A23，Q1。，R"]-hPTH(1-34)、[A1，A3，A23]-hPTH(l_34)、以及[A18，A22，L25，K26]-PTHrP(1-28))。以ImM將所有肽溶解在10mM乙酸中，并存儲在_80°C。如以上針對HKRK-B7細胞所描述的，進行cAMP剌激測定。PTH(1_34)和PTHrP(1_36)用作對照。在37t:下并在有IBMX存在的情況下，用不同濃度的配體處理細胞15分鐘。EC5。和Emax值報告在表8中。所有具有C端修飾的M修飾的PTH類似物顯示與hPTH(l-34)可比較的cAMP信號(圖37)。表8在HKRK-B7細胞中的cAMPEC50(nM)Max(pm/孑1>)hPTH(卜34)2.2667.2PTHrP(l-36)1,4761.9Mc-PTH34(R19)3.2565.5-hPTH(l-34)1.7663.8〖A133]-hPTH(l-34)1.9366.6-PTHrP(1-28)0.5256.4實施例10短效PTH肽在治療骨質(zhì)疏松癥中的應用將短效肽，如上面所描述的那些短效肽，給予患有骨質(zhì)疏松癥的患者。通常，在通過間歇性i.v./i.m.或皮下注射來治療骨質(zhì)疏松癥的情況下，給予的劑量在100至1200單位(yg)/天的范圍內(nèi)。用于給予這些化合物和組合物的確切劑量和方案將必然取決于待治療個體的需要、治療類型、痛苦或需要的程度、以及，當然，醫(yī)生的判斷。通常，腸外給予需要比其它給予55方法(其更依賴于吸收)更低的劑量。實施例11長效PTH肽在治療PTH缺乏癥中的應用將長效肽，如上面所描述的那些長效肽，給予患有與PTH缺乏癥有關的疾病的患者。這些疾病的實例包括與瘤樣鈣質(zhì)沉著癥有關的高磷酸鹽血癥、早期慢性腎疾病以及甲狀旁腺功能減退。待給予的肽的每日劑量取決于適應癥。通常，在每日i.v./i.m.或皮下注射的情況下，優(yōu)選為300-2400單位(yg)/天。用于給予這些化合物和組合物的確切劑量和方案將必然取決于待治療個體的需要、治療類型、痛苦或需要的程度、以及，當然，醫(yī)生的判斷。通常，腸外給予需要比其它給予方法(其更依賴于吸收)更低的劑量。其它實施方式本說明書中提及的所有專利、專利申請、以及出版物均以引用方式結合于本文，如每一個獨立的專利、專利申請、或出版物明確并單獨指出的相同程度以引用方式被結合。分別于2007年8月1日、2007年8月2日、以及2007年8月6日提交的美國臨時申請第60/963，117、60/963，082、以及60/963，867號以引用方式結合于本文。5權利要求一種用于確定候選化合物是否是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的長效激動劑的方法，所述方法包括(a)使所述GPCR與所述化合物接觸，其中所述GPCR具有RG形式；(b)測量所述化合物對所述GPCR的RG形式的親和力；(c)使所述GPCR與所述化合物接觸，其中所述GPCR具有R0形式；以及(d)測量所述化合物對所述GPCR的R0形式的親和力，其中以下化合物被鑒定為所述GPCR的長效激動劑所述化合物(i)具有的對所述GPCR的RG形式的親和力是對所述GPCR的內(nèi)源性激動劑的親和力的至少10％，以及(ii)與所述內(nèi)源性激動劑相比，對所述GPCR的R0形式具有更大的親和力。2.根據(jù)權利要求l所述的方法，進一步包括以下步驟(e)將所述候選化合物給予動物，以及(f)測量所述動物對所述化合物的至少一種生理反應。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述受體是人受體。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述GPCR是促胰液素家族受體。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述受體是PTH/PTHrP受體。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述PTH/PTHrP受體是人受體。7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述測量步驟(b)通過測量細胞內(nèi)或血鈣水平來進行。8.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中，所述測量步驟(b)或步驟(d)利用競爭性結合測定來進行。9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中，所述競爭性結合測定使用了對于所述GPCR的RG形式是特異性的或對于所述GPCR的R°形式是特異性的配體。10.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中，所述測量步驟(b)利用延遲cAMP測定來進行。11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，利用非水解核苷酸類似物來富集所述GPCR的所述W形式。12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，所述核苷酸類似物是GTPyS。13.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，利用顯性負G蛋白來富集所述GPCR的所述RG形式。14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述受體在細胞上或在膜中。15.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述候選化合物包括肽。16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述候選化合物來自化學庫或天然產(chǎn)物庫。17.—種用于確定候選化合物是否是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的短效激動劑的方法，所述方法包括(a)使所述GPCR與所述化合物接觸，其中所述GPCR具有RG形式；(b)測量所述化合物對所述GPCR的RG形式的親和力；(c)使所述GPCR與所述化合物接觸，其中所述GPCR具有R°形式；以及(d)測量所述化合物對所述GPCR的R°形式的親和力，其中以下化合物被鑒定為所述GPCR的短效激動劑所述化合物(i)具有的對所述GPCR的RG形式的親和力是對所述GPCR的內(nèi)源性激動劑的親和力的至少10%，以及(ii)與所述內(nèi)源性激動劑相比，對所述GPCR的W形式具有更低的親和力。18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述受體是人受體。19.根據(jù)權利要求17所述的方法，進一步包括以下步驟(e)將所述候選化合物給予動物，以及(f)測量所述動物對所述化合物的至少一種生理反應。20.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中，所述GPCR是促胰液素家族受體。21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述受體是PTH/PTHrP受體。22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中，所述PTH/PTHrP受體是人受體。23.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中，所述測量步驟(b)通過測量細胞內(nèi)或血鈣水平來進行。24.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述測量步驟(b)或步驟(d)利用競爭性結合測定來進行。25.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述競爭性結合測定使用了對于所述GPCR的RG形式是特異性的或對于所述GPCR的R°形式是特異性的配體。26.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述測量步驟(b)利用延遲cAMP測定來進行。27.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，利用非水解核苷酸類似物來富集所述GPCR的所述W形式。28.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，所述核苷酸類似物是GTPyS。29.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，利用顯性負G蛋白來富集所述GPCR的所述RG形式。30.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述受體在細胞上或在膜中。31.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述候選化合物包括肽。32.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中，所述候選化合物來自化學庫或天然產(chǎn)物庫。33.—種多肽，對PTHRG具有親和力并且對PTHW具有低親和力。34.根據(jù)權利要求33所述的多肽，相對于野生型PTH或PTHrP序列，具有通過取代、缺失、和/或添加一個或多個氨基酸而修飾的氨基酸序列。35.根據(jù)權利要求34所述的多肽，其中，所述氨基酸具有在位置5處的組氨酸或在位置23處的丙氨酸。36.根據(jù)權利要求33所述的多肽，與野生型序列相比，在由下式Ala23PTH、His5-PTH、以及HisS-PTHrP、或其片段表示的肽中具有至少一個氨基酸取代。37.根據(jù)權利要求34所述的多肽，其中，與所述野生型PTH相比，所述氨基酸序列對于所述PTHR的氨基末端胞外域具有更低的親和力。38.根據(jù)權利要求37所述的多肽，其中，所述氨基酸序列包括至少一個取代，所述取代選自由所述PTH或PTHrP序列的位置20處的丙氨酸、位置23處的丙氨酸、位置24處的丙氨酸、以及位置28處的丙氨酸組成的組。39.根據(jù)權利要求33所述的多肽，所述多肽選自由任何在圖26B的表中鑒定為RG選擇性的那些多肽組成的組。40.根據(jù)權利要求34或37所述的多肽，包括以下氨基酸序列Xl-Val-X2-Glu-His-Gln-Lys-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7，其中XI是Ser、Ala、Gly、或Aib;X2是Ser、Ala、或Aib;X3是Ala、Asn、Glu、Val、Asp、或Gln;X4是Leu、Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、或Har;X5是Gly、His、Arg、Ala、或Aib;X6是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala、Arg、或Aib;以及X7是His、Arg、Leu、Phe、Trp、或Aib，或其包含氨基酸l-10、l-ll、l-12、或1-13的片段、或其藥用鹽。41.根據(jù)權利要求40所述的多肽，其中，所述多肽具有長度小于20個氨基酸的氨基酸序列。42.根據(jù)權利要求41所述的多肽，其中，所述氨基酸序列的長度為IO至14個氨基酸。43.根據(jù)權利要求40所述的多肽，基本上由所述氨基酸序列、或所述其片段組成。44.根據(jù)權利要求43所述的多肽，由所述氨基酸序列、或所述其片段組成。45.根據(jù)權利要求33所述的多肽，包括以下氨基酸序列Xl-Val-X2-Glu-X3-Gln-Leu-Met-His-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-X9-Val-Glu-X10-Xll-Arg-Lys-Lys-X12，其中XI是Ser、Ala、或Aib;X2是Ser、Ala、或Aib;X3是lie或His;X4是Asn、Glu、Val、Asp、Glu、或Gln;X5是Leu、Val、Ala、Trp、11e、Met、Lys、Arg、或Har;X6是Gly、His、Arg、或Ala;X7是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala、或Arg;X8是His、Arg、Leu、Phe、或Trp;X9是Arg或Ala;X10是Trp、Phe、或Ala;Xll是Leu或Ala;以及X12是Leu或Ala;其包括所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、或1-27的片段，或其藥用鹽，其中所述氨基酸序列包括選自由位置X3處的His、位置X9處的Ala、位置X10處的Ala、位置X11處的Ala、以及位置X12處的Ala組成的組中的氨基酸中的至少一種。46.根據(jù)權利要求45所述的多肽，其中，所述多肽的長度少于50個氨基酸。47.根據(jù)權利要求46所述的多肽，其中，所述多肽的長度為24-28個氨基酸。48.根據(jù)權利要求45所述的多肽，基本上由所述氨基酸序列、或所述其片段組成。49.根據(jù)權利要求48所述的多肽，由所述氨基酸序列、或所述其片段組成。50.根據(jù)權利要求45-49所述的多肽，其中，X9、XIO、Xll、或X12中的至少一個是丙氨51.—種組合物，包括根據(jù)權利要求33-50所述的多肽以及藥用載體。52.—種用于治療受治療者中骨質(zhì)疏松癥的方法，包括以足以治療骨質(zhì)疏松癥的量將根據(jù)權利要求33-51中任一項所述的多肽或組合物給予需要其的所述受治療者。53.—種用于治療受治療者中骨折修復、骨軟化、關節(jié)炎、血小板減少、甲狀旁腺功能減退或高磷酸鹽血癥或增加受治療者中干細胞轉移的方法，包括以足以治療所述疾病或增加干細胞轉移的量將根據(jù)權利要求33-51中任一項所述的多肽給予所述受治療者。54.根據(jù)權利要求52或53所述的方法，其中，給予的途徑選自由皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)肺、經(jīng)皮、以及口服組成的組。55.—種多肽，所述多肽結合PTH受體并且對所述PTH受體的R°形式具有高親和力。56.根據(jù)權利要求55所述的多肽，相對于野生型PTH或PTHrP序列，具有通過取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸而修飾的氨基酸序列。57.根據(jù)權利要求55所述的多肽，選自由圖26B中IC5。小于7.9nM的任何肽、Ala1，Aib3[M]PTH(1-28)、Ala1，Aib3[M]PTH(1-34)、以及I5_hPTHrP(1-36)(#1208)組成的組。58.根據(jù)權利要求55所述的多肽，其中，與野生型PTH相比，所述氨基酸序列對所述PTHR的氨基末端胞外域具有更高的親和力。59.根據(jù)權利要求55或58所述的多肽，其中，所述氨基酸序列包括在位置19處的精氨酸或在位置5處的異亮氨酸。60.根據(jù)權利要求55-59所述的多肽，包括以下式的氨基酸序列Xl-Val-X2-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7-Leu-Asn-Ser-Met-Arg-Arg-Val_Glu_Trp_Leu_Arg_Lys_Lys_Leu，其中XI是Ser、Ala、或Aib;X2是Ser、Ala、或Aib;X3是Asn、Glu、Val、Asp、Glu、或Gln;X4是Leu、Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、或Arg;X5是Gly、His、Arg、或Ala;X6是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala、或Arg;以及X7是His、Arg、Leu、Phe、或Trp，或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、或1-27的片段，或其藥用鹽。61.根據(jù)權利要求60所述的多肽，其中，所述多肽的長度少于50個氨基酸。62.根據(jù)權利要求61所述的多肽，其中，所述多肽的長度為24-28個氨基酸。63.根據(jù)權利要求60所述的多肽，其中，所述多肽基本上由所述氨基酸序列、或其片段組成。64.—種藥物組合物，包括根據(jù)權利要求60-63所述的多肽和藥用載體。65.—種用于治療受治療者體內(nèi)的疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥選自由甲狀旁腺功能減退、高磷酸鹽血癥、瘤樣鈣質(zhì)沉著、以及骨質(zhì)疏松癥組成的組，所述方法包括以足以治療所述疾病或病癥的量將根據(jù)權利要求55-57中任一項所述的多肽給予需要其的受治療者。66.—種用于治療需要骨折修復、或患有骨軟化、關節(jié)炎、血小板減少、或需要干細胞轉移的受治療者的方法，包括以足以修復所述骨折、治療所述疾病、或轉移干細胞的量將根據(jù)權利要求55-57中任一項所述的多肽給予所述受治療者。67.根據(jù)權利要求65或66所述的方法，其中，給予的途徑選自由皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)肺、經(jīng)皮、以及口服組成的組。68.—種多肽，包括以下氨基酸序列Ala_Val_Ser_Glu_His_Glu_Leu_Leu_His_Asp_Lys_Gly_Lys_Ser_Ile_Gln_Asp_Xl_Arg-Arg-Arg-X2-Phe-Leu-X3-X4-Leu-Ile-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Glu-Ile，其中XI是Leu、Ala、Ser、Met、Phe、或Glu;X2是Phe、Ala、Ser、Leu、Asn、Trp、Glu、或LysX3是His、Leu、Arg、Lys、Trp、11e、或Phe;X4是His、Ala、Ser、Asn、Lys、或Arg;X5是Ala、Gly、Ser、Asn、Gln、Trp、Glu、或LysX6是Glu、Gly、Ser、Leu、Asn、Asp、Lys、或AlaX7是Ile、Leu、Val、Lys、或Ala;X8是His或Ala;X9是Thr、Asn、或Ala;以及X10是Ala或Phe，或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、1-27、1-28、1-29、1-30、1-31、l-32、l-33、l-34、或1-35的片段，并且其中，與相應的野生型PTHrP序列或其片段相比，所述多肽包括至少一個氨基酸取代；或其藥用鹽。69.根據(jù)權利要求68所述的多肽，其中，所述多肽的長度少于50個氨基酸。70.根據(jù)權利要求69所述的多肽，其中，所述多肽或其片段的長度為28至36個氨基酸。71.根據(jù)權利要求68-70所述的多肽，具有選自由XI是Ala或Glu、X2是Ala、X3是Leu、以及X4是Lys組成的組中的至少一個氨基酸取代。72.根據(jù)權利要求68-70所述的多肽，其中，所述多肽包括表1所示的氨基酸序列。73.根據(jù)權利要求71或72所述的多肽，包括氨基酸序列[Ala18，Ala22，Leu25，Lys26]-PTHrP(l-28)或[Glu18，Ala22，Leu25，Lys26]-PTHrP(1-28)。74.根據(jù)權利要求73所述的多肽，由氨基酸序列[Ala18，Ala22，Leu25，Lys26]-PTHrP(l-28)或[Glu18，Ala22，Leu25，Lys26]-PTHrP(1-28)組成。75.根據(jù)權利要求68-70所述的多肽，其中，所述多肽具有羥基基團或在其C端被酰胺化。76.根據(jù)權利要求68-75所述的多肽，其中，所述多肽基本上由所述氨基酸序列或其片段組成。77.根據(jù)權利要求68-76所述的多肽，其中，所述多肽是RG選擇性的或與所述PTH受體的W形式具有低結合親和力。78.—種藥物組合物，包括根據(jù)權利要求68-77所述的任何多肽和藥用載體。79.—種用于治療受治療者中骨質(zhì)疏松癥的方法，包括以足以治療骨質(zhì)疏松癥的量將根據(jù)權利要求68-78中任一項所述的多肽或組合物給予需要其的所述受治療者。80.—種用于在受治療者中治療骨折修復、骨軟化、關節(jié)炎、血小板減少、甲狀旁腺功能減退或高磷酸鹽血癥或增加干細胞轉移的方法，包括以足以治療所述疾病或增加干細胞轉移的量將根據(jù)權利要求68-78中任一項所述的多肽給予所述受治療者。81.根據(jù)權利要求79或80所述的方法，其中，給予的途徑選自由皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)肺、經(jīng)皮、以及口服組成的組。82.—種核酸，包括編碼根據(jù)權利要求33-50、55-63以及68-77中任一項所述的多肽的序列。83.根據(jù)權利要求82所述的核酸，可操作性地連接于啟動子。84.—種載體，包括根據(jù)權利要求83所述的核酸。85.—種細胞，包括根據(jù)權利要求84所述的載體。86.—種制備多肽的方法，包括在表達所述多肽的條件下生長根據(jù)權利要求85所述的細胞。全文摘要本發(fā)明提供了用于GPCR的篩選方法，其基于以下發(fā)現(xiàn)當未結合于G蛋白時，受體激動劑對于GPCR(如甲狀旁腺激素受體)的親和力與其間激動劑有效的時間長度有關，而與它的藥物動力學特性無關。本發(fā)明還提供了PTH和PTHrP來源的多肽。文檔編號A61K38/04GK101784281SQ200880101180公開日2010年7月21日申請日期2008年8月1日優(yōu)先權日2007年8月1日發(fā)明者岡崎誠,哈拉爾德·朱佩內(nèi)爾,市川文彥,托馬斯·J·加德拉,清水勝,約翰·T·波茨申請人:總醫(yī)院有限公司;中外制藥株式會社