專利名稱：具有置于c末端的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及特異性結(jié)合分子及其治療應(yīng)用的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在健康的哺乳動物體內(nèi)，免疫系統(tǒng)保護(hù)機(jī)體免受外源物質(zhì)和病原體的傷害。然而， 在某些情形下，免疫系統(tǒng)出錯(cuò)，導(dǎo)致創(chuàng)傷性損害和/或疾病。例如，B細(xì)胞能夠產(chǎn)生識別自 身蛋白而不識別外源蛋白的抗體，從而導(dǎo)致產(chǎn)生諸如紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫 性疾病特有的自身抗體。在另外的情形下，免疫系統(tǒng)在抵抗外源物質(zhì)方面的典型有益作用 是起反作用的，例如在器官移植之后。已經(jīng)認(rèn)識到了哺乳動物免疫系統(tǒng)，尤其是人類免疫系 統(tǒng)的功能，并且已努力調(diào)控該系統(tǒng)以避免或改進(jìn)對健康的有害影響，所述有害影響由免疫 系統(tǒng)在異常環(huán)境中的正常機(jī)能(例如，器官移植)或由免疫系統(tǒng)在其他方面明顯正常的環(huán) 境中的異常機(jī)能(例如，自身免疫性疾病惡化)導(dǎo)致。另外，已經(jīng)努力對免疫系統(tǒng)進(jìn)行利用 以提供建立在抗體特異性識別及特異性結(jié)合靶標(biāo)的能力基礎(chǔ)上的大量靶標(biāo)特異性診斷和 治療方法學(xué)。免疫系統(tǒng)保護(hù)機(jī)體的一種途徑是通過產(chǎn)生被稱為B淋巴細(xì)胞或B細(xì)胞的特化細(xì) 胞。B細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)合外源物質(zhì)或病原體的抗體，在某些情形下產(chǎn)生介導(dǎo)外源物質(zhì)或病原體破 壞的抗體。然而，在某些情形下，人類免疫系統(tǒng)，特別是人類免疫系統(tǒng)中的B淋巴細(xì)胞出錯(cuò)， 導(dǎo)致疾病。很多癌癥都與B細(xì)胞的無限增殖有關(guān)。還有許多自身免疫性疾病與B細(xì)胞產(chǎn)生 的抗體有關(guān)，這些抗體結(jié)合到機(jī)體某部分，而不是結(jié)合外源物質(zhì)和病原體。另外，有很多自 身免疫性疾病和炎癥性疾病在發(fā)病機(jī)理中與B細(xì)胞有關(guān)。例如，通過錯(cuò)誤地將B細(xì)胞呈遞 給T細(xì)胞或其他與B細(xì)胞相關(guān)的途徑。例如，B細(xì)胞缺陷的具有自身免疫傾向的小鼠不會 發(fā)生自身免疫性腎臟疾病、血管炎或自身抗體。(Shlomchik et al.，J Exp. Med. 1994，180 1295-306)。有趣的是，同樣這些具有自身免疫傾向的小鼠，如果具有B細(xì)胞但在免疫球蛋 白產(chǎn)生方面有缺陷時(shí)，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)下會發(fā)生自身免疫性疾病(Chan et al.，J Exp. Med. 1999， 189 1639-48).這表明，B細(xì)胞在自身免疫性疾病的發(fā)生中起著不可或缺的作用?？梢酝ㄟ^其表面的分子鑒定B細(xì)胞。⑶20是第一個(gè)通過單克隆抗體鑒定的人類B 細(xì)胞譜系特異性表面分子。它是非糖基化、疏水性、分子量為35kDa的B細(xì)胞跨膜磷蛋白， 其氨基端和羥基端都位于細(xì)胞內(nèi)。Einfeld et al.，EMBO J. 1988，7 :711_17。CD20由所有 正常的成熟B細(xì)胞表達(dá)，但不被前體B細(xì)胞或漿細(xì)胞表達(dá)。CD20的天然配基還沒有被鑒定， CD20在B細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能尚未被完全理解。另一個(gè)B細(xì)胞譜系特異性表面分子是⑶37。⑶37是一種高度糖基化的、分子量為 40-52kDa的蛋白，屬于四次跨膜的細(xì)胞表面抗原家族。它四次跨越細(xì)胞膜，形成兩個(gè)細(xì)胞外 環(huán)，并將其氨基端和羥基端暴露在細(xì)胞質(zhì)中。CD37在正常的抗體生成B細(xì)胞(slg+)上高 度表達(dá)，但不在前-B細(xì)胞或漿細(xì)胞上表達(dá)。CD37在靜止和活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì) 胞的表達(dá)水平低；在NK細(xì)胞、血小板或紅細(xì)胞上沒有可檢測的表達(dá)。參見，Belov et al., Cancer Res. ,61(11) 4483-4489(2001) ；Schwartz-Albiez et al., J. Immunol. ,140(3)905-914(1988)；以及 Linket al. , J. Immunol. , 137(9) :3013_3018 (1988)。除了 正常的 B 細(xì)胞外，幾乎所有B細(xì)胞來源的惡性腫瘤(malignancies)都是⑶37表達(dá)陽性的，包括CLL、 NHL和毛細(xì)胞白血病(Moore, et al. 1987 ；Merson andBrochier 1988 ；Faure, et al. 1990)。 CD37參與B細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)CD37缺失的小鼠具有低水平的免疫血清IgGl，并且 針對病毒抗原和模型抗原的體液免疫應(yīng)答被削弱。它看起來是作為非經(jīng)典共刺激分子或通 過與MHC II類分子形成復(fù)合物直接影響抗原呈遞起作用的。參見Knobeloch et al. ,MoI. Cell.Biol.，20 (15) :5363_5369 (2000)。B細(xì)胞譜系特異性表面分子，如CD37和CD20，自身能夠成為抗體的靶標(biāo)，所述抗體 結(jié)合引起癌癥和自身免疫性疾病的表面有CD37和CD20的B細(xì)胞或介導(dǎo)對其的破壞。已出 現(xiàn)了建立在這一概念基礎(chǔ)上的研究和藥物開發(fā)。被稱為“免疫療法”的在非人的動物體內(nèi) 制備的(或基于制備的抗體)結(jié)合CD37或CD20的抗體被給予患者，使引起癌癥或自身免 疫性疾病的B細(xì)胞衰竭。單克隆抗體技術(shù)和遺傳工程方法已經(jīng)促進(jìn)了利用免疫球蛋白分子診斷和治療人 類疾病的發(fā)展。免疫球蛋白的域結(jié)構(gòu)順從工程學(xué)，因?yàn)榭乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域和提供了效應(yīng)器功 能的結(jié)構(gòu)域可以在免疫球蛋白種類和亞類之間交換。免疫球蛋白的機(jī)構(gòu)和功能綜述于例如 Harlow et al. , Eds. , Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實(shí)驗(yàn)室手冊),Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988)中。有關(guān)重組工禾呈抗 體技術(shù)各個(gè)方面的廣泛介紹和詳細(xì)信息能夠在教科書“Recombinant Antibodies (重組抗 體)”(John ffiley&Sons,NY,1999)中找到。對詳細(xì)的抗體工程實(shí)驗(yàn)室操作方案的全面收錄 能夠在 R. Kontermann 禾口 S. Dijbel (eds.), "The Antibody Engineering Lab Manual (抗 體工程實(shí)驗(yàn)室手冊)”(Springer Verlag, Heidelberg/New York, 2000)中找到。免疫球蛋白分子(縮寫為Ig)是一種多聚體蛋白質(zhì)，通常由兩個(gè)相同的輕鏈多肽 和兩個(gè)相同的重鏈多肽(H2L2)組成，所述多肽通過鏈間二硫鍵，即相鄰半胱氨酸殘基的巰 基間的共價(jià)鍵連接成大分子復(fù)合體。基于其重鏈組成，確定了 5種人免疫球蛋白種類，被命 名為IgG, IgM, IgA, IgE和IgD0 IgG類和IgA類抗體被進(jìn)一步分為亞類，即分別為IgGl, IgG2，IgG3和IgG4，以及IgAl和IgA2。鏈內(nèi)二硫鍵連接同一多肽鏈的不同區(qū)域，其形成了 與鄰近的氨基酸一起組成免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的環(huán)。在氨基末端部分，每一輕鏈和每一重鏈 都具有單一的可變區(qū)，其氨基酸組成在不同抗體之間顯示出相當(dāng)大的變異。輕鏈可變區(qū)\ 具有單一的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域并與重鏈Vh(也含有單一的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的可變區(qū)聯(lián)合以 形成免疫球蛋白的抗原結(jié)合部位Fv。
除可變區(qū)外，每一全長抗體鏈都有包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)。輕鏈有包含 單一結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)。因此，輕鏈有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。重鏈有包含幾個(gè) 結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)。IgG、IgA和IgD抗體中的重鏈有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別被命名為C01, Ch2和Ch3 ； IgM和IgE抗體中的重鏈有四個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別被命名為Chi，Ch2，Ch3和CH4。因此，重鏈有一個(gè) 可變結(jié)構(gòu)域以及三或四個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。值得注意的是，這些結(jié)構(gòu)域在所有已知物種中的不 變的組織結(jié)構(gòu)，即包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)位于或接近免疫球蛋白分子的輕鏈和重 鏈的C末端；可變結(jié)構(gòu)域位于朝向輕鏈和重鏈N末端一側(cè)。免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能被綜 述于例如 Harlow et al. , Eds. , Antibodies :A LaboratoryManual (抗體實(shí)驗(yàn)室手冊), Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor(1988)中。
免疫球蛋白的重鏈還能被分成三個(gè)功能區(qū)Fd區(qū)(包含Vi^PChi的片段，即重鏈的 兩個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域)、鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)(“可結(jié)晶片段”區(qū))。Fc區(qū)包含可以和細(xì)胞上的免疫 球蛋白受體以及補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中的初始成分相互作用的結(jié)構(gòu)域。因此，通常認(rèn)為Fc區(qū)或片 段負(fù)責(zé)免疫球蛋白的效應(yīng)器功能，諸如ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用)、CDC (補(bǔ) 體依賴性細(xì)胞毒作用)和補(bǔ)體固定、結(jié)合Fc受體、與一種缺失Fc區(qū)的多肽相比的體內(nèi)更 長的半衰期、蛋白A結(jié)合以及甚至可能的胎盤轉(zhuǎn)移。Capon et al.，Nature，337 :525_531， (1989)。此外，含有Fc區(qū)的多肽允許多肽的二聚體化/多聚體化。這些術(shù)語也可以用于其 它免疫球蛋白的類似區(qū)域。雖然所有的人免疫球蛋白的同種型共同包含一個(gè)可識別結(jié)構(gòu)，但每一同種型都 展示出不同模式的效應(yīng)器功能。作為非窮盡性舉例，IgG中和毒素和病毒，調(diào)理、固定補(bǔ)體 (⑶C)，并且參與ADCC。相比之下，IgM中和血源性病原體，并參與調(diào)理作用。IgA與其分泌 片相連時(shí)，被分泌并提供對微生物經(jīng)粘膜感染的主要防御；它也中和毒素以及支持調(diào)理作 用。IgE介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，主要參與招募其他所需細(xì)胞以引發(fā)完整的應(yīng)答。已知IgD提供免疫 調(diào)節(jié)功能，調(diào)控B細(xì)胞的活化。這些同種型效應(yīng)器功能的描述提供了存在于人同種型中的 差異的非全面說明。IgG、IgA、IgD和IgE類抗體中存在的鉸鏈區(qū)作為柔性間隔子起作用，使Fab部分在 空間內(nèi)自由移動。與恒定區(qū)相比，鉸鏈結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上是多樣化的，其序列和長度在免疫球 蛋白種類和亞類之間均不同。例如，鉸鏈區(qū)的長度和柔性在IgG亞類之間不同。IgGl的鉸 鏈區(qū)包含氨基酸216-231，并且因?yàn)樗亲杂扇犴g的，F(xiàn)ab片段能夠繞著它們的對稱軸旋轉(zhuǎn) 并在以兩個(gè)重鏈間二硫鍵中的第一個(gè)為圓心的范圍內(nèi)移動。IgG2具有比IgGl的鉸鏈更短 的鉸鏈，有12個(gè)氨基酸殘基和四個(gè)二硫鍵。IgG2的鉸鏈區(qū)缺乏甘氨酸殘基、較短并包含剛 性的聚脯氨酸雙螺旋，其通過額外的重鏈間二硫鍵來穩(wěn)定。這些特性限定了 IgG2分子的柔 性。IgG3與其他亞類的不同之處在于其獨(dú)特的延長的鉸鏈區(qū)(約為IgGl鉸鏈的4倍長)， 包含62個(gè)氨基酸(包括21個(gè)脯氨酸和11個(gè)半胱氨酸)，并形成了柔性的聚脯氨酸雙螺旋。 在IgG3中，F(xiàn)ab片段距離Fc片段相對較遠(yuǎn)，產(chǎn)生了柔性更大的分子。IgG3中延長的鉸鏈也 解釋了 IgG3相比于其他亞類的更大分子量。IgG4的鉸鏈區(qū)比IgGl的鉸鏈區(qū)短，且其柔性 介于IgGl和IgG2的柔性之間。據(jù)報(bào)道，鉸鏈區(qū)的柔性以IgG3 > IgGl > IgG4 > IgG2的 順序降低。四種IgG亞類在它們效應(yīng)器功能方面也彼此不同。這一差異與結(jié)構(gòu)上的不同相 關(guān)，所述結(jié)構(gòu)上的不同包括可變區(qū)、Fab片段和恒定Fc片段之間相互作用的不同。按照晶體學(xué)研究，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)還可以在功能上細(xì)分為三個(gè)區(qū)上游鉸鏈區(qū)、 核心區(qū)和下游鉸鏈區(qū)。Shin et al.，1992ImmunologicalReviews (免疫學(xué)綜述)130 :87。 上游鉸鏈區(qū)包括從C01的羧基端至限制運(yùn)動的鉸鏈中的第一個(gè)殘基的氨基酸，所述第一殘 基通常是在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵的第一個(gè)半胱氨酸殘基。上游鉸鏈區(qū)的長度與抗體 的區(qū)段柔性相關(guān)。核心鉸鏈區(qū)包含重鏈間二硫鍵，下游鉸鏈區(qū)連接Ch2結(jié)構(gòu)域的氨基末端并 包括Ch2中的殘基。同上。人IgGl的核心鉸鏈區(qū)包含序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通過形成二 硫鍵二聚化時(shí)形成被認(rèn)為作為支樞的環(huán)狀八肽，由此提供柔性。鉸鏈區(qū)還可以包含一個(gè)或 多個(gè)糖基化位點(diǎn)，其包括許多結(jié)構(gòu)上明顯不同的位點(diǎn)類型用于碳水化合物連接。例如，IgAl 在鉸鏈區(qū)17個(gè)氨基酸區(qū)段內(nèi)包含5個(gè)糖基化位點(diǎn)，賦予了鉸鏈區(qū)多肽對腸蛋白酶的抗性， 這被視為分泌型免疫球蛋白的優(yōu)勢特性。
免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽序列的結(jié)構(gòu)和柔性允許的構(gòu)象變化還可以影響抗體Fc部 分的效應(yīng)器功能。與Fc區(qū)相關(guān)的三大類效應(yīng)器功能包括(1)經(jīng)典補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的活化， (2)與效應(yīng)器細(xì)胞的相互作用，以及(3)免疫球蛋白的區(qū)室化(compartmentalization)。 不同的人IgG亞類在固定補(bǔ)體或者活化和放大補(bǔ)體級聯(lián)步驟中的相對功效不同。參見， iMU, Kirschfink, 2001Immunol. Rev. 180 177 ；Chakraborti et al, 2000CellSignal 12: 607 ；Kohl et al.，1999Mol. Immunol. 36 893 ；Marshetal.，1999Curr.Opin. Nephrol. Hypertens. 8 557 ；Speth et al,1999ffien Klin. Wochenschr. Ill :378。常規(guī)抗體的H2L2結(jié)構(gòu)的例外情況出現(xiàn)在駱駝科動物(駱駝，單峰駝和無峰駝 (llamas) ；Hamers-Casterman et al. ,1993Nature 363 446 ；Nguyen et al. ,1998J. Mol. Biol275 :413)、護(hù)士鯊(Roux et al. , 1998Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 11804)以及斑點(diǎn) 兔銀鮫(Nguyen，et al.，2002Immuno genetics 54(1) :39_47)中發(fā)現(xiàn)的一些同種型免疫球 蛋白中。這些抗體顯然能夠僅利用重鏈可變區(qū)形成抗原結(jié)合區(qū)，即這些功能抗體是僅有重 鏈的同型二聚體(稱為“重鏈抗體”或“HCAbs”)。盡管抗體技術(shù)在疾病診斷和治療中有優(yōu) 勢，但在開發(fā)完整抗體作為診斷和/或治療試劑的技術(shù)中有不利的方面。完整抗體是大蛋 白結(jié)構(gòu)，例如包含兩條輕鏈和兩條重鏈的IgG同種型的異源四聚體結(jié)構(gòu)。這樣的大分子在 一些應(yīng)用中會有空間位阻影響。例如，在治療實(shí)體瘤時(shí)，完整抗體不容易滲透到腫瘤內(nèi)部。 而且，完整抗體相對大的體積給確保此類分子體內(nèi)給藥不誘導(dǎo)免疫反應(yīng)提出了挑戰(zhàn)。此外， 活性抗體分子的產(chǎn)生通常包括培養(yǎng)能夠提供對新生抗體分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆g后加工的重 組真核細(xì)胞，這樣的細(xì)胞難于培養(yǎng)并難于以提供商業(yè)有效產(chǎn)量的活性抗體的方式誘導(dǎo)。最近，已經(jīng)構(gòu)建了較小免疫球蛋白分子以克服與完整免疫球蛋白方法學(xué)相關(guān)的問 題。單鏈可變抗體片段(scFv)包含經(jīng)由短肽連接到抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈可變 結(jié)構(gòu)域(Huston et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,85 5879-83) 由于 scFv 分子的 體積小，它們呈現(xiàn)出比完整免疫球蛋白更為有效的對組織的滲透?？鼓[瘤scFv顯示出比對 應(yīng)的嵌合抗體更為迅速的腫瘤滲透和在腫瘤塊中更為均勻的分布(Yokota et al. ,Cancer Res.1992,52 :3402_08)。盡管scFv分子帶來了血清療法的益處，但這種治療方法仍存在幾種缺點(diǎn)。scFv從 循環(huán)中被迅速清除，這可以降低在正常細(xì)胞中的毒性效應(yīng)，但這種快速清除阻礙了向靶組 織的最小有效量的遞送。由于對產(chǎn)量有不利影響的scFv表達(dá)和分離的困難，制備充足量的 用于患者給藥的scFv已經(jīng)受到挑戰(zhàn)。使用scFv用于治療的另一不利情況是缺乏效應(yīng)器功 能?？蛇x擇地，已提出，scFv與諸如毒素的另一分子的融合物能夠利用scFv的特異性抗原 結(jié)合活性和小體積將毒素遞送到靶組織，但這種結(jié)合物(conjugates)或嵌合體的給藥劑 量受到該種制劑的毒 素部分的過多和/或非特異毒性的限制。此外，免疫毒素本身給予宿 主時(shí)產(chǎn)生高免疫原性，并且針對免疫毒素產(chǎn)生的的宿主抗體限制了對個(gè)體進(jìn)行重復(fù)的治療 性處理的潛在有效性。由于諸如體外放射和化療的非手術(shù)癌癥治療缺乏針對癌細(xì)胞的特異性而導(dǎo)致的 對正常組織和細(xì)胞的毒性效應(yīng)，這些治療的功效有限。為了克服這一限制，已經(jīng)開發(fā)了靶向 的治療方法以增加對需要治療的細(xì)胞和組織進(jìn)行治療的特異性。這種靶向方法學(xué)體內(nèi)應(yīng)用 的實(shí)例是給予抗體偶聯(lián)物，其中抗體經(jīng)設(shè)計(jì)特異地識別需要治療的細(xì)胞或組織相關(guān)的標(biāo)志 物，并且在治療癌癥的情形下將所述抗體偶聯(lián)到諸如毒素的治療劑。作為全身性藥劑的抗體循環(huán)到敏感和不良的身體區(qū)室，諸如骨髓。在急性放射損傷中，淋巴和造血區(qū)室的破壞是 發(fā)生敗血癥及隨后死亡的主要因素。而且，抗體是大的球狀蛋白，在需要治療的組織中的滲 透力差。患有不同終末期疾病的人類患者和非人個(gè)體常常需要器官移植。然而，器官移植 必須克服受體不利的免疫反應(yīng)，并通過用影響造血細(xì)胞的淋巴和其他部分的細(xì)胞毒性試劑 抑制受體對外源器官的細(xì)胞免疫反應(yīng)來防御對移植的器官的免疫排斥。移植接受度由受體 對這些細(xì)胞毒化學(xué)試劑的耐受所限制，其中許多化學(xué)試劑與抗癌(抗增殖的)劑類似。同 樣，當(dāng)使用細(xì)胞毒性抗微生物試劑，特別是抗病毒藥物，或者當(dāng)使用用于自身免疫疾病治療 的細(xì)胞毒性藥物，例如在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡時(shí)，所述治療劑對骨髓和機(jī)體的造血細(xì)胞的 毒性效應(yīng)是其嚴(yán)重的局限性。設(shè)計(jì)了諸如靶向抗體偶聯(lián)物療法的靶向療法的應(yīng)用以盡可能地將治療劑的最大 量局限在希望作用的部位，且治療劑較高的信號-背景比揭示了這種治療的成功。靶向抗 體實(shí)例包括抗體或抗體片段、細(xì)胞或組織特異性肽以及激素和其他受體結(jié)合分子的診斷或 治療劑偶聯(lián)物。例如，針對與病態(tài)的和正常細(xì)胞相關(guān)的以及與致病微生物相關(guān)的不同決定 簇的抗體已經(jīng)用于檢測和治療多種病理狀態(tài)或病變。在這些方法中，靶向抗體直接與例如 在 Hansen et al.，U. S. Pat. No. 3，927，193 以及 Goldenberg, U. S. Pat. Nos. 4，331，647， 4，348，376,4，361，544,4，468，457,4，444，744,4，460，459,4，460，561,4，624，846 和4，818，709中描述的適當(dāng)檢測或治療劑偶聯(lián)。在直接靶向方法，即在其中診斷或治療劑(“活性劑”)直接偶聯(lián)到靶向部分的方 法中遇到的一個(gè)難題是較小部分的偶聯(lián)物實(shí)際結(jié)合到靶部位，而大部分偶聯(lián)物仍留在循環(huán) 中且以一種方式或另一種方式使靶向偶聯(lián)物的功能受損。為了確?；钚詣┳畲缶钟蚧?常施用過量的靶向偶聯(lián)物，確保一些偶聯(lián)物會保持未結(jié)合并有助于活性劑的背景水平。補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)被認(rèn)為是清除諸如腫瘤細(xì)胞的特定靶細(xì)胞的重要 機(jī)制。CDC是由以級聯(lián)方式彼此激活的一系列酶組成的連續(xù)事件。補(bǔ)體在清除抗原中發(fā)揮 重要作用，這通過補(bǔ)體的四個(gè)主要功能實(shí)現(xiàn)(1)局部血管擴(kuò)張，(2)吸引免疫細(xì)胞，特別是 吞噬細(xì)胞(趨化作用)，(3)標(biāo)記外源生物體用于吞噬作用(調(diào)理作用)以及(4)通過膜攻 擊復(fù)合物破壞入侵的生物體(MAC攻擊)。主要分子是C3蛋白。它是通過經(jīng)典途徑或替代 途徑中的組分裂解為兩個(gè)片段的酶。經(jīng)典途徑由抗體誘導(dǎo)，特別是IgG和IgM，而替代途徑 由如脂多糖(LPS)的細(xì)菌產(chǎn)物非特異地激活。簡而言之，C3裂解的產(chǎn)物包括小肽C3a，其對 吞噬作用的免疫細(xì)胞具有趨化性，并通過導(dǎo)致C5a片段從C5的釋放使局部血管擴(kuò)張。C3的 另一部分，C3b，將抗原包被在外源生物體表面，并調(diào)理生物體使其被破壞。C3b也可以與補(bǔ) 體系統(tǒng)的其他組分作用以形成由C5b、C6、C7、C8和C9組成的MAC。因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)對任何抗原，即便是最簡單的抗原的反應(yīng)都是“多克隆的”，即該系 統(tǒng)產(chǎn)生了在結(jié)合區(qū)以及效應(yīng)器區(qū)都具有多種結(jié)構(gòu)的抗體，抗體用于人類治療中存在難題。 已經(jīng)使用兩種方法試圖降低免疫原性的抗體的問題。第一種方法是制備嵌合抗體，其中將 小鼠單克隆抗體的抗原結(jié)合部分(可變區(qū))融合到人抗體的效應(yīng)器部分(恒定區(qū))。在 第二種方法中，通過稱為互補(bǔ)決定簇(⑶R)移植或“人源化(humanization)”的技術(shù)改 造抗體。這種方法已被進(jìn)一步改進(jìn)以包括稱為“整形(reshaping) ”(Verhoeyen，et al, 1988Science 239 :1534-1536 ；Riechmann, et al,1988Nature 332 :323-337 ；Tempest, etal, Bio/Technoll9919 266-271) ,"M&U^it (hyperchimerization) " (Queen, et al, 1989Proc Natl Acad Sci USA 86 10029-10033 ；Co, et al,1991Proc Natl AcadSci USA 88 2869-2873 ；Co,et al, 1992 J Immunol 148 :1149_1154)和“鑲飾(veneering) ”(Mark， et al, In :Metcalf Bff, Dalton BJ, eds. Cellularadhesion :molecular definition to therapeutic potential (細(xì)胞粘附分子定義到治療潛能)· New York =Plenum Press, 1994 291-312)的改變。在試圖開發(fā)和市售更有效的治療劑和緩解劑中，多種抗體技術(shù)已經(jīng)受到關(guān)注。不 幸的是，存在的問題影響了這些治療的前景。例如，用利妥昔單抗(Rituximab)治療的大多 數(shù)癌癥患者一般在約6-12月內(nèi)復(fù)發(fā)，并已報(bào)道了在輸注利妥昔單抗24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)致命的 輸液反應(yīng)。曲妥珠單抗(Trastuzumab)給藥導(dǎo)致心功能不全、充血性心衰以及嚴(yán)重超敏反 應(yīng)(包括過敏癥)、輸液反應(yīng)和肺部事件的出現(xiàn)。達(dá)利珠單抗(Daclizumab)免疫抑制治療使 發(fā)生淋巴組織增生病癥和機(jī)會性感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。據(jù)報(bào)道，在接受吉妥單抗(gemtuzumab) 的患者中出現(xiàn)了由嚴(yán)重的肝中毒和靜脈阻塞疾病(VOD)導(dǎo)致的肝衰引起的死亡。也在接受 阿侖單抗(Alemtuzumab)的患者中報(bào)道了肝中毒。癌癥包括多種多樣的疾病，影響全世界大約四分之一的人口。惡性細(xì)胞迅速和 不受調(diào)節(jié)的增殖是包括血液惡性腫瘤在內(nèi)的多種類型癌癥的特點(diǎn)。盡管血液惡性疾病 患者已受益于過去二十年癌癥治療的進(jìn)展(Multani et al.，1998J. Clin. Oncology 16: 3691-3710)，且緩解期已經(jīng)延長，但大多數(shù)患者仍會復(fù)發(fā)并死于他們所患疾病。用細(xì)胞毒性 藥物治療的障礙包括，例如腫瘤細(xì)胞抗性和化療的高毒性，其在許多患者中妨礙了最佳的 給藥。據(jù)報(bào)道，使用嵌合的CD20單克隆抗體治療低分級或?yàn)V泡性B細(xì)胞淋巴瘤患者引發(fā) 患者部分或完全的應(yīng)答。McLaughlin et al. , 1996Blood 88 :90a(摘要，suppl. 1) ；Maloney et al. ,1997Blood 90:2188-95。然而，如上所述，腫瘤通常在6個(gè)月至1年內(nèi)復(fù)發(fā)。需要 在血清學(xué)治療中作出進(jìn)一步的改進(jìn)以例如，在低分級B細(xì)胞淋巴瘤誘導(dǎo)更長期的應(yīng)答，以 及在高分級淋巴瘤和其他B細(xì)胞疾病中進(jìn)行有效的治療。自身免疫疾病包括自身免疫甲狀腺疾病，其包括格雷夫斯氏病(Grave' s disease)和喬本氏甲狀腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)。另一種自身免疫疾病是類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，其是特征為導(dǎo)致腫脹、疼痛和功能喪失的關(guān)節(jié)炎癥的慢性疾病。RA由包 括最初的感染或損傷、異常免疫反應(yīng)和遺傳因素在內(nèi)的事件組合導(dǎo)致的。盡管自身反應(yīng)性 T細(xì)胞和B細(xì)胞存在于RA中，在RA的診斷中使用稱為類風(fēng)濕因子的聚集在關(guān)節(jié)中的高水 平抗體的檢測。RA的目前治療包括許多管理疼痛和減慢疾病進(jìn)展的藥物。系統(tǒng)性紅斑狼 瘡(SLE)是由對包括腎臟、皮膚和關(guān)節(jié)在內(nèi)的多器官中的血管反復(fù)的損害導(dǎo)致的自身免疫 疾病。在SLE患者中，T細(xì)胞和B細(xì)胞錯(cuò)誤的相互作用導(dǎo)致攻擊細(xì)胞核的自身抗體的產(chǎn)生。
有幾種其他公認(rèn)的自身免疫疾病。干燥綜合征(Sjogren' s syndrome)是特征 為機(jī)體產(chǎn)水分的腺體破壞的自身免疫疾病。免疫性血小板減少性紫癜(ITP)由與血小板結(jié) 合并引起血小板破壞的自身抗體導(dǎo)致。多發(fā)性硬化癥(MS)也是一種自身免疫疾病。它的 特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和使腦、脊髓和身體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞纖維絕緣的髓鞘的破壞。重癥 肌無力(Myasthenia Gravis,MG)是慢性自身免疫性神經(jīng)肌肉病癥，其特征為隨意肌肉群無 力。MG由與表達(dá)于神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿受體結(jié)合的自身抗體導(dǎo)致。所述自身抗體減少或阻斷乙酰膽堿受體，阻止信號從神經(jīng)到肌肉的傳遞。銀屑病侵襲大約5百萬人口，其 特征為皮膚的自身免疫炎癥。硬皮病是結(jié)締組織的慢性自身免疫疾病，也稱為系統(tǒng)性硬化。 硬皮病的特征為膠原的過量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致皮膚的增厚。通過前面的討論，顯然亟需改進(jìn)的組合物和方法以治療、緩解或預(yù)防包括癌癥、炎 癥和自身免疫疾病的多種疾病、病癥和病況。發(fā)明_既述 本發(fā)明通過提供蛋白和編碼此類蛋白的核酸以及所述蛋白和核酸的制備和診 斷及治療用途，滿足了本領(lǐng)域前述需要的至少一種，其中所述蛋白包含經(jīng)由連接子(PIMS 連接子)連接到至少一個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的來自抗體分子的恒定亞區(qū)(constant sub-region)，所述連接子具有來自抗體鉸鏈區(qū)、或連接結(jié)合結(jié)構(gòu)域的區(qū)域、或?qū)⒔Y(jié)合結(jié)構(gòu) 域連接到細(xì)胞表面跨膜區(qū)或膜錨定的區(qū)域的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白在本文稱為PIMS 分子。PIMS連接子具有來自抗體鉸鏈區(qū)、或連接結(jié)合結(jié)構(gòu)域的區(qū)域、或?qū)⒔Y(jié)合結(jié)構(gòu)域連接 到細(xì)胞表面跨膜區(qū)或膜錨定的區(qū)域的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述連接子具有至 少一個(gè)半胱氨酸殘基，其在標(biāo)準(zhǔn)的肽條件下能夠參與至少一個(gè)二硫鍵的形成。在一些實(shí)施 方案中，PIMS分子還包含來自抗體鉸鏈區(qū)的N-末端結(jié)構(gòu)域，所述鉸鏈區(qū)可以與連接恒定亞 區(qū)和特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PIMS連接子相同或不同。類比于抗體恒定區(qū)常規(guī)位于抗體鏈的 羧基末端，通常認(rèn)為將來自抗體的恒定區(qū)置于蛋白內(nèi)部或其N-末端會妨礙效應(yīng)器功能。然 而，將恒定亞區(qū)置于本發(fā)明所述多肽或肽鏈的N-末端或內(nèi)部產(chǎn)生的蛋白呈現(xiàn)出相對地不 受空間位阻妨礙的效應(yīng)器功能和特異性結(jié)合能力?？紤]到本文公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域技術(shù)人 員顯而易見的是，這種結(jié)構(gòu)的蛋白和編碼這些蛋白的核酸會有多種應(yīng)用，包括醫(yī)學(xué)和獸醫(yī) 中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合蛋白的優(yōu)選形式，其包含恒定亞區(qū)、置于所述恒 定亞區(qū)的C-末端的PIMS連接子區(qū)以及至少一個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述恒定亞區(qū)包含部 分或全部的C02結(jié)構(gòu)域和部分或全部的Ch3結(jié)構(gòu)域，所述特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含部分或全部 的\結(jié)構(gòu)域和部分或全部的Vh結(jié)構(gòu)域，并呈現(xiàn)出與結(jié)合伴侶特異結(jié)合的能力，該特異性結(jié) 合結(jié)構(gòu)域置于PIMS連接子的C-末端，其中所述特異性結(jié)合蛋白特異結(jié)合至少一個(gè)靶標(biāo)并 呈現(xiàn)出至少一種抗體分子的效應(yīng)器功能。因此，在優(yōu)選的PIMS蛋白分子中，PIMS連接子以 及因此恒定亞區(qū)置于所述分子的每一特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N-末端。在一些實(shí)施方案中，C02 結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)是完整的抗體結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明適合的特異性結(jié)合蛋白包 括具有選自 IgG (IgGl，IgG2，IgG3，IgG4)，IgE, IgD, IgA (IgAl，Ig A2)和 IgM 抗體結(jié)構(gòu)域 的抗體結(jié)構(gòu)域的蛋白。此類分子包括其中C02結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID N0:377中列出的序列和 /或Ch3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :379中列出的序列的特異性結(jié)合蛋白。恒定亞區(qū)提供的示 例性效應(yīng)器功能包括抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。適用于本發(fā)明所述的PIMS分子中的PIMS連接子區(qū)可以選自抗體鉸鏈區(qū)、II型 C-凝集素(Lectin)分子的莖區(qū)(stalk region)(例如，CD72 莖區(qū))、NKG2a 區(qū)、NKG2A C18S 區(qū)以及其變異體。例如，適合的PIMS連接子包括選自IgG，IgA，IgD和IgE鉸鏈和其變異體 的抗體鉸鏈區(qū)。例如，PIMS連接子可以是選自人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4以及其變 異體的抗體鉸鏈區(qū)。在一些實(shí)施方案中，PIMS連接子區(qū)具有用于形成鏈間二硫鍵的單個(gè)半 胱氨酸殘基。在其他實(shí)施方案中，PIMS連接子具有用于形成鏈間二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基。被考慮用于PIMS分子的PIMS連接子區(qū)包括鉸鏈區(qū)，其包含選自SEQ ID NO :61至SEQ ID NO 118的序列。還被考慮用作PIMS分子的PIMS連接子區(qū)的有SEQ ID NO 2的殘基268_281、SEQ ID NO :3 的殘基 268-282、SEQ ID NO :5 的殘基 268_282、SEQ ID NO :6 的殘基 268_282、SEQ ID NO :8 的殘基 268-282、SEQ ID NO :9 的殘基 268_281、SEQ ID NO :11 的殘基 268_282、SEQ IDNO 12 的殘基 268-282、SEQ ID NO 14 的殘基 268-281、SEQ ID NO 16 的殘基 268-282、 SEQ ID NO 18 的殘基 268-282、SEQ ID NO 20 的殘基 268-282、SEQ ID NO 22 的殘基 268-282、SEQ ID NO 24 的殘基 268-282、SEQ ID NO 26 的殘基 268-282、SEQ ID NO 28 的 殘基 268-282、SEQ ID NO 30 的殘基 268-282、SEQ ID NO 32 的殘基 279-293、SEQ ID NO: 34 的殘基 274-288、SEQ ID NO 34 的殘基 274-288、SEQ ID NO 36 的殘基 261-275、SEQ ID NO 38 的殘基 268-283,SEQ ID NO 40 的殘基 268-282,SEQ ID NO 42 的殘基 270-284,SEQ ID NO 44 的殘基 265-279,SEQ ID NO 46 的殘基 265-279,SEQ ID NO 48 的殘基 265-279、 SEQ ID NO :50 的殘基 265-279、SEQ ID NO :52 的殘基 265-279、SEQ ID NO :54 的殘基 265-279,SEQ ID NO 56 的殘基 265-279、SEQ ID NO 58 的殘基 265-279、SEQ ID NO 60 的 殘基 268-282、SEQ ID NO 359 的殘基 24-38、SEQ ID NO :361 的殘基 24_38、SEQ ID NO 363 的殘基 24-38、SEQ IDNO :365 的殘基 24-38、SEQ ID NO 367 的殘基 24-38、SEQ ID NO 369 的殘基 24-38、SEQ ID NO 371 的殘基 23-37、SEQ ID NO 373 的殘基 23-37 和 SEQ ID NO 375的殘基23-37。此外，序列表中確定的提供鉸鏈區(qū)序列的任何氨基酸序列都可以考慮用 作本發(fā)明所述的PIMS分子中的PIMS連接子。更一般地，PIMS連接子可以是鉸鏈樣肽結(jié)構(gòu) 域，具有能夠參與鏈間二硫鍵的至少一個(gè)自由半胱氨酸。此外，PIMS連接子是II型C-凝 集素分子的莖區(qū)。在一些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合蛋白或PIMS蛋白(或者多肽)特異地結(jié)合多種靶 標(biāo)的一種，所述靶標(biāo)包括但不限于⑶3，⑶19，⑶20，⑶28，⑶37和DR。示例性的PIMS分子 或蛋白是選自下述的特異性結(jié)合蛋白W0001 (由例如SEQ ID N0:358編碼的SEQ ID NO 359)，W0002(由例如 SEQ ID N0:360編碼的 SEQ ID NO :361)，W0003 (由例如 SEQ ID NO 362 編碼的 SEQ ID NO :363)，W0004(由例如 SEQ IDNO :364 編碼的 SEQ ID NO :365)，W0005 (由 例如 SEQ ID NO 366 編碼的 SEQ ID NO 367)，W0006 (由例如 SEQ ID NO 368 編碼的 SEQ IDNO :369)，W0007(由例如 SEQ ID NO 370 編碼的 SEQ ID NO :371)，W0008 (由例如 SEQ ID NO 372 編碼的 SEQ ID NO 373)，W0009 (由例如 SEQ ID NO 374 編碼的 SEQ ID NO 375)， W0011 (由例如 SEQ IDNO 390 編碼的 SEQ ID NO :391)，W0012 (由例如 SEQ ID NO 404 編 碼的 SEQ ID NO 405)，W0023 (由例如 SEQ ID NO 406 編碼的 SEQ IDNO 407)，W0024(由 例如 SEQ ID NO 408 編碼的 SEQ ID NO 409)，W0025 (由例如 SEQ ID NO 410 編碼的 SEQ ID NO 411)，W0028 (由例如 SEQ ID NO 486 編碼的 SEQ ID NO 487)，W0029 (由例如 SEQ IDNO :480編碼的 SEQ ID NO :481)，W0030 (由例如 SEQ ID N0:482編碼的 SEQ ID NO 483), W0031 (由例如 SEQ ID NO 484 編碼的 SEQ IDNO 485)，W0035 (由例如 SEQ ID NO 489 編 碼的 SEQ ID NO 490)，W0036 (由例如 SEQ ID NO 491 編碼的 SEQ ID NO 492)，W0041 (由 例如 SEQ ID NO 497 編碼的 SEQ ID NO 498) ,W0042 (由例如 SEQ IDNO 499 編碼的 SEQ ID NO 500)，W0044 (由例如 SEQ ID NO 503 編碼的 SEQ ID NO 504)，W0045 (由例如 SEQ ID N0:505 編碼的 SEQ IDNO :506)，W0050(由例如 SEQ ID NO :452 編碼的 SEQ ID NO 453),W0051 (由例如 SEQ ID NO 454 編碼的 SEQ ID NO 455)，W0052 (由例如 SEQ ID NO 456 編 碼的 SEQ ID NO 457)，W0053 (由例如 SEQ IDNO 458 編碼的 SEQ ID NO 459)，W0055 (由 例如 SEQ ID N0:510 編碼的 SEQ ID NO :511)，W0056 (由例如 SEQ ID NO :493 編碼的 SEQ IDNO 494) ,W0057(由例如 SEQ ID NO 507 編碼的 SEQ ID NO 508) ,W0083(由例如 SEQ ID NO 460 編碼的 SEQ ID NO 461)，W0087 (由例如 SEQ ID NO 495 編碼的 SEQ ID NO 496)， W0094 (由例如 SEQ IDNO 444 編碼的 SEQ ID NO 445)，W0095 (由例如 SEQ ID NO 446 編 碼的 SEQ ID NO 447)，W0096 (由例如 SEQ ID NO 448 編碼的 SEQ IDNO 449)，W0097 (由 例如 SEQ ID NO 450 編碼的 SEQ ID NO 451)，DNE090 (由例如 SEQ ID NO 392 編碼的 SEQ ID NO 393) ,DNE091 (由例如 SEQ ID NO 394 編碼的 SEQ ID NO 395), DNE092 (由例如 SEQ IDNO 396編碼的 SEQ ID NO :397)，DNE093 (由例如 SEQ ID N0:398編碼的 SEQ ID NO 399), DNE094 (由例如 SEQ ID NO 400 編碼的 SEQ IDNO 401)和 DNE095 (由例如 SEQ ID NO 402 編碼的 SEQ ID NO 403)?？紤]用于PIMS 分子的 PIMS 連接子包含 SEQ ID NO 148, SEQ IDNO 150，SEQ ID NO 152,SEQ ID NO 154,SEQ ID NO 156,SEQ IDNO 158,SEQ ID NO 160,SEQ ID NO 162, SEQ ID NO 164,SEQ IDNO 166,SEQ ID NO 168,SEQ ID NO 172,SEQ ID NO 174,SEQ IDNO 176，SEQ ID NO 180,SEQ ID NO 182,SEQ ID NO 184,SEQ IDNO 186,SEQ ID NO 188,SEQ ID NO :190，SEQ ID NO :192，SEQ IDNO :194，SEQ ID NO :196，SEQ ID NO :198，SEQ ID NO 200，SEQ IDN0202, SEQ ID NO :204，SEQ ID NO :206，SEQ ID NO :208，SEQ IDNO :210，SEQ ID NO :212，SEQ ID NO :214，SEQ ID NO :216，SEQ IDNO :222，SEQ ID NO :230，SEQ ID NO 238，SEQ ID NO 240,SEQ IDNO 242,SEQ ID NO 244,SEQ ID NO 246,SEQ ID NO 248,SEQ IDNO :541，SEQ ID NO :542，SEQ ID NO :543，SEQ ID NO :544，SEQ IDNO :545，SEQ ID NO 546，SEQ ID NO 547和SEQ ID NO :548中任一個(gè)列出的氨基酸序列。其中Vl結(jié)構(gòu)域和Vh 結(jié)構(gòu)域由結(jié)構(gòu)域間連接子分開的特異性結(jié)合蛋白也是被考慮的。在這種實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu) 域間連接子可以顯示出(Gly4Ser)n的結(jié)構(gòu)，其中η優(yōu)選為1_5。適用于PIMS分子中的示例 性的結(jié)構(gòu)域間連接子包括，但不限于HlKSEQ IDNO 544)、H12(SEQ ID NO 545)、H17(SEQ ID NO 184)、H45(SEQ IDNO 240)和H46(SEQ ID NO 242)，以及基于(Gly4Ser) η 的連接子， 諸如 SEQ ID NO 243, SEQ ID NO 245, SEQ ID NO 247, SEQ ID NO 248, SEQ ID NO 539 禾口 SEQ ID Ν0:540中公開的那些。此外，序列表中確定的提供連接子序列的任何氨基酸序列 都可以考慮用于本發(fā)明所述的PIMS分子。在一些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合蛋白具有\(zhòng)結(jié)構(gòu)域和Vh結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)，其 包含選自如下的序列:SEQ ID NO 2的殘基23-128、SEQ ID NO 2的殘基145-265、SEQ ID NO 2 的殘基 520-640,SEQ IDNO 2 的殘基 661-772,SEQ ID NO 28 的殘基 508-629,SEQ ID NO :28 的殘基 647-754、SEQ ID NO 30 的殘基 508-629、SEQ ID NO :30 的殘基 652_759、SEQ ID NO 44 的殘基 21-127、SEQ ID NO 44 的殘基 143-264、SEQ ID NO 354 的殘基 1-121 和 SEQ ID NO :354的殘基134-239。按照次序，上述序列是抗-CD20抗體Vl (2H7)、抗-CD20抗 體乂！^？取)、抗-CD28 抗體 Vh(2E12)、抗-CD28 抗體 VJ2E12)、抗-CD3 抗體 VH(G19_4)、抗-CD3 抗體 Vl(G19-4)、抗-CD37 抗體 VH(G28_1)、抗-CD37 抗體 VJG28-1)、抗-CD20 抗體 VH(2Lm 20-4)和抗-⑶20抗體\(2Lm 20-4)的氨基酸序列。本發(fā)明包括PIMS，其具有與駱駝科動 物抗體組成類似的單一特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及更常見的那些來自抗體的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的成對的重鏈和輕鏈。在后一組成結(jié)構(gòu)中，部分或全部\結(jié)構(gòu)域以及部分或全部Vh結(jié)構(gòu) 域在考慮范圍內(nèi)，前提是PIMS分子保留與結(jié)合伴侶特異結(jié)合的能力。而且，\和Vh可以被 以任一方向排列，并且利用本文公開的連接子肽或能夠提供間隔子功能的任何其他氨基酸 序列或者其混合，\和Vh可以分開至少約5-8個(gè)氨基酸，所述間隔子功能與具有這兩個(gè)結(jié) 構(gòu)域的PIMS的所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相互作用兼容。多特異性PIMS具有至少兩個(gè)特異性結(jié)合 結(jié)構(gòu)域，與駱駝科抗體的組成結(jié)構(gòu)類似，或者具有至少四個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與更常見的 哺乳動物抗體成對的\和\鏈的組成結(jié)構(gòu)類似。此外，PIMS蛋白可以是特異性結(jié)合蛋白， 如上文所述，還包含置于恒定亞區(qū)N-末端的鉸鏈。在一些實(shí)施方案中，鉸鏈包含與置于恒 定亞區(qū)和特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的PIMS連接子相同的序列。在一些實(shí)施方案中，PIMS特 異性結(jié)合蛋白還包含至少另一個(gè)置于恒定亞區(qū)C-末端的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且多個(gè)特 異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合相同或不同的靶標(biāo)。本發(fā)明的另一方面涉及制備本文描述的特異性結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括將 包含編碼特異性結(jié)合蛋白的多核苷酸的細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸；并在適于所述多核苷酸表達(dá)的 條件下在培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)胞。本發(fā)明的再一方面是治療選自癌癥、炎癥和自身免疫病癥的病況的方法，其包括 給予有所需要的生物體有效量的本文描述的特異性結(jié)合蛋白。用于治療的優(yōu)選生物體是 人。本發(fā)明的相關(guān)方面是上文描述的特異性結(jié)合蛋白在制備用于治療選自癌癥、炎癥和自 身免疫病癥的病況的藥物中的用途。所述藥物可以適于給予諸如例如人的哺乳動物的脊椎 動物，這在本發(fā)明的考慮范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一方面是改善選自癌癥、炎癥和自身免疫病癥的病況的癥狀的方法， 其包括給予有所需要的生物體有效量的本文描述的特異性結(jié)合蛋白。同樣，優(yōu)選的生物體 是人。本發(fā)明的相關(guān)方面是上文描述的特異性結(jié)合蛋白在制備用于改善選自癌癥、炎癥和 自身免疫病癥的病況的癥狀的藥物中的用途。所述藥物可以適于給予諸如例如人的哺乳動 物的脊椎動物，這在本發(fā)明的考慮范圍內(nèi)。本發(fā)明的再一方面是本文描述的特異性結(jié)合蛋白在制備用于治療選自癌癥、炎癥 和自身免疫病癥的病癥的藥物中的用途。通過參考下文包括實(shí)施例在內(nèi)的詳細(xì)說明，本發(fā) 明的其他特征和優(yōu)勢會被更好地理解。


圖1顯示了具有效應(yīng)器功能的特異性結(jié)合蛋白或PIMS肽的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2顯示了在CD16(高親和力)結(jié)合ELISA分析中PIMS (W0001)、SMIP (結(jié)合CD20 的2Lm20-4)和Scorpion (S0129，CD20xCD20多特異性結(jié)合蛋白)結(jié)合的比較圖，將結(jié)合的 蛋白的平均熒光強(qiáng)度顯示為蛋白濃度的函數(shù)。圖 3 是在 CD16(低親和力)結(jié)合 ELISA 分析中 PIMS (W0001)、SMIP (2Lm20_4)和 Scorpion(S0129)結(jié)合的比較圖，將結(jié)合的蛋白的平均熒光強(qiáng)度顯示為蛋白濃度的函數(shù)。圖4顯示了 PIMS (W0001)和SMIP (2E12)與人外周CD3+T-細(xì)胞結(jié)合的比較圖。圖5顯示了通過與2E12SMIP、2E12PIMS或者PE⑶3+和單獨(dú)的GAH孵育的外周血 單核細(xì)胞的PE (藻紅蛋白)_標(biāo)記的⑶3+淋巴細(xì)胞的FITC F' 2GAH(山羊抗-人二抗)染 色的平均熒光強(qiáng)度。將平均熒光強(qiáng)度作圖為被測定的試劑樣品(2E12SMIP，2E12PIMS或?qū)φ?PE-偶聯(lián)的抗-⑶3抗體(BD Pharmingen)和山羊抗-人二抗的組合物))濃度的函數(shù)。圖6顯示了 PIMS與WIL2-S細(xì)胞的結(jié)合。將結(jié)合測量為幾何(geometric)或geo 平均熒光強(qiáng)度作為PIMS(ug/ml)濃度的函數(shù)。實(shí)心正方形TRU-015(抗-CD20SMIP)，空心 正方形2Lm20-4scc，實(shí)心豎立三角形(upright triangle) :2Lm20_4HL17，2Lm20_4HL12， 空心豎立三角形PIMS20-17，以及空心菱形PIMS20-12。圖7顯示了 PIMS連接子對抗-DR PIMS與Wil2_S細(xì)胞結(jié)合的影響。將結(jié)合測量 為geo平均熒光強(qiáng)度作為暴露于500，000個(gè)細(xì)胞的蛋白濃度的函數(shù)。實(shí)心菱形M0019 ( 一 種DR SMIP)，實(shí)心正方形W0035PIMS，實(shí)心豎立三角形W0036PIMS，以及“X” :W0056PIMS。圖8顯示了與Ramos細(xì)胞的最大結(jié)合的百分比(最大結(jié)合百分比)，其作為接觸細(xì) 胞的抗-⑶37PIMS分子的濃度(nM)的函數(shù)。實(shí)心正方形TRU-016，抗-⑶37SMIP，實(shí)心豎 立三角形W0012 (基于H7的25個(gè)氨基酸的PIMS連接子)，實(shí)心倒立三角形W0023 (基于 H7的10個(gè)氨基酸的PIMS連接子)，實(shí)心菱形W0024 (基于H7的15個(gè)氨基酸的PIMS連接 子)，實(shí)心圓形W0025 (基于H7的20個(gè)氨基酸的PIMS連接子)，空心正方形W0094 (基于 H65的25個(gè)氨基酸的PIMS連接子)，空心豎立三角形W0095 (基于H65的10個(gè)氨基酸的 PIMS連接子)，空心倒立三角形W0096 (基于H65的15個(gè)氨基酸的PIMS連接子)，以及空 心圓形W0097 (基于H65的20個(gè)氨基酸的PIMS連接子)。圖9顯示了多種PIMS分子和SMIP與Ramos B細(xì)胞的結(jié)合，這通過利用酶偶聯(lián) 的二抗進(jìn)行熒光標(biāo)記后的平均熒光強(qiáng)度顯示?？招恼叫蝍Her2(抗-Her2)，實(shí)心正方 形TRU-016(抗-CD37SMIP)，W0028 (小鼠抗-CD37PIMS)，空心菱形W0029(半人源化的 抗-CD19PIMS)，實(shí)心菱形W0030-HD37(小鼠抗-CD19)，以及實(shí)心圓形W0031_4G7 (小鼠 抗-CD19)。圖10顯示了抗⑶28PIMS與Jurkat T細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)合通過平均熒光強(qiáng)度測 量，將MFI作圖為蛋白濃度(ug/ml)的函數(shù)。實(shí)心菱形W0001 (H7PIMS連接子)，實(shí)心正 方形W0050 (H9PIMS連接子)，實(shí)心豎立三角形W0051 (H47PIMS連接子)，角突起(corner projections)的正方形W0052，角突起以及頂部中心突起的正方形W0053 (H62PIMS連接 子)，實(shí)心圓形:W0083 (H65PIMS連接子)，以及縱刻度線(vertical tick mark)穿過正方 形中心的實(shí)心正方形抗-⑶28SMIP。圖11顯示了 CD 16Lo與結(jié)合到Ramos細(xì)胞的CAS PIMS的結(jié)合。顯示了作為PIMS 濃度函數(shù)的幾何平均熒光強(qiáng)度。菱形⑴TRU-016(抗-CD37SMIP)，正方形(2) :W0012，豎 立三角形(3) :W0023，X-標(biāo)記(4) :W0024，星號(5) :W0025，菱形(6) :W0094，縱刻度線(7) W0095，小長方形(8) :W0096，以及大長方形(9) :W0097。圖12顯示了抗-⑶20PIMS介導(dǎo)的BJAB B-細(xì)胞的ADCC。將作為PIMS濃度的函數(shù) 的特異性BJAB B-細(xì)胞殺傷百分比作圖。藍(lán)色菱形W0008(10個(gè)氨基酸的PIMS連接子)， 紅色圓形W0009 (15個(gè)氨基酸的PIMS連接子)，綠色豎立三角形2Lm20_4SMIP，黑色圓形培養(yǎng)基。圖13顯示了抗CD28PIMS介導(dǎo)的Jurkat T-細(xì)胞的ADCC。顯示了作為PIMS濃 度的函數(shù)的特異性Jurkat T-細(xì)胞殺傷百分比。菱形W0001 (抗-CD28PIMS)，正方形 2E12Ig(抗-CD28SMIP)，三角形2E12N297D Ig(變異的抗-CD28SMIP)，以及圓形培養(yǎng)基。圖14顯示了抗-DR PIMS-介導(dǎo)的BJAB B-細(xì)胞的ADCC。提供了作為PIMS濃度的函數(shù)的特異性BJAB B-細(xì)胞殺傷百分比。菱形M0019 (F3. 3SMIP)，正方形 W0035 (F3. 3H7PIMS)，三角形W0036 (F3. 3NKG2A PIMS)，W0056 (F3. 3NKG2A cys K/0 PIMS)， 帶虛線的正方形利妥昔單抗，以及沒有連接線的正方形培養(yǎng)基。圖15顯示了抗-⑶37PIMS-介導(dǎo)的BJAB B-細(xì)胞的ADCC。將特異性細(xì)胞殺傷百分 比測量為蛋白濃度(nM)的函數(shù)。菱形W0012(H7PIMS連接子)，正方形W0094 (H65PIMS連 接子)，豎立三角形TRU-016 (抗-⑶37SMIP)，帶虛線的圓形利妥昔單抗，以及帶實(shí)線的圓
形培養(yǎng)基。圖16顯示了在人血清存在時(shí)PIMS-介導(dǎo)的Ramos B-細(xì)胞的⑶C。將作為 PIMS濃度(ug/ml)的函數(shù)的碘化丙啶陽性細(xì)胞的百分比作圖。菱形2Lm20-4SMIP(人 源化抗-⑶20SMIP)，正方形W0008 (10個(gè)氨基酸的PIMS連接子；HL結(jié)合結(jié)構(gòu)域取向 (orientation))，豎立三角形W0009 (15個(gè)氨基酸的PIMS連接子；HL結(jié)合結(jié)構(gòu)域取向)，實(shí) 心圓形TRU-015 (抗-CD20SMIP)，以及空心圓形培養(yǎng)基。圖17顯示了抗-DR PIMS抑制了 DHL-6B-細(xì)胞中的ATP釋放。將相對發(fā)光 單位(Relative Luminescence Unit, RLU)測量為蛋白濃度(ug/ml)的函數(shù)。實(shí)心菱 形F3. 3SMIP+GAH(山羊抗-人二抗)，空心正方形F3. 3H7PIMS+GAH，空心豎立三角形 F3. 3NKG2A PIM+GAH，實(shí)心圓形TDR31. 1單克隆抗體+GAM(山羊抗小鼠二抗)，實(shí)心豎立三 角形GAM(3 1)，實(shí)心正方形GAH(3 1)，以及空心圓形培養(yǎng)基。圖18顯示了抗-Her2PIMS與SKBR3細(xì)胞的結(jié)合。將結(jié)合測量為平均熒光強(qiáng)度，作 為蛋白濃度(ug/ml)的函數(shù)。實(shí)心菱形W0042PIMS，實(shí)心正方形W0044PIMS，實(shí)心豎立三角 形W0045PIMS，實(shí)心大正方形W0041PIMS，以及實(shí)心大正方形Her033SMIP。圖19顯示了抗-Her2PIMS與MDA-MB453細(xì)胞的結(jié)合。將結(jié)合測量為平均熒光強(qiáng) 度，作為蛋白濃度(ug/ml)的函數(shù)。實(shí)心菱形Her033SMIP，實(shí)心小正方形W0042，實(shí)心豎立三角形W0057，實(shí)心大正方形對照。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了將特異性結(jié)合給定靶標(biāo)諸如有害細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞或與炎癥或 自身免疫病癥有關(guān)的細(xì)胞)上的靶標(biāo)的能力與抗體效應(yīng)器樣活性結(jié)合的分子，結(jié)合的方 式為將恒定亞區(qū)置于朝向該分子的N-末端的位置，將特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域置于朝向該分 子的C-末端的位置，并帶有連接所述特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域和恒定亞區(qū)的(通常為鉸鏈樣 的)PIMS連接子區(qū)，所述連接子區(qū)任選地包含至少一個(gè)能夠形成至少一個(gè)二硫鍵的半胱 氨酸。效應(yīng)器樣功能包括ADCC(抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用)和CDC(補(bǔ)體依賴性 細(xì)胞毒作用)，因此將細(xì)胞毒作用與有害的細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞以及導(dǎo)致或加劇炎癥或 自身免疫病癥的細(xì)胞)聯(lián)系起來。因?yàn)橥ㄟ^將恒定亞區(qū)置于N-末端，恒定亞區(qū)的C-末 端與分子其余部分以肽鍵連接(這與恒定區(qū)位于分子的C-末端的天然存在的任何抗體 結(jié)構(gòu)不同)而沒有失去活性，所以該分子是有效的。所述分子通常小于天然抗體和類似 的多肽，由此潛在地改善了分子的穿透性，本文稱為反轉(zhuǎn)小模免疫藥物(reverse Small ModularlmmunoPharmaceutical) ( S卩，SMIP)或PIMS分子。值得注意地，小體積并沒降低 PIMS的體內(nèi)持續(xù)性，如在考慮用于生物體給藥的其他小肽分子中發(fā)現(xiàn)的一樣。不希望受任 何理論約束，恒定亞區(qū)的存在可以有助于該分子的體內(nèi)持久性。圖1顯示了示例性PIMS分子的示意性結(jié)構(gòu)。通常，PIMS分子是單鏈多肽，在N-末端到C-末端的方向上包含來自免疫球蛋白(其包括來自相同(優(yōu)選地)或不同動物種類的 Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域)、免疫球蛋白同種型和/或免疫球蛋白亞類的恒定亞區(qū)，通常為來自免疫 球蛋白的鉸鏈區(qū)的PIMS連接子肽，以及來自特異性結(jié)合對的肽成員的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其包括共同地促成功能結(jié)合結(jié)構(gòu)域的來自所述肽成員的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域。在一些實(shí)施方案 中，PIMS分子還包含來自免疫球蛋白的置于N-末端的鉸鏈區(qū)，且所述N-末端鉸鏈區(qū)可以 與在恒定亞區(qū)和結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間存在的PIMS連接子區(qū)相同或不同。PIMS分子還可以包含 用于多肽制備的N-末端前導(dǎo)序列，且所述前導(dǎo)序列可以包括由存在于編碼核酸中經(jīng)設(shè)計(jì) 的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)所編碼的氨基酸。因此，一些PIMS分子的示例性示 意結(jié)構(gòu)包括下 述N-恒定亞區(qū)-PIMS連接子-結(jié)合結(jié)構(gòu)域-C，N-鉸鏈-恒定亞區(qū)-PIMS連接子-結(jié)合結(jié) 構(gòu)域-C，N-前導(dǎo)區(qū)-恒定亞區(qū)-PIMS連接子-結(jié)合結(jié)構(gòu)域-C，或N-前導(dǎo)區(qū)-鉸鏈-恒定 亞區(qū)-PIMS連接子-結(jié)合結(jié)構(gòu)域-C?，F(xiàn)在將更詳細(xì)地描述PIMS分子的功能性組分。本發(fā)明還提供了包含編碼PIMS的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的載體和包含 所述多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞的組合物，提供了制備這種分子的方法，鑒于蛋白體積較 小，優(yōu)選通過重組蛋白制備方法制備，還可以通過化學(xué)合成法制備。此外，本發(fā)明提供了治 療諸如癌癥、炎癥和自身免疫病癥的病癥的方法，以及提供了改善這些病癥的癥狀的相關(guān) 方法。提供了這種分子以及在體內(nèi)重組制備它們的方法，就已經(jīng)獲得了靶向診斷和治療 的新途徑，其允許，例如，將免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器細(xì)胞(例如，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、天然殺傷細(xì) 胞等)靶向召集到待破壞或收繳(sequestered)的細(xì)胞、組織、媒介(agents)和外源目標(biāo)， 諸如癌細(xì)胞和感染性媒介。除了將治療性細(xì)胞定位于治療部位外，所述肽可以用于定位諸 如放射標(biāo)記的蛋白的治療性化合物。此外，該肽也可以用于清除有害的成分，例如，通過使 諸如毒素的有害成分與能夠破壞或消除該毒素的細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞)發(fā)生聯(lián)系。本發(fā) 明的分子在調(diào)節(jié)諸如細(xì)胞表面受體的結(jié)合伴侶分子的活性方面是有用的。其中確定的細(xì)胞 群的消除是有益的疾病和病況包括感染性和寄生性疾病、炎癥性和自身免疫病況、惡性腫 瘤等。通過考慮下面對本文中使用的術(shù)語的明確定義會有助于對本發(fā)明的公開的進(jìn)一步描 述?！皢捂溄Y(jié)合蛋白“是單一連續(xù)地排列的共價(jià)連接的氨基酸，該鏈作為單體和/或 多聚體能夠特異地與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合伴侶結(jié)合，所述結(jié)合伴侶與待被所述單鏈結(jié)合蛋白可 檢測地結(jié)合的結(jié)合部位共享足夠的決定簇。示例性結(jié)合伴侶包括蛋白、碳水化合物、脂類和 小分子。為了便于闡述，根據(jù)與本發(fā)明所述的蛋白和/或多肽和/或肽的差異，描述了本發(fā) 明所述的蛋白、多肽和肽的〃衍生物(derivatives)丨‘和〃變異體(variants)丨‘，這意味 著為本發(fā)明所述的蛋白/多肽/肽的所述衍生物和變異體不同于本發(fā)明定義的非衍生的或 非變異的蛋白、多肽或肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，衍生物和變異體本身為本發(fā)明所述的蛋 白、多肽和肽。“抗體”被給予與其在本領(lǐng)域中的意義一致的最廣泛的定義，包括能夠與諸如蛋白 質(zhì)或非蛋白質(zhì)抗原的至少一種結(jié)合伴侶結(jié)合的蛋白、多肽和肽。本文使用的“抗體”包括免 疫球蛋白超家族蛋白的任一種類、單鏈或多鏈組成的成員以及這些分子的變異體、類似物、 衍生物和片段。特別地，“抗體”包括本領(lǐng)域已知的任一形式的抗體，包括但不限于，單克隆和多克隆抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈可變片段、雙特異性抗 體、雙功能抗體(diabodies)、抗體融合物等。“結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain) ”是諸如來自免疫球蛋白(例如，抗體)的多肽片 段的肽區(qū)域，其特異地結(jié)合一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合伴侶。如果存在多個(gè)結(jié)合伴侶，這些伴侶 共享足以可檢測地與結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)合決定簇。優(yōu)選地，結(jié)合結(jié)構(gòu)域是氨基酸的連續(xù) 序列?！氨砦弧痹诒疚闹斜唤o予其單個(gè)抗原位點(diǎn)的通常含義，即抗體與之特異地相互作用 (例如通過結(jié)合)的物質(zhì)(例如，蛋白)上的抗原決定簇。除非本文特別地說明，在免疫球蛋 白(例如抗體)領(lǐng)域已經(jīng)獲得了確定意義的其他術(shù)語，諸如“可變輕鏈區(qū)”、“可變重鏈區(qū)”、 “恒定輕鏈區(qū)”、“恒定重鏈區(qū)”、“抗體鉸鏈區(qū)，”、“互補(bǔ)決定區(qū)”、“框架區(qū)”、“抗體同種型”、“F。 區(qū)”、“恒定區(qū)”、“單鏈可變片段”或“scFv”、“雙功能抗體(diabody) ”、“嵌合體”、“CDR-移植 的抗體”、“人源化抗體”、“整形抗體(shaped antibody) ”、“抗體融合物”等都用其在本領(lǐng)域 已確定的含義。除非本文明確地說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的涉及抗體技術(shù)的每一術(shù)語都用其在 該領(lǐng)域已獲得的含義。這類術(shù)語的實(shí)例有分別指來自抗體輕鏈和重鏈的可變結(jié)合區(qū)的“VJ 和“VH”;以及指“免疫球蛋白恒定區(qū)”的Q和Ch，即分別來自抗體輕鏈或重鏈的恒定區(qū)，后者 被理解為還可依據(jù)恒定區(qū)來源的抗體同種型(IgA，IgD, IgE, IgG, IgM)進(jìn)一步分為Cm，Ch2， Ch3和Ch4恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。⑶R指“互補(bǔ)決定簇”?！般q鏈區(qū)”來自插入抗體單一鏈的Chi和Ch2 區(qū)之間且將其連接的氨基酸序列，該序列在本領(lǐng)域被理解為以“鉸鏈”的形式為整個(gè)抗體提 供柔性?！昂愣▉唴^(qū)”是本文定義的術(shù)語，指肽、多肽或蛋白序列，其對應(yīng)于或來自恒定亞區(qū) 多肽對應(yīng)的源/親本抗體的一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的部分或全部，而不是對應(yīng)或來自全 部恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。因此，恒定亞區(qū)可以包括任一下述結(jié)構(gòu)域的部分或全部=C02結(jié)構(gòu)域、Ch3結(jié) 構(gòu)域(IgA, IgD, IgG, IgE或IgM)和Ch4結(jié)構(gòu)域(IgE或IgM)。因此，本文所定義的恒定亞區(qū) 可以指對應(yīng)于免疫球蛋白恒定區(qū)一部分的多肽，只要它保留與抗體結(jié)合的至少一個(gè)效應(yīng)器 功能。雖然PIMS分子可以任選地具有連接到恒定亞區(qū)的N-末端鉸鏈區(qū)，但本發(fā)明中的多 肽恒定亞區(qū)或編碼核酸通常具有Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，恒定亞區(qū)被 置于分子的一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N-末端。雖然可以有一些位于恒定亞區(qū)N-末 端的序列，例如前面所述的N-末端鉸鏈，但在這些實(shí)施方案中沒有位于恒定亞區(qū)N-末端的 特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域?！靶?yīng)器功能”是與抗體的恒定區(qū)相關(guān)或由抗體的恒定區(qū)提供的一種功能。示例的 效應(yīng)器功能包括抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，補(bǔ)體激活及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒 作用(CDC)，F(xiàn)c受體結(jié)合，以及延長的血漿半衰期和胎盤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明所述組合物的效應(yīng)器 功能由恒定亞區(qū)提供，并且是可檢測的。優(yōu)選地，本發(fā)明所述組合物與該功能相關(guān)的特異活 性近似于野生型抗體與該效應(yīng)器功能相關(guān)的特異性活性。即優(yōu)選地，PIMS分子的恒定亞區(qū) 相比于野生型抗體沒有失去任何效應(yīng)器功能?！斑B接子”是與其他肽或多核苷酸結(jié)合或連接的肽或多核苷酸。通常，肽連接子是 2-50個(gè)氨基酸的寡肽；因此，編碼這種肽連接子的典型的多核苷酸連接子大約是6-150個(gè) 核苷酸長度。PIMS連接子是一種肽連接子，其將來自免疫球蛋白的恒定亞區(qū)結(jié)合到結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者，當(dāng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域超過一個(gè)時(shí)，結(jié)合到離特異性結(jié)合肽的N末端最近的結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。該P(yáng)IMS連接子的氨基酸序列來自抗體鉸鏈區(qū)，或來自連接結(jié)合結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，或來自 將結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接到細(xì)胞膜表面跨膜區(qū)或膜錨著點(diǎn)的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，該P(yáng)IMS連接 子具有至少一個(gè)在標(biāo)準(zhǔn)肽條件(例如，生理?xiàng)l件、常規(guī)的肽純化條件、常規(guī)的肽維持或保藏 條件等)下能夠參與至少一個(gè)二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，由這些半胱氨酸形成 的二硫鍵是鏈間二硫鍵。結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接子，其可以與上述的介于恒定亞區(qū)和N-末端特異 性結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的連接子相同或相異，可以自身介于包含不少于一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白 質(zhì)的所有結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間。示例的結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接子是屬于(Gly4Ser)n家族的肽，其中優(yōu) 選地，η = 1-5?！鞍袠?biāo)”被給予多于一種的含義，根據(jù)使用的上下文定義其在每一情形的明確含 義。按其最狹義的意義來說，“靶標(biāo)”是結(jié)合位點(diǎn)，即本發(fā)明中所述的肽組合物的結(jié)合伴侶的 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。按其更廣的意義來說，“靶標(biāo)”或“分子靶標(biāo)”指整個(gè)的結(jié)合伴侶(例如，蛋白 質(zhì))，其必然展現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)。諸如“CD20”、“CD37”等的特異性靶標(biāo)都被給予其在本領(lǐng)域獲 得的通常含義。“靶標(biāo)細(xì)胞”是任何的原核或真核細(xì)胞，不管是健康的還是患病的，其與本發(fā) 明中所述的靶標(biāo)分子有關(guān)。當(dāng)然，靶標(biāo)分子也被發(fā)現(xiàn)與任何細(xì)胞都無關(guān)聯(lián)(例如，無細(xì)胞靶 標(biāo))，或者與諸如病毒(包括噬菌體)、有機(jī)或無機(jī)的靶標(biāo)分子載體，以及外源對象的其他組 合物有關(guān)。靶標(biāo)分子可以與其結(jié)合的物質(zhì)的實(shí)例包括自體細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞或其他患病細(xì) 胞)、傳染媒介(例如，傳染性細(xì)胞和傳染性病毒)等。靶標(biāo)分子可以與被用于遞送、運(yùn)輸 或定位靶標(biāo)分子的無核細(xì)胞、細(xì)胞膜、脂質(zhì)體、海綿體、凝膠、膠囊、片劑等結(jié)合，與目的用途 無關(guān)(例如，對于醫(yī)學(xué)治療，作為良性或無意的提供，或者進(jìn)一步生物恐怖的威脅)。“無細(xì) 胞”、“無病毒”、“無載體”、“無對象”等指靶標(biāo)分子沒有與指定的組合物或物質(zhì)結(jié)合?！敖Y(jié)合親和力”指本發(fā)明的肽組合物和它們的結(jié)合伴侶的非共價(jià)結(jié)合的強(qiáng)度。優(yōu)選 地，結(jié)合親和力指結(jié)合對成員之間的吸引力的定量測量?！白魟笔且环N提高或輔助與其結(jié)合的化合物的功能效應(yīng)的物質(zhì)，例如在包含活性 劑和佐劑藥物組合物的形式中。“賦形劑”是惰性物質(zhì)，制備藥物組合物時(shí)被用作稀釋劑。 “載體”是典型的惰性物質(zhì)，被用于提供遞送藥物組合物的運(yùn)送工具?！八拗骷?xì)胞”指任何細(xì)胞，原核的或真核的，在其中存在本發(fā)明所述的多核苷酸、蛋 白質(zhì)或肽。把核酸或多核苷酸“導(dǎo)入”宿主細(xì)胞意味著通過為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何 方法使核酸或多核苷酸進(jìn)入該細(xì)胞，這些方法包括但不限于體外鹽介導(dǎo)的沉淀和其他形式 的裸核酸/多核苷酸或病媒核酸/多核苷酸的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，病毒介導(dǎo)的感染及任選的轉(zhuǎn)導(dǎo)、 通過或不通過“輔助”分子，沖擊投射(ballistic projectile)遞送，共軛等?！胺跤彼拗骷?xì)胞的意思是在為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的環(huán)境條件下維持該細(xì)胞， 使其適于給定目的，例如基因表達(dá)。這些條件包括溫度、離子強(qiáng)度、氧張力、二氧化碳濃度、 營養(yǎng)成分等，其為本領(lǐng)域所熟知。“分離”化合物，諸如本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)或肽，意味著將該化合物與被發(fā)現(xiàn)與其 天然結(jié)合的至少一種不同的化合物分開，諸如在表達(dá)待分離的化合物的宿主細(xì)胞中，例如 通過將包含該化合物的用過的培養(yǎng)基與生長在培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞分離。
“有需要的生物體”指有患疾病、病癥或病況風(fēng)險(xiǎn)或正患疾病、病癥或病況的任何 生物體，所述疾病、病癥或病況可以用本發(fā)明的組合物治療或緩解其包括但不限于各種形 式的癌癥中的任何一種，眾多自身免疫性疾病中的任何一種，由放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)、肽及類 似的化合物引起的放射物中毒，攝入的或內(nèi)部產(chǎn)生的毒素等，結(jié)合全本公開，這會變得顯而 易見。優(yōu)選地，有需要的生物體是人類患者。 “改善”疾病的癥狀，意思是可檢測地減輕疾病的癥狀的嚴(yán)重程度，正如為本領(lǐng)域 所熟知的那樣。示例性的癥狀包括疼痛、發(fā)熱、腫脹和關(guān)節(jié)僵硬。除非上下文中有明確的說明，術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”可以互相交換使用， 用其中的每一個(gè)都可以指至少一個(gè)連續(xù)的氨基酸鏈。類似地，術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”和 “核酸分子”可以互相交換使用，除非從上下文中明確地得出用于特殊的、不可互相交換的 目的?！八帉W(xué)上可接受的鹽”指本發(fā)明中的化合物中的鹽，其來自所述化合物和有機(jī)或無 機(jī)酸(酸加成鹽)或者有機(jī)或無機(jī)堿(堿加成鹽)的組合。在一些實(shí)施方案中，用于PIMS分子重組表達(dá)的多核苷酸會編碼通過編碼多樣化 的短雙肽或三肽的序列連接到N-末端鉸鏈區(qū)(例如，IgGl鉸鏈)的前導(dǎo)肽，所述序列包括 用于所述分子的重組DNA工程的限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)諸如Agel位點(diǎn)(例如，在前 導(dǎo)-編碼序列的末端)和XhoI位點(diǎn)(例如，在編碼諸如IgGl鉸鏈的鉸鏈的序列的起始處) 的序列，隨后是通過諸如H7SC0rpi0n連接子(例如，具有由SEQ ID N0:163編碼的SEQ ID NO 164的氨基酸序列)的(鉸鏈-like)PIMS連接子融合到scFv的鉸鏈(例如，SCC-P)、 Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域(例如，IgGl結(jié)構(gòu)域)。這樣，雖然PIMS分子通常包含兩個(gè)鉸鏈-樣的二硫 鍵區(qū)，一個(gè)N-末端和位于效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的末端和特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的另一個(gè)，但PIMS 分子在天然結(jié)構(gòu)水平上可以被視為類似“反向的(backwards) ” SMIP。PIMS結(jié)合結(jié)構(gòu)域PIMS蛋白或多肽具有不同于其他特異性結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)，所述其他特異性結(jié) 合分子例如多克隆或單克隆抗體，諸如Fab、F(ab' )2或8沖￥的其片段，SMIPs，雙抗 (diabodies), scorpion等。PIMS蛋白或多肽包含多肽N-末端的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域(CH2_CH3， 任選地鉸鏈-Ch2-Ch3)和C-末端的靶標(biāo)特異性(例如，抗原_特異性)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由(鉸鏈-樣)PIMS連接子間隔開。如果PIMS連接子來自Ig鉸鏈，它優(yōu)選地 與該P(yáng)IMS分子的Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)來自相同的抗體種類、同種型或同種亞型 (sub-isotype)。該靶標(biāo)-特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是單一結(jié)構(gòu)域，例如來自駱駝科動物抗體 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者更通常地，多個(gè)區(qū)域可以聯(lián)合形成至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例 如樣結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Vh-樣結(jié)合結(jié)構(gòu)域的鏈間或鏈內(nèi)聯(lián)合。PIMS結(jié)構(gòu)允許效應(yīng)器功能和 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能特性的最佳化。這些分子自身具有活性，同時(shí)還提供了評估多重特異性 結(jié)合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的平臺，例如Scorpion C-末端結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，Scorpion結(jié)合結(jié) 構(gòu)域2(BD2))，以及提供了用于評估效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域-BD2SC0rpi0n連接子的平臺。特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以來自特異性結(jié)合對的蛋白質(zhì)或多肽成員的一個(gè)或多個(gè)區(qū)。 通常地，結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自相同或不同的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)諸如抗體分子的至少一個(gè)區(qū)域。特 異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以呈現(xiàn)與免疫球蛋白的區(qū)域的序列相同的序列，或者可以是該類序列的 修飾物以提供例如改變的結(jié)合特性或改變的穩(wěn)定性。這樣的修飾為本領(lǐng)域所熟知，包括氨基酸序列的改變，其直接促成諸如改變的結(jié)合的改變的特性，例如通過產(chǎn)生改變的二級或 更高級的肽結(jié)構(gòu)。還包括由摻入諸如非天然的常用氨基酸、非常用氨基酸和亞氨基酸的非 天然氨基酸產(chǎn)生的修飾的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，改變的序列產(chǎn)生了改變的翻譯 后加工，例如導(dǎo)致了改變的糖基化模式。對于其中結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自免疫球蛋白的多于一個(gè)區(qū)域(例如，Ig \區(qū)和Ig %區(qū)) 的實(shí)施方案，多個(gè)區(qū)域可以通過連接子肽連接，這將在下文描述。表1中提供了適用于本發(fā) 明中的組合物的示例性但非限定的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。表 1
結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含結(jié)構(gòu)域的示例性分子序列標(biāo)識符(示
例性編碼核酸)
抗-CD20 可變區(qū)2H7 (H3N-VL-VH-CO2H 取向)120(119)
抗-CD20 (2Lm20-4)2Lm20_4 (H3N-VH-VL-CO2H 取向)
HL 12122(121)
抗-CD20 (2Lm20-4)2Lm20_4 (H3N-VH-VL-CO2H 取向)
HL 17124(123)
抗-CD28 可變區(qū)2E12 (H3N-VL-VH-CO2H 取向)126(125)
抗-CD28 可變區(qū)2E12 (H3N-VH-VL-CO2H 取向)128(127)
抗-CD37 可變結(jié)構(gòu)域G28-1 (H3N-VL-VH-CO2H 取向)130(129)
抗-CD37 可變結(jié)構(gòu)域G28-1 (H3N-VH-VL-CO2H 取向)132(131)
抗-CD3 可變結(jié)構(gòu)域G19-4(H3N-VL-VH-CO2H 取向)134(133)
抗-CD3 可變結(jié)構(gòu)域G19-4 (H3N-VH-VL-CO2H 取向)136(135)PIMS恒定亞區(qū)恒定亞區(qū)，接近或位于多肽的N-末端，來自免疫球蛋白的恒定區(qū)。恒定亞區(qū)通常 來自免疫球蛋白的恒定重鏈區(qū)的部分而非全部。通常地，倘若恒定亞區(qū)保留至少一種與抗 體相關(guān)的效應(yīng)器功能，該恒定亞區(qū)包含免疫球蛋白Ch區(qū)的鉸鏈-Ch2部分，盡管它可以來自 鉸鏈-CH2-Ch3部分或者它可以來自Ch區(qū)的鉸鏈-局部Ch2部分。另外，恒定亞區(qū)的部分可 以來自不同的免疫球蛋白的Ch區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鉸鏈和Ch2區(qū)，如果相關(guān)的話也包 括Ch3區(qū)，來自相同的抗體同種型。連接到恒定亞區(qū)或N-末端鉸鏈的N-末端前導(dǎo)序列的分 子也是預(yù)期的。該恒定亞區(qū)提供了與免疫球蛋白Ch區(qū)相關(guān)的至少一種活性，例如下述的一種或多種效應(yīng)器功能抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用 (CDC)、蛋白質(zhì)A結(jié)合、結(jié)合到至少一個(gè)Fc受體、與本發(fā)明所述的除了恒定亞區(qū)缺失的蛋白 質(zhì)有關(guān)的可重復(fù)檢測的穩(wěn)定性，且如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的，或許胎盤轉(zhuǎn)移(其本發(fā)明 的分子代間轉(zhuǎn)移(generational transfer))是有利的。適合用于本發(fā)明的組合物中的恒 定亞區(qū)包括但不限于在表2中示出的結(jié)構(gòu)。恒定亞區(qū)來自至少一個(gè)免疫球蛋白分子，并呈 現(xiàn)出與至少一個(gè)免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域相同或基本相同的氨基酸序列。在一些實(shí)施 方案中，從至少一個(gè)免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)序列中修飾恒定亞區(qū)(通過一個(gè)或多個(gè)非天 然常用的或非常用的，例如，合成的氨基酸或亞氨基酸的取代)，得到一級結(jié)構(gòu)，其可以產(chǎn)生 改變的二級或更高級結(jié)構(gòu)并具有與其相關(guān)的改變的性質(zhì)，或者可以引起翻譯后加工過程的 改變，例如糖基化。表2中例舉了示例性修飾的恒定亞區(qū)，其包括hIgGl(P238S)_CH2CH3(由例如SEQ ID NO 141 編碼的 SEQ ID NO 142)、hIgGl (P331S) -CH2CH3 (由例如 SEQ ID NO 143 編碼的 SEQ ID NO 144)及 hIgGl(P238S/P331S)-Ch2Ch3 (由例如 SEQ ID N0:145 編碼的 SEQ IDNO 146)。應(yīng)當(dāng)注意的是，“P238S”指在使用Kabat編碼系統(tǒng)的第238位上用Ser殘基取代Pro 殘基。該238位(Kabat)在SEQ ID NOS 142和146的第8位，編碼第8位(Kabat 238)殘 基的密碼子存在于示例性編碼核酸(SEQ ID N0S:141和145)的相應(yīng)位置。類似地，P331S 取代是在第331位(Kabat)上，該331位在SEQ ID NO 144和146的第101位，關(guān)聯(lián)密碼子 位于示例性編碼核酸(SEQ ID NOS :143和145)的相應(yīng)位置。對于那些呈現(xiàn)出與一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白多肽相同或基本相同的氨基酸序列的 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和恒定亞區(qū)，本發(fā)明中所述分子的翻譯后修飾可以產(chǎn)生相對于作為修飾基礎(chǔ) 的免疫球蛋白的修飾的分子。例如，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，以相對于未被修飾的(例如， CH0)宿主細(xì)胞中的多肽產(chǎn)生了改變的肽糖基化模式的方式可以修飾宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì) 胞。表 權(quán)利要求
特異性結(jié)合蛋白，其包含來自抗體的恒定亞區(qū)；置于所述恒定亞區(qū)C 末端的PIMS連接子；以及包含VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域置于所述PIMS連接子的C 末端，其中所述特異性結(jié)合蛋白特異結(jié)合至少一種靶標(biāo)并顯示出抗體分子的至少一種效應(yīng)器功能。
2.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述恒定亞區(qū)包含C02結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu) 域，其中所述Ch2結(jié)構(gòu)域和所述Ch3結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)是完整的抗體結(jié)構(gòu)域。
3.如權(quán)利要求2所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域選自IgG、IgE、IgD、IgA 和IgM抗體結(jié)構(gòu)域。
4.如權(quán)利要求2所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述Ch2結(jié)構(gòu)域和所述Ch3結(jié)構(gòu)域的至少 一個(gè)包含選自SEQ ID NO 377和SEQ IDNO 379的序列。
5.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述效應(yīng)器功能是抗體依賴的細(xì)胞的細(xì) 胞毒作用或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。
6.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述PIMS連接子來自II型C-凝集素的 莖區(qū)。
7.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述PIMS連接子選自抗體鉸鏈區(qū)、CD72 莖區(qū)、NKG2a 和 NKG2a C18S。
8.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述PIMS連接子是選自IgG、IgA、IgD、 IgE鉸鏈和其變異體的抗體鉸鏈區(qū)。
9.如權(quán)利要求8所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述鉸鏈?zhǔn)沁x自人IgGl、人gG2、人 IgG3、人IgG4和其人變異體的抗體鉸鏈區(qū)。
10.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述PIMS連接子具有用于形成鏈間二 硫鍵的單一半胱氨酸殘基。
11.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述PIMS連接子具有用于形成鏈間二 硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基。
12.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述PIMS連接子包含選自SEQID NOS 61-118的序列。
13.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述蛋白特異結(jié)合選自CD3、CD19、 CD20、CD28、CD37 和 DR 的靶標(biāo)。
14.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述蛋白選自W0001、W0002、W0003、 W0004、W0005、W0006、W0007、W0008、W0009、WOOl 1、W0012、W0023、W0024、W0025、W0028、 W0029、W0030、W003U W0035、W0036、W004U W0042、W0044、W0045、W0050、W005U W0052、 W0053、W0055、W0056、W0057、W0083、W0087、W0094、W0095、W0096 和 W0097。
15.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述\結(jié)構(gòu)域和所述Vh結(jié)構(gòu)域由結(jié)構(gòu) 域間連接子分開。
16.如權(quán)利要求15所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)域間連接子的結(jié)構(gòu)是 (Gly4Ser)n，其中 η = 1-5。
17.如權(quán)利要求15所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)域間連接子包含選自下述的序歹丨J =SEQ ID NO :544、SEQ ID NO :545、SEQ IDNO :184、SEQ ID NO :240、SEQ ID NO :242、 SEQ ID NO :243、SEQ IDNO :245、SEQ ID NO :247、SEQ ID NO :248、SEQ ID NO 539 和 SEQ IDNO :540 ο
18.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述\結(jié)構(gòu)域和所述Vh結(jié)構(gòu)域的至少 一個(gè)包含選自下述的序列:SEQ ID NO 2的殘基23-128、SEQ ID NO 2的殘基145-265,SEQ ID NO 2 的殘基 520-640、SEQ ID NO :2 的殘基661_772、SEQ ID NO 28 的殘基 508-629、SEQ IDNO 28 的殘基 647-754、SEQ ID NO 30 的殘基 508-629、SEQ ID NO 30 的殘基 652-759、 SEQ ID NO :44 的殘基 21-127、SEQ ID NO :44 的殘基 143_264、SEQ ID NO :354 的殘基 1-121 和 SEQ ID NO 354 的殘基 134-239。
19.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，還包含置于所述亞區(qū)N-末端的鉸鏈。
20.如權(quán)利要求19所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述鉸鏈包含與置于所述恒定亞區(qū)和 所述特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的所述PIMS連接子相同的序列。
21.如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白，還包含置于所述恒定亞區(qū)C-末端的至少另 一個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
22.如權(quán)利要求21所述的特異性結(jié)合蛋白，其中所述特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的每個(gè)都結(jié)合 相同的靶標(biāo)。
23.制備權(quán)利要求1所述特異性結(jié)合蛋白的方法，其包括將包含編碼權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白的多核苷酸的細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸；以及在適于所述多核苷酸表達(dá)的條件下孵育所述培養(yǎng)基中的所述細(xì)胞。
24.治療選自癌癥、炎癥和自身免疫病癥的病況的方法，包括將有效量的權(quán)利要求1所 述的特異性結(jié)合蛋白給予有需要的生物體。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物體是人。
26.改善選自癌癥、炎癥和自身免疫病癥的病況的癥狀的方法，包括將有效量的權(quán)利要 求1所述的特異性結(jié)合蛋白給予有需要的生物體。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述生物體是人。
28.權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白在制備治療選自癌癥、炎癥和自身免疫病癥的 病況的藥物中的用途。
29.如權(quán)利要求28所述的用途，其中所述生物體是人。
30.權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合蛋白在制備改善病況的癥狀的藥物中的用途，所述 病況選自癌癥、炎癥和自身免疫病癥。
31.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述生物體是人。
全文摘要
提供了具有如下通用格式化結(jié)構(gòu)的特異性結(jié)合肽連接到包含CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白來源的恒定亞區(qū)的任選的N-末端鉸鏈區(qū)，隨后是PIMS連接子肽和至少一個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及提供了編碼核酸、載體和宿主細(xì)胞。還提供了制備所述肽的方法，以及利用所述肽治療或預(yù)防多種疾病、病癥或病況和改善與所述疾病、病癥或病況相關(guān)的至少一種癥狀的方法。
文檔編號A61K39/395GK101990439SQ200880105251
公開日2011年3月23日 申請日期2008年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者威廉·布萊蒂, 杰弗里·A·萊德佰特 申請人:特魯比昂藥品公司