專利名稱：：寡肽酪氨酸酶抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酪氨酸酶抑制劑領(lǐng)域，并涉及抑制該酶的處理方法和組合物。相關(guān)技術(shù)本發(fā)明涉及新型生物作用劑，具體地說(shuō)，涉及可降低酪氨酸酶活性的寡肽。這些作用劑可用作基礎(chǔ)科學(xué)研究和診斷應(yīng)用中的研發(fā)工具，用作治療以色素沉著為特征的皮膚病的藥妝品(cosmeceutical)，和用作治療依賴?yán)野彼崦富钚源龠M(jìn)其腫瘤發(fā)生的病理狀態(tài)的治療劑。黑色素對(duì)于保護(hù)人體免于紫外線的有害影響起重要作用。黑色素還是醫(yī)學(xué)和美容學(xué)中的一種重要因子。已知黑色素在皮膚組織中形成或合成。黑色素過(guò)多導(dǎo)致皮膚變黑，黑色素分布不均勻?qū)е曼S褐斑和雀斑，它們都是皮膚疾病。黑色素的生物合成涉及酪氨酸催化羥基化為L(zhǎng)-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)及L-DOPA轉(zhuǎn)變成多巴色素(dopachrome)。抑制黑色素合成的一種有效方法是阻斷酪氨酸的羥基化。氫醌(HQ)從1950年代起即被用于可商購(gòu)的非處方皮膚美白產(chǎn)品，從1960年代起即用作可商購(gòu)的醫(yī)藥品。它還被用于化妝品，例如染發(fā)劑和美甲產(chǎn)品。從2001年開始，在歐盟國(guó)家HQ已不被許可用于化妝用皮膚美白制劑，盡管含有熊果苷(一種HQ類似物)的產(chǎn)品和植物性藥材(botanicals)，包括天然含有HQ和熊果苷的植物，仍然存在于歐洲國(guó)家的市場(chǎng)上。另見Matsubayashi等，"Pharmaceuticalandclinicalassessmentofhydroquinoneointmentpreparedbyextemporaneousnonsterilecompounding,，，BiolPharmBull.2002Jan;25(1):92-6。如該文公開的，在日本已經(jīng)模仿在美國(guó)和歐盟可商購(gòu)的皮膚美白霜(skinlighteningcream)利用即時(shí)無(wú)消毒的配合法(extemporaneousnonsterilecompounding)制備皮膚脫色劑氫醌(HQ)的軟膏。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種問(wèn)題，包括HQ軟膏的色差、相對(duì)較大的效力差異和不良的副作用，盡管它們較為溫和。HQ的公開IC50大約為700iiM。含有氫醌的療法在亞洲國(guó)家已經(jīng)被法律禁止，使得許多受這種疾病困擾的人們無(wú)法接受常規(guī)HQ治療。實(shí)際上，美國(guó)FDA已經(jīng)發(fā)布一項(xiàng)聲明表示其也可能禁止在國(guó)內(nèi)使用氫醌。而且，氫醌與內(nèi)臟惡性腫瘤有關(guān)，選擇長(zhǎng)期局部給藥的治療方式可能帶來(lái)潛在的危害。在最佳條件下，氫醌僅能部分地減輕色素沉著過(guò)度。一些藥妝品制劑包含其它活性成分，例如曲酸(kojicacid)、熊果苷和維生素C，但是由于化學(xué)品的不穩(wěn)定性和不能將活性輸送到合適的皮膚層等問(wèn)題，迄今為止，效果仍然令人失望。盡管采用了更高的濃度，但是患者經(jīng)常由于皮膚剌激而中斷治療。為此，人們添加局部類固醇來(lái)減輕活性成分例如視色素A和氫醌造成的剌激。因?yàn)楹诎卟?melasma)和其它色素沉著過(guò)度(hyperpigmentary)疾病經(jīng)常需要數(shù)月到數(shù)年的治療，所以，以對(duì)抗活性成分剌激效果所需的強(qiáng)度對(duì)面部局部使用類固醇，不可能不會(huì)導(dǎo)致局部類固醇誘發(fā)的副作用。當(dāng)對(duì)面部連續(xù)局部使用中等或更高的效力的類固醇超過(guò)數(shù)周時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)皮膚萎縮(skinatrophy)、變脆和毛細(xì)血管擴(kuò)張(telengiectasia)。這種副作用是不可接受的，特別是在面部等區(qū)域。紅外激光器的使用已經(jīng)獲得了一些成功。它們一般對(duì)于將色素定位于較深層皮膚區(qū)域(例如真皮)的疾病效果較好。為了有效地處理表皮，通常采用切除治療(ablativetreatment)。該治療伴隨著患者長(zhǎng)期停工(downtime)，包括造成二度燒傷(second-degreebum)或者糜爛(erosion)，使患者容易被感染。此外，激光治療是一個(gè)昂貴的治療選項(xiàng)，許多患者承擔(dān)不起。在極端的情形，當(dāng)漂白劑不成功時(shí)，有人采取皮膚脫色(d印igmentation)的手段。很多病理狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致色素異常沉積在皮膚內(nèi)。例如，眾所周知，激素失調(diào)會(huì)導(dǎo)致面部和肢端色素沉著過(guò)度，這最常見于婦女懷孕期間或產(chǎn)后。這種色素沉著過(guò)度往往會(huì)影響到容貌，導(dǎo)致自尊心問(wèn)題和社交尷她。黑斑病經(jīng)常影響Fitzpatrick型IV-VI皮膚的個(gè)體。這些人占世界人口的相當(dāng)大一部分。很多具有Fitzpatrick型IV-VI皮膚的個(gè)體是亞裔。根據(jù)Fitzpatrick皮膚類型尺度(scale)，基于對(duì)陽(yáng)光照射的外觀和皮膚反應(yīng)測(cè)試，個(gè)體可大體上被如下分類I型膚色很淺(Veryfairskintone)，白膚金發(fā)碧眼(blond)或紅發(fā)(redhead)，II型膚色淺(Lightskintone)，可曬成棕色(tan)，但是經(jīng)常曬黑(burns)，III型膚色白到橄欖色，有時(shí)曬黑，IV型膚色中等棕色，很少曬黑，V型膚色暗棕，非常少曬黑，VI型膚色黑，眼睛很黑，不易曬黑(burnresistant)。除了黑斑病之外，在粉剌和酒糟鼻等病癥所導(dǎo)致的炎癥等之后可能在容易影響外貌的區(qū)域(例如面部)發(fā)生高色素沉著。這些狀況也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心理不適。在美國(guó)，每年有130億美元用于藥妝品消費(fèi)。由于美國(guó)市場(chǎng)上對(duì)氫醌禁用的預(yù)期，加上市場(chǎng)上現(xiàn)有的其它非藥物制劑仍然存在穩(wěn)定性(維生素C)或輸送(熊果苷、曲酸等)方面的問(wèn)題，寡肽抑制劑可能為這種亟待解決的巨大需求提供一條解決之道。具體的專利和出版物Scot等，"Productionofcyclicpeptidesandproteinsinvivo，，，Proc.Nat.Acad.Sci.Vol.96，Issue24，13638-13643，November23，1999，公開了在細(xì)菌中產(chǎn)生環(huán)狀八氨基酸酪氨酸酶抑制齊U(cyclic,eight-aminoacidtyrosinaseinhibitor)pseudostenarinF。Verma等，"Modulationofagonistbindingtohumandopaminerec印torsubtypesbyL_prolyl_L_leucyl_glycinamideandap印tidomimeticanalog,"JPharmacolExpTher.2005Dec;315(3):1228-36.Epub2005Aug26，公開了下丘腦三肽L-脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰胺(PLG)及其構(gòu)象約束模擬物(conformationallyconstrainedanalog)3(R)-[(2(S)-吡咯烷基羰基)氨基]-2-氧-1-吡咯烷乙酰胺(PA0PA)在調(diào)節(jié)激動(dòng)劑與人多巴胺(DA)受體亞型的結(jié)合中的作用。于2000年12月26日授權(quán)公告的授予Yamada等的US6，165，982，標(biāo)題為"Useofsericinasantioxidantsandtyrosinaseinhibitors"的專利，公開了——禾中可用作抗氧化劑或酪氨酸酶活性抑制劑的組合物，其包含作為活性成分的、足夠量的絲膠蛋白(sericin)以發(fā)揮抗氧化能力。絲膠蛋白是絲綢的一種高分子量、天然、可溶糖蛋白組分。絲膠蛋白與皮膚和毛發(fā)的角蛋白結(jié)合，形成保護(hù)性膜。于1992年6月30日公告的授予Takeuchi等的US5，126，327，標(biāo)題為"Melanocyte-stimulatinghormoneinhibitorandexternalpreparationcontainingthesame"的專利，公開了一種促黑激素抑制劑，其具有一定的氨基酸序列，一個(gè)具有1-12個(gè)碳原子的酰基，一個(gè)氨基酸殘基，或其具有1-12個(gè)碳原子的?；苌?，具有2-40個(gè)氨基酸殘基的肽殘基或其?；苌?。于2006年4月11日公告的授予Arquette的US7，025，957，標(biāo)題為"Compositionandmethodtowhitenskin"的專利，公開了一種可有效作為皮膚增白劑的組合物。該組合物包括Simmondsin，——禾中從力口州希蒙得木粉(jojobameal)(Simmondsiachinensis)提取出的苷。在某些實(shí)施方案中，該組合物包括加州希蒙得木(Simmondsiachinensis)提取物。該組合物通過(guò)向個(gè)體局部涂施可有效美白皮膚的量的制劑，其中該組合物包括加州希蒙得木提取物。于2006年8月1日公告的授予Fotinos等的US7，083，781，標(biāo)題為"Filmformingpolymers,methodsofuse，anddevicesandapplicationsthereof，，的專利，公開了用于向受試者的皮膚輸送活性劑的組合物和方法，包括聚合物、活性成分和溶劑，該組合物能夠通過(guò)滾壓(rolling)、涂布(spreading)、噴霧(aerosol)或以液滴形式進(jìn)行輸送，并且能夠形成與皮膚接觸的膜。該成膜組合物中可以摻入本領(lǐng)域已知的化妝活性劑，用于改善皮膚外觀。用于制衡該癥候的典型抗色素沉著過(guò)度劑包括酪氨酸酶抑制劑，例如肽混合物和植物提取物、發(fā)酵產(chǎn)物，和抗氧化劑，例如氫醌、曲酸、抗壞血酸衍生物、氫醌的合成或天然衍生物和氫醌的前體。在該發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗色素沉著過(guò)度劑是Pentharm公司(巴塞爾，瑞士)的Melawhite;Coletica(法國(guó))的BiowhiteTM;Sederma(法國(guó))的Etioline;Kelesima(意大利)的Arbossa;Gattefosse(法國(guó))的Gatulinewhitening;Exsymol(摩纟內(nèi)哥)的AscorbocilanC禾口AlpsPharm(曰本)的曲酸。于2006年10月24日公告的授予Lee的US7，125，572，標(biāo)題為"Tyrosinaseinhibitorextract"的專利，公開了來(lái)自檸檬皮的酪氨酸酶抑制劑提取物。該酪氨酸酶抑制劑提供了有利的皮膚美白效果。根據(jù)該發(fā)明，該發(fā)明的酪氨酸酶抑制劑提取物在280nm具有主吸收。這表明，該酪氨酸酶抑制劑提取物含有某種蛋白或肽。人們認(rèn)為這種蛋白質(zhì)或肽是抑制酪氨酸酶的主要活性成分。提取物的其它成分可能提供額外的效果，例如抗老化和抗氧化。酪氨酸酶抑制劑提取物可以被制備成多種形式，包括護(hù)膚液(lotions)、乳膠、6CN101795702A乳霜(creams)、軟膏、貼劑(sticks)、溶液、包劑(pack)和凝膠。酪氨酸酶抑制劑提取物可以和任何化妝品中通常使用的成分混合，例如油性物質(zhì)、保濕劑、增稠劑、防腐劑、乳化劑、藥物成分、香料、乳化穩(wěn)定劑等。授予Ramaiah的US6，143，723教導(dǎo)，根據(jù)下文的YR序列的肽可提高而非降低皮膚色素沉著，這一點(diǎn)在本文中也得到了證明。各種其它的專利和出版物公開了無(wú)關(guān)的肽。見例如US5，789，382，其公開TyrArgSerArgLysTyrSerSerTrpTyr作為FGF受體的阻斷肽。
發(fā)明內(nèi)容下面的簡(jiǎn)述不意圖包括本發(fā)明的全部特征和方面，也不意味著本發(fā)明必須包含在本簡(jiǎn)述中討論的全部特征和方面。本發(fā)明涉及某些肽序列，例如>1SEQIDNO:1KFEKKFEK(KF肽)>2SEQIDNO:2YRSRKYSSWY(YR肽)本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明肽的套盒和組合物，和治療涉及酪氨酸表達(dá)的病癥的方法，其中局部施用本發(fā)明肽，用于治療涉及皮膚中黑素細(xì)胞活性的病癥。其它的制劑可用于處理身體的其它區(qū)域中的酪氨酸酶活性，并可以體內(nèi)施用。因此，在某些方面中，本發(fā)明涉及一種純化的肽，其與氨基酸序列KFEKKFEK具有至少63%的同一性，并且對(duì)酪氨酸酶的IC小于大約10mM。該肽實(shí)際上可以在最多達(dá)3個(gè)位置處被替換，包括缺失。我們給出了關(guān)于進(jìn)行此類改變以及測(cè)試其抑制效力的指導(dǎo)。在一些情況下，肽的IC50小于大約5mM，或者更低。在一些情況下，本發(fā)明包括用R或F替換殘基，因?yàn)檫@些殘基有助于提高肽與酪氨酸酶的結(jié)合。因此，優(yōu)選地，被R或F替換的殘基不是F;如果是，應(yīng)當(dāng)用R替換。類似地，在YRSRKYSSWY情況下，被替換的殘基優(yōu)選地不是R。有1-3個(gè)殘基可以替換成V、A、L、M或I，因?yàn)檫@些殘基有助于提高抑制功能。此外，可以用L或R替換K;用W或Y替換F;用D替換E，因?yàn)橐阎@些殘基是相似的。在一些實(shí)施方案中，讓兩個(gè)帶電氨基酸毗鄰是有利的。在某些方面中，本發(fā)明包括使用D氨基酸作為一些或全部的氨基酸。肽可以和如下文定義的調(diào)節(jié)基團(tuán)，例如棕櫚酸或酯相連。權(quán)利要求l的肽具有兩個(gè)毗鄰的帶電氨基酸。在某些方面中，本發(fā)明的替換可以用表格形式提供第1列-列舉殘基第2列-新殘基KL或RFW或YED7在某些方面中，本發(fā)明包括可用于皮膚美白的局部制劑。該制劑是用皮膚醫(yī)學(xué)可接受的成分制成的。該制劑可以包括通用載體材料，在某些情況下，還可以包括第二處理藥劑和與選自YRSRKYSSWY和KFEKKFEK的序列基本上相同的肽。這些肽可以如上文所述地進(jìn)行改變。在某些實(shí)施方案中，可以對(duì)這些制劑進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以適應(yīng)可能的非處方用途或處方用途。對(duì)于非處方用途，可以使用肽濃度小于大約IC50濃度兩倍的制劑。對(duì)于處方用途，肽濃度可以為IC50濃度的2-100倍。本發(fā)明肽在某些方面優(yōu)于HQ，并可以配制成基本上沒(méi)有HQ。在某些制劑中，可以組合具有不同的序列、不同的附接基團(tuán)等等的不同的肽。載體可以包括選自下組的材料保濕制劑(hydratingformulations)、抗氧化制劑和自由基清除劑。在某些制劑中，可以通過(guò)將肽配制在脂質(zhì)體中而使肽被皮膚更好地?cái)z取。在某些方面中，本發(fā)明包括皮膚處理方法，包括皮膚美白(增白)。本方面包括用于處理皮膚的方法，包括向皮膚施用與(a)KFEKKFEK或(b)YRSRKYSSWY中之一基本上相同的肽，其中所述肽的施用可充分地抑制酪氨酸酶而減輕皮膚色素沉著(lightenskinpigmentation)。該施用可以包括施用局部制備物，如上文所述，并可以進(jìn)一步包括第二處理產(chǎn)品。本發(fā)明的處理方法還包括在微晶皮膚磨削(microdermabrasion)過(guò)程的進(jìn)一步幫助下進(jìn)行皮膚美白。該施用可以和微晶皮膚磨削過(guò)程同時(shí)進(jìn)行。該施用和輻射處理聯(lián)合進(jìn)行。這些過(guò)程可用于增加皮膚滲透性。而且，該施用可以和用研磨設(shè)備(abradingdevice)、微針、電穿孔設(shè)備或離子電滲設(shè)備實(shí)施的物理處理聯(lián)合使用。在某些方面中，本發(fā)明包括用于實(shí)施皮膚美白程序的套盒，其包括對(duì)酪氨酸酶的IC50小于大約10mM的純化肽，選自下組具有YR肽或KR肽序列的肽，或者具有與YR肽或KR肽序列有至少63%同一性的序列的肽；皮膚醫(yī)學(xué)上可接受的載體；第二處理產(chǎn)品；和使用說(shuō)明。該套盒可以面向消費(fèi)者或者醫(yī)生；該套盒可以包括肽與載體的預(yù)組合，從而制劑可以直接施用；或者可能需要將肽與載體混合。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了KF肽和對(duì)照肽KFEFKFEF(SEQIDNO:4)的體外效果，顯示只有KF肽具有抑制活性。圖2是YR肽、對(duì)照VLLK(SEQIDNO:3)、和聚L_乳酸的活性的圖，顯示只有YR肽對(duì)酪氨酸酶具有抑制活性。圖3是顯示對(duì)照氫醌(HQ)和YR肽(以"P4"表示)的增殖速度的柱狀圖。濃度標(biāo)示在每種肽的旁邊?？梢奩R肽沒(méi)有抑制黑素細(xì)胞的細(xì)胞增殖。圖4是比較將細(xì)胞與HQ和YR肽(以"P4"表示)溫育之后黑色素含量的柱狀圖。濃度標(biāo)示在每種肽的旁邊?？梢奩R肽抑制了人黑素細(xì)胞中黑色素的合成。圖5是顯示將細(xì)胞與HQ和YR肽(以"P4"表示)溫育之后酪氨酸酶活性的柱狀圖。濃度標(biāo)示在每種肽的旁邊。YR肽酪氨酸酶活性對(duì)抑制作用與HQ相當(dāng)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明才既述本文公開了一些大約6-12個(gè)氨基酸的短肽，并顯示了它們具有對(duì)酪氨酸酶的抑制活性。在一些實(shí)施方案中，短序列肽是用天然存在的氨基酸合成設(shè)計(jì)的(syntheticallydesigned)，因此是生物學(xué)安全的。可以通過(guò)多種容許到達(dá)合適的皮膚層的機(jī)制，包括但不限于脂質(zhì)體，將它們輸送到黑素細(xì)胞。這些肽不會(huì)像通常使用的成分維生素C那樣受到氧化問(wèn)題的困擾。這些肽不像氫醌那樣會(huì)導(dǎo)致肝癌，而且因?yàn)樗鼈儊?lái)源于天然存在的氨基酸，所以在使酪氨酸酶失活后容易在細(xì)胞內(nèi)降解。它們可以通過(guò)抑制黑色素合成而導(dǎo)致皮膚美白(lightening)或增白(whitening)。定義除非另外定義，否則本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的意思與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所通曉的意思相同。盡管在實(shí)踐和測(cè)試本發(fā)明時(shí)，可以使用任何與本文所述相似或等同的方法和材料，但這里描述了優(yōu)選的方法和材料。一般來(lái)說(shuō)，與細(xì)胞和分子生物學(xué)和化學(xué)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知并且普遍使用的。某些實(shí)驗(yàn)技術(shù)沒(méi)有具體定義，則一般根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法，以及本專利說(shuō)明書通篇中引用和討論的各類一般性的及更專門的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容來(lái)進(jìn)行。為了清楚，下文對(duì)如下術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義。術(shù)語(yǔ)"酪氨酸酶"在本文用于表示單酚單加氧酶(EC1.14.18.1;CAS編號(hào)9002-10-2)，一種催化酚類(例如酪氨酸)氧化的酶。它是存在于植物和動(dòng)物組織中的一種含銅酶，催化通過(guò)氧化由酪氨酸產(chǎn)生黑色素和其它色素。所有酪氨酸酶均在活性位點(diǎn)內(nèi)具有一個(gè)雙核3型銅核心(bi皿cleartype-3co卯ercenter)。這里，兩個(gè)銅原子中的每一個(gè)與三個(gè)組氨酸殘基配位。Matoba等，"Crystallogr即hicevidencethatthedi皿clearcoppercenteroftyrosinaseisflexibleduringcatalysis,"JBiolChem.，2006Mar31;281(13):8981-90.Epub2006Jan25，公開了酪氨酸酶催化中心的三維模型。術(shù)語(yǔ)"肽"在本文用其常規(guī)意思，即以氨基酸為單體并通過(guò)酰胺鍵連接起來(lái)的聚合物，又可稱作多肽。當(dāng)氨基酸是a-氨基酸時(shí)，可以使用L-光學(xué)異構(gòu)體或D-光學(xué)異構(gòu)體。此外，也包括非天然氨基酸，例如e-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。本發(fā)明的肽的長(zhǎng)度是兩個(gè)或多個(gè)氨基酸單體，并可以長(zhǎng)達(dá)20個(gè)氨基酸單體。使用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫(如下文所述)。術(shù)語(yǔ)","是指一般用于配制藥用化合物，用于提高治療用酪氨酸抑制劑的穩(wěn)定性、無(wú)菌性和輸送能力(deliverability)的化合物。當(dāng)肽輸送系統(tǒng)配制為溶液或混懸液時(shí)，輸送系統(tǒng)是可接受的載體，優(yōu)選地是含水載體?？梢允褂枚喾N含水載體，例如水、緩沖水、0.8%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可以通過(guò)常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)滅菌，或者可以無(wú)菌過(guò)濾。所得的水溶液可以包裝供直接使用，或者凍干，凍干的制備物在施用之前與滅菌溶液混合。組合物可以包含模擬合適的生理?xiàng)l件所需要的藥物可接受的輔料，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)物(tonicityadjustingagent)、潤(rùn)濕劑等，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、失水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸等。術(shù)語(yǔ)"局部的(topical)"或"局部地"(topically)在本文中使用其常規(guī)意思，是指這樣的點(diǎn)，其可以在身體任何部分之中或之上，包括但不限于表皮、任何其它真皮或任何其它身體組織。局部施用或涂施意味著肽與含有產(chǎn)黑色素細(xì)胞的組織，例如皮膚或膜，直接接觸。將本局部藥劑施用于皮膚或粘膜的方法包括"非定形"(non-finite)或液體或半液體載體，例如凝膠(gel)、護(hù)膚液(lotions)、乳劑(emulsion)、乳霜(cream)、膏藥(plaster)或軟膏(ointment)，或者"定形"(finite)載體，保持其形狀的非擴(kuò)散性物質(zhì)，例如貼劑(patch)、敷料劑(dressings)和繃帶(bandages)。用于定形和非定形活性肽的溶劑是無(wú)毒、藥物可接受的物質(zhì)，優(yōu)選地是液體，其對(duì)系統(tǒng)的粘附性或溶解性沒(méi)有顯著的不利影響。溶劑優(yōu)選地是某種多羥基醇或多種多羥基醇的組合。術(shù)語(yǔ)"多羥基醇"的意思是任何有機(jī)多元醇，包括一縮二丙二醇(dipropyleneglycol)、丙二醇、聚乙二醇、甘油、丁二醇、己二醇、聚氧乙烯、聚丙二醇、山梨醇、乙二醇等。其它合適的溶劑包括脂肪酸，例如油酸、亞油酸、癸酸等，以及脂肪酯或醇。進(jìn)一步合適的溶劑包括其它在皮膚或透皮組合物中普遍用于溶解肽基組合物的無(wú)毒、非揮發(fā)性溶劑。術(shù)語(yǔ)"序列同一件"在兩條多肽序列的語(yǔ)境中，是指當(dāng)兩條多肽以最大相應(yīng)度比對(duì)時(shí)，兩條多肽中相同的殘基。用于比較的最佳序列比對(duì)可以通過(guò)下述方法進(jìn)行例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法(localhomologyalgorithm),Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對(duì)算法(homologyalignmentalgorithm)，Pearson禾口Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的搜索相似性方法(searchforsimilaritymethod)，這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方式(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup，5775ScienceDr.，Madison,Wis.中的GAP,BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA)，或者通過(guò)檢視(inspection)。序列同一性可以根據(jù)與參考序列相同的殘基來(lái)計(jì)算。例如，對(duì)于具有8個(gè)殘基的KFEKKFEK，可能具有5個(gè)相同的殘基，并具有5/8或62.5(63%)的序列同一性。由于肽的長(zhǎng)度有限，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)進(jìn)行改變時(shí)，至少63%的同一性視為"基本上相同"。也可以有6/8(75%)或7/8(88%)的序列同一性。另舉一例，殘基可以被消除，例如E(谷氨酸)可以變?yōu)閂、L、M或I，并且可以具有7/8或88%的同一性。在YR肽的方法或制劑的場(chǎng)合，可以修改3/10個(gè)殘基，而獲得70%的同一性。術(shù)語(yǔ)"^J^IM"在本文用于表示多肽序列的這樣的特征，其中多肽的序列與參考序列相比，在整個(gè)肽長(zhǎng)度的比對(duì)窗口上具有至少60%的序列同一性，優(yōu)選地至少85%的同一性，和經(jīng)常90-95%的序列同一性，更通常地至少99%序列同一性?；旧系南嗤€包括氨基酸的保守替換。術(shù)語(yǔ)"基本上相同"，在本發(fā)明的8或10個(gè)殘基的肽的語(yǔ)境中，是指根據(jù)本文的教導(dǎo)中特別提及的進(jìn)行此類替換的指導(dǎo)，以及上文的定義，允許有3個(gè)氨基酸替換。保守的氨基酸替換，是在由具有相近側(cè)鏈的氨基酸組成的家族中發(fā)生的替換?；蚓幋a的氨基酸一般分成如下家族(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電極性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的家族是絲氨酸和蘇氨酸為脂肪族-羥基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺為含酰胺家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂肪族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳香族；半胱氨酸和甲硫氨酸是含硫側(cè)鏈家族。例如，有理由預(yù)期，孤立地用異亮氨酸或纈氨酸替換亮氨酸，用谷氨酸替換天冬氨酸，用絲氨酸替換蘇氨酸，或用類似地用結(jié)構(gòu)相近的氨基酸替換某個(gè)氨基酸，不會(huì)對(duì)所得分子的結(jié)合性質(zhì)產(chǎn)生較大影響，特別是當(dāng)替換不涉及框架位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸時(shí)。優(yōu)選的保守氨基酸替換家族是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸_精氨酸，丙氨酸_纈氨酸，谷氨酸_天冬氨酸，半胱氨酸_甲硫氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。進(jìn)一步說(shuō)明如何進(jìn)行氨基酸替換。替換可以通過(guò)將給定殘基變?yōu)镽或F以增加結(jié)合性，或者將其變成V、A、L、M或I以增加抑制性。可以讓肽的一部分負(fù)責(zé)結(jié)合酪氨酸酶，讓另一部分負(fù)責(zé)進(jìn)行抑制。一般優(yōu)選地不改變F或R，或者不改變K或E，以及Y或W。對(duì)于變成Y的改變，應(yīng)當(dāng)在整體序列的背景下進(jìn)行考慮，因?yàn)樵摎埢抢野彼崦傅奶烊坏孜?。?yīng)當(dāng)注意的是，某些改變實(shí)際上會(huì)導(dǎo)致酪氨酸酶活性增加。進(jìn)一步的指導(dǎo)可見Schurink等，"Novelpeptideswithtyrosinaseinhibitoryactivity,，，P印tides28:485:495(Jan.2007)。術(shù)語(yǔ)"^JIMM"在本文中用于表示擔(dān)當(dāng)哺乳動(dòng)物(例如人、狗、貓等)最外部的保護(hù)性遮蓋的含有角蛋白的層，包括但不限于，皮膚、粘膜、嘴唇(lips)、毛發(fā)、趾甲、指甲、角質(zhì)層(cuticles)、蹄等。術(shù)語(yǔ)"^M^M"在本文中的意思是在角質(zhì)組織的表面上涂施(即plication)或涂布(spread)本發(fā)明的組合物。術(shù)語(yǔ)"皮膚醫(yī)學(xué)可接受的"在本文中的意思是所沭的組合物和成分適合用于接觸哺乳動(dòng)物角質(zhì)組織使用，不會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、變應(yīng)性應(yīng)答等。術(shù)語(yǔ)"aaiMr在本文中的意思是適合于注射進(jìn)入人和/或動(dòng)物體內(nèi)的制劑，其中注射是皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。這些制劑是無(wú)菌、無(wú)致熱源，并處于生理學(xué)可接受的pH。術(shù)語(yǔ)"輻射過(guò)禾呈"在本文中意指一種對(duì)受試者皮膚或內(nèi)部組織的處理過(guò)程，其用于化妝或治療目的。該術(shù)語(yǔ)包括使用電磁輻射裝置，例如激光器、LED、射頻等。該術(shù)語(yǔ)還包括使用超聲裝置。所有這些裝置都用于可能利用本發(fā)明的作用劑來(lái)實(shí)施皮膚美白的過(guò)程中。某些上述的過(guò)程可改變角質(zhì)層的滲透性，并可有利地用于施用本發(fā)明肽的處理。術(shù)語(yǔ)"I^^"在本文中意指實(shí)現(xiàn)酪氨酸酶活性的50%抑制(通過(guò)體外測(cè)定實(shí)施)所需的酪氨酸酶抑制劑肽的濃度；"小于"某個(gè)特定濃度的值包括更低濃度的IC50值。術(shù)語(yǔ)"大約"可以包括加減10%的變化，以及由不同試齊U、實(shí)驗(yàn)條件導(dǎo)致的變化等。用純化的酪氨酸酶制備物(例如蘑菇酪氨酸酶)體外測(cè)定IC50可用于確定臨床劑量。通用方法和材料本發(fā)明的材料和方法在廣義上是可抑制酪氨酸酶活性的肽，并可以配制成用于人體。因此，它們可用于治療或減輕涉及黑色素過(guò)量產(chǎn)生的病癥。It本發(fā)明的肽包括保留抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的能力的肽類似物或肽衍生物或肽模擬物(p印tidomimetics)。例如，本發(fā)明的抑制性肽酪氨酸酶調(diào)節(jié)物可以被修飾，以增加其穩(wěn)定性、生物利用度、可溶性等。術(shù)語(yǔ)"肽類似物"、"肽衍生物"和"肽模擬物"在本文中包括模擬肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)并保留肽的功能性質(zhì)的分子。設(shè)計(jì)肽類似物的方法是本領(lǐng)域已知的。例如見Farmer,P.S.，于DrugDesign(E.J.Ariens，ed.)AcademicPress,NewYork,1980，vol.10，pp.119-143;Ball.J.B.andAlewood，P.F.(1990)J.Mol.Recognition3:55;Morgan，B.A.andGainor，J.A.(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24:243;以及Freidinger，R.M.(1989)TrendsPharmacol.Sci.10:270。肽類似物、衍生物、和肽模擬物的實(shí)例包括用一種或多種苯并二氮卓(benzodiaz印ine)分子替換的肽(見James，G丄.等.(1993)Science260:1937-1942)，具有甲基化酰胺連接的肽，和"逆反式"(retro-inverso)肽(見Sisto的美國(guó)專利4，522，752)。肽類似物、肽衍生物和肽模擬物在下文有進(jìn)一步的描述。本發(fā)明的肽可以包括來(lái)自任何天然氨基酸或者任何非天然氨基酸的殘基。這些天然的和非天然的氨基酸可以是D或L構(gòu)型。術(shù)語(yǔ)D和L在本文中使用其本領(lǐng)域已知的意思。本發(fā)明的肽包括單個(gè)氨基酸和小段(例如1-10個(gè))的多個(gè)氨基酸。此外本發(fā)明的修飾肽還可以包括單體或二聚體。本文使用氨基酸的通用單字母和三字母編碼，如下所示A(Ala)丙氨酸C(Cys)半胱氨酸D(Asp)天冬氨酸E(Glu)谷氨酸F(Phe)苯丙氨酸G(Gly)甘氨酸H(His)組氨酸I(lie)異亮氨酸K(Lys)賴氨酸L(Leu)亮氨酸M(Met)甲硫氨酸N(Asn)天冬酰胺P(Pro)脯氨酸Q(Gln)谷氨酰胺R(Arg)精氨酸S(Ser)絲氨酸T(Thr)蘇氨酸V(Val)纈氨酸W(Trp)色氨酸Y(Tyr)酪氨酸如上所述，指定的殘基可以是天然的L氨基酸，或者其修飾物，即化學(xué)修飾物、光學(xué)異構(gòu)體、或者與修飾基團(tuán)相連。我們意圖在肽內(nèi)可進(jìn)行特定的修飾，但保留本發(fā)明肽特異性抑制酪氨酸酶的下述活性的能力其中酪氨酸酶通過(guò)該活性催化色素合成途徑的前兩個(gè)步驟氨基酸酪氨酸被羥化成二羥苯丙氨酸(DOPA)和/或隨后氧化成多巴醌。我們還意圖可以在特定的序列中進(jìn)行特異的修飾，以便向該肽提供某些額外的期望性質(zhì)。蛋白結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以被其它氨基酸替換，而不會(huì)顯著損失肽活性。由于限定某種肽的生物學(xué)功能活性的是該肽的相互作用能力(interactivecapacity)和性質(zhì)，所以即使在短肽序列中也能進(jìn)行某些氨基酸序列替換，而仍然能夠獲得具有相似性質(zhì)的肽。因此，本發(fā)明人預(yù)期，在本發(fā)明酪氨酸酶抑制劑的序列內(nèi)可以進(jìn)行各種改變，而不會(huì)損失生物利用度或活性，并且或許可以提高期望的活性。例如，在設(shè)計(jì)具有酪氨酸酶抑制劑性質(zhì)的肽構(gòu)建體時(shí)，可以使用替換來(lái)調(diào)節(jié)該分子的一種或多種性質(zhì)。這樣的變異體通常在肽的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)氨基酸被交換為另一個(gè)氨基酸。例如，肽結(jié)構(gòu)內(nèi)的某些氨基酸可以被其它的氨基酸替換，以提高結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力。還可以用D-氨基酸替換L-氨基酸，或者引入某些側(cè)鏈共價(jià)修飾。在制造這些改變時(shí)，可能要考慮氨基酸的親水指數(shù)(hydropathicindex)。親水氨基酸指數(shù)在為蛋白提供相互作用生物學(xué)功能中的重要性是本領(lǐng)域普遍理解的(KyteandDoolittle，1982)。人們公認(rèn)，氨基酸的相對(duì)親水性質(zhì)對(duì)最終蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)，而該二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步限定了蛋白與其它分子，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等，的相互作用。每一種氨基酸均根據(jù)其疏水性和電荷特征被給予了一個(gè)親水指數(shù)(hydropathicindex)(KyteandDoolittle，1982)，它們是異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(_0.9);酪氨酸(_1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(_4.5)。在修飾本文示例的序列時(shí)，可以將某些氨基酸替換為其它具有相似親水指數(shù)或得分(hydropathicindexorscore)的氨基酸，仍然獲得具有相似的生物學(xué)活性的蛋白，即仍可獲得生物學(xué)上功能等價(jià)的蛋白質(zhì)。在進(jìn)行這類改變時(shí)，優(yōu)選替換親水指12數(shù)(hydropathicindex)在±2之內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選替換親水指數(shù)(hydropathicindex)士l之內(nèi)的氨基酸，更特別優(yōu)選的是替換親水指數(shù)(hydropathicindex)在±0.5之內(nèi)的氨基酸。還可以根據(jù)親水性(hydrophilicity)有效地進(jìn)行相似氨基酸的替換。美國(guó)專利4，554，IOI(援引并入本文)指出，蛋白的最大局部平均親水性(hydrophilicity)——其是由其相鄰氨基酸的親水性(hydrophilicity)決定的——與該蛋白的生物學(xué)性質(zhì)關(guān)聯(lián)。如美國(guó)專利4，554，101中詳細(xì)描述的，給氨基酸殘基指定了如下的親水性(hydrophilicity)值精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);蘇氨酸(_0.4);脯氨酸(-0.5±);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。在修飾示例序列時(shí)，氨基酸替換還可以一般地基于氨基酸側(cè)鏈替換物的相對(duì)相似性，例如其疏水性、親水性(hydrophilicity)、電荷、尺寸等，但也可以突出肽的某種特定性質(zhì)?？紤]到各種前述特征的替換實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括精氨酸和賴氨酸，它們與組氨酸都在生理PH下呈堿性；谷氨酸和天冬氨酸(酸性)；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。天然存在的氨基酸側(cè)鏈如下所示，其中*代表與化合物骨架連接的點(diǎn)13<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>本發(fā)明肽的氨基酸還可以被修飾，從而使氨基?；?、烷基化或芳基化。芐基基團(tuán)(benzylgroups)可以被卣化、亞硝基化、烷基化、磺化或?；８鞣N化學(xué)修飾的氨基酸均可以加入到本發(fā)明肽內(nèi)。它們的實(shí)例包括乙?；腘-乙酰-L-丙氨酸，N-乙酰-L-精氨酸；N-乙酰_L_天冬酰胺；N_乙酰_L_天冬氨酸；N-乙酰-L-半胱氨酸；N-乙酰-L-谷氨酰胺；N-乙酰_L_谷氨酸；N_乙酰甘氨酸；N-乙酰-L-組氨酸；N-乙酰-L-異亮氨酸；N-乙酰-L-亮氨酸；N2-乙酰-L-賴氨酸；N6-乙酰-L-賴氨酸；N-乙酰-L-甲硫氨酸；N-乙酰-L-苯丙氨酸；N-乙酰_L_脯氨酸；N-乙酰-L-絲氨酸；N-乙酰-L蘇氨酸；N-乙酰-L-色氨酸；N-乙酰_L_酪氨酸；N_乙酰-L-纈氨酸。酰胺化的L-丙氨酸酰胺，L-精氨酸酰胺甲?；腘-甲酰-L-甲硫氨酸羥某化的4-羥基-L-脯氨酸脂質(zhì)改件的(LIPIDMODIFIED)S-法尼基-L-半胱氨酸，S-香葉酰香葉?；?geranylgeranyl)-L-半胱氨酸，N-棕櫚酰-L-半胱氨酸，S-棕櫚酰-L-半胱氨酸，N-肉豆蔻酰_甘氨酸，N6-肉豆蔻酰-L-賴氨酸甲某化的N-甲基-L-丙氨酸，N，N，N-三甲基-L-丙氨酸，"-N，"_N_二甲基_L_精氨酸L-P-甲基硫代天冬氨酸(methylthioasparticacid)，N5_甲基-L-谷氨酰胺，L-谷氨酸5-甲酯3'-甲基《-組氨酸，恥-甲基-L-賴氨酸，N6，N6-二甲基-L-賴氨酸，N6，N6，N6-三甲基_L_賴氨酸，N_甲基_L_甲硫氨酸，N_甲基_L_苯丙氨酸磷酸化的"-N-磷酰(phospho)-L-精氨酸，L-天冬氨酸4-磷酸酐，S_磷酰_L_半胱氨酸，1'-磷?！?組氨酸，3'_磷酰-L-組氨酸，0-磷酰-L-絲氨酸，0-磷酰L-蘇氨酸，04'-磷酰-L-酪氨酸其它L-硒代半胱氨酸，L-硒代甲硫氨酸，L-3-氧代丙氨酸，2-吡咯烷酮_5_羧酸，L_谷氨?；?-甘油基磷酸乙醇胺，2'_[3-甲酰胺基-3-(三甲基銨)丙基]-L-組氨酸(即白喉酰胺(diphthamide))，N6_生物素_L_賴氨酸，N6-(4-氨基-2-羥丁基)_L_賴氨酸(即hypusine)，N6_視黃醛_L_賴氨酸。本發(fā)明肽中包含的其它氨基酸修飾是本領(lǐng)域已知的，在下列文獻(xiàn)中有描述，例如Kuhner等.US6，858，581描述了化學(xué)修飾的抗微生物肽。調(diào)節(jié)基團(tuán)(modulatinggroups)在具有上式(formula)的本發(fā)明酪氨酸酶調(diào)節(jié)物中，可以將用于增加細(xì)胞吸收、提高效力或改善配制(formulation)的調(diào)節(jié)基團(tuán)直接或間接附接在酪氨酸酶抑制劑肽上。例如，調(diào)節(jié)基團(tuán)可以通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)于肽上而直接附接，或者調(diào)節(jié)基團(tuán)可以通過(guò)穩(wěn)定的非共價(jià)締合而間接附接。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)基團(tuán)附接于調(diào)節(jié)物的肽的氨基端?；蛘?，在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)基團(tuán)附接于調(diào)節(jié)物的肽的羧基端。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)基團(tuán)附接于化合物的肽的至少一個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈上(例如通過(guò)賴氨酰殘基的l-氨基，通過(guò)天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的羧基，通過(guò)酪氨酰殘基、絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基，或者通過(guò)氨基酸側(cè)鏈上的其它合適的活性基團(tuán))。關(guān)于制備此類調(diào)節(jié)基團(tuán)的進(jìn)一步指導(dǎo)可見美國(guó)專利5，854，204。本發(fā)明的肽還可以綴合于其它的酪氨酸酶抑制劑，例如曲酸(C6H604;5-羥基-2-(羥甲基)-4-妣喃酮)或gnetol(見BiosciBiotechnolBiochem.2003Mar;67(3):663-5)。另一種用于提高細(xì)胞滲透性的調(diào)節(jié)基團(tuán)是可以被黑色素細(xì)胞識(shí)別和攝取的氨基酸序列。D'Ursi等，"AMembrane-PermeablePeptideContainingtheLast21Residues15oftheGSCarboxylTerminusInhibitsGS—CoupledRec印torSignalinginIntactCells-CorrelationsbetweenPeptideStructureandBiologicalActivity，，，MolPharmacol69:727-736,2006，公開了細(xì)胞滲透性肽，它們能夠運(yùn)送共價(jià)附接的貨物(cargo)——例如內(nèi)源蛋白質(zhì)的肽或多肽片段——通過(guò)細(xì)胞膜。作者們將他們的肽與16-殘基片段penetratin偶聯(lián)；這樣的片段可以偶聯(lián)于本文公開的肽。因此，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)基團(tuán)"的意思是這樣的有機(jī)小分子，它們與肽連接并影響其活性或者通過(guò)提高肽的穩(wěn)定吸收或其它性質(zhì)，或者通過(guò)提供額外的酪氨酸酶抑制。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)基團(tuán)包括環(huán)、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"環(huán)狀基團(tuán)(cyclicgroup)"在本文中意圖包括具有大約3-10個(gè)，優(yōu)選地大約4-8個(gè)，更優(yōu)選地大約5-7個(gè)碳原子的飽和或不飽和(即芳香)環(huán)狀基團(tuán)。環(huán)基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丙基(cyclopropyl)、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)辛基(cyclooctyl)。環(huán)基團(tuán)可以是無(wú)取代的，或者在一個(gè)或多個(gè)環(huán)位置處有取代。因此，環(huán)基團(tuán)可以例如被如下基團(tuán)取代鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、炔基、芳基、雜環(huán)、羥基、氨基、硝基、硫醇、胺、亞胺、酰胺、膦酸鹽或酯(phosphonates)、膦(phosphines)、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、硫醚、磺酰、磺酸醚或酯(sulfonates)、硒醚(selenoethers)、酮、醛、酯、一CF3、一CN、等等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)基團(tuán)包括與肽結(jié)合的脂肪酸，以增加透皮攝取。合適的脂肪酸(意圖包括相應(yīng)的酯)包括選自下組的脂肪酸酯潤(rùn)滑劑棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、月桂酸異丙酯、肉豆蔻酰異丙酯、棕櫚酸異丙酯、棕櫚酸異辛酯、乳酸十二烷基酯和乳酸十六烷基酯。術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)基團(tuán)"意圖包括飽和或不飽和(即芳香)環(huán)狀基團(tuán)，具有大約3-10個(gè)，優(yōu)選地大約4-8個(gè)，更優(yōu)選地大約5-7個(gè)碳原子，其中環(huán)的結(jié)構(gòu)包括大約1-4個(gè)雜原子(heteroatom)。雜環(huán)基團(tuán)包括妣咯烷、、四氫呋喃(oxolane)、四氫噻吩(thiolane)、咪唑、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉。雜環(huán)的一個(gè)或多個(gè)位置可以被如下的取代基取代，例如鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、炔基、芳香基、其它雜環(huán)、羥基、氨基、硝基、硫醇、胺、亞胺、酰胺、膦酸鹽或酯、膦、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、硫醚、磺酰、硒醚(selenoethers)、酮、醛、酯、__CF3、一CN、等等。雜環(huán)還可以和其它環(huán)狀基團(tuán)橋連或稠合。細(xì)本發(fā)明的肽優(yōu)選地配制成局部組合物，其含有皮膚醫(yī)學(xué)可接受的載體。詞組"皮膚醫(yī)學(xué)可接受的載體"在本文中的意思是，該載體適合于局部涂施到角質(zhì)組織，具有良好的美學(xué)性質(zhì)，與本發(fā)明的活性成分(actives)和任何其它成分相容，并且不會(huì)造成任何不良的安全性或毒性問(wèn)題。載體的安全和有效量為組合物的大約50%-大約99.99%，優(yōu)選地大約80%-大約99.9%，更優(yōu)選地大約90%-大約98%，更加優(yōu)選地大約90%-大約95%。載體可以采取多種多樣的形式。例如，乳劑載體，包括但不限于水包油、油包水、水包油包水(water_in_oil_in_water)禾口娃膠包水包油(oil_in_water_in_silicone)乳齊U，可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的載體含有乳齊U，例如水包油乳齊U、油包水乳劑和硅膠包水乳劑。根據(jù)本發(fā)明的乳劑一般含有如上所述的溶液和脂或油。脂或油可以來(lái)源于動(dòng)物、植物或石油，并且可以是天然的或合成的(即人造的)。優(yōu)選的乳劑還含有保濕劑，例如甘油。乳劑優(yōu)選地進(jìn)一步含有以載體重量計(jì)大約0.01%-大約10%，更優(yōu)選地大約0.1%-大16約5%的乳化劑。乳化劑可以是非離子型、陰離子型或陽(yáng)離子型。合適的乳化劑在下列文獻(xiàn)中被公開，例如美國(guó)專利No.3，755，560，1973年8月28日授權(quán)公告；Dickert等；美國(guó)專利No.4，421，769，1983年12月20日授權(quán)公告;Dixon等；和McCutcheon'sDetergentsandEmulsifiers，NorthAmericanEdition,第317—324頁(yè)(1986)。乳劑還可以含有消泡劑，以便將涂施于角質(zhì)組織時(shí)產(chǎn)生的泡沫最小化。消泡劑包括高分子量有機(jī)硅(silicones)和其它本領(lǐng)域眾所周知的用于此用途的材料。合適的乳劑的粘度范圍可以很寬，這取決于期望的產(chǎn)品形式。低粘度乳劑——它們是優(yōu)選的——的實(shí)例的粘度為大約50厘沱或者更低，更優(yōu)選地大約10厘沱或者更低，再優(yōu)選地大約5厘沱或者更低。優(yōu)選的有機(jī)硅包水(water-in-silicone)和水包油乳劑在下列文獻(xiàn)中有更詳細(xì)的描述Bissett等USPGPUB20060188462，2006年8月24日公開，標(biāo)題為"Skincarecompositionscontainingasugaramine，，。本發(fā)明的肽可以被配制在脂質(zhì)體內(nèi)。本發(fā)明的肽可以按照如下的方法包含在脂質(zhì)體中，例如授予Uster等的US4，944，948，標(biāo)題為"EGF/Liposomegelcompositionandmethod"所述的方法，其中用抑制性肽替換該文申采用的EGF。如該文所述，可以用脂質(zhì)體包裹的肽(liposome-entr即pedp印tide)制備帶負(fù)電脂質(zhì)體的高粘度水性分散體。肽/脂質(zhì)體組合物是通過(guò)將脂質(zhì)混合物混懸在低導(dǎo)電率含水介質(zhì)中，形成凝膠樣的組合物而形成的；其中所述脂質(zhì)混合物典型地含有等摩爾量的中性和帶負(fù)電荷的磷脂和膽固醇，所述低導(dǎo)電率含水介質(zhì)含有肽和等電點(diǎn)為pH5.5-8.5的兩性離子化合物。進(jìn)一步的示例指導(dǎo)可見授予Mezei等的US4，485，054，標(biāo)題為"Methodofencapsulatingbiologicallyactivematerialsinmultilamellarlipidvesicles(MLV)，，。本文的肽酪氨酸酶抑制劑還可以被制備成口服或可注射制劑?？勺⑸渲苿┑膒H是重要的，特別是在注射過(guò)程中的安全性和舒適度方面，而且特別是在制備物是作為液體制劑提供時(shí)。合適的制劑可以含有防腐劑，例如苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯等，并且在25t:的pH可為6.8-8.0。pH優(yōu)選地依靠緩沖劑維持。合適的緩沖劑包括醋酸鹽緩沖劑、2-氨基-2-甲基-l-丙醇、甘氨酸緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、(tris〉羥甲基-氨基甲烷)(TRIS)緩沖劑、(2->N-嗎啉代-乙磺酸)等。制劑通常還將包括如上文定義的載體。可注射的制劑適于治療黑素瘤和其它由表達(dá)酪氨酸酶的細(xì)胞衍生的癌癥，例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可見授予Bouchard等的US5，773，291，于1998年6月30日授權(quán)公告，標(biāo)題為"Nornelanotyticmammaliancellconstitutivelyexpressingbiologicallyactivehumantyrosinaseandusethereof"的專利。這些制齊U可用于局部涂施無(wú)法達(dá)到的黑素細(xì)胞，例如非角質(zhì)組織中的黑素細(xì)胞。黑素細(xì)胞可見于表皮基底層，以及毛囊、視網(wǎng)膜、色素層(uvealtract)和柔腦膜。這些細(xì)胞是黑素細(xì)胞的起源部位。關(guān)于口服制劑，示例制劑可見US2007/0134279。本發(fā)明的肽酪氨酸酶抑制劑可以單獨(dú)使用或者互相組合使用。它們還可以和其它生物活性藥物或藥妝品組合使用?？梢酝ㄟ^(guò)脂質(zhì)體或其它經(jīng)皮輸送機(jī)制，例如破壞性裝置(disruptivedevice)等，來(lái)輸送它們?？梢詫㈦牡腃端或N端與脂肪酸鏈偶聯(lián)，以便促進(jìn)非基于脂質(zhì)體的、通過(guò)脂分配(partition)而進(jìn)入角質(zhì)層的輸送?？梢詫⑵渌滤绖┗蜃詺┖碗呐悸?lián)，以便向高水平表達(dá)酪氨酸酶的細(xì)胞，例如黑素瘤細(xì)胞，輸送致死劑或自殺17劑。本發(fā)明肽的脂質(zhì)肽制劑在下列文獻(xiàn)中有進(jìn)一步的描述授予Dasseux的US6，287，590，于2001年9月11日授權(quán)公告，標(biāo)題為"P印tide/lipidcomplexformationbyco-lyophilization";授予Yatvin等的US5，543，389，于1996年8月6日授權(quán)公告，標(biāo)題為"Covalentpolarlipid-peptideconjugatesforuseinsalves，，，以及其它參考文獻(xiàn)。本文描述的寡肽的長(zhǎng)度，即20個(gè)或優(yōu)選地12個(gè)或更少的氨基酸，且具有酪氨酸酶生物抑制活性，先前沒(méi)有被描述過(guò)。我們相信，迄今為止，所有用于體內(nèi)抑制酪氨酸酶活性的制劑都不是基于肽的。配制本發(fā)明肽的進(jìn)一步的指導(dǎo)見授予Chaudhuri等的US20040086560，其于2004年5月6日授權(quán)公告，標(biāo)題為"Skin-lightening"。本發(fā)明肽可以進(jìn)一步與其它可以用于治療或緩解皮膚癥候的成分或與可降低該肽與磨皮處理(abrasiveprocedures)聯(lián)合施用時(shí)的剌激作用的成分一起配制。這些附加成分的實(shí)例在本文中稱作"第二處理劑",包括1X維牛素K和水件某質(zhì)中的1%氫化可的松；痤瘡處理制劑(例如水楊酸，金縷梅緩沖酒精基制劑(alcoholbasebufferedbywitchhaze));細(xì)紋/芻皮紋治療制齊U(finelines/wrinkletreatmentformulation)(例如水基透明質(zhì)酸)；保水制劑(hydratingformulation)(例如礦物油基的金盞花(calendula)、維生素A、D或E，或它們的任意組合)；抗氧化制劑/自由基清除劑(例如礦物油基的維生素A、E和K)?？蓡为?dú)使用或者與其它化合物組合使用的產(chǎn)品類型的其它實(shí)例包括防腐劑、收斂劑、清潔劑、孔減充血?jiǎng)?poredecongestant)、香膏(balms)、植物性藥材(botanical)、膠原剌激物(collagenstimulator)、草藥(herbs)、微乳化劑(microemulsifiers)、氧輸送媒質(zhì)(oxygendeliveryvehicles)、蛋白質(zhì)、血清、皮膚固化劑(skinfirmingagents)、爽膚水(toners)和局部麻醉劑。可用的具名產(chǎn)品有(括號(hào)里注明的是其有益效果)蘆薈(舒膚(calming));a羥酸(蛻皮(peel));a硫辛酸(抗氧化劑)；過(guò)氧化苯酰(benzoil)和其它過(guò)氧化物(痤瘡)；神經(jīng)酰胺(保水劑(hydrator));銅(爽膚(toning));銅肽(爽膚(toning));CoQ-10(輔酶Q-10)和其它酶(爽膚(toning))河的松(舒膚(calming));乙醇酸(蛻皮(peel));透明質(zhì)酸(膠原激活)；親水脂(hydro1ipid)(保水劑(hydrator));乳酸(蛻皮(peel));抗壞血酸磷酸鎂(自由基清除劑、膠原蛋白剌激物、漂白)；煙酸(血管擴(kuò)張)；磷脂(潤(rùn)濕)鉀(爽膚(toning)、牛皮癬)和水楊酸(痤瘡)。上述成分被教導(dǎo)用于授予Karasiuk的USPGPUB20070088371，后者于2007年4月19日授權(quán)公告，標(biāo)題為"MicrodermabrasionSystemandMethodofUse"。作為其它的第二處理劑，本發(fā)明的酪氨酸酶抑制劑肽和制劑還可以任選地互相混合以及與用于處理目的(即皮膚美白或增白)的其它皮膚增白劑混合。例如，可組合的皮膚美白產(chǎn)品包括，但不僅限于，半胱氨酸、4-硫代間苯二酚、3-氨基酪氨酸、5-羥基-2-羥甲基-Y-吡啶酮、fomesj即onicus和靈芝提取物、曲酸、光甘草定(glabridin)、甘草(licorice)提取物、甘草酸(glycyrrhizicacid)、長(zhǎng)春花(catharanthusroseus)提取物、蛋白聚糖、蛋白酶抑制劑、寡肽、甜菜堿、和4-芐氧-2-羥基苯甲酸甲酯、4-芐氧-2-羥基苯甲酸等。本發(fā)明肽還可以組合或與其它酪氨酸酶抑制劑組合，所述其它酪氨酸酶抑制劑例如異甘草素查耳酮(isoliquiritigeninchalcone，ILC)或4，4'-二羥基聯(lián)苯(44'-BP)(見Kim等，"4，4'-Dihydroxybiphenylasanewpotenttyrosinaseinhibitor，"BiolPharmBull.2005Feb;28(2):323-7)。劑量術(shù)語(yǔ)"MiffiM:"意思是足以對(duì)黑色素細(xì)胞產(chǎn)生酪氨酸酶抑制劑效果，導(dǎo)致黑色素產(chǎn)生的減少或消失的藥物量。這些量是本領(lǐng)域已知的，或可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法確定，典型地范圍是大約l-20，000mg/成人，優(yōu)選地大約10-10，OOOmg，最優(yōu)選的范圍是大約20-5，OOOmg抑制劑/次涂施，取決于所選的制劑，以及組織，例如皮膚或黏膜，是否是作用部位。組合物中麻醉劑量的唯一上限是該制備物基本上沒(méi)有抑制劑晶體，并且所用的溶劑量不足以對(duì)有限組合物的性質(zhì)造成不良影響，使其得以貼附在期望的涂施部位。因此，單成分抑制劑肽含有治療有效量的處于上述范圍內(nèi)的作用劑。在實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由IC50推算，肽的濃度是合適的。一般地，我們建議高于2倍IC50(abovetwotimesIC50)的濃度適合于處方應(yīng)用；低于約2倍IC50的濃度適于非處方應(yīng)用。然而，制劑可以含有高達(dá)大約100倍IC50，以備皮膚攝取不足或其它損失。在兩倍IC50下，應(yīng)當(dāng)可以獲得95%酪氨酸酶抑制。下表是示例性的<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>上述制劑的制備基本上如下<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>每單位面積即每平方或立方厘米上抑制劑肽的濃度及量可以獨(dú)立地加以變化，以便獲得理想的效果。在較薄的劑型中包含高濃度的抑制劑肽基質(zhì)可導(dǎo)致持續(xù)時(shí)間短的涂施。在較厚的劑型(更高mg數(shù)的抑制劑肽/平方或立方厘米)中包含高濃度抑制劑肽可導(dǎo)致強(qiáng)力的抑制，起效(onset)迅速且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。在較薄劑型中包含低濃度的抑制劑肽基質(zhì)可導(dǎo)致溫和的抑制，起效時(shí)間較長(zhǎng)，且持續(xù)時(shí)間短。在較厚劑型中包含的低濃度抑制劑肽可導(dǎo)致溫和的抑制，起效時(shí)間較長(zhǎng)，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。如上面的解釋所示，本發(fā)明的實(shí)施者既能夠?qū)⒁种苿╇脑诳偨M合物中的濃度在極低濃度(大約1%)和高濃度(40%或者更高)之間加以改變，還能夠進(jìn)行薄(大約0.001英寸)或厚(大約O.500英寸或者更多)的包衣，從而使得本發(fā)明的實(shí)施者能夠根據(jù)目標(biāo)的特定解剖學(xué)位置的需要改變體系的劑量。—個(gè)通用的規(guī)則是，就給定組織，例如上皮下層而言，所選擇的肽藥物、涂施的濃度和厚度以及持續(xù)時(shí)間取決于肽滲透該組織(例如表皮或黏膜的基底層)，并且在約2-30分鐘內(nèi)到達(dá)效力峰值的能力。抑制劑肽對(duì)組織(例如表皮)的效果的持續(xù)時(shí)間在大約2-240分鐘之間，這取決于所選的作用劑、抑制劑肽的濃度和涂施的厚度。也可以根據(jù)需要選擇更長(zhǎng)或更短的持續(xù)時(shí)間，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易想到的。處理方法經(jīng)過(guò)如上所述方式配制和/或修飾的本發(fā)明的肽，可用于多種處理方式。例如，它們可以口服、注射或者與激光處理或皮膚磨削/微晶皮膚磨削結(jié)合使用。皮膚磨削是一種美容醫(yī)學(xué)程序，其中通過(guò)磨削(磨砂(sanding))除去皮膚表面。它被用于除去曬傷(sun-damaged)的皮膚，和除去或減少皮膚上的傷疤和暗斑。皮膚磨削器件典型地是有金剛石鑲齒的(diamondti卯ed)，盡管也可以使用鋁晶體。一種方法稱作"SilkPeel"，將金剛石鑲齒微切皮機(jī)和溶液深層輸送結(jié)合起來(lái)，所述溶液可以包含增白劑，用于改善皮膚狀況或恢復(fù)皮膚活力。在一種優(yōu)選方法中，肽作為在微晶皮膚磨削期間輸送的溶液的一部分施用。如果進(jìn)行皮膚磨削時(shí)有環(huán)繞接受微磨削的皮膚區(qū)域的液流，則用維生素、護(hù)膚液(lotion)等對(duì)皮膚進(jìn)行預(yù)處理和后處理，在優(yōu)選的方法中，預(yù)處理和后處理還使用本發(fā)明的酪氨酸酶抑制劑肽。預(yù)處理可以軟化待微晶磨削的皮膚處理區(qū)域，借此使表皮剝脫更完全且更容易剝脫，并且使處理后的皮膚組織損傷減少，而后處理有助于減輕處理后皮膚組織的劃痕(streaking)和發(fā)紅。關(guān)于處理方法進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可以參看授予Karasiuk的US6，695，853，其于2004年2月24日授權(quán)公告，標(biāo)題為"Microdermabrasionsystemandmethodofuse'，。本發(fā)明的肽可以和激光處理結(jié)合使用。激光處理(例如鉺激光)可氣化不同深度的受損傷皮膚組織。鉺激光器在美國(guó)專利3，978，427中有進(jìn)一步的描述。鉺激光程序使用局部麻醉液，并且通常要2-5天愈合，取決于激光器能量穿透的深度。根據(jù)黑色素的吸收光譜，Q開關(guān)紅寶石激光器(694nm)和Q開關(guān)Nd:Yag激光器(1064nm)是與本發(fā)明肽組合用于治療過(guò)度色素沉著的損傷(例如痣和炎癥后色素沉著過(guò)度)的首選激光器。除了激光處理之外，本發(fā)明肽還可以和各種輻射處理組合使用，例如通過(guò)Rf設(shè)備、LED或超聲來(lái)施用輻射能。本發(fā)明肽還可用于微針(microneedle)處理、電穿孔或離子電滲(iontophoresis)。合適地微針在授予Garstein等的US6256533中有描述，其于2001年7月3日授權(quán)公告，標(biāo)題為"Apparatusandmethodforusinganintracutaneousmicroneedlearray"。電穿孔涉及向皮膚施加高電壓脈沖，有人提出這樣可誘導(dǎo)形成瞬時(shí)的微孔。高電壓和短處理持續(xù)時(shí)間(毫秒)是最經(jīng)常采用的。其它影響輸送的電學(xué)參數(shù)包括脈沖性質(zhì)，例如波形、速度和數(shù)目，這些在許多出版物中有進(jìn)一步的描述。該技術(shù)已經(jīng)被成功地用于提高皮膚對(duì)具有不同親脂性和尺寸的分子(即小分子、蛋白質(zhì)、肽和寡肽)的滲透性。離子電滲涉及施用低水平的電流，或者直接施用于皮膚或者經(jīng)由劑型間接施用，以提高局部涂施的治療劑的滲透。通過(guò)這種方法獲得的藥物滲透增高，可以歸因于21下列機(jī)制的一種或其組合電排斥(對(duì)于帶電溶液)、電滲(對(duì)于不帶電溶液)和電擾動(dòng)(electro-perturbation)(對(duì)于帶電和不帶電溶液)。目前有數(shù)種離子電滲系統(tǒng)正在商業(yè)開發(fā)中。上文所述的可以使用本發(fā)明的病癥包括(或者除這些病癥之外還有)，但不限于雀斑減少、亞洲人皮膚上的黃色主色(yellowmass-tone)的減少，和與老化過(guò)程相關(guān)的皮膚色素異常(dischromia)的抑制，以及與靜脈疾病相關(guān)的發(fā)紅的減少，和UV誘發(fā)的色素沉著的減少。如上所述，優(yōu)選的處理方法涉及皮膚美白。本發(fā)明抑制劑還可用于其它的處理。酪氨酸酶是用于黑素瘤患者免疫治療的一個(gè)引人注意的靶抗原，因?yàn)樗谋磉_(dá)的均一性比數(shù)種其它的黑素細(xì)胞分化抗原例如MART-1，gp100或gp75更高。在兩項(xiàng)不同的研究中，通過(guò)免疫組化或反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶在100%的新鮮黑素瘤樣品中表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，酪氨酸酶對(duì)于幾乎所有的黑素瘤患者都是一個(gè)優(yōu)良的靶點(diǎn)(Riley等，J.I匪nother.，2001，24，212-220)。Vogt-Koyanagi-Harada(VKH)病也牽涉酪氨酸酶的參與。VKH是一種伴隨有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、聽覺(jué)和皮膚征候的雙側(cè)肉芽腫性全葡萄膜炎。它通常表現(xiàn)與無(wú)菌性腦膜炎相似的前驅(qū)癥狀(prodromal)，隨后發(fā)生具有滲出性視網(wǎng)膜脫落和間板充血(diskhyperemia)的后葡萄膜炎。從VKH病患者來(lái)源建立并經(jīng)酪氨酸酶家族肽剌激的T細(xì)胞克隆表現(xiàn)出占主導(dǎo)地位的促炎性Thl-型T細(xì)胞響應(yīng)。Read等證明，在大鼠中，VKH樣綜合征可以通過(guò)用來(lái)源于酪氨酸酶和其它酪氨酸酶家族蛋白的肽進(jìn)行免疫而誘發(fā)(Read等，Curr.Opin.Ophthalmol.，2000，11，437-442)。實(shí)施例設(shè)計(jì)和體外試驗(yàn)?zāi)⒐嚼野彼崦?、L-酪氨酸和其它用于酶反應(yīng)的化學(xué)品從Sigma-Aldrich獲得。短序列肽1-7根據(jù)與已知酪氨酸酶底物的潛在同源性設(shè)計(jì)。所有合成肽的長(zhǎng)度均為3-10個(gè)氨基酸，用tBoc和/或Fmoc固相化學(xué)合成。所有情況下，肽均被確認(rèn)為研究級(jí)(>80%純度)。應(yīng)當(dāng)理解，使用研究級(jí)試劑是為了方便，優(yōu)選地，肽可制備成藥物級(jí)純度，大于90%，優(yōu)選地大于99%純度。通過(guò)比色檢測(cè)底物L(fēng)-酪氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物，即多巴色素(dopachrome)，來(lái)測(cè)定實(shí)驗(yàn)肽對(duì)酪氨酸酶的抑制。將蘑菇酪氨酸酶、L-酪氨酸和磷酸鉀緩沖液(pH6.8)添加到含有溶解在5%匿S0中的短序列肽的96孔板中，在37t:下溫育。反應(yīng)開始30min后，用BI0-TEK平板閱讀器測(cè)量475nm吸光度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份分3次重復(fù)進(jìn)行(performedintriplicateon3s印arateoccasions)。實(shí)驗(yàn)方案在下列文獻(xiàn)中有更詳細(xì)的描述Piao等，"MushroomTy:rosinaseInhibitionActivityofSomeChromones，，，Chem.Pharm.Bull.56(3):309-311(2002)，和Pomerants，J.Biol.Chem238:2351-2357(1963)。觀察伴隨0.5、1、2、和4mML_酪氨酸底物濃度的反應(yīng)速度的變化，用Michaelis-Menton方程計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)。一旦獲得初始反應(yīng)速度，即作出Lineweaver-Burke點(diǎn)線圖，從而計(jì)算Km，Vmax，確定酶抑制的模式。IC50結(jié)果22下面提供了分子量為321-1，556的7種合成肽。在所篩選的該7種肽中，發(fā)現(xiàn)有5種具有不同的抑制作用，而有2種對(duì)酪氨酸酶沒(méi)有活性。這些肽的IC50值的范圍是40iiM-8mM。結(jié)果在下表中給出<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在高濃度下(15-50mM)，KFEFKFEF形成可干擾比色檢測(cè)的類凝膠物質(zhì)，從而使吸光度異常增加而超過(guò)正常的反應(yīng)值。使用Lineweaver-Burke點(diǎn)線圖，我們發(fā)現(xiàn)所有5種活性肽均可競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸酶。這得到如下發(fā)現(xiàn)的支持，即在存在或不存在抑制肽時(shí)均觀察到恒定的Vmax，而且添加遞增濃度的底物可挽救酪氨酸酶活性。綜上所述，我們根據(jù)它們與酪氨酸酶底物觀察性質(zhì)的相似性設(shè)計(jì)了合成短序列肽。令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)了對(duì)酪氨酸酶具有不同程度抑制的肽。本發(fā)現(xiàn)的一個(gè)方面涉及關(guān)于可能的肽修飾的知識(shí)，包括上文給出的指導(dǎo)。比較下面的兩個(gè)肽，<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>可以看出，用小f表示的Phe殘基位于無(wú)活性肽中，而處于相應(yīng)位置的Lys則提供活性。這表明在上文所示的基序中具有兩個(gè)相鄰的帶正電荷殘基(如下劃線表示的KK所示)是理想的，其它肽中的SR和RN序列進(jìn)一步證實(shí)了這種性質(zhì)。在YRS巡YSSWY中可見到帶電荷殘基。此外，一個(gè)或多個(gè)Tyr或相似殘基(例如Phe或Trp)的存在是理想的。這些觀察結(jié)果可以進(jìn)一步指導(dǎo)人們?cè)O(shè)計(jì)與這些示例相似的序列。此外，可以設(shè)計(jì)肽使它們可形成自組裝二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而可以用一個(gè)復(fù)合體結(jié)合多個(gè)酪氨酸酶分子。這對(duì)具有多個(gè)酪氨酸殘基的序列是有利的。測(cè)得的IC50值低達(dá)40M，這個(gè)值與現(xiàn)有的某些產(chǎn)業(yè)用的高效酪氨酸酶抑制劑相仿。抑制模式在所有實(shí)例中均被確定是競(jìng)爭(zhēng)性的。發(fā)現(xiàn)具有針對(duì)特定的酶的活性的短序列肽，是將來(lái)藥物治療發(fā)展的一個(gè)重要策略。短序列肽與常規(guī)的藥物和生長(zhǎng)因子相比具有多種優(yōu)勢(shì)，包括皮膚滲透增加，易于脂質(zhì)體包裹或脂質(zhì)綴合，和毒性降低。據(jù)我們所知，本文是第一個(gè)證明短序列肽對(duì)酪氨酸酶具有顯著抑制作用的報(bào)道。穩(wěn)定件試驗(yàn)肽從供應(yīng)商N(yùn)eoMPS訂購(gòu)了5種肽，包括本發(fā)明的YRSRKYSSWY(SEQIDNO:2)和KFEKKFEK(SEQIDN0:1)。使用第六種肽VLLK作為內(nèi)標(biāo)，用于定量評(píng)估其它肽的穩(wěn)定性。HPLC/MS:制備每種肽的1%溶液，并密封在試管中，保存于周圍環(huán)境條件下。在將近30天的時(shí)程內(nèi)周期性地測(cè)試高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)。在每次測(cè)試的同一天制備新鮮的1%VLLK溶液用作內(nèi)標(biāo)。每種肽的量通過(guò)其峰面積相對(duì)于VLLK的峰面積加以確定。有4種肽，包括YRSRKYSSWY和KFEKKFEK，在4個(gè)月內(nèi)無(wú)論是從HPLC看還是從MS測(cè)試看均沒(méi)有顯示降解。然而，有一種肽似乎在第一個(gè)月即開始降解，表現(xiàn)在MS中小分子種類的峰面積增加，之后這種降解可能與半胱氨酸有關(guān)。細(xì)胞測(cè)l定色素細(xì)胞中的黑素生成抑制活性的測(cè)定根據(jù)CancerResearch,Vol.42第1994-2002頁(yè)(1982)所述的方法，略有修改。將4xl04B_16細(xì)胞，一種小鼠黑素瘤細(xì)胞株，懸浮于含有10v/v^胎牛血清的10mlEagle'sMEM中，轉(zhuǎn)移到25cm2Roux瓶?jī)?nèi)，并在5v/v^(A氣氛下于37t:溫育。培養(yǎng)持續(xù)5天，其中在初始日和第三日將培養(yǎng)基更新為額外含有測(cè)試樣品的新鮮培養(yǎng)基。用含有O.8w/v^鹽水的磷酸緩沖液(pH7.2)清洗之后，用含有胰蛋白酶和EDTA的溶液將細(xì)胞解離，并通過(guò)過(guò)濾加以回收。然后將濾紙上的細(xì)胞干燥，用密度測(cè)定法確定500nm下的反射光強(qiáng)度?？梢允褂闷渌臏y(cè)定法測(cè)量本發(fā)明肽?？梢允褂糜糜跍y(cè)定酪氨酸酶活性的測(cè)定法進(jìn)一步篩選黑素生成抑制劑，如授予Orlow等的USPGPUB2004/0175767所述，其于2004年9月9日公布，標(biāo)題為"Methodsandcompositionsthataffectmelanogenesis"。如其所述，可以使酪氨酸酶分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中以便于測(cè)試。體外培養(yǎng)生長(zhǎng)的野生型黑素生成細(xì)胞可以在黑素體內(nèi)部合成黑色素，如同它們?cè)隗w內(nèi)一樣。在這些培養(yǎng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶主要位于黑素體膜中，盡管也有一些酪氨酸酶被分泌。發(fā)現(xiàn)位于黑素體膜中的酪氨酸酶通過(guò)一個(gè)C端跨膜域被固定，其活性位點(diǎn)朝向黑素體內(nèi)腔。相比之下，在利用P蛋白突變或者抑制P蛋白功能的化合物抑制了黑素生成的黑素原細(xì)胞中，酪氨酸酶將被錯(cuò)誤定位。細(xì)胞的酪氨酸酶中從細(xì)胞分泌到生長(zhǎng)或溫育培養(yǎng)基中的比例顯著增加。此外，分泌的酪氨酸酶多肽比野生型細(xì)胞中所見的更短，因?yàn)樗鄙貱端膜錨接。然而，被分泌出來(lái)的酪氨酸酶在生長(zhǎng)或溫育培養(yǎng)基中具有酶活性，能夠在生長(zhǎng)或溫育培養(yǎng)基中從細(xì)胞外的酪氨酸合成黑色素。結(jié)果是，來(lái)自黑色素生成被抑制的黑素生成細(xì)胞的含有酪氨酸的生長(zhǎng)或溫育培養(yǎng)基將變黑。培養(yǎng)基中酪氨酸濃度越高，培養(yǎng)基越黑，并且培養(yǎng)基中酪氨酸酶濃度越高，培養(yǎng)基變黑得越快。因?yàn)闆](méi)有被抑制黑素生成的黑素生成細(xì)胞分泌的酪氨酸酶少得多，所以培養(yǎng)這些細(xì)胞所得的含酪氨酸的生長(zhǎng)或溫育培養(yǎng)基不會(huì)變黑。體內(nèi)測(cè)定對(duì)于在體外顯示顯著酪氨酸酶抑制的肽，進(jìn)一步在體內(nèi)測(cè)試其皮膚美白活性。在本測(cè)定中，健康男性和女性志愿者(20-50歲)在手臂區(qū)的兩個(gè)不同點(diǎn)接受大約0.6J紫外線照射，每個(gè)點(diǎn)2.25cm2，每天一次，3天，并在任一個(gè)照射點(diǎn)涂施抑制劑肽，每天3次，24天。之后，將使用皮膚美白劑的照射點(diǎn)與對(duì)照進(jìn)行比較，以估計(jì)黑素生成抑制的程度，即皮膚美白效果。用于該測(cè)試的皮膚美白劑可以如下制備混合10重量份的乙醇和0.18重量份的對(duì)羥基苯甲酸甲酯與0(對(duì)照)、4、10、16或40重量份的50w/w^活性肽或衍生物，用10w/w檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)混合物至PH5.5，向混合物中倒入精制水至總重為100份。因此，皮膚美白劑中肽的濃度為w/w%(對(duì)照)，2w/w^，5w/w^，8w/w^或20w/w%。皮膚美白劑是通過(guò)首先將其吸入紗布中，然后按照封閉敷裹術(shù)(occlusivedressingtechnique)將紗布貼附在被照射點(diǎn)上。皮膚美白效果的確定是通過(guò)比較處理點(diǎn)與對(duì)照的黑素生成抑制，即皮膚美白效果；將皮膚美白效果分級(jí)為"很好"、"無(wú)變化"或"不好"；并計(jì)數(shù)回答"很好"的志愿者數(shù)目(每組20位志愿者)。臨床研究將患有頑固黑斑病的患者(使用非處方藥物、或HQ4%6個(gè)月、或者Tri-luma⑧乳霜6個(gè)月無(wú)效者)隨機(jī)盲目分成2個(gè)處理組(媒介組和肽組)用于下述所有研究；蘑菇酪氨酸酶、L-酪氨酸、氫醌和L-DOPA從SigmaAldrich購(gòu)得。YR肽("P4，"(氨基酸序列YRSRKYSSWY，純度94%)由NeoMPS公司(SanDiego，California,USA)合成。原代(primary)人黑素瘤細(xì)胞，第3代，由斯坦福大學(xué)皮膚醫(yī)學(xué)系的ToddRidky博士惠贈(zèng)。細(xì)胞在補(bǔ)充有人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑(HMGS，CascadeBiologics)的Medium254(CascadeBiologies)中培養(yǎng)。它們?cè)?7°C的5%C02濕潤(rùn)氣氛下生長(zhǎng)。調(diào)整細(xì)胞鋪板密度使細(xì)胞在與測(cè)試樣品溫育的過(guò)程中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將細(xì)胞傳代培養(yǎng)物以4乂104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度鋪板。大約24h后，添加新鮮的培養(yǎng)基和測(cè)試樣品。添加測(cè)試樣品7d后收集細(xì)胞，每2天用新鮮培養(yǎng)基和測(cè)試樣品替換。細(xì)胞活力用WST-1細(xì)胞增殖套盒(Roche)確定。將細(xì)胞以1X105/孔平板接種(24孔板)。鋪板24小時(shí)后，添加測(cè)試樣品，并將培養(yǎng)物再溫育7d。處理結(jié)束時(shí)，向每孔添加50iilWST-1。將平板置于黑暗下37t:4h，并用微孔板讀取450nm吸光度。通常，每個(gè)測(cè)試組測(cè)量3個(gè)重復(fù)孔。含有培養(yǎng)基但無(wú)細(xì)胞的孔用作對(duì)照。細(xì)胞活力根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力=吸光度(測(cè)試樣品)/吸光度(僅培養(yǎng)基)X100%在黑素細(xì)胞上測(cè)試的HQ的濃度為1、10、100和1000iiM，而YR肽的濃度為1、10和100iiM。在添加100或1000iiMHQ24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞死亡，確認(rèn)了HQ的細(xì)胞毒性。用10iiM和更低HQ處理的細(xì)胞則被發(fā)現(xiàn)存活。用高達(dá)100iiM濃度的P4處理7天后沒(méi)有觀察到毒性。為了排除P4對(duì)黑素生成的抑制效果是通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)導(dǎo)致的可能性，我們比較了存在和不存在測(cè)試樣品條件下培育的細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果如圖3所示。我們沒(méi)有觀察到肽對(duì)黑素細(xì)胞增殖速度的任何抑制效果。氫醌在高達(dá)10iiM的濃度下也沒(méi)有顯示抑制效果，盡管對(duì)于更高的濃度由于其100%的細(xì)胞毒性而不能檢測(cè)。黑色素含暈測(cè)暈將人黑素細(xì)胞培養(yǎng)在6孔平板中，并用測(cè)試樣品分別處理7d。用PBS清洗后，通過(guò)在胰蛋白酶/EDTA(0.25%/0.1%PBS溶液)中短暫溫育將細(xì)胞分離。取一等份細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將其余細(xì)胞超聲破碎，并在500ii11MNa0H中在37t:下避光溫育過(guò)夜。黑色素濃度通過(guò)比較未知樣品在475nm的0D與通過(guò)合成黑色素獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線加以計(jì)算。為了提供更直接的證據(jù)證明YR肽抑制黑素生成，我們確定了它對(duì)黑素細(xì)胞中黑色素產(chǎn)生的影響。用分光光度計(jì)確定無(wú)添加、YR肽(P4)處理、或HQ處理7天的黑素細(xì)胞中的黑色素含量，并與黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。黑色素含量的下降如圖4所示。用10i!MHQ(無(wú)毒性劑量)處理略微降低了黑色素的含量。相似濃度的YR肽則顯著降低黑色素的含量，程度大于HQ。YR隨)g雄輔隨性,徵醇酪氨酸酶抑制活性在體外用L-酪氨酸為底物加以確定，采用經(jīng)過(guò)修改的下列文獻(xiàn)的方法PiaoLZ，ParkHR，ParkYK，LeeSK，ParkJH，ParkMK.2002.MushroomTyrosinaseInhibitionActivityofSomeChromones.ChemPharmBull50(3):309-311。酶、底物和抑制劑的濃度分別用[E]、[S]和[I]表示。向96孔微孔板添加80微升0.067M磷酸鉀緩沖液(pH6.8)、40微升溶于0.067M磷酸鉀緩沖液(pH6.8)的L_酪氨酸、40微升溶于5%匿S0溶液中的抑制劑和40微升蘑菇酪氨酸酶溶液，使每種試劑的終濃度為0.2mg/ml[S]和96單位/ml[E]，和不同的[I]?？瞻兹芤禾砑?%DMS0代替抑制劑溶液，并調(diào)節(jié)至總體積200微升，作為對(duì)照。將測(cè)定混合物在37t:溫育。在不同時(shí)間點(diǎn)用微板閱讀器在475nm測(cè)量反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的多巴色素的量。酪氨酸酶活性的抑制百分比計(jì)算如下抑制(％)=[(A-B)-(C-D)]/(A-B)X100A:溫育后空白溶液的吸光度B:溫育前空白溶液的吸光度C:溫育后樣品溶液的吸光度D:溫育前樣品溶液的吸光度按照ChengKT，HsuFL，ChenSH，HsiehPK，HuangHS，LeeCK，LeeMH.2007.NewConstituentfromPodocarpusmacrophyllusvar.macrophyllusShowsAnti—tyrosinaseEffectandRegulatesTyrosinase—RelatedProteinsandmRNAinHumanEpidermalMelanocytes.ChemPharmBull55(5):757-761的方法用L-D0PA為底物測(cè)定細(xì)胞酪氨酸酶活性。人黑素細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)。用各個(gè)測(cè)試樣品處理7d后，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗并用含有1%TritonX-100的磷酸鹽緩沖液，pH6.8裂解。超聲破碎之后，裂解物通過(guò)10000g離心10min澄清。在用Bio-Rad蛋白測(cè)定套盒測(cè)定蛋白濃度后，將裂解物添加到含有等量蛋白質(zhì)(40iig)的96孔培養(yǎng)板中，用裂解緩沖液調(diào)節(jié)至每孔150iU。向每孔添加75ii1溶解于裂解緩沖液的10mML-D0PA。培養(yǎng)板在37。C溫育30min，然后用分光光度計(jì)讀取475nm讀數(shù)。酪氨酸酶抑制活性用如下公式計(jì)算酪氨酸酶抑制(％)=[l-(0.D.475樣品/0.D.475對(duì)照)]X100X在離心和計(jì)算蛋白之后，通過(guò)補(bǔ)償每孔中一定的蛋白量將一定體積的每種樣品上清轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板，并用0.067M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)調(diào)節(jié)每孔的體積為150iU。向每孔添加75ii1溶解于磷酸鹽緩沖液(pH6.8)的10mML-D0PA。培養(yǎng)板在37。C溫育30min，然后用分光光度計(jì)讀取475nm讀數(shù)。結(jié)果如圖5所示。用10yM氫醌處理黑素細(xì)胞可降低細(xì)胞酪氨酸酶活性28.8%。用任一種肽單獨(dú)處理導(dǎo)致細(xì)胞酪氨酸酶活性的劑量依賴性降低。在liiM下，YR肽(P4)降低酶活性14.5%;在10線P4降低24.1%。最后，在100線P4降低酶活性達(dá)37.4%。結(jié)論上述具體的說(shuō)明意圖在例示和圖解本發(fā)明，不應(yīng)當(dāng)看作對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。本專利說(shuō)明書中提到的任何專利或出版物指示本專利或出版物相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員在當(dāng)時(shí)的水平，意圖表達(dá)本發(fā)明可能沒(méi)有明文記載但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的細(xì)節(jié)。本文援引并入這些專利或出版物，如同具體單獨(dú)地援引并入它們中每一個(gè)，以滿足描述和實(shí)現(xiàn)述及的方法或材料的目的。權(quán)利要求一種純化的肽，具有與氨基酸序列KFEKKFEK基本上相同的序列，并且對(duì)酪氨酸酶的IC50小于大約10mM。2.權(quán)利要求1的肽，其IC50小于大約5mM。3.權(quán)利要求1的肽，其中1-2個(gè)殘基被R或F替換。4.權(quán)利要求l的肽，其中l(wèi)-3個(gè)殘基被V、A、L、M或I替換。5.權(quán)利要求4的肽，其中l(wèi)個(gè)殘基被R或F替換，在所示的氨基酸序列中總共有2-3個(gè)替換。6.權(quán)利要求1的肽，其中在下面第1列中列出的1-3個(gè)氨基酸被下表第2列中列出的氨基酸替換，總共有1-3個(gè)替換<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>7.權(quán)利要求l的肽，其包含D-氨基酸。8.權(quán)利要求1的肽，其與調(diào)節(jié)基團(tuán)相連。9.權(quán)利要求l的肽，其中該序列是KFEKKFEK。10.權(quán)利要求l的肽，其具有兩個(gè)毗鄰的帶電荷氨基酸。11.權(quán)利要求1的肽，其具有至少一個(gè)選自Y、F和W的殘基。12.—種局部、口服或可注射制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的肽。13.權(quán)利要求12的制劑，其中所述序列是KFEKKFEK。14.一種皮膚醫(yī)學(xué)可接受的制劑，其包含第二處理劑和與選自YRSRKYSSWY和KFEKKFEK的序列基本上相同的肽。15.權(quán)利要求14的制劑，其中該肽具有至少兩個(gè)毗鄰的帶電荷氨基酸。16.權(quán)利要求14的制劑，其在所示的序列中包含1-3個(gè)氨基酸替換，其中所述替換不發(fā)生在F或R，其中該替換選自下組中的l-3個(gè)改變(i)變?yōu)镕或R;和(ii)變?yōu)閂、A、L、M、I。17.權(quán)利要求14的制劑，其中所述肽的濃度小于IC50濃度的大約2倍。18.權(quán)利要求14的制劑，其中所述肽的濃度是IC50濃度的2-100倍。19.權(quán)利要求14的制劑，其基本上沒(méi)有HQ。20.權(quán)利要求14的制劑，其中第二處理劑是肽，從而存在兩種具有不同結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求14中的肽。21.權(quán)利要求14的制劑，進(jìn)一步包括選自下組的材料保濕制劑、抗氧化制劑和自由基清除劑。22.權(quán)利要求14的制劑，其中所述肽包含在脂質(zhì)體中。23.—種用于處理皮膚的方法，包括施用與下列其中之一基本上相同的肽(a)KFEKKFEK或(b)YRSRKYSSWY，其中所述肽的施用可充分地抑制酪氨酸酶以減輕皮膚色素沉著。24.權(quán)利要求23的方法，其中肽具有YRSRKYSSWY的序列。25.權(quán)利要求24的方法，其中肽YRSRKYSWSWY具有1_3個(gè)替換，其中殘基被變?yōu)镽或K，或者變?yōu)閂、A、L、M或I其中之一。26.權(quán)利要求23的方法，其中該施用包括施用局部制備物。27.權(quán)利要求23的方法，其中該施用包括與第二處理產(chǎn)品一起施用。28.權(quán)利要求23的方法，其中該施用包括與微晶皮膚磨削過(guò)程聯(lián)合進(jìn)行的施用。29.權(quán)利要求23的方法，其中該施用與微晶皮膚磨削過(guò)程同時(shí)進(jìn)行。30.權(quán)利要求23的方法，其中該施用與輻射處理聯(lián)合進(jìn)行。31.權(quán)利要求23的方法，其中該施用與物理處理聯(lián)合進(jìn)行，該物理處理是通過(guò)磨削裝置、微針、電穿孔裝置、或離子電滲裝置進(jìn)行的。32.—種用于實(shí)施皮膚美白程序的套盒，包括純化的肽，其對(duì)酪氨酸酶的IC50小于大約lOmM，并且選自下組具有與YR肽或KF肽序列基本上相同的序列的肽；皮膚醫(yī)學(xué)可接受的載體；第二處理產(chǎn)品；和使用說(shuō)明。33.權(quán)利要求32的套盒，其中肽和載體是預(yù)先組合的。全文摘要本發(fā)明公開了可抑制酪氨酸酶活性的肽及其制劑，以及利用所述肽來(lái)減少皮膚色素沉著的制劑的方法，和在局部制劑(topicalformulation)中施用這些抑制性肽的方法。所公開的肽序列包括KFEKKFEK和YRSRKYSSWY。文檔編號(hào)A61K38/00GK101795702SQ200880104997公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2008年6月25日優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日發(fā)明者巴錫爾·M·漢塔什申請(qǐng)人:里蘭斯坦福初級(jí)大學(xué)理事會(huì)