專利名稱：：葉酸修飾的環(huán)糊精化合物、其制備方法、靶向性藥物傳遞系統(tǒng)用的藥物傳遞劑、藥物組合...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種葉酸修飾的環(huán)糊精化合物，其制備方法，以及藥物傳遞劑，特別是，作為針對過度表達葉酸受體的癌細胞等目標的靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)用的藥物傳遞劑而使用的環(huán)糊精化合物(以下有些情形簡稱為“CD化合物”)，及其制備方法。具體來講，本發(fā)明涉及一種構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基的兩個或兩個以上基團被葉酸所修飾的環(huán)糊精化合物，其制備方法，以及包括所述環(huán)糊精化合物，并且具有不構(gòu)成抗原的隱蔽性、癌細胞識別性、優(yōu)良的藥物傳遞性的特性，應(yīng)用在靶向系統(tǒng)中的藥物傳遞劑，藥物組合物以及造影劑。
背景技術(shù)：
：癌細胞靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(以下簡稱“癌細胞TDDS”)由具有目標的受體(目標部位)的配體(識別標記)、載體(例如，脂質(zhì)體、環(huán)糊精)以及藥物(阿霉素、紫杉酚、姜黃素等)構(gòu)成。一直以來，作為癌細胞的所述識別標記，作為實用化研究對象進行了將葉酸導入到脂質(zhì)體、高分子微囊等的研究。非專利文獻1和2的總論中已揭示作為一種維生素的葉酸與在癌細胞表面上過度表達的葉酸受容體蛋白質(zhì)(以下簡稱“FBP”)將以lC^M—1的締合常數(shù)強有力地締合。并且，在非專利文獻2中記載有葉酸具有有效的炎癥部位識別性能的事項。該文獻中，作為目標的癌細胞種類包括子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、腦癌、精巢癌、卵巢癌、骨髓癌等。被送達的藥物除了抗癌藥之外，還可以是蛋白毒素、造影劑、反義寡核苷酸、基因等。非專利文獻3中已揭示對⑶付與多個識別標記時，如果恰當?shù)嘏渲迷谔囟ǖ募锌臻g的話，與細胞表面的配體受容體蛋白質(zhì)的多個結(jié)合位點之間同時引起多個相互作用。雖然其中每個相互作用是由氫鍵結(jié)合所引起的弱結(jié)合，但是，隨著相互作用個數(shù)的增加，累積性的(指數(shù)函數(shù)關(guān)系)相互作用構(gòu)成強有力的因素，以締合常數(shù)考慮的話，相當于與lC^M—1級別的抗原抗體反應(yīng)相同級別的位置選擇特異性引起強有力的相互作用，也就是，在此記載了所謂的糖簇效應(yīng)。根據(jù)非專利文獻4、5、6中的意大利Padova大學的Caliceti團隊的報告可知，雖然他們使用的利用葉酸的癌細胞靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(以下簡稱“癌細胞TDDS”)目前不具有有效的實用性，但是此報告中確有記載葉酸修飾的環(huán)糊精化合物。特別是，在非專利文獻4中，他們對環(huán)糊精進行甲苯磺?；?，并導入分子量為700(14聚物)的二氨基聚乙二醇化合物(以下簡稱“二氨基PEG化合物”)，并以琥珀酸酯化法使其與葉酸進行反應(yīng)，從而得到葉酸修飾的環(huán)糊精化合物(以下簡稱“CD-PEG-FA”)。利用表面等離子共振(SPR)解析法對所述CD-PEG-FA與固定化FBP的相互作用進行評價。并且，經(jīng)共焦點激光掃描顯微鏡確認，兩個小時之后滲入到人類口腔內(nèi)癌細胞(KB)。進而，作為新的制備方法，對0-CD導入5個六亞甲基二異氰酸酯，使所述二胺PEG化合物結(jié)合，獲得對其中之一導入葉酸的化合物(以下簡稱“〔0-(〔6^^6)5呼々”)。對該化合物進行了生物體內(nèi)分解性、雌二醇、姜黃素等藥物的溶解性等類似的評價。進而，在非專利文獻6中評價了裝載姜黃素的所述化合物對人類口腔內(nèi)皮癌細胞(KB)與人類肺癌細胞(MCF)的靶向性能。可是，這些文獻中的葉酸1置換修飾環(huán)糊精⑶-PEG-FA以及⑶-(C6-PEG)5_FA雖然能識別KB癌細胞，但是滲入情況并不具有定向性和明確性，傳遞抗癌藥的效果也不明確。其制備方法也不明確，上述化合物的締合常數(shù)是呈現(xiàn)較弱的lOM—1左右，其實用性較低。在構(gòu)成環(huán)糊精(CD)的吡喃葡萄糖的6位中存在第1級羥基，例如，構(gòu)成環(huán)糊精(CD)的吡喃葡萄糖為6個時，CD中存在著6個第1級羥基。在非專利文獻7中，本發(fā)明的發(fā)明人將CD中復數(shù)個存在著的所述第1級羥基分別置換為結(jié)合有糖鏈的糖鏈臂，由此制備CD化合物，這種CD化合物與醫(yī)藥或凝集素之間具有非常優(yōu)異的締合性能，也就是，具有所謂的雙重識別能力。非專利文獻1:S.Wang,PhilipS.Low,J.Control.Release,53，39-48(1998)非專禾丨J文獻2:PhilipS.Low,WalterA.Henne,DerekD.Doorneweerd,AccountsChem.Research,41,120-129(2008).非專利文獻3:Y.C.LeeandR.T.Acc.Chem.Res,1995,2非專利文獻4:P.Caliceti,S.Salmaso,A.Semenzato,T.Carofiglio,R.Fornasier,M.Fermeglia,M.Ferrone,S.Pricl,BioconjuateChem.,14,899-908(2003).非專利文獻5:S.Salmaso,A.Semenzato,P.Caliceti,J.Hoebeke,F.Sonvico,C.Dubernet,P.Couvreur,BioconjugateChem.,15,997-1004(2004).:S.Salmaso,S.Sara,A.Semenzato,P.Caliceti,J.DrugTargeting,15(6)，379-390(2007).##iK7:K.Hattori,A.Kenmoku,T.Mizuguchi,D.Ikeda,M.Mizuno,T.Inazu,J.InclusionPhenom.MacrocyclicChem.,56,9-16(2006).
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有優(yōu)異的目標締合性能，或者，具有優(yōu)異的藥物包接能力的環(huán)糊精化合物，其制備方法，包括所述環(huán)糊精化合物的靶向性藥物傳遞劑，藥物組合物以及靶向性造影劑。特別是，本發(fā)明的目的在于提供一種與2個或2個以上葉酸和葉酸結(jié)合位點之間具有2個或2個以上的同時性相互作用的、對癌細胞的締合性能優(yōu)異的、具有優(yōu)異的藥物包接性能的環(huán)糊精化合物，其制備方法，包括所述環(huán)糊精化合物的靶向性藥物傳遞劑，藥物組合物以及靶向性造影劑。根據(jù)本發(fā)明所述，提供了下述方案(1)構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基的兩個或兩個以上羥基分別被具有葉酸的取代基所置換而成的環(huán)糊精化合物，(2)以下述通式1所表示的、被2個或2個以上葉酸修飾而成的(1)中所記載的環(huán)糊精化合物，[化學式1]通式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>取代基是所述環(huán)糊精化合物中的至少兩個。所述環(huán)糊精化合物中的被置換的所述羥基之外的羥基，可以被具有糖基的取代基或者親水性基團所置換。)[化學式2]通式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(在通式2中，※表示與構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位碳原子之間的結(jié)合位置。并且，n表示03的整數(shù)，n為0時，羰基碳原子與氨基氮原子的結(jié)合部分表現(xiàn)為單結(jié)合。)(3)被下述任一式所表示的(2)中所記載的環(huán)糊精化合物，[化學式3]<image>imageseeoriginaldocumentpage7</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>[化學式4](4)葉酸修飾的環(huán)糊精化合物的制備方法，縮合在構(gòu)成環(huán)糊精的各個吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基上具有氨基或者氨基_寡聚乙酰胺基的環(huán)糊精與葉酸，(5)包括上述⑴(3)的任一項所記載的環(huán)糊精化合物的靶向性藥物傳遞劑，(6)包括上述(1)(3)的任一項所記載的環(huán)糊精化合物與藥物，所述藥物被所述環(huán)糊精化合物包接的靶向性藥物組合物，以及(7)包括上述(1)(3)的任一項所記載的環(huán)糊精化合物與藥物，所述藥物被所述環(huán)糊精化合物包接的靶向性藥物組合物。接著，結(jié)合附圖進一步詳細說明本發(fā)明的上述以及其他特征的優(yōu)點。8圖1圖1表示分別對所述例示化合物1等(作為比較例的比較化合物1、2，以及未修飾的0-⑶)的FBP識別締合的sra測定結(jié)果。圖2圖2表示例示化合物1對于人類結(jié)腸癌細胞Caco-2以及小鼠肝臟正常細胞的締合性的sra測定結(jié)果。圖3圖3a是表示例示化合物1對于Caco-2腫瘤細胞的結(jié)合動力學行為的直線圖。圖3b是表示例示化合物1對于抗癌藥DXR的結(jié)合動力學行為的直線圖。具體實施例方式首先，對本發(fā)明的環(huán)糊精化合物進行說明。本發(fā)明的環(huán)糊精化合物是通過構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基的兩個或兩個以上羥基分別被具有葉酸的取代基置換而成。作為本發(fā)明的環(huán)糊精化合物，優(yōu)選的，由下述通式1所表示。[化學式5]通式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>在通式1中，m表示68的整數(shù)，m個的R1表示各自相互獨立地具有下述通式2所表示的葉酸的取代基、羥基、具備糖基的取代基或者親水性基團，并且，具有葉酸的所述取代基是所述環(huán)糊精化合物中的至少兩個。m為6時，構(gòu)成a-環(huán)糊精，m為7時，構(gòu)成3-環(huán)糊精，m為8時，構(gòu)成、-環(huán)糊精。m越大，環(huán)糊精的空洞直徑就越大。在所述環(huán)糊精中，不能封入巨大分子、蛋白質(zhì)，作為空洞的藥物包接，優(yōu)選的是疏水性的難溶性客體醫(yī)藥，另一方面，環(huán)糊精化合物比較小(15nm)，其小于脂質(zhì)體或高分子膠束(lOOnm)，從細胞表面的滲透、組織內(nèi)或者腦屏障中的移動較為容易。如后所述，m是考慮需包接的藥物的分子尺寸而定的，在此優(yōu)選的，m為7。所述環(huán)糊精化合物中，具有葉酸的所述取代基個數(shù)為2個或2個以上，優(yōu)選為m-1個以上，特別是優(yōu)選為m個。所述環(huán)糊精化合物中的被置換的所述羥基之外的羥基，可以被具有糖基的取代基或者親水性基團所置換。作為所述親水性取代基，從本發(fā)明的環(huán)糊精化合物中付與親水性的觀點考慮，可以使用與羥基乙酸進行酯化反應(yīng)而得的羥甲基羰基(-0C0CH20H)，與葡糖酸進行酯化反應(yīng)而得的葡糖酸酯基等。[化學式6]通式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>在通式2中，※表示與構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位碳原子之間的結(jié)合位置。并且，n表示03的整數(shù)，n為0時，羰基碳原子與氨基氮原子的結(jié)合部分表現(xiàn)為單結(jié)合。如后所述，優(yōu)選的，n表示1或者2，更優(yōu)選的，n表示2。在通式2中，下列式所表示的是如后所述的來自作為間隔臂的氨基己酸的重復單元。[化學式7]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>因此，在本發(fā)明的說明書中，有些情形將所述式所表示的部分僅僅標記為“cap”。從而，所述通式2可以表示為如下。[化學式8]通式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>所述通式2中的※以及n的含義跟前述說明相同。在本發(fā)明的說明書中，n為2時簡稱為cap2，n為1時簡稱為capl。另外，n為0時cap表示將式中的羰基碳原子與氨基氮原子相結(jié)合的單結(jié)合。這些作為間隔臂的、來自氨基己酸的重復單元，優(yōu)選考慮下述觀點1)和2)。1)為獲得所謂的“納米簇效應(yīng)”，即多個葉酸和多個葉酸受體(例如，癌細胞表層)之間的同時締合，可提供適當?shù)拈L度。2)環(huán)戊烷部分具有疏水性，可以通過海葵效應(yīng)增強藥物的包接作用。另外，對于葉酸受體的高級結(jié)構(gòu)，從以葉酸為抑制劑的酶甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)解析中，其四聚體的副單元之間具有2個葉酸結(jié)合位點(參照以下報告Z.Luka,S.Pakhomova,L.V.Loukachevitch,Μ.Egli,Μ.Ε.Newcomer,C.Wagner,J.Biol.Chem.,282,4069-4075(2007).)。從而，從生物學上的相同性因素可預測到，在癌細胞中的葉酸受體具有與糖簇效應(yīng)相同的結(jié)構(gòu)，可以想到多個葉酸在結(jié)合位點之間發(fā)揮多個同時性的相互作用。這種效果即是糖鏈的空間配置和受體的拓撲效果，也就是，類似于糖簇效應(yīng)，可以簡稱為“納米簇效應(yīng)”。并且，在多個臂被修飾的環(huán)糊精中，通過?？?yīng)(請參照K.Hatt0ri，A.Kenmoku,Τ.Mizuguchi,D.Ikeda,Μ.Mizuno,Τ.Inazu,J.InclusionPhenom.MacrocyclicChem.，56，9-16(2006).)的藥物包接能力非常強烈，充分超過了作為目標值的lOl1，可以高效率地傳遞藥物。并且，在本發(fā)明所述的通式1所表示的環(huán)糊精化合物中，R1可以為具有下述通式3所表示的葉酸的取代基。如前所述，具有葉酸的所述取代基在所述環(huán)糊精化合物中至少有2個。[化學式9]通式3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>在通式3中，Y表示氧原子或者硫原子。※以及η的意義跟前述說明相同。取代作為間隔臂的重復單元的氨基己酸，當Y為氧原子時，可以采用6-羥基己酸來制備，Y為硫原子時，可以使用巰基己酸來制備。在本發(fā)明的說明書中，可以使用下述通式a表示所述通式1所表示的本發(fā)明的環(huán)糊精化合物。[化學式10]通式a<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>在通式a中，R1和m的意義跟前述說明相同，m個R1表示各自獨立的所述通式2所示的具有葉酸的取代基、羥基、具有糖基的取代基或者親水性基團，并且，具有葉酸的所述取代基是所述環(huán)糊精化合物中的至少兩個。優(yōu)選的，本發(fā)明的環(huán)糊精(CD)化合物是下述通式b所示的化合物。[化學式11]通式b<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>在所述通式b中，m、n的意義跟前述說明相同。ρ為2個或2個以上且m以下的數(shù)值，m-p個X表示各自獨立的具有羥基、糖基的取代基或者親水性基團。所述具有糖基的取代基付與給本發(fā)明的環(huán)糊精(CD)化合物親水性。并且，作為所述取代基中的糖基優(yōu)選為被特定目標疾病(肝癌、大腸癌、炎癥等)的目標蛋白質(zhì)特異性的識別基團，考慮到容易獲得以及容易合成，優(yōu)選為低聚糖(14個單糖)乃至糖鏈，更優(yōu)選為單糖，也就是，與靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)的目標疾病(肝癌、大腸癌、炎癥等)相適應(yīng)的半乳糖基、墨角藻糖基、葡糖基以及甘露糖基等。作為所述具有糖基的取代基，可以為1-糖基-丙氧基巰基氨基，具有作為間隔臂的所述cap的、1-糖基-丙氧基巰基胺己酰氨基(以下有些情形簡稱為“1-糖基-丙氧基巰基胺-capl基”)，1-糖基-丙氧基巰基胺己酰胺己酰胺基(以下有些情形簡稱為“1-糖基-丙氧基巰基胺_cap2基”)等。所述取代基中的葡糖基，優(yōu)選為α-D-半乳糖基、α-L-墨角藻糖基、α-D-甘露糖基或者α_D_葡糖基。作為本發(fā)明的環(huán)糊精化合物的具體例，可以表示為下述例示化合物110，但是本發(fā)明并不局限于這些例示化合物。[化學式12]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>例示化合物ι[化學式13]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>P=3例示化合物2p=l例示化合物5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>ρ=2例示化合物3p=l例示化合物6[化學式14]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>[化學式15]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>接著說明作為本發(fā)明原料而使用的環(huán)糊精(CD)。在本發(fā)明中，作為原料而使用的CD，只要具有環(huán)糊精的基本骨架，則對其無特別限定，可以使用α-⑶、β-⑶以及Y-⑶。在此，這些⑶構(gòu)成具有不同的吡喃葡萄糖數(shù)量(α6個；β:7個；γ:8個)的環(huán)，隨著數(shù)值的不同，其洞的直徑也不同。例如，α-CD具有苯環(huán)可以充分進入的大小，其可包接三氯乙烯，四氯乙烯等。并且，⑶具有萘環(huán)可以充分進入的大小，Y-CD具有兩個蒽環(huán)或者兩個萘環(huán)可以充分進入的大小。從而，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以考慮待包接藥物的分子大小而選擇具有最恰當洞直徑的CD。接著說明本發(fā)明環(huán)糊精(⑶)化合物的制備方法。本發(fā)明的CD化合物的制備方法的特征為縮合在構(gòu)成環(huán)糊精的各個吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基上具有氨基或者氨基_寡聚乙酰胺基的環(huán)糊精與葉酸。優(yōu)選的，本發(fā)明的CD化合物的制備方法的特征為，針對葉酸和，具有官能團的CD或者構(gòu)成CD環(huán)的各個吡喃葡萄糖的6位的全部第一級羥基上具有間隔臂(使CD環(huán)與葉酸的間具有適當距離的結(jié)構(gòu)體)的CD，在凝聚劑存在或者不存在的環(huán)境下使其進行反應(yīng)。接著說明使用所述制備方法制備的具有所述官能團的環(huán)糊精(CD)。本發(fā)明的具有官能團的CD，優(yōu)選為，構(gòu)成CD環(huán)的各個吡喃葡萄糖的6位的全部第一級羥基被置換成官能團。對CD導入所述官能團時，可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員認為可行的任何方法。對于在每個吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基上具有官能團的CD，作為構(gòu)成CD環(huán)的官能團，可以例舉如下氨基、醚基、硫醚基、羧基、疊氮基、P-甲苯磺?；?、環(huán)氧化基、不飽和基、巰基，乙酸基、苯氧基，以及諸如碘、溴及氯等的鹵素基團等，在此，氨基具有與葉酸的明確反應(yīng)性，因此優(yōu)選使用氨基。具體來講，構(gòu)成環(huán)糊精(CD)的各個吡喃葡萄糖的6位的全部第一級羥基置換為氨基的，七-6-氨基_β_環(huán)糊精(下述式1)(以下某些情形簡稱為“全氨基化CD”)，使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員認為可行的任何方法，將各個吡喃葡萄糖的6位的全部第一級羥基氯化(稱為“全氯化”)，全疊氮化之后再通過全氨基化而得到。接著說明構(gòu)成所述環(huán)糊精(CD)的各個吡喃葡萄糖的6位的全部第一級羥基具有間隔臂的⑶。所述具有間隔臂的CD可以通過以下方式構(gòu)筑對于在構(gòu)成CD環(huán)的各個吡喃葡萄糖的6位的全部第一級羥基上具有官能團的CD，利用作為間隔臂的1或者2個或2個以上的(優(yōu)選為1或者2)氨基己酸進行縮合反應(yīng)。所述縮合反應(yīng)可以表示成如下圖示。[化學式ie]Zs\(NH2)/丫，\0ΓΓ\\DMT-MM1NMM脫保護03--_一\Me0H/H20/式1\h/HLτ^^λη=1式2/^rss=Aη=2式.3具體來講，優(yōu)選的，在甲醇/水的混合溶液等的反應(yīng)溶劑中，對于七-6-氨基-β-環(huán)糊精(所述式1)，在室溫(20°C)下，對于氨基，受叔丁氧羰基(Boc)基保護的氨基己酸840當量進行2150小時(最好是在反應(yīng)迅速結(jié)束時間點起224小時)的縮合反應(yīng)之后，進行任意的脫保護(脫Boc化)反應(yīng)。凝聚劑的選擇以及反應(yīng)溶劑的選擇均可以采用業(yè)界人士所認為的恰當方式，但是，作為凝聚劑優(yōu)選為如后所述的4-(4，6_二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-yl)-4-甲基嗎啉氯化物，作為反應(yīng)溶劑優(yōu)選為存在三乙胺(TEA)或者N-甲基嗎啉(NMM)等堿性化合物的甲醇/水的混合溶液。通過重復執(zhí)行N次所述縮合反應(yīng)與脫保護反應(yīng)，可以構(gòu)建對于在構(gòu)成環(huán)糊精(CD)的各個吡喃葡萄糖的6位的全部第一級羥基上，具有η個作為間隔臂的氨基己酸的⑶。如后所述，η優(yōu)選為1或者2。η=1時，上述式2所表示的β-CD可以為“七_6_氨基-capl-β_CD”，n=2時，上述式3所表示的β_⑶可以是“七-6-氨基-cap2-i3-⑶”?？梢允?個或2個以上葉酸與葉酸結(jié)合位點之間發(fā)揮2個或2個以上的同時性相互作用而調(diào)節(jié)所述間隔臂長度，由此可以調(diào)節(jié)本發(fā)明的環(huán)糊精化合物中的葉酸的空間配置。在此，從2個或2個以上的葉酸與葉酸結(jié)合位點充分發(fā)揮2個或2個以上的同時性相互作用的長度以及結(jié)構(gòu)的觀點考慮，作為所述間隔臂優(yōu)選的是，η為1或者2。所述間隔臂的末端具有用于縮合反應(yīng)的官能團。在本發(fā)明的制備方法中，將所述全氨基化⑶(式1)，所述七-6-氨基-capl-β-⑶(式2)或者所述七-6-氨基-cap2-β_⑶(式3)，所述葉酸一同通過縮合反應(yīng)使其結(jié)合，從而可以制備目標CD化合物。以所述七-6-氨基-cap2-i3-⑶(式3)為例，所述縮合反應(yīng)可表示成如下圖示。[化學式17]“Η00_再結(jié)晶，GPC等NlV^^^b^^iH&_^H2W)=N°-W、^^^例示化合物1具體來講，對于所述全氨基化環(huán)糊精(⑶)(式1)，所述七-6-氨基-capl-β-CD(式2)或者所述七-6-氨基-cap2-β-CD(式3)，將10100當量的葉酸溶解于反應(yīng)溶劑中，并且，在三乙胺(TEA)或者N-甲基嗎啉(NMM)等堿性化合物的在存下，在室溫(30°C)中，與4-(4，6_二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-yl)-4-甲基嗎啉氯化物(DMT-MM)等凝聚劑進行2150小時的反應(yīng)，在此優(yōu)選為進行1260小時的反應(yīng)。作為反應(yīng)溶劑，對應(yīng)于化合物的溶解性，可以使用二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、水、甲醇、異丙醇、t-丁醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等。關(guān)于凝聚劑以及反應(yīng)溶劑的選擇，可以由本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員適當選取。所述縮合反應(yīng)中所使用的凝聚劑可以使用4-(4，6_二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-yl)-4-甲基嗎啉氯化物(以下簡稱‘‘DMT-MM”)，二環(huán)己基碳二亞胺(以下簡稱“DCC”)，水溶性碳化二亞胺(以下簡稱“WSC”)等本
技術(shù)領(lǐng)域：
的任何凝聚劑。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員根據(jù)所選擇的官能團或者反應(yīng)溶劑的種類，可以選擇恰當?shù)哪蹌?。例如，在所述縮合反應(yīng)中，環(huán)糊精上的官能團為氨基時，也就是，與葉酸的羧基進行反應(yīng)時，作為凝聚劑使用所述DMT-MM為佳。DMT-MM與碳氫酸反應(yīng)生成酯，然后與胺反應(yīng)形成酰胺鍵。該反應(yīng)在乙醇、甲醇、異丙醇、水等各種溶劑中進行，且值得注意的是，有報告稱進行了定量性反應(yīng)(例如M.Kunishima,C.Kawachi,J.Morita,K.Terao,F.Iwasaki,S.Tani,Tetrahedron,55,13159-13170(1999))。例如，作為脫鹽酸劑可以使用具有與葉酸相同摩爾當量的N-甲基嗎啉(NMM)或者三乙胺，作為凝聚劑可以使用具有相同或者5倍摩爾當量的DMT-MM。利用丙酮再沉淀處理方式對生成物進行未反應(yīng)物去除處理之后，通過凝膠過濾色譜法(GPC)對生成物進行精煉、離析為好。作為使用在GPC中的凝膠可以選用Biogel,Sephadex,TOSO-Pffgel(這些是商品名)，但是，從分離精煉能力的角度考慮，優(yōu)選使用Biogel(例如，P4、P6)。作為溶出溶液可以使用水、氨液等，但是，考慮到與未反應(yīng)葉酸等雜質(zhì)之間的分離能力，優(yōu)選使用水?？梢允褂帽?br>技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員認為合適的任意方法對制備得到的環(huán)糊精化合物結(jié)構(gòu)進行確認。接著說明本發(fā)明的靶向性藥物傳遞劑以及靶向性藥物組合物。本發(fā)明的靶向性藥物傳遞劑包括所述環(huán)糊精化合物，特別是，本發(fā)明的靶向性藥物傳遞劑包括基于由2個或2個以上葉酸引起的納米簇效應(yīng)的所述環(huán)糊精化合物，其應(yīng)用于癌細胞、炎癥等的靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)。并且，本發(fā)明的靶向性藥物組合物包括所述環(huán)糊精化合物與藥物。優(yōu)選的，本發(fā)明的靶向性藥物組合物包括與藥物同等摩爾當量的環(huán)糊精化合物為好。本發(fā)明的靶向性藥物傳遞劑以及靶向性藥物組合物可以包括所述環(huán)糊精化合物之中的一種或者兩種以上。作為環(huán)糊精化合物與藥物共存方式，可以考慮使藥物內(nèi)包(包接)在環(huán)糊精化合物中。在此，所謂靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)是指，通過對藥物的投入形態(tài)(劑形，添加劑等)進行研究，從而精密控制藥物在體內(nèi)的動態(tài)，由此使藥物選擇性并且局部性地送達到目標細胞。根據(jù)本發(fā)明所述，對于發(fā)現(xiàn)葉酸受體的目標細胞或者目標組織，可以更加選擇性地送達目標藥物。特別是，根據(jù)本發(fā)明所述，對于過度表達葉酸受體的目標細胞或者目標組織，可以進一步選擇性地送達目標藥物?？梢赃m用本發(fā)明的目標包括癌、自身免疫疾病、炎癥性疾病等疾病的疾病組織以及疾病部位?？梢赃m用本發(fā)明的癌癥包括上皮性惡性腫瘤，脊髓為主的造血器官惡性腫瘤等，特別是，卵巢癌(非粘液性卵巢癌等)、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、乳癌、乳腺癌、前列腺癌、睪丸癌(睪丸絨毛上皮癌等)、腦癌(室管膜瘤等)、咽喉癌、肺癌、肺腺癌、腎癌(腎細胞癌等)、肝癌、大腸癌(結(jié)腸癌等)、胸膜間皮瘤、肉瘤、慢性以及急性骨髓性白血病、肺轉(zhuǎn)移性腫瘤等各種轉(zhuǎn)移性癌癥?？梢赃m用本發(fā)明的自身免疫疾病以及/或者炎癥性疾病包括風濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化癥、多發(fā)性硬化癥、克羅恩氏病、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、肺纖維癥、移植物抗宿主疾病等。本發(fā)明的靶向性藥物組合物對于疾病組織以及疾病部位，可以應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)葉酸的疾病的治療上，最好是過度表達葉酸的疾病的治療上。在本說明書中，所謂“治療”是指對于有可能遭受疾病或者已遭受疾病的哺乳動物，不僅包括治愈或者改善該疾病，還包括阻止或者緩和該疾病惡化，也就是，不僅包括治療相關(guān)處置，還包括預防相關(guān)處置。并且，作為適用本發(fā)明的藥物可以根據(jù)具體疾病適當選取使用。作為所述藥物除了包括抗癌藥(包括抗癌劑、癌轉(zhuǎn)移抑制劑)之外，還會包括蛋白毒素、造影劑、反義寡核苷酸、基因等。本發(fā)明的靶向性藥物組合物可以為液體藥劑以及固體藥劑。具體來講，作為靶向性藥物組合物的液體藥劑可以為注射劑，特別是皮下、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)用注射劑。作為液體藥劑時，在靶向性藥物組合物中，除藥物以及CD化合物之外，根據(jù)需求還可以添加任意的PH調(diào)整劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑等。并且，作為靶向性藥物組合物的固體藥劑可以為藥片、散藥、顆粒劑、膠囊劑、濃縮溶劑等的口服性固體藥劑或者噴霧劑、栓劑、注射劑、夕卜用劑、點滴劑等非口服用固體藥劑。做成固體藥劑時，在靶向性藥物組合物中，除了藥物以及所述CD化合物之外，根據(jù)需求還可以添加任意的賦形劑、結(jié)合劑、溶解劑、潤滑劑、著色齊U、佐劑等，進而，根據(jù)需求還可以任意實施多種包衣，例如，糖衣、凝膠包衣以及類似的可被應(yīng)用的包衣。本發(fā)明的靶向性藥物組合物可以投入到可能遭受或者已遭受上述疾病的哺乳動物(優(yōu)選為人類)。根據(jù)投入對象的年齡、體重、疾病種類、癥狀程度、藥物種類的不同而其投入量也顯著不同，但是，通常對于成年人而言，1日內(nèi)可分一次或多次投入約ImgIOOmg的藥物。本發(fā)明的靶向性藥物傳遞劑為所述具有糖基的取代基中所述糖基為半乳糖基的環(huán)糊精(CD)化合物時，肝實質(zhì)細胞表面可以成為合適的目標，可以應(yīng)用到肝癌疾病上。并且，所述糖基為墨角藻糖基的CD化合物時，大腸表面細胞可以成為合適的目標，可以應(yīng)用到大腸癌疾病上。具有所述糖基的取代基中的所述糖基為甘露糖基或者葡糖基的CD化合物時，可以通過導入巨噬細胞的方式應(yīng)用到癌癥疾病上。接著說明具有所述糖基的取代基的構(gòu)建。具有所述糖基的取代基，以配糖物為半乳糖苷為例，按照下述反應(yīng)式進行構(gòu)建。[化學式IS]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>具有所述糖基的取代基在酸催化劑的存在下，通過丙烯醇的糖乃至糖鏈的丙氧基化，使用碳個數(shù)為27的巰基脂肪酸進行光加成反應(yīng)的方式進行構(gòu)建。作為所述巰基脂肪酸，優(yōu)選使用3-巰基己酸，4-巰基丁酸。具體來講，使用丙烯醇溶解糖乃至糖鏈，添加酸催化劑并在溫度為97°C的氮氣流回流中合成烯丙基配糖物。在所獲得的烯丙基配糖物和3-巰基己酸等巰基脂肪酸進行光加成反應(yīng)，從而構(gòu)建為糖隔臂單元。所述烯丙基配糖物與巰基脂肪酸的反應(yīng)是在氮氣、氬等惰性氣體氛圍中照射紫外線的方式進行。在此使用200nm400nm范圍內(nèi)的紫外線，優(yōu)選使用340nm380nm。照射時間為120小時，優(yōu)選為37小時。在此，可以根據(jù)反應(yīng)狀態(tài)，反應(yīng)裝置的不同，進行適當改變。作為反應(yīng)溶劑使用DMF、甲醇、水等。對其生成物，使用根據(jù)Si^phadexGlO的GPC方式進行精煉。接著說明藥物以及目標蛋白質(zhì)之間的締合評價。作為包接在⑶中的藥物，可以舉例抗癌醫(yī)藥品——阿霉素(DXR)。本發(fā)明的靶向性藥物組合物為，將以包接締合在CD空洞部分中的藥物做成標識化合物，由此可以做到靶向性造影劑。具體來講，所述被包接締合的標識化合物做成L-[3-18F]-a-甲基酪氨酸(18F-FMT),由此可以做到使用在PET(正電子發(fā)射型斷層顯像)中的靶向性造影劑。并且，所述被包接締合的標識化合物做成熒光色素化合物(例如，熒光素)，由此可以做到使用在熒光/內(nèi)視鏡中的靶向性造影劑。進而，所述被包接締合的標識化合物做成釓(Gd)化合物(例如，釓螯合芳香族化合物)，由此可以做到使用在核磁共振成像技術(shù)(MRI)中的靶向性造影劑。進而，所述包接締合的標識化合物做成鋇化合物，或者碘乃至碘化合物(例如，1，3，5_三碘苯)，由此可以做到使用在X射線電腦斷層掃描法(X射線CT)的靶向性造影劑。評價所述環(huán)糊精(⑶)化合物的雙重識別能力的方法是使用通過表面基因共鳴法獲得的、所述CD化合物對于藥物的包接締合常數(shù)以及對于所述CD化合物的目標蛋白質(zhì)的識別締合常數(shù)構(gòu)成的二維圖示進行。在此，所謂[雙重識別]是指，本發(fā)明的CD化合物，一方面其糖鏈部分與目標蛋白質(zhì)締合，另一方面其CD空洞部分與藥物包接締合的現(xiàn)象。作為目標蛋白質(zhì)可以例舉存在于癌細胞表面等的受體蛋白質(zhì)等。使用固化DXR等藥物，或者葉酸受體蛋白(FBP)等目標蛋白質(zhì)的表面等離子共振(SPR)光學生物傳感器來求得各個締合常數(shù)，并通過二維圖示掃描適合做成所述靶向性藥物傳遞劑的CD化合物。作為評價所述雙重識別能力的方法，經(jīng)過動物實驗或臨床實驗來分別求得醫(yī)藥品及其對應(yīng)細胞表面的受體蛋白之間的締合常數(shù)，將各個對數(shù)標示在橫軸、縱軸而評價雙重識別，越靠近右上則說明該靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)用的藥物傳遞劑具有更好的藥劑包接能力以及目標蛋白質(zhì)之間的締合能力。接著說明表面等離子共振(SPR)光學生物傳感器的原理。使用SI3R光學生物傳感器(例如，IAsys)的表面等離子共振(SPR)法可以測定生物體高分子的分子之間相互作用。利用SI^R法可以測定本發(fā)明的CD化合物的、對于目標蛋白質(zhì)的締合以及藥物包接締合。具體來講，將配體(例如，葉酸結(jié)合蛋白質(zhì))固定在比色杯上，溶解在緩沖溶液中的對象物質(zhì)(例如，本發(fā)明的環(huán)糊精(CD)化合物)注入到所述比色杯中。其次，測定以完全反射角以下的入射角向棱鏡發(fā)射激光時所生成的、損耗波與表面基因組波引起表面等離子共振(SPR)時的入射角。產(chǎn)生SPR的入射角根據(jù)600nm的損耗域內(nèi)的質(zhì)量而變化。可以觀測其變化量，此時的變化量簡稱為響應(yīng)(R)。該入射角與所締合的分子的質(zhì)量成比例。也就是，可以從這些質(zhì)量變化觀測到締合分離相互作用。本發(fā)明的環(huán)糊精化合物，一方面其可以通過本身具有的環(huán)糊精空洞部分與藥物進行包接締合，另一方面，發(fā)揮作為識別標記的葉酸的空間性集中配置的所述納米簇效應(yīng)，其具有優(yōu)異的對于癌細胞等目標的受體等的葉酸結(jié)合位點之間的締合性。本發(fā)明的環(huán)糊精化合物雖然根據(jù)側(cè)鏈的長度而不同，但是，大概為IOnm以下，大部分為5nm以下，也就是，比較小，其具有優(yōu)異的細胞膜透過性，具有穩(wěn)定的環(huán)糊精，另一方面，該環(huán)糊精通過配糖物結(jié)合的加水分解而具有自然分解性，其具有優(yōu)異的生物體內(nèi)的安全性。本發(fā)明的環(huán)糊精化合物，將其分子內(nèi)的羥基被半乳糖基、墨角藻糖基等具有糖基的各種取代基所取代，由此，可以進一步具有目標器官/細胞特異性(癌細胞、肝臟、大腸、巨噬細胞等)。通過本發(fā)明的環(huán)糊精化合物的制備方法，可以不通過復雜工程而簡單獲得所述具有優(yōu)異特性的環(huán)糊精化合物。本發(fā)明的靶向性藥物傳遞劑，其主要由作為糖的環(huán)糊精構(gòu)成，因此，其抗原性較低，還具有隱蔽性。在此，所謂的隱蔽性是指，不遭受來自Y-球蛋白抗體的生物體防御為目標的免疫攻擊，不發(fā)揮抗原性而在生物體內(nèi)移動。由于本發(fā)明的靶向性藥物組合物由于包括所述環(huán)糊精化合物，因此，可以使用在抗癌藥物中的癌細胞目標載體或者炎癥部位目標載體，癌組織的造影劑的目標，基因等的傳遞等領(lǐng)域。具體來講，適合于應(yīng)用在對于癌、肝癌、大腸癌等疾病的靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)，對于癌組織等的靶向性造影劑。實施例接著，對于本發(fā)明的實施例進行進一步說明，但是需要注意的是，本發(fā)明并不局限于這些內(nèi)容。參考例1七-6-氨基-β-⑶(所述式1)的制備(1)七-6-氯-β-CD的制備在雙口燒瓶中放入3.0274g的β-環(huán)糊精(⑶)，利用乙醇進行4次共沸并使其脫水之后，進行20小時的真空干燥(40°C)。真空干燥之后，對燒瓶進行氮氣置換之后取出而獲得2.75g(2.42X10_3mOl)的β-⑶。對此，放入23ml的預先利用CaH2進行脫水的二甲基甲酰胺(DMF)并使其溶解，并放置在氮氣氣流中。進而，緩慢滴入2.9ml(37X10_3mol)的甲烷磺酰氯。其次，在80°C的油槽溫度下進行4小時30分鐘的反應(yīng)。冷卻到室溫之后，為了停止反應(yīng)，放入5ml的乙醇并進行30分鐘的攪拌，利用大約12ml的甲醇鈉28%甲醇溶液進行中和(pH78)，并進行16小時20分鐘。利用蒸發(fā)裝置對其進行干燥固化，移到瓷漏斗中利用甲醇以及水清洗生成物。進行24小時20分鐘的真空干燥(40°C)之后，獲得2.5886g的產(chǎn)量，其收獲率為85%。通過色譜法(TLC)以及激光電離飛行時間質(zhì)譜分析儀(MALDI-TOFMS)進行確認。TLC使用丁醇乙醇水=543的展開溶劑1，并作為顯色試劑使用茴香醛，其Rf值為0.83。(2)七-6-氯-β-CD的制備在圓底燒瓶中，利用二甲基乙酰胺水=60ml8ml溶解1.2630g(9.9930Xl(T4mol)的七_6_氯-β-CD,并添加1.4232g(218.9XΙΟΛιοΙ)的疊氮化鈉。在110°C的油槽溫度下進行24小時的反應(yīng)之后，反應(yīng)溶液的溫度降低到室溫為止攪拌1小時。利用移液管將其溶液滴入到約700ml的水中，使其生成物沉淀化，去除作為雜質(zhì)的濾液。將過濾物轉(zhuǎn)移到瓷漏斗中，利用水對其進行清洗。進行13個小時的真空干燥(40°C)之后，獲得1.1562g的產(chǎn)量，其收獲率為88%。通過色譜法(TLC)以及激光電離飛行時間質(zhì)譜分析儀(MALDI-TOFMS)進行確認。TLC使用丁醇乙醇水=543的展開溶劑1，并作為顯色試劑使用茴香醛，其Rf值為0.77。(3)七-6-氨基-β-CD(所述式1)的制備在圓底燒瓶中，禾U用73ml的DMAc溶解1.0015g(7.6446Xl(T4mol)的七-6-氯-β-⑶、3.1962g(121.86X10-4mol)的三苯基膦，在室溫中進行1小時反應(yīng)之后，添加30ml(4000X10_4mOl)的25%氨水攪拌22小時30分鐘。反應(yīng)之后，利用蒸發(fā)裝置對其進行濃縮，添加500ml的乙醇對生成物進行沉淀化，去除作為雜質(zhì)的濾液。將過濾物移到瓷漏斗中，利用乙醇對其進行清洗。進行19小時50分鐘的真空干燥(40°C)之后，獲得0.8321g的產(chǎn)量，其收獲率為96%。通過色譜法(TLC)以及激光電離飛行時間質(zhì)譜分析儀(MALDI-TOFMS)進行確認。TLC使用丁醇乙醇水=543的展開溶劑1，并作為顯色試劑使用茴香醛以及茚三酮。參考例2七-6-氨基-cap1-β-CD(所述式2)的制備由于在七-6-氨基-β-⑶(所述式1)(1.71g)中導入氨基己酸，使用氨基被Boc基保護的氨基己酸(10當量，3.51g)，在甲醇/水的混合溶液(11v/v,20ml20ml)中，添加N-甲基嗎啉(NMM)(10當量，1.67ml)之后，一次性添加凝聚劑(DMT-MM)(10當量，4.2g)，在室溫中進行48小時的反應(yīng)。反應(yīng)之后，利用蒸發(fā)裝置對其進行濃縮，利用純水對生成物實施再沉淀。去除濾液之后，溶解在甲醇中，將過濾物干燥固化而獲得七-6-Boc-氨^？-capl-β—CDο在七-6-Boc-氨基-capl-β-CD中添加大約4ml的4M-HC1/二氧雜環(huán)乙烷溶液，在冰冷環(huán)境中攪拌3小時，進行脫Boc化，獲得七-6-Boc-氨基-capl-β-⑶(所述式2)。獲得2.17g的產(chǎn)量，其收獲率為74.6%。使用MALDI-TOFMS進行生成物的確認。MALDI-TOFMS計算值1920.55[M]+,1943.54[M+Na]+，1959.65[M+K]+；實測值m/z1919.50，1956.81。參考例3七-6-氨基-cap2-β-CD(所述式3)的制備為了在所述七-6-氨基-capl-β-⑶(1.Og)中進一步導入氨基己酸，使用氨基受Boc基保護的氨基己酸(20當量，2.4g)，在甲醇溶液(100ml)中添加NMM(20當量，1.15ml)之后，一次性添加DMT-MM(20當量，2.88g)，并在室溫中進行48小時的反應(yīng)。反應(yīng)之后，利用蒸發(fā)裝置對其進行濃縮，利用純水對生成物實施再沉淀。去除濾液之后，溶解在甲醇中，將過濾物干燥固化而獲得七-6-Boc-氨基-cap2-β-CD。在七-6-Boc-氨基-cap2-0-CD中添加大約4ml的4M-HC1/二氧雜環(huán)乙烷溶液，在冰冷環(huán)境中攪拌3小時，進行脫Boc化，獲得七-6-Boc-氨基-cap2-β-⑶(所述式3)。獲得1.46g的產(chǎn)量，其收獲率為103.4%。使用MALDI-TOFMS進行生成物的確認。MALDI-TOFMS計算值2712.3[M]+,2735.29[M+Na]+，2751.4[M+K]+；實測值m/z2711.45,2732.78,2748.80。實施例1例示化合物1以及710的制備在IOOml的反應(yīng)容器中放入53.3mg(2X10_5mol)的七-6_Boc-氨基-(即2-3-0)(所述式3)，276.91^(60\10-511101)的葉酸，并在100°C溫度中利用20ml的DMSO進行溶解。接著，添加NMM66μ1(60X10_5mol),DMT_MM(60Xl(T5mol)，甲醇20ml，在30°C的油槽溫度下攪拌45小時。(a)反應(yīng)結(jié)束之后，丙酮再經(jīng)沉淀、吸濾后，在圓底燒瓶中，利用IM氨水對過濾物進行溶出，并進行冷凍干燥。精煉是通過Bio-Gel-P6的GPC來進行。GPC柱條件如下φ4cmX92cm，溶出速度0.25ml/分鐘，樣品濃度294mg/4ml(氨水)Bio-Gel_P6處理之后，獲得55.5mg的產(chǎn)量，收獲率為49.8%的生成物。所述(a)的分離精煉之后，對生成物進行NMR測定的結(jié)果為，δ值(ppm)的8.668.69,7.617.70,6.606.71的各個多原子信號由例示化合物1的葉酸部分信號與作為微量雜質(zhì)的未反應(yīng)葉酸信號構(gòu)成，那些各個信號的積分值進行平均的取代度為6.4，在其中共存這微量的從例示化合物1游離出來的化合物(葉酸6取代環(huán)糊精化合物)。在此，通過下述(b)所示的分離精煉工程對例示化合物1進行精煉、離析。(b)反應(yīng)結(jié)束之后，丙酮再經(jīng)沉淀、吸濾后，在旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)器中，去除揮發(fā)性成分，進行干燥固化。過濾物IOOmg分散于水中，加熱到5060°C，施加超聲波進行溶解。利用膜濾器(0.45μ聚丙烯過濾器，Whatmanpic.制)過濾不溶物之后，通過Bio-Gel-P4凝膠(Bio-RadLaboratories公司制)的GPC填充到Φ4cmX60cm的玻璃柱中，在2.Oml/分鐘的流速、17大氣壓加壓下進行。作為溶出液使用水，利用分部收集器對目標化合物進行分流收集，利用蒸發(fā)裝置進行干燥固化之后，利用少量水進行溶解，冷凍干燥之后獲得例示化合物1為18.3mg,收獲率為44.4%0并且，同時獲得例示化合物710，對其進行分別單離。確認例示化合物1以及710時，利用TLC(Rf值0.48；展開溶劑1_丁醇乙醇水25%氨水=5435，顯色試劑茴香醛以及碘)，MALDI-TOFMS(Μ=C259H350O77N70；[Μ+Η]+計算值5676.98，實測值5674.10；[M+Na]+計算值5698.96，實測值5697.97；[M+K]+計算值5715.07，實測值5716.21),1HNMR以及1H-1HCOSY進行NMR峰值的歸屬。1HNMR(500MHz,DMSO-D2O)δ(ppm)1.24(28H，s)1.40(28H，s)1.49(28H，s)1.931.97(14H,m)2.06(28H,s)2.262.28(14H，t)3.03(28H,s)4.20(7H,t)4.53(14H，s)4.86(7H,s)6.606.71(14H，m)7.617.70(14H，m)8.668.69(7H,m)。利用常用融點測量裝置進行測量之后發(fā)現(xiàn)在188189°C溫度下被分解。例示化合物7計算值5812.12[M+Na]+；實測值5812.03[M+Na]+例示化合物8計算值5585.81[M+Na]+；實測值5586.03[M+Na]+例示化合物9計算值5275.58[M+Na]+；實測值5275.40[M+Na]+例示化合物10計算值5065.37[M+K]+；實測值5065.27[M+K]+實施例2例示化合物2以及6的制備(1)I-D-半乳糖基-丙氧基的制備在雙口燒瓶中放入5.0138g的半乳糖，利用乙醇進行4次共沸并使其脫水，真空干燥之后，對燒瓶進行氮氣置換后取出，放入50ml的丙烯醇進行溶解，并置于氮氣氣流中。在此，作為酸催化劑添加1.5091g的Dowex50W-X8，加熱并進行2小時的回流。其次，通過吸濾方式去除Dowex50W-X8，移到雙口燒瓶進行濃縮干燥固化。冷凍干燥固化之后，獲得產(chǎn)量為6.22g、總收獲率為101%的生成物。(2)1-α-D-半乳糖基_丙氧基巰基羧酸(所述式4)的制備在雙口燒瓶中，將6.22g的I-D-半乳糖基-丙氧基溶解于25ml的甲醇并置于氬氣流之下。其次，添加2.7ml的3-巰基己酸，停止氬氣流并蓋上蓋子，攪拌的同時照射5個小時的紫外線。濃縮干燥固化，冷凍干燥固化之后，在S印hadexG-IO的GPC中對其進行精煉。獲得7.06g的產(chǎn)量，其收獲率為77%。計算值349.35[M+Na]+、365.46[M+K]+；實測值350.04,365.9(3)例示化合物2以及5的制備利用1.Oml的甲醇和1.Oml的DMSO(11)溶解4.5mg的通過參考例1制備的所述七-6-氨基-β-⑶和1.Smg的葉酸(對于所述七-6-氨基-β_⑶相當于1當量)，并添加作為凝聚劑的DMT-MM(對于七-6-氨基-β_⑶相當于1當量)，在室溫中攪拌30分鐘，使其進行反應(yīng)。其次，利用0.5ml的甲醇溶解39.6mg的D-半乳糖基-丙氧基巰基羧酸(對于七-6-氨基-β-⑶相當于1當量)，并添加作為凝聚劑的DMT-MM(對于七-6-氨基-β-⑶相當于30當量)，在室溫中攪拌13天，使其進行反應(yīng)。使用總計34.7mg的DMT-MM。利用MALDI-TOFMS對生成物進行確認之后，利用巴斯德吸管將其生成物一點點添加在10倍容量的丙酮中，并析出生成物和未反應(yīng)葉酸。對此進行吸濾之后，在析出物質(zhì)之中，可以溶解于水的成分流入圓底燒瓶，使其冷凍干燥，獲得例示化合物2以及5的混合物質(zhì)，其產(chǎn)量為10.5mg，其收獲率為76%。例示化合物2(C147H2tl8O71N28S4)計算值3670·73[M+K]+；實測值3671·04[M+K]+例示化合物5(C133H214O75N14S6)計算值3440.66[M+K]+；實測值3432.68[M+K]+如前所述，利用上述質(zhì)譜等，以完全不同的分子峰值進行檢測，并且，其分子量之差導致在GPC中的溶出時間不同，由此，通過Bio-Gel-P4的GPC，利用通常方法對例示化合物2以及5進行分離或精煉。實施例3例示化合物3以及6的制備(1)I-L-墨角藻糖基_丙氧基巰基羧酸的制備在實施例2中，與所述I-D-半乳糖基-丙氧基巰基羧酸(所述式4)的制備相同的順序制備I-L-墨角藻糖基-丙氧基巰基羧酸。計算值333.35[M+Na]+、349.46[M+K]+；實測值334.09[M+Na]\350.08[M+K]+(2)例示化合物3以及6的制備接著，在IOOml的容器中，放入118.8mg(3.82Xl(T4m0l)的所述1_L_墨角藻糖基_丙氧基巰基羧酸，157.5mg(3.56XΙΟΛιοΙ)的葉酸，溶解于6ml的DMSO中，并且，添加參考例1中所制備的13.6mg(l.20X10_5mol)的所述七-6-氨基-β-CD，201.3mg的DMT-MM，12ml的甲醇，并攪拌13天。其次，進行丙酮再沉淀，并通過吸濾方式去除I-L-墨角藻糖基-丙氧基巰基羧酸，葉酸，DMT-MM，可以溶解于水的成分移到圓底燒瓶(將玻璃過濾器內(nèi)的殘留物移到圓底燒瓶時使用超純水)，并進行濃縮干燥固化。獲得產(chǎn)量為11.lmg，收獲率為26.8%的例示化合物3以及6的混合物。例示化合物3(C140H211O68N21S5)計算值3475.70[M+K]+；實測值3478.85[M+K]+例示化合物6(C133H214O69N14S6)計算值3344·66[M+K]+；實測值3347·65[M+K]+如前所述，利用上述質(zhì)譜等，以完全不同的分子峰值進行檢測，并且，其分子量之差導致在GPC中的溶出時間不同，由此，通過Bio-Gel-P4的GPC，利用通常方法對例示化合物3以及6進行分離或精煉。[化學式19]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>實施例4例示化合物4的制備將通過現(xiàn)有方法(例如，Aoki，R.Arai,K.Hattori,J.InclusionPhenom.，50，115-120(2004))合成的單一_6_氨基-β-CD(式5;0.17g)，葉酸(0.07g)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC；0.03g)溶解于5mL的DMS0，10μL的呲啶中，并在室溫(24°C)中攪拌24小時。反應(yīng)之后，利用蒸發(fā)裝置對其進行濃縮，利用S印hadexG-10柱(3CmX20Cm)進行凝膠過濾操作。利用蒸發(fā)裝置對分離取得的溶液進行濃縮干燥固化，利用少量水溶解之后進行冷凍干燥，獲得例示化合物4。其產(chǎn)量為0.llg，其收獲率為45%。IHNMR(500MHz,D20)δ(ppm):1.802.32(4H,m)，4.955.00(7H,d)，6.726.76(2H,d)，7.537.57(2H,d)，MALDI-TOFMS(C61H89O39N8)計算值1558.39[M+H]+；實測值1559.13[M+H]+實施例5對于例示化合物1等的葉酸結(jié)合蛋白質(zhì)(FBP)的締合評價<FBP的固定化〉使用在固定化的試劑通過下述方式獲得?！mMBS3溶液將2.9mg的雙(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸鹽(BS3)溶解于5ml的IOmM磷酸緩沖溶液(pH7.2)而得?！BP固定化溶液將Img的FBP(SIGMA公司制)溶解于Iml的IOmM磷酸緩沖溶液(ρΗ7·2)而得。利用所述IAsys(表面等離子共振(SPR)裝置)，通過下述(1)(8)操作對FBP進行固定化。(1)在sra光學生物傳感器反應(yīng)杯表面上的氨基硅烷基團上，作為與凝集素蛋白質(zhì)的氨基進行反應(yīng)的銜接物，注入所述ImMBS3溶液并使其預先進行反應(yīng)，響應(yīng)平衡為止放置15分鐘左右。(2)在所述反應(yīng)杯中注入IOmM磷酸緩沖溶液(pH7.2)，并使其響應(yīng)平衡為止等待。(3)使響應(yīng)盡量少變化為止，多次(例如，4次)重復所述(1)，(2)操作。(4)為了使得惰性化、阻塞未反應(yīng)的氨基硅烷，將乙酐-醋酸溶液(混合體積比11)注入到反應(yīng)杯中。(5)注入IOmM磷酸緩沖溶液(pH7.2)進行清洗之后，注入IOmM磷酸緩沖溶液(pH7.2)進行溶劑置換。(6)注入所述FBP固定化溶液，進行反應(yīng)，使其平衡為止，放置。(7)注入IOmM磷酸緩沖溶液(pH7.2)使其穩(wěn)定為止，備用。(8)考慮到反應(yīng)杯上的后臺影響，為了使得惰性化、阻塞未反應(yīng)的BS3末端的琥珀酸酰胺酯基，注入IM乙醇胺溶液，并放置5分鐘左右。關(guān)于FBP的固定化，由于注入(6)時被測定的FBP的響應(yīng)(R)的變化量為1081.4arcsec，因此，識別為R=600arcsec時在lng/mm2中，每Inm2存在1個氨基硅烷基團，因此，以1.80ng/mm2進行固定化。<對于FBP的所述例示化合物1等的締合評價>在固定化FBP的反應(yīng)杯中，注入200μ1的溶解于IOmM磷酸緩沖溶液(ρΗ7.3；含有0.85%NaCl)的所述例示化合物1(1.OX10_6M)，由此得到圖1所示的飽和曲線(測定溫度25.O0C)。通過實施例2獲得的由例示化合物2以及5構(gòu)成的混合物，通過實施例3獲得的由例示化合物3以及6構(gòu)成的混合物，作為比較例的比較化合物1、2，未修飾的β-⑶，均以1.OXICT6M的濃度，如同例示化合物1的方法進行SI3R測定，并評價了對于FBP的締合性。[化學式2O]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>圖1表示所述例示化合物1(圖中1)、由例示化合物2以及5構(gòu)成的所述混合物(圖中2)、由例示化合物3以及6構(gòu)成的所述混合物(圖中3)、作為比較例子的比較化合物1(圖中4)、比較化合物2(圖中5)、以及未修飾的β-CD(圖中6)對于上述物質(zhì)的FBP識別締合的sra測定結(jié)果示意圖。響應(yīng)的變化量與所締合的化合物質(zhì)量呈比例，響應(yīng)越大則締合常數(shù)越大，認為具有優(yōu)異的締合性。如圖1所示，不具備作為識別標記的葉酸的比較化合物1、2，未修飾的β-⑶完全沒有表現(xiàn)締合性。另一方面，由例示化合物2以及5構(gòu)成的所述混合物，由例示化合物3以及6構(gòu)成的所述混合物均顯示對于FBP的締合性。進而，具有7個葉酸基團的所述例示化合物1基于所述納米簇效應(yīng)，其締合性能最好。締合常數(shù)為5.IXIO9M-10另外，對于例示化合物4也進行了同樣的Sra測定，其結(jié)果為，其締合性能不如具有7個葉酸基團的所述例示化合物1。締合常數(shù)的概算值為7.8XIO5M-1。實施例6例示化合物1對于Caco-2腫瘤細胞以及小鼠肝臟正常細胞的締合比較評價例示化合物1通過如同上述方法對于引起人類結(jié)腸癌的細胞的Caco-2細胞以及作為其比較目標細胞的小鼠肝臟正常細胞進行SPR測定，由此比較評價了識別相互作用。試驗6-1.對Caco-2腫瘤細胞的SPR測定取代FBP固定化溶液而作為Caco-2細胞固定溶液使用Caco-2細胞的適量濃度液體(磷酸緩沖溶液(PH7.3)+0.85%NaCl)(CORNING公司制)之外，其他部分與實施例10的<FBP的固定化>操作相同，由此進行了Caco-2細胞的固定化。進而，對Caco-2細胞進行固定化之后的反應(yīng)杯中，注入200μ1的、溶解于磷酸緩沖溶液(ρΗ7.3)+0.85%NaCl的、所述例示化合物Kl.OXI(T10M)，并進行SPR測定。試驗6-2.對小鼠肝臟正常細胞的SPR測定取代FBP固定化溶液而作為小鼠肝臟正常細胞固定溶液使用小鼠肝臟正常細胞的適量濃度液體(生理食鹽水)(COSMOBIOco.，ltd.(RKL)公司制)之外，其他部分與實施例5的<FBP的固定化>操作相同，由此進行了小鼠肝臟正常細胞的固定化。進而，對小鼠肝臟正常細胞進行固定化之后的反應(yīng)杯中，注入200μ1的、溶解于生理食鹽水(含有ImMCaCl2NaCl)的、所述例示化合物1(1.OXI(TiqM)，并進行SI3R測定。圖2表示通過試驗6-1以及6-2獲得的結(jié)果。圖2表示例示化合物1分別對于Caco-2腫瘤細胞(圖中7)以及小鼠肝臟正常細胞(圖中8)的締合性的SI5R測定結(jié)果。如上所述，響應(yīng)越大則締合常數(shù)越大并具有優(yōu)異的締合性能，如圖2所示，例示化合物1幾乎不與小鼠肝臟正常細胞締合，但是，與Caco-2腫瘤細胞強有力的締合，也就是，對于癌細胞具有特殊的識別締合性能。實施例7例示化合物1對于Caco-2腫瘤細胞以及抗癌藥DXR的締合比較評價使用引起人類結(jié)腸癌的細胞的Caco-2細胞，并評價了識別相互作用。試驗7-1.對Caco-2腫瘤細胞的識別締合測定取代FBP固定化溶液而作為Caco-2腫瘤細胞固定溶液使用Caco-2細胞的適量濃度液體(磷酸緩沖溶液(PH7.3)+0.85%NaCl)之外，其他部分與實施例5的<FBP的固定化>操作相同，由此進行了Caco-2腫瘤細胞的固定化，進而，由于通過直線圖示方法求得對于FBP的締合常數(shù)，因此，將包含改變成多個濃度的所述例示化合物1的溶液注入到對Caco-2腫瘤細胞進行固定化了的反應(yīng)杯中，并進行SPR測定。圖3a是表示對于Caco-2腫瘤細胞的結(jié)合動力學行為的直線圖。如圖3a所示，與Caco-2腫瘤細胞的締合測定結(jié)果，例示化合物1的締合常數(shù)為5.IXlO9M-1O作為特異性反應(yīng)的典型例的抗原抗體反應(yīng)的締合常數(shù)為IOkT1左右，考慮到例示化合物1對于Caco-2細胞具有相同水準的締合常數(shù)，因此，可以認為例示化合物1對于癌細胞具有充分的特異性識別締合性能。并且，該締合性能的強度受所述納米簇的影響。試驗7-2.藥物DXR的包接性能的測定作為藥物使用制癌抗生物質(zhì)-阿霉素(以下簡稱“DXR”)，使用相同于試驗例1的方法評價本發(fā)明的CD化合物的包接性能。1)DXR的固定化對于DXR的光學生物傳感器反應(yīng)杯的固定化操作是，除了溶解藥物的緩沖溶液的PH不同之外，其他操作方法相同于上述FBP的固定化。(1)在反應(yīng)杯表面上的氨基硅烷基團上，作為與DXR的氨基進行反應(yīng)的銜接物，注入ImMBS3溶液/IOmM磷酸緩沖溶液，并在pH6.5環(huán)境中使其進行反應(yīng)。光學生物傳感器的響應(yīng)相對穩(wěn)定為止多次重復此操作，并通過添加乙酐-醋酸溶液(混合體積比11)，使得惰性化、阻塞未反應(yīng)的氨基硅烷基團。阻塞之后，置換為pH5.3的IOmM-磷酸緩沖溶液，添加DXR溶液(2mgDXR/10mM-磷酸緩沖溶液，PH5.3)，使其反應(yīng)。其次，考慮到反應(yīng)杯上的后臺影響，使用IM乙醇胺溶液在PH8.5環(huán)境下進行琥珀酸酰胺酯基的阻塞操作。關(guān)于DXR的固定化，由于DXR的響應(yīng)的變化量為186.Iarcsec,因此，識別為R=600arcsec時在lng/mm2中，每Inm2存在1個氨基硅烷基團，因此，以0.31ng/mm2進行固定化。2)測定使用DXR固定化反應(yīng)杯，如同試驗1，測定了所述例示化合物1與DXR之間的結(jié)合動力學行為。圖2b表示通過上述方式獲得的結(jié)果。圖2b表示對于DXR的結(jié)合動力學行為的直線圖。如圖3b的直線圖所示，例示化合物1對于DXR的包接締合常數(shù)為3.δΧΙΟ1。作為環(huán)糊精的包接作用，只要締合常數(shù)達到IO6M-1,則識別為具有作為藥物傳遞劑的充分強有力的包接能力，但是，在此超過此締合常數(shù)。本發(fā)明人認為，由于葉酸部分具有疏水性，因此與DXR包接時，?？?yīng)(請參照K.Hattori，A.Kenmoku，Τ.Mizuguchi,D.Ikeda,Μ.Mizuno,Τ.Inazu,J.InclusionPhenom.MacrocyclicChem.,56,9-16(2006).)起強有力的作用所引起的。另外，如同例示化合物1的方法，對于例示化合物4也測定了同樣的對于抗癌醫(yī)藥DXR的締合常數(shù)，其結(jié)果，所述例示化合物4對于DXR的締合常數(shù)為1.72XIO5M4,這一數(shù)字不如具有7個葉酸基團的所述例示化合物1。構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖之中的1個3位羥基被葉酸取代的下述比較化合物3，對于此例示化合物3也進行對于Caco-2腫瘤細胞以及DXR的締合試驗。與例示化合物1以及4的結(jié)果一同列在下述表1中。[化學式2I]比較化合物3:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表1所示，具有7個葉酸基團的所述例示化合物1與，基于所述納米簇效應(yīng)而僅具有一個葉酸基團的例示化合物4和比較化合物3相比，所述例示化合物1顯示大約104倍的受體締合性能。另一方面，具有7個葉酸基團的所述例示化合物1與，基于所述海葵效應(yīng)而僅具有一個葉酸基團的例示化合物4和比較化合物3相比，所述例示化合物1顯示IO2倍以上的DXR包接性能。從以上結(jié)果可知，本發(fā)明的環(huán)糊精化合物對于癌細胞以及藥物顯示優(yōu)異的雙重識別性能，因此，可以作為對癌細胞的靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)中的載體使用。產(chǎn)業(yè)上的可利用件本發(fā)明的環(huán)糊精化合物，可以使用在抗癌藥物中的癌細胞目標載體或者炎癥部位目標載體，癌組織的造影劑的目標，基因等的傳遞等領(lǐng)域。本發(fā)明的靶向性藥物傳遞系統(tǒng)以及靶向性藥物組合物，可以使用于對癌、肝癌、大腸癌等疾病的靶向性藥物傳遞系統(tǒng)(TDDS)，還可以作為對癌、肝癌、大腸癌等疾病的靶向性造影劑而使用。在此我們結(jié)合實施例說明了本發(fā)明，但是，只要我們沒有特意指定的話，不能限定本發(fā)明的說明中的細節(jié)部分，這一點并非違反權(quán)利要求范圍所示的發(fā)明精神與范圍，應(yīng)該認為可以做寬廣范圍的解釋。本申請主張2007年9月28日在日本提出的專利申請?zhí)枮?007-256527的發(fā)明專利申請的優(yōu)先權(quán)，上述發(fā)明專利申請被引入本說明書中作為參考。權(quán)利要求一種環(huán)糊精化合物，其特征在于構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基的兩個或兩個以上基團分別被具有葉酸的取代基置換而成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精化合物，其特征在于其可以表示為下述通式1，其被2個或2個以上的葉酸修飾而成；[化學式1]通式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>基是所述環(huán)糊精化合物中的至少兩個；[化學式2]通式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>在通式2中，※表示與構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位碳原子之間的結(jié)合位置。并且，n表示03的整數(shù)，n為0時，羰基碳原子與氨基氮原子的結(jié)合部分表現(xiàn)為單結(jié)合。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)糊精化合物，其特征在于被下述任一式所表示[化學式3]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>例示化合物1[化學式4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>4.一種葉酸修飾的環(huán)糊精化合物的制備方法，其特征在于縮合在構(gòu)成環(huán)糊精的各個吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基上具有氨基或者氨基_寡聚乙酰胺基的環(huán)糊精與葉酸。5.一種靶向性藥物傳遞劑，其特征在于包括權(quán)利要求13的任一項所述的環(huán)糊精化合物。6.一種靶向性藥物組合物，其特征在于包括權(quán)利要求13的任一項所述的環(huán)糊精化合物與藥物，所述藥物被所述環(huán)糊精化合物包接。7.—種靶向性造影劑，其特征在于包括權(quán)利要求13的任一項所述的環(huán)糊精化合物與藥物，所述造影劑被所述環(huán)糊精化合物包接。全文摘要構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的6位的第一級羥基的兩個或兩個以上基團分別被具有葉酸的取代基置換而成的環(huán)糊精化合物。文檔編號A61K47/48GK101809039SQ20088010935公開日2010年8月18日申請日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者服部憲治郎申請人:那諾蒂克株式會社