專利名稱：重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體和包含這些突變體，特別是避免N-連接的糖基 化并保持野生型蛋白質(zhì)生物活性的突變體序列的蛋白質(zhì)。本申請(qǐng)還涉及編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白 突變體序列的重組蛋白的多核苷酸，和制備與使用所述重組蛋白的方法。發(fā)明背景 本說明書中列出或討論的在先公開文件不應(yīng)視為是對(duì)所述文獻(xiàn)屬于現(xiàn)有技術(shù)的 一部分或者是公知常識(shí)的承認(rèn)。據(jù)估計(jì)，有超過370種新的生物技術(shù)藥物在研制中。生產(chǎn)生物技術(shù)藥物是復(fù)雜而 耗時(shí)的過程。細(xì)胞必須在經(jīng)過嚴(yán)格維持和調(diào)控的條件下在大型不銹鋼發(fā)酵罐中生長(zhǎng)。在 有些情況下，細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)；在其它情況下，細(xì)胞必須裂解，使得可以提取和純化蛋白質(zhì)。 一旦方法經(jīng)過測(cè)試、設(shè)計(jì)和放大，就可以大批量生產(chǎn)生物技術(shù)藥物。這可以通過在嚴(yán)格控制 的條件下，在大不銹鋼釜中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化而包含目的基因或抗體的宿主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞保 持存活，并通過精確的培養(yǎng)條件加以刺激，使其產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)，所述條件包括溫度(其可 通常變化不超過一攝氏度)、氧、酸度(即使PH水平變化很小，細(xì)胞也很容易死亡)、培養(yǎng)基 組分和其它變量的平衡。在合適的培養(yǎng)基或血清中小心培養(yǎng)后(持續(xù)時(shí)間依賴于產(chǎn)生的 蛋白質(zhì)和生物體性質(zhì)而變化)，從培養(yǎng)物分離蛋白質(zhì)，在純化的每個(gè)步驟嚴(yán)格測(cè)試，并配制 成具有藥物活性的產(chǎn)品。所有這些步驟嚴(yán)格遵照食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)的規(guī)定進(jìn) ^f (http://www.bio.org/pmp/factsheetl.asp， “ A Brief Primer on Manufacturing Therapeutic Proteins")。有很多不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)基可用于支持細(xì)胞生存，例如DMEM培養(yǎng)基 (H. J. Morton, 1970, In Vitro，6，89)、F12 培養(yǎng)基(R. G. Ham, 1965, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53，288)和 RPMI 1 640 培養(yǎng)基(J. W. Goding, 1980，J. Immunol. Methods, 39，285 JAMA, 1957，199，519)。然而，這些培養(yǎng)基(常稱作“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”)經(jīng)常嚴(yán)重缺乏大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞 所需的營(yíng)養(yǎng)成分。通常，必須向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清來克服這些缺陷。通常以顯著的濃 度使用胎牛血清(FBS，由牛胎收獲)、人血清、豬血清和馬血清。盡管使用血清對(duì)于正確的細(xì)胞生長(zhǎng)而言是理想的，也常是必需的，但是它有一些 缺點(diǎn)。很難獲得具有一致的生長(zhǎng)特性的血清。此外，血清的生化復(fù)雜性能使目的蛋白質(zhì)的 下游加工復(fù)雜化，從而增加生產(chǎn)成本。在試圖解決這個(gè)問題的嘗試中，去除了血清而加入特 定成分代替。這些組分之一是轉(zhuǎn)鐵蛋白。人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(HST)是正常人血漿中的主要鐵 結(jié)合蛋白質(zhì)，并且以約 2-4g/l 存在(van Campenhout 等，2003，F(xiàn)ree Radic. Res.，37， 1069-1077)。在生理上，它的功能是將鐵從吸收和儲(chǔ)存部位安全轉(zhuǎn)運(yùn)至利用部位，如發(fā)育中 的紅血細(xì)胞。它與鐵的高度親和性可降低胞外環(huán)境中鐵催化的自由基反應(yīng)的損害作用(von Bonsdorff等，2001, Biologicals, 29，27-37)，并且隨后的低游離鐵濃度對(duì)于很多生物體都 是抑菌的(von Bonsdorff 等，2003，F(xiàn)EMS Immunol. Med. Microbiol. , 37,45-51)；它還可具 有更直接的抗菌作用(Ardehali 等，2003，J. Biomed. Mater. Res. Α，66，21-28)。
HST是分子量約為SOkDa的單體糖蛋白，能非常緊密地但可逆地結(jié)合兩個(gè)鐵離 子。它包含兩個(gè)球狀葉(稱作N-葉和C-葉)，每個(gè)由被深的裂縫分隔開兩個(gè)亞域組成，其 包含鐵離子的結(jié)合位點(diǎn)和協(xié)同作用的碳酸根陰離子。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，通過將載有鐵 的全轉(zhuǎn)鐵蛋白與特定的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)結(jié)合，然后通過Fe3+/HST/TfR復(fù)合物的胞吞作 用而獲得鐵。鐵在核內(nèi)體的酸性條件中釋放，之后HST/TfR復(fù)合物返回至細(xì)胞表面，由這 里將不含鐵的脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白釋放回循環(huán)中(MacGiIlivray等，1998，Biochemistry, 37, 7919-7928 ；Hirose,2000，Biosci.Biotechnol. Biochem.，64，1328—1336 ；Hemadi 等，2004， Biochemistry,43,1736-1745)。HST在肝臟中作為698-殘基蛋白質(zhì)而產(chǎn)生。在分泌過程中去除19殘基的前導(dǎo)序 列以產(chǎn)生約SOKDa的成熟糖蛋白，所述糖蛋白具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。成熟轉(zhuǎn)鐵 蛋白的約75KDa多肽鏈包含19個(gè)二硫鍵，并具有預(yù)計(jì)的pi為6. 64。N-葉和C-葉分別由殘 基 1-331 和 338-679 形成(Steinlein 等，1995,Protein. Expr. Purif.，6，619-624)。C-葉 在Asn413和Asn611包含兩個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)(如上所示，在SEQ ID N0:1中加下劃 線)。在由倉(cāng)鼠幼鼠腎臟細(xì)胞(Gomme等1，2005，Drug Discov. Today，10，267-273)和酵母 巴斯德畢赤酵母(Bewley等，1999，Biochemistry，38，2535-2541)重組表達(dá)而產(chǎn)生的N-葉 轉(zhuǎn)鐵蛋白中也已經(jīng)鑒定了絲氨酸32處的0-連接的糖基化位點(diǎn)。
任何動(dòng)物或哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)鐵蛋白可以用于細(xì)胞培養(yǎng)基中，如HST或牛血清轉(zhuǎn)鐵蛋白 (BST)。然而，人們?cè)絹碓疥P(guān)注使用源自動(dòng)物的組分如轉(zhuǎn)鐵蛋白時(shí)病原體可能污染細(xì)胞培 養(yǎng)物的風(fēng)險(xiǎn)。在BST的情況中，存在認(rèn)為導(dǎo)致瘋牛病(BSE)的朊病毒是與通過血液分級(jí)產(chǎn) 生BST特別相關(guān)的問題。對(duì)于HST，當(dāng)通過血液分級(jí)產(chǎn)生HST時(shí)，存在可能受到肝炎和免疫 缺陷病毒如HIV污染的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞而言，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白培養(yǎng)基是標(biāo)準(zhǔn)的含血清培養(yǎng)基的優(yōu)異替代品。 它具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括更好的組成限定，并且非常重要的是，沒有以源自動(dòng)物的病原體污染 的風(fēng)險(xiǎn)。由于日益關(guān)注來自人類和動(dòng)物的血液傳遞的疾病，所以越來越關(guān)注如何找到不含 源自動(dòng)物的轉(zhuǎn)鐵蛋白和其它傳統(tǒng)的源自動(dòng)物的組分的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的培養(yǎng)能力可與 傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基相比。在本領(lǐng)域持續(xù)需要這樣的細(xì)胞培養(yǎng)基，其不包括與疾病轉(zhuǎn)移相 關(guān)的使用風(fēng)險(xiǎn)，但是可以以合適的濃度提供所有必需的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子，從而優(yōu)化細(xì)胞 的生長(zhǎng)。近年來大多數(shù)努力致力于通過向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)加合適的營(yíng)養(yǎng)物而開發(fā)無血清 培養(yǎng)基，從而避免加入血清，無需犧牲細(xì)胞存活度和/或細(xì)胞生長(zhǎng)和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這 種組分的實(shí)例包括牛轉(zhuǎn)鐵蛋白和人轉(zhuǎn)鐵蛋白；牛白蛋白和人白蛋白；源自天然(動(dòng)物)或 重組來源的某些生長(zhǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)；月旨 類如脂肪酸、留醇和磷脂；脂類衍生物和復(fù)合物如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；蛋白質(zhì) 和類固醇激素如胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、氫化可的松和孕酮；核苷酸前體；和 某些痕量元素(由 Waymouth, C.,于Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology, Vol. 1 :Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-FreeAnimal Cell Culture, Barnes, D. W.等編，New York :Alan R. Liss, Inc.,pp. 23-68 (1984)，和 Gospodarowicz，D.，Id.，在 pp 69-86 (1984)綜述)。然而，本文中列出的大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)仍然描述的是包含源自動(dòng)物的組分的培養(yǎng)基。Bowman 和 Yang (US 5，026，651，1991 年授權(quán))公開 了編碼 HST 的 cDNA 序列的分 離。其中公開的序列通過提述并入本文。因此，將來在技術(shù)上可能構(gòu)建HST編碼載體并表 達(dá)它們以產(chǎn)生重組HST。然而，如上述對(duì)于SEQ ID NO 1的討論，HST的序列包括兩個(gè)用于 N-連接的糖基化的共有位點(diǎn)。Lau等(1983，J. Biol. Chem.，258，15225-15260)報(bào)導(dǎo)，寡糖 轉(zhuǎn)移酶催化糖鏈轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)的序列-Asn-X-Thr/Ser-中包含的天冬酰胺殘基，其中X是 任何氨基酸。HST的序列包含兩個(gè)這樣的共有序列，分別以氨基酸N413和N611開始，兩個(gè) 序列都由可在N413和N611導(dǎo)致N-連接的糖基化的寡糖轉(zhuǎn)移酶而識(shí)別。所選重組宿主細(xì) 胞的性質(zhì)對(duì)于HST產(chǎn)物的糖基化水平和類型有顯著影響，并且能產(chǎn)生在人體中具有可能不 理想的抗原作用的異源HST產(chǎn)物。換句話說，在非人細(xì)胞中重組產(chǎn)生的HST與源自血清的 HST相比，可進(jìn)行了顯著不同的糖基化。發(fā)明概述 在本發(fā)明的第一方面，提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中Ser415突 變成不允許在Asn413發(fā)生糖基化的氨基酸。Ser415可以突變成基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突 變體的生物功能的氨基酸。例如，Ser415可以突變成保守氨基酸，如甘氨酸或丙氨酸。優(yōu) 選丙氨酸。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白還可以包含對(duì) Asn611的突變，使得其也突變成不允許在該位置糖基化的氨基酸。Asn611可以突變成基本 上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的生物功能的氨基酸。例如，Asn611可以突變成保守氨基酸，或 者可以突變成天冬氨酸或谷氨酰胺。根據(jù)本發(fā)明的第一方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白還可以包含對(duì) Val612的突變，使得其突變成不允許在Asn611糖基化的氨基酸。Val612可以突變成基本 上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的生物功能的氨基酸。例如，Val612可以突變成脯氨酸、半胱氨 酸或色氨酸。在本發(fā)明的第二方面，提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中Thr613突 變成不允許在Asn611糖基化的氨基酸。Thr613可以突變成基本上不降低突變體的生物功 能的氨基酸。Thr613可以突變成保守氨基酸，如甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸。優(yōu)選 丙氨酸。根據(jù)本發(fā)明第二方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白還可以包含對(duì) Asn413的突變，使得其也突變成不允許在該位置糖基化的氨基酸。Asn413可以突變成基本 上不降低突變體的生物功能的氨基酸。例如，Asn413可以突變成保守氨基酸，或者可以突 變成天冬氨酸或谷氨酰胺。根據(jù)本發(fā)明第二方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白還可以包含Lys414 的突變，使得其也突變成不允許在Asn413糖基化的氨基酸。Lys414可以突變成基本上不降 低突變體的生物功能的氨基酸。例如，Lys414可以突變成脯氨酸、半胱氨酸或色氨酸。在本發(fā)明的第三方面，提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中Ser415按 照本發(fā)明的第一方面突變，并且其中Thr613按照本發(fā)明的第二方面突變。根據(jù)本發(fā)明第三方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白還可以包含在Asn413、Lys414、Asn611和/或 Val612中任一個(gè)或者全部以上述針對(duì)本發(fā)明的第一和第二方面限定的形式的突變。本發(fā)明的第三方面的優(yōu)選實(shí)施方案可以是下述蛋白質(zhì)，其包含或組成為人轉(zhuǎn)鐵蛋 白蛋白質(zhì)的序列，所述蛋白質(zhì)具有突變S415A、T613A。此蛋白質(zhì)的示例性序列如SEQ ID NO 2中所示。
兩個(gè)-N-X-S/T-識(shí)別序列中S415A和T613A突變用于N-連接的糖基化。在本發(fā)明的第四方面，提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中除了在 Ser415突變成不允許Asn413糖基化的氨基酸的突變和/或在Thr613突變成不允許Asn611 糖基化的氨基酸的突變之外，引入至少一個(gè)另外的可減少蛋白質(zhì)的0-連接的糖基化的突 變。至少一個(gè)可減少0-連接的糖基化的突變的優(yōu)選實(shí)例是在Ser32的突變，如S32A或 S32C。在本發(fā)明的第五方面，提供多核苷酸，其包含編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的蛋白質(zhì) 的序列，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體如上述本發(fā)明的第一、第二、第三或第四方面中任一方面所限 定。例如，根據(jù)本發(fā)明第五方面的多核苷酸可以編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含或組成為SEQ ID NO 2的序列。這種多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO 3的序列。在SEQ ID NO :3中，人轉(zhuǎn)鐵蛋白cDNA (來自國(guó)家生物技術(shù)信息中心核苷酸序列匪 001063)的S415和T613密碼子變成丙氨酸密碼子GCT，其在釀酒酵母中是優(yōu)選的(37%， http //www. yeastRenome. orR/codon usaRe. shtml)。為此，將 1243 至 1245 位置的絲氨酸 415的AGC密碼子變成GCT，并且通過在位置1837將腺嘌呤突變成鳥嘌呤而將蘇氨酸613 的ACT密碼子變成GCT。根據(jù)本發(fā)明第五方面的多核苷酸可以包含分泌前導(dǎo)序列。因此，編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋 白突變體序列的重組蛋白的序列可以與編碼分泌前導(dǎo)序列的多核苷酸序列可操作連接。例 如，編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的序列可以在其5’末端與編碼分泌前導(dǎo)序列 的多核苷酸序列的3’末端可操作地連接。在本發(fā)明的第六方面，提供包含根據(jù)本發(fā)明第五方面的多核苷酸的質(zhì)粒。在一個(gè) 實(shí)施方案中，質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步包含編碼蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶的多核苷酸序列。質(zhì)?？梢?是2μπι質(zhì)粒。在本發(fā)明的第七方面，提供根據(jù)本發(fā)明第五或第六方面的多核苷酸或質(zhì)粒用于轉(zhuǎn) 化宿主細(xì)胞并從而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋 白突變體序列的重組蛋白的用途。在本發(fā)明的第八方面，提供產(chǎn)生能表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞的方法，所述蛋白質(zhì) 包含根據(jù)本發(fā)明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列，方法包括 提供根據(jù)本發(fā)明第五或第六方面的多核苷酸或質(zhì)粒；提供宿主細(xì)胞；用多核苷酸或質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化宿主細(xì)胞；和選擇已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第九方面，提供產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明第一、第二、第三或第四方面中任一方 面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的方法，所述方法包括提供包含根據(jù)本發(fā)明第五 或第六方面的多核苷酸或質(zhì)粒的宿主細(xì)胞；和在允許表達(dá)包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的重組蛋白 的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。方法可以進(jìn)一步包括分離已表達(dá)重組蛋白的步驟。方法還可以 進(jìn)一步包括用載體或稀釋劑配制分離的重組蛋白和任選的以單位劑量形式(unit dosageform)提供配制的蛋白質(zhì)的步驟，或者將分離的重組蛋白凍干的步驟。由本發(fā)明的第七、第八或第九方面限定的宿主細(xì)胞可以是任何類型的宿主細(xì) 胞。它可以是，例如，細(xì)菌或酵母(或其它真菌)宿主細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞可為對(duì)于克 隆目的特別有用的。酵母宿主細(xì)胞可為對(duì)于表達(dá)質(zhì)粒中存在的基因特別有用的。在一 個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，如酵母屬、克魯維酵母屬或畢赤酵母屬的成員，如 釀酒酵母、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、巴斯德畢赤酵母和膜蹼畢赤酵母 (Pichia membranaefaciens)，或魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜氏接合酵 母(Zygosaccharomyces bailii) >^Ι^ 'pff^fij (Zygosaccharomyces fermentati), gJc^ 蠅克魯維酵母(Kluyveromyces drosphilarum)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì) 胞，如黑曲霉、米曲霉、木霉屬、鑲片鐮孢(Fusarium venenatum)、安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)或多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)。在本發(fā)明的第十方面中，提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含根據(jù)本發(fā)明第一、第 二、第三或第四方面中任一方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白和選自下組的一個(gè) 或多個(gè)組分谷氨酰胺、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、維生素、月旨 蛋白、脂肪酸、氨基酸、亞硒酸鈉、蛋白胨和抗氧化劑。 在本發(fā)明的第十一方面中，提供培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括在細(xì)胞 培養(yǎng)基中培育細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含根據(jù)本發(fā)明第一、第二、第三或第四方面中任一方 面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，和選自下組的一個(gè)或多個(gè)組分谷氨酰胺、胰島 素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、維生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亞硒酸 鈉、蛋白胨和抗氧化劑。在本發(fā)明的第十二方面中，提供藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明第一、第二、第三 或第四方面中任一方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，和醫(yī)藥上可接受的載體。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白。通過“重組”，我們表示通過在 宿主細(xì)胞中表達(dá)遺傳修飾的(即非天然的)基因序列而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。通常，本發(fā)明的重 組蛋白通過下述產(chǎn)生用編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在適于 表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和回收由所述細(xì)胞表達(dá)的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的 重組蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白的變體形式由定點(diǎn)突變等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生，如下面的實(shí)例中報(bào)導(dǎo)的。本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白根據(jù)由SEQ ID NO=I限定的HTS序 列中特定氨基酸(特別是，SEQ ID NO 1 的 Ser415，SEQ ID NO 1 的 Asn611，SEQ ID NO 1 的 Val612 ；SEQ ID NO 1 的 Thr613 ；SEQ ID NO 1 的 Asn413 ；SEQ ID NO 1 的 Lys414)的 突變和/或防止糖基化而限定。然而，本發(fā)明基于對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)共有序列 中絲氨酸和蘇氨酸氨基酸的功能和作用的改進(jìn)的理解，其應(yīng)用不限于將特定的突變引入由 SEQ ID NO 1限定的轉(zhuǎn)鐵蛋白的全部和確切的序列中。HTS有很多變體，如通過等電聚焦(IEF)所顯示的(Constans等，1980，Hum. Genet.，55，111-114 ；Namekata 等，1997，Hum. Genet.，100，457-458)。在神經(jīng)氨酸苷酶處理 和用鐵飽和后，通過電泳已經(jīng)檢測(cè)到至少22種功能性變體。這些變體的初級(jí)氨基酸序列不 同(第一決定因素)，其可以通過遺傳表征而限定特定的氨基酸取代或缺失。其它變化在鐵含量上有差異(第二決定因素)和N-連接的多糖鏈上有差異(第三決定因素(de Jong等，1990，Clin. Chim. Acta, 190，1-46)) 在歐洲人口中，超過95%的人口認(rèn)定為具有TfC表型(de Jong等，1990，如前所 述)。在1987年，宣布C-變體的總數(shù)為16。暫時(shí)將兩個(gè)主要的變體總地命名為TfC1和 TfC2,其中計(jì)算得出TfC1最常見，以約0. 74至0. 82的頻率發(fā)生(Kuhnl和Spielmann，1978， Hum. Genet.，43，91-95 ；Kuhnl 禾口 Spielmann, 1979, Hum. Genet.，50，193-198 ；Weidinger 等， 1980，Z. Rechtsmed.，85，255-261)。在密碼子570處的C/T堿基取代用TfC2中的絲氨酸取 代Tf°C ！中的脯氨酸。從愛斯基摩人到土著居民，已將C1亞種鑒定為特別突出的轉(zhuǎn)鐵蛋白， 其顯示強(qiáng)的選擇優(yōu)勢(shì)(de Jong等，1990，如前所述^TfC1表型是異源的，并且能根據(jù)限制片 段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析而分成兩個(gè)亞類(Beckman等，1998，Hum. Genet.，102，141-144)。SEQ ID NO=I基于成熟的TfC1蛋白質(zhì)序列，并且(在SEQ ID NO :2中)我們已經(jīng) 提供了經(jīng)修飾的序列，其中寡糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別序列中的絲氨酸415和蘇氨酸613變成丙氨 酸殘基，以防止分別在Asn413和Asn611位點(diǎn)處的N-連接的糖基化。由于轉(zhuǎn)鐵蛋白的多變性，甚至在人類群體中也是如此，此外因?yàn)楸景l(fā)明基于對(duì)轉(zhuǎn) 鐵蛋白的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)共有序列中絲氨酸和蘇氨酸氨基酸的功能和作用的改進(jìn)的理解， 所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的應(yīng)用不限于SEQ ID NO :1所限定的轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)的完整和確切序列，然 后技術(shù)人員可以理解術(shù)語“轉(zhuǎn)鐵蛋白”用于本文可用于表示除SEQ ID NO :1限定的蛋白質(zhì) 之外的其它轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)。例如，其它天然或非天然轉(zhuǎn)鐵蛋白序列也可以由術(shù)語“轉(zhuǎn)鐵蛋 白”涵蓋，其中它們包含與SEQ ID N0:1的Ser415和/或Thr613等同的氨基酸。與SEQ ID NO :1的Ser415和/或Thr613等同的氨基酸是存在于轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì) 的N-連接的糖基化共有位點(diǎn)中(即在由寡糖轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的序列中)存在的絲氨酸或蘇氨 酸殘基，通常具有N-X-S或N-X-T序列(以N-到C-方向)，其中X是任何氨基酸，如賴氨 酸或纈氨酸，并且通常不是半胱氨酸、色氨酸或脯氨酸。然而，與Ser415和/或Thr613等 同的氨基酸不需要處于與Ser415( S卩，從轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)的N-末端開始415個(gè)氨基酸)或 Thr613(即，從轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)的N-末端開始613個(gè)氨基酸)相同的位置而成為等同的。 例如，通過將SEQID NO 1序列和截短形式進(jìn)行簡(jiǎn)單比對(duì)，技術(shù)人員將能容易地確定Ser415 和Thr613的等同物在SEQ ID NO :1的N-末端截短形式中的位置。在本上下文中，等同物 是功能性等同物，使得轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中的氨基酸如果是轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)的N-連接的糖基 化位點(diǎn)中的第三個(gè)氨基酸(第一個(gè)是Asn)并且位于轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)N-末端最接近的糖基 化位點(diǎn)時(shí)，能稱為與SEQ ID N0:1的Ser415等同。同樣地，轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中的氨基酸如果 是轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)的N-連接的糖基化位點(diǎn)中的第三個(gè)氨基酸(第一個(gè)是Asn)并且位于轉(zhuǎn) 鐵蛋白蛋白質(zhì)N-末端第二接近的糖基化位點(diǎn)時(shí)，能稱為與SEQ ID N0:1的Thr613等同。SEQ ID No 1 的 Asn413、SEQ ID No 1 的 Lys414、SEQ ID No 1 的 Asn611，和 SEQ ID No 1的Val612的等同物也可以使用相同的方法容易地確定。Asn413和Asn611的等 同物將一直是Asn，并發(fā)現(xiàn)其分別距離Ser415和Thr613的等同物兩個(gè)氨基酸(在N-末端 方向)。Lys414的等同物可以是任何氨基酸，其任一側(cè)翼為Asn413和Ser415的等同物。 Val612的等同物可以是任何氨基酸，其任一側(cè)翼為Asn611和Thr615的等同物。因此，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)可以在除本發(fā)明第一、第二和第三方面已 經(jīng)限定的那些修飾之外的位置，通過序列插入、缺失和取代而不同于SEQ ID No:l的序列。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)可以是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的任何成員(Testa，Proteins of iron metabolism,CRC Press,2002 ;Harris禾口Aisen,Ironcarriers and iron proteins,Vol.5, Physical Bioinorganic Chemistry, VCH, 1991)及其衍生物，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、突變轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Mason 等，1993，Biochemistry, 32, 5472 ；Mason et al, 1998，Biochem. J.，330(1)，35)、截 短的轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白葉(Mason 等，1996，Protein Expr. Purif. ,8,119 ；Mason 等，1991， Protein Expr. Purif.，2，214)、乳鐵蛋白、突變?nèi)殍F蛋白、截短的乳鐵蛋白、乳鐵蛋白葉或 上述任一種與其它肽、多肽或蛋白質(zhì)的融合體(Shin等，1995，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,2820 ；Ali 等，1999，J. BiolChem. ,274,24066 ；Mason 等，2002，Biochemistry，41，9448)， 只要轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)包含SEQ ID No 1的氨基酸Asn413、Lys414、Ser415、Asn611、Val612 和Thr613的等同物。 本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體可以任選地與其它蛋白質(zhì)融合，特別是生物活性蛋白 質(zhì)，如下所述。融合可以在N-或C-末端或包含插入。技術(shù)人員還應(yīng)理解，開放閱讀框可以 編碼包含任何序列的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可以為天然蛋白質(zhì)(包括酶原)，或天然蛋白質(zhì)的 變體或片段(其可以是，例如域)；或全部合成的蛋白質(zhì)；或不同蛋白質(zhì)(天然或合成)的 單或多融合體。轉(zhuǎn)鐵蛋白融合體的實(shí)例在美國(guó)專利申請(qǐng)如US2003-026778、US2003-0221201 和 US 2003-0226155，和 Shin 等(1995)Proc. Natl. Acad.Sci USA. 92m 2820，Ali等(1999) J Biol Chem274，24066，Mason 等 2002，Biochemistry 41，9448 中公開，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通 過提述并入本文。本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體可以任選地使用本領(lǐng)域已知的方法，并入納米體中，如 WO 2008/007146 中所述。轉(zhuǎn)鐵蛋白可以是或者可以不是人轉(zhuǎn)鐵蛋白。術(shù)語“人轉(zhuǎn)鐵蛋白，，在本文中用來表 示與源自人的轉(zhuǎn)鐵蛋白沒有區(qū)別或?yàn)槠渥凅w或片段的材料。“變體”包括插入、缺失和取代， 或者保守或者非保守。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)鐵蛋白的突變體。這些突變體可具有或者可不具有改變的免疫原 性。轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體可以或者可以不改變其與金屬離子和/或其它蛋白質(zhì)(如轉(zhuǎn)鐵蛋白受 體)的天然結(jié)合。我們還包括人轉(zhuǎn)鐵蛋白或人轉(zhuǎn)鐵蛋白類似物的天然存在的多態(tài)變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)，如本發(fā)明的第一、第二或第三方面所限定 的，將具有與 SEQ ID No :1 的序列有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的序列。序列同一性 可以使用本領(lǐng)域公知的方法計(jì)算，如根據(jù)WO 2006/136831中所述的方法進(jìn)行。通常地，人轉(zhuǎn)鐵蛋白的變體或片段將具有包含SEQ ID No 1序列的蛋白質(zhì)的配體 結(jié)合能力的至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50% (優(yōu)選至少80%、90%或95% )， 所述比例為重量比例(weight for weight)。轉(zhuǎn)鐵蛋白或測(cè)試樣品的鐵結(jié)合能力可以如下 所述確定。包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的蛋白質(zhì)包含對(duì)至少Ser415 (或其等同物)的 突變，使其被不允許在Asn413糖基化的氨基酸(或其等同物)取代，和/或?qū)hr613(或 其等同物)的突變，使其被不允許在Asn611糖基化的氨基酸(或其等同物)取代。用“不 允許糖基化”，我們包括如下意義當(dāng)編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的基因依照本申請(qǐng)實(shí)施例中給出的規(guī)程在釀酒酵母宿主菌株中表達(dá)時(shí)，在與突變的氨基酸相同的糖基 化位點(diǎn)中的Asn氨基酸(即，在Ser415突變情況中的Asn413，和在Thr613突變情況中的 Asn611)未進(jìn)行可檢出的N-連接的糖基化，并且其中選擇的釀酒酵母宿主菌株能在由SEQ ID No 1的序列組成的蛋白質(zhì)的Asn413和Asn611進(jìn)行N-連接的糖基化。蛋白質(zhì)可包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列，其中除了 Ser415突變成不允許在 Asn413糖基化的氨基酸和/或Thr613突變成不允許在Asn611糖基化的氨基酸之外，引入 至少一個(gè)降低蛋白質(zhì)的0-連接的糖基化的其它突變。用“降低0-連接的糖基化”，我們包 括下述意義在天然轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中與0-糖基化相關(guān)聯(lián)的氨基酸突變成不能糖基化的氨 基酸，或者突變成導(dǎo)致0-連接的糖基化程度低于在天然轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中所觀察到的程度 的氨基酸。這種突變的優(yōu)選位置是SEQ ID NO 1中的位置32，更優(yōu)選S32A或S32C。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了防止突變體的糖基化，對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列 進(jìn)行的突變基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的生物功能。這是在與“對(duì)照”蛋白質(zhì)比較中評(píng) 估的，所述對(duì)照蛋白質(zhì)具有與所述包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白相同的序列，除了 對(duì)下述任一個(gè)的突變SEQ ID NO 1 的 Ser32 ；SEQ ID No 1 的 Ser415 ；SEQ ID No 1 的 Asn611 ；SEQ ID No 1 的 Val612 ；SEQ ID No 1 的 Thr613 ；SEQ ID No 1 的 Asn413 ；SEQ ID No 1的Lys414(或它們的等同物)以防止糖基化，任選地，其中所述重組蛋白和其對(duì)照在 相同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并使用相同的方法分離。突變體的生物功能，與對(duì)照相比，指下述功能中的至少一種或多種鐵結(jié)合能力， 受體結(jié)合能力，鐵攝入能力，和細(xì)胞培養(yǎng)性能。鐵結(jié)合能力指包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白可逆結(jié)合鐵的能力。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，如果突變體具有對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵結(jié)合能力的至少50 %、60 %、70 %、 80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或基本上 100% (和，任選 地，不超過對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵結(jié)合能力的150%、140%、130%、120%、110%、105%、104%、 103%、102%、101%或基本上100% )，認(rèn)為對(duì)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋 白中的轉(zhuǎn)鐵蛋白序列所進(jìn)行以防止突變體糖基化的突變基本上不降低突變體的生物功能。 可以用分光光度計(jì)，通過蛋白質(zhì)在其無鐵和全鐵負(fù)荷狀態(tài)的470nm 280nm吸光度比例來 確定鐵結(jié)合能力。除非特別說明，試劑應(yīng)不含鐵。能通過針對(duì)0. IM檸檬酸(鹽)，0. IM乙 酸(鹽)，IOmM EDTApH 4. 5透析而從轉(zhuǎn)鐵蛋白或測(cè)試樣品去除鐵。蛋白質(zhì)在IOOmM HEPES, IOmM NaHC03pH8. 0中應(yīng)該為約20mg/mL。測(cè)定在水中稀釋的脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白(即不含鐵的 對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白)(Calbiochem，CN Biosciences, Nottingham, UK)的 470nm 280nm 吸光度 比例，使280nm處吸光度能用分光光度計(jì)準(zhǔn)確地確定(0%鐵結(jié)合)。通過將191mg氨基三 乙酸(nitrotriacetic acid)溶解于2mL IM NaOH中，然后加入2mL 0. 5M氯化鐵而制備 20mM氨基三乙酸鐵(FeNTA)溶液。用去離子水稀釋至50mL。通過加入足夠過量的新鮮制 備的20mM FeNTA而完全用鐵加載脫輔基(對(duì)照)轉(zhuǎn)鐵蛋白(100 %鐵結(jié)合的)，然后針對(duì) IOOmM HEPESUOmM NaHC03pH8. 0完全透析全轉(zhuǎn)鐵蛋白制備物以去除剩余的FeNTA，然后測(cè) 量470nm 280nm的吸光度比例。使用測(cè)試樣品(即所述包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組 蛋白)重復(fù)所述步驟，所述樣品開始應(yīng)不含鐵，并將最終比例與對(duì)照相比。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果突變體具有對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體結(jié)合能力的至少 50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或基本上100% (和，任選地，不超過對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體結(jié)合能力的150%、140%、130%、120%、 110%、105%、104%、103%,102%,101%或基本上100% )，認(rèn)為對(duì)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白 突變體序列的重組蛋白中的轉(zhuǎn)鐵蛋白序列所進(jìn)行以防止突變體的糖基化的突變基本上不 降低突變體的生物功能?？赏ㄟ^用于研究生物分子實(shí)時(shí)相互作用的基于無標(biāo)記表面等離子 體共振(SPR)的技術(shù)，或者通過放射標(biāo)記的鐵攝入試驗(yàn)確定受體結(jié)合能力(見下文)。鐵攝入能力指包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的下述能力結(jié)合鐵，并結(jié) 合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，然后通過受體介導(dǎo)的胞吞作用由細(xì)胞內(nèi)化，從而將鐵傳遞入細(xì)胞內(nèi)。因 此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果突變體具有對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵攝入能力的至少50%、60%、 70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或基本上 100% (和， 任選地，不超過對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵攝入能力的150 % ,140% ,130% ,120% ,110% ,105%, 104%、103%、102%、101%或基本上100% )，認(rèn)為對(duì)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的 重組蛋白中的轉(zhuǎn)鐵蛋白序列進(jìn)行以防止突變體糖基化的突變基本上不降低突變體的生物 功能?？梢允褂萌思t白血病(erythr0leukemiC)K562細(xì)胞，通過在55Fe攝入試驗(yàn)中放射標(biāo) 記的轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體介導(dǎo)的傳遞而確定鐵攝入能力。這種紅白血病細(xì)胞系是通過這種途 徑進(jìn)行的轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體介導(dǎo)的胞吞和鐵供給的模型開發(fā)中的標(biāo)準(zhǔn)(Klausner等，1983， J. Biol.Chem.，258，4715-4724 ；Bates&Schlabach, 1973，J. Biol.Chem.，248，3228-3232)。 或者，轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品可以在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中互相比較，例如，通過血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)照，比較兩個(gè) 未標(biāo)記的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的抑制放射性標(biāo)記鐵攝入的能力。 對(duì)于從標(biāo)記的二鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵-55攝入，用包含HEPES緩沖液和lmg/ml牛血清 白蛋白的無血清培養(yǎng)基洗滌在標(biāo)準(zhǔn)條件下(碳酸氫鹽緩沖液，5% CO2，抗生素，10%胎牛血 清)于RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的K562紅白血病細(xì)胞，并且在次培養(yǎng)基中以1000萬細(xì)胞/ ml的濃度使用。測(cè)試的樣品應(yīng)該以與脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白相等的摩爾濃度制備?？梢允褂冒?基三乙酸鐵作為鐵源，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)過程用鐵加載轉(zhuǎn)鐵蛋白。更高濃度的對(duì)照蛋白質(zhì)或各個(gè)用 55Fe標(biāo)記的測(cè)試蛋白質(zhì)樣品(0、25、100、200、400、800、1600nM)，應(yīng)該與25 μ 1培養(yǎng)基混合， 并通過加入300 μ 1細(xì)胞懸浮液而開始反應(yīng)。應(yīng)該在過量百倍的未標(biāo)記鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白存在的 情況下進(jìn)行第二個(gè)系列的平行實(shí)驗(yàn)用于考察(accountfor)非特異性結(jié)合。在37°C 25分鐘 后，通過浸入冰浴而停止反應(yīng)，將60 μ 1細(xì)胞懸浮液的三個(gè)等分試樣轉(zhuǎn)移至新試管中并在 低溫離心細(xì)胞，并在加入鄰苯二甲酸二乙酯/鄰苯二甲酸二丁酯的油層之后再次在低溫離 心細(xì)胞。應(yīng)去除上清，將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至計(jì)數(shù)瓶中并用0. 5Μ K0H+1% Triton X-100裂解。 裂解液應(yīng)在過夜裂解后用IM HCl中和，并與Readysolv閃爍混合物(cocktail)混合，并在 Packard Liquid Scintillation Counter 中計(jì)數(shù)。結(jié)果可以用 fmol55Fe/百萬細(xì)胞表示， 并且可用于計(jì)算轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的解離常數(shù)(Kd)。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，可將更高濃度的對(duì)照二鐵蛋白質(zhì)和測(cè)試二鐵蛋白質(zhì)樣品(0、25、 100、200、400、800、1600nM)與25 μ 1培養(yǎng)基中的用55Fe標(biāo)記的IOOnM天然二鐵血漿轉(zhuǎn)鐵蛋 白混合。并通過加入300 μ 1細(xì)胞懸浮液而開始反應(yīng)。在37°C 25分鐘后，通過浸入冰浴而停 止反應(yīng)，將60 μ 1細(xì)胞懸浮液的三個(gè)等分試樣轉(zhuǎn)移至新試管中并在低溫離心細(xì)胞，并在加 入鄰苯二甲酸二乙酯/鄰苯二甲酸二丁酯的油層之后再次在低溫離心細(xì)胞。去除上清，將 細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至計(jì)數(shù)瓶中并用0.5Μ K0H+1% Triton X-100裂解。裂解液在過夜裂解后用 IM HCl 中和，與 Readysolv 閃爍混合物混合，并在 Packard LiquidScintillation Counter中計(jì)數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果突變體具有對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)性能的至少 50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或基本上 100% (和，任選地，不超過對(duì)照轉(zhuǎn)鐵蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)性能的150%、140%、130%、120%、 110%、105%、104%、103%,102%,101%或基本上100% )，認(rèn)為對(duì)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白 突變體序列的重組蛋白中的轉(zhuǎn)鐵蛋白序列所進(jìn)行以防止突變體的糖基化的突變基本上不 降低突變體的生物功能。可以通過Keenan等，2006，Cytotechnology，51，29-37所述的方 法確定細(xì)胞培養(yǎng)性能，所述方法通過提述并入本文。如本文所使用的，術(shù)語“保守的”氨基酸取代指在相同組中進(jìn)行的取代，其通?；?本不影響蛋白質(zhì)功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用下圖確定保守的氨基酸取代_ 在另一個(gè)實(shí)施方案中，“保守的”氨基酸取代指在相同組中進(jìn)行的取代，如在堿性 氨基酸組(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基 酸組(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨 基酸組(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸 和甲硫氨酸)中進(jìn)行的取代。因此，例如，Ser415的保守取代包括甘氨酸或丙氨酸。Thr613的保守取代包括甘 氨酸、丙氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸。Asn413和/或Asn611的保守取代包括谷氨酰胺和天冬氨酸。非保守取代包括一組中的氨基酸由另一組中的氨基酸取代。例如，非保守取代包 括用極性氨基酸取代疏水性氨基酸。可以產(chǎn)生多核苷酸(如DNA或RNA分子)，其包含編碼蛋白質(zhì)的序列，所述蛋白質(zhì) 包含如上由本發(fā)明第一、第二或第三方面中任一方面所限定的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的序列。其可以是編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)包含重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的序列。 編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的蛋白質(zhì)的基因，其包含編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體 序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列(通常根據(jù)任何給出的生物體的標(biāo)準(zhǔn)密碼子選擇)，指定開 放閱讀框(“0RF”)?；蚩梢灶~外地包含一些不編碼開放閱讀框的多核苷酸序列(稱為 “非編碼區(qū)”)。基因中的非編碼區(qū)可以包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，其與ORF可操作地連接，允許 開放閱讀框的轉(zhuǎn)錄和/或得到的轉(zhuǎn)錄本的翻譯。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”指調(diào)節(jié)(即，促進(jìn)或減少)與其可操作連接的ORF的表達(dá)(即， 轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的序列。調(diào)節(jié)區(qū)通常包括啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等。技術(shù)人員 應(yīng)理解的是，調(diào)節(jié)區(qū)的選擇依賴于意欲表達(dá)的系統(tǒng)。例如，啟動(dòng)子可為組成型或誘導(dǎo)型的， 并且可為細(xì)胞或組織類型特異性或非特異性的。合適的調(diào)節(jié)區(qū)，可以長(zhǎng)為5bp、10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、 50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、lOObp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、220bp、240bp、 260bp、280bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、 800bp、850bp、900bp、950bp、lOOObp、llOObp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp 或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員承認(rèn)，編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的基因還可以 包含非編碼區(qū)和/或調(diào)節(jié)區(qū)。這些非編碼區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)不限于通常與分子伴侶ORF相關(guān)的天 然非編碼區(qū)和/或調(diào)節(jié)區(qū)。當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)(即宿主細(xì)胞)是酵母如釀酒酵母時(shí)，對(duì)于釀酒酵母合適的啟動(dòng)子包 括與 PGKl 基因，GALl 或 GAL10 基因，TEFl，TEF2, PYKl，PMAl，CYCl，PH05, TRPl，ADHl，ADH2, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡 萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖激酶的基因，α "交配因子信息素，a-交配因子信息素相關(guān)的那些啟動(dòng) 子，PRBl啟動(dòng)子，PRAl啟動(dòng)子，GPDl啟動(dòng)子，和涉及5’調(diào)節(jié)區(qū)部分與其它啟動(dòng)子的5’調(diào)節(jié) 區(qū)部分或與上游活化位點(diǎn)形成的雜合體的雜合啟動(dòng)子(例如EP-A-258067的啟動(dòng)子)。合適的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)在本領(lǐng)域中公知。當(dāng)宿主細(xì)胞是真核生物時(shí)，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) 優(yōu)選源自真核基因的3’側(cè)翼序列，其包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化的正確信號(hào)。合適的3’側(cè)翼 序列可以，例如，是與使用的表達(dá)調(diào)控序列天然連接的基因的那些，即可以對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子。 或者，它們可以不同。在這種情況下，并且當(dāng)宿主是酵母，優(yōu)選釀酒酵母時(shí)，則優(yōu)選釀酒酵母 ADH1、ADH2、CYC1或PGKl基因的終止信號(hào)。對(duì)于啟動(dòng)子和編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的基因的開放閱讀框來 說，有益的是側(cè)翼為轉(zhuǎn)錄終止序列，使得轉(zhuǎn)錄終止序列位于啟動(dòng)子和開放閱讀框的上游和 下游，以防止轉(zhuǎn)錄通讀入任何相鄰基因如2 μ m基因中，反之亦然。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母如釀酒酵母中有利的調(diào)節(jié)序列包括酵母啟動(dòng)子(例如 釀酒酵母PRBl啟動(dòng)子)JnEP 431880中所教導(dǎo)的；和轉(zhuǎn)錄終止子，優(yōu)選來自酵母屬ADHl的 終止子，如EP 60057中所教導(dǎo)的。對(duì)于非編碼區(qū)有益的是，并入多于一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄終止密碼子如UAA、UAG或UGA的 DNA序列以將翻譯通讀降至最少，從而避免產(chǎn)生延長(zhǎng)的非天然融合蛋白質(zhì)。優(yōu)選翻譯終止密 碼子UAA。術(shù)語“可操作地連接”包括這樣的意義調(diào)節(jié)序列定位于基因中任何非編碼區(qū)中，使得其與ORF形成關(guān)系以允許調(diào)節(jié)區(qū)以期望的方式作用于ORF上。因此調(diào)節(jié)區(qū)“可操作地 連接”于以這種方式定位的0RF，使得調(diào)節(jié)區(qū)能在與調(diào)節(jié)序列相容的條件下，以期望的方式 影響ORF的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白是分泌的。在這 種情況下，編碼分泌前導(dǎo)序列的序列可以包括在開放閱讀框中。因此，根據(jù)本發(fā)明第四方面 的多核苷酸可包含編碼重組蛋白的序列，所述重組蛋白包含與編碼分泌前導(dǎo)序列的多核苷 酸序列可操作連接的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列。前導(dǎo)序列通常，盡管并不必需，位于ORF的初級(jí) 翻譯產(chǎn)物的N末端，并且通常，盡管并不必需，在分泌過程中從蛋白質(zhì)切掉，以產(chǎn)生“成熟” 蛋白質(zhì)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在前導(dǎo)序列的上下文中的術(shù)語“可操作地連接”包括這 樣的意義編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的序列在其5’端并以符合讀框的方 式(in frame)連接至編碼分泌前導(dǎo)序列的多核苷酸序列的3’端。或者，編碼分泌前導(dǎo)序 列的多核苷酸序列可以符合讀框的方式位于包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的編碼 序列中，或者位于包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的編碼序列的3’端。很多天然或人工多肽前導(dǎo)序列(也稱作分泌前區(qū)域和前區(qū)域/區(qū)域原)已用于開 發(fā)用于分泌來自宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)。前導(dǎo)序列指導(dǎo)初生蛋白質(zhì)朝向?qū)⒌鞍踪|(zhì)從細(xì)胞輸出至 周圍培養(yǎng)基或在有些情況下輸出至周質(zhì)空間中的細(xì)胞機(jī)器。為了在真核菌種如酵母釀酒酵母、接合酵母菌種、乳酸克魯維酵母和巴斯德畢赤 酵母中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，已知的前導(dǎo)序列包括來自釀酒酵母酸性磷酸酶蛋白質(zhì)(Pho5p)(參見 EP 3664o0)、轉(zhuǎn)化酶蛋白質(zhì)(Suc2p)(參見 Smith 等(1985) Science, 229，1219—1224)和熱 沖擊蛋白-150(Hspl50p)(參見WO 95/33833)的那些。此外，已經(jīng)使用了來自釀酒酵母交 配因子α-l蛋白質(zhì)(MFa-I)和來自人溶菌酶和人血清白蛋白(HAS)蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列， 后者已經(jīng)特別地用于(盡管不是專用于)分泌人白蛋白。WO 90/01063公開了 MFa-I和 HAS前導(dǎo)序列的融合體。此外，天然轉(zhuǎn)鐵蛋白前導(dǎo)序列可以或者可以不用于指導(dǎo)包含轉(zhuǎn)鐵蛋 白突變體序列的重組蛋白的分泌。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，可將根據(jù)本發(fā)明第五方面的多核苷酸整合入質(zhì)粒。技術(shù) 人員應(yīng)理解的是，可以使用任何合適的質(zhì)粒，如著絲粒質(zhì)粒。其它合適的質(zhì)粒包括酵母相容 的基于2 μ m的質(zhì)粒。WO 2005/061718提供了對(duì)于合適質(zhì)粒的完整描述，其內(nèi)容通過提述并 入本文。此外，也如WO 2005/061718中所公開的，質(zhì)?？梢园幋a分子伴侶的基因，如蛋 白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)，用于與包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒編碼基因共 表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明第五和第六方面的多核苷酸或質(zhì)粒可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可 以是任何類型的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是或者可以不是動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、鳥類、昆蟲等)、植 物、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌和真菌如酵母宿主細(xì)胞可以是或者可以不是優(yōu)選的。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，如酵母屬、克魯維酵母屬或畢赤酵母屬 的成員，如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母和膜蹼畢赤酵母，或魯氏接合酵母， 拜耳接合酵母，發(fā)酵接合酵母，多形漢遜酵母(也稱作安格斯畢赤酵母)或果蠅克魯維酵母 是優(yōu)選的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，如黑曲霉、米曲霉、木霉屬、鑲片鐮 孢、安格斯畢赤酵母或多形漢遜酵母。
可為特別有利的是使用在一種或多種涉及蛋白質(zhì)0-糖基化的蛋白質(zhì)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶中有缺陷(例如通過破壞基因編碼序列得到)的宿主細(xì)胞如酵母宿主細(xì)胞。WO 94/04687公開了在一種或多種PMT基因中有缺陷的酵母菌株，并且在WO 2005/061718中進(jìn) 一步進(jìn)行了討論，文獻(xiàn)內(nèi)容通過提述并入本文?；蛘?，能在存在抑制PMT基因之一的活性的 化合物存在的情況下培養(yǎng)酵母(Duffy等，“Inhibition of protein mannosyltransferase 1 (PMTl) activity in the pathogenic yeastCandida albicans，，，International Conference on Molecular Mechanisms of Fungal Cellffall Biogenesis,26_31August 2001，Monte Verita, Switzerland,海報(bào)摘要(PosterAbstract)P38 ；海報(bào)摘要可以在 http://www. micro, biol. ethz. ch/cellwall/ 瀏覽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以過表達(dá)分子伴侶，如PDI或另一種分子伴侶，如 WO 2005/061718,WO 2006/067511或WO 2006/136831中討論的，每篇文獻(xiàn)的內(nèi)容通過提述 并入本文。例如，除了分子伴侶的內(nèi)源拷貝之外，宿主細(xì)胞可以包含分子伴侶(例如PDI) 基因的一個(gè)或多個(gè)額外的染色體拷貝，或者可(例如)經(jīng)過遺傳修飾，以引起內(nèi)源分子伴侶 (例如PDI)基因過表達(dá)。轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞的合適方法在本領(lǐng)域中公知，并且包括，例如使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (如慢病毒載體)。Wolkowicz 等，2004，Methods Mol. Biol.，246，391-411 描述了慢病毒 載體將重組核酸序列傳遞至哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的用途。FaSSler，2004， EMBORep. ,5(1), 28-9綜述了慢病毒轉(zhuǎn)基因載體及其在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)產(chǎn)生中的用途。關(guān)于脊椎 動(dòng)物細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞的試劑，例如磷酸鈣和DEAE-右旋糖酐或脂質(zhì)體配制物，可由 StratageneCloning Systems 或 Life Technologies Inc. , Gaithersburg, MD 20877, USA 得到。對(duì)于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，參見，例如，Cohen等(1972)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69，2110 禾口 Sambrook 等(2001)Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第 3 版· Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY。在 Sherman 等(1986)Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor，NY中描述了酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。也可以用Beggs (1978) Nature275， 104-109的方法。用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母的方法通常在EP 251744、EP 258067和WO 90/01063 中教導(dǎo)，全部文獻(xiàn)通過提述并入本文。電穿孔也可以用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且在本領(lǐng)域中公知可用于轉(zhuǎn)化真菌(包括酵母) 細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和動(dòng)物(包括脊椎動(dòng)物)細(xì)胞。用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法 公開于 Becker&Guarente (1990) Methods Enzymo 1. 194，182 中。如上所述的多核苷酸或質(zhì)粒，可以通過上述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入宿主。通常，多核苷酸或 質(zhì)粒不會(huì)轉(zhuǎn)化所有宿主，并且因此需要選擇已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。因此，多核苷酸或質(zhì)粒可以 包含選擇性標(biāo)記，包括但不限于細(xì)菌選擇性標(biāo)記和/或酵母選擇性標(biāo)記。通常的細(xì)菌選擇 性標(biāo)記是內(nèi)酰胺酶基因，盡管本領(lǐng)域中已知很多其它標(biāo)記。通常的酵母選擇性標(biāo)記包 括 LEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、ΜΕΤ15、LYS5、LYS2、ILV2、FBAl、PSEl、 PDIl 和 PGKl。一種選擇技術(shù)涉及將DNA序列標(biāo)記(及任何必要的調(diào)控元件)并入多核苷酸或質(zhì) 粒中，所述標(biāo)記在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中編碼可選擇的性狀。這些標(biāo)記包括針對(duì)真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶、G418、新霉素或博萊霉素(zeocin)抗性，和針對(duì)培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌 的四環(huán)素、卡那霉素、氨芐青霉素(即內(nèi)酰胺酶)或博萊霉素抗性基因。博萊霉素抗性 載體可由Invitrogen得到。或者，這些可選擇性狀的基因可以在另一個(gè)載體上，該載體用 于共轉(zhuǎn)化期望的宿主細(xì)胞。另一種鑒定成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法涉及培養(yǎng)由于導(dǎo)入多核苷酸或質(zhì)粒而得到的細(xì) 胞，任選地允許表達(dá)重組多肽(即由質(zhì)粒上的多核苷酸序列編碼的多肽，并且對(duì)于宿主細(xì) 胞是異源的，意味著該多肽不是由宿主天然產(chǎn)生的)。重組多肽可以是或者可以不是本發(fā)明 的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白?？梢允斋@并裂解細(xì)胞，并使用如S0uthern(1975) J. Mol. Biol. 98，503或Berent等(1985) Biotech. 3,208所述的方法或本領(lǐng)域常用的其它 DNA和RNA分析方法，檢查其中DNA或RNA內(nèi)容物中是否存在重組序列。或者，可以使用抗 體檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中多肽的存在。除了直接測(cè)定是否存在重組DNA之外，當(dāng)重組DNA能指導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)，可以通 過公知的免疫方法確認(rèn)轉(zhuǎn)化是否成功。例如，用表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生表現(xiàn)出合適 抗原性的蛋白質(zhì)。收獲懷疑被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞樣品，并使用合適的抗體測(cè)定蛋白質(zhì)。
在選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可以在允許表達(dá)所述包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組 蛋白的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞?？紤]到本文中公開的教導(dǎo)，適當(dāng)?shù)臈l件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的。培養(yǎng)基可以是非選擇性的或?qū)⑦x擇壓力施加于維持本發(fā)明的第四或第五方面的多肽 或質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。因此產(chǎn)生的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白可以存在于細(xì)胞內(nèi)，或者，如果 分泌，則存在于培養(yǎng)基和/或宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間。因此可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行另外的從已培養(yǎng) 宿主細(xì)胞、重組生物體或培養(yǎng)基分離表達(dá)的重組蛋白的步驟?！皬囊雅囵B(yǎng)宿主細(xì)胞、重組生物體或培養(yǎng)基分離表達(dá)的重組蛋白”的步驟任選地包 含細(xì)胞固定化、細(xì)胞分離和/或細(xì)胞裂解，但是總是包含至少一個(gè)不同于細(xì)胞固定化、分離 和/或裂解步驟的其它純化步驟。細(xì)胞固定化技術(shù)，如使用海藻酸鈣珠裝入(encase)細(xì)胞，在本領(lǐng)域中公知。相似 地，細(xì)胞分離技術(shù)，如離心、過濾(例如錯(cuò)流過濾、膨脹床色譜等)在本領(lǐng)域中公知。相似地， 細(xì)胞裂解的方法，包括珠磨、超聲處理、酶處理等，在本領(lǐng)域中公知?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)回收表達(dá)的重組蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含轉(zhuǎn)鐵蛋 白突變體序列的已表達(dá)重組蛋白由宿主分泌，通過離心和收集上清而從細(xì)胞培養(yǎng)基回收， 以得到部分純化的重組蛋白。可以通過一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)純化步驟，從上清進(jìn)一步純化部分純化 的重組蛋白。用于純化轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法在例如US 5，986，067、US6，251，860、US 5，744，586 和US 5，041，537中公開。盡管這些文獻(xiàn)中一些涉及從血漿而不是從重組宿主細(xì)胞純化轉(zhuǎn) 鐵蛋白，但是可以應(yīng)用其中使用的一些步驟。此外，可以使用已發(fā)現(xiàn)可用于純化蛋白質(zhì)的任 何已知的技術(shù)。合適的方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸或溶劑提取，陰離子或陽離子交換層 析，磷酸纖維素層析，疏水性相互作用層析，親和層析，羥磷灰石層析，凝集素層析，濃縮，稀 釋，PH調(diào)整，滲濾(diafiltration)，超濾，高效液相色譜(“HPLC” )，反相HPLC，電導(dǎo)率調(diào) 整等。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用一個(gè)或多個(gè)離子交換步驟。例如，可以使用陽離 子交換步驟，所述步驟相對(duì)于包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的重組蛋白以主動(dòng)或被動(dòng)模式進(jìn)行，任選地之后進(jìn)行(有或沒有中間的純化步驟)陰離子交換步驟，所述步驟相對(duì)于包含轉(zhuǎn)鐵蛋 白突變體的重組蛋白以主動(dòng)或被動(dòng)模式進(jìn)行，或者反之亦然。因此可以以無鐵(即“脫輔基”)形式，提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的由此分離 的重組蛋白，作為包含脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，或者可以使用本領(lǐng)域已知 的技術(shù)進(jìn)行全鐵化(即用Fe3+離子飽和)，以產(chǎn)生包含全_轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋 白。最后產(chǎn)生的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的制備物可以部分或全部全鐵化。例 如，它可具有少于 99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、14%、 13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或基本上0%的鐵結(jié)合能 力。可以通過，例如EP 1094835B1的方法確定鐵結(jié)合能力(參見49-51段，所述內(nèi)容通過 提述并入本文)。 可以進(jìn)一步操作包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的分離的重組蛋白，以改變其濃度或 環(huán)境，例如使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)如超濾和滲濾。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以約io_4g.
Olg. 02g. 03g. 04g. 05g. 06g. 07g. L—1、 0. 08g. 09g. lg. 2g. 3g. 4g. 5g. 6g. 7g. L—1、 0. 8g. L \0. 9g. L \ lg. L \2g. L \3g. L \4g. L \5g. L \6g. L \7g. L \8g. L \9g. L \ IOg. r\l5g. r\20g. r\25g. r\30g. r\40g. L_\50g. L_\60g. U\70g. U\70g. L_\90g. Γ1、 IOOg. r\l50g. r\200g. L"\250g.廠\300g. L"\350g.廠\400g. L"\500g.廠\600g. I/1、 700g. r\800g. r\900g. L^UOOOg. L—1或更高的濃度提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的分離 的重組蛋白。I-IOOg. Γ1，如 10-50g. r\l5-25g. Γ1 或 18_22g. Λ例如約 20g. Γ1 的濃度可 為優(yōu)選的。包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的分離的重組蛋白還可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)滅菌， 如0. 22 μ m過濾。通過相對(duì)粗糙的純化方法可以獲得商業(yè)或工業(yè)可接受的純度水平，通過所述方 法，將包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白制成適用于其期望目的的形式。已純化至商業(yè) 或工業(yè)可接受的純度水平的蛋白質(zhì)制備物，除了包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白之 夕卜，還可包含例如細(xì)胞培養(yǎng)組分如宿主細(xì)胞或由其得到的碎片?；蛘?，高分子量組分(如宿 主細(xì)胞或由其得到的碎片)可以或者可以不去除(如通過過濾或離心進(jìn)行)而獲得包含重 組蛋白的組合物，所述蛋白質(zhì)包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列和，任選的功能上可接受水平的源 自細(xì)胞培養(yǎng)過程的低分子量污染物。包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的分離的重組蛋白可以純化或者可以不純化而實(shí)現(xiàn)醫(yī) 藥上可接受的純度水平。如果蛋白質(zhì)基本上不含致熱源(pyrogen)并且能以醫(yī)藥有效量施 用而不會(huì)引起與蛋白質(zhì)活性無關(guān)的醫(yī)學(xué)效果，則所述蛋白質(zhì)具有在醫(yī)藥上可接受的純度水 平。得到的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的分離的重組蛋白可以用于其已知的任何用途， 包括對(duì)患者靜脈注射以治療各種病癥，和補(bǔ)充培養(yǎng)基，和作為其它蛋白質(zhì)的配制物中的賦 形劑。本發(fā)明的分離的重組蛋白可以使用本領(lǐng)域公知的方法配制成醫(yī)藥組合物，并施 用用于治療已知可由轉(zhuǎn)鐵蛋白(如血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白)治療的適應(yīng)癥?？梢栽诿绹?guó)專利申請(qǐng) 10/405,612中找到作為轉(zhuǎn)鐵蛋白已知的臨床用途的實(shí)例。
本發(fā)明的分離的重組蛋白還可用于具有轉(zhuǎn)鐵蛋白的已知用途的應(yīng)用，如普通醫(yī)療用途、涂層和生物材料。其中可使用本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物材料的實(shí)例在Ghosh等(2008) Angew. Chem. Int. Ed 47,2217-2221 中提及。本發(fā)明的方法可以或者可以不進(jìn)一步包括用載體或稀釋劑配制包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突 變體序列的分離的重組蛋白和任選的以單位劑量形式提供由此配制的蛋白質(zhì)的步驟。盡管由本發(fā)明過程獲得的、包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的分離的重組蛋白可能單獨(dú) 施用，但是優(yōu)選將其連同一種或多種可接受的載體或稀釋劑作為醫(yī)藥配制物提供。載體或 稀釋劑必須是“可接受的”，表示與期望的蛋白質(zhì)相容，并且對(duì)于其接受者無害。通常，載體 或稀釋劑是水或鹽水，其是無菌的并且不含致熱源。任選地，由此配制的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白以單位制劑形式，如以 片劑、膠囊、注射溶液等形式提供?；蛘撸景l(fā)明的方法可以或者可以不進(jìn)一步包括將由此獲得的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變 體序列的分離的重組蛋白凍干的步驟。如上所討論的，本發(fā)明的第十方面提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含根 據(jù)本發(fā)明第一、第二、第三或第四方面的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白和一個(gè)或多 個(gè)選自下組的組分谷氨酰胺、胰島素、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、維生素、脂蛋白、脂肪酸、 氨基酸、亞硒酸鈉、蛋白胨、胰島素樣生長(zhǎng)因子和抗氧化劑。在本發(fā)明第十方面的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)包含轉(zhuǎn) 鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和一個(gè)或多個(gè)選自下組的組分胰島素、亞硒酸鈉、谷氨酰 胺、白蛋白、蛋白胨、乙醇胺、胎球蛋白、維生素、脂蛋白、脂肪酸、胰島素樣生長(zhǎng)因子和氨基 酸。組合物可以包含，例如，0.0001-10 %,0. 0005-7. 5 %,0. 001-5. 0 %,最特別為 0. 05-3.0% (w/v)的根據(jù)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白。組合物可以包含0. 001-1000mg/L,更特別為0. 01_500mg/L，甚至更特別為 0. 01-100mg/L并且最特別為0. 04-10mg/L的白蛋白。白蛋白可以是重組白蛋白，在此情況 中其優(yōu)選獲得自無血清來源并在將其加入組合物之前基本上不含任何其它源自動(dòng)物的蛋 白質(zhì)，例如如WO 2000/044772中所公開的，所述文獻(xiàn)內(nèi)容通過提述并入本文。組合物可以包含0. 01-1000mg/L,更特別為0. 01_500mg/L，甚至更特別為 0. l-100mg/L，如l_50mg/L，并且最特別為4_20mg/L的胰島素。胰島素可以是重組胰島素， 在此情況中其優(yōu)選獲得自無血清來源并在將其加入組合物之前基本上不含任何其它源自 動(dòng)物的蛋白質(zhì)。組合物可以包含0. 0001-10mg/L,更特別為0. 005-7. 5mg/L,甚至更特別為 0. 1-5. 0mg/L并且最特別為0. 75-3. 5mg/L的脂蛋白。脂蛋白可以是重組脂蛋白，在此情況 中其優(yōu)選獲得自無血清來源并在將其加入組合物之前基本上不含任何其它源自動(dòng)物的蛋 白質(zhì)。組合物可以包含0. 00001-50mg/L的IGF，更特別為0. 001-5. 0mg/L,甚至更特別為 0. 01-1. 0mg/L,并且最特別為0. 04-0. 2mg/L的IGF。IGF可以是重組IGF，在此情況中其優(yōu) 選獲得自無血清來源并在將其加入組合物之前基本上不含任何其它源自動(dòng)物的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明第十方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；(iii)胰島素；(iv)亞硒酸鈉；和/或(ν)白蛋白。組合物可以包含至少2,2. 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5 或 9mg/ml 白蛋白(任選的，如上所討論的重組白蛋白)；至少3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,7. 0、 10,15或20 μ g/ml本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；約5. 5,6. 0,6. 5,7. 0、
7.5,8. 0,8. 5,9. 0,9. 5、10、10. 5、11、11. 5、12、15 或 20 μ g/ml 胰島素(任選的，如上所討論 的重組胰島素)；至少 1、2、3、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5,6. 7,7. 0,7. 5,8. 0,9. 0、10、 15或20 μ g/ml亞硒酸鈉。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可以包含約4mg/ml白蛋 白；約5. 5μ g/ml本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；約 ομ g/ml胰島素；約 6. 7 μ g/ml亞硒酸鈉。
在本發(fā)明第九方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)白蛋 白(任選的，如上所討論的重組白蛋白)；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰島素(任選的，如上所討 論的重組白蛋白)；(ν)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或(vi)乙醇 胺。組合物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可以包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOmM谷氨酰胺；約0. 1,0.2, 0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、2、3、4、5、6、7 或 8% (w/v)白蛋白；約 1、2、3、4、5、6、7、
8、9、9·5、10、10. 5、11、11. 5、12、13、14、15、16、17、18、19、20mg/L 胰島素；約 0· 1、0· 2,0. 3、 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,0. 95、1、1· 5、2、2· 5、3、4、5、6 或 7mg/L 本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白 突變體序列的重組蛋白；和約 1、2、3、4、5、6、7、8、8. 5、9、9· 5、10、10· 5、11、11· 5、12、13、14、 15、16、17、18、19 或 20μΜ 乙醇胺。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可以包含約4mM谷氨酰 胺；約0. 5%白蛋白；約10mg/L胰島素；約lmg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組 蛋白；和/或約10 μ M乙醇胺。在本發(fā)明第九方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可包含(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)白 蛋白(任選的，如上所討論的重組白蛋白)；和一種或多種選自下組的下述組分(iii)谷 氨酰胺；(iv)胰島素(任選的，如上所討論的重組胰島素)；(ν)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突 變體序列的重組蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOmM谷 氨酰胺；約 0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5,3. 5 至 5、5 至 10,10 M 20% (w/v)白蛋白；約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、9· 5、10、10· 5、11、11· 5、12、13、14、15、16、17、 18,19 或 20mg/L 胰島素；和或約 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,0. 95、1、1· 5、2、 2. 5、3、4、5、6或7mg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白。在一個(gè)特定的實(shí)施 方案中，組合物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含約4mM谷氨酰胺，約(w/v)白蛋白，約10mg/L胰島 素，和/或約lmg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白。在本發(fā)明第九方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)谷氨 酰胺；(iii)重組白蛋白(任選的，如上所討論的重組白蛋白)；(iv)胰島素(任選的，如上 所討論的重組胰島素)；和/或(ν)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或 (vii)蛋白胨。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOmM谷氨酰胺；約 0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5,3. 5 至 5、5 至 10,10 至 20% (w/ ν)白蛋白；約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、9· 5,10,10. 5、11、11· 5、12、13、14、15、16、17、18、19 或20mg/L 胰島素；約 O. 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、0· 95、1、1· 5、2、2· 5、3、4、5、6 或7mg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或約0. 01、0. 02、0. 03,0. 04、 0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、0. 09、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、1、2 或 3% (w/v)蛋白胨。在一個(gè)特定 的實(shí)施方案中，組合物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可包含約4mM谷氨酰胺，約(w/v)重組白蛋白， 約10mg/L胰島素，約lmg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，和/或約0. 1 % (w/v)蛋白胨。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，蛋白胨或蛋白胨混合物是蛋白質(zhì)水解物，其獲得自水解 的動(dòng)物或植物 蛋白質(zhì)。蛋白胨可以源自屠宰場(chǎng)的動(dòng)物副產(chǎn)品、純化的明膠或植物材料。來 自動(dòng)物或植物來源的蛋白質(zhì)可以使用酸、熱或多種酶制備物水解。能使用的蛋白胨混合物 包括SPY蛋白胨、“Primatone RL”和/或“Primatone HS”，后兩者均為商業(yè)上可得到的 (Sheffield, England 或 QuestInternational (IPL :5X59051)，PRIMATONE RL)。或 者，蛋白胨可以產(chǎn)生自非動(dòng)物來源的產(chǎn)品，如源自植物的蛋白胨。在本發(fā)明第九方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)谷氨 酰胺；(iii)白蛋白(任選的，如上所討論的重組白蛋白)；(iv)胰島素(任選的，如上所討 論的重組胰島素)；(ν)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或(vi)胎球蛋 白(如Pedersen)。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOmM谷 氨酰胺；約 0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5,3. 5 至 5、5 至 10,10 M 20% (w/v)白蛋白；約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、9· 5、10、10· 5、11、11· 5、12、13、14、15、16、17、 18,19 或 20mg/L 胰島素；約 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,0. 95、1、1· 5、2、2· 5、 3、4、5、6或7mg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或約2、3、4、5、6、7、 8、9、10、10· 5、11、11. 5、12、12. 5、13、13. 5、14、14. 5、15、16、17、18、19、20 μ g/ml 胎球蛋白。 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可包含約4mM谷氨酰胺，約 (w/v)白蛋白，約10mg/L胰島素，約lmg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白， 和/或約12. 5 μ g/ml胎球蛋白(如Pedersens)。在本發(fā)明第九方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)白蛋 白(任選的，如上所討論的重組白蛋白)；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰島素(任選的，如上所討 論的重組胰島素)；(ν)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或(vi)維生素 E0在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOmM谷氨酰胺；約0. 2、 0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5,3. 5 至 5、5 至 10、10 至 20% (w/v)白 蛋白；約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、9. 5,10,10. 5、11、11· 5、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20mg/L 胰島素；約 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,0. 95、1、1· 5、2、2· 5、3、4、5、6 或 7mg/ L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10微摩 爾維生素E。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可包含約4mM谷氨 酰胺，約(w/v)重組白蛋白，約10mg/L胰島素，約lmg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體 序列的重組蛋白，和/或約5 μ M維生素Ε。組合物可以包含約4mM谷氨酰胺，約1 % (w/v) 重組白蛋白，約10mg/L胰島素，約lmg/L本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，約 0. 1% (w/v)蛋白胨，約12. 5 μ g/mL胎球蛋白(如Pederson)，和/或約5 μ M維生素E。在另外的實(shí)施方案中，組合物可以包含WO 2005/070120的表1中列出的任何培養(yǎng) 基，所述文獻(xiàn)通過提述并入本文。在另一個(gè)實(shí)施方案中，無血清培養(yǎng)基是雜交瘤培養(yǎng)基，無動(dòng)物組分或 Ex-Cell (JRH Biosciences, Inc.)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供組合物用作細(xì)胞培養(yǎng)基，用來增加由培養(yǎng)基中培養(yǎng) 的細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)物如蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以將生物產(chǎn)物的產(chǎn) 量增加至少25%、30 %、50%、100 %、200%或300 %。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生的生物產(chǎn) 物可以是肽，如治療或診斷肽、多肽、蛋白質(zhì)、單克隆抗體、免疫球蛋白、細(xì)胞因子(如干擾 素)、整合素、抗原、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞循環(huán)蛋白、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、融合肽、血蛋白和/或 嵌合蛋白。產(chǎn)生的生物產(chǎn)物可以或者可以不包含選自包含以下的列表的生物產(chǎn)物4-1ΒΒ配 基、5-螺旋蛋白、人C-C趨化因子、人L105趨化因子、命名為huL1053的人L105趨化因子、 由Y-干擾素誘導(dǎo)的單核因子(MIG)、部分CXCR4B蛋白、血小板基礎(chǔ)蛋白(PBP)、α工-抗 胰蛋白酶、ACRP-30同源物；互補(bǔ)組分Clq C、腺樣表達(dá)的趨化因子(ADEC)、aFGF ；FGF-U AGF、AGF蛋白、白蛋白、依托泊苷、血管抑素、炭疽疫苗、對(duì)腦衰蛋白具有特異性的抗體、 antistasin、抗-TGF β家族抗體、抗凝血酶III、APM-I ；ACRP-30 ；Famoxin、載脂蛋白種類 (apo-lipoprotein species)、芳基硫酸酯酶 B、b57 蛋白、BCMA、β-凝血球蛋白(β-TG)、 bFGF ；FGF2、血凝因子、BMP 加工酶弗林蛋白酶、BMP-10, BMP-12, BMP-15, BMP-17, BMP-18、 BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2、降鈣素、鈣蛋白酶_10a、鈣蛋白 酶-10b、鈣蛋白酶-10c、癌癥疫苗、羧肽酶、C-C趨化因子、MCP2、CCR5變體、CCR7、CCR7、 CDlla Mab,CD137 ；4-1BB 受體蛋白、CD20Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30 配體、CD33 免疫毒素、 ⑶40、⑶40L、⑶52Mab、cerebus蛋白、趨化因子嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、趨化因子hIL_8、 趨化因子hMCPl、趨化因子hMCPla、趨化因子hMCPlb、趨化因子hMCP2、趨化因子hMCP3、趨 化因子hSDFlb、趨化因子MCP-4、趨化因子TECK和TECK變體、全長(zhǎng)和成熟趨化因子-樣蛋 白IL-8M1、全長(zhǎng)和成熟趨化因子-樣蛋白IL-8M10、趨化因子-樣蛋白質(zhì)IL-8M3、全長(zhǎng)和 成熟趨化因子_樣蛋白IL-8M8、全長(zhǎng)和成熟趨化因子-樣蛋白IL-8M9、全長(zhǎng)和成熟趨化因 子-樣蛋白PF4-414、全長(zhǎng)和成熟趨化因子-樣蛋白PF4-426、全長(zhǎng)和成熟趨化因子-樣蛋 白PF4-M2、霍亂疫苗、軟骨調(diào)節(jié)因子-樣蛋白、c-kit配體；SCF ；肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子；MGF ； 纖維肉瘤來源的干細(xì)胞因子、CNTF及其片段(如CNTFax: (Axokine ))、前和活性形式的凝 結(jié)因子、膠原、互補(bǔ)C5Mab、結(jié)締組織活化蛋白-III、CTAA16. 88Mab、CTAP-III, CTLA4_Ig、 CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3 ；CXC 趨化因子受體 3、cyanovirin-N、Darb印oetin (促紅血球 生成素)、指定的exodus、指定的huL1057、DIL-40、脫氧核糖核酸酶、EDAR、EGF受體Mab、 ENA-78、內(nèi)皮抑素、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、上皮嗜中性粒細(xì)胞活化蛋白-78、EPO受體； EP0R、紅細(xì)胞生成素(EPO)和EPO模擬物、Eutropin、Exodus蛋白、因子IX、因子VII、因 子 VIII、因子 X 和因子 XIII、FAS 配體抑制蛋白(DcR3)、FasL, FasL, FasL, FGF、FGF-12 ； 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子同源因子-I、FGF-15, FGF-16、FGF-18、FGF-3 ；INT-2、FGF-4 ；HST-I ； HBGF-4、FGF-5、FGF-6 ；肝素結(jié)合分泌轉(zhuǎn)化因子_2、FGF-8、FGF-9 ；神經(jīng)膠質(zhì)活化因子、纖維 蛋白原、flt-1、flt-3配體、濾泡刺激激素α亞基、濾泡刺激激素β亞基、促濾泡素、趨化 因子CX3(fractalkine)、肌原纖維蛋白肌鈣蛋白I、FSH、半乳糖苷酶、半乳凝素-4、G-CSF, GDF-1、基因療法、膠質(zhì)瘤來源的生長(zhǎng)因子、胰增血糖素、胰增血糖素-樣肽、葡糖腦苷脂酶、 葡萄糖氧化酶、 葡糖苷酶、妊娠相關(guān)蛋白-A(GlycodeIin-A)；與孕酮有關(guān)的子宮內(nèi)膜蛋白、 GM-CSF、促性腺激素、粒性白細(xì)胞趨化性蛋白-2(GCP-2)、粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)相關(guān)的致癌基因-α (GRO-α)、生長(zhǎng)相關(guān)的致癌基因-β (GRO-β)、生 長(zhǎng)相關(guān)的致癌基因_ Y (GRO- y )、hAPO-4 ；TROY、hCG、乙肝表面抗原、乙肝疫苗、HER2受體 Mab、水蛭素、HIV gpl20、HIV gp41、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV蛋白酶抑制 肽、HIV-I蛋白酶抑制物、HPV疫苗、人6CKine蛋白、人Act_2蛋白、人脂肪形成抑制因子、 人B細(xì)胞刺激因子_2受體、人β -趨化因子Η1305 (MCP-2)、人C-C趨化因子DGWCC、人CC 趨化因子ELC蛋白、人CC型趨化因子白介素C、人CCC3蛋白、人CCF18趨化因子、命名為 SLC(第二淋巴樣趨化因子)的人CC-型趨化因子蛋白、人趨化因子β _8短形、人趨化因 子ClO、人趨化因子CC-2、人趨化因子CC-3、人趨化因子CCR-2、人趨化因子Ck β -7、人趨化 因子ΕΝΑ-78、人趨化因子嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、人趨化因子GRO α、人趨化因子GROa、 人趨化因子GRO β、人趨化因子HCC-I、人趨化因子HCC-I、人趨化因子1-309、人趨化因子 1 -10、人趨化因子1^1053、人趨化因子1^1057、人趨化因子肌6、人趨化因子肌6-0蛋白、人 趨化因子MIP-I α、人趨化因子MIPl β、人趨化因子ΜΙΡ_3 α、人趨化因子MIP-3 β、人趨化 因子PF4、人趨化因子蛋白331D5、人趨化因子蛋白61164、人趨化因子受體CXCR3、人趨化 因子SDFl α、人趨化因子SDFl β、人趨化因子ZSIG-35、人Chrl9Kine蛋白、人CKbeta_9、 人CKbeta-9、人CX3C111氨基酸趨化因子、人DNAX白介素_40、人DVic-IC-C趨化因子、人 EDIRF I蛋白序列、人EDIRF II蛋白序列、人嗜曙紅細(xì)胞CC型趨化因子嗜酸細(xì)胞活化趨化 因子、人嗜曙紅細(xì)胞表達(dá)的趨化因子(EEC)、人快速顫搐骨骼肌肌鈣蛋白C、人快速顫搐骨 骼肌肌鈣蛋白I、人快速顫搐骨骼肌肌鈣蛋白亞基C、人快速顫搐骨骼肌肌鈣蛋白亞基I蛋 白、人快速顫搐骨骼肌肌鈣蛋白亞基T、人快速顫搐骨骼肌肌鈣蛋白T、胎兒脾臟表達(dá)的趨 化因子、FSEC、人GM-CSF受體、人gro-α趨化因子、人gro-β趨化因子、人gro-γ趨化因 子、人IL-16蛋白、人IL-1RD10蛋白序列、人IL-1RD9、人IL-5受體α鏈、人IL-6受體、 人IL-8受體蛋白hIL8RA、人IL-8受體蛋白hIL8RB、人IL-9受體蛋白、人IL-9受體蛋白 變體#3、人IL-9受體蛋白變體片段、人IL-9受體蛋白變體片段#3、人白介素1 δ、人白介 素10、人白介素10、人白介素18，、人白介素18衍生物、人白介素-1 β前體、人白介素-1 β 前體、人白介素-1受體輔助蛋白、人白介素-1受體拮抗劑β、人白介素-13-型受體、人 白介素-10 (前體)、人白介素-10 (前體)、人白介素-11受體、人白介素_1240kD亞基、人 白介素-12 β -1受體、人白介素-12 β -2受體、人白介素_12ρ35蛋白、人白介素_12ρ40蛋 白、人白介素-12受體、人白介素-13α受體、人白介素-13β受體、人白介素_15、來自Pl 克隆的人白介素-15受體、人白介素-17受體、人白介素-18蛋白(IL-18)、人白介素_3、 人白介素_3受體、人白介素_3變體、人白介素_4受體、人白介素_5、人白介素-6、人白介 素-7、人白介素_7、人白介素-8 (IL-8)、人胞內(nèi)IL-I受體拮抗劑、人ΙΡ-10和HIV_lgpl20 高可變區(qū)融合蛋白、人IP-10和人Muc-I核心表位(VNT)融合蛋白、人肝臟和活化調(diào)節(jié)趨 化因子(LARC)、人Lkn-I全長(zhǎng)和成熟蛋白、全長(zhǎng)和成熟的人乳腺相關(guān)趨化因子(MACK)蛋 白、人成熟趨化因子Cki3_7、人成熟gro-α、用于治療敗血癥(s印sis)的人成熟gro_Y多肽、人MCP-3和人Muc-I核心表位(VNT)融合蛋白、人MIlO蛋白、人MIlA蛋白、人單核 細(xì)胞化學(xué)引誘物因子hMCP-Ι、人單核細(xì)胞化學(xué)引誘物因子hMCP-3、人單核細(xì)胞趨化原蛋白 (MCPP)序列、人neurotactin趨化因子樣域、人非-ELR CXC趨化因子Hl74、人非-ELRCXC 趨化因子IP10、人非-ELR CXC趨化因子Mig、人PAI-I突變體、具有IL-16活性的人蛋白、 具有IL-16活性的人蛋白、人第二淋巴樣趨化因子(SLC)、人SISD蛋白、人STCP-I、人基質(zhì)細(xì)胞來源的趨化因子、SDF-1、人T細(xì)胞混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)表達(dá)的趨化因子(TMEC)、人胸腺和活化調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(TARC)、人胸腺表達(dá)的、人TNF- α、人TNF- α、人TNF- β (LT- α )、人 CC型趨化因子嗜酸細(xì)胞活化趨化因子3蛋白序列、人II型白介素-1受體、人野生型白介 素-4 (hIL-4)蛋白、人ZCHEM0-8蛋白、人源化的抗-VEGF抗體，及其片段，人源化的抗-VEGF 抗體，及其片段，透明質(zhì)酸酶、ICE IOkD亞基、ICE 20kD亞基、ICE 22kD亞基、艾杜糖醛 酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸酶、IL-I α、IL-I β、IL-I抑制劑(IL-Ii)、成熟IL_1、IL-10 受體、IL-IU IL-IU IL-12p40 亞基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15 受體、IL-17、IL-17 受體、 11-17 受體、11-17 受體、IL-19、IL-Ii 片段、ILl-受體拮抗劑、IL-21 (TIF)、含 IL-3 融合 蛋白、IL-3突變蛋白、IL-3變體、IL-3變體、IL-4、IL-4突變蛋白、IL-4突變蛋白Y124G、 IL-4突變蛋白Y124X、IL-4突變蛋白、11-5受體、IL-6、11-6受體、IL-7受體克隆、IL-8 受體、IL-9成熟蛋白變體(Metll7型)、免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或它們的片 段(例如小模塊 ImmunoPharmaceutical ( “SMIP，，)或 dAb、Fab，片段、F(ab，)2、scAb、 scFv或scFv片段)，包括但不限于血纖維蛋白溶酶原、流感疫苗、抑制素α、抑制素β、胰 島素、胰島素-樣生長(zhǎng)因子、整合素MabjBl α胰蛋白酶抑制劑、間α胰蛋白酶抑制劑、干 擾素Y誘導(dǎo)蛋白(IP-IO)、干擾素(如干擾素α種類和子種類，干擾素β種類和子種類， 干擾素Y種類和子種類)、干擾素(如干擾素α種類和子種類，干擾素β種類和子種類， 干擾素Y種類和子種類)、白介素6、白介素8(IL-8)受體、白介素8受體B、白介素-Ια、 白介素-2受體相關(guān)蛋白Ρ43、白介素-3、白介素-4突變蛋白、白介素-8 (IL-8)蛋白、白 介素-9、白介素-9(IL-9)成熟蛋白(Thrll7型)、白介素(如IL10、ILll和IL2)、白介素 (如IL10、ILll和IL2)、日本腦炎疫苗、Kalikrein抑制劑、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、Kunitz域 蛋白(如抑肽酶、淀粉樣前體蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋白，包含或不包含白蛋 白融合體)、Kimitz域蛋白(如抑肽酶、淀粉樣前體蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋 白，包含或不包含白蛋白融合體)、LACI、乳鐵蛋白、潛在TGF-β結(jié)合蛋白II、瘦素、肝臟表 達(dá)趨化因子-I(LVEC-I)、肝臟表達(dá)趨化因子-2 (LVEC-2)、LT-α、LT-β、黃體素化激素、萊 姆疫苗、淋巴細(xì)胞趨化因子、巨噬細(xì)胞來源的趨化因子類似物MDC (η+1)、巨噬細(xì)胞來源的趨 化因子類似物MDC-eyfy、巨噬細(xì)胞來源的趨化因子類似物MDC_yl、巨噬細(xì)胞來源的趨化因 子、MDC、巨噬細(xì)胞來源的趨化因子(MDC)、乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)；蛋白酶抑制 劑5、MCP-I受體、MCP-la, MCP-Ib, MCP-3、MCP-4受體、M-CSF、黑素瘤抑制蛋白、膜結(jié)合蛋 白、Metll7人白介素9、ΜΙΡ-3 α、ΜΙΡ-3 β、MIP-γ、MIRAP、修飾的Rantes、本文未描述的 單克隆抗體、MP52、突變白介素6S176R、肌原纖維蛋白收縮蛋白肌鈣蛋白I、鈉尿肽、神經(jīng)生 長(zhǎng)因子- β、神經(jīng)生長(zhǎng)因子- β 2、Neuropilin-U Neuropilin-2、Neurotactin、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋 白_3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白_4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白_4a、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白_4b、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4c、神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)蛋白-4d、嗜中性粒細(xì)胞活化肽-2(NAP-2)、N0G0-66受體、NOGO-A, NOGO-B, N0G0-C、命 名為PTEC的新β -趨化因子、N-末端修飾的趨化因子GroHEK/hSDF-Ι α、N-末端修飾的 趨化因子GroHEK/hSDF-Ι β、N-末端修飾的趨化因子met-hSDF-l α、N-末端修飾的趨化 因子 met-hSDF-1 β、0PGL、成骨蛋白-1 ；OP-I ；BMP-7、成骨蛋白-2、0X40 ；ACT-4、0X40L、催 產(chǎn)素(神經(jīng)垂體激素運(yùn)載蛋白I)、甲狀旁腺激素、Patched、Patched-2, PDGF-D、百日咳類 毒素、腦垂體表達(dá)的趨化因子(PGEC)、胎盤生長(zhǎng)因子、胎盤生長(zhǎng)因子_2、血纖維蛋白溶酶原 活化子抑制劑-1 ；PAI-1、血纖維蛋白溶酶原活化子抑制劑-2 ；PAI-2、血纖維蛋白溶酶原活化子抑制劑-2 ；PAI-2、血小板來源生長(zhǎng)因子、血小板來源生長(zhǎng)因子Bv-sis、血小板來源 生長(zhǎng)因子前體A、血小板來源生長(zhǎng)因子前體B、血小板Mab、血小板來源內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (PD-ECGF)、血小板來源生長(zhǎng)因子A鏈、血小板來源生長(zhǎng)因子B鏈、用于治療敗血癥的多肽、 前原載脂蛋白(Pr印roapolipoprotein) “米蘭”變體、前原載脂蛋白“巴黎”變體、前-凝血 酶、靈長(zhǎng)類動(dòng)物CC趨化因子〃 ILINCK"、靈長(zhǎng)類動(dòng)物CXC趨化因子〃 IBICK"、胰島素原、 催乳素、催乳素2、pr0Saptide、蛋白酶抑制肽、蛋白C、蛋白S、凝血酶原、尿激酶原、RANTES、 RANTES 8-68、RANTES 9_68、RANTES肽、RANTES受體、重組白介素-16、抵抗素、逆轉(zhuǎn)錄病毒 蛋白酶抑制劑、輪狀病毒疫苗、RSV Mab、分泌的和跨膜多肽、分泌的和跨膜多肽、血清膽堿 酯酶、血清蛋白(如凝血因子)、可溶BMP受體激酶蛋白-3、可溶VEGF受體、干細(xì)胞抑制因 子、葡萄球菌屬(Straphylococcus)疫苗、基質(zhì)來源的因子_1 α、基質(zhì)來源的因子_1 β、物 質(zhì) P (速激肽)、T1249 肽、Τ20 肽、Τ4 內(nèi)切核酸酶、TACI、Tarc、TGF- β 1、T GF- β 2、Thr 117 人 白介素9、凝血酶、促血小板生成素、促血小板生成素衍生物1、促血小板生成素衍生物2、促 血小板生成素衍生物3、促血小板生成素衍生物4、促血小板生成素衍生物5、促血小板生成 素衍生物6、促血小板生成素衍生物7、胸腺表達(dá)的趨化因子(TECK)、甲狀腺刺激激素、壁虱 抗凝肽、Tim-I蛋白、TNF-α前體、TNF-R、TNF-RII ；TNF ρ75受體；死亡受體、tPA、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、肌鈣蛋白肽、截短型單核趨化因子蛋白2 (6-76)、截短型單核趨化因子蛋 白2 (6-76)、截短型RANTES蛋白(3_68)、腫瘤壞死因子、尿酸氧化酶、尿激酶、加壓素(神 經(jīng)垂體激素運(yùn)載蛋白 II)、VEGF R-3 ；flt-4、VEGF 受體；KDR ；flk-1、VEGF-110, VEGF-12U VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E ； VEGF-X, von Willebrand因子、野生型單核細(xì)胞趨化因子蛋白2、野生型單核細(xì)胞趨化因子 蛋白2、ZTGF-β 9和它們的變體、片段和類似物。如上所討論的，本發(fā)明的第十一方面提供培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包 括在根據(jù)本發(fā)明第九方面的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基可以或者可以不 用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，或者作為用于雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞、病毒 產(chǎn)生細(xì)胞、轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、癌細(xì)胞和/或重組肽產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)基。組合物可以用于培養(yǎng)真核 細(xì)胞，如植物和/或動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、魚細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞 或鳥細(xì)胞。其它類型的細(xì)胞可以選自下組ΜΚ2.7細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)CRL1909，抗-鼠-VCAM IgGI表達(dá)型雜交瘤細(xì)胞)、ΗΕΚ 293細(xì)胞、PER-C6細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、5L8雜交瘤細(xì)胞、 Daudi 細(xì)胞、EL4 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、HL-60 細(xì)胞、K562 細(xì)胞、Jurkat 細(xì)胞、THP-I 細(xì)胞、Sp2/0 細(xì)胞；和/或WO 2005/070120表11(其通過提述并入本文)中列出的雜交瘤細(xì)胞，或本文 公開的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它細(xì)胞類型。基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以包含，但不限于Dulbecco修正Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、最小基本培 養(yǎng)基(MEM)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基 Eagle (BME)、RPMI 1640、F-10、F_12、α 最小基本培養(yǎng)基(α MEM)、 Glasgow最小基本培養(yǎng)基(G-MEM)，和/或Iscove修正Dulbecco培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供培養(yǎng)真核細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物可用 作本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基和/或在適于支持在培養(yǎng)物中培養(yǎng)細(xì)胞的條件下維持細(xì)胞。在一個(gè) 特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞是癌細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，提供培養(yǎng)組織外植體 (explant)的方法，包括將組織與本文所述細(xì)胞培養(yǎng)基組合物接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括將雜交瘤細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包括(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(ii)重組白蛋白；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰島素(任選的，如上所討論的重組胰島素)；(ν)本發(fā)明的包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；和/或(vi)乙醇胺，和/或 在適于支持在培養(yǎng)物中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的條件下維持雜交瘤細(xì)胞。在一個(gè)特定的實(shí)施方案 中，方法包括將雜交瘤細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包括(i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；( )約0. 5% (w/v)白蛋白；(iii)約4mM谷氨酰胺；(iv)約10mg/L胰島素；(ν)約lmg/L本發(fā)明的包含 轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白；(vi)約10 μ M乙醇胺?，F(xiàn)在將參照下述非限定性實(shí)施例和圖來例示本發(fā)明。附圖簡(jiǎn)述

圖1至10顯示實(shí)施例中提及的質(zhì)粒的多個(gè)質(zhì)粒圖譜。圖11顯示從包含pDB2973和pDB2974的多種釀酒酵母菌株中分泌的轉(zhuǎn)鐵蛋白 (S415A，T613A)的RIE分析。用300 μ 1冷凍保存的酵母儲(chǔ)存物一式三份地接種IOmL BMMD 搖瓶，并在30°C培養(yǎng)4天。在火箭免疫電泳凝膠的每個(gè)孔加載5 μ 1培養(yǎng)物上清液。血漿Tf 標(biāo)準(zhǔn)物濃度用Pg/mL表示。5(^1^羊抗1￡/50!^瓊脂糖。將Precipin用考馬斯藍(lán)染色。圖12顯示從包含pDB2973和pDB2974的專有菌株中分泌的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A， T613A)的SDS-PAGE分析。用300 μ 1冷凍保存的酵母儲(chǔ)存物一式三份地接種IOmL BMMD 搖瓶，并在30°C培養(yǎng)4天。在非還原性SDS-PAGE (4-12 % NuPAGE ，MOPS緩沖液， InVitrogen)上用GelCode Blue 試劑(Pierce)分析 20 μ 1 上清液。在圖12的凝膠1中，泳道對(duì)應(yīng)于下述樣品1 = 20μ 1 SeeBlue Plus標(biāo)記物； 2 = 20 μ 1 菌株 lpSAC35s/n(陰性對(duì)照)；3 = 20 μ 1 菌株 lpDB2973s/n ；4 = 20 μ 1 菌株 lpDB2973s/n ；5 = 20 μ 1 菌株 2 ；6 = pDB2973s/n ；6 = 20 μ 1 菌株 3pDB2973s/n ；7 = 20 μ 1 菌株 4pDB2973s/n ；8 = 20 μ 1 菌株 lpDB2974s/n ；8 = 20 μ 1 菌株 lpDB2929s/n(陽性對(duì) 照)；10 = 20 μ 1 SeeBlue Plus 標(biāo)記物。在圖12的凝膠2中，泳道對(duì)應(yīng)于下述樣品1 = 20μ 1 SeeBlue Plus標(biāo)記物； 2 = 20 μ 1 菌株 lpSAC35s/n(陰性對(duì)照)；3 = 20 μ 1 菌株 lpDB2974s/n ；4 = 20 μ 1 菌株 lpDB2974s/n ；5 = 20 μ 1 菌株 2pDB2974s/n ；6 = 20 μ 1 菌株 3pDB2974s/n ；7 = 20 μ 1 菌株 4pDB2974s/n ；8 = 20 μ 1 菌株 lpDB2973s/n ；9 = 20 μ 1 菌株 lpDB2929s/n(陽性對(duì)照)；10 =20μ 1 SeeBlue Plus 標(biāo)記物。圖13顯示重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(N413Q，N611Q)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的分析型 TBE-脲凝膠分析。根據(jù)下述實(shí)例中所述規(guī)程制備樣品。在6% TBE脲PAGE(Invitrogen) 上分離20 μ g樣品，并用考馬斯G250 (Pierce)染色。泳道1_3顯示菌株1 [pDB2929]樣品； 泳道4-6顯示菌株1 [pDB2973]樣品；泳道1和4顯示純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體；泳道2 和5顯示重組脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體；泳道3和6顯示重組全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體。圖14顯示質(zhì)粒pDB3191的結(jié)構(gòu)。圖15顯示質(zhì)粒pDB3753的結(jié)構(gòu)。圖16顯示質(zhì)粒pDB3768的結(jié)構(gòu)。圖 17 顯示分別從包含 pDB2973、pDB3773、pDB3765、pDB3768 或 pDB3778 的釀酒 酵母菌株1分泌的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)、重組轉(zhuǎn)鐵 蛋白(S415A，T613C)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)，和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A， T613A)的RIE分析。用200 μ L凍存的酵母儲(chǔ)存物一式兩份地接種IOmL BMMD搖瓶，并在30°C培育5天?；鸺庖唠娪灸z的每個(gè)孔加載4yL培養(yǎng)上清液的兩個(gè)樣品。血漿Tf標(biāo) 準(zhǔn)物濃度用Pg/mL表示。3(^1^羊抗1￡/50!^瓊脂糖。用考馬斯藍(lán)將Precipin染色。圖17的凝膠1顯示分別從包含pDB3237、pDB3773或pDB3765的釀酒酵母菌株1分 泌的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A， T613C)的RIE分析。圖17的凝膠2顯示分別從包含pDB3237、pDB3768或pDB3778的釀酒 酵母菌株1分泌的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)和重 組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)的RIE分析。
圖 18 顯示分別從包含 pDB2973、pDB3773、pDB3765、pDB3768 和 pDB3778 的釀酒 酵母菌株1分泌的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)、重組轉(zhuǎn) 鐵蛋白(S415A，T613C)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A， T613A)的SDS-PAGE分析。用200 μ L凍存的酵母儲(chǔ)存物一式兩份地接種IOmL BMMD搖瓶， 并在 30°C培育 5 天。在非還原性 SDS-PAGE(4-12 % Bis/Tris NuPAGE , MOPS 緩沖液， Invitrogen)上用GelCode Blue 試劑(Pierce)分析 20 μ L 上清液。在圖18的凝膠1中，泳道對(duì)應(yīng)下述樣品1 = 20 μ LSeeBlue Plus標(biāo)記物；2 = 20 μ L 菌株 1 [PDB3237] s/n ；3 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3237] s/n ；4 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3773] s/ η ;5 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3773] s/n ；6 =菌株 1 [pDB3765] s/n ；7 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3765] s/ η。在圖18的凝膠2中，泳道對(duì)應(yīng)下述樣品1 = 20 μ LSeeBlue Plus標(biāo)記物；2 =無樣品；3 =20 μ L 菌株 1 [pDB3237] s/n ；4 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3237] s/n ；5 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3768] s/n ；6 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3768] s/n ；7 =菌株 1 [pDB3778] s/n ；8 = 20 μ L 菌株 1 [pDB3778] 上清液。圖19顯示重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)的分析 型TBE-脲凝膠分析。根據(jù)下述實(shí)例所述規(guī)程制備樣品。在6% TBE脲PAGE(Invitrogen)上分離5 μ g 樣品，并用考馬斯G250 (Pierce)染色。泳道1-2顯示菌株1 [pDB3237]樣品；泳道3顯示菌株1 [pDB3773]樣品；泳道1顯 示無鐵重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)制備物；泳道2和3顯示加載鐵的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變 體。圖20顯示由菌株1 [pDB3237]、菌株1 [pDB3773]和菌株1 [pDB3765]的表達(dá)的重組 轉(zhuǎn)鐵蛋白上清液的分析型TBE-脲凝膠分析。圖20的凝膠1中，泳道1-2顯示純化的重組 轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)樣品；泳道3_4顯示菌株1 [pDB3237]樣品；泳道1和3顯示無鐵 制備物；泳道2和4顯示加載鐵的制備物。圖20的凝膠2中，泳道1-2顯示純化的重組轉(zhuǎn) 鐵蛋白(S415A，T613A)樣品；泳道3_4顯示菌株1 [pDB3773]樣品；泳道1和3顯示無鐵制 備物；泳道2和4顯示加載鐵的制備物。圖20的凝膠3中，泳道1-2顯示純化的重組轉(zhuǎn)鐵 蛋白(S415A，T613A)樣品；泳道3_4顯示菌株1 [pDB3765]樣品；泳道1和3顯示無鐵制備 物；泳道2和4顯示加載鐵的制備物。圖21顯示由菌株1 [pDB3237]、菌株1 [pDB3778]和菌株1 [pDB3768]的表達(dá)的重組 轉(zhuǎn)鐵蛋白上清液的分析型TBE-脲凝膠分析。圖21的凝膠1中，泳道1-2顯示純化的重組轉(zhuǎn) 鐵蛋白(S415A，T613A)樣品；泳道3_4顯示菌株1 [pDB3768]樣品；泳道1和3顯示無鐵制 備物；泳道2和4顯示加載鐵的制備物。圖21的凝膠2中，泳道1-2顯示菌株1 [pDB3237]樣品；泳道3-4顯示菌株1 [pDB3778]樣品；泳道1和3顯示無鐵制備物；泳道2和4顯示 加載鐵的制備物。圖22顯示重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)的純化 的加載鐵的制備物的表面等離子體共振(SPR)分析。圖23顯示由使用ESI-TOF質(zhì)譜法分析重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋 白(S32C，S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)得到的去卷積質(zhì)譜。譜A顯 示由菌株l[pDB3237]的高細(xì)胞密度發(fā)酵純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的質(zhì)譜。峰標(biāo) 識(shí)A)未修飾的分子(理論質(zhì)量75098Da)，B)未修飾的分子+1己糖(理論質(zhì)量75259Da)。 譜B顯示由菌株l[pDB3778]的高細(xì)胞密度發(fā)酵 純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A) 變體的質(zhì)譜。峰標(biāo)識(shí)C)未修飾的分子(理論質(zhì)量75114Da)。譜C顯示由菌株1 [pDB3768] 的高細(xì)胞密度發(fā)酵純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)變體的質(zhì)譜。峰標(biāo)識(shí)D)未修 飾的分子(理論質(zhì)量75130Da)。圖24質(zhì)粒pDB3237的質(zhì)粒圖譜。
實(shí)施例實(shí)施例1，表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，用于產(chǎn)生在-N-X-S/T-基序中具有對(duì)絲氨酸-415和蘇氨酸-613 的突變的未糖基化重組轉(zhuǎn)鐵蛋白。在先前公開的未糖基化重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體N413Q、 N611Q(由第一個(gè)釀酒酵母菌株(菌株1) [pDB2929]產(chǎn)生時(shí))和新的未糖基化重組轉(zhuǎn)鐵蛋白 突變體S415A、T613A(由菌株1 [pDB2973]產(chǎn)生時(shí))的數(shù)量或質(zhì)量未觀察到顯著差別，如由 RIE、SDS-PAGE、脲凝膠分析、質(zhì)譜、N-末端測(cè)序和向體外生長(zhǎng)的人紅白血病細(xì)胞的鐵傳遞所 確定的。寡糖基轉(zhuǎn)移酶催化寡糖鏈從焦磷酰多萜醇轉(zhuǎn)移至序列-Asn-X-Thr/Ser-中的天 冬酰胺殘基，其中X是除脯氨酸或天冬氨酸之外的任何氨基酸(de Jong等，1990，Clin Chim 八(^&，190，1;1^11等，1983，了 Biol Chem，258，15255)。分泌的蛋白質(zhì)的N-連接的糖基化在 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的這個(gè)序列基序處發(fā)生。然而，由于空間約束，蛋白質(zhì)所有可能的位點(diǎn)中只有約三分之一被糖基化。在人轉(zhuǎn) 鐵蛋白中兩個(gè)可能的位點(diǎn)是可用的，在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611處(均位于C-葉 中)，并且兩個(gè)位點(diǎn)都被利用。先前嘗試從釀酒酵母分泌人轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)生彌散的異源產(chǎn)物， 據(jù)信這是由于在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611的高甘露糖基化(hypermarmosylation) (未給出數(shù)據(jù))，這與先前在非人宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生人轉(zhuǎn)鐵蛋白的相關(guān)觀察是一致的。本文描述了通過將絲氨酸-415和蘇氨酸-613改變成丙氨酸殘基而產(chǎn)生非糖基化 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體，以防止在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611處的N-連接的糖基化。質(zhì)粒pDB2504(圖la)是包含用于人轉(zhuǎn)鐵蛋白的NofI表達(dá)盒的pBST(+) (Sle印 等，2001，Yeast，18,403-441)，除了成熟轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白質(zhì)的殘基413和611的密碼子未突變 以防止N-連接的糖基化，并且分別是編碼天冬酰胺殘基的AAT和AAC之外，所述表達(dá)盒與 PDB2536 (W0 2005/061719的圖36和實(shí)施例2，和WO 2005/061718的實(shí)施例1)中的表達(dá)盒 相同，pDB2504的糖基化人轉(zhuǎn)鐵蛋白DNA序列中絲氨酸_415和蘇氨酸_613的密碼子突變成釀酒酵母對(duì)于丙氨酸的優(yōu)選密碼子，其為GCT (37%，http://www. yeastgenome. org/ codon_usage. shtml)。這可以根據(jù)Stratagene的QuickChange 定點(diǎn)突變?cè)噭┖械恼f明手 冊(cè)實(shí)現(xiàn)。使用突變寡核苷酸CF156(SEQ ID NO 4)和CF157(SEQ ID NO 5)導(dǎo)入S415A突 變，并且使用寡核苷酸CF158(SEQ ID NO 6)和CF159(SEQ ID NO 7)導(dǎo)入T613A突變(表 1)。表1: 突變?cè)?154-bp HpaI-SphI pDB2504片段上進(jìn)行，其已經(jīng)亞克隆入用HpaI、SphI 和小牛腸堿性磷酸酶消化的阿泊拉霉素選擇性大腸桿菌克隆載體pDB2685(圖lb，還參見 WO 2005/061719)中。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α并選擇阿泊拉霉素抗性菌 落(35 μ g. mL-1阿泊拉霉素)。通過用HpaI, SphI、EcoRI和NdeI限制性消化而鑒定質(zhì)粒 PDB2958 (圖 2)。用寡核苷酸CF156和CF157(表1)突變質(zhì)粒pDB2958，導(dǎo)入S415A修飾并產(chǎn)生質(zhì) 粒pDB2970(圖3)。用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci使其具有阿泊拉霉素抗性，并從四個(gè)阿 泊拉霉素抗性菌落中分離質(zhì)粒DNA。隨后用寡核苷酸CF158和CF159突變這些質(zhì)粒，導(dǎo)入 T613A修飾，并產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2971 (圖4)。分離阿泊拉霉素菌落，并由用于導(dǎo)入S415A修飾 的四個(gè)反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)所產(chǎn)生的兩個(gè)克隆制備質(zhì)粒DNA。選出八個(gè)質(zhì)粒制備物中的三個(gè)首 先用于DNA測(cè)序，以鑒定S415A和T613A修飾，其每個(gè)都源自單獨(dú)的T613A突變反應(yīng)。DNA 測(cè)序使用寡核苷酸 DS 181 (SEQ ID NO :8)、DS182 (SEQ ID NO :9)、DS183 (SEQ ID NO :10)、DS184(SEQ ID NO 11)、DS185 (SEQ ID NO 12)、DS186 (SEQ ID N0:13)、 DS187(SEQ ID NO :14)、M13 正向(SEQ ID NO 15)和 M13 反向引物(SEQ ID NO 16)(表 2)。表2: 所有三個(gè)質(zhì)粒都包含期望的S415A和T613A修飾，但是一個(gè)在1154-bpHpaI_SphI 區(qū)中的其它地方還包含額外的腺嘌呤插入。因此，用相同的引物將正確的PDB2971質(zhì)粒克 隆之一的祖質(zhì)粒測(cè)序，并顯示其在完整的1154-bpHpaI-SphI區(qū)中包含期望的pDB2970序 列。通過凝膠純化分離包含S415A和T613A修飾的1154_bp HpaI_SphIpDB2971片段， 并與來自pDB2928(圖5，也參見WO 2005/061718)的5312-bpHpaI_SphI片段連接，后者在 用HpaI、SphI、AccI和小牛腸堿性磷酸酶消化后純化。AccI的加入導(dǎo)致未修飾的1154_bp HpaI-SphI片段三重消化。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，使其具有氨芐青霉素抗 性，并由選擇的克隆制備質(zhì)粒DNA。通過用HpaI、SphI、NotI和NdeI限制性消化鑒定基于 pBST(+)的質(zhì)粒，pDB2972(圖6)，其包含用于使用mHSA-前先導(dǎo)序列進(jìn)行非糖基化重組人 轉(zhuǎn)鐵蛋白分泌的NotI表達(dá)盒。用引物05181、05182、05184、05185、05186和05187(表2)的DNA 測(cè)序確認(rèn)了 1， 154-bp HpaI-SphI區(qū)的正確序列和臨近序列。隨后在用NotI和ScaI消化后從pDB2972分 離了 3，256-bp表達(dá)盒。將其與pDB2690(圖7，也參見WO 2005/061718)連接，所述pDB2690 已用NotI和小牛腸堿性磷酸酶消化。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，使其具有氨芐青霉 素抗性，并由選擇的克隆制備質(zhì)粒DNA。使用HindIII、NotI、BamHI、NdeI和EcoRI的限制 性消化鑒定pDB2973(圖8)和pDB2974(圖9)。兩個(gè)質(zhì)粒均確認(rèn)了 1，154-bpHpaI-SphI區(qū) 的正確DNA序列和臨近序列。在pDB2973中，轉(zhuǎn)鐵蛋白基因以與LEU2相同的方向轉(zhuǎn)錄，而 在PDB2974中，它以相反的方向轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例2 =HST突變體的產(chǎn)生和分析用pDB2973和pDB2974轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株(菌株1)，使其成為亮氨酸原養(yǎng)型。使用修正的乙酸鋰方法轉(zhuǎn)化酵母(Sigm酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-1，規(guī)程2 ;Ito等，1983， J. Bacteriol.，153，16 ；Elble, 1992，Biotechniques, 13，18)。在 BMMD-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn) 化體，隨后挑取接于BMMD-瓊脂平板上。BMMD的組成如Sle印等，2002，Yeast, 18,403所 述。由IOmL BMMD搖瓶培養(yǎng)物(24小時(shí)，30°C，200rpm)，在20% (w/v)海藻糖中制備冷凍儲(chǔ) 存物。用包含pDB2973和pDB2974的每個(gè)菌株接種一式三份的IOmL BMMD搖瓶培養(yǎng)物， 并在30°C生長(zhǎng)4天。菌株1 [pDB2929](圖10，也參見W02005/061718)相似地生長(zhǎng)用于對(duì) 照目的。pDB2929包含以與LEU2相同的方向轉(zhuǎn)錄的N413Q、N611Q突變體轉(zhuǎn)鐵蛋白基因和 釀酒酵母SKQ2n PDIl基因。通過RIE和非還原性SDS-PAGE分析上清液。RIE分析表明所 有包含pDB2973和pDB2974的菌株都分泌重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(圖11)。來自包含pDB2973的所 有菌株的表達(dá)效價(jià)(titre)看起來略高于包含PDB2974的菌株。來自pDB2973和pDB2974 的效價(jià)看起來是相當(dāng)?shù)?。因此，通過RIE，在所研究菌株的搖瓶培養(yǎng)過程中分泌的可選的非N-連接的-糖基 化突變體水平之間未表現(xiàn)出顯著差別。重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)分泌的非還原性SDS-PAGE分析如圖12所示。包含 PDB2973和pDB2974的多個(gè)釀酒酵母菌株(菌株1至4)都分泌與來自菌株1 [pDB2929]的 轉(zhuǎn)鐵蛋白(N413Q，N611Q)共遷移的蛋白條帶，其在陰性對(duì)照菌株中不存在。通過SDS-PAGE 觀察到的轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)條帶的產(chǎn)量(yield)與通過RIE觀察到的效價(jià)一致。此 夕卜，通過SDS-PAGE分析，來自菌株l[pDB2973]的轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)條帶與來自菌株 1 [pDB2929]的轉(zhuǎn)鐵蛋白(N413Q，N611Q)條帶之間未表現(xiàn)出顯著差別。轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A， T613A)條帶明顯沒有彌散，表明絲氨酸-415和蘇氨酸613變?yōu)楸彼釟埢耐蛔兂晒Ψ乐?了天冬酰胺-413和天冬酰胺611處的高糖基化。菌株l[pDB2973]的高細(xì)胞密度發(fā)酵產(chǎn)生約1. 74g.廠1 (η = 4)的產(chǎn)量，這與菌株 1 [pDB2929]的生產(chǎn)能力相似。從菌株1 [pDB2973]表征轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)表明其在 功能上與來自菌株l[pDB2929]的轉(zhuǎn)鐵蛋白(N413Q，N611Q)相當(dāng)。在純化(SP-FF和DE-FF) 和脲凝膠分析(圖13)的過程中，可選的非糖基化突變體看起來是相當(dāng)?shù)摹Ｊ褂肕akey 和 Seal 過程的修正方法(Monthony 等，1978，Clin. Chem.，24， 1825-1827 ;Harris 禾口 Aisen,1989, Physical biochemistry of the transferrins, VCH ； Makey 禾口 Seal，1976，Biochim. Biophys. Acta. ,453,250-256 ；Evans 禾口 Williams，1980， Biochem. J.，189，541-546)，用商業(yè)迷你凝膠(6%同源TBE脲，Invitrogen)，進(jìn)行脲凝膠 電泳。將包含約IOyg蛋白質(zhì)的樣品1 1稀釋于TBE-脲樣品緩沖液(Invitrogen)中， 在180V分離550至600Vh并用GelCode Blue試劑 (Pierce)染色。通過針對(duì)0. IM檸 檬酸(鹽)、0. IM乙酸(鹽)、10mM EDTA pH 4. 5透析而制備脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白。過濾溶液 (0. 22 μ m)，并使用Vivaspin聚醚砜10，000NMWC0離心濃縮機(jī)濃縮至10mg/ml，并針對(duì)10倍 體積的水，然后是10倍體積的0. IM HEPES、0. IM NaHC03pH 8. O滲濾。從濃縮機(jī)通過沖洗而 回收樣品，并使其終濃度達(dá)到5mg/ml。通過加入10 μ 1 ImM FeNTA (新鮮制備，作為氯化鐵 于氨基三乙酸二鈉中的等摩爾溶液)至50μ 1等分試樣而由這個(gè)溶液制備重構(gòu)的全鐵轉(zhuǎn)鐵 蛋白，并靜置10分鐘以在電泳分析前使CO2溶解，完成鐵結(jié)合。這一技術(shù)可分離不同鐵負(fù) 荷的四種分子形式(目的是增加遷移率(mobility))，即脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白、C-葉和N-葉結(jié)合單鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白和全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白。認(rèn)為四種形式轉(zhuǎn)鐵蛋白的分離是由于在6M脲中的部 分變性，其中任何葉上的鐵結(jié)合會(huì)引起構(gòu)型變化，導(dǎo)致對(duì)變性的耐受性增加。因此葉中存在 鐵可產(chǎn)生更緊密的結(jié)構(gòu)，具有更高的電泳遷移率。因?yàn)镹-葉的二硫鍵比C-葉少(分別是 8和11)，其在缺乏鐵的情況下進(jìn)一步解折疊，使具有結(jié)合至C-葉的鐵的單鐵形式遷移性最差(the least mobile)。質(zhì)譜鑒定了不同非糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體之間期望的質(zhì)量差別，并為轉(zhuǎn)鐵蛋白 (S415A，T613A)中正確的一級(jí)蛋白質(zhì)序列提供了很好的證據(jù)(未顯示數(shù)據(jù))。關(guān)于翻譯后 修飾，轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)也可與轉(zhuǎn)鐵蛋白(N413Q，N611Q)相比。此外，來自菌株l[pDB2973]的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的體外將鐵傳遞至 K562細(xì)胞的能力與來自菌株l[pDB2929]的轉(zhuǎn)鐵蛋白(N413Q, N611Q)相當(dāng)(表3)。
表3-來自人血漿對(duì)照禾口轉(zhuǎn)鐵蛋白的，由體外牛長(zhǎng)的人紅白血病K562細(xì)胞的總鐵攝入、非特異性攝入、表觀親和性和關(guān)聯(lián)系數(shù)(r2)攝入數(shù)據(jù)以fmol Fe/百萬細(xì)胞25分鐘表示，表觀親和性用nM轉(zhuǎn)鐵蛋白(估計(jì)的 濃度，未針對(duì)系統(tǒng)誤差進(jìn)行調(diào)整)表示。 應(yīng)注意的是，盡管對(duì)照的最大攝入看起來更高，但是此數(shù)字并不重要(relevant)。 經(jīng)常是天然轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)照的攝入最大，因此與重組樣品的差異是統(tǒng)計(jì)偏差。唯一重要的數(shù) 字是表觀親和常數(shù)，其都略低于天然轉(zhuǎn)鐵蛋白，和代表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)。簡(jiǎn)言之， 可以說所有這些重組轉(zhuǎn)鐵蛋白將鐵傳遞至紅系細(xì)胞的能力至少和天然蛋白一樣好。表3中的數(shù)據(jù)獲得自競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，其中血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白用鐵-55放射性標(biāo)記，并且通過 放射性標(biāo)記鐵-55比較兩個(gè)未標(biāo)記的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的抑制鐵-55傳遞的能力。用包含HEPES-緩沖液和lmg/ml牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基洗滌標(biāo)準(zhǔn)條件下 (碳酸氫鹽緩沖的，5% CO2，抗生素，10%胎牛血清)在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的K562紅 白血病細(xì)胞，并在此培養(yǎng)基中以一千萬細(xì)胞/ml的濃度使用。將濃度漸增的天然或各個(gè)二鐵重組轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品(0、25、100、200、400、800、 1600nM)與用55Fe標(biāo)記的于25 μ 1培養(yǎng)基中的IOOnM天然二鐵血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白混合。通過加入3001細(xì)胞懸浮液而開始反應(yīng)。在37°C 25分鐘后，通過浸入冰浴中而終 止反應(yīng)，將60 μ 1的細(xì)胞懸浮液的三個(gè)等分試樣轉(zhuǎn)移至新管，并在低溫離心細(xì)胞，在加入鄰 苯二甲酸二乙酯/鄰苯二甲酸二丁酯的油層后再次在低溫離心細(xì)胞。去除上清液，將細(xì)胞 沉淀轉(zhuǎn)移至計(jì)數(shù)瓶中，并用0. 5MK0H+1% Triton X-100裂解。在ο/η裂解后用IM HCl中和 裂解物，與Readysolv閃爍混合物(cocktail)混合，并在Packard液體閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。因此，絲氨酸-415和蘇氨酸-613的突變看來是對(duì)-N-X-S/T-基序中天冬酰胺殘基的突變的可行的替代方案，用于防止由釀酒酵母分泌的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的N-連接的糖基 化。先前的研究已經(jīng)得出結(jié)論，即N413Q，N611Q轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體與未突變轉(zhuǎn)鐵蛋白在 生物學(xué)上相當(dāng)(未給出數(shù)據(jù))，并且這些研究表明，絲氨酸-415和蘇氨酸-613的突變得到 的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體與N413Q，N611Q轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體在生物學(xué)上相當(dāng)。因此，可以得出結(jié)論， 即絲氨酸-415和蘇氨酸-613的突變得到的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體與未突變轉(zhuǎn)鐵蛋白在生物學(xué)上 相當(dāng)。實(shí)施例3.轉(zhuǎn)鐵蛋白突變蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 A 舶辨舶赫汰碰白_聿本發(fā)明用于轉(zhuǎn)鐵蛋白變體的表達(dá)質(zhì)?？梢杂门c下述對(duì)于Tf變體S415A，T613A相 似的方式構(gòu)建。通過定點(diǎn)突變修飾名為PDB3237的質(zhì)粒而產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白突變蛋白質(zhì)。使用商業(yè)提 供的試劑盒(如Stratagene的Quikchange 試劑盒)所示的步驟，用重疊突變寡核苷酸序 列將選擇的殘基密碼子修飾成可以編碼半胱氨酸殘基的任何DNA序列(TGT或TGC)。B 轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A, T613A)表汰質(zhì)粒dDB3237的構(gòu)津使用重疊寡核苷酸引物產(chǎn)生合成DNA，其編碼轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列人轉(zhuǎn)鐵蛋白 (S415A，T613A)，所述DNA為在釀酒酵母中表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。SEQ ID NO 18包含成熟人轉(zhuǎn)鐵蛋白C1變體蛋白質(zhì)編碼序列，其在絲氨酸415和蘇 氨酸613處修飾成丙氨酸殘基，以防止在Asn413和Asn611位點(diǎn)發(fā)生N-連接的糖基化(核 苷酸124-2160)；兩個(gè)翻譯終止密碼子(核苷酸2161-2166)；轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)(信號(hào))蛋白質(zhì)編 碼序列(核苷酸67-123) ；3’ UTR和部分ADHl基因終止子一直到SphI克隆位點(diǎn)(核苷酸 2167-2359) ；5，UTR和部分PRBl基因啟動(dòng)子一直到AfIII克隆位點(diǎn)(核苷酸1-66)。轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)(信號(hào))蛋白質(zhì)編碼序列(核苷酸67-123)編碼信號(hào)肽 MLLQAFLFLLAGFAAKISA(SEQ ID NO: 19)。用SphI和AflII完全消化轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列人轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)DNA序 列，產(chǎn)生2. 357kb片段。使用限制性內(nèi)切酶SphI和AflII完全消化WO 00/44772中所 述質(zhì)粒pDB2241 (4. 383kb)，產(chǎn)生4. 113kb片段，其隨后使用小牛堿性腸磷酸酶去磷酸化。 將2. 537kb轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列人轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)DNA片段連接入來自pDB2241的 4. 113kb Sphl/Aflll片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB3191 (圖14)。用NotI限制性內(nèi)切酶完全消化質(zhì) 粒PDB3191，釋放3. 259kb轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列人轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)表達(dá)盒。質(zhì)粒pDB2690的構(gòu)建如W0/2005061719A1中所述。用限制性內(nèi)切酶NotI完全消 化質(zhì)粒PDB2690 (13. 018kb)，并使用小牛堿性腸磷酸酶去磷酸化，并與3. 259kb NotI轉(zhuǎn)鐵 蛋白(S415A，T613A)表達(dá)盒連接，產(chǎn)生16. 306kbpDB3237，其具有與LEU2基因反向的轉(zhuǎn)鐵 蛋白(S415A，T613A)表達(dá)盒(圖24)?；蛘?，可以在將NotI轉(zhuǎn)鐵蛋白變體表達(dá)盒亞克隆入pD B2690之前通過將合成的 DNA片段亞克隆入質(zhì)粒pDB3191(圖14)而產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白變體的表達(dá)質(zhì)粒。pDB3191 (圖14)的轉(zhuǎn)鐵蛋白DNA序列包含唯一的AflII、XcmI、NcoI和AccI限制 性內(nèi)切酶位點(diǎn)。預(yù)定突變的位置定位于PDB3191(圖14)的轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)盒序列上。序列 側(cè)翼為AflII和XcmI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以促進(jìn)克隆。通過修飾AflII和XcmI限制性位點(diǎn)之間的DNA序列而產(chǎn)生另外的硫代轉(zhuǎn)鐵蛋白變體，其包含在絲氨酸415處修飾成丙氨酸以防止在Asn413位點(diǎn)處的N-連接的糖基化的成熟人轉(zhuǎn)鐵蛋白C1變體蛋白質(zhì)編碼序列直 到XcmI克隆位點(diǎn)的部分(核苷酸124-1487)、轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)(信號(hào))蛋白質(zhì)編碼序列(核苷 酸67-123)和PRBl基因啟動(dòng)子直到AflII克隆位點(diǎn)的部分(核苷酸1_66)。在給出的實(shí)例 中，將密碼子TGT用于半胱氨酸殘基，然而，本發(fā)明中也使用密碼子TGC。SEQ ID NO 18，包含在絲氨酸-32處修飾成丙氨酸以防止0_連接的糖基化(核苷 酸216-218)并在絲氨酸-415處修飾成丙氨酸以防止在Asn413位點(diǎn)處的N-連接的糖基化 的成熟人轉(zhuǎn)鐵蛋白C1變體蛋白質(zhì)編碼序列直到XcmI克隆位點(diǎn)的部分(核苷酸124-1487)、 轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)(信號(hào))蛋白質(zhì)編碼序列(核苷酸67-123)和PRBl基因啟動(dòng)子直到AflII克 隆位點(diǎn)的部分(核苷酸1-66)。在這個(gè)實(shí)施例中，使用密碼子優(yōu)化的DNA，然而，本發(fā)明中也 可使用未進(jìn)行密碼子優(yōu)化的DNA。用AflII和XcmI完全消化SEQ ID NO 18變體DNA序列，產(chǎn)生1. 479kb片段。使 用限制性內(nèi)切酶AflII和XcmI完全消化質(zhì)粒pDB3191 (6. 47kb)，產(chǎn)生4. 991kb片段，其隨后 使用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。將1.479kb轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A)變體DNA片段亞克隆入 來自 pDB3191 的 4. 99IkbAflΙΙ/XcmI 片段，產(chǎn)生質(zhì)粒 pDB3753 (圖 15)。用NotI限制性內(nèi)切酶完全消化轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)變體亞克隆質(zhì)粒 PDB3753，釋放合適的3. 259kb轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A, T613A)表達(dá)盒。W0/2005061719A1中已經(jīng)描述了質(zhì)粒pDB2690的構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶NotI完全 消化質(zhì)粒PDB2690 (13. 018kb)，并使用蝦堿性磷酸酶去磷酸化，并與3. 259kb NotI轉(zhuǎn)鐵蛋 白(S32A，S415A，T613A)變體表達(dá)盒連接，產(chǎn)生16. 306kb質(zhì)粒pDB3768，其具有與LEU2基 因同向的轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)變體表達(dá)盒(圖15)。用質(zhì)粒PDB3237或pDB3768將釀酒酵母菌株(菌株1)轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。使用 修改的乙酸鋰方法(Sigma酵母轉(zhuǎn)化試劑盒，YEAST-I，規(guī)程2 ；Ito等，1983，J. Bacteriol.， 153，16 ；Elble, 1992, Biotechniques, 13,18)轉(zhuǎn)化酵母。在BMMD-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體， 隨后挑取到BMMD-瓊脂平板上。BMMD的組成由Sle印等，2002，Yeast，18，403描述。從IOmL BMMD搖瓶培養(yǎng)物(24小時(shí)，30°C，200rpm)在20% (w/v)海藻糖中制備冷凍的保存物。C 轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)表達(dá)質(zhì)粒pDB3773的構(gòu)建使用與構(gòu)建pDB3237的方法相應(yīng)的方法構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒。D 轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613C)表達(dá)質(zhì)粒pDB3765的構(gòu)建使用與構(gòu)建pDB3237的方法相應(yīng)的方法構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒。E 轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A, T613A)表達(dá)質(zhì)粒PDB3778的構(gòu)建使用與構(gòu)建pDB3237的方法相應(yīng)的方法構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒。實(shí)施例4 表達(dá)重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的酵母菌株的生產(chǎn)能力用包含pDB3237、pDB3773、pDB3765、pDB3778 和 pDB3768 的菌株 1 酵母菌株接種 一式兩份的IOmL BMMD搖瓶培養(yǎng)物，并在30°C生長(zhǎng)5天。通過火箭免疫-電泳(RIE)和 非還原性SDS-PAGE分析上清液。RIE分析表明包含pDB3237、pDB3773、pDB3765、pDB3768 和pDB3778的所有菌株都分泌重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(圖17和圖18)。當(dāng)與分別包含pDB3778和 PDB3768表達(dá)重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體S32C，S415A，T613A和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體S32A，S415A， T613A的菌株1比較時(shí)，來自包含pDB3237表達(dá)重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體S415A、T613A的菌株1的表達(dá)效價(jià)看來相似(圖17中的凝膠2)，表明這些構(gòu)建體中絲氨酸-32的突變不會(huì)降低產(chǎn) 物產(chǎn)量。相反，來自分別包含PDB3773或pDB3765表達(dá)重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體S415C，T613A 或重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體S415A，T613C的菌株1的表達(dá)效價(jià)看來較低(圖17中的凝膠1)， 表明優(yōu)選絲氨酸和蘇氨酸變?yōu)楸彼釟埢苑乐筃-連接的糖基化的突變。因此，通過RIE，當(dāng)與僅包含S415A和T613A突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體相比，包含 S415A和T613A突變和在絲氨酸-32處額外的突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體水平之間看來沒 有顯著差異。相似地，通過SDS-PAGE分析(圖18中的凝膠2)，與來自菌株1 [pDB3778]的 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)條帶，或來自菌株1 [pDB3768]的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A， S415A，T613A)條帶相比，來自菌株1 [pDB3237]的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)條帶看來 沒有顯著差異。然而，通過RIE分析，當(dāng)表達(dá)包含“非保守”突變?nèi)鐚⒔z氨酸-415取代為半胱氨酸 或?qū)⑻K氨酸-613取代為半胱氨酸的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體時(shí)，分泌的重組蛋白的量減少。通 過SDS-PAGE分析確認(rèn)了這個(gè)結(jié)果(圖18中的凝膠1)。
表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)變體的菌株1 [pDB3768]的高細(xì)胞密度補(bǔ) 料批式發(fā)酵得到的產(chǎn)量為Z^emg.mL-1，并且表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)的菌株 1 [pDB3768]得到的產(chǎn)量為1. 95mg. mL—1，其與表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)變體的菌株 1 [pDB3237]中所見相似。然而，表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)變體的菌株1 [pDB3773]的 高細(xì)胞密度補(bǔ)料批式發(fā)酵得到的產(chǎn)量約為1. 06mg. mL-1 (η = 2)，表明絲氨酸-415變?yōu)榘腚?氨酸殘基的“非保守”取代導(dǎo)致生產(chǎn)能力顯著下降。實(shí)施例5 與重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)相比， 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的鐵結(jié)合能力將由菌株l[pDB3237]、菌株l[pDB3773]和菌株1 [pDB3765]的搖瓶上清液純化 的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A， T613C)的鐵結(jié)合能力與純化的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)標(biāo)準(zhǔn)物相比較。對(duì)于加載鐵的純化重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C， T613A)，使用下述方法。向純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白加入碳酸氫鈉，得到20mM的終濃度。計(jì)算鐵量 (以IOmg. mL—1 (16. 5-18. 5% Fe)檸檬酸鐵銨的形式)以靶向2摩爾Fe3+每摩爾轉(zhuǎn)鐵蛋白，力口 至重組轉(zhuǎn)鐵蛋白/20mM重碳酸鈉制備物，并在環(huán)境溫度混合最少60分鐘，然后超濾至145mM NaCl 中。為了制備無鐵的純化重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)，在0. IM檸檬酸鈉、0. IM乙酸 鈉、IOmM EDTApH 4. 5中在環(huán)境溫度溫育樣品最少180分鐘，然后超濾至IOOmM HEPESUOmM 碳酸鈉緩沖液PH 8.0中。在6% TBE 脲 PAGE (Invitrogen)上分離 5 μ g 樣品，并用考馬斯 G250 (Pierce)染 色(圖19)。純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)的鐵結(jié)合能力在這些實(shí)驗(yàn)條件下看來與 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)不同。已經(jīng)進(jìn)行相同的全鐵化處理的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C， T613A)樣品(圖19中的泳道3)看來未用鐵完全飽和，并且顯示通過分析型TBE脲凝膠遷 移的條帶比重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)更慢(圖19中的泳道2)，表明重組“全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋 白”(S415C，T613A)樣品與重組“全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白”(S415A，T613A)所含鐵量不相同。通過離心從酵母生物質(zhì)分離在200mL BMMD搖瓶中生長(zhǎng)5天后作為搖瓶上清液表達(dá)的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白變體。將上清液樣品濃縮至ImL并滲濾至IOmM HEPES緩沖液pH 8中。 通過RP-HPLC測(cè)試材料，以獲得蛋白質(zhì)濃度，隨后分成兩個(gè)樣品。將一個(gè)樣品通過兩倍稀釋 和在0. IM檸檬酸鈉、0. IM乙酸鈉、IOmM EDTA pH 4. 5中溫育三小時(shí)而轉(zhuǎn)化成脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋 白形式，將另一個(gè)樣品通過在全鐵化緩沖液(0. 5M碳酸鹽，2. Smg.mr1檸檬酸鐵)中兩倍稀 釋而能將脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)化成二鐵全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白形式(鐵結(jié)合)的步驟處理三小時(shí)。在6% TBE 脲 PAGE (Invitrogen)上分離 0. 5 μ g 樣品，并用考馬斯 G250 (Pierce) 染色。分離自搖瓶上清液的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)(圖19的凝膠1中的泳道3和4) 看來與鐵加載的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)(圖20的凝膠1中的 泳道1和2)具有相同 的鐵結(jié)合能力。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，分別分離自菌株1 [PDB3773]和菌株1 [pDB3765]的搖瓶上清 液的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613C)的鐵結(jié)合能力看來不同 于分離自菌株l[pDB3237]的搖瓶上清液的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)。，進(jìn)行全鐵化處 理以用鐵加載轉(zhuǎn)鐵蛋白的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)樣品(圖20的凝膠2中的泳道4) 與和純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)(圖20的凝膠2中的泳道2)相比遷移率降低的 一些種類一起遷移通過分析型TBE脲凝膠，表明重組“全鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白”(S415C，T613A)以 鐵部分飽和，并且與結(jié)合的鐵為2摩爾的一些重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)以及結(jié)合的鐵 小于2摩爾的一些重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)不同源。進(jìn)行全鐵化處理以用鐵加載轉(zhuǎn)鐵蛋白的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A T613C)樣品(圖20 的凝膠3中的泳道4)也與和純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)(圖20的凝膠3中的泳道 2)相比遷移率降低的一些種類一起遷移通過分析型TBE脲凝膠，表明在本分析中，重組“全 鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白”(S415A，T613C)與結(jié)合的鐵為2摩爾的一些重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613C) 以及結(jié)合的鐵小于2摩爾的一些重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613C)不同源。通過分析型TBE脲凝膠電泳，與重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白 (S415A，T613C)相比，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的鐵結(jié)合能力看來有功能性差異。這 表明優(yōu)選重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)突變體用于控制N-連接的糖基化。實(shí)施例6 與重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)相比，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的 受體結(jié)合能力通過表面等離子體共振(SPR)分析來評(píng)價(jià)重組轉(zhuǎn)鐵蛋白變體的受體結(jié)合能力。可 以使用表面等離子體共振(SPR)測(cè)定轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合活性，所述SPR 是一種非侵入性光學(xué)技術(shù)，其中的SPR響應(yīng)是由于分子結(jié)合或解離而在檢測(cè)器表面的質(zhì)量 濃度變化的量度。將樣品通過恒定流速的微流系統(tǒng)送至傳感器芯片的表面上。在這個(gè)分析 中，如果轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品能與TfR結(jié)合，表面?zhèn)鞲衅餍酒系馁|(zhì)量會(huì)由于TfR和Tf分子之間 的結(jié)合而增加，產(chǎn)生表面等離子體波，并且可檢測(cè)與結(jié)合量成比例的sra信號(hào)的變化作為 共振單位(RU)的變化。IRU的響應(yīng)相當(dāng)于約lpg. mm 2的表面濃度的變化。通過首先將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體固定化，然后加入轉(zhuǎn)鐵蛋白而制備Biacore傳感器 芯片，用于進(jìn)行轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體之間的相互作用分析。具體地，在25°C使用氨耦合 化學(xué)，將抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(抗-TfR)抗體固定化在CM5傳感器芯片表面(GE Healthcare目 錄號(hào)BR-1000-14)。通過加入N-羥基琥珀酰亞胺N-乙基-N’ _( 二甲基氨基丙基)碳二 亞胺(NHS :EDC)，將CM5傳感器芯片流動(dòng)池上的羧甲基化的右旋糖酐表面轉(zhuǎn)化成活性的琥拍酉先胺酉旨(succinamideester)。在由溶劑或類似物使樣品標(biāo)本在芯片上流動(dòng)以去除所謂的本體效應(yīng)時(shí)，同時(shí)制 備具有固定化蛋白質(zhì)而不是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的傳感器芯片，并扣除共振單位的變化，從而可 確認(rèn)(轉(zhuǎn)鐵蛋白)受體的特異性結(jié)合。將抗-TfR抗體(AbDSerotec目錄號(hào)MCA1148)在 IOmM 乙酸 pH 5. O (GE Healthcare cataloguenumber BR-1003-50)中稀釋至 lOyg.mL-1， 并僅注入流動(dòng)池2。同時(shí)將50 μ 1轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR) (AbD Serotec目錄號(hào)9110-300) (用 HBS-EP (IOmMHEPES，I5OmM NaCl, 3mM EDTA，0. 005%表面活性劑 P_20，pH 7. 4)稀釋至 10-20 μ g. mL-1)注入兩個(gè)流動(dòng)池中。使用乙醇胺氫氯化物(1M pH 8.5)使傳感器芯片表面 上過量的酯基團(tuán)失活。使用HBS-EP作為電泳緩沖液和稀釋緩沖液，用于相互作用分析。將純化的加載鐵 的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)或純化的加載鐵的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)稀釋至 10 μ g.mL—1，并向兩個(gè)流動(dòng)池注入50 μ L。進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以確?？芍貜?fù)性。通過在樣品注入 之間8-12s注入IOmM乙酸鈉pH 4. 5 (GEHealthcare目錄號(hào)BR-1003-50)，而在加入純化的 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白變體之間再生制備的Biacore傳感器芯片表面。進(jìn)行了多至三次注射后，根 據(jù)需要直到恢復(fù)基線。 根據(jù)Sra分析，純化的加載鐵的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)的受體結(jié)合能力 看來不同于純化的加載鐵的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)。純化的加載鐵的重組轉(zhuǎn)鐵蛋 白(S415A，T613A)給出最大響應(yīng)59. 3(n = 3)，而純化的加載鐵的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C， T613A)給出最大響應(yīng)44. 6(n = 3)，表明與重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415C，T613A)相比，重組轉(zhuǎn)鐵蛋 白(S415A，T613A)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合能力有功能性差異。這表明重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A， T613A)突變體優(yōu)選用于控制N-連接的糖基化。實(shí)施例7 與重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A， T613A)相比，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的質(zhì)譜分析ESI-TOF質(zhì)譜分析是研究翻譯后變化和蛋白質(zhì)中其它修飾的強(qiáng)大方法。它能提供 士0. 01%的質(zhì)量精確度(對(duì)于轉(zhuǎn)鐵蛋白可低至幾個(gè)道爾頓)，并且能區(qū)別相差少至20道爾 頓的種類。通過ESITOF質(zhì)譜儀分析重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白 (S32A，S415A，T613A)的樣品，并與純化的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的樣品比較。分別從菌株1 [pDB3778]和菌株1 [pDB3237]的高細(xì)胞密度補(bǔ)料批式發(fā)酵純化重 組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的樣品，同時(shí)通過由 IOOOODa分子量截留旋轉(zhuǎn)柱(SartoriusVivaspin20-10000MWC0)濃縮15mL上清液而從菌 株l[pDB3768]搖瓶上清液純化重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)。根據(jù)制造商的說明離 心重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)樣品，然后使用15mL 0. 三氟乙酸(TFA)重新平 衡。將重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)樣品重懸于1. 2mL 0. 1% TFA中，并轉(zhuǎn)移至微型 離心管，然后進(jìn)行HPLC脫鹽。使用反相HPLC (RP. HPLC)將0. 5mL轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A， T613A)樣品脫鹽/濃縮。以測(cè)試蛋白質(zhì)的水溶液形式制備所有樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，所述溶液使用RP HPLC脫鹽/濃縮，使回收蛋白質(zhì)的濃度通常為ZO-lOOnmol.mr1。在Brownlee Aquapore BU-300 (C4) 7mm, 100x2. Imm 柱上進(jìn)行 RP HPLC 脫鹽，方法使用 0. 1% (ν/ν)三氟乙酸(TFA)作為溶劑A，并且70% (ν/ν)乙腈、0.1% (v/v)TFA作為溶劑B的二元梯度，并收集通過 在280nm處的UV吸光度檢出的洗脫的組分。飛行時(shí)間質(zhì)譜將樣品導(dǎo)入混合的四極飛 行時(shí)間質(zhì)譜儀(QqOaTOF，Applied Biosystems, QSTAR-XL ')，其配備有陽離子模式的 IonSprayTM源，使用流動(dòng)注射分析(FIA)?；钚哉{(diào)節(jié)的唯一的設(shè)備參數(shù)是去耦電勢(shì)(DP)，通 常設(shè)為250V。通常，將多個(gè)2分鐘樣品掃描平均。對(duì)于蛋白質(zhì)分析，針對(duì)質(zhì)子化的分子離 子馬肌紅蛋白(Sigma)校準(zhǔn)TOF分析儀，并且分辨率通常為12000。使用AnalystTM QS ν 1. 1軟件(Applied Biosystems)進(jìn)行設(shè)備控制和數(shù)據(jù)獲取與處理。轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的質(zhì)譜分析顯示兩個(gè)峰(圖23)。在這種情況下，一個(gè)峰 (圖23中標(biāo)為“A”)對(duì)應(yīng)于未修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)分子，表觀質(zhì)量為75097 (理 論質(zhì)量為75098Da)(圖23中的譜1)。還有一個(gè)大峰(圖23中標(biāo)為“B”)，預(yù)期其由于加 入了單己糖而增加了 162道爾頓。這可能代表了 0-連接的糖基化。在絲氨酸-32處具有 突變的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的質(zhì)譜分析僅顯示一個(gè)峰。轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)的質(zhì)譜分 析僅顯示一個(gè)主峰。圖23中標(biāo)為“C”的峰對(duì)應(yīng)于未修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A) 分子，表觀質(zhì)量為75112 (理論質(zhì)量為75114Da)(圖23中的譜2)。此外，轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A， S415A，T613A)的質(zhì)譜分析僅顯示一個(gè)主峰。圖23中標(biāo)為“D”的峰對(duì)應(yīng)于未修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋 白(S32A，S415A，T613A)分子，表觀質(zhì)量為75082 (理論質(zhì)量為75080Da)(圖23中的譜3)。 這個(gè)結(jié)果表明絲氨酸-32的突變防止在這個(gè)位置發(fā)生0-連接的糖基化。實(shí)施例8 與重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A， T613A)相比，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的伴刀豆球蛋白A分析由于與包含α-甘露糖殘基的寡糖鏈高度的親和性，伴刀豆球蛋白A(ConA)已 廣泛用于糖蛋白的研究。將重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，Τ613Α)、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A， Τ613Α)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)的純化樣品進(jìn)行ConA瓊脂糖親和層析，通過 RP. HPLC確定加載的樣品和洗脫液的濃度，允許計(jì)算％ ConA結(jié)合材料(表4)。表4 與重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A) 相比，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)的伴刀豆球蛋白A分析。
通過將4mL 50% (ν/ν)漿料 ConA 瓊脂糖珠ComA平衡緩沖液(lOOmMNaOAc，IOOmM NaCl，ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM CaCl2pH 5. 5)分散到 2mL —次性柱上而制備 ConA 柱。以 約 IOmg. mL-1，通過在ConA稀釋緩沖液(200mM Na0Ac,85mM NaCl,2mM MgCl2, 2mM MnCl2, 2mM CaCl2, pH5. 5)中以1 : 1稀釋而制備轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品(約20mg. mL—1)。通過RP. HPLC確認(rèn) 稀釋的“加載”樣品的濃度。排空ConA柱并用5mL ConA平衡緩沖液(lOOmMNaOAc，IOOmM NaCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM CaCl2pH 5. 5)平衡。將Iml重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A)加載至2mL ConA柱上，而將IOmL重組轉(zhuǎn)鐵 蛋白(S32A, S415A, T613A)和重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C, S415A, T613A)加載至 2mL ConA 柱上。 用ConA平衡緩沖液將柱洗滌三次，并用6mL ConA洗脫緩沖液(IOOmM NaOAc, IOOmM NaCl， 0. 5M甲基-α -D-甘露吡喃糖苷，ρΗ 5. 5)洗脫。通過RP. HPLC確定洗脫樣品的濃度(表 4)。約6. 6%重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S415A，T613A) (η = 10)結(jié)合至 ConA，而只有 0. 25% (η = 2)的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32C，S415A，T613A)和0. 15% (η = 1)的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A， T613A)能結(jié)合ConA，證明轉(zhuǎn)鐵蛋白中絲氨酸-32的突變引起O-連接的糖基化的降低，并且 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白(S32A，S415A，T613A)是控制重組產(chǎn)物糖基化的優(yōu)選突變體。
權(quán)利要求
包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中Ser415突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體在Asn413糖基化的氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組蛋白，其中Ser415突變成基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的生 物功能的氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組蛋白，其中Ser415突變成保守氨基酸，甘氨酸或丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組蛋白，其中Ser415突變成丙氨酸。
5.包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中Thr613突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體 在Asn611糖基化的氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組蛋白，其中Thr613突變成基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的生 物功能的氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的重組蛋白，其中Thr613突變成保守氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至6中任一項(xiàng)的重組蛋白，其中Thr613突變成甘氨酸、纈氨酸、丙氨 酸或甲硫氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的重組蛋白，其中Thr613突變成丙氨酸。
10.包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)， Ser415突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體在Asn413糖基化的氨基酸，并且根據(jù)權(quán)利要求5至9 中任一項(xiàng)，其中Thr613突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體在Asn611糖基化的氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的重組蛋白，其中Asn611突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突 變體在該位置糖基化的氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的重組蛋白，其中Asn611突變成基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的 生物功能的氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的重組蛋白，其中Asn611突變成保守氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的重組蛋白，其中Asn611突變成天冬氨酸或谷氨 酰胺。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的重組蛋白，其中Val612突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突 變體在Asn611糖基化的氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的重組蛋白，其中所述氨基酸基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的生 物功能。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的重組蛋白，其中Val612突變成脯氨酸、色氨酸或半胱氨酸。
18.通過權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)的重組蛋白，其中Asn413突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突 變體在該位置糖基化的氨基酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組蛋白，其中Asn413突變成基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的 生物功能的氨基酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的重組蛋白，其中Asn413突變成保守氨基酸，天冬氨酸或谷氨酰胺。
21.根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)的重組蛋白，其中Lys414突變成不允許轉(zhuǎn)鐵蛋白突 變體在Asn413糖基化的氨基酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的重組蛋白，其中Lys414突變成基本上不降低轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的生物功能的氨基酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的重組蛋白，其中Lys414突變成脯氨酸、色氨酸或半胱氨酸。
24.包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中所述轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體具有由SEQID NO :2所限定的序列。
25.由SEQID NO :2所限定的序列組成的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的重組蛋白，其中所述轉(zhuǎn)鐵蛋白還包含至少一個(gè)可減 少0-連接的糖基化的突變。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的重組蛋白，其中所述至少一個(gè)可減少0-連接的糖基化的突變是 對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1中Ser32的突變，優(yōu)選S32A或S32C。
28.多核苷酸，其包含編碼蛋白質(zhì)的序列，所述蛋白質(zhì)包含權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所 述的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的多核苷酸，其包含SEQID NO 3的序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的多核苷酸，其中編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白 的序列與編碼分泌前導(dǎo)序列的多核苷酸序列可操作地連接。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的多核苷酸，其中編碼包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白的序 列，在其5’末端，與編碼分泌前導(dǎo)序列的多核苷酸序列的3’末端可操作地連接。
32.包含根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一項(xiàng)的多核苷酸的質(zhì)粒。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的質(zhì)粒，其還包含編碼蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶的多核苷酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的質(zhì)粒，其為釀酒酵母(S.cerevisiaeUym質(zhì)粒。
35.如權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所限定的多核苷酸或質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并由此 產(chǎn)生重組蛋白的用途，所述蛋白質(zhì)包含權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的 序列。
36.產(chǎn)生能表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞的方法，所述蛋白質(zhì)包含權(quán)利要求1至24中任一 項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的序列，該方法包括(a)提供權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所限定的多核苷酸或質(zhì)粒；(b)提供宿主細(xì)胞；(c)用多核苷酸或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和(d)選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
37.產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述蛋白質(zhì)包含權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白 突變體的序列，該方法包括(a)提供含有權(quán)利要求28至34中任一項(xiàng)所限定的多核苷酸或質(zhì)粒的宿主細(xì)胞；和(b)在允許表達(dá)包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的序列的重組蛋白的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其還包括將已表達(dá)的重組蛋白分離的步驟。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其還包括配制所述分離的重組蛋白與載體或稀釋劑的步 驟，和任選的以單位劑量形式提供經(jīng)配制的蛋白質(zhì)的步驟。
40.權(quán)利要求38的方法，其還包括將分離的重組蛋白凍干的步驟。
41.權(quán)利要求35的用途或權(quán)利要求36至40中任一項(xiàng)的方法，其中宿主細(xì)胞是 酵母細(xì)胞，如酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，或畢赤酵母 屬(Pichia)的成員，如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和膜蹼畢赤酵母(Pichiamembrmaefaciens)，或魯氏接合 酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、發(fā) 酵接合酵母(Zygosaccharomyces fermentati)，或果蠅克魯維酵母(Kluyveromyces drosphilarum)。
42.包含重組蛋白和選自下組的一種或多種組分的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基谷氨酰胺、 胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、維生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亞 硒酸鈉、蛋白胨和抗氧化劑，所述重組蛋白包含權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白 突變體的序列。
43.培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包 含重組蛋白和一種或多種選自下組的組分谷氨酰胺、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、白蛋白、 乙醇胺、胎球蛋白、維生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亞硒酸鈉、蛋白胨和抗氧化劑，所述重 組蛋白包含權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的序列。
44.包含根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的重組蛋白的組合物。
45.包含重組蛋白的藥物組合物，所述重組蛋白包含權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的 轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體的序列和藥物可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供包含轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體序列的重組蛋白，其中Ser415突變成不允許在Asn413糖基化的氨基酸和/或其中Thr613突變成不允許在Asn611糖基化的氨基酸。本發(fā)明還提供編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸和制備與使用所述重組蛋白的方法。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101842110SQ200880103324
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者喬安娜·海, 克里斯托弗·J·A·菲尼斯, 達(dá)雷爾·斯利普 申請(qǐng)人:諾維信生物制藥丹麥公司