專利名稱：治療肺癌、特別是非小肺癌(nsclc)的組合物的制作方法
治療肺癌、特別是非小肺癌(NSCLC)的組合物 本發(fā)明涉及活性(免疫刺激性)組合物，其包括至少一種RNA，優(yōu)選mRNA，其編碼 至少兩種(優(yōu)選不同的)能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)的抗原。本發(fā)明還涉 及包括所述活性(免疫刺激性)組合物的疫苗，涉及所述活性(免疫刺激性)組合物(用 于制備疫苗)的應(yīng)用和/或所述疫苗用于引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)以用于治療肺癌、特別 是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、或與其相關(guān)的病癥的應(yīng)用，所述肺癌優(yōu)選選自三種主要亞型的鱗 狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。最后，本發(fā)明涉及包含所述活性(免疫刺激性)組合物和 /或所述疫苗的試劑盒，特別是多部件的試劑盒。在所有的惡性腫瘤中，有25%為支氣管癌(肺癌)。在全世界范圍內(nèi)，這是男性中 最常見的癌癥相關(guān)的死亡原因，女性中第二常見的癌癥相關(guān)的死亡原因。在德國(guó)，它是排在 前列腺癌(carcinoma of the prostata)和結(jié)腸直腸癌之后的第三大類最多的癌癥。它每 年在世界范圍內(nèi)引起130萬(wàn)例死亡。在中歐，發(fā)病率為約60人/100. 000名居民，并且最近 診斷患有肺癌的人數(shù)穩(wěn)步上升(在德國(guó)，目前為約50. 000/年)，當(dāng)診斷患有肺癌時(shí)，平均 總共5年的存活率僅為5%。此外，每名個(gè)別患者的生命預(yù)期完全取決于疾病階段(TMN分 類)和患有的癌癥(肺癌)的亞型(見下文)。由在顯微鏡下鑒定的惡性細(xì)胞的尺寸和外觀分類的肺癌的主要亞型為小細(xì)胞肺 癌(20% )和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) (80% )0盡管是基于單純的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，但是這種分 類對(duì)于疾病的臨床管理和預(yù)后具有非常重要的意義，其中小細(xì)胞肺癌通常通過(guò)化療進(jìn)行治 療，而非小細(xì)胞肺癌主要進(jìn)行手術(shù)作為一線治療。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)分組在一起，是因?yàn)樗鼈兊念A(yù)后和管理大致相同。存在三 種主要的亞型鱗狀細(xì)胞肺癌，腺癌和大細(xì)胞肺癌。手術(shù)是主要的治療，然而，僅有四分之 一的患者進(jìn)行了成功的切除，具有50%的復(fù)發(fā)率。晚期疾病的治療方法包括一一在手術(shù) 后一一輔助的化療和/或輔助的放療，而化療作為單一治療(一線治療)似乎是與相對(duì)較 差的結(jié)果相關(guān)的方法。在四種常用的組合化療方案的比較中，沒(méi)有一種是優(yōu)越的。響應(yīng)率 從15%到22%變化，1年的存活率為31% -36% (參見，例如，0' Mahony, D.，S. Kummar, 等· (2005). “ Non-small-cell lung cancer vaccine therapy :aconcise review.(非小 細(xì)胞肺癌疫苗治療簡(jiǎn)短綜述)"J Clin Oncol (臨床腫瘤學(xué)雜志)23 (35) :9022_8)。因 此，即使手術(shù)前的化療似乎尚未導(dǎo)致生命預(yù)期的延長(zhǎng)，但是輔助的化療一一還包括如果與 放療組合一一沒(méi)有顯示出生命預(yù)期的顯著增加。當(dāng)前所用的一種化療方法是組合基于鉬的物質(zhì)與例如吉西他濱(Gemcitabin)甚 至作為一線治療，而例如培美曲塞用作二線治療。用于NSCLC治療的另一選擇是所謂的“靶向治療”，其試圖通過(guò)在分子水平上影響 腫瘤特異性靶標(biāo)結(jié)構(gòu)而提高經(jīng)典細(xì)胞毒性化療的成功性。所用的物質(zhì)包括貝伐單抗(血管 生成抑制劑)或厄洛替尼，其目的在于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的酪氨酸激酶。即使無(wú)疑在當(dāng)前的肺癌、特別是NSCLC的治療方法處理中存在一些提高，但是由 于高死亡率，對(duì)于其它、備選的或改進(jìn)的治療方法的強(qiáng)烈需求仍然是一場(chǎng)艱難的戰(zhàn)斗。因此，本文建議在NSCLC治療方法中應(yīng)用免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)在多種疾病的治療和預(yù)防中起著重要的作用。按照目前的知識(shí)水平，哺乳動(dòng)物提供了多種機(jī)制通過(guò)識(shí)別和殺 死例如腫瘤細(xì)胞來(lái)保護(hù)生物體。這些腫瘤細(xì)胞必須檢測(cè)到并且與生物體的正常細(xì)胞和組織 區(qū)別開來(lái)。脊椎動(dòng)物如人的免疫系統(tǒng)由多種類型的蛋白、細(xì)胞、器官、和組織組成，其以精細(xì) 的和動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)相互作用。作為該種更復(fù)雜的免疫反應(yīng)的部分，脊椎動(dòng)物系統(tǒng)隨時(shí)間適應(yīng) 更有效地識(shí)別特定病原體或腫瘤細(xì)胞。適應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生免疫學(xué)記憶，并且允許在將來(lái)相遇過(guò) 程中甚至更有效的保護(hù)。該適應(yīng)性或獲得性免疫性過(guò)程形成接種策略的基礎(chǔ)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)是抗原特異性的，并且需要在稱為抗原呈遞的過(guò)程中識(shí)別特定的 “自體”或“非自體”抗原?？乖禺愋栽试S產(chǎn)生專門針對(duì)特定病原體或病原體-感染細(xì)胞 或腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)。固定這些專門反應(yīng)的能力在體內(nèi)通過(guò)所謂的“記憶細(xì)胞”保持。如果 病原體不止一次感染機(jī)體，則這些特異性記憶細(xì)胞用來(lái)快速清除其。因此，適應(yīng)性免疫系統(tǒng) 允許更強(qiáng)的免疫反應(yīng)以及允許免疫學(xué)記憶，其中每種病原體或腫瘤細(xì)胞被一種或多種特征 抗原“記住”。脊椎動(dòng)物中適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要成分在細(xì)胞水平主要包括淋巴細(xì)胞，在分子水 平主要包括抗體。淋巴細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分包括B細(xì)胞和T細(xì)胞，其來(lái)源 于骨髓中的造血干細(xì)胞。B細(xì)胞參與體液反應(yīng)，而T細(xì)胞參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。B細(xì)胞 和T細(xì)胞攜帶識(shí)別特定靶標(biāo)的受體分子。僅在抗原(例如，病原體的小片段)已經(jīng)被處理 且與稱為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的“自我”受體組合呈遞后，T細(xì)胞識(shí)別“非自 我”靶標(biāo)，如致病性靶標(biāo)結(jié)構(gòu)。相反，B細(xì)胞抗原特異性受體是在B細(xì)胞表面上的抗體分子， 并且當(dāng)其表面上的抗體與特異性外源抗原結(jié)合時(shí)，識(shí)別這樣的病原體。該抗原/抗體復(fù)合 體被B細(xì)胞吸收，并且通過(guò)蛋白質(zhì)水解作用處理成肽。然后，B細(xì)胞在其表面II類MHC分 子上展示這些抗原肽。MHC和抗原的這種組合吸引匹配的輔助T細(xì)胞，其釋放淋巴因子并且 激活B細(xì)胞。因?yàn)榛罨腂細(xì)胞然后開始分化，其后代分泌數(shù)百萬(wàn)拷貝的識(shí)別該抗原的抗 體。這些抗體在血漿和淋巴中循環(huán)，結(jié)合病原體或表達(dá)所述抗原的腫瘤細(xì)胞，并且將它們標(biāo) 記，用以通過(guò)補(bǔ)體激活進(jìn)行分解或用以通過(guò)吞噬細(xì)胞吸收和分解。作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞成分，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)可以形成CTL-反應(yīng)。細(xì) 胞毒性T細(xì)胞(CD8+)可以識(shí)別來(lái)自內(nèi)源性病原體的肽和由I型MHC分子結(jié)合的自體抗原。 CD8+-T細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性蛋白而行使它們的殺傷功能。免疫系統(tǒng)機(jī)制形成有療效的治療的靶標(biāo)。適當(dāng)?shù)姆椒ǖ湫偷鼗谑┯米魟?，以?發(fā)先天性免疫反應(yīng)，或者基于施用抗原或免疫原，以激發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。由于抗原典型地 是基于病原體(例如，表面蛋白)或其片段的特定成分，所以還考慮向患者施用核酸然后其 表達(dá)需要的多肽、蛋白或抗原。迄今為止引發(fā)免疫反應(yīng)，免疫或接種的常規(guī)方法是基于DNA分子的應(yīng)用，以將需 要的遺傳信息結(jié)合到細(xì)胞中。已經(jīng)開發(fā)了多種方法，用以將DNA引入到細(xì)胞中，如磷酸鈣轉(zhuǎn) 染，聚戊二烯轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合，電穿孔，顯微注射和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，已經(jīng)特別證明脂質(zhì)轉(zhuǎn)染 法是合適的方法。DNA病毒可以同樣用作DNA賦形劑。由于它們的感染特性，所述病毒實(shí) 現(xiàn)非常高的轉(zhuǎn)染率。所用的病毒以這樣的方式進(jìn)行遺傳修飾，以致在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中不形成功 能性感染顆粒。然而，盡管有這些防范，不可能排除所引入的基因和病毒基因的不可控的繁 殖的風(fēng)險(xiǎn)，這是例如由于潛在的重組事件引起。這還伴隨著例如通過(guò)重組DNA被插入到宿主細(xì)胞基因組的完整基因中的危險(xiǎn)，產(chǎn)生這樣的后果，即，該基因可能突變，并且因此完全 或部分失活，或者可能產(chǎn)生錯(cuò)誤信息。換言之，對(duì)細(xì)胞至關(guān)重要的基因產(chǎn)物的合成完全被抑 制，或者備選地表達(dá)修飾的或錯(cuò)誤的基因產(chǎn)物。如果DNA整合到參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的基因 中，則發(fā)生一種特別的危險(xiǎn)。在該情形中，宿主細(xì)胞可能變成退化的，并且導(dǎo)致癌癥或腫瘤 形成。此外，如果引入到細(xì)胞中的DNA將被表達(dá)，則相對(duì)應(yīng)的DNA賦形劑需要包含強(qiáng)啟動(dòng)子， 如病毒CMV啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子整合到治療的細(xì)胞的基因組中可以在細(xì)胞中導(dǎo)致基因表達(dá) 調(diào)控的不需要的改變。使用DNA作為誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的試劑(例如，作為疫苗)的另一種危 險(xiǎn)是在已經(jīng)引入了外源DNA的患者中誘導(dǎo)致病性抗-DNA抗體，因此導(dǎo)致(可能致死性)的 免疫反應(yīng)。因此，綜上所述，對(duì)于有效的系統(tǒng)存在空間和需求，所述有效的系統(tǒng)可以用來(lái)有效 地刺激免疫系統(tǒng)，以允許治療肺癌，特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，同時(shí)避免由于基于DNA 的組合物引起的所引入的基因的不可控增殖的問(wèn)題。因此，本發(fā)明的目的是提供一種組合物，其a)允許通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)治療肺癌， 同時(shí)b)避免上述提及的缺點(diǎn)。這一目的由本發(fā)明的主題解決，特別是由活性(免疫刺激性)組合物解決，所述活 性(免疫刺激性)組合物包括至少一種RNA，其編碼選自包括下列抗原的組的至少兩種(優(yōu) 選不同的)抗原· hTERT，‘ WTl,· MAGE-A2,· 5T4,· MAGE-A3,‘ MUCl,· Her-2/neu,· NY-ESO-1，· CEA， 存活蛋白，· MAGE-Cl，和/ 或·ΜΑ6Ε-C2。令人吃驚地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)前文提及的組的至少兩種抗原、抗原性蛋白或抗原性肽的 特定組合，被包含在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中，能夠有效地刺激(適應(yīng) 性)免疫系統(tǒng)，以允許治療肺癌，特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。在本文中，術(shù)語(yǔ)抗原、抗原 性蛋白或抗原性肽可以同義使用。在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性) 組合物還應(yīng)該理解為一種組合物，其能夠引發(fā)免疫反應(yīng)，優(yōu)選是本文定義的適應(yīng)性免疫反 應(yīng)，這是由于所述活性(免疫刺激性)組合物的成分所包含或所編碼的成分之一引起，優(yōu)選 是由編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的至少一種RNA，優(yōu)選是(m)RNA引起。所述活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA可以編碼hTERT。在本發(fā)明的 上下文中，“hTERT”是人端粒末端轉(zhuǎn)移酶反轉(zhuǎn)錄酶，并且編碼“hTERT”的RNA、優(yōu)選mRNA 的優(yōu)選序列一一如果用于本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中一一顯示在圖7中(SEQ ID N0:7)，并且——甚至更優(yōu)選地，顯示在圖8中(SEQ ID NO :8)。Minev, Hipp 等.(2000)描述了端粒末端轉(zhuǎn)移酶是一種核糖核蛋白酶，其已經(jīng)與人細(xì)胞中的惡性轉(zhuǎn)化相 聯(lián)系(Minev, B. , J. Hipp,等，(2000). “ Cytotoxic T cell immunity againsttelomerase reverse transcriptase in humans.(針對(duì)人中端粒末端轉(zhuǎn)移酶反轉(zhuǎn)錄酶的細(xì)胞毒性T細(xì) 胞免疫性)〃 Proc Natl Acad Sci USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))97 (9) :4796_801)。在非 常大部分的人腫瘤中，端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性升高，使得其基因產(chǎn)物成為所有人腫瘤最常見 的分子。因此，內(nèi)源性加工的與I類MHC分子結(jié)合的端粒末端轉(zhuǎn)移酶肽的產(chǎn)生可能使細(xì)胞 毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)靶向不同來(lái)源的腫瘤。因此，根據(jù)它們，這可能促進(jìn)針對(duì)癌癥的疫苗 治療，條件是在正常成人和癌癥患者中識(shí)別端粒末端轉(zhuǎn)移酶肽的前體CTL可以通過(guò)免疫擴(kuò) 充。他們還證明，在體外針對(duì)來(lái)自端粒末端轉(zhuǎn)移酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTRT)的兩種HLA-A2. 1限制 性肽免疫的大部分正常個(gè)體和患有前列腺癌的患者發(fā)展了 hTRT-特異性的CTL。Carpenter 禾口Vonderheide (2006) (Carpenter,Ε· L.禾口R. H. Vonderheide(2006) ； “ Telomerase-based immunotherapy of cancer (基于端粒末端轉(zhuǎn)移酶的癌癥免疫治療).“Expert Opin Biol Ther (生物學(xué)治療的專家觀點(diǎn))6 (10) :1031_9)報(bào)道了從1997年克隆人端粒末端轉(zhuǎn)移酶反 轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)到hTERT作為抗腫瘤免疫治療靶標(biāo)的第一次臨床試驗(yàn)的進(jìn)展已經(jīng)是迅速 的。hTERT在大部分人癌癥中是過(guò)量表達(dá)的，而其在正常的成人組織中具有有限的表達(dá)。其 在腫瘤形成中起著重要作用，并且可以由癌癥干細(xì)胞表達(dá)。然而，盡管是自體抗原，hTERT在 體外和體內(nèi)均是免疫原性的。已經(jīng)在患有乳腺癌、前列腺癌、肺癌和其它癌癥的患者中完成 了一些I期hTERT免疫治療研究，并且臨床和免疫學(xué)結(jié)果是令人鼓舞的。在不存在臨床毒 性的條件下，免疫治療誘導(dǎo)患者中的功能性抗腫瘤T細(xì)胞。對(duì)于基于hTERT的治療，還可以 考慮作為免疫預(yù)防策略而接種個(gè)體的時(shí)機(jī)。Nair，S. K.和Heiser等，(2000)描述了在用 轉(zhuǎn)導(dǎo)了鼠TERT RNA的樹突細(xì)胞接種的小鼠中誘導(dǎo)了抗鼠TERT免疫性(參見Nair，S. K.， A. Heiser,等，(2000). “ Induction of cytotoxic T cell responses and tumor immunity against unrelatedtumors using telomerase reverse transcriptase RNA transfected dendritic cells.(使用端粒末端轉(zhuǎn)移酶反轉(zhuǎn)錄酶RNA轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞反應(yīng)和針對(duì)不相關(guān)的腫瘤的腫瘤免疫性)"Nat Med(自然醫(yī)學(xué))6(9) :1011-7·)。按照 優(yōu)選實(shí)施方案，因此，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以編碼選自如 圖7所示(SEQ ID N0:7)，且——更優(yōu)選地圖8所示(SEQ ID NO 8)的序列的hTERT抗原。 按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以備選地 或另外編碼選自下列各項(xiàng)的hTERT抗原如圖7所示(SEQ ID NO 7)，且一一更優(yōu)選地圖 8所示(SEQ ID NO 8)的hTERT序列的片段、變體或表位。 所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼WT1。在本發(fā)明的 上下文中，“WT1 ”是維爾姆斯瘤1，并且優(yōu)選的編碼“WT1 ”的RNA序列、優(yōu)選mRNA序列一一如 果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中顯示在圖9中(SEQ ID N0:9)，更 優(yōu)選顯示在

圖10中(SEQ ID NO 10)，并且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖11中(SEQ ID NO 11)。Oka, Y. Α.和Tsuboi等，(2004)發(fā)現(xiàn)維爾姆斯瘤蛋白在肺癌中過(guò)量表達(dá)(參見Oka， Y.,A. Tsuboi,等，(2004) · “ Induction of WTl(Wilms‘ tumorgene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WTl peptide vaccine and theresultant cancer regression. (iM 過(guò)WTl肽疫苗誘導(dǎo)WTl (維爾姆斯瘤基因)-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和所獲得的癌癥衰退)〃 Proc Natl Acad Sci USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))101 (38) 13885-90)。Oka 等，(2004，同前所述)用來(lái)源于WTl的肽接種了 10名肺癌患者。他們可表明，臨床反應(yīng)與抗腫 瘤CD8+T細(xì)胞活性相關(guān)。維爾姆斯瘤基因WTl在白血病和多種類型的實(shí)體瘤中過(guò)量表達(dá)，并 且證明WTl蛋白是針對(duì)這些惡性腫瘤的免疫治療的令人感興趣的靶標(biāo)抗原。Oka等，(2004， 同前所述)報(bào)道了基于WTl肽的免疫治療用于患有乳腺癌或肺癌、脊髓發(fā)育不良綜合征、或 急性骨髓性白血病的患者的I期臨床研究的結(jié)果。對(duì)于可以評(píng)估WTl接種功效的20名患 者中有12名表現(xiàn)出臨床響應(yīng)，如白血病母細(xì)胞或腫瘤尺寸和/或腫瘤標(biāo)記的減少。在WTl 接種后的WTl-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的頻率和臨床響應(yīng)的增加之間觀察到明顯的相 關(guān)性。因此，證明WTl接種可能誘導(dǎo)WTl-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，并且導(dǎo)致癌癥衰退， 而不損傷正常組織。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種 RNA可以因此編碼選自如圖9 (SEQ ID NO 9)所示，且-更優(yōu)選地，如圖10 (SEQ ID NO 10) 所示且甚至更優(yōu)選地如圖11 (SEQ ID NO :11)所示的序列的WTl抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施 方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以備選地或另外地編碼選自 下列各項(xiàng)的WTl抗原如圖9 (SEQ ID NO 9)所示，且-更優(yōu)選地，如圖10 (SEQ ID NO 10) 所示，且甚至更優(yōu)選地如圖11(SEQ ID N0:11)所示的WTl序列的片段、變體或表位。所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼MAGE-A2。在本 發(fā)明上下文中，“MAGE-A2”是黑素瘤抗原家族A，2B,并且優(yōu)選的編碼“MAGE-A2”的RNA序 列、優(yōu)選是mRNA序列一一如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中一一顯 示在圖14(SEQ ID N0:14)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖15(SEQ ID N0:15)中。 Gillespie和 Coleman(1999) (Gillespie，A.M.和 R. Ε· Coleman(1999). “ The potentialof melanoma antigen expression in cancer therapy.(黑素瘤抗原表達(dá)在癌癥治療中的潛 力)"Cancer Treat Rev (癌癥治療綜述)25 (4) :219_27)報(bào)道了在膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸 直腸癌、胃癌、頭頸癌、肺癌、上頌骨癌、黑素瘤、食管癌、骨肉瘤、和卵巢癌中的表達(dá)。按照優(yōu) 選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以因此編碼選自如圖 14 (SEQ ID NO 14)所示，且-更優(yōu)選地，如圖15 (SEQ ID NO 15)所示的序列的MAGE-A2抗 原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以另 外或者備選地編碼選自下列各項(xiàng)的MAGE-A2抗原如圖14(SEQ ID NO 14)所示，且-更優(yōu) 選地，如圖15(SEQ ID NO 15)所示的MAGE-A2序列的片段、變體或表位。所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼5T4。在本發(fā)明 的上下文中，“5T4”是滋養(yǎng)層糖蛋白，并且優(yōu)選的編碼“5T4”的RNA序列，優(yōu)選是mRNA序
列--------如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中一一顯示在圖3 (SEQ ID
NO 3)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖 4(SEQ ID NO 4)中。Harrop，Connolly 等，(2006) 報(bào)道了人癌胚抗原5T4是一種72-kDa的富含亮氨酸的膜糖蛋白，其以高水平表達(dá)在胎盤 上，并且還表達(dá)在寬范圍的人癌癥上，包括結(jié)腸直腸癌、胃癌、腎癌、和卵巢癌，但是在正常 組織中很少表達(dá)(參見Harrop，R.，N. Connolly，等，(2006). “ Vaccination of colorectal cancer patients with modified VacciniaAnkara delivering the tumor antigen 5T4 (TroVax) induces immune responseswhich correlate with disease control -.a phase I/II trial.(用遞送腫瘤抗原5T4 (TroVax)的改良安卡拉疫苗(Vaccinia Ankara) 接種結(jié)腸直腸癌患者誘導(dǎo)與疾病控制相關(guān)的免疫反應(yīng)I/II期試驗(yàn))"Clin CancerRes (臨床癌癥研究)12 (11 Ptl) :3416-24)。5T4的過(guò)量表達(dá)與患有結(jié)腸直腸癌、胃癌和卵巢癌的患者的較差的預(yù)后相關(guān)。盡管所述組合因素，在TroVax免疫后，在大部分患者(17 名中有16名；94%)中誘導(dǎo)了 5T4-特異性細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)，與多種其它癌癥免疫 治療實(shí)驗(yàn)相比較，認(rèn)為其是令人鼓舞的。總之，他們證明了通過(guò)i.m.和i.d.施用途徑遞送 的 TroVax 的安全性和免疫原性。Zhao 和 Wang (2007) (Zhao，Y.和 Y. Wang (2007). 〃 5T4on cotrophoblast glycoprotein janus molecule in life and a novel potentialtarget against tumors. (5T4癌滋養(yǎng)層糖蛋白在生命和新型潛在的抗腫瘤靶標(biāo)中的兩面分 子)"Cell Mol Immunol (細(xì)胞分子免疫學(xué))4 (2) :99_104)報(bào)道了 5T4癌滋養(yǎng)層糖蛋白是 一種表達(dá)在胚胎組織和多種惡性腫瘤細(xì)胞表面上的跨膜蛋白。它在多種生物學(xué)和病理學(xué)過(guò) 程中起著至關(guān)重要的作用，包括在胚胎形成過(guò)程中的大量細(xì)胞遷移，與植入相關(guān)的細(xì)胞侵 入，和腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的腫瘤轉(zhuǎn)移。按照Kopreski，Benko等，(2001)，5T4是通常在上皮 惡性腫瘤中過(guò)量表達(dá)的滋養(yǎng)層糖蛋白，其為癌癥治療提供了潛在的靶標(biāo)(參見Kopreski， Μ. S. , F.A.Benko,等，(2001). " Circulating RNA asa tumor marker !detection of 5T4 mRNA in breast and lung cancer patientserum.(循環(huán)的RNA作為腫瘤標(biāo)記在乳腺癌禾口 肺癌患者血清中檢測(cè)5T4mRNA) 〃 Ann NY Acad Sci (紐約科學(xué)學(xué)會(huì)年刊)945 172-8)。血清 收集自19名患有晚期乳腺癌(5名患者)或非小細(xì)胞肺癌(14名患者)患者，和25名具有 擴(kuò)增RNA的正常對(duì)照志愿者。將由所述血清提取的RNA用半巢式、兩階段反應(yīng)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)。5T4mRNA在8/19(42%)癌癥患者血清中可重復(fù)檢測(cè)到，其 中包括2/5乳腺癌患者血清和6/14肺癌患者血清，但是僅在3/25(12% )正常對(duì)照血清中 可重復(fù)檢測(cè)到(P = 0. 035)。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述 至少一種RNA可以因此編碼選自如圖3 (SEQ ID NO 3)所示，且-更優(yōu)選地，如圖4 (SEQ ID NO 4)所示的序列的5T4抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的 所述至少一種RNA可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的5T4抗原如圖3 (SEQ ID NO 3)所示，且-更優(yōu)選地，如圖4(SEQ ID NO 4)所示的5T4序列的片段、變體或表位。
所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼MAGE-A3。在 本發(fā)明的上下文中，‘‘MAGE-A3”是黑素瘤抗原家族A，3，并且優(yōu)選的編碼‘‘MAGE-A3”的 RNA序列，優(yōu)選是mRNA序列，一一如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物 中——顯示在圖16 (SEQ ID NO :16)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖17 (SEQ ID N0: 17)中。Gillespie 和 Coleman (1999) (Gillespie，A.M.和 R. Ε· Coleman (1999) · “ The potentialof melanoma antigen expression in cancer therapy. (MM'^iliW^^iik^ 癌癥治療中的潛力)"Cancer Treat Rev (癌癥治療綜述)25 (4) :219_27)報(bào)道了在膀 胱癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸癌、肺癌、上頌骨癌、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì) 胞瘤、食管癌和卵巢癌中的表達(dá)。Sienel，Varwark等，(2004)描述了為確定在早期非小 細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的MAGE-A3表達(dá)率進(jìn)行的研究(參見Sienel，W.，C. Varwerk,等， (2004). “ Melanomaassociated antigen(MAGE)-A3 expression in Stages I and II non-small celllung cancer :results of a multi-center study.(在 I 禾口 II 期非小細(xì)胞 肺癌中的黑素瘤相關(guān)的抗原(MAGE)-A3的表達(dá)多中心研究的結(jié)果)“Eur .TCardiothorac Surg (歐洲心肺手術(shù)雜志)25 (1) 131-4)。收集來(lái)自204名具有手術(shù)臨床I和II期NSCLC 的患者的原發(fā)性腫瘤樣品，并且確定病理學(xué)階段。通過(guò)使用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)MAGE-A3轉(zhuǎn)錄物而分析來(lái)自組織樣品的MAGE-A3表達(dá)。在204份檢驗(yàn)的I-II期原發(fā)性腫 瘤中的 80 份(39. 2% )中觀察至Ij MAGE-A3 表達(dá)。Atanackovic, Altorki 等，(2004)描述 了 MAGE-A3，最初在黑素瘤中鑒定的一種腫瘤相關(guān)抗原，還在非小細(xì)胞肺腫瘤中發(fā)現(xiàn)(參見 Atanackovic, D. , N. K. Altorki,等，(2004). “ Vaccine-induced CD4+T cell responses to MAGE-3 protein in lung cancerpatients.(在肺癌患者中疫苗誘導(dǎo)的針對(duì) MAGE-3 蛋 白的CD4+T細(xì)胞反應(yīng))“J Immunol (免疫學(xué)雜志)172 (5) :3289_96)。在臨床試驗(yàn)中，9名 NSCLC患者接種該蛋白；3名發(fā)展了抗體反應(yīng)。接受與佐劑AS02B組合的MAGE-A3的8名患 者中有7名產(chǎn)生了針對(duì)MAGE-A3的抗體。這些患者中的一些還發(fā)展了針對(duì)該蛋白的T細(xì)胞 反應(yīng)。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以因此 編碼選自如圖16(SEQ ID NO 16)所示，且-更優(yōu)選地，如圖17 (SEQ ID N0:17)所示的序列 的MAGE-A3抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一 種RNA可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的MAGE-A3抗原如圖16 (SEQ ID NO 16)， 所示，且_更優(yōu)選地，如圖17 (SEQ ID NO 17)所示的MAGE-A3序列的片段、變體或表位。
所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼MUCl。在本發(fā) 明的上下文中，“MUC1”是黏蛋白1，并且優(yōu)選的編碼“MUC1”的RNA序列、優(yōu)選是mRNA序 列如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中顯示在圖1 (SEQ ID N0 1)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖2 (SEQ ID NO 2)中。癌癥相關(guān)的黏蛋白是用于免疫 治療的潛在的靶標(biāo)。認(rèn)為這些分子通過(guò)促進(jìn)惡性細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞表面而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。 按照 Denda-Nagai 禾Π Irimura (2000) (Denda-Nagai, K.和 Τ. Irimura (2000). “ MUCl in carcinoma-host interactions.(癌癥-宿主相互作用中的MUC1) 〃 Glycoconj J17(7_9) 649-58)，MUC-I在90%的所有腺癌中過(guò)量表達(dá)， 包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃 癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。Kontani，Taguchi等，(2001)發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MUC-1在60 %的肺癌 Kontani, K. , 0. Taguchi,^, (2001). “ Modulation of MUClmucin as an escape mechanism of breast cancer cells from autologouscytotoxic T-lymphocytes. (MUC1黏蛋白的調(diào)控作為乳腺癌細(xì)胞逃離自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的逃逸機(jī)制)"Br J Cancer (英國(guó)癌癥雜志)84 (9) 1258-64)，而 Kontani，Taguchi 等，(2003)在分析使用 MUCl 抗原脈沖的DCs來(lái)在MUCl陽(yáng)性癌癥中引發(fā)細(xì)胞免疫性的研究中發(fā)現(xiàn)，臨床上9名MUC-I 陽(yáng)性患者中有7名響應(yīng)該治療，具有腫瘤標(biāo)記水平的下降或惡性胸膜滲出的消失(參見 Kontani,K. ,0. Taguchi,等，(2003) · “ Dendritic cellvaccine immunotherapy of cancer targeting MUCl mucin.(靶向MUCl黏蛋白的樹突細(xì)胞疫苗癌癥免疫治療)〃 Int J Mol Med (國(guó)際分子醫(yī)學(xué)雜志)12 (4) :493-502)。這些響應(yīng)的患者中有三名患有NSCLC。Palmer, Parker等，(2001)報(bào)道了在III/IV期NSCLC中使用MUCl肽的I期臨床試驗(yàn)中，確定了該 試劑的安全性和耐受性(參見 Palmer，M.，J. Parker，等，(2001). “ Phase I study of the BLP25(MUC1 peptide)liposomal vaccine for activespecific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer (在IIIB/IV期非小細(xì)胞肺癌中用于活性特異性免 疫治療的BLP25(MUC1肽)脂質(zhì)體疫苗的I期研究).“Clin Lung Cancer (臨床肺癌)3 (1) 49-57;討論58)。12名患者中有5名(42具有免疫學(xué)響應(yīng)，并且12名患者中有4名 (33% )達(dá)到了穩(wěn)定疾病。Wierecky，Mueller 等，(2006)還鑒定了 TAAMUC1 的兩種 HLA-A2 結(jié)合的新型9-mer肽，其在多種血液學(xué)和上皮惡性腫瘤上過(guò)量表達(dá)(參見Wierecky，J.，Μ. Mueller,等，(2006). “ Dendriticcel1-based cancer immunotherapy targeting MUC-1.(靶向MUC-I的基于樹突細(xì)胞的癌癥免疫治療)〃 Cancer Immunol Immunother (癌 癥免疫學(xué)免疫治療)55(1) :63-7)。在用這些肽脈沖DC后產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T細(xì)胞能夠以抗 原-特異性和HLA-限制性方式誘導(dǎo)表達(dá)MUCl的腫瘤細(xì)胞裂解。在兩個(gè)臨床研究中，表明 用MUCl衍生的肽脈沖的DCs接種患有晚期癌癥的患者是很好耐受的，沒(méi)有嚴(yán)重的副作用， 并且能夠誘導(dǎo)免疫學(xué)反應(yīng)。在20名患有轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的患者中，6名患者表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移的 衰退，3名具有客觀的響應(yīng)(1CR，2PR)。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合 物的所述至少一種RNA可以因此編碼選自如圖1 (SEQ ID NO :1)所示，且-更優(yōu)選地，如圖 2 (SEQ ID NO 2)所示的序列的MUCl抗原。按照其它優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激 性)組合物的所述至少一種RNA可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的MUCl抗原如圖 1(SEQID NO 1)中所示，且-更優(yōu)選地，如圖2 (SEQ ID NO 2)中所示的MUCl序列的片段、 變體或表位。 所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼Her-2/neu。在 本發(fā)明的上下文中，“Her-2/neu”是V-erb_b2成紅血細(xì)胞白血病病毒癌基因同源物2，并 且優(yōu)選的編碼“Her-2/neu”的RNA序列、優(yōu)選是mRNA序列一一如果用在本發(fā)明所述的活 性(免疫刺激性)組合物中顯示在圖5(SEQ ID NO 5)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯 示在圖 6(SEQ IDNO :6)中。按照 Baxevanis，Sotiropolou 等，(2004)，HER-2/neu(還已 知為HER2或C-erb-B2)是一種具有酪氨酸激酶活性和廣泛的針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(EGF) 受體的同源性的185-kDa蛋白受體(參見Baxevanis, C. N.，P. A. Sotiropoulou,等， (2004). “ Immunobiology of HER-2/neu oncoprotein and itspotential application in cancer immunotherapy. (HER-2/neu癌蛋白的免疫生物學(xué)及其在癌癥免疫治療中潛在 的應(yīng)用)〃 Cancer Immunol Immunother (癌癥免疫學(xué)和免疫治療)53 (3) 166-75)。HER_2/ neu在多種上皮腫瘤中表達(dá)，并且已知在約20-25%的所有的卵巢癌和乳腺癌、35-45%的 所有的胰腺癌、和多至90%的結(jié)腸直腸癌中過(guò)量表達(dá)。HER-2/neu過(guò)量表達(dá)代表較差的預(yù) 后的標(biāo)記。已經(jīng)在乳腺、卵巢、胰腺、結(jié)腸、肺和其它組織的惡性腫瘤中觀察到Her-2的過(guò) 量表達(dá)。正常情況下，Her-2以低水平在多種人組織(皮膚，消化道上皮，乳腺，卵巢，肝細(xì) 胞)中表達(dá)。Bernhard，Salazar (2002)在他們的結(jié)論中報(bào)道，針對(duì)HER-2/neu主動(dòng)免疫 癌癥患者的臨床試驗(yàn)的早期結(jié)果表明可能產(chǎn)生免疫性，并且免疫反應(yīng)持續(xù)一段時(shí)間(參見 Bernhard, H. , Salazar L.,等，(2002). “ Vaccination against the HER-2/neuoncogenic protein.(針對(duì)HER-2/neu致瘤蛋白的接種)〃 Endocr Relat Cancer (內(nèi)分泌相關(guān)癌 癥)9(1) 33-44) 0當(dāng)前的疫苗試驗(yàn)完全集中于基于表位或基于肽的疫苗的使用，主要是 由于這樣的觀察，即，在嚙齒動(dòng)物模型中肽疫苗策略可能回避neu-特異性耐受性。按照 Bernhard等，(2002，同前所述)的下一代疫苗方法將可能包括基于蛋白的疫苗，負(fù)載在DC 上的HER-2/neu抗原制備物，和基于核酸的制劑。在嚙齒動(dòng)物模型中在臨床前水平研究這 些策略的研究是有希望的。因此，在主動(dòng)免疫后離體擴(kuò)增HER-2/neu-特異性T-細(xì)胞或用表達(dá)HER-2/neu的DC在體外培養(yǎng)被認(rèn)為是治療晚期過(guò)度表達(dá)HER-2/neu的腫瘤的治療 選擇。Baxevanis，Sotiridou等，(2006)發(fā)現(xiàn)，在人類中，盡管已經(jīng)檢測(cè)到針對(duì)用于接種 的肽的免疫學(xué)反應(yīng)，但是尚沒(méi)有記述臨床響應(yīng)(參見Baxevanis，C. N.，N. N. Sotiriadou, 等，(2006). ‘‘ Immunogenic HER-2/neu peptides as tumor vaccines.(作為月中瘤疫苗的免疫原性HER-2/neu肽)“Cancer Immunol Immunother (癌癥免疫學(xué)免疫治療)55 (1)85-95)。按照 Disis，Gooley 等，(2002)，Her-2/neu 是 EGFR家族的一員(參見 Disis，M. L.， T. A. Gooley,等，(2002). “ Generation ofT-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization withHER-2/neu peptide-based vaccines.(用基于 HER-2/ neu肽的疫苗主動(dòng)免疫后產(chǎn)生針對(duì)HER-2/neu蛋白的T細(xì)胞免疫性)"J Clin Oncol (臨 床腫瘤學(xué)雜志)20 (11) :2624-32)。它通常在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中過(guò) 量表達(dá)。在I期臨床試驗(yàn)中，38名患者(2名患有NSCLC)用Her-2/neu肽接種。92%的患 者發(fā)展了針對(duì)Her-2/neu的T-細(xì)胞免疫性。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性) 組合物的所述至少一種RNA可以因此編碼選自如圖5 (SEQ ID NO 5)所示，且-更優(yōu)選地， 如圖6(SEQ ID NO 6)所示的序列Her-2/neu抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免 疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的Her-2/ neu抗原如圖5 (SEQ ID NO 5)所示，且-更優(yōu)選地，如圖6 (SEQ ID NO 6)所示的Her_2/ neu序列的片段、變體或表位。 所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼NY-ES0-1。在 本發(fā)明的上下文中，“NY-ES0-1”是癌癥/睪丸抗原1B，并且優(yōu)選的編碼“NY-ES0-1”的RNA 序列、優(yōu)選是mRNA序列一一如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中一一顯 示在圖20 (SEQ ID NO 20)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖21 (SEQ ID NO 21)中。Chen， Scanlan等，(1997)報(bào)道了通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)NY-ES0-1在多種人腫瘤中的mRNA表達(dá)，黑素瘤 23/67，卵巢癌2/8，乳腺癌10/33，甲狀腺癌2/5，前列腺癌4/16，膀胱癌4/5，結(jié)腸癌0/16， 伯基特淋巴瘤1/2，神經(jīng)膠質(zhì)瘤0/15，基底細(xì)胞癌0/2，胃癌0/12，平滑肌肉瘤0/2，肺癌 2/12，其它肉瘤0/2，腎癌0/10，胰腺癌0/2，淋巴瘤0/10，精原細(xì)胞瘤0/1，肝細(xì)胞瘤2/7，脊 髓瘤0/1(參見0^11，￥.1\，]\1工50&111&11，等，(1997).〃 A testicular antigenaberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening.(通過(guò)自體 抗體篩查檢測(cè)到在人癌癥中異常表達(dá)的睪丸抗原)〃 Proc Natl Acad Sci USA(美國(guó)國(guó)家 科學(xué)院學(xué)報(bào))94(5) 1914-8) ο Jager，Karbach 等，(2006)報(bào)道了 NY-ESO-1 是在寬范圍人 惡性腫瘤中表達(dá)的癌癥/睪丸抗原，并且正在開發(fā)多種靶向NY-ES0-1的疫苗策略(參見 Jager, E. , J. Karbach,等，(2006). “ Recombinant vaccinia/fowlpox NY-ESO-Ivaccines induce both humoral and cellular NY-ES0-l-specific immuneresponses in cancer patients.(重組痘苗/禽痘NY_ES0_1疫苗在癌癥患者中誘導(dǎo)體液和細(xì)胞NY-ES0-1-特異 性免疫反應(yīng))〃 Proc Natl Acad Sci USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))103 (39) :14453_8)。在本 研究中，在一系列具有一定范圍的不同腫瘤類型的36名患者中分析重組痘苗-NY-ES0-1和 重組禽痘-NY-ES0-1的安全性和免疫原性。每種構(gòu)建體首先以兩種不同的劑量水平檢測(cè)， 然后用重組痘苗-NY-ES0-1之后是重組禽痘-NY-ES0-1的引發(fā)-加強(qiáng)設(shè)定。所述疫苗不論 是單獨(dú)的還是一起的很好耐受。通過(guò)以每月一次的時(shí)間間隔至少4次接種的過(guò)程，在高比 例的患者中誘導(dǎo)了針對(duì)寬范圍的NY-ES0-1表位的NY-ES0-1-特異性抗體反應(yīng)和/或特異 性⑶8和⑶4T細(xì)胞反應(yīng)。源自5名接種的患者的⑶8T細(xì)胞克隆表現(xiàn)出裂解表達(dá)NY-ES0-1 的黑素瘤靶細(xì)胞。在數(shù)名患有黑素瘤的患者中，存在強(qiáng)烈的印象，即，疾病的自然過(guò)程有利 地被接種影響。Davis，Chen等，(2004)報(bào)道了皮內(nèi)注射的HLA-A2-限制性NY-ES0-1肽 表現(xiàn)出是安全和免疫原性的(Davis，I.D.，W. Chen，等，(2004). “ Recombinant NY-ES0-1protein withlSCOMATRIX adjuvant induces broad integrated antibody and CD4(+) andCD8 (+)T cell responses in humans.(重組NY-ESO-l 蛋白與 ISCOMATRIX佐劑在人中誘 導(dǎo)廣泛整合的抗體和CD4(+)與CD8(+)T細(xì)胞反應(yīng))"ProcNatl Acad Sci USA(美國(guó)國(guó)家科 學(xué)院學(xué)報(bào))101(29) 10697-702) 0盡管設(shè)計(jì)這些試驗(yàn)僅是為了確定安全性和免疫原性，但 是一些患者表現(xiàn)出腫瘤衰退或疾病的穩(wěn)定。JagenGnjatic等，(2000)進(jìn)一步表示，在具有 切除的表達(dá)NY-ES0-1的黑素瘤的患者中用重組NY-ES0-1蛋白組合ISCOMATRIX佐劑(CSL Ltd.，Parkville，Victoria，澳大利亞)免疫后，觀察到廣泛的NY-ES0-1-特異性免疫反應(yīng)， 包括抗體和 CD4 與 CD8T 細(xì)胞反應(yīng)(參見 Jager, E.，S. Gnjatic,等，(2000) · “ Induction of primary NY-ESO-limmunity :CD8+T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinatedpatients with NY-ESO-l+cancers.(誘導(dǎo)一級(jí) NY-ESO-1 免疫個(gè)生在 肽-接種的NY-ES0-1+癌患者中的CD8+T淋巴細(xì)胞和抗體反應(yīng))〃 Proc NatlAcad Sci USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))97(22) =12198-203) 0這種針對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)似乎與長(zhǎng)久的 無(wú)疾病存活相關(guān)。此外，Odunsi，Qian等，(2007)報(bào)道用NY-ES0-1肽接種在卵巢癌中誘 導(dǎo)整合的體液禾口 T 細(xì)胞反應(yīng)(參見 Odunsi，K.，F(xiàn). Qian，等，(2007). “ Vaccination with an NY-ESO-Ipeptide of HLA class I/II specificities induces integrated humoral and T cellresponses in ovarian cancer.(用 HLA I/II 類特異性 NY-ESO-l 肽接種誘導(dǎo) 整合的體液和T細(xì)胞反應(yīng))"Proc Natl Acad Sci USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))104 (31) 12837-42)。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以 因此編碼選自如圖20 (SEQ ID NO :20)所示序列，且-更優(yōu)選地，如圖21 (SEQ ID NO :21)所 示的序列的NY-ES0-1抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所 述至少一種RNA可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的NY-ES0-1抗原如圖20 (SEQ ID NO 20)所示，且-更優(yōu)選地，如圖21 (SEQ ID NO 21)所示的NY-ES0-1序列的片段、變體或 表位。 所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼CEA。在本發(fā)明 的上下文中，‘‘CEA”是癌胚抗原(CECAM5 =癌胚抗原-相關(guān)細(xì)胞黏附分子5)，并且優(yōu)選的編 碼“CEA”的RNA序列、優(yōu)選是mRNA序列一一如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性) 組合物中——顯示在圖12(SEQ ID NO :12)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖13(SEQID NO 13)中。按照Hammarstrom(1999)，CEA是一種180kDa的作用為黏附分子的胎性癌糖蛋 白，并且在 70% 的 NSCLC 中過(guò)量表達(dá)(Hammarstrom，S. (1999). “ The carcinoembryonic antigen(CEA)family structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues.(癌胚抗原(CEA)家族結(jié)構(gòu)、提議的功能和在正常和惡性組織 中的表達(dá))"Semin Cancer Biol (癌癥生物學(xué)研討會(huì))9 (2) :67_81)。Berinstein (2002) 報(bào)道了 CEA具有作為抗癌主動(dòng)接種方法的靶標(biāo)的多種令人感興趣的特征(Berinstein， N. L. (2002). “ Carcinoembryonic antigen as a target fortherapeutic anticancer vaccines :a review.(癌胚抗原作為治療性抗癌疫苗的靶標(biāo)綜述)〃 J Clin Oncol (臨 床腫瘤學(xué)雜志)20(8) :2197-207)。它具有有利的表達(dá)模式，并且在多于50 %的所有人類 癌癥中表達(dá)。它自身可能在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起作用，并且因此在整個(gè)癌癥進(jìn)展過(guò)程中其表 達(dá)可以被選擇和保守的。已經(jīng)充分證明，CEA在多種1類MHC分子上加工和呈遞。此外， 針對(duì)CEA的免疫學(xué)耐受性不是絕對(duì)的。存在大量的數(shù)據(jù)證明人T細(xì)胞可以識(shí)別、變成激活的、并且裂解表達(dá)CEA的癌細(xì)胞。已經(jīng)評(píng)估了一些使用CEA作為靶抗原的不同的治療性 接種方法。已經(jīng)確定了這些方法的安全性。另外，已經(jīng)證明了針對(duì)CEA的體液和/或細(xì)胞 反應(yīng)。盡管Berinstein (2002，同前所述)描述的為這些研究所選的大部分患者患有非常 晚期和難以治愈的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，但是已經(jīng)記錄了一些臨床活性證據(jù)，在一些患者中發(fā)生 的疾病穩(wěn)定性和甚至是客觀的響應(yīng)。用激動(dòng)劑CEAI類MHC結(jié)合肽(CAP1-6D)和有或無(wú)共 刺激分子的結(jié)合CEA的基于痘病毒的載體脈沖的樹突細(xì)胞似乎在激活CD8 T-細(xì)胞反應(yīng)中 最活躍。不幸的是，樹突細(xì)胞方法可能受到獲得患者-特異性的樹突細(xì)胞制備物的后勤 (logistic)困難的限制。報(bào)道了使用金絲雀痘載體系統(tǒng)靶向CEA的四次I期研究。這些 試驗(yàn)表明所述方法是安全的，具有主要局限在注射部位的輕微的1級(jí)和2級(jí)毒性。此外，所 述試驗(yàn)表明在大部分患者中可以激活針對(duì)CEA的特異性細(xì)胞T細(xì)胞反應(yīng)。這些反應(yīng)可以通 過(guò)在所述載體中包含B7. 1共刺激分子或通過(guò)在注射部位加入重組GM-CSF而增強(qiáng)。盡管 沒(méi)有報(bào)道客觀的臨床響應(yīng)，但是在這些I期研究中的顯著比例的患者已經(jīng)經(jīng)歷了疾病穩(wěn)定 性。進(jìn)一步增強(qiáng)識(shí)別CEA的T細(xì)胞頻率的接種策略認(rèn)為是對(duì)這些疫苗的臨床活性的進(jìn)一步 加強(qiáng)。存在數(shù)據(jù)表明至少一些疫苗可能在最小的疾病狀態(tài)更有效。Ueda，Itoh等(2004)描 述了一次研究，其中用CEA-衍生的肽脈沖的自體樹突細(xì)胞治療18名患有轉(zhuǎn)移胃腸癌或肺 癌的患者(參見 Ueda, Y.，T. Itoh,等，(2004). “ Dendritic cell-based immunotherapy ofcancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24_restricted CTLepitope Clinical outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal orlung adenocarcinomas.(使用癌胚抗原-衍生的、HLA-A24-限制性CTL表位的基于樹突細(xì)胞的 癌癥免疫治療18名轉(zhuǎn)移胃腸癌或肺腺癌患者的臨床結(jié)果)"Int J OncoK國(guó)際腫瘤學(xué)雜 志)24(4) 909-17)。在大部分患者中觀察到通過(guò)皮膚測(cè)試和體外T細(xì)胞測(cè)定法測(cè)量的免疫 反應(yīng)。盡管沒(méi)有報(bào)道客觀臨床響應(yīng)，但是一些患者在接受該種免疫治療時(shí)具有穩(wěn)定的疾病。 按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以因此編碼選 自如圖12 (SEQ ID NO 12)所示，且-更優(yōu)選地，如圖13 (SEQ ID NO 13)所示的序列的CEA 抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以 備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的CEA抗原如圖12 (SEQ ID NO 12)所示，且-更優(yōu)選 地，如圖13(SEQ ID NO 13)中所示的CEA序列的片段、變體或表位。
所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼存活蛋白。在 本發(fā)明的上下文中，“存活蛋白，，是桿狀病毒IAP重復(fù)-包含5 (存活蛋白)，并且優(yōu)選的編 碼“存活蛋白”的RNA序列、優(yōu)選是mRNA序列如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激 性)組合物中一一顯示在圖18 (SEQ ID N0:18)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖19 (SEQ ID NO 19)中。Grube，Moritz 等，(2007)描述了存活蛋白(參見 Grube，M.，S. Moritz, 等，(2007). “ CD8+T cells reactive to survivin antigen in patients withmultiple myeloma.(在患有多發(fā)性骨髓瘤的患者中與存活蛋白抗原反應(yīng)的⑶8+T細(xì)胞)"Clin Cancer Res (臨床癌癥研究)13 (3) 1053-60).存活蛋白是程序性細(xì)胞死亡家族抑制劑中 的一員，并且在不同類型的惡性腫瘤中過(guò)量表達(dá)?？梢栽隗w外和通過(guò)對(duì)患有白血病、乳腺 癌、和黑素瘤的患者接種而引發(fā)識(shí)別存活蛋白表位的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。研究了存活蛋白-特 異性CD8+T細(xì)胞是否在多發(fā)性骨髓瘤患者中存在，并且在23名患者中的9名中和21名健康 志愿者中的1名中檢測(cè)到識(shí)別HLA-A2. 1-結(jié)合存活蛋白肽的T細(xì)胞。存活蛋白-反應(yīng)性T細(xì)胞鑒定為終末分化的效應(yīng)器T細(xì)胞(⑶8+，⑶45RA+，和CCR7-)。在11名患者中的7名中表現(xiàn)出在骨髓樣品中骨髓瘤細(xì)胞的陽(yáng)性存活蛋白表達(dá)。存活蛋白在大部分上皮和造血來(lái)源的 人癌細(xì)胞中高度表達(dá)，并且過(guò)量表達(dá)與癌癥進(jìn)展、極差的預(yù)后、抗性、和短的患者存活相關(guān)。 Duffy, O’ Donovan(2007)描述了存活蛋白是一種在幾乎所有的惡性腫瘤中過(guò)量表達(dá)但是 很少在正常分化的成人組織中檢測(cè)到的16. 5kDa蛋白(參見Duffy，Μ. J.，N. O' Donovan, 等，(2007). “ Survivin :a promising tumor biomarker.(存活蛋白有希望的腫瘤生物 標(biāo)記)〃 CancerLett (癌癥通信)249 (1) :49_60)。功能上，存活蛋白已經(jīng)表現(xiàn)出抑制程序 性細(xì)胞死亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和增強(qiáng)血管形成。與其在這些過(guò)程中的作用一致，描述存活蛋白 在癌癥進(jìn)展中起著重要的作用。由于在正常和惡性組織之間表達(dá)的巨大差異及其在癌癥 進(jìn)展中的因果作用，目前正對(duì)存活蛋白進(jìn)行作為潛在的腫瘤標(biāo)記的強(qiáng)化研究。出現(xiàn)的數(shù)據(jù) 表明存活蛋白的測(cè)量可以輔助膀胱癌的早期診斷，確定多種癌癥類型的預(yù)后，和預(yù)測(cè)對(duì)各 種抗癌治療的響應(yīng)。Zeis，Siegel等，(2003)證明通過(guò)用轉(zhuǎn)染了存活蛋白-RNA的自體樹 突細(xì)胞刺激由PBMC產(chǎn)生的人存活蛋白-特異性CTLs對(duì)于一系列的造血惡性細(xì)胞系和由 急性骨髓性白血病患者分離的原代腫瘤細(xì)胞是細(xì)胞毒性的(參見Zeis，Μ.，S.Siegel，等， (2003). “ Generation of cytotoxicresponses in mice and human individuals against hematological malignanciesusing survivin-RNA-transfected dendritic cells.(使 用存活蛋白-RNA-轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞在小鼠和人個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)造血惡性腫瘤的細(xì)胞毒性 反應(yīng))"JImmimol (免疫學(xué)雜志)170(11) :5391_7)。還表明用存活蛋白-RNA-轉(zhuǎn)染的樹 突細(xì)胞接種小鼠導(dǎo)致對(duì)表達(dá)存活蛋白的淋巴瘤刺激的長(zhǎng)期抗性，這證明存活蛋白作為腫瘤 排斥性Ag的潛力。提供了存活蛋白用作抗造血性腫瘤的免疫治療策略的靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的證據(jù)。 按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以因此編碼選 自如圖18(SEQID NO 18)所示，且-更優(yōu)選地，如圖19 (SEQ ID NO 19)所示的序列的存活 蛋白抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的存活蛋白抗原如圖18(SEQ ID NO 18)中所示， 且-更優(yōu)選地，如圖19(SEQID NO 19)中所示的存活蛋白序列的片段、變體或表位。
所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼MAGE-Cl。在本 發(fā)明的上下文中，“MAGE-Cl ”是黑素瘤抗原家族C，1，并且優(yōu)選的編碼“MAGE-C1 ”的RNA序 列、優(yōu)選是mRNA序列一一如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中一一顯 示在圖22 (SEQ IDNO 22)中，更優(yōu)選地顯示在圖23 (SEQ ID NO 23)中，且-甚至更優(yōu)選 地-顯示在圖24(SEQ ID NO 24)中。Lucas，De Smet等，(1998)最近通過(guò)進(jìn)行RDA鑒定 了 MAGE-Cl (參見 Lucas，S.，C. De Smet，等，(1998). “ Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression byrepresentational difference analysis. (通過(guò)代表性差異分析鑒定具有腫瘤-特異性表達(dá)的新MAGE基因)"Cancer Res (癌癥 研究)58(4) :743-52)。除了睪丸之外，MAGE-Cl不在所檢測(cè)的一組正常組織中表達(dá)。在 腫瘤樣品中，MAGE-Cl通常在精原細(xì)胞瘤、黑素瘤、和膀胱癌中表達(dá)。它還在顯著部分的 頭頸癌、乳腺癌、非小肺癌、前列腺腺癌和肉瘤中表達(dá)。Jungbluth，Chen等，(2002)描 述了在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、睪丸癌、膀胱癌、黑素瘤和非小細(xì)胞肺癌(39%)中的表達(dá) (參見 Jungbluth，A. A.，Y. T. Chen，等，(2002). “ CT7 (MAGE-Cl) antigen expression in normal andneoplastic tissues. (CT7 (MAGE-C1)抗原在正常和腫瘤組織中的表達(dá))“IntJ Cancer (國(guó)際癌癥雜志)99 (6) 839-45)。Gure，Chua 等，(2005)分析了來(lái)自523名非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的腫瘤，分析其癌性睪丸抗原的表達(dá)(參見Gure， A. 0. ,R. Chua,等，(2005) · “ Cancer-testis genes are coordinatelyexpressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer (在非小細(xì)胞月市癌中，癌性 睪丸基因協(xié)同表達(dá)并且是極差結(jié)果的標(biāo)記).“ClinCancer Res (臨床癌癥研究)11 (22) 8055-62)。MAGE-Cl 在 18 名中存在，為 8 %。Scanlan，Altorki 等，(2000)還報(bào)道了 CT 抗原在33例非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)MAGE-Cl 30% (參見Scanlan，M.J.，N. K.Altorki, 等，(2000). “ Expression of cancer-testis antigens in lung cancer :definition ofbromodomain testis-specif ic gene (BRDT) as a new CT gene, CT9.(癌性辜丸抗原在月市 癌中的表達(dá)溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)睪丸-特異性基因(BRDT)作為新CT基因CT9的定 義)"Cancer Lett (癌癥通信)150 (2) 155-64).按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺 激性)組合物的所述至少一種RNA可以因此編碼選自如圖22 (SEQ ID NO 22)所示，且-更 優(yōu)選地，如圖23(SEQ ID NO 23)中所示，且甚至更優(yōu)選地如圖24 (SEQ ID NO 24)中所示的 序列的MAGE-Cl抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至 少一種RNA可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng)的MAGE-Cl抗原如圖22 (SEQ ID NO 22)中所示，且-更優(yōu)選地，如圖23 (SEQ ID NO 23)中所示，且甚至更優(yōu)選地如圖24 (SEQ ID NO 24)中所示的MAGE-Cl序列的片段、變體或表位。所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼MAGE-C2。在本 發(fā)明的上下文中，“MAGE-C2”是黑素瘤抗原家族C2，并且優(yōu)選的編碼“MAGE-C2”的RNA序 列、優(yōu)選是mRNA序列一一如果用在本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物中一一顯示 在圖25 (SEQ IDNO 25)中，且-甚至更優(yōu)選地-顯示在圖26 (SEQ ID NO 26)中。Lucas， De Plaen等，(2000)最近通過(guò)進(jìn)行RDA在黑素瘤細(xì)胞系上鑒定了 MAGE-C2 (參見Lucas， S. , Ε. De Plaen,等，(2000). “ MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, and MAGE-C3 :four new members of the MAGE family withtumor-specific expression. (MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2，和MAGE-C3 四種具有腫瘤特異性表達(dá)的MAGE家族新成員)‘‘Iht J Cancer (國(guó) 際癌癥雜志)87(1) :55-60)。除了睪丸之外，MAGE-C2不在所檢測(cè)的一組正常組織中表 達(dá)。在腫瘤樣品中，MAGE-C2通常在精原細(xì)胞瘤、黑素瘤、和膀胱癌中表達(dá)。它還在顯著部 分的頭頸癌、乳腺癌、非小肺癌和肉瘤中表達(dá)。Scanlan，Altorki等，(2000)報(bào)道了 CT抗 原在33例非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá):MAGE-C2 30% (參見Scanlan，Μ. J.，N. K.Altorki, 等，(2000). “ Expression of cancer-testis antigens in lung cancer :definition ofbromodomain testis-specif ic gene (BRDT) as a new CT gene, CT9.(癌性辜丸抗原在月市 癌中的表達(dá)溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)睪丸-特異性基因(BRDT)作為新CT基因CT9的定 義)"Cancer Lett (癌癥通信)150 (2) 155-64).按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述活性(免疫刺 激性)組合物的所述至少一種RNA可以因此編碼選自如圖25 (SEQ ID NO 25)所示，且-更 優(yōu)選地，如圖26(SEQ ID N0:26)所示的序列的MAGE-C2抗原。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，所 述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以備選地或另外地編碼選自下列各項(xiàng) 的MAGE-C2抗原如圖25(SEQ ID NO 25)中所示，且-更優(yōu)選地，如圖26 (SEQ ID NO 26) 中所示的MAGE-C2序列的片段、變體或表位。上述定義的可以由本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA編碼的抗原、抗原蛋白或抗原肽，可以包括那些序列的片段或變體。所述片段或變體可以典 型地包括與上文提及的抗原、抗原蛋白或抗原肽或序列或它們的編碼核酸序列之一具有至 少5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，優(yōu)選地至少70 %，更優(yōu)選地至少80 %，等價(jià)地更 優(yōu)選地至少85 %，甚至更優(yōu)選地至少90 %且最優(yōu)選地至少95 %或甚至97 %，至完整的野生 型序列的序列同源性的序列，不管是在核酸水平還是在氨基酸水平上。在本發(fā)明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的“片段”可以包括如上文定義的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，關(guān)于其氨基酸序列(或編碼其的核酸序列)，與原始(天 然)蛋白的氨基酸序列(或編碼其的核酸序列)相比較，其是N端、C端和/或序列內(nèi)部截 短的。所述截短可以因此發(fā)生在氨基酸水平或者相對(duì)應(yīng)的發(fā)生在核酸水平上。因此，關(guān)于 如上文定義的所述片段的序列同源性可以優(yōu)選地是指如上文定義的完整的抗原、抗原蛋白 或抗原肽或所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的完整(編碼)核酸序列。在本發(fā)明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段還可以包括如上述定義的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，其具有約6-約20個(gè)或甚至更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，例如，由 I類MHC分子處理和呈遞的片段，優(yōu)選地具有約8-約10個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，例如，8，9，或10 個(gè)，(或者甚至6，7，11，或12個(gè)氨基酸)，或由II類MHC分子處理和呈遞的片段，優(yōu)選地具有 約13個(gè)以上的氨基酸的長(zhǎng)度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20個(gè)或甚至更多個(gè)氨基酸，其 中這些片段可以選自所述氨基酸序列的任一部分。這些片段典型地以由所述肽片段和MHC 分子組成的復(fù)合體形式被T細(xì)胞識(shí)別，即，所述片段典型地不以它們的天然形式被識(shí)別。如本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段還可以包括那些抗原、抗原蛋白或 抗原肽的表位。在本發(fā)明的上下文中，表位(還稱為“抗原決定簇”)典型地是位于本文定 義的(天然)抗原、抗原蛋白或抗原肽的外表面的片段，優(yōu)選地具有5-15個(gè)氨基酸，更優(yōu)選 地具有5-12個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選地具有6-9個(gè)氨基酸，其可以被抗體或B細(xì)胞受體識(shí)別， 艮口，以它們的天然形式被識(shí)別?？乖?、抗原蛋白或抗原肽的所述表位還可以選自本文提及的 所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的變體的任一種。在該情形中，抗原決定簇可以是構(gòu)象或不連 續(xù)的表位，其由本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段組成，所述片段在本文定義的抗 原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列中是不連續(xù)的，但是在三維結(jié)構(gòu)中是在一起的或是由 單一多肽鏈組成的連續(xù)的或線性表位。如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的“變體”可以由本發(fā)明所述的活性(免疫 刺激性)組合物的所述至少一種RNA編碼，其中編碼如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽 的所述至少一種(m)RNA的核酸是交換的。由此，可以產(chǎn)生具有在一個(gè)或多個(gè)突變，如一個(gè) 或多個(gè)取代的、插入的和/或刪除的氨基酸而與原始序列不同的氨基酸序列的抗原、抗原 蛋白或抗原肽。優(yōu)選地，與全長(zhǎng)天然抗原或抗原蛋白相比較，這些片段和/或變體具有相同 的生物學(xué)功能或特異性活性，例如，其特異性抗原特性。本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA還可以編碼上文定義的抗原或抗原蛋白，其中與其生理學(xué)序列相比較，所編碼的氨基酸序列包括保守氨基酸 取代。那些編碼的氨基酸序列以及它們的編碼核苷酸序列特別落入如上文定義的術(shù)語(yǔ)變體 中。來(lái)源于相同種類的氨基酸與另一種交換的取代稱為保守取代。特別地，這些是具有脂肪 族側(cè)鏈、帶正電荷或負(fù)電荷的側(cè)鏈、在側(cè)鏈中具有芳香族基團(tuán)的氨基酸，或其側(cè)鏈可以進(jìn)入 氫橋的氨基酸，例如，具有羥基官能的側(cè)鏈。這意味著，例如，具有極性側(cè)鏈的氨基酸被具有同樣極性側(cè)鏈的另一種氨基酸替換，或者例如，以疏水側(cè)鏈為特征的氨基酸被具有同樣的疏水側(cè)鏈的另一種氨基酸取代(例如，絲氨酸(蘇氨酸)被蘇氨酸(絲氨酸)置換或亮氨酸 (異亮氨酸)被異亮氨酸(亮氨酸)置換)。插入和取代是可能的，特別是在對(duì)三維結(jié)構(gòu)沒(méi) 有引起修飾或不影響結(jié)合區(qū)的那些序列位置上。插入或刪除對(duì)三維結(jié)構(gòu)的修飾可以容易地 確定，例如，使用 CD 光譜確定(圓二色譜)(Urry，1985，Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polyp印tides (多肽的吸附、圓二色性和 ORD)，在Modern Physical Methods in Biochemistry (生物化學(xué)的現(xiàn)代物理方法)中，Neuberger等，(ed.)，Elsevier，阿姆斯 特丹)。此外，如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的變體，其可以由本發(fā)明所述的活性 (免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA編碼，還可以包括那些序列，其中所述至少一種 (m)RNA的核酸按照遺傳密碼的簡(jiǎn)并性進(jìn)行交換，不導(dǎo)致所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的各 自氨基酸序列的改變，即，所述氨基酸序列或至少其部分可以以在上述意義內(nèi)的一個(gè)或多 個(gè)突變而并不在原始序列上不同。為了確定兩個(gè)序列(核酸序列，例如，如本文定義的RNA或mRNA序列，或氨基酸序 列，優(yōu)選地它們編碼的氨基酸序列，例如，如上文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸 序列)相同的百分比，可以比對(duì)序列，以隨后與另一種進(jìn)行比較。因此，例如，可以在第一序 列的序列中插入缺口，并且可以比較在第二序列的相對(duì)應(yīng)位置處的成分。如果在第一序列 中的位置由與在第二序列中位置處的情形相同的成分占據(jù)，則這兩個(gè)序列在該位置處是相 同的。兩個(gè)序列相同的百分比是相同的位置數(shù)目除以位置總數(shù)的函數(shù)。兩個(gè)序列相同的 百分比可以使用數(shù)學(xué)算法確定?？梢詰?yīng)用的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的實(shí)例是 Karlin 等，(1993)，PNAS USA，90 :5873_5877或Altschul 等，(1997)，Nucleic Acids Res. (核酸研究)，25:3389-3402的算法。這樣的算法結(jié)合在BLAST程序中。可以通過(guò)該程序 鑒定與本發(fā)明的序列在某種程度上相同的序列。本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物包括，如上文定義，至少一種RNA，其編碼 選自上述組的任意抗原的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，原因在于按照本發(fā)明，前文提及的 組的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的特定組合能夠有效刺激(適應(yīng)性)免疫系統(tǒng)，以允許 治療肺癌，尤其是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。然而，本發(fā)明還可以提供這樣的活性(免疫刺激 性)組合物，其包括編碼選自上述組任意抗原的三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、 十種、十一種或甚至十二種(優(yōu)選不同的)抗原的至少一種RNA，其中這些抗原的任意組合 是可能的和被考慮的。按照特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少 一種RNA可以編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，所述抗原選自包括下述抗原的亞組的任 意抗原· hTERT,‘ WTl,· 5T4,· NY-ESO-1， 存活蛋白，和/或· MAGE-C2.
更優(yōu)選地，本發(fā)明還可以提供包括至少一種RNA的活性(免疫刺激性)組合物，所述至少一種RNA編碼選自上述組或亞組的任意抗原的至少三種、四種、五種或六種(優(yōu)選不 同的)抗原，其中這些抗原的任意組合是可能的。因此，由于另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所 述至少一種RNA可以編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，所述抗原選自上文提及的包括(至 少)任一種下述抗原組合的組或亞組的任意抗原· hTERT 禾口 WT1，或.hTERT 和 5T4，或· hTERT 和 NY-ES0-1，或· hTERT和存活蛋白，或· hTERT 和 MAGE-C2，或·Π1 禾口 5T4，或· WTl 禾口 NY-ES0-1，或· WTl和存活蛋白，或· WTl 禾口 MAGE-C2，或· 5Τ4 和 NY-ES0-1，或·5Τ4和存活蛋白，或· 5Τ4 和 MAGE-C2，或· NY-ES0-1和存活蛋白，或· NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或·存活蛋白和MAGE-C2，或· hTERT, WTl 和 5T4，或· hTERT, WTl 和 NY-ESO-l，或· hTERT，WTl和存活蛋白，或· hTERT，WT1 禾口 MAGE-C2，或
· hTERT, 5T4,和 NY-ESO-l，或· hTERT，5T4，和存活蛋白，或· hTERT，5T4，和 MAGE-C2，或· hTERT, NY-ES0-1 和存活蛋白，或· hTERT, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· hTERT，存活蛋白和 MAGE-C2，或· WTl，5T4 和 NY-ESO-l，或· WT1，5T4和存活蛋白，或· WT1，5T4 禾口 MAGE—C2，或· WT1，NY-ES0-1 和存活蛋白，或· WT1，NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· WT1，存活蛋白和 MAGE-C2，或· 5T4，NY-ES0-1 和存活蛋白，或
· 5T4, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· 5T4，存活蛋白和 MAGE-C2，或· NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或· hTERT, WTl，5T4 和 NY-ESO-l，或· hTERT，WT1，5T4 和存活蛋白，或· hTERT，WT1，5T4 禾口 MAGE-C2，或· hTERT, 5T4, NY-ESO-I 和存活蛋白，或· hTERT, 5T4, NY-ESO-I 和 MAGE-C2，或· hTERT, NY-ESO-I，存活蛋白和 MAGE-C2，或· WTl, 5T4, NY-ES0-1，和存活蛋白，或· WT1，5T4，NY-ES0-1，和 MAGE-C2，或· WT1，5T4，存活蛋白，和 MAGE-C2，或· 5T4, NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或· hTERT, WTl, 5T4, NY-ES0-1 和存活蛋白，或· hTERT, WTl, 5T4, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或· WTl, 5T4, NY-ES0-1，存活蛋白和 MAGE-C2，或· hTERT, WTl, 5T4, NY-ESO-l，存活蛋白，和 MAGE-C2。更優(yōu)選地，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以編碼專 門選自上文提及的組或亞組的任意抗原的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，所述組或亞組包 括(至少)任一種下述抗原組合· hTERT 禾口 WTl，或.hTERT 和 5T4，或· hTERT 和 NY-ES0-1，或· hTERT和存活蛋白，或· hTERT 和 MAGE-C2，或·Π1 禾口 5T4，或.WTlfPNY-ESO-Ij· WTl和存活蛋白，或· WTl 禾口 MAGE-C2，或· 5Τ4 和 NY-ES0-1，或·5Τ4和存活蛋白，或· 5Τ4 和 MAGE-C2，或· NY-ES0-1和存活蛋白，或· NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或·存活蛋白和MAGE-C2，或
hTERT，WT1 和 5T4，或 hTERT, WT1 和 NY-ESO-l，或 hTERT，WT1和存活蛋白，或 hTERT，WT1 禾P MAGE-C2，或 hTERT, 5T4,和 NY-ESO-l，或 hTERT，5T4，和存活蛋白，或 hTERT，5T4，和 MAGE-C2，或 hTERT，NY-ES0-1 和存活蛋白，或 hTERT, NY-ESO-l 和 MAGE-C2，或 hTERT，存活蛋白和 MAGE-C2，或 WT1，5T4 和 NY-ES0-1，或 WT1，5T4和存活蛋白，或 WT1，5T4 和 MAGE-C2，或 WT1，NY-ES0-1 和存活蛋白，或 WT1，NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或 WT1，存活蛋白和 MAGE-C2，或 5T4，NY-ES0-1 和存活蛋白，或 5T4, NY-ES0-1 和 MAGE-C2，或 5T4，存活蛋白和 MAGE-C2，或 NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或 hTERT, WT1, 5T4 和 NY-ESO-l，或 hTERT，WT1，5T4 和存活蛋白，或 hTERT，WT1，5T4 和 MAGE-C2，或 hTERT, 5T4, NY-ESO-l 和存活蛋白，或 hTERT, 5T4, NY-ESO-l 和 MAGE-C2，或 hTERT, NY-ESO-l，存活蛋白和 MAGE-C2，或 ffTl,5T4, NY-ESO-l，和存活蛋白，或 WT1，5T4，NY-ESO-l，和 MAGE-C2，或 WT1，5T4，存活蛋白，和 MAGE-C2，或 5T4, NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2，或 hTERT, WT1,5T4, NY-ESO-l 和存活蛋白，或 hTERT, WT1,5T4, NY-ESO-l 和 MAGE-C2，或 WT1,5T4, NY-ESO-l，存活蛋白和 MAGE-C2，或 hTERT，WT1，5T4，NY-ES0-1，存活蛋白，和 MAGE-C2.按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供包括編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的至 少一種RNA的活性(免疫刺激性)組合物，
a)其中這些至少兩種抗原的至少一種、優(yōu)選地至少兩種、三種、四種、五種、或甚至 六種選自 5T4‘ NY-ES0-1, MAGE-A2，‘ MAGE-A3, MAGE-C1，禾口 / 或.MAGE-C2，禾口b)其中其它抗原選自本文定義的至少一種抗原，優(yōu)選地在任意本文提及的抗原組 合、組或亞組中，例如，所述其它抗原選自，例如 hTERT，‘ WT1, MAGE-A2， 5T4,‘ MAGE-A3,‘ MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1， CEA， 存活蛋白， MAGE-C1，禾口 / 或 MAGE-C2。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，按照a)的所述至少一種抗原選自 NY-ES0-1, MAGE-C1，禾口 / 或 MAGE_C20按照另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，按照a)的所述至少一種抗原選自 MAGE-C1，禾口 / 或 MAGE-C2。按照另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，按照b)的所述至少一種抗原選自在下述組合之一中 定義的一種抗原(多種抗原).hTERT 和 WT1;或 hTERT 和 MAGE-A2 ；或.hTERT 和 5T4;或 hTERT 和 MAGE-A3 ；或 hTERT 和 MUC1 ；或 hTERT 和 Her-2/neu ；或 hTERT 和 NY-ESO-l ；或 hTERT 禾口 CEA ；或
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hTERT和存活蛋白；或 hTERT 和 MAGE-C1 ；或 hTERT 和 MAGE-C2 ；或 WT1 禾口 MAGE-A2 ；或 WT1 禾口 5T4 ；或 WT1 禾口 MAGE-A3 ；或.WT1 禾口 MUC1;或 WT1 禾口 Her-2/neu ；或 WT1 禾口 NY-ES0-1 ；或 町1禾口〇￡八；或和存活蛋白；或.m 和 MAGE-C1;或 WT1 禾口 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2 和 5T4 ；或 MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2 禾口 MUC1 ；或 MAGE-A2 禾口 Her-2/neu ；或 MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2 和 CEA ；或 MAGE-A2和存活蛋白；或 MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 5T4 禾口 MAGE-A3 ；或.5T4 和 MUC1;或 5T4 禾口 Her-2/neu ；或 5T4 和 NY-ES0-1 ；或 5丁4和〇￡六；或*5T4和存活蛋白；或 5T4 和 MAGE-C1 ；或 5T4 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3 禾口 MUC1 ；或 MAGE-A3 禾口 Her-2/neu ；或 MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A3和存活蛋白；或 MAGE-A3 禾口 MAGE-C1
MAGE-A3 和 MAGE-C2 MUC1 禾口 Her-2/neu ；或 MUC1 禾口 NY-ESO-l ；或
MUC1和 CEA ；或*MUC1和存活蛋白；或 MUC1 和 MAGE-C1 ；或 MUC1 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU 和 NY-ESO-l ；或 HER-2/NEU 和 CEA ；或 HER-2/NEU和存活蛋白；或
HER-2/NEU 和 MAGE-C1 ；或 HER-2/NEU 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1 和 CEA ；或 NY-ES0-1和存活蛋白；或 NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或*CEA和存活蛋白；或 CEA 和 MAGE-C1 ；或 CEA 和 MAGE-C2 ；或 存活蛋白和MAGE-C1 ；或 存活蛋白和MAGE-C2 ；或 MAGE-C 1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT，WT1 和 MAGE-A2 ；或 hTERT, WT1 和 5T4 ；或 hTERT，WT1 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WT1 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1 和 CEA ；或 hTERT, WT1和存活蛋白；或 hTERT, WT1 和 MAGE—C1 ；或 hTERT，WT1 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2 和 5T4 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MUC1 ；或 WT1，MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2 和存活蛋白；或 WT1, MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或
MAGE-A2，5T4 和 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2,5T4 和 MUC1 ；或 MAGE-A2，5T4 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2，5T4 和 CEA ；或 MAGE-A2，5T4 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2，5T4 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 5T4，MAGE-A3 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1 禾口 Her-2/neu ；或 MAGE-A3, MUC1 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUC1 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu 禾口 NY-ESO-l ；或 MUC1，Her-2/neu 和 CEA ；或 MUC1，Her-2/neu 和存活蛋白；或 MUC1, Her-2/neu 禾口 MAGE-C1 ；或 MUC1, Her-2/neu 禾口 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 CEA ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1，CEA 和存活蛋白；或 NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 5T4 ；或
hTERT, WT1, MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或
hTERT，WT1，MAGE-A2 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4 禾口 MAGE—A3 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MUC1 ；或 WT1，MAGE-A2,5T4 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2，5T4 禾口 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4 禾口 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1，和 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 NY-ESO-l ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或
HER-2/NEU, NY-ESO-l，CEA 和 MAGE-C2 ；或 NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE—A2，5T4 禾口 MAGE—A3 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 禾口 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1, MAGE—A2，5T4 禾口 CEA ；或 hTERT，WT1，MAGE-A2，5T4 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 NY-ESO-l ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 NY-ESO-l ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C1 ；或
HER-2/NEU, NY-ESO-l，CEA,存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 NY-ESO-l，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和 MUC1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4，MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC 1 和 Her-2/neu ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUC1 和 NY-ES0-1 ；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1 和存活蛋白；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C1 ；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUC1，Her-2/neu, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1，Her-2/neu, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；
38
或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 NY-ESO-l ；或
hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC 1 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 NY-ESO-l ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu，NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 CEA ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 CEA ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或
5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 CEA ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和存活蛋白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l 和 MAGE-C2 ；或 WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ； 或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C2 ； 或 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA 和存活蛋 白；或 hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA 和 MAGE-C1 ； 或'hTERT, WT1, MAGE-A2，5T4, MAGE-A3，MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA 和 MAGE-C2 ； 或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 WT1, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA,存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE_A2，5T4，MAGE-A3，MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1, MAGE_A2，5T4，MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4，MAGE-A3，MUC1，Her-2/neu, NY-ESO-l，CEA，存活蛋白，MAGE-C1 禾口 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-l, CEA，存活蛋白， MAGE-C1和 MAGE-C2.按照另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，按照b)的所述至少一個(gè)抗原選自下述如上文定義的特定的抗原組合 存活蛋白和5T4本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA典型地是任意RNA， 優(yōu)選地，但不限于此，編碼RNA，環(huán)形或線性RNA，單鏈或雙鏈RNA (其還可以視為是由于兩個(gè) 單鏈RNA的非共價(jià)締合形成的RNA)或部分雙鏈或部分單鏈的RNA，其至少部分是自身互補(bǔ) 性的(這些部分雙鏈或部分單鏈的RNA分子二者典型地由更長(zhǎng)和更短的單鏈RNA分子形 成，或者由兩個(gè)單鏈RNA分子形成，其在長(zhǎng)度上大約相等，其中一個(gè)單鏈RNA分子部分與另 一而單鏈RNA分子互補(bǔ)，并且因此二者在該區(qū)域形成雙鏈RNA，S卩，相對(duì)于完整的RNA序列部 分是雙鏈或部分是單鏈的RNA)。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的所 述至少一種RNA是單鏈RNA，甚至更優(yōu)選地是線性RNA。最優(yōu)選地，本發(fā)明所述的活性(免 疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA是信使RNA (mRNA)。在該情形中，信使RNA (mRNA)典 型地是這樣的RNA，其由(至少)一些結(jié)構(gòu)元件組成，例如，任選的5’ -UTR區(qū)，位于上游的 核糖體結(jié)合位點(diǎn)，之后是編碼區(qū)，任選的3’-UTR區(qū)，其可以后接聚腺苷酸尾(和/或聚胞苷 酸尾)。由于一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少 兩種(優(yōu)選不同的)抗原的每一種，可以由一種(單順?lè)醋?RNA編碼，優(yōu)選地一種(單順 反子)mRNA編碼。換言之，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物可以包含至少兩種(單順 反子)RNAs，優(yōu)選mRNAs，其中這些至少兩種(單順?lè)醋?RNAs、優(yōu)選mRNAs的每一種可以僅 編碼一種(優(yōu)選不同的)抗原，所述抗原選自上文提及的組或亞組之一，優(yōu)選地以上文提及 的組合之一。按照另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物可以包括 (至少)一種雙順?lè)醋踊蛘呱踔炼囗樂(lè)醋覴NA，優(yōu)選mRNA，S卩，攜帶至少兩種(優(yōu)選不同的) 抗原的兩種或甚至多種編碼序列的(至少)一種RNA，所述抗原選自上文提及的組或亞組 之一，優(yōu)選地在上文提及的組合之一中。所述(至少)一種雙順?lè)醋踊蛏踔炼囗樂(lè)醋覴NA 的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的所述編碼序列可以由至少一個(gè)下文定義的IRES(內(nèi)部核 糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列分開。因此，術(shù)語(yǔ)“編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原”可以意指，但 不限于，所述(至少)一種(雙順?lè)醋踊蛏踔炼囗樂(lè)醋?RNA，優(yōu)選mRNA，可以編碼上文提及 的抗原組的至少兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種(優(yōu) 選不同的)抗原或在它們上述定義內(nèi)的片段或變體。更優(yōu)選地，但不限于此，所述(至少) 一種(雙順?lè)醋踊蛏踔炼囗樂(lè)醋?RNA,優(yōu)選mRNA，可以編碼，例如，上文提及的抗原亞組的 至少兩種、三種、四種、五種或六種(優(yōu)選不同的)抗原或它們?cè)谏鲜龆x內(nèi)的片段或變體。 在該情形中，如上文定義的所謂的IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列可以作為唯一的核糖 體結(jié)合位點(diǎn)行使功能，但是它還可以作用為提供如上文定義的編碼幾種蛋白的雙順?lè)醋踊?甚至多順?lè)醋覴NA，所述蛋白將由彼此獨(dú)立的核糖體翻譯。按照本發(fā)明可以使用的IRES序 列的實(shí)例是選自小RNA病毒(例如FMDV)，鼠疫病毒(CFFV)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)，腦心肌 炎病毒(ECMV)，口蹄疫病毒(FMDV)，丙型肝炎病毒(HCV)，豬霍亂病毒(CSFV)，小鼠淋巴瘤 病毒(MLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些。按照另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物可以包括 如上文定義的至少一種單順?lè)醋覴NA、優(yōu)選mRNA和如上述定義的至少一種雙順?lè)醋踊蛏踔?br> 41多順?lè)醋覴NA、優(yōu)選mRNA的混合物。所述至少一種單順?lè)醋覴NA和/或所述至少一種雙順 反子或甚至多順?lè)醋覴NA優(yōu)選地編碼不同的抗原或它們?cè)谏鲜龆x內(nèi)的片段或變體，所述 抗原優(yōu)選地選自上文提及的抗原組或亞組之一，更優(yōu)選地在上文提及的組合之一中。然而， 所述至少一種單順?lè)醋覴NA和所述至少一種雙順?lè)醋踊蛏踔炼囗樂(lè)醋覴NA可以優(yōu)選地還編 碼選自上文提及的抗原組或亞組之一的(部分)相同的抗原，優(yōu)選地在上文提及的組合之 一中，條件是本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物完全提供如上文定義的至少兩種(優(yōu)選 不同的)抗原。這樣的實(shí)施方案可以有利的用于，例如交錯(cuò)的，例如時(shí)間依賴性的向需要其 的患者施用本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物。本發(fā)明的所述活性(免疫刺激性)組合 物的成分，特別是編碼所述至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的不同RNAs，可以，例如，包含在部 分組合物試劑盒(的不同部分)中，或者可以，例如，作為本發(fā)明所述的不同活性(免疫刺 激性)組合物的成分分開施用。優(yōu)選地，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA，其編碼選自上文定 義的抗原組或亞組、更優(yōu)選地在上述組合中的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，典型地包括約 50-約20000個(gè)，或100-約20000個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，優(yōu)選地約250-約20000個(gè)核苷酸，更優(yōu) 選地約500-約10000個(gè)，甚至更優(yōu)選地約500-約5000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA，其編碼 選自上文定義的抗原組或亞組、更優(yōu)選地在上述組合中的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原， 可以采用修飾的RNA的形式，其中如本文定義的任何修飾可以引入到所述活性(免疫刺激 性)組合物的所述至少一種RNA中。如本文定義的修飾優(yōu)選地導(dǎo)致本發(fā)明的活性(免疫刺 激性)組合物的穩(wěn)定的至少一種RNA。按照第一實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可 以因此提供為“穩(wěn)定的RNA”，優(yōu)選穩(wěn)定的mRNA，也就是說(shuō)，作為基本上抗體內(nèi)降解(例如， 由外切-或內(nèi)切-核酸酶進(jìn)行)的(m)RNA。所述穩(wěn)定可以，例如，通過(guò)本發(fā)明的活性(免 疫刺激性)組合物的所述至少一個(gè)(m)RNA的修飾的磷酸酯骨架實(shí)現(xiàn)。關(guān)于本發(fā)明的骨架 修飾是其中化學(xué)修飾RNA中包含的核苷酸骨架的磷酸酯的修飾?？梢詢?yōu)選地用在該情形 中的核苷酸包含，例如，硫代磷酸酯_修飾的磷酸酯骨架，優(yōu)選地磷酸酯骨架中所包含的至 少一個(gè)磷酸氧被硫原子取代。穩(wěn)定的(m)RNAs還可以包括，例如非離子磷酸酯類似物，諸 如例如，烷基和芳基磷酸酯，其中帶電荷的磷酸酯氧被烷基或芳基替換，或磷酸二酯和烷基 磷酸三酯，其中帶電荷的氧殘基以烷基化形式存在。所述骨架修飾典型地包括，但不暗示 任何限制，來(lái)自由下列各項(xiàng)組成的組的修飾甲基膦酸酯，磷酰胺和硫代硫酸酯(例如，胞 苷-5' -0-(l-硫代磷酸))。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以另外或備選地還包 含糖修飾。與本發(fā)明有關(guān)的糖修飾是對(duì)所述至少一種RNA的核苷酸的糖的化學(xué)修飾，并且 典型地包括，不暗示任何限制，選自由下列各項(xiàng)組成的組的糖修飾2'-脫氧-2'-氟-寡 核糖核苷酸(2'-氟-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氟-2'-脫氧尿苷-5'-三磷 酸)，2'-脫氧-2'-脫氨寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氨 基-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸)，'-0-烷基寡核糖核苷酸，2'-脫氧-2' -C-烷基寡 核糖核苷酸(2 ‘ -0-甲基胞苷-5'-三磷酸，2'-甲基尿苷-5'-三磷酸)，‘-C-烷 基寡核糖核苷酸，和它們的異構(gòu)體(2'-阿糖胞苷(araCytidine)-5'-三磷酸，2'-阿
42糖尿苷(araUridine)-5' _三磷酸)，或疊氮三磷酸(2'-疊氮-2'-脫氧胞苷-5'-三 磷酸，2'-疊氮-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸)。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以另外或備選地還包 含至少一種堿基修飾，與未改變的、即天然(natural)(=天然(native)) RNA序列相比較， 其優(yōu)選地適于顯著增加由所述至少一種RNA序列編碼的蛋白的表達(dá)。在這種情形中，顯著 性意指與天然RNA序列的表達(dá)相比，蛋白表達(dá)增加至少20%，優(yōu)選地至少30%，40%，50% 或60 %，更優(yōu)選地至少70 %，80 %，90 %或甚至100 %，并且最優(yōu)選地至少150 %，200 %或者 甚至300%以上。關(guān)于本發(fā)明，具有這樣的堿基修飾的核苷酸優(yōu)選地選自由下列各項(xiàng)組成的 堿基-修飾的核苷酸組2_氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸，2-氨基腺苷-5'-三磷酸， 2_硫胞苷-5'-三磷酸，2-硫尿苷-5'-三磷酸，4-硫尿苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙 基胞苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，5-溴尿 苷-5'-三磷酸，5-碘胞苷-5'-三磷酸，5-碘尿苷-5'-三磷酸，5-甲基胞苷-5'-三 磷酸，5-甲基尿苷-5'-三磷酸，6-氮胞苷-5'-三磷酸，6-氮尿苷-5'-三磷酸，6-氯 嘌呤核苷-5'-三磷酸，7-脫氮腺苷-5'-三磷酸，7-脫氮鳥苷-5'-三磷酸，8-氮雜 腺苷-5'-三磷酸，8-疊氮腺苷-5'-三磷酸，苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸，N1-甲基 腺苷-5'-三磷酸，N1-甲基鳥苷-5'-三磷酸，N6-甲基腺苷-5'-三磷酸，06-甲基鳥 苷-5'-三磷酸，假尿苷-5'-三磷酸，或嘌呤霉素-5'-三磷酸，黃苷-5'-三磷酸。 對(duì)于堿基修飾特別優(yōu)選的核苷酸選自由下列各項(xiàng)組成的堿基_修飾的核苷酸組5_甲基胞 苷-5'-三磷酸，7-脫氮鳥苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，和假尿苷-5'-三 磷酸。按照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 同樣可以通過(guò)引入進(jìn)一步修飾的核苷酸進(jìn)行修飾(且優(yōu)選地進(jìn)行穩(wěn)定)，所述進(jìn)一步修飾 的核苷酸包含它們的核糖或堿基結(jié)構(gòu)部分的修飾。通常，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組 合物的所述至少一種(m)RNA可以包含任何天然的(=天然存在的)核苷酸，例如，鳥苷， 尿嘧啶，腺苷，和/或胞嘧啶或它們的類似物。在該情形中，核苷酸類似物定義為天然存 在的核苷酸的非天然存在的變體。因此，類似物是化學(xué)衍生的具有非天然存在的官能團(tuán) 的核苷酸，所述非天然存在的官能團(tuán)優(yōu)選地添加或由天然存在的核苷酸刪除，或其取代核 苷酸的天然存在的官能團(tuán)。因此，天然存在的核苷酸的每個(gè)成分可以進(jìn)行修飾，即，形成 RNA序列的骨架(見上文)的堿基成分、糖(核糖)成分和/或磷酸酯成分。鳥苷、尿嘧 啶、腺苷和胞嘧啶的類似物包括，不暗示任何限制，已經(jīng)化學(xué)改變的任何天然存在的或非天 然存在的鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷或胞嘧啶，例如，通過(guò)乙?；⒓谆?、羥基化等化學(xué)改 變，其包括1-甲基-腺苷，1-甲基-鳥苷，1-甲基-肌苷，2，2_ 二甲基-鳥苷，2，6_ 二氨 基嘌呤，2'-氨基-2'-脫氧腺苷，2'-氨基-2'-脫氧胞苷，2'-氨基-2'-脫氧 鳥苷，2'-氨基-2'-脫氧尿苷，2-氨基-6-氯嘌呤核苷，2-氨基嘌呤-核苷，2'-阿 糖腺苷(Araadenosine),2'-阿糖胞苷(Aracytidine), 2 ‘-阿糖尿苷(Arauridine)， 2'-疊氮-2'-脫氧腺苷，2'-疊氮-2'-脫氧胞苷，2'-疊氮-2'-脫氧鳥苷， 2'-疊氮-2'-脫氧尿苷，2-氯腺苷，2'-氟-2'-脫氧腺苷，2'-氟-2'-脫氧胞 苷，2'-氟-2'-脫氧鳥苷，2'-氟-2'-脫氧尿苷，2'-氟胸苷，2-甲基-腺苷，2-甲 基-鳥苷，2-甲基-硫-N6-異戊烯基(isopenenyl)-腺苷，2' -0-甲基_2_氨基腺苷，2' -0-甲基-2'-脫氧腺苷，2' -0-甲基-2'-脫氧胞苷，2' -0-甲基-2'-脫氧鳥 苷，2' -0-甲基-2'-脫氧尿苷，2' -0-甲基-5-甲基尿苷，2' -0-甲基肌苷，2' -0-甲 基假尿苷，2-硫代胞苷，2-硫代-胞嘧啶，3-甲基-胞嘧啶，4-乙酰基-胞嘧啶，4-硫尿苷， 5-(羧基羥甲基)-尿嘧啶，5，6- 二氫尿苷，5-氨基烯丙基胞苷，5-氨基烯丙基-脫氧-尿 苷，5-溴尿苷，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶，5-氯-阿 糖胞苷，5-氟-尿苷，5-碘尿苷，5-甲氧基羰基甲基-尿苷，5-甲氧基-尿苷，5-甲基-2-硫 代_尿苷，6-氮胞苷，6-氮尿苷，6-氯-7-脫氮-鳥苷，6-氯嘌呤核苷，6-巰基-鳥苷，6-甲 基_巰基嘌呤_核苷，7-脫氮-2 ‘-脫氧-鳥苷，7-脫氮腺苷，7-甲基-鳥苷，8-氮腺苷， 8_溴-腺苷，8-溴-鳥苷，8-巰基-鳥苷，8-氧代鳥苷，苯并咪唑-核苷，3-D-甘露糖基-辮 苷((0-D-marmosyl-queosine)，二氫-尿嘧啶，肌苷，N1-甲基腺苷，N6_([6_氨基己基] 氨基甲酰基甲基)“腺苷，N6-異戊烯基-腺苷，N6-甲基-腺苷，N7-甲基-黃苷，N-尿嘧 啶-5-羥基乙酸甲酯，嘌呤霉素，辮苷(Queosine)，尿嘧啶-5-羥基乙酸，尿嘧啶-5-羥基乙 酸甲酯，Wybutoxosine，黃苷，和木-腺苷。所述類似物的制備是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的， 例如，由美國(guó)專利 4，373，071，US 4, 401, 796,US 4, 415, 732,US 4, 458, 066,US 4，500，707， US4, 668, 777,US 4，973，679，US 5，047，524，US 5，132，418，US 5，153，319，US5, 262，530 和 5，700，642可知。在上述類似物的情形中，按照本發(fā)明可以特別優(yōu)選增加本發(fā)明活性(免 疫刺激性)組合物的RNA的免疫原性和/或不干擾已經(jīng)引入的RNA進(jìn)一步修飾的那些類似 物。按照特別的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 可以包含脂質(zhì)修飾。所述脂質(zhì)_修飾的RNA典型地包括如本文定義的RNA，其編碼選自上述 定義的抗原組或亞組的、優(yōu)選在上述組合中的至少兩種抗原。所述脂質(zhì)_修飾的RNA典型 地進(jìn)一步包含與所述RNA共價(jià)連接的至少一個(gè)連接體，和與各自的連接體共價(jià)連接的至少 一個(gè)脂質(zhì)。備選地，所述脂質(zhì)_修飾的RNA包括如本文定義的至少一個(gè)RNA和與所述RNA 共價(jià)連接(無(wú)連接體)的至少一個(gè)(雙官能性)脂質(zhì)。按照第三備選方案，所述脂質(zhì)-修 飾的RNA包括如本文定義的RNA，與所述RNA共價(jià)連接的至少一個(gè)連接體，和與各自的連接 體共價(jià)連接的至少一個(gè)脂質(zhì)，和與所述RNA共價(jià)連接(無(wú)連接體)的至少一個(gè)(雙官能性) 脂質(zhì)。在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA中包含的脂質(zhì)(與 其復(fù)合或共價(jià)結(jié)合)典型地是脂質(zhì)或優(yōu)選自身是生物活性的親脂殘基。所述脂質(zhì)優(yōu)選地 包括天然物質(zhì)或化合物，諸如例如，維生素，例如，a “生育酚(維生素E)，包括RRR- a -生 育酚(以前為D-a-生育酚)，L-a-生育酚，外消旋D，L_ a -生育酚，維生素E琥珀酸 酯(VES)，或維生素A及其衍生物，例如視黃酸，視黃醇，維生素D及其衍生物，例如維生素 D以及其麥角固醇前體，維生素E及其衍生物，維生素K及其衍生物，例如維生素K和相關(guān) 的醌或植醇化合物，或類固醇，如膽汁酸，例如膽酸，脫氧膽酸，脫氫膽酸，可的松，洋地黃毒 苷(digoxygenin)，睪酮，膽固醇或硫代膽固醇。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它脂質(zhì)或親脂殘基包 括，不暗示任何限制，聚二醇(Oberhauser等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1992，20， 533)，脂肪族基團(tuán)，諸如例如，C1-C20-鏈烷，C1-C20-鏈烯或C1-C20-鏈烷醇化合物，等等， 諸如例如，十二烷二醇，十六醇或i^一烷基殘基(Saison-Behmoaras等，，EMB0 J，1991，10， 111 ；Kabanov 等，，F(xiàn)EBS Lett. (FEBS 通信)，1990，259，327 ；Svinarchuk 等，，Biochimie,1993，75，49)，磷脂，諸如例如，磷脂酰甘油，二?；字８视?，磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂 酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，雙十六烷基_外消旋_甘油 (di-hexadecyl-rac-glycerol)，鞘脂，腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂，或三乙基銨1，2_ 二 _0_十六 烷基_外消旋_甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，，Tetrahedron Lett.(四面體通信)， 1995，36，3651 ；Shea 等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1990，18，3777)，聚胺或聚二醇， 諸如例如，聚乙二醇(PEG) (Manoharan 等，，Nucleosides&Nucleotides (核苷和核苷酸)， 1995，14，969)，六甘醇(HEG)，棕櫚酸甘油酯或棕櫚基殘基(Mishra等，，Biochim. Biophys. Acta (生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào))，1995，1264，229)，十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇?xì)?基(Crooke 等，，J. Pharmacol. Exp. Ther.(藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)治療雜志)，1996，277，923)，以及 蠟，萜烯，脂環(huán)烴，飽和的和單_或多-不飽和脂肪酸殘基，等等。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA可以同樣進(jìn)行穩(wěn)定，以 防止RNA在體內(nèi)被各種途徑降解。在本領(lǐng)域已知mRNA或RNA的體內(nèi)不穩(wěn)定性和(快速) 降解通?？梢栽诨赗NA的組合物應(yīng)用中代表這嚴(yán)重的問(wèn)題。這種RNA不穩(wěn)定性典型地是 由于RNA-降解酶“RNA酶”(核糖核酸酶)引起，其中所述核糖核酸酶的污染有時(shí)可以完全 降解溶液中的RNA。因此，在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的天然mRNA降解非常精細(xì)地調(diào)控，并且RNA酶 污染通?？梢酝ㄟ^(guò)在使用所述組合物之前進(jìn)行專門的處理而去除，特別是用焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理。在現(xiàn)有技術(shù)中，在該情形中，可以使用的多種天然降解機(jī)制是已知的。例如， 在體內(nèi)，末端結(jié)構(gòu)典型地對(duì)于mRNA是至關(guān)重要的。例如，在天然存在的mRNAs的5'末端通 常存在所謂的“帽結(jié)構(gòu)”(修飾的鳥苷核苷酸)，且在3'末端典型地是多至200個(gè)腺苷的核 苷酸的序列(所謂的聚腺苷酸尾)。本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA，特別是如果作為mRNA提 供，因此可以通過(guò)添加所謂的“5'帽”結(jié)構(gòu)而抗RNA酶降解被穩(wěn)定。在這種情形中，特別優(yōu) 選 m7G(5' )ppp(5' (A，G(5' )ppp(5' )A 或 G(5' )ppp(5' )G 作為 “5'帽”結(jié)構(gòu)。然 而，僅在如果還沒(méi)有在本發(fā)明的免疫刺激性組合物的(m)RNA 5'末端引入修飾如脂質(zhì)修飾 時(shí)或者如果所述修飾不干擾所述(未修飾的或化學(xué)修飾的)(m)RNA的免疫原性特性時(shí)引入 這樣的修飾。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種 RNA，特別是如果所述RNA采用mRNA形式時(shí)，可以在3'末端包含典型地約10-200個(gè)腺苷 核苷酸、優(yōu)選約10-100個(gè)腺苷核苷酸、更優(yōu)選約20-100個(gè)腺苷核苷酸或甚至更優(yōu)選地約 40-80個(gè)腺苷核苷酸的聚腺苷酸尾。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種 RNA，特別是如果所述RNA采用mRNA形式時(shí)，可以在3'末端包含典型地約10-200個(gè)胞嘧啶 核苷酸、優(yōu)選地約10-100個(gè)胞嘧啶核苷酸、更優(yōu)選地約20-70個(gè)胞嘧啶核苷酸或甚至更優(yōu) 選地約20-60個(gè)或甚至10-40個(gè)胞嘧啶核苷酸的聚胞苷酸尾。按照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA 可以進(jìn)行修飾，并且因此被穩(wěn)定，特別是如果所述RNA采用mRNA形式時(shí)，通過(guò)修飾所述RNA 的G/C含量，優(yōu)選是至少一種RNA的編碼區(qū)的G/C含量進(jìn)行。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，與其具體的野生型(m)RNA，即未修飾的(m) RNA編碼區(qū)的G/C含量相比較，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA的編碼區(qū)的G/C含量被修飾，特別是增加。與具體的野生型(m) RNA所編碼的氨基酸序列相 比較，所述至少一種(m) RNA所編碼的氨基酸序列優(yōu)選不被修飾。 本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA的這種修飾是基于 要翻譯的任意(m) RNA區(qū)序列對(duì)于所述(m) RNA的有效翻譯是重要的事實(shí)。因此，多種核苷酸 的組成和序列是重要的。特別地，具有增加的G(鳥苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增 加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更穩(wěn)定。按照本發(fā)明，因此與其野生型(m)RNA相比 較，所述(m)RNA的密碼子不同，同時(shí)保留所翻譯的氨基酸序列，以致它們包括增加量的G/C 核苷酸。關(guān)于一些密碼子編碼一種和相同的氨基酸的事實(shí)(所謂的遺傳密碼簡(jiǎn)并性)，可以 確定對(duì)穩(wěn)定性最有利的密碼子(所謂的備選密碼子應(yīng)用)。取決于由所述至少一種(m) RNA編碼的氨基酸，與其野生型序列相比較，對(duì)于所述 至少一種(m)RNA序列的修飾存在多種可能性。在由專門包含G或C核苷酸的密碼子編碼 的氨基酸的情形中，不需要密碼子的修飾。因此，對(duì)于Pro (CCC或CCG)，Arg (CGC或CGG)， Ala (GCC或GCG)和Gly (GGC或GGG)的密碼子不需要修飾，因?yàn)椴淮嬖贏或U。相反，包含A和/或U核苷酸的密碼子可以通過(guò)編碼相同的氨基酸但是不含有A 和/或U的其它密碼子的取代而進(jìn)行修飾。這些的實(shí)例如下Pro的密碼子可以由CXU或CCA修飾為CCC或CCG ；Arg的密碼子可以由CGU或CGA或AGA或AGG修飾為CGC或CGG ；Ala的密碼子可以由G⑶或GCA修飾為GCC或GCG ；Gly的密碼子可以由GGU或GGA修飾為GGC或GGG。在其它情形中，盡管不從所述密碼子中去除A或U核苷酸，然而，可以通過(guò)使用含 有較低的A和/或U核苷酸含量的密碼子而降低A和U含量。這些的實(shí)例如下Phe的密碼子可以由UUU修飾為UUC ；Leu的密碼子可以由UUA，UUG, CUU或CUA修飾為CUC或CUG ；Ser的密碼子可以由UCU或UCA或AGU修飾為UCC，UCG或AGC ；Tyr的密碼子可以由UAU修飾為UAC ；Cys的密碼子可以由UGU修飾為UGC ；His的密碼子可以由CAU修飾為CAC ；Gln的密碼子可以由CAA修飾為CAG ；Ile的密碼子可以由AUU或AUA修飾為AUC ；Thr的密碼子可以由A⑶或ACA修飾為ACC或ACG ；
Asn的密碼子可以由AAU修飾為AAC ；Lys的密碼子可以由AAA修飾為AAG ；Val的密碼子可以由GUU或GUA修飾為GUC或⑶G ；Asp的密碼子可以由GAU修飾為GAC ；Glu的密碼子可以由GAA修飾為GAG ；終止密碼子UAA可以修飾為UAG或UGA。另一方面，在Met (AUG)和Trp (UGG)的密碼子的情形中，不存在序列修飾的可能性。上文列出的取代可以單獨(dú)的或以所有可能的組合使用，以在與其具體的野生型(m) RNA (S卩，原始序列)相比較時(shí)，提高本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少 一種(m)RNA的G/C含量。因此，例如，在野生型序列中存在的所有Thr密碼子可以修飾為 ACC (或ACG)。然而，優(yōu)選地，例如，使用上述取代可能性的組合將原始序列(野生型(m) RNA)中編碼Thr的所有密碼子取代為ACC (或ACG)和將原始編碼Ser的所有密碼子取代為UCC (或UCG或AGC)；將原始序列中編碼Ile的所有密碼子取代為AUC和將原始編碼Lys的所有密碼子取代為AAG和將原始編碼Tyr的所有密碼子取代為UAC ；將原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或GUG)和將原始編碼Glu的所有密碼子取代為GAG和將原始編碼Ala的所有密碼子取代為GCC (或GCG)和將原始編碼Arg的所有密碼子取代為CGC (或CGG)；將原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或GUG)和將原始編碼Glu的所有密碼子取代為GAG和將原始編碼Ala的所有密碼子取代為GCC (或GCG)和
將原始編碼Gly的所有密碼子取代為GGC (或GGG)和將原始編碼Asn的所有密碼子取代為AAC ；將原始序列中編碼Val的所有密碼子取代為GUC (或GUG)和將原始編碼Phe的所有密碼子取代為UUC和將原始編碼Cys的所有密碼子取代為UGC和將原始編碼Leu的所有密碼子取代為CUG (或CUC)和將原始編碼Gln的所有密碼子取代為CAG和將原始編碼Pro的所有密碼子取代為CCC(或CCG)；等等。優(yōu)選地，與編碼本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或變體的野生型(m) RNA的G/C含量相比較，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m) RNA的編 碼區(qū)的G/C含量增加至少7%，更優(yōu)選地至少15%，特別優(yōu)選地至少20%。按照具體實(shí)施方 案，在編碼本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或變體的區(qū)域中或野生型(m)RNA 序列的完整序列中至少5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，更優(yōu)選地至少70%，甚至 更優(yōu)選地至少80%和最優(yōu)選地至少90%，95%或者甚至100%的可取代的密碼子被取代， 由此增加所述序列的GC/含量。在該情形中，與野生型序列相比較，特別優(yōu)選將本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合 物的所述至少一種(m) RNA的G/C含量增加至最大值(S卩，可取代的密碼子100%被取代)， 特別是在編碼蛋白的區(qū)域中。按照本發(fā)明，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA的另一種優(yōu)選修飾基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即翻譯效率也通過(guò)細(xì)胞中tRNA出現(xiàn)的不同頻率確定。因此， 如果在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m) RNA中存在所謂的“罕用密 碼子”達(dá)到增多的程度，則相應(yīng)修飾的至少一種(m) RNA序列被翻譯至比其中存在編碼相對(duì) “頻繁” tRNA的密碼子的情形顯著更差的程度。按照本發(fā)明，在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述修飾的至少一種(m)RNA中，編碼輔助蛋白的區(qū)域與野生型(m)RNA的相應(yīng)區(qū)域相比被修飾，以致編碼細(xì)胞中相對(duì)稀有的tRNA的野生型序列的至少一個(gè)密碼子交換成編碼細(xì)胞中相對(duì)頻繁的tRNA的密碼 子并攜帶與相對(duì)稀有tRNA相同的氨基酸。通過(guò)該變化，改變本發(fā)明的活性(免疫刺激性) 組合物的所述至少一種(m)RNA的序列，從而插入可以獲得頻繁出現(xiàn)的tRNA的密碼子。換 言之，按照本發(fā)明，在各種情形中，通過(guò)該變化，野生型序列的編碼細(xì)胞中相對(duì)稀有的tRNA 的所有密碼子可以交換成編碼細(xì)胞中相對(duì)頻繁的tRNA的密碼子，并且其，在各種情形中， 攜帶與相對(duì)稀有tRNA相同的氨基酸。哪些tRNA在細(xì)胞中相對(duì)頻繁出現(xiàn)和相反地哪些相對(duì)罕見出現(xiàn)是本領(lǐng)域中技術(shù) 人員已知的，cf.例如Akashi，Curr. Opin. Genet. Dev.(當(dāng)前遺傳發(fā)育觀點(diǎn))2001，11 (6) 660-666。特別優(yōu)選對(duì)于特定氨基酸，使用最頻繁出現(xiàn)的tRNA的密碼子，例如Gly密碼子， 其使用在(人)細(xì)胞中最頻繁出現(xiàn)的tRNA。按照本發(fā)明，特別優(yōu)選的是將本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述修飾的 至少一種(m) RNA中增加的特別是最大化的序列G/C含量與不改變由所述(m) RNA編碼區(qū)編 碼的蛋白的氨基酸序列的“頻繁”密碼子相連。這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案容許提供本發(fā)明的活 性(免疫刺激性)組合物的特別有效翻譯和穩(wěn)定(修飾)的至少一種(m)RNA。如上述的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的修飾的至少一種(m)RNA的確定 (增加的G/C含量；tRNA的交換)可以利用WO 02/098443中解釋的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行——其 公開內(nèi)容全文包括在本發(fā)明中。利用該計(jì)算機(jī)程序，任何所需的(m)RNA的核苷酸序列可以 借助于遺傳密碼或其簡(jiǎn)并性質(zhì)來(lái)修飾，由此最大G/C含量結(jié)果，與使用編碼細(xì)胞中盡可能 頻繁出現(xiàn)的tRNA的密碼子相結(jié)合，導(dǎo)致由所述修飾的至少一種(m) RNA編碼的氨基酸序列 與未修飾的序列相比，優(yōu)選不被改變。備選地，與原始序列相比，還可能僅改變G/C含量或 僅改變密碼子的使用。Visual Basic (視覺基礎(chǔ))6. 0(使用的開發(fā)環(huán)境具有Servic印ack3 的 Microsoft Visual StudioEnterprise6. 0)中的源碼也記述在 WO 02/098443 中。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少 一種(m) RNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)環(huán)境中的A/U含量與其特定野生型(m) RNA的核糖體結(jié)合 位點(diǎn)環(huán)境中A/U含量相比是增加的。該修飾(在核糖體結(jié)合位點(diǎn)周圍增加的A/U含量) 增加核糖體結(jié)合所述至少一種(m)RNA的效率。核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Kozak序列 GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO 27)，AUG形成起始密碼子)的有效結(jié)合又具有有效翻譯所述至 少一種(m)RNA的作用。按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種 (m) RNA可以關(guān)于潛在地促降解序列元件(destabilizingsequence elements)而被修飾。 具體地，所述至少一種(m)RNA的編碼區(qū)和/或5’和/或3’非翻譯區(qū)與特定野生型(m)RNA 相比可以被修飾，從而不包含促降解序列元件，所修飾的至少一種(m)RNA的編碼氨基酸序 列與其特定野生型(m) RNA相比優(yōu)選不被修飾。已知，例如，在真核生物的RNA序列中存在 促降解序列元件(DSE)，信號(hào)蛋白與其結(jié)合并在體內(nèi)調(diào)節(jié)RNA的酶降解。為了進(jìn)一步穩(wěn)定所 修飾的至少一種(m)RNA，任選地在編碼本文定義的抗原、抗原蛋白或抗原肽的區(qū)域內(nèi)，可以 因此進(jìn)行與野生型(m)RNA的相應(yīng)區(qū)域相比的一種或多種這樣的修飾，從而使其中不含有 或基本上不含有促降解序列元件。按照本發(fā)明，也可以通過(guò)所述修飾，從本發(fā)明的活性(免 疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA中除去非翻譯區(qū)(3‘-和/或5' -UTR)中存在的DSE。所述促降解序列是例如富含AU的序列(AURES)，其存在于許多不穩(wěn)定RNA的 3 ‘ -UTR 部分(Caput 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))1986，83 1670-1674)。因此按照本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA與野生型 (m)RNA相比，優(yōu)選被修飾使得該所述至少一種(m)RNA不含有所述促降解序列。這還應(yīng)用于 那些由可能的核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列基序，例如序列GAACAAG，其包含在編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 的基因的 3' -UTR 片段中(Binder 等，EMBO J. (ΕΜΒ0 雜志)1994，13 1969-1980)。在本發(fā) 明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA中，這些序列基序優(yōu)選地被去除。按照本發(fā)明還優(yōu)選地，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA，以 修飾的形式，具有如上文定義的以修飾形式存在的至少一個(gè)IRES和/或至少一個(gè)5'和/ 或3'穩(wěn)定序列，例如，以增強(qiáng)核糖體結(jié)合或允許位于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物 的至少一種(雙_或甚至是多順?lè)醋?RNA上的不同編碼的抗原的表達(dá)。按照本發(fā)明，本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種(m)RNA還更 優(yōu)選地具有至少一個(gè)5'和/或3'穩(wěn)定序列。這些位于5’和/或3’非翻譯區(qū)的穩(wěn)定序 列具有增長(zhǎng)所述至少一種(m)RNA在細(xì)胞溶膠中半衰期的作用。這些穩(wěn)定序列可以與在病 毒、細(xì)菌和真核生物中存在的天然存在序列具有100%序列同源性，但也可以是部分或完全 合成的。例如來(lái)自智人(Homo sapiens)或非洲爪蟾(Xenopus laevis)的珠蛋白基因的 不翻譯序列(UTR)可以作為可以在本發(fā)明中關(guān)于穩(wěn)定的RNA使用的穩(wěn)定序列的實(shí)例提及。 穩(wěn)定序列的另一個(gè)實(shí)例具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO :28)，其包 含在編碼珠蛋白，α (I)-膠原蛋白，15-脂加氧酶或編碼酪氨酸羥化酶的非常穩(wěn)定的RNA 的 3，UTR 中(參見 Holcik 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))1997，94 2410-2414)。所述穩(wěn)定序列當(dāng)然可以單獨(dú)或彼此組合使用，并且還與本領(lǐng)域中技術(shù)人員已 知的其他穩(wěn)定序列組合使用。本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種(m)RNA因 此優(yōu)選表示為珠蛋白UTR(非翻譯區(qū))-穩(wěn)定的RNA，特別地表示為珠蛋白UTR-穩(wěn)定的RNA。然而，關(guān)于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA優(yōu)選地進(jìn)行堿基 的置換、添加或去除，其利用用來(lái)制備本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA 的DNA基質(zhì)使用公知的基因定點(diǎn)誘變或寡核苷酸連接策略技術(shù)進(jìn)行(參見例如Maniatis 等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，第三版，Cold Spring Harbor(冷泉港)， 紐約，2001)。在該過(guò)程中，為了制備所述至少一種(m)RNA，可以在體外轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的DNA分 子。該DNA基質(zhì)優(yōu)選地包括合適的啟動(dòng)子，例如T7或SP6啟動(dòng)子，以用于體外轉(zhuǎn)錄，其后是 待制備的所述至少一種RNA的理想核苷酸序列和體外轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)。形成至少一種目 的RNA基質(zhì)的DNA分子可以通過(guò)發(fā)酵增殖和隨后分離為可以在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制的質(zhì)粒的一部分 來(lái)制備?？梢宰鳛檫m合于本發(fā)明提及的質(zhì)粒是例如質(zhì)粒pT7Ts (GenBank編號(hào)U26404 ；Lai 等，Development (發(fā)育)1995，121 :2349_2360)，pGEM 系列，例如pGEM -l (GenBank 編號(hào) X65300 ；來(lái)自 Promega)和 pSP64(GenBank 編號(hào) X65327)；還參考Mezei 和 Storts， Purification of PCRProducts (PCR 產(chǎn)物的純化)，在Griffin 和 Griffin (編)，PCR Technology =Current Innovation (PCR 技術(shù)當(dāng)前改革)中，CRC Press (CRC 出版社)，Boca Raton, FL,2001 ο
本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的穩(wěn)定可以同樣通過(guò) 將所述至少一種RNA與陽(yáng)離子化合物締合或復(fù)合、或與其結(jié)合而進(jìn)行，所述陽(yáng)離子化合物 特別是聚陽(yáng)離子化合物，例如，(聚)陽(yáng)離子肽或蛋白。特別地，使用魚精蛋白、核仁蛋白 (nucleoline)、精胺(spermin)或亞精胺作為聚陽(yáng)離子，針對(duì)RNA的核苷酸結(jié)合蛋白是特別 有效的。此外，同樣可以使用其它陽(yáng)離子肽或蛋白，諸如聚-L-賴氨酸或組蛋白。用于穩(wěn)定 RNA的這一方法記述在EP-A-1083232中，其公開內(nèi)容通過(guò)弓I用完全結(jié)合在本發(fā)明中?？梢?用于穩(wěn)定本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的RNA的其它優(yōu)選的陽(yáng)離子物質(zhì)包括陽(yáng)離子 多糖，例如，脫乙酰殼多糖、polybrene、聚氮丙啶(PEI)或聚-L-賴氨酸(PLL)等。本發(fā)明 活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA與陽(yáng)離子化合物(例如，作為基于脂質(zhì)的 復(fù)合劑的陽(yáng)離子蛋白或陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如，oligofectamine)的締合或復(fù)合優(yōu)選地增加作為 藥物活性成分存在的所述至少一種RNA向待治療的細(xì)胞或待治療的生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。關(guān)于 通過(guò)復(fù)合穩(wěn)定本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的穩(wěn)定作用，還參 考本文的公開內(nèi)容，其也支持RNA的穩(wěn)定。按照另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一 種RNA可以另外或備選地編碼分泌信號(hào)肽。所述信號(hào)肽是這樣的序列，其典型地表現(xiàn)出約 15-30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，且優(yōu)選地位于所編碼的肽的N端，并不限于此。如本文定義的信號(hào) 肽優(yōu)選地允許由所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA編碼的抗原、抗原蛋 白或抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)到限定的細(xì)胞區(qū)室中，優(yōu)選地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或內(nèi)體-溶酶 體區(qū)室中。如本文定義的分泌信號(hào)肽序列的實(shí)例包括，但不限于此，經(jīng)典或非經(jīng)典MHC-分 子的信號(hào)序列(例如，MHC I和II分子的信號(hào)序列，例如，I類MHC分子HLA-A*0201的信號(hào) 序列)，如本文定義的細(xì)胞因子或免疫球蛋白的信號(hào)序列，如本文定義的免疫球蛋白或抗體 的不變鏈的信號(hào)序列，Lampl、Tapasin、Erp57、Calretikulin、鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)、和其它 膜締合蛋白或與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或內(nèi)體-溶酶體區(qū)室締合的蛋白的信號(hào)序列。特別優(yōu)選地，按 照本發(fā)明可以使用I類MHC分子HLA-A*0201的信號(hào)序列。任何上述修飾可以應(yīng)用于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種 RNA上，并且還應(yīng)用于在本發(fā)明的情形中所使用的任意(m) RNA上，并且可以，如果合適或需 要，以任意組合彼此組合，條件是這些修飾組合在各自的至少一種RNA中彼此互不干擾。本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠因此進(jìn)行他的選擇。按照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物可以包括佐劑。 在該情形中，佐劑可以理解為適于支持本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物的施用和 遞送的任何化合物。此外，所述佐劑可以，不限于此，起始或增加先天免疫系統(tǒng)的免疫反應(yīng)， 即，非特異性免疫反應(yīng)。換言之，當(dāng)施用時(shí)，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物典型 地由于由包含在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物中的至少一種RNA編碼的至少兩種 抗原而起始適應(yīng)性免疫反應(yīng)。另外，本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物可以由于加 入如本文為本發(fā)明所述的活性(免疫刺激性)組合物限定的佐劑而產(chǎn)生(支持性)先天 性免疫反應(yīng)。所述佐劑可以選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和適用于本情形的任何佐劑，即， 支持在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的任何佐劑。優(yōu)選地，所述佐劑可以選自由下列各項(xiàng)組 成的組，但不限于此TDM，MDP,胞壁酰二肽，泊洛沙姆(pluronics)，明礬溶液，氫氧化鋁， ADJUMER (聚磷腈)；磷酸鋁凝膠；源自藻類的葡聚糖；algammulin ；氫氧化鋁凝膠(明礬)；高蛋白吸附性氫氧化鋁凝膠；低粘性氫氧化鋁凝膠；AF或SPT(角鯊?fù)槿闋钜?5% )，吐溫 80(0.2% )，泊洛沙姆 L121(1.25% )，磷酸鹽緩沖液，pH 7.4) ；AVRIDINE (丙烷二胺)； BAYR1005 ((N- (2-脫氧-2-L-亮氨酰氨基_b_D_吡喃葡糖基)-N-十八烷基-十二烷酰_酰 胺氫化乙酸(hydroacetate)) ；CALCITRI0L (1-α，25-二羥基-維生素D3)；磷酸鈣凝膠； CAPTM (磷酸鈣納米顆粒)；霍亂全毒素，霍亂-毒素-Al-蛋白-A-D-片段融合蛋白，霍亂毒 素的B亞基；CRL 1005(嵌段共聚物Ρ1205)；包含細(xì)胞因子的脂質(zhì)體；DDA (二甲基二-十八 烷基溴化銨)；DHEA (脫氫表雄酮)；DMPC (二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿)；DMPG ( 二肉豆蔻酰磷 脂酰甘油)；DOC/明礬復(fù)合物(脫氧膽酸鈉鹽)；弗氏完全佐劑；弗氏不完全佐劑；Y菊粉； Gerbu佐劑(下列各項(xiàng)的混合物i)N-乙酰葡糖胺基-(P 1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰 基-D-谷氨酰胺(GMDP)，ii) 二甲基雙十八烷基氯化銨(DDA)，iii)鋅_L_脯氨酸鹽復(fù)合物 (ZnPro-8) ；GM-CSF) ；GMDP (N-乙酰葡糖胺基_(bl_4)-N-乙酰胞壁酰_L_丙氨?；?D-異谷 氨酰胺)；咪喹莫特(1-(2_甲基丙基)-1Η-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)；ImmTherTM(N-乙 酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-異Glu-L-Ala- 二棕櫚酸甘油酯)；DRVs (由脫 水-再水合小泡制備的免疫脂質(zhì)體)；干擾素-Y ；白介素；白介素-2;白介素-7;白介 素-12 ； ISC0MS ； ISC0PREP 7. 0. 3. ；脂質(zhì)體；L0X0RIBINE (7-烯丙基 _8_ 氧代鳥苷)；LT 口服佐劑(大腸桿菌(E. coli)易變腸毒素-前毒素)；任意組成的微球體和微粒；MF59 ； (角鯊烯-水乳狀液)；M0NTANIDE ISA 51 (純化的不完全弗氏佐劑)；M0NTANIDEISA 720 (可代謝的油佐劑)；MPL (3-Q-去?；?4 ‘-單磷?；|(zhì)A) ；MTP-PE和MTP-PE脂 質(zhì)體((N-乙?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰基-L-丙氨酸-2- (1，2- 二棕櫚?；?sn-甘 油 _3-(羥基磷酰氧基))-乙基酰胺，一鈉鹽)；MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH 3) ；MURAPALMITINE 和 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-異 Gln-sn-甘油二棕櫚酰)； NAGO(唾液酸苷酶-半乳糖氧化酶)；任意組成的納米球體或納米顆粒；NISVs (非離子表 面活性劑小泡)；PLEURAN ( β -葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA (乳酸和乙醇酸的同聚物-和共 聚物；微球體/納米球體)；PLUR0NICL121 ;PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；P0DDS (類蛋白 微球體)；聚乙烯氨基甲酸酯衍生物；聚_rA:聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸復(fù)合物)；聚山 梨酸酯80 (吐溫80)；螺旋狀蛋白(Avanti極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids, Inc.), Alabaster, AL) ；STIMUL0N (QS-21) ；Quil-A (Quil-A 皂角苷)；S-28463 (4-氨基-otec-二 甲基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-ItmC Syntex佐劑制劑〃)； Sendai脂蛋白體(proteoliposomes)和包含Sendai的脂質(zhì)基質(zhì)；Span-85 (失水山梨糖醇 三油酸酯)；Specol (Marcol 52，司盤85和吐溫85的乳液)；角鯊烯或Robane (2,6,10, 15，19，23-六甲基二十四燒和 2，6，10，15，19，23—六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四燒 己烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸鹽酸鹽)；Theramid (N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰-L-Ala-D-異 Glu-L-Ala- 二棕櫚氧基丙酰胺)；Theronyl-MDP (Termurtide 或[thr U-MDP ；N-乙?；邗?L-threonyl-D-異谷氨酰胺)；Ty顆粒(Ty-VLPs或病 毒樣顆粒)；Walter-Reed脂質(zhì)體(包含吸附在氫氧化鋁上的脂質(zhì)A的脂質(zhì)體)，和脂質(zhì) 肽，其包括Pam3Cys，特別是鋁鹽，諸如Adju-phos，鋁膠(Alhydrogel)，Rehydragel ；乳狀 液，其包括 CFA，SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin ；共聚物，其包 括 Optivax (CRL1005)，L121, Poloaxmer4010)，等；脂質(zhì)體，其包括 Stealth，cochleates, 包括BIORAL ；植物來(lái)源的佐劑，其包括QS21，Quil A，Iscomatrix, ISCOM ；適于共刺激的佐劑，其包括番茄素，生物聚合物，其包括PLG，PMM，菊粉；微生物來(lái)源的佐劑，其包括羅莫肽，DET0X，MPL，CWS，甘露糖，CpG核酸序列，CpG7909，人TLR 1-10的配體，鼠TLR 1-13的配體， ISS-1018, IC31，咪唑并喹啉，阿普林津，Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs，霍亂毒素，熱變性 毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI錨定子，LNFPII I/LewisX,抗微生物肽，UC-1V150, RSV融合蛋 白，cdiGMP ；和適合用作拮抗劑的佐劑，包括CGRP神經(jīng)肽。合適的佐劑還可以選自陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子化合物，其中所述佐劑優(yōu)選地當(dāng)本發(fā)明 的活性(免疫刺激性組合物)的所述至少一種RNA與所述陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子化合物復(fù)合 時(shí)制備。所述活性(免疫刺激性)組合物的RNA與本文定義的陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子化合物 的締合或復(fù)合優(yōu)選地為佐劑提供特性，并且賦予所述活性(免疫刺激性)組合物的所述 至少一種RNA的穩(wěn)定作用。特別地，所述優(yōu)選的陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子化合物選自陽(yáng)離子或 聚陽(yáng)離子肽或蛋白，其包括魚精蛋白，核仁蛋白，精胺或亞精胺，或其它陽(yáng)離子肽或蛋白， 諸如聚-L-賴氨酸(PLL)，聚-精氨酸，堿性多肽，穿透細(xì)胞的肽(CPPs)，其包括HIV-結(jié) 合肽，Tat, HIV-ITat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetrain, VP22來(lái)源的或類似物肽，HSV VP22(單純皰疹)，MAP，KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精 氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，MPG-肽，Pep-1, L-寡聚物，降鈣素肽，觸角足來(lái)源的肽(特 另1J是來(lái)自 Drosophila antennapedia)，ρAntp, plsl, FGF，乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-來(lái)源的肽，SAP，魚精蛋白，精胺，亞精 胺，或組蛋白。其它優(yōu)選的陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子化合物可以包括陽(yáng)離子多糖，例如，脫乙酰 殼多糖，polybrene，陽(yáng)離子聚合物，例如聚氮丙啶(PEI)，陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如DOTMA [1_(2， 3-sioleyloxy)丙基)]-N，N, N-三甲基氯化銨，DMRIE，二 -C14-脒，DOTIM，SAINT，DC-Chol， BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷脂酰乙醇胺，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS Dioctadecylamidoglicylspermin, DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨， DOTAP 二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14 :0，O-雙十四烷酰_Ν_( α -三甲基氨 溶乙酰基)二乙醇胺氯，CLIPl 外消旋-[(2，3_雙十八烷基氧基丙基)(2-羥基乙基)]-二 甲基氯化銨，CLIP6:外消旋-[2(2，3_雙十六烷基氧基丙基-羥甲基氧基)乙基]三甲基 銨，CLIP9:外消旋-[2 (2，3-雙十六烷基氧基丙基-羥基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基銨， oligofectamine，或陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子聚合物，例如改性聚氨基酸，諸如β -氨基酸-聚 合物或反轉(zhuǎn)聚酰胺，等，改性聚乙烯，諸如PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，等， 改性丙烯酸脂，諸如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))，等，改性酰氨基胺 (Amidoamines)諸如pAMAM(聚(酰氨基胺))，等，改性聚β氨基酯(PBAE)，諸如二胺末端 改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，等，樹狀聚體，諸如聚丙胺樹 狀聚體或基于PAMAM的樹狀聚體，等，聚亞胺，諸如PEI 聚(乙烯亞胺)，聚(丙烯亞胺)， 等，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，諸如基于環(huán)糊精的聚合物，基于葡萄糖的聚合物，脫 乙酰殼聚糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，諸如PMOXA-PDMS共聚物，等，嵌段聚合 物，其由一個(gè)或多個(gè)陽(yáng)離子嵌段(例如，選自如上文提及的陽(yáng)離子聚合物)的組合和一個(gè)或 多個(gè)親水_或疏水_嵌段(例如，聚乙二醇)的組合組成；等。另外，可以通過(guò)與所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA復(fù)合而 用作佐劑的優(yōu)選的陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子蛋白或肽，可以選自具有下述總式(I)的蛋白或肽 (Arg)1 ； (Lys) m ； (His)n ； (Orn)。；(Xaa)x，其中 l+m+η+ο+χ = 8-15，并且 1，111，11或0 彼此獨(dú)立地可以是選自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15 的任一數(shù)字，條件是 Arg，Lys， His和Orn的總含量占該寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是選自除Arg，Lys, His或Orn外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是選自 0，1，2，3或4的任一數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過(guò)該寡肽所有氨基酸的50%。在該情 形中特別優(yōu)選的低聚精氨酸是，例如，Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9，R9H3, H3R9H3, YS SR9S SY, (RKH)4, Y (RKH)2R,等。此外，合適的佐劑可以選自具有式(II)的核酸=G1XmGn，其中G是鳥苷，尿嘧啶或 是鳥苷或尿嘧啶的類似物；χ是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的類 似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時(shí)，G是 鳥苷或其類似物，當(dāng)1 > 1時(shí)，至少50%的核 苷酸是鳥苷或其類似物；m是整數(shù)，并且至少為3 ;其中當(dāng)m= 3時(shí)，X是尿嘧啶或其類似物， 當(dāng)m > 3時(shí)，存在至少3個(gè)連續(xù)的尿嘧啶或其類似物；η是1_40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時(shí)，G 是鳥苷或其類似物，當(dāng)η > 1時(shí)，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物。其它合適的佐劑還可以選自具有式(III)的核酸=C1XmCn，其中C是胞嘧啶、尿嘧 啶或者是胞嘧啶或尿嘧啶的類似物；X是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核 苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時(shí)，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)1 > 1時(shí)，至 少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似物；m是整數(shù)，并且至少為3 ；其中當(dāng)m = 3時(shí)，X是尿嘧 啶或其類似物，當(dāng)m > 3時(shí)，存在至少3個(gè)連續(xù)的尿嘧啶或其類似物；η是1_40的整數(shù)，其 中當(dāng)η = 1時(shí)，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)η > 1時(shí)，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似 物。按照一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明還可以提供包含本發(fā)明所述的活性(免疫刺激 性)組合物的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以另外包含藥用載體和/或其它輔助物質(zhì)和添加劑和/ 或佐劑。按照特別優(yōu)選的實(shí)施方案，由包含在本發(fā)明的疫苗中的所述活性(免疫刺激性)組 合物的所述至少一種RNA編碼的抗原選自上述提及的組或亞組。按照甚至更優(yōu)選的實(shí)施方 案，蛋白抗原選自下述亞組的任一種抗原，其包括=NY-ESOl [登記號(hào)NM_001327]，hTERT [登 記號(hào)NM_198253]，存活蛋白[登記號(hào)AF077350]，5T4 [登記號(hào)NM_006670]和WTl [登記 號(hào)NM_000378]，和/或選自下述亞組的任一種抗原，其包括如本文所定義的MAGE-Cl和 MAGE-C2，和/或選自下述亞組的任一種抗原，其包括如本文所定義的MAGE-A2和MAGE-A3。本發(fā)明的疫苗典型地包括安全和有效量的如上述定義的所述活性(免疫刺激性) 組合物的所述至少一種RNA，其如上述定義編碼至少兩種抗原，更優(yōu)選地編碼選自上述組或 亞組的任一項(xiàng)的至少兩種抗原，最優(yōu)選地以所示組合的任一種。當(dāng)用于本文時(shí)，“安全和有 效量”意指如上定義的疫苗中所述活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的量，所 述量足以顯著誘導(dǎo)待治療的肺癌、優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)病癥、更優(yōu)選與三種主 要亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥的積極緩和，所述三種主要亞型的非小細(xì)胞肺 癌(NSCLC)包括但不限于鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。然而，同時(shí)，“安全和有效量”是 足以避免嚴(yán)重副作用的少量，即，足以允許優(yōu)點(diǎn)和風(fēng)險(xiǎn)之間的合理關(guān)系。這些限制的確定典 型地在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍之內(nèi)。關(guān)于本發(fā)明的疫苗，表述“安全和有效的量”優(yōu)選地意 指這樣的RNA量(和所編碼的至少兩種抗原的量)，其適于以這樣的方式刺激適應(yīng)性免疫系 統(tǒng)，以致不獲得過(guò)量的或破壞性的免疫反應(yīng)，但是，優(yōu)選地，也沒(méi)有低于可測(cè)量水平的這樣 的免疫反應(yīng)。如上文定義的疫苗中活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA的所述“安全和有效量”還可以取決于RNA的類型進(jìn)行選擇，例如，單順?lè)醋?、雙-或甚至多順?lè)醋?RNA,這是因?yàn)殡p-或甚至多順?lè)醋覴NA可以導(dǎo)致比使用等量單順?lè)醋覴NA顯著更高的編碼 抗原的表達(dá)。包含在本發(fā)明疫苗中的如上文定義的活性(免疫刺激性)組合物的至少一種 RNA的“安全和有效量”，還將與待治療的特定病癥相關(guān)而不同，并且還與待治療的患者的年 齡和身體條件、病癥的嚴(yán)重性、治療的持續(xù)時(shí)間、伴隨治療的性質(zhì)、所用的特定藥用載體、以 及類似因素相關(guān)，這在陪同醫(yī)師的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)范圍內(nèi)。按照本發(fā)明的疫苗可以按照本發(fā)明 作為藥物組合物或作為疫苗用于人以及用于獸醫(yī)醫(yī)學(xué)目的。按照本發(fā)明的疫苗典型地包含藥用載體。當(dāng)用于本文時(shí)，表述“藥用載體”優(yōu)選地 包括基于液體或非液體的本發(fā)明的疫苗。如果本發(fā)明的疫苗以液體形式提供，則載體典型 地是無(wú)熱原的水；等滲鹽水或緩沖的(水性)溶液，例如，磷酸鹽_、檸檬酸鹽-緩沖溶液，等 等。特別地對(duì)于本發(fā)明疫苗的注射，可以使用水，或者優(yōu)選地使用緩沖液，更優(yōu)選地使用水 性緩沖液，其包含鈉鹽，優(yōu)選至少50mM的鈉鹽，鈣鹽，優(yōu)選至少0，OlmM的鈣鹽，和任選地鉀 鹽，優(yōu)選至少3mM的鉀鹽。按照優(yōu)選實(shí)施方案，所述鈉、鈣和任選地鉀鹽可以以它們的鹵化 物形式存在，例如，氯化物、碘化物或溴化物，以它們的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、或硫酸 鹽等形式存在。不限于此，鈉鹽的實(shí)例包括，例如NaCl，NaI，NaBr, Na2CO3,NaHCO3,Na2SO4,任 選地鉀鹽的實(shí)例包括，例如KC1，KI，KBr，K2C03, KHCO3, K2SO4,和鈣鹽的實(shí)例包括例如CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2。此外，緩沖液中可以包含前述陽(yáng)離子的有機(jī)陰離子。按 照更優(yōu)選的實(shí)施方案，如上文定義適于注射目的的緩沖液可以包含選自氯化鈉(NaCl)，氯 化鈣(CaCl2)和任選地氯化鉀(KCl)的鹽，其中除了氯化物之外可以存在其它陰離子。CaCl2 也可以被另一種鹽如KCl替換。典型地，注射緩沖液中的鹽以至少50mM氯化鈉(NaCl)，至 少3mM氯化鉀(KCl)和至少0，OlmM氯化鈣(CaCl2)的濃度存在。所述注射緩沖液可以相對(duì) 于特定的參照介質(zhì)是高滲的、等滲的或低滲的，即，相對(duì)于特定的參照介質(zhì)，所述緩沖液可 以具有更高、相等或更低的鹽含量，其中優(yōu)選地可以使用前文提及的鹽的所述濃度，其不導(dǎo) 致由于滲透或其它濃度影響引起的對(duì)細(xì)胞的損傷。參照介質(zhì)為，例如，在“體內(nèi)”方法中存在 的液體，如血液、淋巴、細(xì)胞質(zhì)液體、或其它體液，或者例如可以在“體外”方法中用作參照介 質(zhì)的液體，諸如普通緩沖劑或液體。所述普通緩沖劑或液體是技術(shù)人員已知的。林格-乳 酸鹽溶液特別優(yōu)選地用作液體基礎(chǔ)。然而，還可以使用適用于施用給人的一種或多種相容的固體或液體填充劑或稀釋 劑或包封化合物。術(shù)語(yǔ)“相容”用在本文意指本發(fā)明疫苗的組成能夠以在典型的使用條件 下不發(fā)生顯著降低本發(fā)明疫苗的藥物效用的相互作用的方式與所述活性(免疫刺激性)組 合物的、編碼如上文定義的至少兩種抗原的所述至少一種RNA相混合。當(dāng)然，藥用載體、填 充劑和稀釋劑必需具有充分高的純度和充分低的毒性，以使得它們適用于施用給待治療的 人?？梢杂米魉幱幂d體、填充劑或其組分的化合物的一些實(shí)例為糖，諸如例如，乳糖、葡萄 糖和蔗糖；淀粉，諸如例如玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，諸如例如，羧甲基 纖維素鈉，乙基纖維素，醋酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；牛脂；固體助流劑，諸如例 如，硬脂酸，硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，諸如例如，花生油，棉籽油，芝麻油，橄欖油，玉米油 和可可油；多元醇，諸如例如，聚丙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。藥用載體的選擇主要由施用本發(fā)明疫苗的方式?jīng)Q定。例如，本發(fā)明的疫苗可以系 統(tǒng)性或口服施用。系統(tǒng)性施用的途徑通常包括，例如，透皮、口服、腸胃外途徑，包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)和腹膜內(nèi)注射和/或鼻內(nèi)施用途徑。局部施用途徑通常包括，例 如，局部施用途徑以及皮內(nèi)、透皮、皮下、或肌內(nèi)注射或損傷內(nèi)、顱骨內(nèi)、肺內(nèi)、心臟內(nèi)、和舌 下注射。更優(yōu)選地，疫苗可以通過(guò)皮內(nèi)、皮下、或肌內(nèi)途徑施用。因此，組合物/疫苗優(yōu)選地 配制為液體或固體形式。本發(fā)明的疫苗施用的適合量可以通過(guò)用動(dòng)物模型進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)確 定。所述模型包括，但不暗示任何限制，兔、綿羊、小鼠、大鼠、狗和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物模型。優(yōu)選 的用于注射的單位劑型包括無(wú)菌水溶液、生理鹽水或它們的混合物。所述溶液的PH應(yīng)該調(diào) 節(jié)為約7. 4。用于注射的合適載體包括水凝膠、可控或延遲釋放的裝置、聚乳酸和膠原基質(zhì)。 用于局部應(yīng)用的合適的藥用載體包括適合用在洗液、膏劑、凝膠等中的那些。如果本發(fā)明的 疫苗應(yīng)該經(jīng)口施用，片劑、膠囊等是優(yōu)選的單位劑型。用于制備可以用于口服施用的單位劑 型的藥用載體在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。其選擇取決于次要的考慮，如口味、成本和保存性， 其對(duì)于本發(fā)明的目的不是至關(guān)重要的，并且可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員不費(fèi)力的確定。本發(fā)明的疫苗可以另外包含一種或多種輔助物質(zhì)，以進(jìn)一步增加免疫原性。由此 優(yōu)選地獲得如上文定義的活性(免疫刺激性)組合物的所述至少一種RNA和如上文所述 還可以任選地包含在本發(fā)明疫苗中的輔助物質(zhì)的協(xié)同作用。取決于輔助物質(zhì)的各種類型， 在這一方面可以考慮多種機(jī)制。例如，允許樹突細(xì)胞(DCs)成熟的化合物，例如脂多糖， TNF-α或⑶40配體，形成第一類合適的輔助物質(zhì)。通常，可以使用以“危險(xiǎn)信號(hào)”(LPS， GP96，等)方式影響免疫系統(tǒng)的任何試劑或以靶向方式允許由本發(fā)明所述的免疫刺激佐劑 引起的免疫反應(yīng)被增強(qiáng)和/或被影響的細(xì)胞因子如GM-CFS作為輔助物質(zhì)。特別優(yōu)選的輔 助物質(zhì)為細(xì)胞因子，諸如，單核因子，淋巴因子，白介素或趨化因子，其一一除了通過(guò)所編 碼的至少兩種抗原誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)之外促進(jìn)先天性免疫反應(yīng)，諸如IL-1，IL-2， IL-3, IL-4, IL-5, IL-6， IL-7， IL-8， IL-9， IL-10， IL-12， IL-13， IL-14， IL-15， IL-16， IL-17, IL-18, IL-19, IL-20， IL-21， IL-22， IL-23， IL-24， IL-25， IL-26， IL-27， IL-28， IL-29, IL-30, IL-31, IL-32，IL-33，INF-α，IFN-β，INF- y , GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-β 或TNF-α，生長(zhǎng)因子，如hGH?？梢园诒景l(fā)明的疫苗中的其它添加劑為乳狀液，諸如例如，Tween ^潤(rùn)劑， 諸如例如，十二烷基硫酸鈉；著色劑；口味賦予劑，藥用載體；片劑形成劑；穩(wěn)定劑；抗氧化 劑；防腐劑。本發(fā)明的疫苗還可以另外包含任何其它化合物，已知其由于其針對(duì)人Tol 1-樣受 體 TLR1，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLRlO 的結(jié)合親和力(作為配 體)、或由于其針對(duì)鼠 Toll-樣受體 TLRl，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLRl 1，TLR12或TLR13的結(jié)合親和力(作為配體)而是免疫刺激性的。在該情形中，可以添加到本發(fā)明疫苗中的另一類化合物可以是CpG核酸，特別 是 CpG-RNA 或 CpG-DNA。CpG-RNA 或 CpG-DNA 可以是單鏈 CpG-DNA (ss CpG-DNA)，雙鏈 CpG-DNA (dsDNA)，單鏈 CpG-RNA (ss CpG-RNA)或雙鏈 CpG-RNA (ds CpG-RNA)。CpG 核酸優(yōu)選 地以CpG-RNA形式存在，更優(yōu)選地以單鏈CpG-RNA (ss CpG-RNA)形式存在。CpG核酸優(yōu)選地 包含至少一個(gè)或多個(gè)(促有絲分裂的)胞嘧啶/鳥嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。按照第 一個(gè)優(yōu)選的備選方案，包含在這些序列中的至少一個(gè)CpG基序，即CpG基序的C(胞嘧啶) 和G(鳥嘌呤)，是未甲基化的。任選地包含在這些序列中的所有其它胞嘧啶或鳥嘌呤可以 是甲基化的或未甲基化的。然而，按照更優(yōu)選的備選方案，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鳥嘌呤)還可以以甲基化形式存在。按照本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的目的，如本文定義的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或編碼至少兩種(優(yōu)選地)不同的抗原的所述至少一種RNA可以(用于制備)用于 治療肺癌，優(yōu)選地非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥，更優(yōu)選地與三種主要亞型的非小細(xì) 胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥(的本發(fā)明所述的疫苗)，所述三種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)包括，但不限于，鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選目的，本發(fā)明的疫苗或如本文定義的編碼至少兩種(優(yōu) 選地)不同抗原的至少一種RNA可以用于治療肺癌，優(yōu)選地非小細(xì)胞肺癌(NSCLC相關(guān)疾 病，更優(yōu)選地與三種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥，所述病癥包括但不限 于，鱗狀細(xì)胞肺癌，腺癌和大細(xì)胞肺癌。在該情形中，治療肺癌、優(yōu)選地非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥、更優(yōu)選地與三 種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥的方法也包含在本發(fā)明中，所述三種主要 亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)包括，但不限于，鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌，所述方 法通過(guò)向需要其的患者施用藥物有效量的本發(fā)明的疫苗、或藥物有效量的本發(fā)明的活性 (免疫刺激性)組合物進(jìn)行。所述方法典型地包括制備本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合 物、或本發(fā)明的疫苗的任選的第一步驟，和第二步驟，其包括向需要其的患者施用(藥物有 效量的)所述本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或所述本發(fā)明的疫苗。需要其的患者典 型地選自任何哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的情形中，哺乳動(dòng)物優(yōu)選地選自包括但不限于下列各項(xiàng) 的組例如，山羊、牛、豬、狗、貓、猴、猿，嚙齒動(dòng)物如小鼠、倉(cāng)鼠、兔，以及特別是人，其中所述 哺乳動(dòng)物典型地患有肺癌，優(yōu)選地非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥，更優(yōu)選地與三種主 要亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥，所述三種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 包括，但不限于，鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌或與其相關(guān)的病癥。本發(fā)明還涉及如本文定義的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或編碼至少兩種 (優(yōu)選地)不同抗原的所述至少一種RNA (用于制備本發(fā)明的疫苗)、優(yōu)選地用于在哺乳動(dòng) 物中引發(fā)免疫反應(yīng)、優(yōu)選地用于治療肺癌、更優(yōu)選地用于治療如本文定義的非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)相關(guān)病癥的應(yīng)用。類似地，本發(fā)明還涉及如本文定義的本發(fā)明的疫苗本身或編碼至少兩種(優(yōu)選 地)不同抗原的所述至少一種RNA用于在哺乳動(dòng)物中引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)、優(yōu)選地用于治 療肺癌、更優(yōu)選地用于治療如本文定義的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)病癥的應(yīng)用。在需要其的患者中預(yù)防或治療肺癌、優(yōu)選地如本文定義的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 相關(guān)病癥可以通過(guò)一次性或以時(shí)間交錯(cuò)方式施用本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物和/ 或本發(fā)明的疫苗而進(jìn)行，例如，作為多部件的試劑盒，每個(gè)部件包含至少一種優(yōu)選不同的抗 原。對(duì)于施用，優(yōu)選地可以使用如上文定義的任何施用途徑。例如，人們可以通過(guò)基于由本 發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA編碼的至少兩種(特別選擇的)抗原誘 導(dǎo)或增強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)而治療肺癌，優(yōu)選地如本文定義的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)病 癥。然后，可以在施用如本文定義的另一種本發(fā)明的創(chuàng)造性活性(免疫刺激性)組合物和 /或本發(fā)明的疫苗之前、同時(shí)和/或隨后進(jìn)行施用本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物和/ 或本發(fā)明的疫苗，其中所述另一種本發(fā)明的創(chuàng)造性活性(免疫刺激性)組合物和/或本發(fā) 明的疫苗可以包含編碼不同抗原的另一種RNA組合，其中由本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的至少一種RNA編碼的每種抗原可以優(yōu)選地適用于治療肺癌，更優(yōu)選地適用于治療如 本文定義的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)病癥。在該情形中，如本文定義的治療還可以包括 與肺癌相關(guān)的疾病、優(yōu)選如本文定義的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)。
按照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還包括所述活性(免疫刺激性)組合物(用于制備) 用于在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)、優(yōu)選誘導(dǎo)或增強(qiáng)如本文定義的免疫反應(yīng)的、更優(yōu)選地支持肺癌、特 別是如本文定義的NSCLC的治療(本發(fā)明的疫苗的)應(yīng)用。在該情形中，肺癌，尤其是如本 文定義的NSCLC的治療的支持可以是用于肺癌，尤其是本文定義的NSCLC的常規(guī)癌癥治療 的任何組合，諸如放射治療、化療、質(zhì)子治療、激素治療、抗體治療、佐劑治療、包括除本發(fā)明 疫苗之外的其它疫苗的治療、包括激酶抑制劑或小核苷酸的治療等，或者這些中的一些的 組合，和使用如本文定義的本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物或本發(fā)明疫苗的治療。對(duì)肺 癌、特別是如本文定義的NSCLC的治療的支持還可以在本文定義的任意其它實(shí)施方案中討 論。如本文定義的本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或編碼至少兩種(優(yōu)選地)不 同的抗原的至少一種RNA或本發(fā)明的疫苗的施用可以在時(shí)間交錯(cuò)治療中進(jìn)行。時(shí)間交錯(cuò)的 治療可以是，例如，在治療肺癌、特別是NSCLC之前、同時(shí)和/或隨后施用如本文定義的本發(fā) 明的活性(免疫刺激性)組合物或編碼至少兩種(優(yōu)選地)不同的抗原的至少一種RNA或 本發(fā)明的疫苗，例如，通過(guò)在治療性適于治療肺癌、特別是如本文定義的NSCLC的治療或施 用之前、同時(shí)和/或隨后施用本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或疫苗。所述時(shí)間交錯(cuò) 的治療可以使用例如試劑盒、優(yōu)選如下文定義的多部件的試劑盒進(jìn)行。時(shí)間交錯(cuò)的治療可以另外或備選地還包括以這樣的形式施用本發(fā)明的活性(免 疫刺激性)組合物或疫苗、優(yōu)選地如上述定義的編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的至少 一種RNA，其中如上文定義的編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原的至少一種RNA(其優(yōu)選地 形成本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物或疫苗的一部分)與如上文定義的編碼至少兩種 (優(yōu)選不同的)抗原的另一種至少一種RNA(其優(yōu)選地形成同一份本發(fā)明的活性(免疫刺 激性)組合物或疫苗的一部分)平行、在其之前或之后施用。優(yōu)選地，(所有至少一種RNA 的)施用在1小時(shí)內(nèi)、更優(yōu)選在30分鐘內(nèi)、甚至更優(yōu)選地在15，10，5，4，3，或2分鐘或者甚 至1分鐘內(nèi)進(jìn)行。所述時(shí)間交錯(cuò)的治療可以使用例如試劑盒、優(yōu)選如下文定義的多部件的 試劑盒進(jìn)行。 按照最后一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還提供試劑盒，特別是多部件的試劑盒，其包括所 述活性本發(fā)明的(免疫刺激性)組合物、和/或本發(fā)明的疫苗，和任選地具有所述本發(fā)明的 活性(免疫刺激性)組合物和/或本發(fā)明的疫苗的施用和劑量的信息的技術(shù)說(shuō)明書。所述 技術(shù)說(shuō)明書可以包含關(guān)于本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物、和/或本發(fā)明的疫苗的施 用和劑量的信息。所述試劑盒、優(yōu)選多部件的試劑盒，可以用于，例如，任何上文提及的應(yīng)用 或用途，優(yōu)選地用于至少一種本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物(用于制備)治療肺癌、 特別是如本文定義的NSCLC (的本發(fā)明的疫苗)的應(yīng)用。所述試劑盒還可以用于至少一種本 發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物(用于制備)治療肺癌、優(yōu)選是如本文定義的NSCLC(的 本發(fā)明的疫苗)的應(yīng)用，其中本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物)和/或所述疫苗由于 所編碼的至少兩種抗原可以能夠在如上文定義的哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)。所述試 劑盒還可以用于至少一種本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物(用于制備)在如上文定義的哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)、優(yōu)選引發(fā)、例如誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)、且優(yōu)選地支持肺癌、特別是NSCLC 治療(的本發(fā)明的疫苗)的應(yīng)用。多部件的試劑盒，作為試劑盒的特殊形式，可以在試劑盒 的不同部件中包含一種或多種相同或不同的活性本發(fā)明的(免疫刺激)組合物和/或一種 或多種相同或不同的本發(fā)明的疫苗。多部件的試劑盒還可以在試劑盒的不同部件中包含 (例如一種)活性本發(fā)明的(免疫刺激性)組合物、(例如一種)本發(fā)明的疫苗和/或如上 文定義編碼至少一種抗原的至少一種RNA，例如，試劑盒的每個(gè)部件包含編碼優(yōu)選不同的抗 原的至少一種RNA。另外，兩種類型的多部件試劑盒的組合是可以的。例如，當(dāng)考慮時(shí)間交錯(cuò) 治療時(shí)，例如，當(dāng)在同一體內(nèi)治療過(guò)程中使用不同配制和/或增加濃度的活性本發(fā)明的(免 疫刺激性)組合物、本發(fā)明的疫苗和/或如上文定義的編碼至少一種抗原的至少一種RNA 時(shí)，可以使用多部件試劑盒。還可以在考慮本發(fā)明活性(免疫刺激性)組合物的不同抗原 (例如，在多部件中)的分開的配制或施用時(shí)或有此需要時(shí)(例如，為了技術(shù)原因)，但是例 如仍然實(shí)現(xiàn)不同抗原在體內(nèi)的組合存在時(shí)，使用多部件試劑盒。特別地，考慮作為特殊形式 的試劑盒的多部件試劑盒，其中所述試劑盒的每個(gè)部件包含如上文定義的至少一種優(yōu)選不 同的抗原，所述多部件試劑盒的所有部件優(yōu)選形成如本文定義的所述活性本發(fā)明的(免疫 刺激性)組合物或本發(fā)明的疫苗。所述特殊的多部件試劑盒可以特別是合適的，例如，如果 不同抗原作為該試劑盒的不同部分分別配制，但是然后一起一次性或以時(shí)間交錯(cuò)方式施用 至需要其的哺乳動(dòng)物。在后一種情形中，所述試劑盒的所有不同部件的施用典型地在短時(shí) 間限制內(nèi)施用，以致所有抗原在緊隨試劑盒最后部件的施用之后幾乎同時(shí)存在于哺乳動(dòng)物 中。上述任一種試劑盒可以用作如上文所述的治療中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供用于治療肺癌、特別是非小肺癌(NSCLC)的活性(免疫刺激性)組合 物，其中所述組合物包括至少一種RNA、優(yōu)選mRNA，其編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)(適應(yīng) 性)免疫反應(yīng)的至少兩種(優(yōu)選不同的)抗原，其中所述抗原選自由下列各項(xiàng)組成的組 hTERT, WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1， 或MAGE-C2。所述活性(免疫刺激性)組合物允許肺癌、特別是非小肺癌(NSCLC)的有效治 療，或者當(dāng)使用常規(guī)治療時(shí)的補(bǔ)充治療。此外，它通過(guò)利用RNA作為醫(yī)療方法的途徑而避免 所引入的DNA序列的不可控增殖的問(wèn)題。用在本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的RNA 比DNA表達(dá)系統(tǒng)具有其它相當(dāng)多的優(yōu)點(diǎn)，例如，在免疫反應(yīng)、免疫或接種中。這些優(yōu)點(diǎn)特別 包括引入到細(xì)胞中的RNA不整合到基因組中。這避免該基因的突變的風(fēng)險(xiǎn)，其另外可以完 全或部分被滅活或者產(chǎn)生錯(cuò)誤信息。它還避免使用DNA作為誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的試劑(例如， 作為疫苗)的其它風(fēng)險(xiǎn)，諸如在已經(jīng)引入外源DNA的患者中誘導(dǎo)病原性抗-DNA抗體，因此 導(dǎo)致(可能是致死性的)免疫反應(yīng)。相反，尚未檢測(cè)到抗-RNA抗體。附圖下述附圖意欲進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。它們不意欲另外限制本發(fā)明的主題。圖1 描述編碼MUCl(HsMUCl-5xVNTR(野生型序列通常表示40個(gè)串聯(lián)重復(fù)。這 些出于克隆原因減少為5個(gè)串聯(lián)重復(fù)))的RNA序列(SEQ ID N0:1)(起始序列 基于野生型)。GC含量61. 27% ；長(zhǎng)度1668bp)。圖 2 描述編碼 MUCl 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 2) (HsMUClGC-5xVNTR, 1.GC最大化，2.密碼子應(yīng)用)GC含量73. 56% ；長(zhǎng)度1668bp。與基本序列(圖1 (SEQ IDNO 1))的不同398/1668 個(gè)堿基=23. 86%。圖3 描述編碼5T4 (Hs5T4 (滋養(yǎng)層糖蛋白TPBG)的RNA序列(SEQID NO 3)(起始序列基于野生型)；GC含量61.60% ；長(zhǎng)度1263bp。圖4 描述編碼 5T4 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 4) (Hs5T4GC，1. GC-最大化， 2.密碼子應(yīng)用)；GC含量70. 47%;長(zhǎng)度1263bp。與基本序列(圖3 (SEQ ID NO 3))的不 同247/1263 個(gè)堿基=19. 56%。圖5 描述編碼Her-2/neu (HsHer2/neu (v-erb_b2成紅血細(xì)胞白血病病毒癌基因 同源物2))的RNA序列(SEQ ID NO 5)(起始序列基于野生型)；GC含量60· 78% ；長(zhǎng)度 3768bp。圖 6 描述編碼 Her-2/neu 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 6) (HsHer2/neu GC, 1.GC-最大化，2.密碼子應(yīng)用)；GC含量70. 54%;長(zhǎng)度3768bp。與基本序列(圖5 (SEQ ID NO 5))的不同:772/3768 個(gè)堿基=20.49%。圖7 描述編碼hTERT (HsTERT (端粒末端轉(zhuǎn)移酶反轉(zhuǎn)錄酶)的RNA序列(SEQ ID NO 7)(起始序列基于野生型)；GC含量66. 08% ；長(zhǎng)度3399bp。圖 8 描述編碼 hTERT 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 8) (HsTERT GC, 1. GC-最 大化，2.密碼子應(yīng)用)；GC含量72.96% ；長(zhǎng)度3399bp，與基本序列(圖7 (SEQ ID NO 7)) 的不同566/3399個(gè)堿基=16. 65%。圖9 描述編碼WTl (HsffTl (維爾姆斯瘤1))的RNA序列(SEQ IDNO 9)(起始序列 基于野生型)；GC含量61.78% ；長(zhǎng)度1554bp。圖10 圖10A)描述編碼WTl (HsWTl (維爾姆斯瘤1))的RNA序列(SEQ ID NO 10)， 其與野生型序列相對(duì)應(yīng)的區(qū)域相比較，在所述序列的區(qū)域325-408表現(xiàn)出具有減少的GC含 量的序列。圖10B)，C)和D)顯示相對(duì)應(yīng)的區(qū)域325-408的比較在B)中，圖9 (SEQ ID NO: 9)所述的野生型序列，在C)中，圖11 (SEQ ID NO :11)所述的GC-最大化的序列，和在D) 中，圖10 (SEQ ID NO 10)所述的GC-減少的序列，其均表現(xiàn)出不同的GC-模式。圖11 描述編碼 WTl 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 11) (HsffTlGC, 1. GC-最大 化，2.密碼子應(yīng)用)；GC含量72. 59% ；長(zhǎng)度1554bp。與基本序列(圖9(SEQ ID NO 9)) 的不同=322/1554個(gè)堿基=20. 72%。圖12 描述編碼 CEA (CEA (癌胚抗原)HsCEACAM5)的 RNA 序列(SEQ ID NO 12)(起 始序列基于野生型)；GC含量52. 20% ；長(zhǎng)度:2109bp。圖 13 描述編碼 CEA 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 13) (CEACAM5GC, 1. GC-最 大化，2.密碼子應(yīng)用，已經(jīng)在適當(dāng)?shù)奈恢?；GC含量66.24% ；長(zhǎng)度2109bp。與基本序列 (圖 12 (SEQ ID NO 12))的不同495/2109 個(gè)堿基=23. 47%。圖14 描述編碼 MAGE-A2 (HsMAGE_A2 (黑素瘤抗原家族 A，2) HsMAGE_A2B)的 RNA 序 列(SEQ ID NO 14)(起始序列基于野生型)。GC含量55. 87% ；長(zhǎng)度945bp。圖 15 描述編碼 MAGE-A2 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 15) (HsMAGE_A2B GC, 1.GC-最大化，2.密碼子應(yīng)用)；GC含量68. 57%;長(zhǎng)度945bp。與基本序列(圖14 (SEQ ID NO 14))的不同187/945 個(gè)堿基=19.79%。圖16 描述編碼MAGE-A3 (MAGE-A3 (黑素瘤抗原家族A，3)MAGE_A3)的RNA序列 (SEQ ID NO 16)(起始序列基于野生型)，GC含量56. 30% ；長(zhǎng)度945bp。
圖 17 描述編碼 MAGE-A3 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 17) (MAGE-A3GC, 1.GC-最大化，2.密碼子應(yīng)用，已知富含GC的)；GC含量69.00% ；長(zhǎng)度945bp。與基本序 列(圖 16(SEQID NO: 16))的不同190/945 個(gè)堿基=20. 11%。圖18 :描述編碼存活蛋白(存活蛋白(包含桿狀病毒IAP重復(fù)5，BIRC5) HsSurvivin(Wt))的 RNA 序列(SEQ ID NO 18)(起始序列基于野生型)；GC 含量52· 68% ； 長(zhǎng)度429bp。圖19 描述編碼存活蛋白的(GC)穩(wěn)定RNA序列(SEQ ID NO 19) (HsSurvivin(GC), 1.GC-最大化，2.密碼子應(yīng)用，已知富含GC的)；GC含量65. 27%;長(zhǎng)度: 429bp。與基本序列(圖 18(SEQID NO 18))的不同72/429 個(gè)堿基=16. 78%。圖 20 描述編碼 NY-ES0-1 (智人(Homo sapiens) NY-ESO-I (NY-ESO-l (wt))的 RNA 序列(SEQ ID NO 20)(起始序列基于野生型)；GC-含量67. 4%。
圖 21 描述編碼 NY-ES0-1 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 21) (NY-ESO-l (GC)， GC-含量79. 56%，(已知富含GC的)；與野生型(圖20 (SEQ ID NO 20))的不同112/543 個(gè)堿基，20. 63%。圖22 描述編碼 MAGE-Cl (HsMAGECl (黑素瘤抗原家族 C，1)HsMAGEC 1 (wt))的 RNA 序列(SEQ ID NO 22)(起始序列基于野生型)，GC含量51. 86% ；長(zhǎng)度3429bp。圖 23 描述編碼 MAGE-C 1 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 23) (HsMAGECl (GC)， 1.GC-最大化，2.密碼子應(yīng)用)。GC含量68. 73% ；長(zhǎng)度3429bp。與基本序列(圖22 (SEQ ID NO 22))的不同964/3429 個(gè)堿基=28. 11%圖24 描述編碼截短的MAGE-Cl的(GC)穩(wěn)定RNA序列(SEQ IDNO 24) (HsMAGECl (GC)，1. GC-最大化，2.密碼子應(yīng)用)。與基本序列(圖22 (SEQ ID NO 22))相 比較，刪除重復(fù)區(qū)，并且按照?qǐng)D24的序列，在最初的起始密碼子(ATG)之后，以613個(gè)aa的 GC-最大化的野生型序列開始(圖23 (SEQ ID NO :23))。圖25 描述編碼 MAGE-C2 (HsMAGE_C2 (黑素瘤抗原家族 C，2) HsMAGE_C2)的 RNA 序 列(SEQ ID NO :25)(起始序列基于野生型)；GC含量50. 81% ；長(zhǎng)度1122bp。圖 26 描述編碼 MAGE-C2 的(GC)穩(wěn)定 RNA 序列(SEQ ID NO 26) (HsMAGE_C2GC， 1.GC-最大化，2.密碼子應(yīng)用)；GC含量66. 58%;長(zhǎng)度1122bp，與基本序列(圖25 (SEQ ID NO 25))的不同:264/1122 個(gè)堿基=23. 53%。圖27顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中對(duì)腫瘤抗原NY_ES0_1 特異性的IgGl抗體的存在，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比例配制的 編碼一種 NSCLC 相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl ,MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。圖28 顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中對(duì)腫瘤抗原NY_ES0_1 特異性的IgG2a抗體的存在，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比例配制 的編碼一種NSCLC相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4)的mRNA。圖29 顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中對(duì)腫瘤抗原MAGE-Cl特 異性的IgGl抗體的存在，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比例配制的編 碼一種 NSCLC 相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。圖30 顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中對(duì)腫瘤抗原MAGE-Cl特 異性的IgG2a抗體的存在，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比例配制的編碼一種 NSCLC 相關(guān)抗原(NY-ESO-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。圖31顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中對(duì)腫瘤抗原MAGE-C2特 異性的IgGl抗體的存在，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比例配制的編 碼一種 NSCLC 相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl，MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。 圖32 顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中對(duì)腫瘤抗原MAGE-C2特 異性的IgG2a抗體的存在，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比例配制的 編碼一種 NSCLC 相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl ,MAGE-C2，存活蛋白和 5T4)的 mRNA。圖33 顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中針對(duì)腫瘤抗原5T4的 抗原特異性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì)量比例配 制的編碼一種NSCLC相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4)的mRNA。圖34 顯示在用由5種成分組成的mRNA疫苗接種的小鼠中針對(duì)腫瘤抗原 NY-ES0-1的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)，所述5種成分分別包含與魚精蛋白以4 1的 質(zhì)量比例配制的編碼一種NSCLC相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4) 的 mRNA。
實(shí)施例下述實(shí)施例意欲進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明。它們不意欲另外限制本發(fā)明的主題。1.制備編碼的質(zhì)粒在下述實(shí)驗(yàn)中，分別制備對(duì)應(yīng)于編碼下述抗原的各自mRNA序列末端的DNA序列· hTERT,‘ WTl,· MAGE-A2,· 5T4,· MAGE-A3,‘ MUCl,· Her-2/neu,· NY-ES0-1，· CEA， 存活蛋白，· MAGE-Cl，或·ΜΑ6Ε_〇2。并且用于體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。由此，對(duì)應(yīng)于天然抗原編碼mRNA的DNA序列增加 GC-含量且是密碼子-優(yōu)化的。然后，將編碼序列轉(zhuǎn)移至RNActive構(gòu)建體(庫(kù)瑞瓦格有限 責(zé)任公司，Tubingen，德國(guó))中，其已經(jīng)用聚腺苷酸標(biāo)記和聚胞苷酸標(biāo)記(A70-C30)進(jìn)行了 修飾。2.體外轉(zhuǎn)錄基于在實(shí)施例1中獲得的重組質(zhì)粒DNA，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄制備RNA序列。因此，將所 述重組質(zhì)粒DNA線性化，并且隨后使用T7RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄。然后通過(guò)DNA酶I消化 降解DNA模板，并且通過(guò)LiCl沉淀回收RNA，并且通過(guò)HPLC提取(PUREMessenger ，庫(kù)瑞瓦格有限責(zé)任公司，Tubingen，德國(guó))進(jìn)一步純化。3.與龜精蛋白復(fù)合為了將所述RNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞和生物體中，將通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA優(yōu)選地復(fù)合， 更優(yōu)選地當(dāng)將所述RNA與魚精蛋白混合時(shí)與魚精蛋白復(fù)合。4.接種實(shí)驗(yàn)對(duì)于接種，將通過(guò)如上述體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)獲得的RNA(見實(shí)驗(yàn)2)轉(zhuǎn)染到小鼠(小鼠 C57 BL/6)中，優(yōu)選地在與魚精蛋白復(fù)合時(shí)進(jìn)行(見實(shí)驗(yàn)3)。轉(zhuǎn)染發(fā)生在不同組中，其中每 組5只小鼠(C57BL/6)在3周內(nèi)用本發(fā)明的mRNA混合物即與魚精蛋白復(fù)合的mRNA的混合 物皮內(nèi)免疫 8 次，其中所述 RNA 編碼抗原 hTERT，WT1，MAGE-A2，5T4，MAGE-A3, MUC1，Her_2/ neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-Cl，或 MAGE-C2 中的至少兩種。5. nm^M-^n^f^m. (n-mm^^m.)抗原-特異性免疫反應(yīng)(B-細(xì)胞免疫反應(yīng))的檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)抗原_特異性抗體進(jìn) 行。因此，在最后一次接種后一周從接種的小鼠采集血液樣品，并且制備血清。將MaxiSorb 板(Nalgene Nunc International)用由所述mRNA-混合物編碼的抗原蛋白(0. 5 μ g/孔) 包被。在用包含0.05%吐溫-20和1%BSA的IX PBS封閉之后，將板用稀釋的小鼠血清 (1 30,1 90，1 270,1 810)溫育。隨后，加入生物素-偶聯(lián)的二抗(抗-小鼠_IgG2a Pharmingen)。洗滌后，將板用辣根過(guò)氧化物酶_鏈霉抗生物素蛋白溫育，并且隨后測(cè)量 ABTS底物(2，2’ -連氮基-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)的轉(zhuǎn)化。6.誦i寸ELISP0T檢測(cè)丨杭原-特異件細(xì)胞為,瘡反應(yīng)(T細(xì)胞為,瘡反應(yīng))在最后一次接種后2周，將小鼠處死，去除脾并且分離脾細(xì)胞。在存在來(lái)自上述抗 原的肽(肽文庫(kù))的條件下或與由用編碼所述抗原的RNA電穿孔的天然同系小鼠的骨髓細(xì) 胞產(chǎn)生的樹突細(xì)胞共溫育，將所述脾細(xì)胞再刺激7天。為了確定抗原-特異性細(xì)胞免疫反 應(yīng)，在再刺激后測(cè)量INFy分泌。為了檢測(cè)INFy，將包被多篩選平板(Millipore)用包括 針對(duì)INF γ的抗體(BD Pharmingen，Heidelberg，德國(guó))的包被緩沖液0. IM碳酸鹽-碳酸 氫鹽緩沖液PH 9.6,10. 59g/l Na2CO3,8. 4g/l NaHCO3)溫育過(guò)夜。在所述平板中以1 20 的比例溫育刺激和效應(yīng)細(xì)胞24小時(shí)。將板用IXPBS洗滌，并且用生物素-偶聯(lián)的二抗溫 育。在用lXPBS/0.05%吐溫-20洗滌后，向板中加入底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/ 氮藍(lán)四唑液體底物系統(tǒng)，來(lái)自SigmaAldrich (西格瑪奧德里奇)，Taufkirchen，德國(guó))，并且 可以視覺檢測(cè)底物的轉(zhuǎn)化。7.腫瘤攻擊免疫在最后一次免疫后一周，將IMio B16黑素瘤細(xì)胞或TRAMP-Cl細(xì)胞皮下注射至小 鼠中。分別在2周(B16)或7周(TRAMP-Cl)內(nèi)，確定腫瘤體積。8.制備mRNA疫苗按照上述公開內(nèi)容，在下述制備本發(fā)明的活性(免疫刺激性)組合物的特定實(shí)例， 其包括一些抗原的組合，用作用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的疫苗。所述示例性的本發(fā) 明的活性(免疫刺激性)組合物由5種成分組成，每種成分包含與魚精蛋白以4 1的質(zhì) 量比例配制的編碼一種NSCLC相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl, MAGE-C2，存活蛋白和5T4，按 照 SEQ ID NOs :4，19，21，24 和 26 (富含 GC 的序列))的 mRNA。接種
將C57BL/6小鼠用由5種成分組成的mRNA疫苗皮內(nèi)接種，每種成分包含編碼一種 NSCLC相關(guān)抗原(NY-ES0-1，MAGE-Cl,MAGE-C2，存活蛋白和 5T4，按照 SEQ ID NOs :4，19，21， 24和26 (GC-富集的序列))的mRNA，所述抗原用魚精蛋白配制(64 μ g/抗原/周期，分成 4次注射/周期)。對(duì)照接種使用響應(yīng)總劑量的編碼LacZ的RNA(對(duì)照mRNA IacZ)進(jìn)行。 接種包括三個(gè)免疫周期(第1、3和5周)。組、小鼠數(shù)目和小鼠品系顯示在下表中
"II小鼠品系I小鼠數(shù)目
mRNA 疫苗C57BL/6 10 只
5只用于Elispot，5只用 于通過(guò)ELISA檢測(cè)血清 中的抗體
對(duì)照 mRNA IacZ C57BL/6 5K
3只用于Elispot，所有5 只用于通過(guò)ELISA檢測(cè) 血清中的抗體檢測(cè)抗原_特異性的抗體最后一次接種后6天，后眼窩采集血液樣品(200 μ 1)，并且使用ELISA分析血清中 抗原特異性抗體亞型IgGl和IgG2a的存在。將96-孔ELISA板用重組蛋白(在包被緩沖 液中1(^8/!111，在371溫育4小時(shí))包被，并且每孔用200 μ 1封閉緩沖液在4°C封閉過(guò)夜。 隨后，將樣品用從每組小鼠收集的血清溫育，并且在室溫下在1 3-1 48范圍內(nèi)的稀釋 液中滴定4小時(shí)。在用針對(duì)小鼠IgGl或IgG2a的特異性抗體(在封閉緩沖液中1 300) 溫育和用HRP-偶聯(lián)的二次抗體(在封閉緩沖液中1 500)溫育后，加入TMB-底物。使用 ELISA 讀數(shù)儀(Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim，德國(guó))在 450nm 處測(cè)量比色反應(yīng)。ELISPOT為了檢測(cè)細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，使用ELISPOT技術(shù)，可以在單細(xì)胞水 平顯現(xiàn)響應(yīng)特定刺激的效應(yīng)器細(xì)胞因子IFN-Y的分泌的分析。在最后一次接種后6天，分離來(lái)自抗原_接種的和對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至 用抗-IFN-γ捕捉抗體(10yg/ml)包被的96-孔ELISPOT板中。然后，將細(xì)胞在37°C用相 關(guān)的抗原_來(lái)源的肽文庫(kù)或用HIV-來(lái)源的文庫(kù)或所述肽的溶劑DMSO刺激24小時(shí)，或在純 培養(yǎng)基中溫育作為對(duì)照。所有文庫(kù)均以Iyg/肽/ml的濃度使用。在溫育期間之后，從板 洗掉細(xì)胞，并且使用針對(duì)小鼠IFN-Y的生物素?；亩慰贵w(lyg/ml)、然后是鏈霉抗 生物素蛋白-AKP檢測(cè)由該細(xì)胞分泌的IFN- γ。使用BCIP/NBT底物顯現(xiàn)點(diǎn)，并且使用自動(dòng) ELISPOT 讀數(shù)儀(Immunospot Analyzer, CTL AnalyzersLLC)計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用 Graph Pad Prism 5. 01 (GraphPad Software, Inc. (GraphPad 軟件公司))進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果表示為平均值(或中值)士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。對(duì)于Elispot測(cè) 定，由于基本活化是強(qiáng)烈的個(gè)體依賴性的事實(shí)，通過(guò)從所有其它數(shù)值中減去培養(yǎng)基孔的點(diǎn) 數(shù)分別進(jìn)行每只小鼠的背景校正。使用雙尾Marm-Whitney檢驗(yàn)來(lái)分析測(cè)試組之間的不同，顯著水平為5%。結(jié)果和討論小鼠用如上述定義包含5種成分的mRNA疫苗、特別是分別獨(dú)立地與陽(yáng)離子肽魚精 蛋白以4 1的質(zhì)量比例配制的編碼NSCLC-相關(guān)抗原NY-ES0-1，MAGE-C2, MAGE-C1，存活 蛋白和5T4，(按照SEQ ID而8:4，19，21，24和26(富含6(的序列))的富含6(的1111 離 接種。對(duì)照小鼠用與魚精蛋白以與所述mRNA疫苗相同的比例配制的編碼LacZ的不相關(guān)的 RNA進(jìn)行處理。使用分離自采自抗原_接種的和對(duì)照小鼠的血液的血清，我們檢測(cè)了針對(duì)所 述抗原的特異性抗體的誘導(dǎo)。對(duì)于五種分析的蛋白中的三種，即，MAGE-Cl, MAGE-C2和 NY-ES0-1，我們?cè)谟盟鰉RNA疫苗接種的小鼠血清中檢測(cè)到抗原特異性抗體，這表明所述 mRNA在體內(nèi)是功能性的和免疫原性的。檢測(cè)抗體所需要的蛋白在大腸桿菌(E.coli)中生 產(chǎn)。因?yàn)樵诖竽c桿菌中的蛋白生產(chǎn)可以影響翻譯后修飾，并且對(duì)于所用的抗原，沒(méi)有充分描 述這些，這可解釋對(duì)于其余蛋白觀察到的響應(yīng)的缺乏。然后，分析了響應(yīng)所述mRNA疫苗的施用的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活。IFN-γ是Thl 反應(yīng)的主要調(diào)控子，并且由激活的CTL分泌。因此，使用ELISP0T技術(shù)，研究抗原-特異性 細(xì)胞毒性T細(xì)胞在來(lái)自接種的小鼠的脾細(xì)胞中的存在。使用限制性肽文庫(kù)作為脾細(xì)胞的抗 原刺激物。因?yàn)樗玫娜丝乖槍?duì)小鼠MHC(在C57BL/6小鼠中H_2Kb和H_2Db)的獨(dú)特表 位是未知的，所以我們必須使用通過(guò)搜索SYFPEITHI數(shù)據(jù)庫(kù)由于潛在的結(jié)合親和性所選擇 的假設(shè)的肽選擇。從肽文庫(kù)(15mers，其中11個(gè)氨基酸重疊)，淘選蛋白的完整序列，選擇 那些包含假設(shè)最佳表位的15mers，并且合并至最多18個(gè)肽。然而，這些選擇可能不必需包 含正確的表位，以致在這些工具輔助下的免疫反應(yīng)檢測(cè)可能容易地產(chǎn)生假陰性結(jié)果。然而， 用起源于NY-ES0-1和5T4的這些文庫(kù)中的兩種刺激，在來(lái)自用所述mRNA疫苗接種的小鼠 的脾細(xì)胞中導(dǎo)致高IFN-Y分泌，且在來(lái)自用編碼不相關(guān)蛋白β-半乳糖苷酶的mRNA接種 的對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞中沒(méi)有。所述脾細(xì)胞沒(méi)有一種與HIV-來(lái)源的對(duì)照肽文庫(kù)反應(yīng)。僅在 培養(yǎng)基中溫育的脾細(xì)胞的IFN-Y點(diǎn)數(shù)表示新鮮分離的細(xì)胞的基本激活。由于基本激活是 強(qiáng)烈個(gè)體依賴性的事實(shí)，所以通過(guò)從所有其它數(shù)值中減去培養(yǎng)基孔的點(diǎn)數(shù)而獨(dú)立進(jìn)行背景 校正。三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖27-34中。
權(quán)利要求
活性(免疫刺激性)組合物，其包括編碼至少兩種不同抗原的至少一種RNA，a)其中所述至少兩種抗原中的至少一種選自·NY-ESO-1，·MAGE-C1，和/或·MAGE-C2；和b)其中其它抗原選自這樣的至少一種抗原，所述至少一種抗原選自下述組·hTERT，·WT1，·MAGE-A2，·5T4，·MAGE-A3，·MUC1，·Her-2/neu，·NY-ESO-1，·CEA，·存活蛋白，·MAGE-C1，和/或·MAGE-C2。
2.按照權(quán)利要求1的活性(免疫刺激性)組合物，其中按照a)的所述至少兩種不同的 抗原中的至少一種選自 MAGE-CLiP / 或 MAGE-C2。
3.按照權(quán)利要求1或2的活性(免疫刺激性)組合物，其中按照b)的所述其它抗原專 一地選自下述抗原組合 hTERT 和 WTl ；或 hTERT 和 MAGE-A2 ；或 hTERT 和 5T4 ；或 hTERT 禾口 MAGE-A3 ；或 hTERT和 MUCl ；或 hTERT 禾口 Her-2/neu ；或 hTERT 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT 和 CEA ；或 hTERT和存活蛋白；或 hTERT 和 MAGE-Cl ；或 hTERT 和 MAGE-C2 ；或 WTl 禾口 MAGE-A2 ；或 WTl 禾口 5T4 ；或 WTl 和 MAGE-A3 ；或 WTl 禾口 MUCl ；或 WTl 禾口 Her-2/neu ；或 WTl 禾口 NY-ESO-I ；或 WTl 禾口 CEA ；或 WTl和存活蛋白；或 WTl 禾口 MAGE-Cl ；或 WTl 禾口 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2 和 5T4 ；或 MAGE-A2 禾口 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2 禾口 MUCl ；或 MAGE-A2 禾口 Her-2/'neu ；或 MAGE-A2 和 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A2 和 CEA ；或 MAGE-A2和存活蛋白；或 MAGE-A2 禾口 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 5T4 禾口 MAGE-A3 ；或 5T4 和 MUCl ；或 5T4 禾口 Her-2/neu ；或 5T4 和 NY-ES0-1 ；或 5T4 和 CEA ；或 5T4和存活蛋白；或 5T4 禾口 MAGE-Cl ；或 5T4 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 MAGE-A3 禾口 Her-2/'neu ；或 MAGE-A3 禾口 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A3和存活蛋白；或 MAGE-A3 禾口 MAGE-Cl MAGE-A3 禾口 MAGE-C2 MUCl 和 Her-2/neu ；或 MUCl 和 NY-ES0-1 ；或 MUCl 禾口 CEA ；或 MUCl和存活蛋白；或 MUCl 和 MAGE-Cl ；或 MUCl 禾口 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU 和 NY-ES0-1 ；或 HER-2/NEU 和 CEA ；或 HER-2/NEU和存活蛋白； 或 HER-2/NEU 和 MAGE-Cl ；或 HER-2/NEU 和 MAGE-C2 ；或 NY-ESO-I 和 CEA ；或 NY-ES0-1和存活蛋白；或 NY-ES0-1 和 MAGE-Cl ；或 NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 CEA和存活蛋白；或 CEA 和 MAGE-Cl ；或 CEA 和 MAGE-C2 ；或 存活蛋白和MAGE-Cl ；或 存活蛋白和MAGE-C2 ；或 MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WTl 和 MAGE-A2 ；或 hTERT, WTl 和 5T4 ；或 hTERT, WTl 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WTl 和 MUCl ；或 hTERT, WTl和 Her-2/neu ；或 hTERT, WTl 和 NY-ES0-1 ；或 hTERT, WTl 和 CEA ；或 hTERT, WTl和存活蛋白；或 hTERT, WTl 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WTl 和 MAGE-C2 ；或 WT1,MAGE-A2 和 5T4 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MUCl ；或 WT1，MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 WTl，MAGE-A2 和 NY-ES0-1 ；或 WTl, MAGE-A2 和 CEA ；或 WTl，MAGE-A2和存活蛋白；或 ffTl，MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-A3 ；或 MAGE-A2，5T4 禾口 MUCl ；或 MAGE-A2 , 5T4 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2 , 5T4 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A2，5T4 和 CEA ；或 MAGE-A2，5T4和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 NY-ESO-1 ；或 5T4, MAGE-A3 禾口 CEA ；或 5T4，MAGE-A3和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3 禾口 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A3, MUCl 禾口 NY-ES0-1 ；或 MAGE-A3, MUCl 禾口 CEA ；或 MAGE-A3, MUCl和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUCl 禾口 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUCl和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu 和 NY-ES0-1 ；或 MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 MUCl，Her-2/neu和存活蛋白；或 MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 CEA ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C1 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1, CEA和存活蛋白；或 NY-ES0-1，CEA 禾口 MAGE-Cl -M NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 CEA，存活蛋白和MAGE-Cl ；或 CEA，存活蛋白和MAGE-C2 ；或 存活蛋白，MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 5T4 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 禾口 MUCl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 NY-ESO-l ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2 和 MAGE-C2 ；或‘WTl, MAGE-A2, 5Τ4 禾口 MAGE-A3 ；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5Τ4 禾口 MUCl ；或 WT1，MAGE-A2, 5Τ4 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5Τ4 禾口 NY-ESO-1 ；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5Τ4 禾口 CEA ；或 WTl，MAGE-A2,5T4和存活蛋白；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5T4 禾口 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，禾口 Her-2/neu ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 禾口 NY-ESO-1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 禾口 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 禾口 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA 和存活蛋白；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 NY-ES0-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 CEA,存活蛋白，MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-A3 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MUCl ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2,5T4 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4 和 MAGE-C2 ；或 ‘WTl, MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 禾口 MUCl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 NY-ESO-1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C1 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 NY-ES0-1，CEA，存活蛋白，MAGE-Cl 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MUCl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 Her-2/neu ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 NY-ESO-1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 CEA ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ； 或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ； 或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ； 或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ； 或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ； 或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白； 或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C1 ； 或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和 MAGE-C2 ； 或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 HER-2/NEU, NY-ES0-1，CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 Her-2/neu ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和存活蛋白； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ； 或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C1 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 NY-ESO-1 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu 和 MAGE-C2 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 WTl, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C1 ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 CEA ；或 hTERT, WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1 和 MAGE-C2 ； 或 WTl，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-I, CEA 和存活蛋白；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 和 MAGE-C2 ； 或 hTERT, WTl，MAGE-A2，5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA 和存活蛋白；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2, 5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA 和 MAGE-C2 ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C1 ；或 WTl，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA,存活蛋白，MAGE-Cl 禾口 MAGE-C2 ；或 hTERT, WT1，MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ESO-1，CEA，存活蛋白和 MAGE-Cl ；或 hTERT, WTl, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白和 MAGE-C2 ；或 WT1,MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl，Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA，存活蛋白，MAGE-C1 禾口 MAGE-C2 ；或 hTERT, WTl, MAGE-A2,5T4, MAGE-A3, MUCl, Her-2/neu, NY-ES0-1, CEA,存活蛋白， MAGE-Cl 禾口 MAGE-C2。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 包括250-20000個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 為 mRNA。
6.按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 為單順?lè)醋?、雙順?lè)醋踊蛏踔潦嵌囗樂(lè)醋覴NA。
7.按照權(quán)利要求5的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少兩種抗原每種由單順 反子RNA編碼。
8.按照權(quán)利要求6的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少兩種抗原由單順?lè)醋印?雙順?lè)醋雍?或甚至多順?lè)醋覴NAs的混合物編碼。
9.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 包括選自編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)定義的抗原的片段、變體或表位的RNA。
10.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA包括選自與按照SEQ ID NOs :1，3，5，7，9，12，14，16，18，20，22或25的RNA序列相同或至少 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，或 80%相同的 RNA 的 RNA。
11.按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 是修飾的RNA，特別是穩(wěn)定的mRNA。
12.按照權(quán)利要求11的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA編碼區(qū)的 G/C含量與野生型RNA編碼區(qū)的G/C含量相比增加，與野生型RNA編碼的氨基酸序列相比 較，所述至少一種RNA編碼的氨基酸序列優(yōu)選地不被改變。
13.按照權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種 RNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)環(huán)境中的A/U含量與野生型RNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)環(huán)境中的A/U含 量相比較增加。
14.按照權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述修飾的mRNA 的編碼區(qū)和/或5'和/或3'非翻譯區(qū)與野生型RNA相比較被修飾，以致其不包含促降解 序列元件，與野生型RNA相比較，所述修飾的mRNA編碼的氨基酸序列優(yōu)選地不被改變。
15.按照權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述修飾的mRNA 具有5'帽結(jié)構(gòu)和/或聚腺苷酸尾，優(yōu)選地為10-200個(gè)腺苷核苷酸，和/或聚胞苷酸尾，優(yōu) 選地為10-200個(gè)胞嘧啶核苷酸，和/或至少一個(gè)IRES和/或至少一個(gè)5 ‘和/或3 ‘穩(wěn)定 序列。
16.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種 RNA，優(yōu)選所有mRNAs，包括選自與按照 SEQ ID NOs :2，4，6，8，10，11，13，15，17，19，21，23，24 或26的RNA序列相同或至少80%相同的RNA的RNA。
17.按照權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種RNA 與一種或多種聚陽(yáng)離子復(fù)合，優(yōu)選地與魚精蛋白或oligofectamine、最優(yōu)選與魚精蛋白復(fù)口 O
18.按照權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述活性組合物 另外包括至少一種佐劑。
19.按照權(quán)利要求18的活性(免疫刺激性)組合物，其中所述至少一種佐劑選自由下 列各項(xiàng)組成的組陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子化合物，其包括陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子肽或蛋白，包括魚精蛋白，核仁蛋 白，精胺或亞精胺，聚-L-賴氨酸(PLL)，聚-精氨酸，堿性多肽，穿透細(xì)胞的肽(CPPs)，其包 括HIV-結(jié)合肽，Tat, HIV-I Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetratin, VP22來(lái)源的或類似物 肽，HSV VP22(單純皰疹)，MAP, KALA或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs，PpT620,富含脯氨酸的肽， 富含精氨酸的肽，富含賴氨酸的肽，MPG-肽，Pep-1, L-寡聚物，降鈣素肽，觸角足來(lái)源的肽 (特別是來(lái)自 Drosophila antennapedia), ρAntp, plsl, FGF,乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-來(lái)源的肽，SAP，魚精蛋白，精胺，亞精 胺，或組蛋白，陽(yáng)離子多糖，其包括脫乙酰殼多糖，polybrene，陽(yáng)離子聚合物，其包括聚氮丙 啶(PEI)，陽(yáng)離子脂質(zhì)，其包括DOTMA :[1_(2，3-sioleyloxy)丙基)]_N，N, N-三甲基氯化 銨，DMRIE，二 -C14-脒，DOTIM, SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷 月旨酰乙醇胺，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS =Dioctadecylamidoglicylspermin, DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨，DOTAP 二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14:0，0-雙十四烷酰-Ν-(α-三甲基氨溶乙酰基)二乙醇胺氯化物，CLIPl 外消 旋-[(2,3-雙十八烷基氧基丙基)(2-羥基乙基)]_ 二甲基氯化銨，CLIP6 外消旋-[2(2， 3-雙十六烷基氧基丙基-羥甲基氧基)乙基]三甲基銨，11 9:外消旋-[2(2，3-雙十六 烷基氧基丙基-羥基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基銨，oligofectamine，或陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離 子聚合物，其包括改性聚氨基酸，包括β “氨基酸_聚合物或反轉(zhuǎn)聚酰胺，改性聚乙烯，包括 PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，改性丙烯酸脂，包括pDMAEMA (聚(二甲基氨基 乙基甲基丙烯酸酯))，改性酰氨基胺(Amidoamines)，包括pAMAM(聚(酰氨基胺))，改性聚 β氨基酯(ΡΒΑΕ)，包括二胺末端改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合 物，樹狀聚體，包括聚丙胺樹狀聚體或基于PAMAM的樹狀聚體，聚亞胺，包括PEI 聚(乙烯 亞胺)，聚(丙烯亞胺)，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，包括基于環(huán)糊精的聚合物，基于 葡萄糖的聚合物，脫乙酰殼多糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，諸如PMOXA-PDMS共 聚物，等，嵌段聚合物，其由選自如前文提及的陽(yáng)離子聚合物的一個(gè)或多個(gè)陽(yáng)離子嵌段的組 合與一個(gè)或多個(gè)親水_或疏水嵌段(例如，聚乙二醇)的組合組成；或陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子蛋白或肽，其選自具有下述總式(I)的蛋白或肽(Arg)1; (Lys)m; (His)n; (Orn)。；(Xaa)x，其中l(wèi)+m+η+ο+χ = 8-15，并且l，m，n或ο彼此獨(dú)立地可以是選自0， 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14 或 15 的任一數(shù)字，條件是 Arg，Lys, His 和 Orn 的總 含量占該寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是選自除Arg，Lys, His或Orn外的 天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是選自0，1，2，3或4的 任一數(shù)字，條件是Xaa的總含量不超過(guò)該寡肽所有氨基酸的50% ；或具有式(II)的核酸=G1XmGn，其中G是鳥苷，尿嘧啶或是鳥苷或尿嘧啶的類似物；X是 鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng) 1 = 1時(shí)，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)1 > 1時(shí)，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物；m是整 數(shù)，并且至少為3 ；其中當(dāng)m = 3時(shí)，X是尿嘧啶或其類似物，當(dāng)m > 3時(shí)，存在至少3個(gè)連續(xù) 的尿嘧啶或尿嘧啶類似物；11是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時(shí)，G是鳥苷或其類似物，當(dāng)11 > 1時(shí)，至少50%的核苷酸是鳥苷或其類似物；或具有式(III)的核酸=C1XmCn，其中C是胞嘧 啶、尿嘧啶或者是胞嘧啶或尿嘧啶的類似物；X是鳥苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述 提及的核苷酸的類似物；1是1-40的整數(shù)，其中當(dāng)1 = 1時(shí)，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)1 > 1時(shí)，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其類似物；m是整數(shù)，并且至少為3 ；其中當(dāng)m = 3時(shí)，X 是尿嘧啶或其類似物，當(dāng)m > 3時(shí)，存在至少3個(gè)連續(xù)的尿嘧啶或尿嘧啶類似物；η是1_40 的整數(shù)，其中當(dāng)η = 1時(shí)，C是胞嘧啶或其類似物，當(dāng)η > 1時(shí)，至少50%的核苷酸是胞嘧啶 或其類似物。
20.疫苗，其包括按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物。
21.按照權(quán)利要求20的疫苗，其中按照要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合 物引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
22.按照權(quán)利要求20和21中任一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗還包括藥用載體。
23.按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺激性)組合物用于制備疫苗的應(yīng)用， 所述疫苗用于治療肺癌、優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)病癥、更優(yōu)選與三種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)相關(guān)的病癥，所述三種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)包括鱗狀 細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。
24.試劑盒，優(yōu)選多部件的試劑盒，其包括按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的活性(免疫刺 激性)組合物，和/或按照權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的疫苗，和任選地具有所述活性(免疫 刺激性)組合物和/或所述疫苗的施用和劑量的信息的技術(shù)說(shuō)明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及活性(免疫刺激性)組合物，其包括至少一種RNA，優(yōu)選mRNA，其編碼至少兩種(優(yōu)選不同的)能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)的抗原。本發(fā)明還涉及包括所述活性(免疫刺激性)組合物的疫苗，涉及所述活性(免疫刺激性)組合物(用于制備疫苗)的應(yīng)用和/或所述疫苗用于引發(fā)(適應(yīng)性)免疫反應(yīng)以用于治療肺癌、特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、或與其相關(guān)的病癥的應(yīng)用，所述肺癌優(yōu)選選自三種主要亞型的鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。最后，本發(fā)明涉及包含所述活性(免疫刺激性)組合物和/或所述疫苗的試劑盒，特別是多部件的試劑盒。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101820899SQ200880110920
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者托馬斯·蘭德爾, 約亨·普羅布斯特, 英馬爾·霍伊爾, 馬里耶克·貝爾納 申請(qǐng)人:庫(kù)瑞瓦格有限責(zé)任公司