專利名稱：糖尿病治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人的糖尿病的治療，特別涉及基于增強(qiáng)胰島素的作用的糖尿病的治療方法、糖尿病治療用的蛋白質(zhì)及含有該蛋白質(zhì)的糖尿病治療劑。
背景技術(shù)：
肥胖及肥胖相關(guān)疾病在許多國(guó)家正逐漸成為主要的健康問題。特別是在以西歐為 中心的各發(fā)達(dá)國(guó)家，因肥胖而導(dǎo)致患病率及死亡率上升(非專利文獻(xiàn)1)。近年來(lái)，這些現(xiàn)象 也經(jīng)常與以內(nèi)臟脂肪的積累為原因之一的綜合征、即被稱作所謂代謝綜合征的疾病聯(lián)系在 一起討論。其中，對(duì)肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了大量研究，由脂肪細(xì)胞分泌的內(nèi)分泌物 質(zhì)(脂肪因子(adipokine))與肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病密切相關(guān)這一事實(shí)被逐漸闡明。例如， 已闡明脂肪因子中的瘦素(1印tin)、脂連蛋白(adiponectin)及抵抗素(resistin)控制細(xì) 胞的能量穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感度(非專利文獻(xiàn)2、3)。除此之外，脂肪細(xì)胞也分泌以往已知由 巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，例如TNF-α和也與胰島素抗性(細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感度的 下降)相關(guān)的MCP-I等蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)4、5)。這些細(xì)胞因子也可以認(rèn)為是脂肪因子的 一種。除此之外，也觀察到多種脂肪因子在從前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的過程中表達(dá)。如上所述，闡明由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子的功能在闡明包括糖尿病在內(nèi)的肥胖 相關(guān)疾病和所謂代謝綜合征的病因、進(jìn)而開發(fā)出對(duì)這些疾病有效的新的療法方面是極為重 要的。肥胖相關(guān)疾病中，糖尿病僅在日本國(guó)內(nèi)患者人數(shù)就超過700萬(wàn)人，而且該數(shù)量正 急劇增加。其它發(fā)達(dá)國(guó)家也處于與日本同樣的狀況。糖尿病是因血糖值的調(diào)節(jié)能力(糖耐 量)減弱、血糖值異常升高而引發(fā)的全身性代謝障礙，糖尿病的特征在于不僅會(huì)引發(fā)高滲 性昏迷和酮酸中毒等嚴(yán)重的代謝異常，而且因微血管病性的并發(fā)癥而使得預(yù)后變差，使生 活質(zhì)量(QOL)極度下降。糖尿病大致分為因胰臟β細(xì)胞被破壞(以自身免疫異常為主要原 因)而引起的1型糖尿病及對(duì)胰島素的抗性的增強(qiáng)和胰島素分泌低下疊加的2型糖尿病。2型糖尿病(占糖尿病患者的約90% )中，胰臟β細(xì)胞中的胰島素分泌的低下和 作為胰島素的靶細(xì)胞的骨骼肌等中的胰島素抗性在不同程度上疊加而引發(fā)胰島素作用的 低下，從而導(dǎo)致高血糖狀態(tài)。此外，由于胰島素抗性的持續(xù)，形成胰臟β細(xì)胞疲勞、胰島素 分泌能力進(jìn)一步下降這樣的惡性循環(huán)，癥狀不斷惡化。對(duì)于2型糖尿病，為切斷這樣的惡性 循環(huán)，改善胰島素抗性的藥劑被認(rèn)為是極為有效的。作為針對(duì)2型糖尿病的治療劑，已市售的有米格列奈鈣水合物片(商品名 Glufast片)和鹽酸吡格列酮片(商品名=Actos片)。然而，病因尚未闡明，尚無(wú)法應(yīng)對(duì)具 有多種背景的所有2型糖尿病患者。因此希望開發(fā)出作用機(jī)理不同的新的藥劑。凱莫瑞(chemerin)(也稱為TIG2、代謝因子(metabokine))是針對(duì)巨噬細(xì)胞和未 分化樹枝狀細(xì)胞的趨化因子，是G蛋白偶聯(lián)受體(ChemR23)的配體(非專利文獻(xiàn)6、7)。據(jù) 報(bào)道，凱莫瑞作為針對(duì)免疫調(diào)節(jié)性抗原遞呈細(xì)胞的特異性群體的趨化因子，具有控制炎癥或損傷部位的免疫反應(yīng)的功能(非專利文獻(xiàn)8、9)。人凱莫瑞被翻譯成由163個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，在以修飾加工有由N末端 的20個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽的前體(人凱莫瑞原(prochemerin))(堿基序列示于序列 編號(hào)1，氨基酸序列示于序列編號(hào)2)的形式分泌后，C末端的6個(gè)氨 基酸(氨基酸序列 Lys-Ala-Leu-Pro-Arg-Ser 序列編號(hào)3)被除去，成為對(duì)ChemR23具有高親合性的由137個(gè) 氨基酸構(gòu)成的人成熟型凱莫瑞(堿基序列示于序列編號(hào)4，氨基酸序列示于序列編號(hào)5)(非 專利文獻(xiàn)7和10)。最近據(jù)報(bào)道，凱莫瑞是參與脂肪細(xì)胞的分化的脂肪因子的一種(非專利文獻(xiàn)11)， 凱莫瑞的血中濃度與體重指數(shù)(BMI)、甘油三酯的血中濃度及血壓相關(guān)(非專利文獻(xiàn)12)。 然而，凱莫瑞在代謝調(diào)控中的作用尚未闡明。非專利文獻(xiàn)1 =Nature,414 :782_7(2001)非專利文獻(xiàn)2 J Allergy Clin Immunol, 115 911-9 (2005) ；quiz 920非專利文獻(xiàn)3 :Endocrinol Metab，89 :2548_56 (2004)非專利文獻(xiàn)4:Circ Res，95 :858_66 (2004)非專利文獻(xiàn)5:Annu Rev Immunol, 18 217-42 (2000)非專利文獻(xiàn)6 J Invest Dermatol，109 :91_5 (1997)非專利文獻(xiàn)7 J Exp Med, 198 :977_85 (2003)非專利文獻(xiàn)8 J Biol Chem，280 :34661-6 (2005)非專利文獻(xiàn)9 J Immunol, 174 244-51 (2005)非專利文獻(xiàn)10 J Biol Chem, 279 9956-62 (2004)非專利文獻(xiàn)11 J Biol Chem, 282 :28175_88 (2007)非專利文獻(xiàn)12 =Endocrinology, 148 4687-94 (2007)發(fā)明的揭示在上述背景下，本發(fā)明的目的在于提供糖尿病、特別是2型糖尿病的治療方法，糖 尿病治療用的蛋白質(zhì)及含有該蛋白質(zhì)的治療劑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用作為前脂肪細(xì)胞的小鼠的3T3-L1細(xì)胞作為體外的脂肪細(xì)胞 模型，采用差異顯示(differential display)法來(lái)克隆在3T3-L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的 過程中被誘導(dǎo)表達(dá)的基因，檢測(cè)出伴隨著向脂肪細(xì)胞的分化而被誘導(dǎo)表達(dá)的基因，該基因 便是凱莫瑞。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，人成熟型凱莫瑞可增強(qiáng)胰島素對(duì)3T3-L1細(xì)胞的葡萄糖攝取 促進(jìn)作用。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，人成熟型凱莫瑞對(duì)正常小鼠及2型糖尿病模型小鼠具有增強(qiáng) 胰島素的降血糖作用的效果。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。1. 一種糖尿病治療劑，其中含有人成熟型凱莫瑞作為有效成分。2.上述1的糖尿病治療劑，其中所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。3.上述1的糖尿病治療劑，其中所述糖尿病是2型糖尿病。4.上述1 3中的任一項(xiàng)的糖尿病治療劑，該糖尿病治療劑是降血糖劑。5.上述1 4中的任一項(xiàng)的糖尿病治療劑，該糖尿病治療劑是胰島素作用增強(qiáng)劑。6.上述1 5中的任一項(xiàng)的糖尿病治療劑，該糖尿病治療劑是同時(shí)接受人胰島素 給藥的患者用的糖尿病治療劑。
7.上述1 5中的任一項(xiàng)的糖尿病治療劑，該糖尿病治療劑是注射劑的形態(tài)。8.上述7的糖尿病治療劑，其中所述注射劑是含有人成熟型凱莫瑞的水性液劑。 9.上述7的糖尿病治療劑，其中所述注射劑是含有人成熟型凱莫瑞的冷凍干燥 物。10.上述1 9中的任一項(xiàng)的糖尿病治療劑，其中所述人成熟型凱莫瑞包含序列編 號(hào)5的氨基酸序列。11. 一種患者的糖尿病的治療方法，其中包括給予該患者有效量的人成熟型凱莫 瑞的步驟。12.上述11的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。13. 一種人成熟型凱莫瑞，其用于糖尿病治療。14.上述13的人成熟型凱莫瑞，其中所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。人成熟型凱莫瑞增強(qiáng)胰島素對(duì)細(xì)胞的葡萄糖攝取的促進(jìn)作用，增強(qiáng)胰島素的降血 糖作用。因此，人成熟型凱莫瑞可用于糖尿病的治療，含有人成熟型凱莫瑞的本發(fā)明的糖尿 病治療劑可增強(qiáng)患者的內(nèi)源性胰島素或給予患者的胰島素的作用，提高細(xì)胞對(duì)血中葡萄糖 的攝取，與僅使用胰島素的情況相比可更有效地降低血糖值。因此，本發(fā)明的糖尿病治療劑 可用于1型糖尿病和2型糖尿病中的任一種，特別是因?yàn)樵鰪?qiáng)胰島素對(duì)細(xì)胞的葡萄糖攝取 的促進(jìn)作用，所以尤其適合用作伴隨著胰島素抗性的2型糖尿病的治療劑。此外，本發(fā)明的 糖尿病治療劑增強(qiáng)胰島素的作用，所以對(duì)于能分泌足量的內(nèi)源性胰島素的患者，可在不同 時(shí)進(jìn)行胰島素給藥的情況下單獨(dú)給予本發(fā)明的糖尿病治療劑來(lái)降低血糖值，此外，患者的 內(nèi)源性胰島素分泌量下降或?qū)嵸|(zhì)上沒有分泌的情況下，可與補(bǔ)充性的胰島素給藥并用。此外，本發(fā)明的糖尿病治療劑被認(rèn)為是G蛋白偶聯(lián)受體(ChemR23)的配體，通過 ChemR23起作用，其作用機(jī)理與現(xiàn)有的藥劑完全不同，因此可用作對(duì)現(xiàn)有的藥劑有抗性的糖 尿病患者的治療劑。附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1所示為由各種人臟器提取的mRNA的以人凱莫瑞cDNA為探針的RNA印跡 (northern blotting)。泳道1為心臟的mRNA，泳道2為腦的mRNA，泳道3為胎盤的mRNA， 泳道4為肺的mRNA，泳道5為肝臟的mRNA，泳道6為骨骼肌的mRNA，泳道7為腎臟的mRNA， 泳道8為胰臟的mRNA。圖2是表示人凱莫瑞原和人成熟型凱莫瑞表達(dá)用載體的構(gòu)建方法的概要的工序 圖。圖3是表示人凱莫瑞原和人成熟型凱莫瑞表達(dá)用載體的構(gòu)建方法的概要的工序 圖。圖4所示為經(jīng)純化的人成熟型凱莫瑞的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜。(A)考馬斯亮藍(lán) 染色。M表示分子量標(biāo)記物。泳道1加載3yg蛋白質(zhì)，泳道2加載5yg蛋白質(zhì)。(B)蛋白 質(zhì)印跡(western blotting)。M表示分子量標(biāo)記物。圖5所示為人成熟型凱莫瑞對(duì)由人胰島素誘導(dǎo)的前脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取量的 影響。豎線表示標(biāo)準(zhǔn)差，星號(hào)(*)表示t檢驗(yàn)中P <0.05。圖6所示為人成熟型凱莫瑞對(duì)正常小鼠中的人胰島素的降血糖作用的影響。豎線 表示標(biāo)準(zhǔn)差，星號(hào)(*)表示t檢驗(yàn)中P < 0. 05。
圖7所示為人成熟型凱莫瑞對(duì)2型糖尿病模型小鼠中的人胰島素的降血糖作用的影響。實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明中，用人成熟型凱莫瑞進(jìn)行治療的“患者”是包括人在內(nèi)的哺乳類動(dòng)物，特優(yōu)選人。本發(fā)明的糖尿病治療劑含有人成熟型凱莫瑞作用有效成分。本發(fā)明中，提及“人成 熟型凱莫瑞”時(shí)，除了野生型的人成熟型凱莫瑞(即從剛在人體內(nèi)翻譯好的人凱莫瑞除去信 號(hào)肽部分和C末端的6個(gè)氨基酸而成的蛋白質(zhì)序列編號(hào)5)以外，(只要具有增強(qiáng)胰島素的 作用的效果)也包括在該蛋白質(zhì)的N末端附加1個(gè)或2個(gè)氨基酸殘基(例如Asp-Pro-等) 而成的蛋白質(zhì)。在N末端附加上述1個(gè)或2個(gè)氨基酸不會(huì)對(duì)野生型的人成熟型凱莫瑞的上 述作用造成特別的影響。特別是在采用基因重組技術(shù)使宿主細(xì)胞產(chǎn)生異種蛋白質(zhì)時(shí)有時(shí)會(huì) 因技術(shù)上的制約而殘存N末端的上述1 2個(gè)追加的殘基，但包含這些追加的氨基酸殘基 的人成熟型凱莫瑞通常也可與不含這些追加的氨基酸殘基的原本的人成熟型凱莫瑞完全 同樣地使用。本發(fā)明中，人成熟型凱莫瑞可采用基因重組技術(shù)作為基因重組產(chǎn)物制造。此時(shí)，作 為構(gòu)成表達(dá)系統(tǒng)的宿主，可使用大腸桿菌、CHO細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。以人成熟型凱莫瑞作為有效成分的本發(fā)明的糖尿病治療劑能以注射劑的形式在 靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥。其中優(yōu)選皮下給藥。本發(fā)明的糖尿病治療劑能以冷凍干燥制 劑或水性液劑的形式提供。制成水性液劑時(shí)，可以制成填充于管瓶(vial)的形態(tài)，也能以 預(yù)先填充于注射器的預(yù)灌裝型制劑的形式提供。冷凍干燥制劑的情況下，在使用前溶解于 水性介質(zhì)使用。以人成熟型凱莫瑞作為有效成分的本發(fā)明的糖尿病治療劑可與胰島素制劑并用。 此時(shí)，含有人成熟型凱莫瑞的糖尿病治療劑可以在給予胰島素制劑前給予，也可以在給予 胰島素制劑的同時(shí)給予，還可以在給予胰島素制劑后給予。此時(shí)，本發(fā)明的糖尿病治療劑也 可以與胰島素制劑組合，以糖尿病治療用試劑盒的形式提供。作為試劑盒，可以是將胰島素 制劑(安瓿、管瓶或預(yù)灌裝型)和本發(fā)明的人成熟型凱莫瑞制劑(安瓿、管瓶或預(yù)灌裝型) 組合并收納于單個(gè)容器而成的試劑盒。此時(shí)，胰島素制劑也可以是與以往常用的制劑同樣 的制劑。此外，欲同時(shí)給予胰島素和人成熟型凱莫瑞時(shí)，本發(fā)明的糖尿病治療劑也可以是同 時(shí)含有有效量的人成熟型凱莫瑞和有效量的胰島素的單一制劑。本發(fā)明中，人成熟型凱莫瑞的給藥量是由主治醫(yī)師根據(jù)患者的胰島素抗性的程度 和胰島素分泌低下的程度來(lái)判斷的事項(xiàng)，在患者的內(nèi)源性胰島素量少、對(duì)患者同時(shí)給予胰 島素和人成熟型凱莫瑞的情況下，例如能以相對(duì)于100單位的胰島素、人成熟型凱莫瑞為 50 IOOOmg的比例并用?；颊叩膬?nèi)源性胰島素的分泌量有相當(dāng)程度、不給予胰島素而只給 予人成熟型凱莫瑞的情況下，人成熟型凱莫瑞的給藥量例如可以是10 200mg/成人/天。此外，在沒有嚴(yán)重的副作用的可接受的范圍內(nèi)，本發(fā)明的糖尿病治療劑可與米格 列奈鈣水合物、鹽酸吡格列酮等其它的糖尿病治療劑并用。本發(fā)明的糖尿病治療劑也可以是將凱莫瑞與無(wú)菌的水性介質(zhì)或非水性介質(zhì)混合 調(diào)制而成的注射劑的形態(tài)。作為無(wú)菌的水性介質(zhì)，可使用注射用水，作為無(wú)菌的非水性介 質(zhì)，可從丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、大豆油、玉米油、丙二醇脂肪酸酯等本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的非水性的注射劑的介質(zhì)中適當(dāng)選擇使用。優(yōu)選的介質(zhì)是水性介質(zhì)，特優(yōu)選水。此外，本 發(fā)明的糖尿病治療劑也可以是根據(jù)需要在注射劑中摻入常用的各種添加劑而得的治療劑。 作為上述添加劑的主要例子，可例舉等滲劑、緩沖劑、保存劑、穩(wěn)定劑、PH調(diào)整劑等。上文中，作為等滲劑的例子，可例舉氯化鈉等鹽類。作為緩沖劑的例子，可例舉磷 酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、乙酸緩沖液、丙二酸緩沖液、丁二酸緩沖液等。作為保存劑的例 子，可例舉氯丁醇、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸酯類(對(duì)羥基苯甲酸甲酯(methyIparaberOJi 羥基苯甲酸丙酯(propylparaben))、山梨酸、苯乙醇、苯酚、脫氫乙酸等。作為穩(wěn)定劑，可例 舉白蛋白、球蛋白、山梨糖醇、乙二醇、丙二醇、亞硫酸鈉等。作為PH調(diào)整劑，可例舉鹽酸、 硫酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸，乙酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、葡糖酸、富 馬酸、山梨酸等有機(jī)酸，氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉等無(wú)機(jī)堿，檸檬酸鈉、酒石酸鈉、琥珀酸 鈉、蘋果酸鈉、葡糖酸鈉等有機(jī)堿。PH無(wú)特別限定，可預(yù)先設(shè)定在中性附近，例如pH7. 4左 右ο
實(shí)施例下面參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但并不表示本發(fā)明受到這些實(shí)施例 的限定。另外，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照神戶大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針來(lái)實(shí) 施。〈3T3-L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化>作為小鼠前脂肪細(xì)胞的3T3-L1細(xì)胞是在體外研究前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分 化時(shí)最常用的細(xì)胞(Cell 5:19-27(1975))。3T3-L1細(xì)胞(得自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏 所(ATCC))用含10% FCS的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行傳代培 養(yǎng)。3T3-L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)按照已有報(bào)道的下述步驟進(jìn)行(Life Sci,68 2917-23 (2001))。即，用添加有250nmol/L的地塞米松、0. 5nmol/L的1-甲基-3-異丁基黃 嘌呤及10 μ g/mL的胰島素的含10% FCS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后，換成添加有10 μ g/ mL的胰島素的含10% FCS的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)48小時(shí)。<差異顯示法>使用QuickPr印mRNA純化試劑盒(GE醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)公司(GE > 7 > 7 K 4才寸4 - > ^社))從分化前和分化后的3T3-L1細(xì)胞(各5X IO7個(gè))提取mRNA。使 用ReverTra AceTM(東洋紡株式會(huì)社(東洋紡))由0. 5 μ g的mRNA制成cDNA溶液。艮口， 在0. 5 μ L的cDNA溶液中添加4. 5 μ L的PCR溶液，該P(yáng)CR溶液包含2 μ M的dNTPs，5 μ Ci 的[33P]dATP(3000Ci/mmol，新英格蘭核公司(New England Nuclear)), AmpliTaq(珀金埃 爾默公司(Perkin-Elmer社))，1 μ M的錨定引物(anchor primer) (T12MN,克隆技術(shù)公司 (Clontect^i;))以及0. 5 μ M的任意引物(arbitrary primer) (10mer，GC 比例=40 60%， 克隆技術(shù)公司)。PCR反應(yīng)如下所述進(jìn)行以[94°C:3分鐘，40°C:3分鐘，72°C:5分鐘]的 條件進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，以[94°C 30秒，40°C 2分鐘，72°C 30秒]的條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最 后 于72。C反應(yīng)5分鐘。通過6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳使經(jīng)PCR反應(yīng)用33P標(biāo)記的DNA片段 展開后，使X射線膠片與凝膠重疊，使膠片感光。將X射線膠片顯影，在X射線膠片上對(duì)由 分化前和分化后的各細(xì)胞的cDNA通過PCR反應(yīng)得到的DNA片段的電泳圖譜進(jìn)行比較。將 與分化前相比在分化后X射線膠片上的濃度發(fā)生了變化的條帶視作因脂肪細(xì)胞的分化而被誘導(dǎo)表達(dá)的基因的片段，將與該條帶相對(duì)應(yīng)的部分的凝膠切下，將其作為模板以與上述 同樣的條件再次進(jìn)行PCR反應(yīng)。將由此得到的PCR產(chǎn)物亞克隆至pGEM-T Easy載體(普洛 麥格公司(口乂力'社))。對(duì)于通過亞克隆而得的318個(gè)克隆，按照常規(guī)方法進(jìn)行DNA測(cè)序分析，結(jié)果可知， 其中包括1個(gè)包含小鼠凱莫瑞的基因片段的克隆?！慈藙P莫瑞原基因的克隆〉對(duì)于通過差異顯示法得到的小鼠凱莫瑞基因的堿基序列，用基因庫(kù)(GENEBANK) 進(jìn)行同源性檢索，得到編碼人凱莫瑞原的DNA的堿基序列(序列編號(hào)1)。以人脂肪組織 cDNA(克隆技術(shù)公司)為模板，以引物H (5，-GGATCCTGAGCTCACGGAAGCCCA-3，序列編號(hào) 6)和引物 rl(5’ -CTCGAGTTAGCTGCGGGGCAGGGCCTT-3，序列編號(hào) 7)為引物，用 ReverTra AceTM(東洋紡株式會(huì)社)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增編碼人凱莫瑞原的cDNA。PCR反應(yīng)以[94°C: 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 2分鐘]的條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后于72°C反應(yīng)5分鐘。將擴(kuò) 增好的人凱莫瑞原cDNA插入pCR2. 1載體(諾華基因公司(Novagen社))。將該質(zhì)粒記作 pCR2. 1-凱莫瑞。<RNA 印跡〉用Ndel和Xhol消化pCR2. 1_凱莫瑞，將人凱莫瑞原cDNA切下。使用Rediprime II隨機(jī)引物標(biāo)記系統(tǒng)(安瑪西亞生命科學(xué)公司(AmershamBiosciences社))，用[32P] dCTP(10mCi/mL，安瑪西亞生命科學(xué)公司)對(duì)切下的cDNA進(jìn)行放射標(biāo)記，將其作為探針。 按照常規(guī)方法使上述經(jīng)放射標(biāo)記的探針與人8泳道多組織RNA印跡膜(Human 8-lane Multiple Tissue NorthernBlot) (BD 生命科學(xué)公司(BD Bioscience 社))雜交來(lái)進(jìn)行 RNA 印跡，所述人8泳道多組織RNA印跡膜是為了進(jìn)行RNA印跡而將來(lái)源于心臟、腦、胎盤、肺、 肝臟、骨骼肌、腎臟及胰臟的RNA轉(zhuǎn)印到尼龍膜上而得的膜。其結(jié)果是，人凱莫瑞基因的表 達(dá)主要可在肝臟和胰臟中檢出(圖1)?！炊嗫寺】贵w的制備〉以 pCR2. 1-凱莫瑞為模板，以引物 f2 (5，-CATATGGAGCTCACGGAAGCCCA-3’ 序列編 號(hào)8)和引物r2(5，-GGATCCTTAGCTGCGGGGCAGGGCCTT-3，序列編號(hào)9)為引物，擴(kuò)增人凱莫 瑞原cDNA。PCR反應(yīng)以[94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 2分鐘]的條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)， 最后于72V反應(yīng)5分鐘。將擴(kuò)增好的人凱莫瑞原cDNA插入pT7BlueT載體(諾華基因公 司)。將該質(zhì)粒記作pT7Blue-凱莫瑞。用Ndel和BamHI消化pT7Blue_凱莫瑞，切下人凱 莫瑞原cDNA，將其插入經(jīng)Ndel和BamHI消化的pET14_b載體(諾華基因公司)。將該質(zhì)粒 記作PET-凱莫瑞。pET-凱莫瑞的制作方法的概要示于圖2及圖3。用pET-凱莫瑞得到的 人凱莫瑞原在N末端附加有組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，將其記作組氨酸標(biāo)簽-人凱莫瑞原。用pET-凱莫瑞轉(zhuǎn)化大腸桿菌ADA494(DE3)。使經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌懸浮于2L的 LB培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)，在0D_達(dá)到約0. 4時(shí)以濃度達(dá)到0. 4mM的條件在培養(yǎng)基中添 加IPTG，再培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)后，離心分離回收大腸桿菌，用含有500mM氯化鈉和0. TritonX-100的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 5)清洗1次后，使其懸浮于細(xì)胞破碎液[含有 500mM氯化鈉、0. 1 % TritonX-100及8M尿素的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 5)]，超聲波破碎 細(xì)胞。離心分離除去細(xì)胞殘?jiān)?，所得上清?. 22 ym濾器過濾后，過預(yù)先用細(xì)胞破碎液平衡 好的HiTrapchelating HP柱(安瑪西亞生命科學(xué)公司)。用5倍容積的細(xì)胞破碎液清洗柱后，用添加有200mM咪唑的細(xì)胞破碎液將組氨酸標(biāo)簽-人凱莫瑞原洗脫。回收的洗脫液過 用含有4M尿素、ImM的2-巰基乙醇、ImM的DTT、500mM的氯化鈉、0. 的TritonX-100的 20mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 5)平衡好的Superdex200柱(安瑪西亞生命科學(xué)公司)，從而回 收組氨酸標(biāo)簽_人凱莫瑞原。按照常規(guī)方法用回收的組氨酸標(biāo)簽_人凱莫瑞原免疫兔子， 獲得含抗組氨酸標(biāo)簽_人凱莫瑞原抗體的抗血清。<人成熟型凱莫瑞表達(dá)用桿狀病毒載體的制備>用BamHI消化pFastBac-1 (吉布科BRL公司(GIBCO BRL))后，將BamHI的突 出末 端用Klenow片段(東洋紡株式會(huì)社)補(bǔ)平，用連接試劑盒第2版(寶公司(TAKARA))使其 自連，破壞pFastBac-1的BamHI位點(diǎn)。將該質(zhì)粒記作pFastBacl [-BamHI]。以人脾臟cDNA文庫(kù)(寶生物公司(夕力，^ 4才))為模板，用引物f3(5，_CGCG GATCCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC-3，序列編號(hào) 10)和弓丨物 r3(5，-AAGGAAAAAAGCGGC CGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3，序列編號(hào) 11)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增人 IgG 的 Fc 基 因。PCR反應(yīng)如下進(jìn)行以[94°C 3分鐘，55°C 1分鐘，72°C 2分鐘]的條件進(jìn)行35個(gè)循 環(huán)，最后于72V反應(yīng)5分鐘。用BamHI和NotI消化PCR產(chǎn)物，將其重組于經(jīng)BamHI和NotI 消化的pBluesCriptSK(-) (pBSK (-)，斯特拉塔基因公司(STRATAGENE社))。將該質(zhì)粒記作 pBlu-Fc 。用EcoRI和NotI消化pBlu_Fc，切下Fc基因片段，將其重組于經(jīng)EcoRI和NotI消 化的 pFastBacl [-BamHI]。將該質(zhì)粒記作 pFastBac-Fc。將編碼蜜蜂的蜂毒肽(melittin)信號(hào)序列的彼此互補(bǔ)的2條寡聚DNA、即寡聚DN Afl (5’ -GAATTCTATMATATGMATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCT ATGCG-3，序列編號(hào) 12)和寡聚 DNArl (5，-GGATCCGCATAGATGTAAGAAATGTACACGACCATAAAAAC AAGGGCAACGTTGACTAAGAATTTCATATTTATAG-3’ 序列編號(hào) 13)的 5，末端用 T4 多聚核苷酸激 酶(東洋紡株式會(huì)社(T0Y0B0社))磷酸化后，使它們彼此退火形成雙鏈DNA，將其重組于經(jīng) EcoRI和BamHI消化的pFastBac-Fc。將其記作pFastBac-信號(hào)序列-Fc。以pT7Blue-凱莫瑞為模板，以引物 f4(5，-GGATCCTGAGCTCACGGAA-3，序列編號(hào) 14)和引物r4(5’ -CTCGAGTTAGGAGAAGGCGAA-3’ 序列編號(hào)15)為引物，擴(kuò)增人成熟型凱莫 瑞cDNA。擴(kuò)增的人成熟型凱莫瑞cDNA用BamHI和Xhol消化，使其與經(jīng)BamHI和Xhol消化 的pFastBac-信號(hào)序列_Fc進(jìn)行連接反應(yīng)。將5 y L連接反應(yīng)液與50 y L的Bacmid構(gòu)建用 大腸桿菌DHlOBac的感受態(tài)細(xì)胞(英杰公司(Invitrogen社))混合，在冰上靜置30分鐘。 加以熱激后，加入加溫至37°C的0. 5mL的S0C培養(yǎng)基并混合，于37°C培養(yǎng)5小時(shí)。將培養(yǎng) 液用LB培養(yǎng)基稀釋2000倍，將0. 2mL稀釋液鋪于LB平板(卡那霉素50 u g/mL,慶大霉素 7iig/mL，四環(huán)素10iig/mL，涂布有IPTG/Xgal)。于37°C培養(yǎng)2天。培養(yǎng)后，從平板上選擇 大而白的大腸桿菌菌落，從該克隆純化BacmidDNA。將其記作人成熟型凱莫瑞表達(dá)用桿狀病 毒載體(pFastBac-信號(hào)序列-凱莫瑞)。通過使用pFastBac-信號(hào)序列-凱莫瑞，以N末 端附加有蜂毒肽信號(hào)序列的分泌蛋白質(zhì)的形式在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)人成熟型凱莫瑞，表達(dá)后 蜂毒肽信號(hào)序列部分被除去，人成熟型凱莫瑞被釋放至培養(yǎng)基中。pFastBac-信號(hào)序列-凱 莫瑞的制作方法的概要示于圖3。<人成熟型凱莫瑞表達(dá)用重組桿狀病毒的制備>將懸浮于含10% FCS的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(英杰公司)的Sf9細(xì)胞以每孔1. 5 X 106個(gè)/2mL的量鋪于6孔板后，于27°C靜置1. 5小時(shí)，使Sf9細(xì)胞貼壁。從板中除去培 養(yǎng)基，用每孔2mL不含添加劑的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(英杰公司)清洗細(xì)胞后，每孔添加 2mL不含添加劑的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，于27°C靜置10分鐘。將5 y L的Cellfectin (英 杰公司)與100 y L不含添加劑的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基混合，向其中添加5 u L人成熟型 凱莫瑞表達(dá)用桿狀病毒載體溶液和100 yL不含添加劑的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的混合 液，進(jìn)一步混合，于27°C靜置30分鐘。靜置后，向其中添加800 u L不含添加劑的Grace 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，制成Bacmid-Cellfectin混合液。從板中除去培養(yǎng)基，每孔添加lmL的 Bacmid-Cellfectin混合液，于27°C靜置5小時(shí)。靜置后，每孔用2mL含10% FCS的Grace 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基清洗，每孔添加2mL含10% FCS的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，于27°C培養(yǎng)3 天。培養(yǎng)后回收培養(yǎng)上清，將通過離心分離(3000rpm，5分鐘)除去了細(xì)胞殘?jiān)囊后w作為 人成熟型凱莫瑞表達(dá)用種病毒液(表達(dá)用種病毒液)。表達(dá)用種病毒液于4°C保存待用。<人成熟型凱莫瑞表達(dá)用桿狀病毒的大量制備>用含10% FCS的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基使Sf9細(xì)胞以0. 8X 106個(gè)/mL的濃度懸 浮，將10mL該懸浮液鋪于75cm2培養(yǎng)瓶。于27°C靜置1小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。除去培養(yǎng)液，加 入4mL上述培養(yǎng)基和lmL表達(dá)用種病毒液的混合液，室溫下輕振1小時(shí)以使病毒感染。除 去上清，每瓶添加10mL上述培養(yǎng)基，于27°C培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后回收培養(yǎng)上清，將通過離心分 離(3000rpm，5分鐘)除去了細(xì)胞殘?jiān)囊后w作為人成熟型凱莫瑞表達(dá)用病毒液。人成熟 型凱莫瑞表達(dá)用病毒液于4°C保存待用。<重組人成熟型凱莫瑞的表達(dá)>使High-Five 細(xì)胞以2. 5X106f/mL的濃度懸浮于含10% FCS的Grace昆蟲 細(xì)胞培養(yǎng)基，將20mL該懸浮液鋪于150cm2培養(yǎng)瓶(15個(gè))。于27°C靜置1小時(shí)，使細(xì)胞貼 壁。除去培養(yǎng)上清后，向瓶中加入9. 5mL上述培養(yǎng)基和0. 5mL凱莫瑞表達(dá)用病毒液的混合 液，室溫下輕振1小時(shí)以使病毒感染。除去上清，每瓶添加20mL的EX-CELL405培養(yǎng)基(JRH 生命科學(xué)公司(JRH Biosciences社))，于27°C培養(yǎng)3天?；厥张囵B(yǎng)上清，通過離心分離 (3000rpm, 5分鐘)除去細(xì)胞殘?jiān)厥张囵B(yǎng)上清，用0. 22 y m濾器過濾該培養(yǎng)上清。<人成熟型凱莫瑞的純化>用100mM的HEPES緩沖液(pH7. 0)對(duì)回收的上述培養(yǎng)上清進(jìn)行透析。將其過預(yù)先 用50mM的HEPES緩沖液(pH7. 0)平衡好的SP Sepharose (HiTrap SP XL, GE醫(yī)療集團(tuán)生 命科學(xué)公司(GE Healthcare Bio-Sciences社)，柱尺寸5mL)，使人成熟型凱莫瑞吸附于樹 脂。用5倍容積的50mM的HEPES緩沖液(pH7. 0)清洗樹脂后，用氯化鈉濃度梯度將吸附于 樹脂的人成熟型凱莫瑞洗脫?；厥粘霈F(xiàn)在約400mM的氯化鈉濃度處的主峰?；厥盏南疵撘?過用PBS平衡好的Tricorn Superdex 75 (100/300)，將主峰作為人凱莫瑞回收。用10-20%梯度凝膠(PAG mini “第一” 10/20，第一化學(xué)藥品株式會(huì)社)對(duì)人成 熟型凱莫瑞進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳后，對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。其結(jié)果是，在根據(jù)人成 熟型凱莫瑞的氨基酸序列預(yù)測(cè)的分子量的位置出現(xiàn)了條帶(圖4A)。此外，用抗組氨酸標(biāo) 簽-人凱莫瑞抗體進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡，結(jié)果與通過丙烯酰胺凝膠電泳而得的條帶相對(duì)應(yīng)的 位置被染色，確認(rèn)該條帶是人成熟型凱莫瑞的條帶(圖4B)。<人成熟型凱莫瑞的N末端氨基酸序列的分析>用10-20%梯度凝膠(PAG mini “第一” 10/20，第一化學(xué)藥品株式會(huì)社)對(duì)回收的人成熟型凱莫瑞進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳后，通過半干印跡法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。用麗春紅3R將PVDF膜染色，將被染色的蛋白質(zhì)的點(diǎn)(spot)切下，用20%乙醇脫 色后，用蛋白質(zhì)測(cè)序儀ProciSe492HT(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司、7 H A卜才* 7歹A文 社))進(jìn)行N末端氨基酸序列的分析。其結(jié)果是，解讀了自N末端起的9個(gè)氨基酸的序列(A sp-Pro-Glu-Leu-Thr-Glu-Ala-Gln-Arg 序列編號(hào)16)。自N末端起的2個(gè)氨基酸殘基(即 Asp-Pro-)是來(lái)源于蜂毒肽的信號(hào)序列的氨基酸殘疾，之后的7個(gè)氨基酸序列與預(yù)測(cè)的人 成熟型凱莫瑞的氨基酸序列完全一致。即，這里純化的人成熟型凱莫瑞是在天然的人成熟 型凱莫瑞的N末端側(cè)附加有來(lái)源于蜂毒肽的信號(hào)序列的2個(gè)氨基酸(Asp-Pro-)的蛋白質(zhì)。<人成熟型凱莫瑞對(duì)脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取量的影響>按照已報(bào)道的方法研究了人成熟型凱莫瑞對(duì)3T3-L1細(xì)胞的葡萄糖攝取量的影響 (Biochem J. 1990 ；271 :201_207)。即，將已分化成脂肪細(xì)胞的3T3-L1細(xì)胞、即3T3-L1脂 肪細(xì)胞在lOOng/mL的人成熟型凱莫瑞存在下培養(yǎng)12小時(shí)(凱莫瑞添加組)，再以10_8M及 10_7M的濃度添加人胰島素，培養(yǎng)15分鐘。將未添加人成熟型凱莫瑞的細(xì)胞作為凱莫瑞不 添加組，對(duì)于該組也以10_8M及10_7M的濃度添加人胰島素，培養(yǎng)15分鐘。接著，在各組的 培養(yǎng)液中均添加0. 5 y Ci的[1，2-3H] 2-脫氧-D葡萄糖(NEN生命科學(xué)制品公司(NENLife Science Products社))，再培養(yǎng)15分鐘。培養(yǎng)后，用PBS清洗細(xì)胞3次。添加0. 2M的NaOH 來(lái)溶解細(xì)胞，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性，求出被細(xì)胞攝取的葡萄糖量。葡萄糖量以相 對(duì)于每單位蛋白質(zhì)量(mg)的量算出。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過t檢驗(yàn)進(jìn)行凱莫瑞添加組和凱莫 瑞不添加組的組間比較，P值< 0. 05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。與凱莫瑞不添加組相比，凱莫瑞添加組中，以10_8M及W_7M的濃度添加人胰島素 后，葡萄糖攝取量顯著增加，兩組間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。另一方面，未添加人胰島素的 情況下，凱莫瑞添加組和凱莫瑞不添加組之間沒有差異，未見因人成熟型凱莫瑞的添加所 導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取增加(圖5)。這些結(jié)果表明，單獨(dú)的人成熟型凱莫瑞不會(huì)對(duì) 脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取造成影響，但人成熟型凱莫瑞具有增強(qiáng)人胰島素對(duì)脂肪細(xì)胞的葡萄 糖攝取的促進(jìn)作用的功能。<正常小鼠中的人成熟型凱莫瑞對(duì)人胰島素的降血糖作用的影響>在12小時(shí)的照明切換調(diào)節(jié)及恒定室溫的條件下飼養(yǎng)雄性C57BL/6J小鼠，讓它們 自由攝取飼料和水，達(dá)到8周齡的小鼠供實(shí)驗(yàn)。從實(shí)驗(yàn)前一天起將小鼠禁食，禁食起18小 時(shí)后，在腹腔內(nèi)給予溶解于200 y L的PBS的40 y g人成熟型凱莫瑞(凱莫瑞給藥組)。將 給予200 y L的PBS來(lái)代替人成熟型凱莫瑞溶液的小鼠作為對(duì)照組。各組的小鼠的個(gè)體數(shù) 為9只。給予人成熟型凱莫瑞45分鐘后，給予兩組動(dòng)物0.009單位的人胰島素(和光純藥 工業(yè)株式會(huì)社(和光純薬工業(yè)))。經(jīng)時(shí)地從眼眶靜脈叢采集約5 u L的血液，用血糖值測(cè)定 器(GlucoCard Alfa GT-1660，愛科萊公司(7 —夕X社))測(cè)定血中的葡萄糖濃度。通 過t檢驗(yàn)進(jìn)行凱莫瑞給藥組和對(duì)照組的組間比較，p值< 0. 05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差升。兩組的給藥前的血糖值均為50 55mg/dL，人胰島素給藥15分鐘后，兩組的血糖 值均急速下降，給藥30分鐘后顯示出最低值(約20mg/dL)。此時(shí)血糖值無(wú)組間差異。該血 糖值的下降是因?yàn)槿艘葝u素的作用(圖6)。然后，血糖值緩緩恢復(fù)，在對(duì)照組中，血糖值在 給藥120分鐘后恢復(fù)到給藥前的值。另一方面，凱莫瑞給藥組與對(duì)照組相比，血糖值的恢復(fù)速度慢，在給藥75 120分鐘后，凱莫瑞給藥組的血糖值與對(duì)照組相比顯示出明顯更低的 值。特別是在給藥105和120分鐘后，其差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。上述結(jié)果表明人凱莫瑞具 有使人胰島素的降血糖作用長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的效果。<2型糖尿病小鼠中的人成熟型凱莫瑞對(duì)人胰島素的降血糖作用的影響>下面，用瘦素受體缺失的2型糖尿病模型小鼠C57BL+S/J_m+/+L印rdb小鼠(db/db 小鼠，柯力亞公司(々> 7社))來(lái)研究人成熟型凱莫瑞的人胰島素敏感度增強(qiáng)效果。在 12小時(shí)的照明切換調(diào)節(jié)及恒定室溫的條件下飼養(yǎng)雄性db/db小鼠，讓它們自由攝取飼料和 水，達(dá)到7周齡的小鼠供實(shí)驗(yàn)。從實(shí)驗(yàn)前一天起將小鼠禁食，禁食起20小時(shí)后，在腹腔內(nèi) 給予溶解于250 y L的PBS的100 u g人成熟型凱莫瑞(凱莫瑞給藥組)。將在腹腔內(nèi)給予 250 y L的PBS來(lái)代替人成熟型凱莫瑞溶液的小鼠作為對(duì)照組。各組的小鼠的個(gè)體數(shù)為9只。 人成熟型凱莫瑞給藥1. 5小時(shí)后，給予0. 06單位的人胰島素(和光純藥株式會(huì)社)。經(jīng)時(shí) 地從眼眶靜脈叢采集約5 iiL的血液，用血糖值測(cè)定器(GlucoCard Alfa GT-1660，愛科萊 公司)測(cè)定血中的葡萄糖濃度。通過t檢驗(yàn)進(jìn)行凱莫瑞給藥組和對(duì)照組的組間比較，p值 < 0. 05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。兩組的給藥前的血糖值均為約120mg/dL。人胰島素給藥15分鐘后，兩組的血糖值 均下降，但在凱莫瑞給藥組中該值約為62mg/dL，在對(duì)照組中該值約為95mg/dL，與對(duì)照組 相比，凱莫瑞給藥組顯示出明顯更低的值(圖7)。該趨勢(shì)持續(xù)至給藥60分鐘后，血糖值的 組間差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。給藥75分鐘后及此后，血糖值未見組間差異。上述結(jié)果表明， 在2型糖尿病模型小鼠中，給予的人成熟型凱莫瑞增強(qiáng)胰島素的降血糖作用?！仓苿?shí)施例1〕水性注射劑人成熟型凱莫瑞.....50mg氯化鈉.........9mg注射用水........總量lmL以上述成分比例使人成熟型凱莫瑞和氯化鈉溶解于注射用水，制成水性注射劑?！仓苿?shí)施例2〕水性注射劑人成熟型凱莫瑞.....200mg氯化鈉.........18mg注射用水........總量2mL以上述成分比例使人成熟型凱莫瑞和氯化鈉溶解于注射用水，制成水性注射劑?！仓苿?shí)施例3〕冷凍干燥型水性注射劑人成熟型凱莫瑞.....lOOmg白蛋白.........lOOmg氯化鈉.........16mg注射用水........總量2mL以上述成分比例使人成熟型凱莫瑞、白蛋白及氯化鈉溶解于注射用水，冷凍干燥， 制成冷凍干燥型水性注射劑。通過在使用時(shí)用2mL的注射用水溶解，從而復(fù)原成水性注射 劑。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性以人成熟型凱莫瑞作為有效成分的本發(fā)明的糖尿病治療劑可增強(qiáng)胰島素的降血糖作用和葡萄糖攝取促進(jìn)作用。因此，本發(fā)明可作為糖尿病的治療劑單獨(dú)使用或與胰島素 共同使用，特別是可用作以胰島素抗性或分泌低下為特征的2型糖尿病的治療劑。
權(quán)利要求
一種糖尿病治療劑，其特征在于，含有人成熟型凱莫瑞作為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的糖尿病治療劑，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖 尿病。
3.如權(quán)利要求1所述的糖尿病治療劑，其特征在于，所述糖尿病是2型糖尿病。
4.如權(quán)利要求1 3中的任一項(xiàng)所述的糖尿病治療劑，其特征在于，該糖尿病治療劑是 降血糖劑。
5.如權(quán)利要求1 4中的任一項(xiàng)所述的糖尿病治療劑，其特征在于，該糖尿病治療劑是 胰島素作用增強(qiáng)劑。
6.如權(quán)利要求1 5中的任一項(xiàng)所述的糖尿病治療劑，其特征在于，該糖尿病治療劑是 同時(shí)接受人胰島素給藥的患者用的糖尿病治療劑。
7.如權(quán)利要求1 5中的任一項(xiàng)所述的糖尿病治療劑，其特征在于，該糖尿病治療劑是 注射劑的形態(tài)。
8.如權(quán)利要求7所述的糖尿病治療劑，其特征在于，所述注射劑是含有人成熟型凱莫 瑞的水性液劑。
9.如權(quán)利要求7所述的糖尿病治療劑，其特征在于，所述注射劑是含有人成熟型凱莫 瑞的冷凍干燥物。
10.如權(quán)利要求1 9中的任一項(xiàng)所述的糖尿病治療劑，其特征在于，所述人成熟型凱 莫瑞包含序列編號(hào)5的氨基酸序列。
11.一種患者的糖尿病的治療方法，其特征在于，包括給予該患者有效量的人成熟型凱 莫瑞的步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病。
13.一種人成熟型凱莫瑞，其特征在于，用于糖尿病治療。
14.如權(quán)利要求13所述的人成熟型凱莫瑞，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病或2 型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明揭示了糖尿病的治療方法、糖尿病治療用的蛋白質(zhì)及含有該蛋白質(zhì)的糖尿病治療劑。該蛋白質(zhì)是人成熟型凱莫瑞，可用于糖尿病、特別是2型糖尿病的治療，尤其可用于同時(shí)接受人胰島素給藥的患者的糖尿病的治療。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101848720SQ20088011454
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者千原和夫, 高橋裕 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人神戶大學(xué);日本化學(xué)研究株式會(huì)社