專利名稱：促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的制作方法
促紅細(xì)胞生成素融合蛋白本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素(EP0)融合多肽和二聚體；編碼所述多肽的核酸分子 和使用所述多肽/二聚體治療的方法。細(xì)胞因子受體可被分為兩個(gè)不同的類型。1類受體(也稱為造血或生長(zhǎng)激素家族) 是由它們的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基末端部分中四個(gè)保守的半胱氨酸殘基以及C-端部分中保守 的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序的存在表征的。受體由兩條多肽鏈組成。I類受體可被再分 為 GM-CSF 亞家族(其包括 IL-3、IL-5、GM-CSF、GCSF)和 IL-6 亞家族(其包括 IL_6、IL_11 和IL-12)。在IL-6亞家族中，有與一種或兩種不同的細(xì)胞因子亞基相關(guān)的常見的轉(zhuǎn)導(dǎo)亞 基(gpl30)。還有一種亞家族被稱為IL-2亞家族(包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)。 重復(fù)的Cys基序也存在于2類(干擾素受體家族)中，其配體為a、0和Y干擾素，但是 缺少保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。人類EP0是參與調(diào)節(jié)骨髓中紅血球生成的35kD的糖蛋白激素。它由腎產(chǎn)生并且 自從在1977年將其純化和在1985年將其克隆以來，它常被用來在慢性腎衰竭和其他疾病 中治療貧血。響應(yīng)EP0的細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)和心臟細(xì)胞。由于不同的糖基化，EP0的 制劑是非均質(zhì)的。體外活性不需要EP0的糖基化表明EP0的成熟形式可在沒有糖基化存在 的情況下結(jié)合EP0受體。然而，EP0的體內(nèi)活性依賴于防止其降解并延遲清除的糖類部分 的加合。EP0通過活化在紅系細(xì)胞上以低水平表達(dá)而在成熟的血紅細(xì)胞中缺乏的單一的高 親和力受體來活化紅血球發(fā)育。EP0受體(EP0R)屬于I類細(xì)胞因子受體超家族。EP0與 EP0R的結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化，其誘導(dǎo)大量胞質(zhì)和膜相關(guān)的分子包括EP0R的酪氨酸磷酸化。 已經(jīng)在肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到EP0R，并且據(jù)信EP0起到控制心臟和大腦 發(fā)育的作用。已經(jīng)顯示EP0保護(hù)心臟和大腦不受炎性和缺血性損害。EP0的血清水平可響應(yīng)于 正常和病理狀況而變化。EP0的水平可響應(yīng)于缺氧或失血而升高100-1000倍。貧血可由大量病理狀況所導(dǎo)致。例如，缺血狀態(tài)可由失血、溶血、缺鐵癥、骨髓再生 障礙或營養(yǎng)缺乏所導(dǎo)致。在一些病理狀況中，EP0的水平可以低很多并且由導(dǎo)致EP0的生成 減少和隨后的貧血的慢性腎衰竭所導(dǎo)致。此外，在患有疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、AIDS和癌 (作為化學(xué)治療的結(jié)果)的患者中，EP0的水平可能是低的。當(dāng)施用重組的EP0(如Epogen、 Aransesp和Epogin)時(shí)，對(duì)貧血的治療是非常有效的。通常重組的EP0通過皮下注射或靜 脈內(nèi)地每周施用兩次或三次。EP0的施用不是沒有風(fēng)險(xiǎn)的。一些副作用包括增加的血壓、惡 心、嘔吐、頭疼和呼吸急促。有開發(fā)可被較低頻率施用并且具有增加的血清穩(wěn)定性從而導(dǎo)致較低劑量的施用 和較少的副作用的另外的形式的EP0的需要。本公開內(nèi)容涉及具有改善的藥物動(dòng)力學(xué)和活性的EP0重組形式的鑒定。新的EP0 分子是生物學(xué)上有活性的，形成二聚體并且具有改善的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包含編碼具有促紅細(xì)胞生成素活性的多肽的核酸 序列的核酸分子，其中所述多肽包含與促紅細(xì)胞生成素受體的促紅細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接或間接連接的促紅細(xì)胞生成素或者其部分。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了融合多肽，其包含與促紅細(xì)胞生成素受體的促紅 細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接或間接連接的促紅細(xì)胞生成素或其活性結(jié)合部分的氨基酸序 列。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中促紅細(xì)胞生成素通過肽連接體優(yōu)選柔性肽連接體 與促紅細(xì)胞生成素受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述肽連接分子包含至少一個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述肽連接分子包含2、3、4、5或6個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser。優(yōu)選地，所述肽連接分子由3個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser組成。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽連接分子由4個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser 組成。在本發(fā)明的另外的可選的實(shí)施方案中，所述多肽不包含肽連接分子，而是促紅細(xì) 胞生成素和促紅細(xì)胞生成素受體的促紅細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的直接融合物。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了包含選自下列的核酸序列的核酸分子i)如SEQ ID NO 1中所表示的核酸序列；ii)如SEQ ID NO 3中所表示的核酸序列；iii)如SEQ ID NO 5中所表示的核酸序列；iv)如SEQ ID NO 7中所表示的核酸序列；或v)包含在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID NO :1、3、5或7雜交并且編碼具有促紅細(xì)胞 生成素受體調(diào)節(jié)活性的多肽的核酸序列的核酸分子。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽是激動(dòng)劑。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽是拮抗劑。當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)的核酸分子具有一定量的彼此鍵合的氫時(shí)，發(fā)生核酸分子的雜交。雜 交的嚴(yán)格性可根據(jù)核酸周圍的環(huán)境條件、雜交方法的性質(zhì)以及所用的核酸分子的組成和長(zhǎng) 度來變化。關(guān)于獲得特定級(jí)別的嚴(yán)格性所需要的雜交條件的分析論述在Sambrook等人， Molecular Cloning :A LaboratoryManual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor，NY，2001)禾口Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes (生物 化學(xué)和分子生物學(xué)中的技術(shù)一使用核酸探針的雜交)I部分，第2章(ElseviehNew York, 1993)。1 是核酸分子的給定鏈的50%與其互補(bǔ)鏈雜交的溫度。下列是雜交條件的示例性 設(shè)定并且是非限制性的非常高的牛(fr.i^)雜交5x SSC 于 65 °C 16 小時(shí)清洗兩次2x SSC于室溫(RT)每次15分鐘清洗兩次0. 5x SSC于65°C每次20分鐘^r^t^ (fri午H有至小、80%同一件的序歹I丨雜交)雜交5x-6x SSC 于 65°C-70°c 16-20 小時(shí)
清洗兩次2x SSC于RT每次5-20分鐘清洗兩次lx SSC于55°C _70°C每次30分鐘低戶鼎(介午‘辟4、50%胃一性請(qǐng)歹丨丨棘)雜交6x SSC 于 RT 至 55 °C 16-20 小時(shí)清洗至少兩次 2x_3xSSC于RT至55°C每次20-30分鐘。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :1中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO 1中所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :3中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO :3中所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :5中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO :5中所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :7中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO :7中所表示的核酸序列組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的多肽。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了包含選自下列的氨基酸序列的多肽i)如SEQ ID NO 2中所表示的氨基酸序列；ii)如SEQ ID NO 4中所表示的氨基酸序列；iii)如SEQ ID NO 6中所表示的氨基酸序列；iv)如SEQ ID NO 8中所表示的氨基酸序列；v)如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸序列；vi)如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸序列；或其中所述多肽具有促紅細(xì)胞生成 素受體調(diào)節(jié)活性。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽是激動(dòng)劑。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽是拮抗劑。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :2中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :2中所表示的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :4中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :4中所表示的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :6中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :6中所表示的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :8中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :8中所表示的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸 序列或由如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸 序列或由如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸序列組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了由兩個(gè)多肽組成的同型二聚體，其中所述多肽中 的每一個(gè)包含i)包含促紅細(xì)胞生成素或其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一部分，其任選地通過肽連接分子連接至ii)包含促紅細(xì)胞生成素受體的促紅細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二部分。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽包含SEQ ID NO 2 或由 SEQ ID NO 2 組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :4 或由 SEQ ID NO 4 組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :6 或由 SEQ ID NO 6 組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :8 或由 SEQ ID NO 8 組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽包含SEQ ID NO 17 或由 SEQ ID NO 17 組成。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽包含SEQ ID NO 18 或由 SEQ ID NO 18 組成。在本發(fā)明的另外的方面提供了包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述載體是適于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表 達(dá)載體。含有根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體不必包含啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)序列，尤其是如果載體 將被用于將核酸引入細(xì)胞以便為了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染重組至基因組。優(yōu)選地載體中的核酸可操作 地連接于適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或其他調(diào)節(jié)元件以便在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。載體可以是在多個(gè)宿主中 起作用的雙功能表達(dá)載體?！皢?dòng)子”意指來自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的核苷酸序列，并且包含 所有轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)區(qū)。適合的啟動(dòng)子包括組成型、組織特異型、可誘導(dǎo)的、發(fā)育的或用于 在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的其他啟動(dòng)子。“可操作地連接”意指連接為同一核酸分子的部 分，適當(dāng)?shù)囟ㄎ徊⑶叶ㄏ蛞员銖膯?dòng)子起始轉(zhuǎn)錄?？刹僮龅剡B接于啟動(dòng)子的DNA處于啟動(dòng) 子的“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)之下”。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是組成型的、可誘導(dǎo)的或者可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞?？蛇x擇地所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述細(xì)胞選自由下列組成的組真菌細(xì)胞(例如畢 赤酵母屬(Pichia spp)、酵母屬(Saccharomyces spp)、脈胞菌屬(Neurospora spp)),昆蟲 細(xì)胞(例如灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp))，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞、CH0細(xì)胞)，植 物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了包含含有賦形劑或載體的根據(jù)本發(fā)明的多肽的 藥物組合物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述藥物組合物與另外的治療劑組合。當(dāng)被施用時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物以藥學(xué)上可接受的制劑被施用。這種制劑可常 規(guī)地含有藥學(xué)上可接受的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的載體和任選的其他治療劑。本發(fā)明的藥物組合物可通過任何常規(guī)的途徑被施用，包括注射。施用和使用可以例如是□服的、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腔內(nèi)的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、皮下的、局部(眼部)的、 皮膚的(例如脂溶性的滲入皮膚或粘膜的乳膏)、經(jīng)皮的或鼻內(nèi)的?？梢砸杂行У牧渴┯帽景l(fā)明的藥物組合物。“有效的量”是單獨(dú)或與另外的劑量或 協(xié)同的藥物一起產(chǎn)生所期望的響應(yīng)的藥物/組合物的量。這可僅包括暫時(shí)性地減緩疾病發(fā) 展，盡管更優(yōu)選地，其包括永久地停止疾病的發(fā)展。這可通過常規(guī)方法監(jiān)測(cè)或可根據(jù)診斷學(xué) 方法監(jiān)測(cè)。向受治療者施用的藥物組合物的劑量可根據(jù)不同的參數(shù)尤其是根據(jù)所使用的施 用的方式和受治療者的狀況(即，年齡、性別)來選擇。當(dāng)施用時(shí)，以藥學(xué)上可接受的量并 以藥學(xué)上可接受的組合物來應(yīng)用本發(fā)明的藥物組合物。當(dāng)用于藥品中時(shí)，鹽應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)上 可接受的，但非藥學(xué)上可接受的鹽可被常規(guī)地用于制備其藥學(xué)上可接受的鹽并且不被排除 在本發(fā)明的范圍之外。這種藥理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于從下列酸所制備的那 些氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、醋酸、水楊酸、檸檬酸、富馬酸、丙二酸、琥珀 酸以及類似酸。而且，藥學(xué)上可接受的鹽可被制備為堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀或鈣
Trrt. o如果需要，藥物組合物可以是與藥學(xué)上可接受的載體組合的。如本文所用的，術(shù)語 “藥學(xué)上可接受的載體”意指適于施用于人類的一種或多種相容的固體或液體填充劑、稀釋 劑或包封物質(zhì)。術(shù)語“載體”意指天然或合成的有機(jī)或無機(jī)的成分，活性成分與其組合以促 進(jìn)應(yīng)用。藥物組合物的組分也能夠以沒有顯著損害所期望的藥物功效的相互作用的方式與 本發(fā)明的分子共混以及彼此共混。藥物組合物可含有適當(dāng)?shù)木彌_劑，包括醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽。藥物組合物任選地還可含有適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，例如氯化苯甲烴銨、三氯叔丁醇、尼 泊金類和硫柳汞。藥物組合物可方便地被制備為單位劑型并且可通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的方法中任一 種來制備。所有的方法包括使活性劑與組成一種或多種助劑的載體聯(lián)合的步驟。通常組合 物通過使活性化合物均勻并且緊密地與液體載體、精細(xì)分離的固體載體或兩者聯(lián)合并且之 后如果必須，將產(chǎn)品成型來制備。適用于口服施用的組合物可被制備為分離的單位，例如膠囊、片劑、錠劑，其每一 種含有預(yù)定量的活性化合物。其他的組合物包括含水液體或不含水液體中的懸浮液，例如 噴霧、酏劑或乳液。適用于胃腸外施用的組合物常規(guī)包含無菌的含水或非含水制劑，其優(yōu)選地與受 體的血液等滲。這種制劑可根據(jù)使用適當(dāng)?shù)姆稚┗蛟鰸駝┮约皯腋┑囊阎椒▉砼?制。無菌的可注射的制劑還可是溶于無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注 射的溶液或懸浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇的溶液?？杀皇褂玫目山邮艿娜軇┦撬⒘指袢?液和等滲的氯化鈉溶液，此外，無菌的不揮發(fā)的油被常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這一 目的可使用任何溫和的不揮發(fā)的油，包括合成的單甘油酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如 油酸可被用于可注射的制劑。適用于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等等施用的載體制劑可在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥學(xué))，Mack Publishing Co. ,Easton, PA中找到。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了治療患有從促紅細(xì)胞生成素激動(dòng)劑的施用受益的病況的人類受治療者的方法，其包括施用有效的量的至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中所述多肽被靜脈內(nèi)施用。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選的方法中所述多肽被皮下施用。在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的方法中所述多肽被以兩天的間隔施用；優(yōu)選地，所述多 肽被以每隔一周、兩周或一個(gè)月的間隔施用。在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中所述病況是貧血。在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中所述病況是由慢性腎臟疾病導(dǎo)致的貧血。在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中所述病況是由癌的治療中的化學(xué)治療所導(dǎo)致的貧血。在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中所述病況是由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中的化學(xué)治療所 導(dǎo)致的貧血。在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中所述病況是由AIDS的治療中的化學(xué)治療所導(dǎo)致的貧血。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的多肽在制備用于治療貧血的藥物中 的用途。在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述多肽被以兩天的間隔施用；優(yōu)選地，所 述多肽被以每隔一周、兩周或一個(gè)月的間隔施用。在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中所述病況是由慢性腎臟疾病導(dǎo)致的貧血。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述病況是由癌的治療中的化學(xué)治療所導(dǎo) 致的貧血。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述病況是由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中的 化學(xué)治療所導(dǎo)致的貧血。在本發(fā)明的可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述病況是由AIDS的治療中的化學(xué)治療所 導(dǎo)致的貧血。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽或二聚體的單克隆抗 體。優(yōu)選地，所述單克隆抗體是結(jié)合多肽或二聚體但沒有個(gè)別地特異性結(jié)合促紅細(xì)胞 生成素或促紅細(xì)胞生成素受體的抗體。單克隆抗體結(jié)合通過本發(fā)明的多肽或包含本發(fā)明的多肽的二聚體而呈遞的構(gòu)象 抗原。在本發(fā)明的另外的方面，提供了制備產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 系的方法，其包括下列步驟i)使用含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽的免疫原使免疫活性的哺乳動(dòng)物免疫；ii)將免疫的免疫活性的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì) 胞；iii)根據(jù)對(duì)(i)的多肽的結(jié)合活性篩選通過步驟(ii)的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克 隆抗體；iv)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞以增殖和/或分泌所述單克隆抗體；以及v)從培養(yǎng)上清液獲得單克隆抗體。優(yōu)選地，所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是小鼠?？蛇x擇地，所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是大鼠°使用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體是本領(lǐng)域中熟知的。用于產(chǎn)生單克隆抗體 的方法由 Kohler 和 Milstein 于 Nature 256,495-497(1975)中以及由 Donillard 和 Hoffman, “ Basic Facts about Hybridomas ( ^T^^^WS^ff % ) " T Compendium of Immunology V. II Schwartz編，1981中公開，它們通過引用并入。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的或可獲得的雜交 瘤細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了診斷檢驗(yàn)以在生物樣品中檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的多 肽，其包括i)提供有待檢驗(yàn)的分離的樣品；ii)將所述樣品與結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽的配體接觸；以及iii)檢測(cè)所述樣品中所述配體的結(jié)合。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中所述配體是抗體，優(yōu)選地，單克隆抗體。這一說明書的整個(gè)描述和權(quán)利要求中，詞“包含(comprise) ”和“含有”以及詞的 變體例如“包含(comprising) ”和“包含(comprises) ”意指“包括但不限于”并且不意圖 (并且不)排除其他的部分、添加劑、成分、整數(shù)或步驟。這一說明書的整個(gè)描述和權(quán)利要求中，除非上下文另外要求，單數(shù)包含復(fù)數(shù)。尤其 是當(dāng)使用不定冠詞時(shí)，除非上下文另外要求，說明書應(yīng)被理解為涵蓋復(fù)數(shù)以及單數(shù)。連同本發(fā)明的特定的方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣?、整?shù)、表征、化合物、化 學(xué)部分或基團(tuán)應(yīng)被理解為除非與其矛盾，則可用于本文描述的任何其他的方面、實(shí)施方案 或?qū)嵤├，F(xiàn)在將僅通過實(shí)施例并引用下列附圖來描述本發(fā)明的實(shí)施方案圖la是編碼用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的EP0-Ll-EP0rEC (EP0經(jīng)由(G4S)4與 EPOrEC連接)的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度=1299bp，包含信號(hào)序列)。序列含有以粗體 小寫字體形式的信號(hào)序列*是指終止密碼子；圖lb氨基酸序列(沒有信號(hào)序列的長(zhǎng)度= 406aa)。信號(hào)序列以粗體顯示；圖2a是編碼用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的EP0-Ll-EP0rEC (EP0經(jīng)由(G4S) 4與 EPOrEC連接)的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度=1242bp)。粗體字母是指Xhol和6x組氨酸殘 基*是指終止密碼子，以粗斜體表示ATG起始密碼子；圖2b氨基酸序列(長(zhǎng)度=414aa)；圖3a是編碼用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的EP0-L2-EP0rEC (EP0經(jīng)由(G4S) 3與 EPOrEC連接)的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度=1284bp，包含信號(hào)序列)。核苷酸和蛋白序 列代表在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)的伴隨有信號(hào)序列的全序列。序列含有以粗體小寫字體形 式的信號(hào)序列。*是指終止密碼子；圖3b氨基酸序列(沒有信號(hào)序列的長(zhǎng)度=401aa)。信 號(hào)序列以粗體顯示；圖4a是編碼用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的EP0-L2-EP0rEC (EP0經(jīng)由(G4S) 3與 EPOrEC連接)的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度=1227bp)。核苷酸和蛋白序列代表在大腸桿 菌(E. coli)中表達(dá)的具有6X組氨酸標(biāo)簽而沒有信號(hào)序列的全序列。粗體字母是指Xhol和 6x組氨酸殘基。*是指終止密碼子。以粗斜體表示ATG起始密碼子，圖4b氨基酸序列(長(zhǎng) 度=409aa)；
圖5a是編碼用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的EP0的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度= 579bp，包含信號(hào)序列)。核苷酸和蛋白序列代表在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)的伴隨有信號(hào)序 列的全序列。序列含有以粗體小寫字體形式的信號(hào)序列*是指終止密碼子；圖5b氨基酸 序列(沒有信號(hào)序列的長(zhǎng)度=166aa)。信號(hào)序列以粗體顯示。圖6a是編碼用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的EP0的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度= 522bp)。核苷酸和蛋白序列代表在大腸桿菌中表達(dá)的具有6X組氨酸標(biāo)簽的全序列。粗體 字母是指Xhol和6x組氨酸殘基。*是指終止密碼子。以粗斜體表示ATG起始密碼子；圖 6b氨基酸序列(長(zhǎng)度=174aa)；圖7a是編碼在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的EPOrEC的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度= 732bp，包含信號(hào)序列)。核苷酸和蛋白序列代表在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)的伴隨有信號(hào)序 列的全序列；圖7b氨基酸序列(沒有信號(hào)序列的長(zhǎng)度=220aa)。信號(hào)序列以粗體顯示；圖8a是編碼在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的EPOrEC的核酸序列(核酸序列長(zhǎng)度=684bp)。 核苷酸和蛋白序列代表在大腸桿菌中表達(dá)的具有6X組氨酸標(biāo)簽的全序列。粗體字母是指 Xhol和6x組氨酸殘基。*是指終止密碼子。以粗斜體表示ATG起始密碼子；圖8b氨基酸 序列(長(zhǎng)度=228aa)；圖9a)PCR被用于產(chǎn)生由適合的限制性位點(diǎn)(包含在引物Rl_4中)側(cè)翼的所感 興趣的基因組成的DNA。b)PCR產(chǎn)物于連接體區(qū)的任一側(cè)被連接至適合的載體中。c)之后 將構(gòu)建體修飾以引入正確的連接體，其不含有任何所不需要的序列(即非天然的限制性位占).
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圖10a)寡核苷酸被設(shè)計(jì)以部分地形成具有獨(dú)特重疊的雙鏈區(qū)，當(dāng)被退火并且加 工時(shí)，將編碼具有側(cè)翼區(qū)的連接體，其將退火至配體和受體，b)使用“大引物”和末端引物 (R1和R2)進(jìn)行PCR以產(chǎn)生LR融合基因。R1和R2引物被設(shè)計(jì)以引入有用的側(cè)翼的限制性 位點(diǎn)以便連接至靶載體中；圖11說明了 EP0融合蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。表達(dá)EP0和EP0嵌合構(gòu)建體的CH0 flpln穩(wěn)定細(xì)胞系的蛋白質(zhì)印跡分析，道1 = 3B2 ；道2 = 3B2 ；道3 = EP0 ；道4 = 3A1 ；道 5 =模擬介質(zhì)。A =非還原性條件；B =還原條件；圖12說明了與人類EP0相比EP0融合蛋白3A1的活性。圖12A顯示TF-1細(xì)胞增 殖測(cè)定中對(duì)EP0國際標(biāo)準(zhǔn)品的劑量響應(yīng)；顯示在TF-1細(xì)胞增殖測(cè)定中對(duì)AFT-EPO 3A1的劑 量響應(yīng)；圖13是顯示TF-1細(xì)胞增殖測(cè)定中對(duì)EP0國際標(biāo)準(zhǔn)品的劑量響應(yīng)的圖示；圖14是顯示TF-1細(xì)胞增殖測(cè)定中對(duì)AFT-EP0融合蛋白(3A1)的劑量響應(yīng)的圖 示；圖15是顯示與未處理的陰性對(duì)照和EP0陽性對(duì)照相比，3A1對(duì)％網(wǎng)狀細(xì)胞的影響 的圖示；圖15是顯示與未處理的陰性對(duì)照和EP0陽性對(duì)照相比，3A1對(duì)血紅蛋白計(jì)數(shù)(g/ dL)的影響的圖示。材料和方法體外檢驗(yàn)對(duì)EP0的體外生物測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的。這些測(cè)定測(cè)量EP0誘導(dǎo)的對(duì)增殖的刺激和/或表達(dá)EP0R的細(xì)胞的分化。一些測(cè)定使用骨髓作為EP0響應(yīng)細(xì)胞的來源測(cè)量紅細(xì)胞 系的集落形成。其他生物測(cè)定使用3H-胸苷測(cè)量增殖或通過測(cè)量懸浮液培養(yǎng)基中放射性鐵 向紅血蛋白的結(jié)合來測(cè)量分化。EP0響應(yīng)腫瘤細(xì)胞系(TF1細(xì)胞)或用EP0R轉(zhuǎn)化的細(xì)胞已 經(jīng)被用于檢驗(yàn)EP0激動(dòng)劑活性。體內(nèi)檢騎對(duì)促紅細(xì)胞生成素的體內(nèi)測(cè)定是本領(lǐng)域中熟知的并且是以在動(dòng)物模型例如大鼠 中通過紅細(xì)胞形成的外源EP0刺激為基礎(chǔ)的，其中紅細(xì)胞系先祖庫已經(jīng)由缺氧、出血或細(xì) 胞毒類藥物擴(kuò)展。響應(yīng)通常通過放射性鐵向脾或紅細(xì)胞的結(jié)合來測(cè)量。一種這樣的檢驗(yàn)被稱為超低氧紅細(xì)胞增多癥小鼠測(cè)定，并且是檢驗(yàn)重組EP0的工 業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(參見 Coles 等人 Nature 191 :1065，1961)。免疫檢騎測(cè)量EP0對(duì)多克隆和單克隆抗體的結(jié)合的免疫測(cè)定是本領(lǐng)域已知的。商業(yè)上可得 的EP0抗體可用于檢測(cè)樣品中的EP0并且還被用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制研究。例如，單克隆抗體可 在 http://www.ab_direct.com/index AbD Serotec 獲得。融合蛋白的重組牛產(chǎn)融合蛋白的組分由使用如下的引物的PCR產(chǎn)生被設(shè)計(jì)以退火至配體或受體并將 用于克隆的適合的限制性位點(diǎn)引入靶載體(圖8a)。用于PCR的模板包含靶基因并且從 IMAGE克隆、cDNA庫或從委托合成的基因獲得。一旦具有適當(dāng)?shù)膫?cè)翼限制性位點(diǎn)的配體和 受體基因被合成，之后這些被連接在靶載體中連接體區(qū)的任何一側(cè)(圖8b)。之后通過將委 托合成長(zhǎng)度的DNA插入連接體區(qū)任一側(cè)的兩個(gè)獨(dú)特的限制性位點(diǎn)之間，通過經(jīng)由ssDNA修 飾技術(shù)的連接體區(qū)的突變，通過將引物雙鏈體/多鏈體插入適合的限制性位點(diǎn)之間或通過 PCR修飾，將構(gòu)建體修飾以含有正確的連接體而沒有側(cè)翼限制性位點(diǎn)(圖8c)?？蛇x擇地，被設(shè)計(jì)以退火至所選擇的配體或受體結(jié)構(gòu)域的具有側(cè)翼序列的連接 體，通過產(chǎn)生寡核苷酸雙鏈體而被初始合成并且其被加工以產(chǎn)生雙鏈的DNA(圖9a)。之后 使用連接體序列作為“大引物”，即針對(duì)配體和受體的與“大引物”所退火至的末端相對(duì)的末 端設(shè)計(jì)的引物，并用配體和受體作為模板進(jìn)行PCR。末端引物被設(shè)計(jì)以具有用于連接至所選 擇的表達(dá)載體的適合的限制性位點(diǎn)(圖％)。融合蛋白的表達(dá)和純化在適當(dāng)?shù)捏w系(例如哺乳動(dòng)物CH0細(xì)胞、大腸桿菌)中進(jìn)行表達(dá)，并且其取決 于產(chǎn)生EP0融合基因的載體。之后使用不同的方法分析表達(dá)，其可包括本領(lǐng)域中熟知的 SDS-PAGE、天然PAGE、蛋白質(zhì)印跡、ELISA中的一種或多種。在75cm2瓶中培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO Flp-In細(xì)胞系約3_4天，于此點(diǎn)采集樣品用以 分析。將樣品與等體積的laemmli上樣緩沖液在25mM DTT存在或不存在的情況下混合并 且煮沸5分鐘。將樣品在15% (w/v)的雙丙烯酰胺凝膠上分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在溶于 PBS-0. 05% (v/v)吐溫20的5% (w/v)牛乳蛋白中封閉后，使用特異性抗EP0抗體與軛合 二抗的辣根過氧化物酶(HRP) —起進(jìn)行樣品檢測(cè)。通過使用HRP檢測(cè)試劑盒的對(duì)照相膠片 的化學(xué)發(fā)光來顯影；參見圖11。一旦達(dá)到適合的表達(dá)水平，就大規(guī)模表達(dá)RL融合物以產(chǎn)生足以純化并之后分析 的蛋白。使用一種或多種層析步驟的適當(dāng)組合進(jìn)行純化，所述層析步驟例如離子交換層析、疏水相互作用層析、硫酸銨沉淀、凝膠過濾、尺寸排阻和/或親和層析(使用鎳/鈷_樹脂， 固定抗體的樹脂和/或固定配體/受體的樹脂)。使用包括Bradford測(cè)定、SDS-PAGE、天 然PAGE、蛋白質(zhì)印跡、ELISA中的一種或多種的不同方法分析純化的蛋白。LR-融合物的表征變性PAGE、天然PAGE凝膠和蛋白質(zhì)印跡被用于分析融合多肽并且使用對(duì)LR融合 物非構(gòu)象敏感的抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡?？蓮募夹g(shù)諸如使用Superose G200分析柱的尺寸 排阻層析和分析性超速離心的技術(shù)獲得天然溶解狀態(tài)分子量信息。統(tǒng)計(jì)學(xué)如果兩組的方差是正態(tài)分布用學(xué)生檢驗(yàn)(Student' s test)對(duì)比，或者如果不是 正態(tài)分布用學(xué)生_薩脫斯威特檢驗(yàn)(Student-Satterthwaite ‘ s test)。用F檢驗(yàn)來檢驗(yàn) 分布。使用單因素方差分析比較3組或更多組的平均數(shù)，如果顯著的水平為p<0. 05，用鄧 奈特檢驗(yàn)進(jìn)行個(gè)體比較。所有統(tǒng)計(jì)性檢驗(yàn)兩側(cè)5%顯著水平，并且不對(duì)漏失值進(jìn)行差補(bǔ)。體外牛物測(cè)定細(xì)胞制備在體外TF-1細(xì)胞增殖模型中測(cè)定3A1的生物活性。從液氮儲(chǔ)存取出TF-1細(xì)胞 (ATCC，批號(hào)5003310)并放入37°C水浴2分鐘。之后將瓶中內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至含有9ml培養(yǎng) 基(溶于RPMI的10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉素、2ng/ mlGM-CSF)的15ml試管。將細(xì)胞于123Xg離心5分鐘；將細(xì)胞團(tuán)重懸于培養(yǎng)基中并且將細(xì) 胞密度調(diào)整至4xl04細(xì)胞/ml。細(xì)胞培養(yǎng)在C02培養(yǎng)箱(5% C02，37°C )中于培養(yǎng)基中以2xl04-5xl04細(xì)胞/ml的密度培養(yǎng) 細(xì)胞。每周進(jìn)行兩次傳代確保細(xì)胞密度不超過7xl05細(xì)胞/ml。通過錐蟲藍(lán)不相容評(píng)估細(xì) 胞活力。在測(cè)定前將細(xì)胞用PBS通過以約125xg旋轉(zhuǎn)5分鐘來清洗3次。之后將細(xì)胞團(tuán)重 構(gòu)于測(cè)定培養(yǎng)基(溶于RPMI的10% FBSU00U/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素、2mM L-谷氨 酰胺)中并將細(xì)胞密度調(diào)整至2xl05細(xì)胞/ml。標(biāo)準(zhǔn)品/樣品制備將EP0(國際標(biāo)準(zhǔn)品，NIBSC，批號(hào)88/574)在測(cè)定培養(yǎng)基中重構(gòu)至1 P g/ml (120IU/ ml)的濃度，分為100 yl等份并儲(chǔ)存于-80°C。每天測(cè)定時(shí)從冰箱取出1瓶并制備工作濃度。TF-1生物測(cè)定將50 ill的每種檢測(cè)的蛋白放入96孔微板的適當(dāng)?shù)目字?。之后加?0 u 1的細(xì) 胞懸浮液并且將板溫和振蕩以允許細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)品/樣品混合。對(duì)照孔僅含有測(cè)定培養(yǎng)基和 細(xì)胞懸浮液(50iil+50ia)并且空白孔僅有測(cè)定培養(yǎng)基(100 ill)。在C02培養(yǎng)箱(5% co2， 37 °C )中將細(xì)胞暴露于不同濃度的檢測(cè)蛋白72小時(shí)，并且之后向每孔加入10 yl的MTT。 孵育(5% C02，37°C )4小時(shí)后加入增溶緩沖液(10(^1/孔)，并且將板在C02培養(yǎng)箱中靜 置過夜。之后于570nm和650nm(參考)讀取吸光率。結(jié)果計(jì)算使用具有下列轉(zhuǎn)換的Gen5軟件分析所有原始數(shù)據(jù)1.從于570nm獲得的結(jié)果減去來自參考(650nm)的結(jié)果
2.之后從暴露于不同濃度的檢測(cè)蛋白的細(xì)胞獲得的結(jié)果減去從對(duì)照獲得的結(jié)果3.將從步驟2獲得的結(jié)果作圖為0D/0Dmax(% )的比以各自的劑量響應(yīng)曲線(對(duì)數(shù)，4參數(shù))為基礎(chǔ)，計(jì)算每種蛋白的EC5Q (產(chǎn)生最大 響應(yīng)的50%的濃度)的值。體內(nèi)牛物測(cè)定如下文所詳述的在Normocythaemic小鼠模型中檢測(cè)EP0-LR融合蛋白(3A1)。 Normocythaemic小鼠模型是以在小鼠中對(duì)網(wǎng)狀細(xì)胞產(chǎn)生的刺激的測(cè)量為基礎(chǔ)的。此外，該 模型可被用于檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素(EP0)或其EP0模擬蛋白的生物學(xué)活性。動(dòng)物類型32 B6D2Fl/01aHsd小鼠，雌性，研究開始時(shí)6-9周大。每個(gè)處理使用4只小鼠。動(dòng)物來源于來 自HarlanWinkelmann GmbH的可控的全屏障的維持繁育系統(tǒng)(SPF)。測(cè)定步驟開始時(shí)，將小鼠隨機(jī)分配為每籠4只小鼠。將這些動(dòng)物通過尾部圖色(每 籠一個(gè)標(biāo)記)加以標(biāo)記以便鑒別。將動(dòng)物用0. 5mL的適當(dāng)?shù)奶幚?每籠一種溶液)皮下注 射并放入新的籠中。以裝有處理小鼠的每籠含有每種不同處理的一只小鼠的方式組合小 鼠。注射后四天，從尾部靜脈收集血液并且通過流式細(xì)胞儀測(cè)定網(wǎng)狀細(xì)胞的數(shù)目。實(shí)施例1以IMAGE克隆獲得EP0基因并且亞克隆至表達(dá)載體pET21a+ (用于大腸桿菌表達(dá)) 和pSecTag(用于哺乳動(dòng)物表達(dá))中。PCR被用于產(chǎn)生含有側(cè)翼有用于向載體插入的適合的 限制性位點(diǎn)的EP0基因的DNA。對(duì)于細(xì)菌表達(dá)來說，所使用的引物是用于組氨酸標(biāo)簽的蛋白的NdeEP0F(5，-aatta attcatatggccccaccacgcctcatctg-3，)和 EP0XhoR(5，-aattctcgagtctgtcccctgtcctgcag-3，)以及用于未標(biāo)簽的蛋白的 NdeEPOF 和 EP0*XhoR (5，-aattctcgagctatctgtcccctgtcctgc ag-3，)。之后將PCR產(chǎn)物連接于pET21a+中的Ndel和Xhol位點(diǎn)之間。所得的克隆通過測(cè) 序確認(rèn)。在用pET21a+EP0+/_His質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3) RIPL細(xì)胞中進(jìn)行來自大 腸桿菌的EP0的表達(dá)。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并且通過使用抗EP0的抗體的蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)(圖 2X)。對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)來說，所使用的引物是NheEPOF ( 5 '-aaatttgctagccac catgggggtgcacgaatgtcctg-3 ‘)禾口 epo*H3R (5 ‘-aattaagcttctatctgtcccctgtcctgca g-3 ‘)。
之后將PCR產(chǎn)物連接于pSecTag中的Nhel和Hindlll位點(diǎn)之間。實(shí)施例2EP0R是委托合成的基因/獲得自胎兒肝臟cDNA文庫并且被亞克隆至表達(dá)載體 pET21a+(用于大腸桿菌表達(dá))和pSecTag(用于哺乳動(dòng)物表達(dá))中。PCR被用于產(chǎn)生含有 側(cè)翼有用于向載體插入的適合的限制性位點(diǎn)的EP0基因的DNA。對(duì)于細(xì)菌表達(dá)來說，所使用的引物是用于組氨酸標(biāo)簽的蛋白的NdeE PORFor (5' -gcgcataCATATGgcgcccccgcctaacctccc-3')禾口 EP0RXhoRev2(5‘ -g cgcCTCGAGCGTCAGCAGCGACACAGGCT-3，)以及用于未標(biāo)簽的蛋白的 NdeEPOF 和 EP0R*XhoRev2 ( 5'-gcgcCTCGAGtcaCGTCAGCAGCGACACAGGCT -3，)。之后
將PCR產(chǎn)物連接于pET21a+中的Ndel和Xhol位點(diǎn)之間。所得的克隆通過測(cè)序確認(rèn)。對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)來說，所使用的引物是NheEPORFor (5，-gcgcGCTAGCcaccatggaccacctcggggcgtc-3，)和 EP0RHindRev2(5， -gcgcAAGCTTtcaCGTCAGCAGCGACACAGGCT-3，)。 之后將PCR產(chǎn)物連接于pSecTag中的Nhel和Hindlll位點(diǎn)之間。實(shí)施例3通過將下列三個(gè)寡核苷酸一起退火以形成寡核苷酸的多鏈體來合成在一個(gè)末端 具有與EP0互補(bǔ)的側(cè)翼序列而在另一個(gè)末端具有與EP0R互補(bǔ)的側(cè)翼序列的(G4S)3連接體 EP01ink3F(5，-aggtagtggtggcggaggtagcggtggcgg-3，)、EP01ink3Rl (5，-gggaggttaggcgg gggcgcagaacctccgccaccgctacc-3，)和 EP01 ink3R2 (5，-tccgccaccactacctccgccacctctgtc ccctgtcctgcag-3')。這一多鏈體之后被加工以產(chǎn)生可被用作PCR中的引物的雙鏈DNA。之后用弓丨物 BamNheEPOFor (5，-aaatttggatccgctagccaccatgggggtgcacgaatgtcct g-3，)、EP0RHindRev2 (5，-gcgcAAGCTTtcaCGTCAGCAGCGACACAGGCT_3，)和之前產(chǎn)生的連接體 “大引物”以及作為模板的EP0和EP0R進(jìn)行PCR。這產(chǎn)生側(cè)翼有用于連接至哺乳動(dòng)物表達(dá) 載體pSecTag中的適合的限制性位點(diǎn)(Nhel和Hindlll)和用于連接至噬菌體載體M13mpl8 中的適合的限制性位點(diǎn)(BamHI和Hindlll)的EP0-(G4S) 3_EP0rEC基因。對(duì)于細(xì)菌表達(dá)來說，通過使用引物NdeEP0F(5，-aattaattcatatggccccacc acgcctcatctg-3，)禾口 EP0R*XhoRev2 ( 5，-gcgcCTCGAGtcaCGTCAGCAGC GACACAGGCT -3')的 PCR 用 Ndel 和 *XhoI 側(cè)翼區(qū)產(chǎn)生 EP0-(G4S)3-EP0rEC 基因。之 后其被連接至pET21a+。實(shí)施例4圖11說明EP0受體融合蛋白的兩個(gè)實(shí)例3A1和3B2的表達(dá)和檢測(cè)。3A1和3B2都 運(yùn)行在75和lOOkDa之間。如對(duì)糖基化蛋白所預(yù)期的EP0運(yùn)行在37和45kDa之間。與人類EP0相比測(cè)定3A1的生物活性并且說明于圖12、13和14中。實(shí)施例5對(duì)3A1所檢測(cè)的劑量范圍是從每kg動(dòng)物體重2. 5至150ug(與標(biāo)準(zhǔn)EP0相等的質(zhì) 量)。圖15和16顯示給藥4天之后3A1對(duì)網(wǎng)狀細(xì)胞和血紅蛋白的體內(nèi)活性。
權(quán)利要求
一種核酸分子，包含編碼具有促紅細(xì)胞生成素活性的多肽的核酸序列，其中所述多肽包含與促紅細(xì)胞生成素受體的促紅細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接或間接連接的促紅細(xì)胞生成素或者其部分。
2.一種融合多肽，包含與促紅細(xì)胞生成素受體的促紅細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接或 間接連接的促紅細(xì)胞生成素或其活性結(jié)合部分的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的融合多肽，其中促紅細(xì)胞生成素通過肽連結(jié)體與促紅細(xì)胞生成 素受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。
4.如權(quán)利要求2所述的融合多肽，其中所述肽連接分子包含至少一個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser。
5.如權(quán)利要求4所述的融合多肽，其中所述肽連接分子包含2、3、4、5或6個(gè)拷貝的肽 Gly Gly Gly Gly Ser。
6.如權(quán)利要求5所述的融合多肽，其中分子由3個(gè)拷貝的肽GlyGlyGly Gly Ser組成。
7.如權(quán)利要求5所述的融合多肽，其中所述肽連接分子由4個(gè)拷貝的肽GlyGly Gly Gly Ser 組成。
8.如權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽不包含肽連接分子，而是 促紅細(xì)胞生成素和促紅細(xì)胞生成素受體的促紅細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的直接融合物。
9.一種核酸分子，包含選自下列的核酸序列i)如SEQID NO 1中所表示的核酸序列；ii)如SEQID NO 3中所表示的核酸序列；iii)如SEQID NO 5中所表示的核酸序列；iv)如SEQID NO 7中所表示的核酸序列；或v)包含在嚴(yán)格雜交條件下與SEQID NO :1、3、5或7雜交并且編碼具有促紅細(xì)胞生成 素受體調(diào)節(jié)活性的多肽的核酸序列的核酸分子。
10.如權(quán)利要求9所述的核酸分子，其中所述多肽是激動(dòng)劑。
11.如權(quán)利要求9所述的核酸分子，其中所述多肽是拮抗劑。
12.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 1中所表示的核酸序列。
13.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 3中所表示的核酸序列。
14.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 5中所表示的核酸序列。
15.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 7中所表示的核酸序列。
16.一種多肽，由如權(quán)利要求1或9-15中任一項(xiàng)所述的核酸編碼。
17.一種多肽，包含選自下列的氨基酸序列i)如SEQID NO 2中所表示的氨基酸序列；ii)如SEQID NO 4中所表示的氨基酸序列；iii)如SEQID NO 6中所表示的氨基酸序列；iv)如SEQID NO 8中所表示的氨基酸序列；v)如SEQID NO 17中所表示的氨基酸序列；vi)如SEQID NO 18中所表示的氨基酸序列；或 其中所述多肽具有促紅細(xì)胞生成素受體調(diào)節(jié)活性。
18.如權(quán)利要求17所述的多肽，其中所述多肽是激動(dòng)劑。
19.如權(quán)利要求17所述的多肽，其中所述多肽是拮抗劑。
20.一種多肽，包含如SEQ ID NO :2中所表示的氨基酸序列。
21.一種多肽，包含如SEQ ID NO :4中所表示的氨基酸序列。
22.—種多肽，包含如SEQ ID NO :6中所表示的氨基酸序列。
23.一種多肽，包含如SEQ ID NO :8中所表示的氨基酸序列。
24.—種多肽，包含如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸序列。
25.一種多肽，包含如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸序列。
26.一種同型二聚體，由兩個(gè)多肽組成，其中所述多肽中的每一個(gè)包含i)包含促紅細(xì)胞生成素或其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一部分，任選地通過肽連接分子連接至ii)包含促紅細(xì)胞生成素受體的至少一個(gè)促紅細(xì)胞生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二部分。
27.如權(quán)利要求26所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :2。
28.如權(quán)利要求26所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :4。
29.如權(quán)利要求26所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :6。
30.如權(quán)利要求26所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :8。
31.如權(quán)利要求26所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :17。
32.如權(quán)利要求26所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :18。
33.一種載體，包含如權(quán)利要求1或9-15所述的核酸分子。
34.一種細(xì)胞，用如權(quán)利要求1或9-15中任一項(xiàng)所述的核酸分子或如權(quán)利要求33所述 的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。
35.如權(quán)利要求34所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求34所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
37.一種藥物組合物，包含如權(quán)利要求2-8或16或17-25中任一項(xiàng)所述的多肽，包含賦 形劑或載體。
38.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中所述組合物與另外的治療劑組合。
39.一種治療患有從促紅細(xì)胞生成素激動(dòng)劑的施用受益的病況的人類受治療者的方 法，包括施用有效的量的至少一種如權(quán)利要求2-8或16或17-25中任一項(xiàng)所述的多肽。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述病況是貧血。
41.如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述病況是由慢性腎臟疾病導(dǎo)致的貧血。
42.如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述病況是由癌的治療中的化學(xué)治療所導(dǎo)致 的貧血。
43.如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述病況是由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中的化 學(xué)治療所導(dǎo)致的貧血。
44.如權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述病況是由AIDS的治療中的化學(xué)治療所 導(dǎo)致的貧血。
45.如權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽被靜脈內(nèi)施用。
46.如權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽被皮下施用。
47.如權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以兩天的間隔被施用。
48.如權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽每隔一個(gè)星期被施用。
49.如權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽每隔兩個(gè)星期被施用。
50.如權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽每隔一個(gè)月被施用。
51.如權(quán)利要求2-8或16或17-25中任一項(xiàng)所述的多肽在制備用于治療貧血的藥物中 的用途。
52.一種單克隆抗體，結(jié)合如權(quán)利要求2-8、16、17-25或26-32中任一項(xiàng)所述的多肽或二聚體。
53.如權(quán)利要求52所述的單克隆抗體，其中所述抗體結(jié)合所述多肽或二聚體但沒有個(gè) 別地特異性結(jié)合促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素受體。
54.一種制備產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法，包括下列步驟i)使用含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽或其片段的免疫原使免疫活性的哺乳動(dòng)物免疫；ii)將所述免疫的免疫活性的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞；iii)根據(jù)對(duì)(i)的多肽的結(jié)合活性篩選通過步驟(ii)的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體；iv)培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞以增殖和/或分泌所述單克隆抗體；以及v)從培養(yǎng)上清液獲得所述單克隆抗體。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是小鼠或大鼠。
56.一種雜交瘤細(xì)胞系，通過如權(quán)利要求54或55所述的方法獲得或可獲得。
57.一種診斷檢驗(yàn)，以在生物樣品中檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的多肽，包括i)提供有待檢驗(yàn)的分離的樣品；ii)將所述樣品與結(jié)合如權(quán)利要求2-8、16和17-25中任一項(xiàng)所述的多肽的配體接觸；以及iii)檢測(cè)所述樣品中所述配體的結(jié)合。
58.如權(quán)利要求57所述的檢驗(yàn)，其中所述配體是抗體。
59.如權(quán)利要求58所述的檢驗(yàn)，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本公開涉及促紅細(xì)胞生成素(EPO)融合多肽；編碼所述多肽的核酸分子和使用所述多肽治療的方法。
文檔編號(hào)A61K38/18GK101878224SQ200880110331
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2008年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日
發(fā)明者喬恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·羅斯 申請(qǐng)人:埃斯特瑞恩有限公司