專利名稱：階段Ⅱ解毒和抗氧化劑活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及柳、茶、及其提取物的抗氧化劑和解毒功能增強(qiáng)作用。
背景技術(shù)：
活體不斷被暴露于能引起不良效果的各種物質(zhì)。此類物質(zhì)包括例如重金屬、某些 食品添加劑、紫外線、和煙草。在這些物質(zhì)對(duì)活體起作用時(shí)，產(chǎn)生稱為自由基的反應(yīng)性氧類 別(reactive oxygen species)?；铙w進(jìn)一步暴露于它作為某些生理學(xué)過(guò)程的副產(chǎn)物生成 自身的氧化應(yīng)激。認(rèn)為氧化應(yīng)激為許多狀況諸如癌癥、常見(jiàn)的疾病、和衰老癥狀的風(fēng)險(xiǎn)因素 之一。活體使用清除自由基和使毒性物質(zhì)解毒的機(jī)制(在本文中稱為宿主防御機(jī)制)來(lái)處 理此類氧化應(yīng)激。在這種介導(dǎo)(mediation)/解毒機(jī)制受到損害時(shí)(例如由于正常的衰老 過(guò)程)，防御機(jī)制不能完全介導(dǎo)這些化學(xué)物，并使這些化學(xué)物解毒，即一種有時(shí)能導(dǎo)致疾病 發(fā)作的過(guò)程。為了解決此問(wèn)題，已經(jīng)嘗試了用于阻止疾病的形成或行進(jìn)的方法，包括采取或應(yīng) 用具有抗氧化劑效果的物質(zhì)(例如包含維生素C和/或E的組合物)。這些方法是有效的； 不過(guò)，通常需要消化大量的抗氧化物質(zhì)，以便產(chǎn)生臨床上顯著的效果。另一方面，一旦得到增強(qiáng)，上文所提及的宿主防御機(jī)制能有效地除去氧化應(yīng)激，并 且因此預(yù)期比采用抗氧化物質(zhì)更有用。“Nrf2”(即一種細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子)作為調(diào)節(jié)宿主 防御機(jī)制的一種至關(guān)重要的蛋白質(zhì)吸引了眾多興趣。在細(xì)胞暴露于氧化應(yīng)激或毒性物質(zhì) 時(shí)，細(xì)胞胞質(zhì)中存在的Nrf2分子被輸入細(xì)胞核中，在那里它們結(jié)合稱為抗氧化劑應(yīng)答元件 的基因調(diào)節(jié)區(qū)(參見(jiàn)例如 Nguyen 等，Ann. Rev. Pharm. Toxicol.，2003，43 :233_60)，而且誘 導(dǎo)稱為階段II解毒酶(phase II detoxification enzyme)的氧化應(yīng)激響應(yīng)酶(其存在于 稱為抗氧化劑應(yīng)答元件的序列下游)的表達(dá)。已知缺乏Nrf2基因的動(dòng)物具有受損的宿主 防御機(jī)制。如此Nrf2在針對(duì)氧化應(yīng)激和毒性物質(zhì)的宿主防御機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，某些植物提取物中的物質(zhì)活化SKN_1/Nrf2，而且強(qiáng)烈誘導(dǎo) 階段II解毒酶(P2D)基因的表達(dá)，降低8-羥基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(8-0HdG)的水平，并提高叉 頭框(forkhead box)01 (F0X01)基因表達(dá)的水平。如此，一方面，本發(fā)明的特征為用于增強(qiáng)P2D和抗氧化劑酶活性的方法和組合物， 例如包含植物提取物(例如柳、綠茶、胡蘿卜、或花椰菜(broccoli)的提取物)和/或其活 性級(jí)分的組合物。另一方面，本發(fā)明的特征為鑒定活化SKN-1/Nrf2，因此增強(qiáng)P2D基因表達(dá) 的物質(zhì)的方法。如本文中所使用的，“活性級(jí)分”指與非分級(jí)提取物相比每份重量具有升高 的活性的提取物級(jí)分。一方面，本發(fā)明提供了包含植物提取物(例如柳、綠茶、胡蘿卜、或花椰菜的提取物)或其活性級(jí)分的組合物，其中所述組合物提高階段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化劑酶 基因之一或兩者在細(xì)胞中的表達(dá)。例如，組合物能提高選自谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾 物亞基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)的P2D基因；和/或抗氧化劑 基因(例如超氧化物歧化酶1(S0D1))的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，組合物還提高F0X01的 表達(dá)和/或降低8-羥基-2’ -脫氧鳥(niǎo)苷(8-0HdG)的水平。在一些實(shí)施方案中，將所述組合物配制用于口服，而且還可以包含一種或多種口 服可接受載體和添加劑。在一些實(shí)施方案中，將組合物配制用于表面(topical)施用，而且 還可以包含一種或多種表面可接受載體和添加劑。在又一方面，本發(fā)明提供了用于提高柳提取物的階段II解毒酶(P2D)和/或抗氧 化劑酶增強(qiáng)活性的方法。該方法包括提供具有第一水平的P2D增強(qiáng)活性的柳提取物；對(duì)所 述提取物分級(jí)，以便獲得兩種或更多種級(jí)分；選擇具有0. 5或更大的Rf值的級(jí)分；測(cè)定所 述級(jí)分的P2D增強(qiáng)活性；并且若級(jí)分具有比P2D增強(qiáng)活性的第一水平高的P2D增強(qiáng)活性水 平，則選擇該級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述提取物分級(jí)包括使用一種或多種選自下組的方法柱 層析、液液分級(jí)、和固液分級(jí)。在又一方面，本發(fā)明提供了鑒定提高階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑基因在細(xì)胞 中表達(dá)的化合物的方法。該方法包括提供表達(dá)(i)P2D或抗氧化劑基因或(ii)包含P2D或 抗氧化劑基因啟動(dòng)子(例如P2D基因啟動(dòng)子的Nrf2結(jié)合序列)的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；提 供植物提取物的級(jí)分；使所述細(xì)胞與所述級(jí)分接觸；并檢測(cè)所述級(jí)分對(duì)所述P2D或抗氧化 劑基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響。提高所述P2D或抗氧化劑基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的 級(jí)分包含提高階段II解毒酶(P2D)和/或抗氧化劑基因在細(xì)胞中的表達(dá)的化合物。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括選擇提高所述P2D或抗氧化劑基因或報(bào)告物構(gòu) 建體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi)所述級(jí)分，以便生成兩種或更多種亞級(jí)分；提供表達(dá)P2D或 抗氧化劑基因或包含P2D或抗氧化劑基因啟動(dòng)子(例如P2D基因啟動(dòng)子的Nrf2結(jié)合序列) 的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；使所述細(xì)胞與所述亞級(jí)分接觸；并檢測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述P2D或 抗氧化劑基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響，其中提高所述P2D或抗氧化劑基因或報(bào)告物構(gòu) 建體表達(dá)的亞級(jí)分包含提高階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑基因在細(xì)胞中表達(dá)的化合物。 提高P2D或抗氧化劑基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的亞級(jí)分包含提高階段II解毒酶(P2D)和 /或抗氧化劑基因在細(xì)胞中表達(dá)的化合物。任選地，可以重復(fù)這些步驟，直至獲得純化的化 合物，或者使用標(biāo)準(zhǔn)的分開(kāi)-合并(split-pool)方法來(lái)鑒定和獲得純化的化合物。 在一些實(shí)施方案中，該方法還包括將所述純化的化合物配制用于口服或表面施 用。在一些實(shí)施方案中，這些方法中所使用的細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)、或秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中的細(xì)胞(例如ASI細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，所述植物提取物是柳提取物。在一些實(shí)施方案中，所述P2D基因選自下組谷氨酸_半胱氨酸連接酶修飾物亞基 (GCLM)，谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)。還可以使用抗氧化劑基因(例如超氧 化物歧化酶1(S0D1))來(lái)實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括選擇提高所述P2D或抗氧化劑基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi)所述級(jí)分，以便生成兩種或更多種亞級(jí)分；提供表達(dá) F0X01基因或包含F(xiàn)0X01基因啟動(dòng)子的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；使所述細(xì)胞與所述亞級(jí)分接 觸；檢測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響；并選擇提高所述F0X01 基因或報(bào)告物構(gòu)建體的表達(dá)的亞級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括選擇提高所述P2D或抗氧化劑基因或報(bào)告物 構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi)所述級(jí)分，以便生成兩種或更多種亞級(jí)分；使細(xì)胞與所述 亞級(jí)分接觸；檢測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述細(xì)胞中的8-羥基-2’ -脫氧鳥(niǎo)苷(8-0HdG)水平的影 響；并選擇降低所述細(xì)胞中的8-0HdG水平的亞級(jí)分。在又一方面，本發(fā)明提供了鑒定提高叉頭框01 (F0X01)基因在細(xì)胞中表達(dá)的化合 物的方法。該方法包括提供表達(dá)(i)F0X01基因或(ii)包含F(xiàn)0X01基因啟動(dòng)子的報(bào)告物構(gòu) 建體的細(xì)胞；提供植物提取物的級(jí)分；使所述細(xì)胞與所述級(jí)分接觸；并檢測(cè)所述級(jí)分對(duì)所 述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響。提高所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí) 分包含提高F0X01在細(xì)胞中表達(dá)的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括選擇提高所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建 體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi)所述級(jí)分，以便生成兩種或更多種亞級(jí)分；提供表達(dá)F0X01基 因或包含F(xiàn)0X01基因啟動(dòng)子的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；使所述細(xì)胞與所述亞級(jí)分接觸；并檢 測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響。提高所述F0X01基因或報(bào)告 物構(gòu)建體表達(dá)的亞級(jí)分包含提高F0X01在細(xì)胞中表達(dá)的化合物?？梢灾貜?fù)這些步驟，直至 獲得純化的化合物，或者可以使用其它方法來(lái)鑒定純化的活性化合物，例如分開(kāi)_合并方 法。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將所述級(jí)分或純化的化合物配制用于口 服或表面施用。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、成纖維細(xì) 胞、或秀麗隱桿線蟲(chóng)中的細(xì)胞，例如ASI細(xì)胞。本文還提供了提高細(xì)胞中的階段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化劑酶基因增強(qiáng)活 性的方法，其通過(guò)對(duì)所述細(xì)胞施用有效量的植物提取物(例如柳提取物)或其活性級(jí)分來(lái) 進(jìn)行。此外，本發(fā)明提供了提高細(xì)胞中的階段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化劑酶基因增 強(qiáng)活性的方法，其通過(guò)對(duì)所述細(xì)胞施用有效量的包含植物提取物(例如柳提取物)或其活 性級(jí)分的組合物來(lái)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，提取物或活性級(jí)分降低或阻止對(duì)細(xì)胞的氧化損害。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在活的哺乳動(dòng)物中，并且所述提取物降低所述哺乳 動(dòng)物組織中的氧化損害。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是皮膚細(xì)胞，并且所述提取物降低對(duì) 所述哺乳動(dòng)物皮膚的氧化損害。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是皮膚細(xì)胞，并且所述提取物降低源自于暴露于紫 外放射的所述哺乳動(dòng)物皮膚中的色素沉著。在一些實(shí)施方案中，在暴露于紫外放射前將所述植物提取物應(yīng)用至所述哺乳動(dòng)物 的皮膚。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將通過(guò)本文所描述的方法鑒定的提取物或純化的化合物配制用于口服或表面施用。還包括化合物和配制的化合物。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通 技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。本文中描述了在本發(fā)明中使用的方法和材料；也可 以使用本領(lǐng)域中已知的其它合適的方法和材料。材料、方法、和實(shí)施例僅是例示性的，而且 并不意圖是限制性的。通過(guò)提及而完整收錄本文所提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、序 列、數(shù)據(jù)庫(kù)條目、和其它參考文獻(xiàn)。在矛盾的情況中，應(yīng)以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。從以下詳細(xì)的描述和附圖及權(quán)利要求書(shū)出發(fā)，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)會(huì)是顯而 易見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述

圖1的圖形顯示了由綠茶提取物誘導(dǎo)的GFP表達(dá)。圖2的圖形顯示了由柳提取物誘導(dǎo)的GFP表達(dá)。圖3的圖形顯示了由萊菔硫烷(sulforaphane)誘導(dǎo)的GFP表達(dá)。圖4是薄層層析譜的再現(xiàn)，其顯示了如實(shí)施例4中所描述的那樣生成的9種級(jí)分 之每種的分開(kāi)，其中表格描述了各級(jí)分的物理特征和活性。圖5是一組9幅照片，其顯示了如實(shí)施例4中所描述的分級(jí)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖6和圖7是柱形圖，其顯示了不同濃度(10、50、或100 y g/ml)的分級(jí)柳級(jí)分對(duì) Nrf2下游基因表達(dá)的影響。使用用SYBR Green進(jìn)行的RT-PCR來(lái)檢測(cè)谷氨酸-半胱氨酸 連接酶修飾物亞基(GCLM，圖6)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC，圖7)的表達(dá)。圖8是一幅線圖，其顯示了柳提取物補(bǔ)充對(duì)S0D1表達(dá)的影響。圖9是一幅線圖，其顯示了柳提取物補(bǔ)充對(duì)Nrf2表達(dá)的影響。圖10是一幅線圖，其顯示了柳提取物補(bǔ)充對(duì)GCLM表達(dá)的影響。圖11是一幅線圖，其顯示了柳提取物補(bǔ)充對(duì)過(guò)氧化氫酶表達(dá)的影響。圖12是一幅線圖，其顯示了柳提取物補(bǔ)充對(duì)血清8-羥基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(8-0HdG) 轉(zhuǎn)化的影響。圖13是一幅線圖，其顯示了柳提取物補(bǔ)充對(duì)血清GSH轉(zhuǎn)化的影響。圖14是一幅線圖，其顯示了柳提取物補(bǔ)充對(duì)血清SOD轉(zhuǎn)化的影響。圖15是一幅線圖，其顯示了柳提取補(bǔ)充對(duì)叉頭框01 (F0X01)表達(dá)的影響。圖16是薄層層析譜的復(fù)現(xiàn)，其顯示了如實(shí)施例4中所描述的那樣生成和如實(shí)施例 6中所描述的那樣合并的5種級(jí)分之每種的分開(kāi)，其中表格描述了各級(jí)分的物理特征和活 性。圖17是一幅柱形圖，其顯示了分級(jí)的柳提取物誘導(dǎo)階段II響應(yīng)(GCS-1: :GFP表 達(dá))。將指定數(shù)目的動(dòng)物暴露于柳制備物的不同級(jí)分。使用10mg/ml每種材料(除級(jí)分 A(5ug/ml)外)來(lái)實(shí)施溫育。使用M9作為所有樣品(除那些含有級(jí)分A的樣品外，對(duì)此 DMS0為對(duì)照)的對(duì)照。誤差工形線對(duì)應(yīng)于多個(gè)個(gè)體實(shí)驗(yàn)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖18是一幅線圖，其顯示了柳提取物(10mg/ml)、綠茶提取物(2 y g/ml)或柳級(jí)分 A(5ug/mL)保護(hù)N2蟲(chóng)免于氧化應(yīng)激。顯示了代表性實(shí)驗(yàn)，其中誤差工形線指明標(biāo)準(zhǔn)偏差。 在平板上進(jìn)行48小時(shí)(參見(jiàn)文本)。圖19是一幅柱形圖，其顯示了胡蘿卜和花椰菜粉末誘導(dǎo)階段II響應(yīng)(GCS-1: :GFP 表達(dá))。將指定數(shù)目的動(dòng)物暴露于胡蘿卜或花椰菜制備物，除在右側(cè)標(biāo)示的對(duì)照樣品外。顯示了代表性的實(shí)驗(yàn)。圖20A-B是柱形圖，其顯示了柳提取物對(duì)兩種正是其表達(dá)由Nrfl調(diào)節(jié)的基因，即 H0-1 (20A)和 NQ01(20B)的影響。圖21是一幅柱形圖，其顯示了 10ug/ml和100ug/ml柳提取物對(duì)人PBMC中的NRF2 基因表達(dá)的影響。圖22是一幅柱形圖，其顯示了 10ug/ml和100ug/ml柳提取物對(duì)人PBMC中的NRF2 蛋白水平的影響。圖23是一幅柱形圖，其顯示了 1柳提取物對(duì)表達(dá)抗氧化劑應(yīng)激水平的影響。圖24是一幅線圖，其顯示了 口服柳提取物對(duì)人受試者中的TBARS的影響。圖25是一幅柱形圖，其顯示了 口服的柳提取物對(duì)安慰劑對(duì)人皮膚中的抗氧化劑 響應(yīng)的效果，其通過(guò)暴露于UV的皮膚的灰度值均值測(cè)量。圖26是一幅柱形圖，其顯示了表面施用的柳提取物對(duì)安慰劑對(duì)人皮膚中的抗氧 化劑響應(yīng)的影響，其通過(guò)暴露于UV的皮膚的灰度值均值測(cè)量。發(fā)明詳述本文描述了可以用于增強(qiáng)Nrf2活性，并且如此激活階段II解毒系統(tǒng)，降低8-羥 基_2’ -脫氧鳥(niǎo)苷(8-0HdG，氧化受損的DNA的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物)水平，和/或降低叉頭框 01 (F0X01)基因表達(dá)水平的方法和組合物，以及用于鑒定柳和茶中存在的也增強(qiáng)Nrf2，降 低8-0HdG水平，和提高F0X01基因表達(dá)水平的別的化合物的方法。Nrf2Nrf2 (即一種轉(zhuǎn)錄因子)是哺乳動(dòng)物中氧化應(yīng)激響應(yīng)的一種關(guān)鍵因子。Nrf2受到 Keapl、GSK-3、和其它機(jī)制阻抑；此阻抑在存在氧化應(yīng)激的情況中被消除，在該點(diǎn)Nrf2從細(xì) 胞質(zhì)輸入細(xì)胞核中，在那里它結(jié)合階段II解毒酶(P2D)基因的抗氧化劑應(yīng)答區(qū)。Nrf2的 結(jié)合激活P2D基因的轉(zhuǎn)錄，由此誘導(dǎo)P2D酶的表達(dá)。如此，在細(xì)胞核輸入和NRF2對(duì)Nrf2基 因的結(jié)合受到促進(jìn)時(shí)，P2D酶的生成受到增強(qiáng)，而且體內(nèi)抗氧化劑能力受到加強(qiáng)。Nrf2基因 敲除小鼠趨于受到藥物毒素和癌癥的極端影響，而且不響應(yīng)化學(xué)防御方法中所使用的抗氧 化劑(Chan and Kan，1999，Proc. Natl. Acad. Sci.，96，12731-12736 ；Chan 等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci.，98，4611-4616 ；Fahey 等，2002，Proc. Natl. Acad. Sci.，99，7610-7615 ； Ramos-Gomez 等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci.，98，3410-3415)。秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)(即一類線蟲(chóng))與哺乳動(dòng)物具有類似的 氧化應(yīng)激響應(yīng)系統(tǒng)。此系統(tǒng)稱為MAPK級(jí)聯(lián)。SKN-1 (即MAPK級(jí)聯(lián)的一種靶物)是一種轉(zhuǎn)錄 因子。與Nrf2 —樣，SKN-1的GSK-3阻抑在存在氧化應(yīng)激的情況中被解除。然后SKN-1從 細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核中(例如在消化系統(tǒng)(腸)中)，結(jié)合P2D基因的抗氧化劑應(yīng)答區(qū)，并 且激活P2D基因的轉(zhuǎn)錄，由此誘導(dǎo)P2D酶的表達(dá)。如此，線蟲(chóng)的SKN-1通過(guò)與哺乳動(dòng)物中的 Nrf2機(jī)制非常類似的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)P2D酶的生成。假設(shè)于此，預(yù)期促進(jìn)SKN-1的細(xì)胞核輸入 和階段II解毒酶基因?qū)寡趸瘎?yīng)答區(qū)的結(jié)合，由此增強(qiáng)階段II解毒酶在秀麗隱桿線蟲(chóng) 中生成的物質(zhì)能增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中由Nrf2引起的階段II解毒酶生成。此外，還可以預(yù)期對(duì) 癌癥和各種變性疾病的阻抑。為了證實(shí)由SKN-1引起的P2D基因表達(dá)，已知的方法使用如下基因，其中可以將 編碼谷氨酰半胱氨酸合成酶的gcs-1基因(秀麗隱桿線蟲(chóng)中的一種已知P2D基因)和SKN-1的結(jié)合靶物與編碼報(bào)告物(例如綠色熒光蛋白(GFP))的基因融合(GCS-1::GFP) (An 禾口 Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882—1893 ；An 等，2005，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，102，16275-16280 ；Inoue 等，2005，Genes Dev.，19，2278-2283)。在此方法中，首先 將融合的GCS-1: :GFP基因轉(zhuǎn)移至線蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在具有低氧化應(yīng)激的正常條件下，可以通 過(guò)自GFP的熒光發(fā)射來(lái)確認(rèn)融合基因在秀麗隱桿線蟲(chóng)的咽和ASI中的表達(dá)。在氧化應(yīng)激條 件下，此融合基因在秀麗隱桿線蟲(chóng)的腸中表達(dá)。如本文中所描述的，SKN-1活化物質(zhì)(例如 柳提取物和荼提取物)強(qiáng)烈地引起GCS-1: :GFP融合基因的表達(dá)。F0X01F0X0蛋白是受到胰島素相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)抑制，并且牽涉許多生物學(xué)過(guò)程(包括干 細(xì)胞維持、脂肪分化、胰島素敏感性、通過(guò)提高抗氧化劑酶基因增強(qiáng)活性實(shí)現(xiàn)的針對(duì)反應(yīng)性 氧類別(R0S)的防御、凋亡、腫瘤抑制、和壽命)的轉(zhuǎn)錄因子家族。它們公知的靶基因中有 許多是應(yīng)激應(yīng)答基因，包括SOD。參見(jiàn)例如Antebi，PLOS genetics 3，1565-1571 (2007)； Tothova 和 Gilliland，CellStem Cell 1，140-152 (2007)；及 Accili 和 Arden，Cell 117， 421-476(2004)。柳提取物在本文所描述的方法中使用的柳是楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)或楊 屬(Populus)中的植物。楊屬中的植物的例子包括“Ura j irohako yanagi ”(同義詞 “Hakuyo”，“Gindoro” ；銀白楊(P. alba))、加拿大白楊(加楊(P. x Canadensis))、三葉楊 (cottonwood)(美洲黑楊(P. deltoides))(同義詞 “Hiroha hakoyanagi”)、“Kotokake yanagi"(古月 (P. euphratica)) >"Oobayamanarashi" ( € 白■ (P. tomentosa)) > "Chirimendoro，，(香楊(P. koreana))、“Doronoki，，(遼楊(P. maximowiczii))、“Yoroppa kuroyamanarashi"((P. nigra)) >"Seiyohakoyanagi"(IsJ^CW"Italia yamanarashi"； 鉆天楊(P. nigra var. italica))、"Yamanarashi，，(同義詞"Hakoyanagi，，，"Popura，，；西 氏楊(P. sieboldii))、香月旨白楊(Balsam Poplar)(香月旨白楊(P. tacamahaca))、‘‘Shina yamanarashi">"Chosenyamanarashi( |JL||^ (P. davidiana))(American Poplar) (美洲山楊(P. tremu 1 o i des))、和歐美楊(P. eurameri cana)。柳屬中的植物的例子包括 白柳(S. alba) >"Saikoku kitsune yanagi，，(S. alopochroa)、‘‘Yusuraba yanagi，，(耳 柳(S. aurita)),"Shidare yanagi，，(同義詞"Ito yanagi，，，垂柳(S. babylonica))、 "Yamaneko yanagi，，(同義詞"Bakko yanagi，，，S. bakko)、"Akame yanagi，，(同義詞 "Maruba yanagi，，，腺柳(S. chaenomeloides))、‘‘Koganeshidare，，(S. chrysochoma)、瑞 ^ (S.daphnoides) >"Salikkusu elaeagunosu" (S. elaeagnos 'Scopoli' )>"Pokkiri yanagi，，(爆竹柳(S. fragilis)) ."Ookitsune yanagi，，(同義詞 ‘‘Kinme yanagi，，， S. futura)、“Kawayanagi，，(同義詞"Nagaba kawa yanagi，，，吉爾吉柳(S. gilgiana))、“Neko yanagi，，(細(xì)柱柳(S. gracilistyla))、“Kuro yanagi，，(黑穗細(xì)柱柳(S. gracilistyla var. melanostachys))、“ Sause，，(S. humboldtiana)、“ Inukori yanagi，，(杞 柳 (S. integra))>“Shiba yanagi” (S. japonica)>"Shiro yanagi” (S. jessoensis)> "Kinu yanagi" (S. kinuyanagi) >"Kori yanagi，，(尖葉紫柳(S. koriyanagi))、"Ezo yanagi，，(粉枝柳(S. rorida))、“Furisode yanagi，，(銀芽柳((S. leucopithecia))、 "Unryu yanagi，，(龍爪柳(S. matsudana f. tortuosa)) >"Takaneiwa yanagi，，(同義詞"Rengeiwa yanagi，，)、“0oshidare yanagi，，(青皮垂柳(S. ohsidare))、“Ezomame yanagi" (S.nummularia ssp. Pauciflora) >"Ezonokinu yanagi" (S. pet-susu)> tE
(S. purpurea)、“Kouhiryu，，、“Miyamayanagi，，(同 % W "Mineyanagi S. reinii)> "Komaiwa yanagi，，(S. rupifraga) >"0noe yanagi，，(同義詞"Karafuto yanagi，，，龍江 柳(S. sachalinensis))、"Kogomeyanagi，，(S. serissaefolia)、"Shirai yanagi，，(S. shiraii)、柳(Salix sp)、"Tachiyanagi，，(S. subfragilis)、"Noyanagi，，(同義詞 "Himeyanagi，，)、"Seiyotachiyanagi，，、"Kitsune yanagi，，(同 義 詞 ‘‘Iwayanagi，，， S. vulpine)、和"Ezonotakaneyanagi” (S. yezoalpina)。柳的芽、葉、果實(shí)、枝、樹(shù)干、樹(shù)皮、 和/或根可以單獨(dú)或以其任意組合使用，并在必要時(shí)加工成適合于攝取的形式。優(yōu)選的柳 是白柳，特別優(yōu)選瑞香柳、柳、紅皮柳、爆竹柳、和白柳。在一些實(shí)施方案中，柳是白柳、瑞香 柳、紅皮柳或爆竹柳。優(yōu)選地，在上述柳在必要時(shí)進(jìn)行適合于提取的處理(例如切碎、干燥、和/或粉碎) 后提取本發(fā)明的柳提取物。通常使用提取劑在必要時(shí)通過(guò)例如靜置(standing)、搖動(dòng)、照射 超聲(irradiating ultrasound)、加熱、和/或應(yīng)用壓力(獨(dú)立地或以其任意組合)來(lái)提取 如上文所提及的經(jīng)處理的柳。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的規(guī)程是在提取劑中浸沒(méi)柳，接著搖 動(dòng)或攪拌。在一些實(shí)施方案中，對(duì)柳提取物進(jìn)行分級(jí)，如本文中所描述的，并在本文中所描 述的組合物中使用具有最高活性的級(jí)分。水性和有機(jī)溶劑通常作為提取劑使用，并且可以單獨(dú)地或以其組合使用。有機(jī)溶 劑的例子包括乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇等低級(jí)醇、聚乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、二丙二醇 等多元醇；乙酸乙酯、乙酸丁酯和類似的酯；丙酮、甲基乙基甲酮等酮；和C02及類似的超臨 界流體。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的提取劑包括水、乙醇和其混合物。在一些實(shí)施方案中， 水作為提取劑使用。還可以改變實(shí)施這些操作所處的溫度。提取溫度通常自3°C至所使用提取劑的沸 點(diǎn)。提取時(shí)間隨著例如提取劑的種類、提取溫度、和/或柳的形式而變化，但是通常自1小 時(shí)至7天，且優(yōu)選自2小時(shí)至3天?？梢詰?yīng)用壓力，若需要的話。在一些實(shí)施方案中，使用 沸水來(lái)制備柳提取物?？梢栽诒疚乃枋龅慕M合物和方法中使用沒(méi)有修飾的提取物。提取物也可以以溶 解于例如水或有機(jī)溶劑中的形式使用，例如在濃縮、脫水(desiccate)、干燥(exsiccate)、 和/或冷凍干燥后；在以不損害提取物效果的程度進(jìn)行純化處理諸如脫色、除臭、和/或脫 鹽后；和/或在進(jìn)行級(jí)分處理(例如液液分配層析和柱層析)后?；蛘撸崛∥锟梢园?在合適的載體(例如脂質(zhì)體或微膠囊)中。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定級(jí)分的保留因素(retention factor，Rf)，并選擇具有高 于0. 5，例如高于0. 6,0. 7,0. 75、或0. 78的Rf值的級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，本方法中有 用的級(jí)分不含顯著量的水楊苷。茶提取物本文中所描述的方法和組合物中使用的茶可以包括例如綠茶、烏龍茶(Oolong tea)、紅茶、或普洱茶(Pu-erh tea)(它們均衍生自茶(Camelliasinensis))。可以使用植 物的任何部分，例如花、葉、和/或枝(單獨(dú)地或以其任意組合)，并在必要時(shí)加工成適合于 攝取的形式。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)使用葉。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的茶是綠茶。
—般在茶在必要時(shí)進(jìn)行適合于提取的處理(例如切碎、干燥、和/或粉碎)后制備 本文中所描述的茶提取物。然后通常使經(jīng)處理的茶與提取劑接觸，并通過(guò)例如靜置、搖動(dòng)、 照射超聲、加熱、和/或應(yīng)用壓力(獨(dú)立地或以其任意組合)來(lái)提取。在一些實(shí)施方案中， 將茶浸沒(méi)于提取劑中，接著搖動(dòng)或攪拌。水性和有機(jī)溶劑通常作為提取劑使用(單獨(dú)地或以其任意組合)。有機(jī)溶劑的例 子包括但不限于乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇等低級(jí)醇、聚乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、二丙二 醇等多元醇；和C02及其它超臨界流體。它們可以單獨(dú)地或者以其組合使用。優(yōu)選的提取劑 是水和乙醇。在一些實(shí)施方案中，提取劑是約65至85%的含水乙醇，例如水中約70-80% 的乙醇。提取溫度通常自;TC至所使用提取劑的沸點(diǎn)。提取時(shí)間隨著例如提取劑的種類、提 取溫度、和/或柳的形式而變化，但是通常自1小時(shí)至7天，例如自2小時(shí)至3天。可以進(jìn) 一步應(yīng)用壓力，若需要的話。此外，可以在必要時(shí)預(yù)先將抗氧化物質(zhì)諸如抗壞血酸添加至提 取物，用于活性成分的穩(wěn)定提取。在一些實(shí)施方案中，對(duì)茶提取物進(jìn)行分級(jí)，如本文中所描述的，并在本文中所描述 的組合物中使用具有最高活性的級(jí)分?？梢栽诒疚乃枋龅慕M合物和方法中使用沒(méi)有修飾的提取物。提取物也可以以溶 解于水、有機(jī)溶劑等中的形式使用，例如在濃縮、脫水、干燥、或冷凍干燥后；在以不損害提 取物效果的程度進(jìn)行純化處理，例如脫色、除臭、或脫鹽后；和/或在進(jìn)行級(jí)分處理諸如液 液分配層析和柱層析后?；蛘撸杼崛∥锟梢砸园诤线m的載體(例如微膠囊或脂質(zhì)體) 中的形式使用?；ㄒ朔勰┍疚闹兴枋龅姆椒ㄖ惺褂玫幕ㄒ耸歉仕{(lán)(Brassica oleracea)屬中的甘藍(lán) (Cabbage)科，即十字花科(Brassicaceae)(以前為Cruciferae)植物?；ㄒ说幕ā⒀?、莖、 和葉可以單獨(dú)地或者以其任意組合使用，并且在必要時(shí)加工成適合于內(nèi)部或外部使用的形 式。優(yōu)選地，使用花芽和莖兩者。優(yōu)選地，在上述花椰菜在必要時(shí)進(jìn)行適合于準(zhǔn)備好提取的 處理(例如切碎、干燥、和/或粉碎)后提取花椰菜粉末。然后通常使用提取劑(例如水、 乙醇、或其混合物)在必要時(shí)通過(guò)靜置、搖動(dòng)、照射超聲、加熱、和/或應(yīng)用壓力(獨(dú)立地或 以其任意組合)來(lái)榨取和/或提取如上文所提及的經(jīng)處理的花椰菜。在一些實(shí)施方案中， 優(yōu)選的規(guī)程是榨取大量花椰菜頭狀花序的菜漿。在一些實(shí)施方案中，對(duì)花椰菜提取物進(jìn)行 分級(jí)，如本文中所描述的，并在本文中所描述的組合物中使用具有最高活性的級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，可以在本文所描述的組合物和方法中使用沒(méi)有修飾的提取 物。提取物也可以以溶解于例如水或有機(jī)溶劑中的形式使用，例如在濃縮、脫水、干燥、和 /或冷凍干燥后；在以不損害提取物效果的程度進(jìn)行純化處理諸如脫色、除臭、和/或脫鹽 后；和/或在進(jìn)行級(jí)分處理(例如液液分配層析和柱層析)后。胡蘿卜粉末本文中所描述的方法中使用的胡蘿卜是野胡蘿卜(Daucus carota)屬中的植物。 胡蘿卜的根、葉、和莖可以單獨(dú)地或者以其任意組合使用，并且在必要時(shí)加工成適合于內(nèi)部 或外部使用的形式。優(yōu)選地，使用根。優(yōu)選地，在上述胡蘿卜在必要時(shí)進(jìn)行適合于準(zhǔn)備好提 取的處理(例如切碎、干燥、和/或粉碎)后提取胡蘿卜粉末。然后通常使用提取劑(例如水、乙醇、或其混合物)在必要時(shí)通過(guò)例如靜置、搖動(dòng)、照射超聲、加熱、和/或應(yīng)用壓力(獨(dú) 立地或以其任意組合)來(lái)榨取和/或提取如上文所提及的經(jīng)處理的胡蘿卜。在一些實(shí)施方 案中，優(yōu)選的規(guī)程是榨取胡蘿卜的根泥。在一些實(shí)施方案中，對(duì)胡蘿卜提取物進(jìn)行分級(jí)，如 本文中所描述的，并在本文中所描述的組合物中使用具有最高活性的級(jí)分?？梢栽诒疚乃枋龅慕M合物和方法中使用沒(méi)有修飾的提取物。提取物也可以以溶 解于例如水或有機(jī)溶劑中的形式使用，例如在濃縮、脫水、干燥、和/或冷凍干燥后；在以不 損害提取物效果的程度進(jìn)行純化處理諸如脫色、除臭、和/或脫鹽后；和/或在進(jìn)行級(jí)分處 理(例如液液分配層析和柱層析)后。組合物本文中所描述的組合物可以包含一種或多種植物提取物(例如胡蘿卜、花椰菜、 柳、和/或茶提取物)和/或自其衍生的活性級(jí)分或藥劑，其通常占約0. 0001至95% (按 重量計(jì))，優(yōu)選0.001至70% (按重量計(jì))，且最優(yōu)選0.01至30% (按重量計(jì))。在一些實(shí) 施方案中，有用的組合物包含如下文實(shí)施例4中所描述的那樣制備的柳提取物的一些或所 有更具活性的級(jí)分，例如級(jí)分1+2或級(jí)分1+2+3。此外，本文中所描述的組合物可以含有在 例如化妝品、醫(yī)學(xué)、或食品領(lǐng)域中可用的添加劑，只要化合物的活性沒(méi)有受到顯著不利的影 響。供口服用的藥物組合物一方面，本發(fā)明包括包含如本文中所描述的提取物和活性級(jí)分的藥物組合物。在 一種或多種植物提取物和/或自其衍生的活性級(jí)分或藥劑外，本文中所描述的組合物可 以進(jìn)一步含有口服可接受載體、添加劑等。組合物可以以多種形式使用，例如適合于口服 攝取的形式，例如液體制劑；片劑、粒劑、細(xì)微粒劑、粉末等固體制劑；含有所述液體或固體 制劑的膠囊；口服噴霧劑；和錠劑?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)生成這些形式的制劑。優(yōu)選地， 制劑處于丸劑(特別是片劑)、膠囊、小粒(parvule)、粉劑、或粒劑，更優(yōu)選丸劑或膠囊的 形式。藥學(xué)制劑領(lǐng)域中使用的口服可接受添加劑和載體也可以包含在組合物中。下文給 出了例子，但不限于此。賦形劑包括例如糖醇(例如麥芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、或赤藻 糖醇)、乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、淀粉、碳酸鹽(例如碳酸鈣)、高嶺土、結(jié)晶纖維素、 硅酸、甲基纖維素、甘油、精氨酸鈉、阿拉伯膠、滑石、磷酸鹽(例如二代磷酸鈣(calcium secondaryphosphate)、磷酸二氫鈣、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈣、或 磷酸二氫鈉)、硫酸鈣、乳酸鈣、或可可脂。粘度控制劑包括例如單糖漿(simple syrup), 葡萄糖液體、淀粉液體、和明膠溶液。粘合劑包括例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷 酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosspolyvinylpyrrolidone)、羥丙基纖維素、低取代羥基丙基 纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧基乙烯基聚合物(carboxyvinyl polymer), 結(jié)晶纖維素、粉狀纖維素、結(jié)晶纖維素-羧甲基纖維素鈉(carmellose sodium)、羧甲基纖 維素、紫膠、甲基纖維素、乙基纖維素、磷酸鉀、粉狀阿拉伯膠、支鏈淀粉(pullulan)、果膠、 糊精、玉米淀粉、a-淀粉、羥丙基淀粉、明膠、黃原膠、角叉藻聚糖、黃蓍膠、粉狀黃蓍膠、和 Macrogoal.崩解劑包括例如干淀粉、精氨酸鈉、瓊脂粉末、海帶多糖(laminaran)粉末、碳 酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸甘油一酯、淀粉、和 乳糖。崩解抑制劑包括例如白糖、硬脂酸、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑諸如季銨鹽和十二 烷基硫酸鈉。吸附劑包括例如淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤(rùn)土、和膠體硅酸。滑潤(rùn)劑包括例如精制滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉末、和聚乙二醇。乳化劑包括例如蔗糖脂肪酯、山梨聚糖脂肪酯、 經(jīng)酶處理的卵磷脂、酶解卵磷脂、和皂苷。抗氧化劑包括例如抗壞血酸和生育酚?？寡趸瘎?包括例如乳酸、檸檬酸、葡糖酸、和谷氨酸。增強(qiáng)劑包括例如維生素、氨基酸、乳酸鹽、檸檬 酸鹽、和葡糖酸鹽。增塑劑包括例如二氧化硅。增甜劑包括例如半乳蔗糖、乙?；前匪徕?(acesulphame potassium)、阿司巾白坦(aspartame)、禾口甘草阜昔(glycyrrhizin)。芳香劑包 括例如薄荷油、桉葉油、肉桂油、小茴香油、丁香油、橙油、檸檬油、玫瑰油、果實(shí)香料(fruit flavor)、薄荷香料(mintflavor)、薄荷粉、dl_薄荷醇、和1_薄荷醇。寡糖包括例如乳果 糖、棉子糖、和乳果糖(lactosucrose)。制劑溶劑包括例如乙酸鈉。此外，可以用如制備例如糖包被的片劑、明膠薄膜包被的片劑、腸溶性包被片劑、 薄膜包被片劑、雙層片劑、或多層片劑所必需的典型涂層來(lái)包被固體制劑諸如片劑。液體制 劑可以處于基于水或基于油的懸浮液、溶液、糖漿、或酏劑形式，而且可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法使 用例如如本領(lǐng)域中所知道的和/或本文中所描述的典型載體和/或添加劑來(lái)制備。供口服用的保健用組合物本發(fā)明中還包括包含與例如可食用載體、食品成分、或食品添加劑組合的一種或 多種植物提取物和/或自其衍生的活性級(jí)分或藥劑的保健用組合物。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的 方法來(lái)制備此類組合物。此類保健食品的例子包括液體食品諸如飲料，和固體食品諸如條 形物(bar)、蛋糕、片劑、粒劑、可咀嚼片劑?；蛘?，它們可以是半固體，例如酸乳酪或酸乳酪 樣稠度。此類食品形式的具體例子包括但不限于液體飲料諸如汁(juice)、軟飲料、和茶； 粉狀飲料諸如粉狀汁或粉狀湯；零食諸如巧克力、糖果、口香糖、冰淇淋、果子凍(jelly)、 餅干(cookies)、軟餅(biscuit)、玉米片(corn f lake)、可咀嚼片劑、薄膜片(filmsheet)、 薄餅(wafer)、軟糖(gummies)、脆米餅(rice cracker)、和具有豆醬填充物的小圓面 包；調(diào)味品(seasoning)諸如敷料劑(dressing)、醬油(sauce)等；面包、面團(tuán)(pasta)、 konjakmannans、魚(yú)醫(yī)(fish paste)(例如魚(yú)魔(kamaboko))、曬干的噴撒物(seasoned sprinkle)、口服噴霧劑、和錠劑。保健食品還可以包括本領(lǐng)域中已知的各種添加劑和載體。例如，活的微生物諸如 乳酸細(xì)菌、滅活的微生物、其它益生菌(probiotics)、維生素、植物學(xué)藥物、其它植物諸如全 草及其提取物可以作為添加劑使用。載體的例子包括糖醇、賦形劑、粘合劑、乳化劑、抗氧化 劑、酸化劑、增強(qiáng)劑、抗結(jié)團(tuán)劑、潤(rùn)滑劑、增甜劑和調(diào)味品(flavoring)?？梢允褂帽＝∮媒M合物作為例如健康食品、功能食品、指定的健康食品、營(yíng)養(yǎng)功能 食品、或用于治療受試者中的狀況(例如疾病或衰老癥狀)的食品?？谇蛔o(hù)理產(chǎn)品可以在供口腔護(hù)理諸如牙膏、牙粉、液體潔齒劑(dentifrice)、凝膠潔齒劑、預(yù)防 膏、口腔噴霧劑、和漱口劑用的組合物中使用本文中所描述的植物提取物和其活性級(jí)分。用 于制備此類組合物和合適的載體和添加劑的方法是本領(lǐng)域中已知的。供表面施用用的組合物在一種或多種植物提取物和/或自其衍生的活性級(jí)分或藥劑外，本文中所描述的 組合物可以進(jìn)一步含有外部可接受載體、添加劑等。組合物可以以多種適合于向皮膚應(yīng)用 的形式使用，例如水溶液、溶解性表面組合物、粉末分散體、水油2層組合物、水油粉末3層 組合物、油/水乳劑、水/油乳劑、水/油/水乳劑、凝膠、氣溶膠、噴霧(mist)、膠囊、片劑、粒劑和粉末。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)生成這些形式的制劑。優(yōu)選地，制劑處于水溶液、油/水 乳劑、水/油乳劑、水/油/水乳劑、凝膠、氣溶膠、或噴霧形式。藥學(xué)或化妝品制劑領(lǐng)域中使 用的外部可接受添加劑和載體也可以包含在組合物中。下文給出了例子，但不限于此。賦形 劑包括例如陰離子表面活性劑(例如烷基硫酸鹽、聚氧乙烯烷基醚、烷基丙氨酸鹽、烷基谷 氨酸鹽、烷基羥乙基磺酸鹽、烷基肌氨酸鹽或脂肪酸鹽(soap))、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性表 面活性劑(例如烷基甜菜堿、氨基丙基甜菜堿、或咪唑啉甜菜堿)、非離子表面活性劑(例如 聚氧乙烯氫化蓖麻油、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基酯、 嵌段共聚物、脂肪酸酯、烷基甘油醚、卵磷脂、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、皂苷、糖酯、 或烷醇酰胺)、油性物質(zhì)(例如礦物油、角鯊?fù)椤⒀蛎?、軟石臘(petrolatum)、植物油、動(dòng) 物油、地蠟(ceresin)、脂肪酸酯、或高級(jí)醇)、多元醇(例如丙二醇、1，3_ 丁二醇、甘油、1， 2-己二醇、戊二醇、或聚氧乙烯二醇)、聚合物(例如聚硅氧烷、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯 酯、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚 乙二醇、支鏈淀粉、果膠、糊精、或黃原膠)、粉末(例如高嶺土、結(jié)晶纖維素、滑石、或膨潤(rùn)土 (bentonite))、有機(jī)酸、和無(wú)機(jī)酸?？梢該饺脒m合于摻入化妝品、準(zhǔn)藥物(quasi-drug)、藥物 等中的其它各種成分(例如環(huán)硅氧烷、聚乙烯醇、蛋白質(zhì)、水解蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、紫外線 吸收劑、防腐劑、PH調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑、維生素、醫(yī)學(xué)有效成分、防腐劑、著色劑、或芳香劑)，只 要由此沒(méi)有對(duì)本發(fā)明的目的強(qiáng)加顯著的有害影響，例如活性成分的活性沒(méi)有顯著的降低。 準(zhǔn)藥物對(duì)身體具有適度影響，但是既不意圖診斷、預(yù)防或治療疾病，也不影響身體的結(jié)構(gòu)或 功能。產(chǎn)品還可以是常規(guī)用于向皮膚外部應(yīng)用的任何類型的，包括例如面部化妝品諸如 護(hù)膚液(lotion)、乳狀乳劑(milky emulsion)、面霜(cream)和美容涂敷劑(pack)；化妝 品諸如粉底、胭脂、唇膏、眼瞼膏、眼線筆和遮光劑(sunscreen)；體用化妝品，例如護(hù)膚液 和面霜；皮膚清潔化妝品諸如卸妝液(make-upremover)、面部洗潔劑和體用洗發(fā)劑；浴用 配制品；和頭發(fā)護(hù)理配制品諸如洗發(fā)劑和潤(rùn)發(fā)乳(conditioner)。有效劑量可以使用本領(lǐng)域中已知的方法(例如基于體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn))來(lái)確定本文中所 描述的組合物的有效劑量。在一些實(shí)施方案中，要在內(nèi)部施用的植物提取物(例如作為口 服組合物)的劑量會(huì)是每天每名成人約50至2000mg，例如約100至lOOOrng。此外，可以在 一天的一個(gè)至數(shù)個(gè)部分中，即在各餐前(例如在5分鐘內(nèi))、在各餐間、在各餐后(例如在5 分鐘內(nèi))、或與各餐一起服用口服組合物。在一些實(shí)施方案中，與各餐一起或者在各餐后服 用口服劑量。在一些實(shí)施方案中，要外部施用的植物提取物(例如在表面配制品諸如面霜 或護(hù)膚液中)的劑量會(huì)占所述配制品的約0.0001至95% (按重量計(jì))，優(yōu)選0.001至70% (按重量計(jì))，且更優(yōu)選0.001至30% (按重量計(jì))。在一些實(shí)施方案中，表面配制品可以 每天應(yīng)用一次或多次。_ 本文中所描述的或由本文中所描述的方法所公開(kāi)的組合物在需要階段II解毒活 性增強(qiáng)的受試者的治療中是有用的。例如，認(rèn)為氧化應(yīng)激可以在變性疾病的病因?qū)W中發(fā)揮 重要的作用，所述變性疾病一般的特征在于組織細(xì)胞的進(jìn)行性形態(tài)學(xué)變化和進(jìn)行性正常 代謝活性喪失。在一些實(shí)施方案中，變性疾病可以以例如患病細(xì)胞或組織中存在的谷胱甘肽、或任何階段II酶的異常水平表征。這些異常水平可以是變性疾病的原因或癥狀。如本 文中所使用的，短語(yǔ)“變性疾病”指以受累組織中不是由于腫瘤生長(zhǎng)或急性毒性損傷引起的 正常細(xì)胞死亡表征的生理學(xué)狀況。變性病癥的例子包括但不限于糖尿病、慢性肝衰竭、慢性 腎衰竭、威爾遜氏病(Wilson’ s disease)、充血性心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、和神經(jīng)變性疾 病，例如帕金森氏病(Parkinson’ s Disease)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’ s Disease)、 亨延頓氏病(Huntington's Disease)、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、癲癇、重癥肌無(wú)力、神 經(jīng)病、共濟(jì)失調(diào)、癡呆、慢性軸突性神經(jīng)病(chronic axonal neuropathy)和中風(fēng)?？梢允?用本文中所描述的處理來(lái)治療患有先存在的變性狀況的受試者，或者預(yù)防或延遲有變性病 癥素因的受試者中的疾病發(fā)作或形成。另外，化合物可用于處理受試者中的衰老對(duì)例如受試者的皮膚的影響。如此，可以 使用本文中所描述的組合物來(lái)治療例如皺紋、不想要的色素沉著、粗糙且干燥的皮膚、或暗 淡的皮膚。篩詵方法茶和柳提取物中存在的化合物是P2D基因的Nrf2/Skn-1激活的增強(qiáng)物的發(fā)現(xiàn)提 供了用于鑒定那些提取物中的活性化合物的方法的基礎(chǔ)?？梢栽谶@些方法中使用許多測(cè)定 法，例如秀麗隱桿線蟲(chóng)中的天然或工程化改造的Skn-1活性，和任何合適的細(xì)胞(例如表 達(dá)Nrf2的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中的報(bào)告基因構(gòu)建體。對(duì)抗氧化劑應(yīng)答元件激活物的基因組篩 選記載于 Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，104 (12) :5205_5210 (2007)。報(bào)告物構(gòu)建 體包含與典型的最小啟動(dòng)子序列以及任何可檢測(cè)報(bào)告元件(例如熒光蛋白諸如綠色熒光 蛋白(GFP)或其變體，例如紅色熒光蛋白(RFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、黃色熒光蛋白(YFP) 或增強(qiáng)型GFP(eGFP)；螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、或0 -半乳糖苷酶)連接的抗 氧化劑應(yīng)答元件。用于設(shè)計(jì)、選擇、和制備此類構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域中公知的，參見(jiàn)例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)?？寡趸瘎?yīng)答元件(ARE)ARE是許多階段II解毒酶的5’側(cè)翼區(qū)中找到的順式作用調(diào)節(jié)增強(qiáng)子元件(核心 共有序列5，-GTGACnnnGC-3' )。ARE受到反應(yīng)性氧類別以及其它親電子劑及受到Nrf2結(jié) 合激活。受ARE調(diào)節(jié)的基因包括P2D血紅素加氧酶-1、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移 酶、和NAD(P)H 醌氧化還原酶1 (NQ01)、谷氨酰半胱氨酸合成酶(例如谷氨酸-半胱氨酸連 接酶修飾物亞基(GCLM)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC))、和過(guò)氧化氫酶、和抗 氧化劑酶超氧化物歧化酶(例如S0D1)。階段II解毒酶有6類階段II偶聯(lián)反應(yīng)，包括葡糖醛酸化(glucuronidation)、硫酸化、甲基化、乙 ?；?、氨基酸偶聯(lián)和谷胱甘肽偶聯(lián)。由酶硫氰酸生成酶催化的反應(yīng)(將硫離子轉(zhuǎn)移至氰化 物以形成硫氰酸鹽)在本文中也會(huì)被認(rèn)為階段II反應(yīng)。參見(jiàn)美國(guó)專利No. 6，812，248，通 過(guò)提及而將其完整收入。在一些實(shí)施方案中，本文中所描述的篩選方法包括在細(xì)胞中檢測(cè) 這些中的一種或多種偶聯(lián)反應(yīng)，并量化此類活性以確定級(jí)分是否包含提高偶聯(lián)反應(yīng)的化合 物。分級(jí)的樣品
—般而言，本文中所描述的方法包括使用提取物的級(jí)分，例如提取物中存在的所 有成分的子集?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)生成此類級(jí)分，并且可以基于提取物 成分的一項(xiàng)或多項(xiàng)物理性質(zhì)(例如大小、pH、pI、溶解度、或電荷)來(lái)制備。用于對(duì)本文中所 描述的提取物分級(jí)的許多方法是本領(lǐng)域中已知的，例如蛋白質(zhì)和肽分級(jí)技術(shù)，包括但不限 于免疫消減(親和力消除)、凝膠電泳、反相層析、凝膠或其它過(guò)濾、離子交換、柱層析(例如 使用硅膠)、等電點(diǎn)聚焦(例如固定化的PH梯度等電點(diǎn)聚焦(IPG IEF))，和通過(guò)pi對(duì)蛋白 質(zhì)或肽分級(jí)的溶液相、基于pi的分級(jí)系統(tǒng)。也可以使用液液分級(jí)或固液分級(jí)方法。參見(jiàn)例如Jin 等，Biotechnol J. 2006 年 2 月；1(2) 209-13 ；Si 等， Bioassay-guided purification and identification of antimicrobial components inChinese green tea extract.J Chromatogr A.2006 ；1125(2) 204-10 ；Paveto 等，Anti-Trypanosoma cruzi activity of green tea(Camel1ia sinensis)catechins. Antimicrob Agents Chemother. 2004 ；48(1) 69-74 ；Kinjo 等， Activity-guidedfractionation of green tea extract with antiproliferative activity against humanstomach cancer cells.Biol Pharm Bui1.2002 ；25 (9) 1238-40 ；Satoh 等’ Black teaextract, thearubigin fraction, counteracts the effect of tetanus toxin in mice. ExpBiol Med(Maywood). 2001 ；226 (6) :577_80 ; Sagesake-MitanePlateletaggregation inhibitors in hot water extract of green tea. Chem Pharm Bull(Tokyo). 1990 ；38 (3) 790-3 Jassbi, Z Naturforsch[C]. 2003 ； 58(7-8) 573~9. Secondary metabolites as stimulants and antifeedants of Salix integra for the leafbeetle Plagiodera versicolora ； 及 ffildermuth 禾口 Fall, Biochemicalcharacterization of stromal and thylakoid-bound isoforms of isoprene synthase inwillow leaves. Plant Physiol. 1998 ；116 (3) :1111_23 等。
實(shí)施例本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步進(jìn)行描述，所述實(shí)施例并不限制權(quán)利要求書(shū)中所描 述的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1-提取物的制備制備多種提取物來(lái)在本實(shí)驗(yàn)中使用，包括綠茶、白柳、松樹(shù)皮、和花椰菜(萊菔硫 烷)提取物。綠茶提取物如下制備綠茶提取物(Thaea Sinensis, Emil Flachsmann AG/Frutarom, Haifa, Israel, Prod. No. 85. 942)，即將綠茶葉浸沒(méi)在如下溶液中，其中將0. 0025%抗壞血酸溶解 于乙醇(80%)中，并于室溫緩慢攪拌4小時(shí)，接著過(guò)濾提取物以除去茶葉。然后使用減壓 濃縮器來(lái)除去提取劑，由此制備綠色/褐色提取物，向該提取物添加糊精作為賦形劑，并使 混合物成粉末以在實(shí)驗(yàn)中使用。制備含有綠茶提取物的2mg/mL DMS0溶液。因?yàn)镈MS0在較高濃度能引起氧化 應(yīng)激，將綠茶提取物添加至M9鹽水培養(yǎng)基(42mM Na2HP04 ；22mMKH2P04 ；86mM NaCl ；ImM MgS04*7H20)以便具有作為測(cè)試材料使用的2 u g/mL的最終濃度。DMS0的終濃度是0. 1 %。 此類低濃度的DMS0在秀麗隱桿線蟲(chóng)中不引起氧化應(yīng)激。
白柳提取物如下制備白柳提取物(Salicis Cortex, Emil Flachsmann AG/Frutarom, Haifa, Israel, Prod. No. 0085816)，即將干燥的商品化白柳樹(shù)皮和芽浸沒(méi)于凈化水中，并于室溫緩 慢攪拌4小時(shí)，接著過(guò)濾提取物以除去固體物質(zhì)。然后使用減壓濃縮器來(lái)除去提取劑，由此 制備褐色提取物，向該提取物添加阿拉伯膠作為賦形劑，并使混合物成粉末以在實(shí)驗(yàn)中使用。使用處于10mg/mL濃度的溶解于M9鹽水培養(yǎng)基中的柳提取物作為測(cè)試材料。松樹(shù)皮提取物如下制備松樹(shù)皮提取物來(lái)在實(shí)驗(yàn)中使用，即在熱水中達(dá)3至4小時(shí)自干燥的松樹(shù) 皮提取。將松樹(shù)皮提取物溶解于DMS0中以便具有2mg/mL的濃度，并添加至M9鹽水培養(yǎng)基 以具有作為測(cè)試材料使用的2 u g/mL的終濃度。萊菔硫烷此外，使用萊菔硫烷(花椰菜芽的活性衍生物)作為陽(yáng)性對(duì)照。將萊菔硫烷溶解 于乙腈中，然后用M9鹽水培養(yǎng)基稀釋至lmg/mL以作為測(cè)試材料使用。實(shí)施例2-gcs-l::GFP融合構(gòu)律體的制各和表汰公知的是，由gcs-1基因編碼的酶(CGS-1)，即階段II解毒酶(P2D)是用于體內(nèi)谷 胱甘肽合成的限速酶，而且gcs-1基因是調(diào)節(jié)第二代的解毒和抗氧化的SKN-1的靶基因。使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將編碼GCS-1啟動(dòng)子的核酸(如記載于An和 Blackwell,2003, Genes&Dev.，17，1882-1893的)與編碼綠色熒光蛋白(GFP)的序列融合 以制備報(bào)告物構(gòu)建體(gcs-1: :GFP)。將此融合構(gòu)建體基因轉(zhuǎn)移入秀麗隱桿線蟲(chóng)中(An和 Blackwell,2003, Genes&Dev.，17，1882-1893 ；Mello 等，EMB0 J. 1991. 10(12) :3959_70)， 并在實(shí)驗(yàn)中使用所獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化秀麗隱桿線蟲(chóng)。在正常的、低氧化應(yīng)激條件下，gcs-1 :GFP 構(gòu)建體在秀麗隱桿線蟲(chóng)的咽區(qū)和ASI中表達(dá)，在那里可以測(cè)量GFP的熒光發(fā)射。作為比較，將gcs-1基因啟動(dòng)子中的SKN-1結(jié)合位點(diǎn)的變體(gcs 1 A 2Mut3)(參 見(jiàn)An和Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882-1893)與編碼GFP的序列融合以制備基因 (gcs-1 A 2Mut3 GFP基因)，其以與用gcs-1 GFP基因相同的方式測(cè)試。因?yàn)榇送蛔冃突?因不能與SKN-1結(jié)合，它不能表達(dá)由SKN-1調(diào)節(jié)的GCS-1。因此在GFP在上述融合基因中表 達(dá)，但不在突變型基因中表達(dá)時(shí)確認(rèn)GCS-1表達(dá)的SKN-1調(diào)節(jié)。實(shí)施例3-柳和茶提取物增強(qiáng)GCS-1 :GFP表達(dá)遵循依照An 和 Blackwell，2003，Genes&Dev.，17，1882-1893 的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)研 究實(shí)施例1中所制備的各種提取物對(duì)GCS-1: :GFP報(bào)告物構(gòu)建體(實(shí)施例2中所描述的) 在秀麗隱桿線蟲(chóng)中表達(dá)的影響。每次實(shí)驗(yàn)前，將攜帶GCS-1 :GFP報(bào)告物構(gòu)建體轉(zhuǎn)基因的約20粒L4期蟲(chóng)挑選至含 有0P50細(xì)菌(大腸桿菌菌株；秀麗隱桿線蟲(chóng)的食物)的NGM平板(一類瓊脂培養(yǎng)基，參見(jiàn) Brenner, Genetics, 1974May ；77(1) :71_94)，并容許生長(zhǎng)2至3天。為了用測(cè)試材料進(jìn)行 處理通過(guò)用鹽水培養(yǎng)基(M9)淹沒(méi)NGM平板表面來(lái)將蟲(chóng)與鹽水培養(yǎng)基(M9) —起轉(zhuǎn)移至微離 心管。然后離心微離心管，并除去上清液。再次重復(fù)相同的規(guī)程以清洗蟲(chóng)。此清洗除去已 經(jīng)作為食物給予的細(xì)菌。
一旦蟲(chóng)得到清洗，便添加它們以在規(guī)定濃度的規(guī)定測(cè)試材料中溫育達(dá)如下的時(shí)間 量。首先，溫育時(shí)間是30分鐘，并且隨后意圖包括60、90、和120分鐘。進(jìn)行處理達(dá)所述給 定的時(shí)間后，在M9中清洗蟲(chóng)至少兩次，轉(zhuǎn)移回含有細(xì)菌的NGM平板，并容許恢復(fù)約30分鐘。 然后將蟲(chóng)嵌入(mount)載玻片上，并在顯微鏡下對(duì)GFP表達(dá)水平評(píng)分?；谌蔚梅謥?lái)評(píng) 估每粒蟲(chóng)的腸中的GFP表達(dá)水平；高的、中等的、和低的表達(dá)。對(duì)整條腸具有GFP表達(dá)的蟲(chóng) 給予高得分。腸上半段的GFP表達(dá)評(píng)分為中等的。將低得分給予在其腸中具有非常少或沒(méi) 有GFP表達(dá)的蟲(chóng)。圖1和圖2中所顯示的結(jié)果表明用綠茶提取物或柳提取物進(jìn)行的處理與對(duì)照條件 相比顯著地提高由gcs-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)。柳提取物顯著地增加在表達(dá)方面給予中等或高得分的蟲(chóng)數(shù)目。在這些實(shí)驗(yàn)中，陰 性對(duì)照M9鹽水溶液沒(méi)有在腸中誘導(dǎo)GFP表達(dá)，其中所有蟲(chóng)都被評(píng)分為低的。在60分鐘處 理的情況中看到最大應(yīng)答。然而，用萊菔硫烷在溫育30、60或90分鐘后沒(méi)有看到效果。對(duì) 于此原因，給予用萊菔硫烷進(jìn)行的處理更長(zhǎng)的溫育時(shí)間，并且在6小時(shí)后首次看到效果。圖 3中所顯示的數(shù)據(jù)揭示，茶提取物和柳提取物與萊菔硫烷相比在明顯更短的時(shí)間中顯著誘 導(dǎo) GCS-1::GFP 表達(dá)。使用轉(zhuǎn)移有g(shù)cs-1 A 2: :GFP基因的蟲(chóng)(GCS-1 A 2: :GFP蟲(chóng))來(lái)測(cè)試測(cè)試材料的效 果是否依賴于SKN-1。此啟動(dòng)子突變型轉(zhuǎn)基因缺乏咽gcs-1基因表達(dá)；然而，它在ASI神 經(jīng)元和腸中維持SKN-1依賴性表達(dá)。用綠茶提取物和柳提取物兩者，GCS-1 A2: :GFP蟲(chóng) 在60分鐘溫育的條件下展示出與GCS-1: :GFP蟲(chóng)相同的表達(dá)水平。還使用突變型轉(zhuǎn)基因 GCS-1 A2mut3: :GFP蟲(chóng)來(lái)確定應(yīng)答是否是SKN-1依賴性的。此基因，即gcs_l A2: :GFP基 因的變體(gcs-lA2mut3::GFP基因)在其啟動(dòng)子區(qū)域中缺乏SKN-1結(jié)合位點(diǎn)，因此在正 常和應(yīng)激條件下GFP不在咽、ASI神經(jīng)元、或腸中表達(dá)。在用綠茶或柳提取物處理這些變 體(GCS-1 A2mut3: :GFP蟲(chóng))時(shí)，沒(méi)有觀察到GFP表達(dá)。用測(cè)試材料在CGS-1 :GFP蟲(chóng)、 GCS-1 A2: :GFP蟲(chóng)、和GCS-1 A2mut3: :GFP蟲(chóng)中的結(jié)果的比較揭示，用綠茶提取物和柳提取 物，在ASI神經(jīng)元和腸中看到GCS-1: :GFP表達(dá)，在咽中基本上沒(méi)有看到GCS-1: :GFP表達(dá)， 如此GCS-1: :GFP表達(dá)受到SKN-1結(jié)合調(diào)節(jié)。然而，在萊菔硫烷的情況中，比較顯示在咽中 看到約一半的GCS-1: :GFP表達(dá)，并且GCS-1 GFP表達(dá)并不是部分受到SKN-1調(diào)節(jié)。實(shí)施例4-柳提取物的分級(jí)為了自初始柳提取物鑒定對(duì)階段II激活具有最大影響的級(jí)分，使用柱層析方法。 例如，可以使用硅膠填充柱來(lái)對(duì)柳提取物分級(jí)。圖4和圖5顯示了使用柱層析實(shí)施的分級(jí) 實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。為了制備分離柱，將400g硅膠60 (70-230篩目ASTM，購(gòu)自Merck)在甲醇中懸浮， 并倒入柱中。之后，用氯仿甲醇(10 1)溶液替換甲醇。將5克初始柳提取物在水中重 懸，并在硅膠表面上側(cè)上加樣。作為第一洗脫溶劑，使用約1.5L氯仿甲醇(10 1)來(lái)洗 脫材料。將洗脫的溶液收集入分級(jí)管中，達(dá)每管20mL。液相是氯仿甲醇(10 1)溶液， 接著是上層的氯仿甲醇水(7 3 1)，然后是氯仿甲醇水(6 4 1)，氯仿甲 醇水(5 5 1)，并且最后使用甲醇清洗。然后，通過(guò)薄層層析(TLC)方法來(lái)測(cè)定材料。 使用氯仿甲醇水(6 4 1)溶液來(lái)在TLC板(由Merck提供的TLC板硅膠60F254) 上顯現(xiàn)洗脫的溶液。為了檢測(cè)級(jí)分，將50%硫酸噴灑在TLC板上，然后將其于250度加熱。
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通過(guò)TLC顯現(xiàn)的保留因素(Rf)值來(lái)進(jìn)一步限定最有效的材料。Rf定義為化合物 經(jīng)過(guò)的距離除以溶劑經(jīng)過(guò)的距離。表1中顯示了級(jí)分1-4的Rf值。有效級(jí)分的Rf值位于 0. 5至0. 9。最有效級(jí)分的Rf值為0. 6至0. 9。表1 級(jí)分1-4的Rf 值 也可以通過(guò)其它方法分離具有0.6至0.9的Rf值的級(jí)分。例如，也可以使用反相 顆粒(C2，C8，C18 :C指碳carbon)替代硅膠。在此情況中，可以使用水甲醇或水乙醇 溶液來(lái)洗脫更有效的級(jí)分，并通過(guò)其Rf值確定級(jí)分的身份。也可以使用凝膠層析方法(其通過(guò)分子量分開(kāi)各種類)和離子吸附凝膠層析方法 (其通過(guò)分子的極性分開(kāi))來(lái)分級(jí)。也可以使用液液分級(jí)或固液分級(jí)方法來(lái)替代柱層析。實(shí)施柱層析前，可以使用活化的木炭(例如活化的木炭柱)作為預(yù)處理，以除去顏 色(例如從黑暗的奇特顏色的提取物除去葉綠素)。圖4和圖5顯示了使用柱層析的一次分級(jí)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。柱是固相硅膠60 (70-230 篩目ASTM，購(gòu)自Merck)。液相是氯仿甲醇(10 1)溶液，接著是氯仿甲醇水 (7:3: 1)，然后是氯仿甲醇水(6 4 1)，氯仿甲醇水平(5 5 1)，和最后 的甲醇清洗。如下制備圖5中所顯示的提取物使用氯仿甲醇(10 1)溶液提取提取物 1至3，使用氯仿甲醇水(7 3 1)提取提取物4，使用氯仿甲醇水(6 4 1) 提取提取物5至7，使用氯仿甲醇水(5 5 1)提取提取物8，然后使用甲醇提取提 取物9。然后使用標(biāo)準(zhǔn)的蒸發(fā)器除去溶劑。“外表(aspect)”指目視檢查的級(jí)分外觀。將 0. 05g材料放入5ml水中，并旋渦振蕩。若它在室溫中明顯可溶，則測(cè)量水溶解度；在圖4 中，空心圓圈指明材料是明顯可溶的，而“X”指明不是明顯可溶的(例如存在顆粒物質(zhì))。 使用UV檢測(cè)器觀察UV斑點(diǎn)，并通過(guò)目視檢查測(cè)量UV吸收。還是在圖4中，空心圓圈指明， 觀察到UV斑點(diǎn)，而“X”指明沒(méi)有觀察到斑點(diǎn)。圖4中顯示的百分比按重量計(jì)。若GCLM和 GCLC兩者的基因表達(dá)與對(duì)照相比顯著更高，且相對(duì)值大于4 (在100 y g/ml)，則歸于“高”基 因表達(dá)；若GCLM和GCLC兩者的基因表達(dá)與對(duì)照相比顯著更高，且相對(duì)值小于4(在lOOii g/ ml)，則歸于“中等的”；而“低的”意味著GCLM和GCLC兩者的基因并不顯著高于對(duì)照，且相 對(duì)值小于4(在100iig/ml)。圖6和圖7顯示了評(píng)估分級(jí)的柳提取物對(duì)Nrf2下游基因表達(dá)的影響的結(jié)果。使 人成纖維細(xì)胞與10 u g/ml、50 u g/ml、或100 u g/ml濃度的圖4和圖5中所顯示的9種分級(jí) 柳提取物接觸，并溫育24小時(shí)。使用用SYBR Green進(jìn)行的RT-PCR來(lái)檢測(cè)谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾物亞基(GCLM，圖6)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC，圖7)的 表達(dá)。還評(píng)估PPIA作為內(nèi)部對(duì)照基因。結(jié)果表明級(jí)分1、2、和3含有最高量的NRF2激活活 性。實(shí)施例5-對(duì)人警試者施用柳提取物本實(shí)施例描述了為了在年齡為約26-45歲，且平均年齡為34. 2歲的健康人志愿者 中檢查柳提取物的抗氧化能力而進(jìn)行的小試驗(yàn)。登記16名受試者(7名男性和9名女性)， 試驗(yàn)過(guò)程中放棄3名。對(duì)受試者施用來(lái)自Ask Intercity Co.，Ltd.的柳提取物。如下制備此柳提取物， 即在加熱的情況中將干燥的商品化柳樹(shù)皮和芽浸沒(méi)于凈化水中，其中柳樹(shù)皮和幼嫩的枝是 基于歐洲藥典和德國(guó)藥典(Commission E Monograph)的“白柳樹(shù)皮”。劑量方案是6粒膠囊/天(每天總共800mg柳提取物)達(dá)兩周的一 段時(shí)間(接著是兩周的沖洗(washout)期間)。然后每名受試者經(jīng)歷臨床檢查，包括(i)在使用Ficcoll-Conray梯度自肝素化血液分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC) 中測(cè)量抗氧化劑相關(guān)基因表達(dá)_Nrf2、GCLM、叉頭框01 (F0X01)、S0D1、和過(guò)氧化氫酶。使用 GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照(使用RT-PCR在0、1、2、和4周時(shí)測(cè)量)；(ii)血清抗氧化系數(shù)-8-羥基-2，-脫氧鳥(niǎo)苷(8-0HdG)、GSH、S0D、8_異前列腺素 (isoprostane)、和TRAP的水平(在0、1、2、和4周時(shí)測(cè)量)；(iii)血液生物化學(xué)-總蛋白質(zhì)、GOT、GPT、總膽固醇、HDL-C、LDL-C、甘油三酯、 ALP、清蛋白、A/G比率、Y-GTP、淀粉酶、尿素氮、尿酸、肌酸酐、和動(dòng)脈硬化癥系數(shù)(在0、2、 和4周時(shí)測(cè)量)；(iv)血液血細(xì)胞計(jì)數(shù)-血液葡萄糖、冊(cè)々1(3、18(、1 (、冊(cè)、批、血小板、嗜堿性粒細(xì) 胞、嗜酸性粒細(xì)胞(acidphol)、嗜中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、MCV、MCH、和MCHC (在0、2、 和4周時(shí)測(cè)量)；和(v)其它-胰島素、脂連蛋白、IGF-1和水楊酸(在0、2、和4周時(shí)測(cè)量)。表2中顯示了受試者的概況。表2:受試者概況 圖8-15中顯示了結(jié)果。首先，如圖8和表2中所顯示的，2周的柳提取物補(bǔ)充在 PBMC中誘導(dǎo)S0D1基因表達(dá)。如圖9-11中所顯示的，PBMC中的Nrf2基因表達(dá)在攝取后一 周顯著下降，而下游基因GCLM或過(guò)氧化氫酶在補(bǔ)充期期間都不顯著改變(過(guò)氧化氫酶基因 表達(dá)在第一周攝取期期間略微升高，但在第二周攝取期期間返回至基線，而過(guò)氧化氫酶基 因表達(dá)在剩余期期間降低)。如圖12中所顯示的，用柳提取物進(jìn)行的補(bǔ)充在兩周中顯著降 低血清8-0HdG水平，并且效果在結(jié)束處理后持續(xù)。然而，如圖13和圖14中所顯示的，血清 中的GSH和SOD轉(zhuǎn)化水平貫穿整個(gè)測(cè)試期均沒(méi)有改變。比較而言，如圖15中所顯示的，F(xiàn)0X01 mRNA在用柳提取物補(bǔ)充2周后在PBMC中 顯著升高。F0X01是已知用于調(diào)節(jié)解毒和抗氧化劑基因表達(dá)(包括S0D1)的轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)施例6-疏水件柳提取物提高體內(nèi)GCS-1表汰本實(shí)施例描述了為了調(diào)查柳提取物的某些級(jí)分是否在活的秀麗隱桿線蟲(chóng)中誘導(dǎo) SKN-1/階段II解毒途徑而實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。如上文所描述的那樣制備柳提取物的分級(jí)產(chǎn)物，并 如表3中所顯示的那樣合并以形成級(jí)分A-E(Fr. A-Fr. E)。表3:組合的級(jí)分 如上文的，在秀麗隱桿線蟲(chóng)中使用已經(jīng)與綠色熒光蛋白(GFP)融合的gcs-1轉(zhuǎn)基 因(GCS-1: :GFP)實(shí)施這些實(shí)驗(yàn)。gcs-1編碼如下酶，其對(duì)于谷胱甘肽合成是限速的，而且是 階段II主要調(diào)節(jié)物SKN-1的尤其充分表征的和診斷性的靶基因(An和Blackwell，Genes Dev. (17) 1882-93 (2003) ；An 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (102) 16275-80 (2005)； Inoue 等，Genes Dev. (19) :2278_83 (2005) ；Tullet 等，Cell. 132 :1025-38 (2008))。在氧 化應(yīng)激條件下，SKN-1依賴性gcs-1表達(dá)在腸細(xì)胞中受到誘導(dǎo)。用各種級(jí)分對(duì)GCS-1 :GFP蟲(chóng)進(jìn)行處理，并觀察動(dòng)物腸中的GFP表達(dá)水平。在每次 個(gè)體實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)中，將約20粒L4期蟲(chóng)挑選至含有0P50細(xì)菌的新鮮平板。2-3天后，用材料處 理動(dòng)物。如下將蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至微離心管，即用M9(鹽水培養(yǎng)基)淹沒(méi)含有蟲(chóng)的平板，并使用移液 管將它們轉(zhuǎn)移至管?？焖傩D(zhuǎn)后，除去M9，并用M9再清洗動(dòng)物一次。此清洗除去任何剩余 的細(xì)菌。一旦清洗過(guò)蟲(chóng)，將它們與所提供的制備物一起溫育30或60分鐘。溫育后，在M9中 再清洗蟲(chóng)2次，并轉(zhuǎn)移至含有細(xì)菌的新鮮NGM平板，并容許恢復(fù)約30分鐘。然后將蟲(chóng)嵌入 載玻片上，并在顯微鏡下對(duì)GFP表達(dá)評(píng)分?；谀c中的GFP表達(dá)水平給出三種得分(高的、 中等的或低的表達(dá))之一，如記載于(An 和 Blackwell，Genes Dev. (17) 1882-93 (2003)； Tullet等，Cell. 132 :1025-38(2008))的。對(duì)整條腸具有GFP的動(dòng)物給予高得分。整條腸 半段的GFP表達(dá)是中等得分的例子。將低得分給予在其腸中具有非常少或沒(méi)有GFP表達(dá)的 蟲(chóng)。首先，檢查用柳提取物級(jí)分處理后的gcs-1轉(zhuǎn)基因報(bào)告物的誘導(dǎo)(圖17)。用級(jí) 分A進(jìn)行的處理在處理30分鐘后在與對(duì)照相比時(shí)導(dǎo)致腸GFP表達(dá)升高最高(圖17)。以 低濃度(5 u g/mL)施用來(lái)自級(jí)分A的材料，因?yàn)樗蝗芙庥贒MS0中，所述DMS0在較高濃度 能引起氧化應(yīng)激響應(yīng)。級(jí)分A樣品中的DMS0的低的終濃度(006% DMS0)沒(méi)有在gcs-1蟲(chóng) (對(duì)照，圖17)中引發(fā)應(yīng)激響應(yīng)。級(jí)分B-E (其在M9培養(yǎng)基中以10mg/ml施用)也誘導(dǎo)腸 GCS-1: :GFP表達(dá)，其中每種連續(xù)級(jí)分導(dǎo)致比先前級(jí)分略低水平的誘導(dǎo)(圖17)。有趣的是， 級(jí)分B在以5 y g/mL施用時(shí)引發(fā)相當(dāng)強(qiáng)烈的應(yīng)答(未顯示)，提示其潛力與級(jí)分A的潛力相 當(dāng)。總之，以gcs-1誘導(dǎo)活性表征所有柳級(jí)分，其中級(jí)分A和B是最有力的，而其它的 連續(xù)顯示較小的活性。實(shí)施例7-綠茶和柳提取物的保護(hù)件效果本實(shí)施例描述了為了調(diào)查用先前分析的綠茶和柳提取物材料進(jìn)行的處理是否在氧化應(yīng)激和正常條件下增強(qiáng)秀麗隱桿線蟲(chóng)存活而實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。對(duì)下列材料測(cè)試它們是否保護(hù)動(dòng)物免于對(duì)氧化應(yīng)激的暴露柳提取物綠茶提取物 柳提取物的分級(jí)產(chǎn)物(Fr. A)在每次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)用叔丁基過(guò)氧化氫溶液(t-B00H)(即過(guò)氧化物游離基的脂溶 性來(lái)源)進(jìn)行的處理來(lái)將蟲(chóng)暴露于氧化應(yīng)激(圖18)。將L4期蟲(chóng)挑選至含有要測(cè)試的材 料或?qū)φ盏钠桨?。已?jīng)用細(xì)菌培養(yǎng)物接種那些平板，所述細(xì)菌培養(yǎng)物已經(jīng)被向下旋轉(zhuǎn)，并在 5ml各種材料中重懸。于20°C溫育24或48小時(shí)后，將蟲(chóng)與少量細(xì)菌一起移動(dòng)至含有15. 4mM t-B00H的平板。然后每小時(shí)對(duì)蟲(chóng)檢查移動(dòng)和咽泵，直至所有蟲(chóng)均死亡。每塊平板使用約 20粒蟲(chóng)一式三份實(shí)施每次分析。使用如下對(duì)照柳LB中重懸的0P50細(xì)菌食物；綠茶含 有.DMS0的LB中重懸的0P50 ；柳級(jí)分A 含有.006% DMS0的LB中重懸的0P50。48小時(shí)后，所有三種材料均提供針對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)，如隨著與合適對(duì)照相比存 活增加所指明的。柳提取物在LB中在10mg/mL的濃度是可溶的。此組的陰性對(duì)照(單獨(dú)的 0P50細(xì)菌)沒(méi)有提供針對(duì)t-B00H的保護(hù)，其中所有蟲(chóng)到第9小時(shí)均死亡。比較而言，用柳 提取物處理的一些蟲(chóng)活過(guò)12小時(shí)(圖18)。茶葉提取物也提供保護(hù)，即使其終濃度為2ug/ mL，因?yàn)樗鼉H在DMS0(.01%)中是可溶的。最后，用柳提取物級(jí)分A進(jìn)行的處理也提供顯著 的保護(hù)。比較而言，暴露于這些相同的提取物材料僅24小時(shí)沒(méi)有提供針對(duì)t-B00H應(yīng)激的 任何保護(hù)?？傊?，用每種所測(cè)試的制備物進(jìn)行的處理保護(hù)秀麗隱桿線蟲(chóng)免于隨后的氧化應(yīng)激 考驗(yàn)(用t-B00H進(jìn)行的處理)。建立條件用于分析對(duì)壽命的影響。實(shí)施例8-胡蘿卜和花椰菜提取物的效果使用下列材料替換柳或茶提取物來(lái)實(shí)施如上文在實(shí)施例6中所描述的實(shí)驗(yàn)胡蘿卜粉末發(fā)酵的胡蘿卜粉末花椰菜粉末發(fā)酵的花椰菜粉末用各10mg/mL每種制備物處理蟲(chóng)達(dá)30分鐘。用胡蘿卜粉末進(jìn)行的處理在30分鐘 處理后與其它材料相比導(dǎo)致GFP報(bào)告物的腸表達(dá)升高最高(圖19)。這些中的每種在M9鹽 水中在10mg/mL濃度是可溶的。陰性M9對(duì)照再次顯示對(duì)腸中的GFP沒(méi)有影響，其中所有蟲(chóng) 均被評(píng)分為低的?？傊?，所有所測(cè)試的材料與M9對(duì)照相比都適度地誘導(dǎo)gcs-1表達(dá)。實(shí)施例9-柳提取物對(duì)由Nrf2調(diào)節(jié)的基因(H0-1和NQ01)的表達(dá)的影響為了檢查柳提取物對(duì)由Nrf2調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)的影響，HUVEC購(gòu)自Sanko Junyaku (日本)，并于 37°C和 5% C02 在補(bǔ)充有 10% FBSU0ng/mL FGF 禾口 100U/mL 青霉素、 和100 u g/mL鏈霉素的MCDB131中在經(jīng)I型膠原包被的平板中培養(yǎng)。在12孔經(jīng)I型膠原 包被的平板上接種第4代HUVEC。在細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)，在含有2% FBS而沒(méi)有FGF的培養(yǎng)基 中使它們饑餓達(dá)隨后的24小時(shí)。饑餓期后，將培養(yǎng)基交換成含有以想要的終濃度溶解的柳提取物(Ask IntercityCo.，Ltd.)的新鮮培養(yǎng)基(參見(jiàn)圖20A-B)。在導(dǎo)入柳提取物后6小 時(shí)時(shí)使用總RNA迷你試劑盒(BIO-RAD，USA)自細(xì)胞提取總RNA。使用PrimeScript RT試 劑試劑盒(Takara，Japan)自0. 5 y g總RNA合成單鏈cDNA。通過(guò)使用ABI 7500快速實(shí)時(shí) PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Japan)進(jìn)行的實(shí)施PCR來(lái)實(shí)施對(duì)血紅素加氧酶1 (H0-1) 和 NADPH 脫氫酶醌 l(NQ01)mRNA 的定量分析。使用 Premix Ex Taq(Takara, Japan)和 Assay-on-Demand，基因表達(dá)產(chǎn)品(GeneExpression Products)來(lái)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR分析。 通過(guò)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)水平來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化所有定量數(shù)據(jù)。圖20A-B中顯示的結(jié)果指明柳提取物以劑量依賴性方式提高H0-1和NQ01，即由 Nrf-2調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。實(shí)施例10-柳提取物對(duì)分離的PBMC中的Nrf2表汰的影響將來(lái)自健康志愿者的血液收集入肝素化的管中，并通過(guò)添加等量的PBS(-)來(lái)稀 釋。使用Ficcoll-Conray梯度方法自稀釋的血液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。在存在 或沒(méi)有來(lái)自Ask Intercity Co.，Ltd的柳提取物的情況中于37°C和5% C02在補(bǔ)充有10% FBS、100U/mL青霉素、和100 y g/mL鏈霉素的RPMI1640中培養(yǎng)1. 0 X 106個(gè)PBMC。在溫育后 4小時(shí)使用總RNA迷你試劑盒(BI0-RAD，USA)自細(xì)胞提取總RNA。使用PrimeScript RT試 劑試劑盒(Takara，Japan)自總RNA合成單鏈cDNA。通過(guò)使用ABI 7500快速實(shí)時(shí)PCR系 統(tǒng)(Applied Biosystems, Japan)進(jìn)行的實(shí)施PCR來(lái)實(shí)施對(duì)谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾 物亞基(GCLM)和NF-E2相關(guān)因子2(NRF2)mRNA的定量分析。使用Premix Ex Taq (Takara, Japan)和Assay-on-Demand，基因表達(dá)產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR分析。通過(guò)甘油醛_3_磷 酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)水平來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化所有定量數(shù)據(jù)。圖21中顯示的結(jié)果指明柳提取物在人PBMC中以劑量依賴性方式提高Nrf-2的表 達(dá)。實(shí)施例11-對(duì)Nrf2自細(xì)朐,質(zhì)向細(xì)朐j亥的移位的i平估皮膚成纖維細(xì)朐,中的Nrf2 激活效果用于本實(shí)施例的皮膚成纖維細(xì)胞是自50歲白人女性衍生的的腹部成纖維細(xì)胞 (下文縮寫為HDF50) (Cell Applications, Inc.)。所使用的培養(yǎng)基是如下制備的MEM (+) 培養(yǎng)基，即將50mL標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(SIGMA)和5. OmL抗生素殺真菌劑溶液(100x) (SIGMA)添 加至500mL MEM-Eagle培養(yǎng)基(SIGMA)，并混合。將HDF50在5% C02培養(yǎng)箱中于37°C在MEM(+)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在HDF50達(dá)到匯合 狀態(tài)時(shí)，分離細(xì)胞以通過(guò)血球計(jì)(Btoker-Ttok血球計(jì))來(lái)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。將所獲得的細(xì)胞 在MEM(+)培養(yǎng)基中稀釋以制備1.9x10s個(gè)細(xì)胞/15mL。將要評(píng)估的材料添加至經(jīng)稀釋的培 養(yǎng)基后，將混合物在5% C02培養(yǎng)箱中于37°C再溫育24小時(shí)。其后，再次分離細(xì)胞以使用細(xì) 胞核/胞質(zhì)溶膠分級(jí)試劑盒來(lái)獲得細(xì)胞核提取物。使用蛋白質(zhì)測(cè)定快速試劑盒來(lái)測(cè)定細(xì)胞 核提取物中的蛋白質(zhì)，并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度以使所有樣品間的蛋白質(zhì)量相等。將如此制備的 樣品與等體積的含有5% 2-巰基乙醇的Laemmli樣品緩沖液混合，并煮沸。將自煮沸的混 合物獲得的上清液進(jìn)行凝膠電泳。完成電泳后立即使用iBlot凝膠轉(zhuǎn)移裝置將凝膠轉(zhuǎn)移至 與試劑盒附著的硝酸纖維素膜，并使用Amersham ECLPlus Western印跡檢測(cè)系統(tǒng)在lOOKda 左右檢測(cè)Nrf2條帶。此外，使用Re-BlotWestern印跡再循環(huán)試劑盒除去抗體后，以類似的 方式檢測(cè)核纖層蛋白A/C作為對(duì)照。關(guān)于Nrf2條帶，掃描凝膠圖像，并使用Scion圖像軟件(NIH的Windows版本)來(lái)定量Nrf2條帶的密度以計(jì)算相對(duì)Nrf2蛋白水平作為對(duì)照。圖22中顯示的結(jié)果指明柳提取物在人成纖維細(xì)胞中以劑量依賴性方式提高 Nrf-2蛋白水平。實(shí)施例12-對(duì)預(yù)防氧化應(yīng)激的能力的評(píng)估在具有經(jīng)稀釋的材料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，將HDF50在含有5mMH202的 Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(SIGMA)(下文縮寫為D-PBS)中溫育30分鐘。其后，用MEM(+) 培養(yǎng)基替換培養(yǎng)液，并在5% C02培養(yǎng)箱中于37°C再繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。完成培養(yǎng)后，使用血球計(jì)(Bilrker-Tilrk血球計(jì))來(lái)測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目(A)，并依照如 下等式比較無(wú)H202添加條件的活細(xì)胞數(shù)目(B)來(lái)計(jì)算細(xì)胞成活率細(xì)胞成活率=[(A)/(B)]X100(%)圖23中顯示的結(jié)果指明柳提取物對(duì)預(yù)防氧化應(yīng)激有陽(yáng)性效果。實(shí)施例13-人皮膚中的抗氧化(口服攝取)為了評(píng)估柳提取物對(duì)人皮膚中的抗氧化的刺激作用，以每天800mg的劑量對(duì)7名 年齡為32至43歲的健康男性口服給予柳提取物(Ask Intercity Co.，Ltd.)。攝取期為4 周，而沖洗期為8周。通過(guò)皮脂中的脂質(zhì)過(guò)氧化物量來(lái)測(cè)量抗氧化劑活性?？偣?次獲得 皮質(zhì)，即攝取開(kāi)始前立即，完成攝取期后，沖洗期間(在第4周時(shí))和完成沖洗期后。如下獲得皮脂，即將丙酮/醚(1 1)溶液注射入緊密放置在收集位置上的具有 4cm內(nèi)徑的圓筒中。組合自每名受試者背部三處位置獲得的皮脂樣品，并使用TBARS測(cè)定試 劑盒(0XITEK)來(lái)測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化物。使用RF540熒光分光光度計(jì)(Shimadzu，Japan)來(lái)實(shí) 施脂質(zhì)過(guò)氧化物測(cè)定中的熒光測(cè)量，并獲得脂質(zhì)過(guò)氧化物量作為MDA值(TBARS含量(nmol/ mL/g))。圖24中顯示的結(jié)果指明柳提取物在口服4周后顯著地且可逆地提高抗氧化劑活 性。為了進(jìn)一步評(píng)估口服的柳提取物對(duì)人皮膚中的抗氧化的刺激作用，將16名年齡 為24至47歲的健康男性分成測(cè)試組(11名男性)和安慰劑組(5名男性)。對(duì)測(cè)試組口 服給予每天6粒膠囊(每天總共800mg柳提取物(Ask IntercityCo.，Ltd.)和結(jié)晶纖維 素)。對(duì)安慰劑組口服給予每天6粒膠囊(僅含有結(jié)晶纖維素)。攝取期為6周。實(shí)施UV 照射兩次，即在開(kāi)始攝取前2周和開(kāi)始攝取后4周。使用太陽(yáng)模擬器以30mJ/cm2對(duì)每名受 試者背部照射UV。每次UV照射后2周拍攝UV照射位置處的照片。在與測(cè)試組中的時(shí)間相 同的時(shí)間在安慰劑組中實(shí)施UV照射和拍照。使用Photoshop Element (Adobe)中的色圖實(shí) 施照片圖像數(shù)據(jù)的自動(dòng)顏色水平修正后使用Java第1.39版(NIH)中的圖像加工和分析來(lái) 獲得色素量(灰度值均值)。圖25中顯示的結(jié)果指明柳提取物在口服后提高抗氧化劑活性，如通過(guò)由UV照射 所產(chǎn)生的色素量的顯著降低所證明的。實(shí)施例14-人皮膚中的抗氧化(表面應(yīng)用)本實(shí)施例描述了對(duì)表面施用的柳提取物對(duì)人皮膚中的抗氧化的刺激作用的評(píng)估。 外部應(yīng)用期為1周。使用含有含水酒精凝膠(含有0.45%卡波姆(carbomer)和4. 75%乙 醇)中的要測(cè)試的柳提取物(Ask Intercity Co.，Ltd.)的測(cè)試樣品。使用含有0. 45% 卡波姆和4. 75%乙醇的安慰劑樣品。以0. 2g/5cm2的劑量一天兩次在下臂上應(yīng)用含水酒精
26凝膠。完成應(yīng)用期后，用水清洗應(yīng)用位置，并干燥。然后使用太陽(yáng)模擬器以30至40mJ/cm2 的UV (根據(jù)小組對(duì)UV敏感性調(diào)整)照射所述位置。UV照射后6天時(shí)，在照射位置處拍攝照 片。使用Photoshop Element (Adobe)中的色圖實(shí)施照片圖像數(shù)據(jù)的自動(dòng)顏色水平修正后 使用Java第1. 39版(NIH)中的圖像加工和分析來(lái)獲得色素量(灰度值均值)。圖26中顯示的結(jié)果指明柳提取物在表面施用后提高抗氧化劑活性，如通過(guò)由UV 照射所產(chǎn)生的色素量的顯著降低所證明的。其它實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)理解的是，雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)的描述進(jìn)行了描述，上述描述意圖例 示，而并不限制由所附權(quán)利要求書(shū)的范圍所限定的本發(fā)明的范圍。其它方面、優(yōu)點(diǎn)、和修飾 在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種組合物，其包含白柳提取物或其活性級(jí)分，其中所述組合物提高階段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化劑酶基因之一或兩者在細(xì)胞中的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物提高如下基因的表達(dá)選自谷氨酸-半胱氨 酸連接酶修飾物亞基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)的P2D基因；或 包括超氧化物歧化酶I(SODl)的抗氧化劑酶基因。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物還提高F0X01的表達(dá)和/或降低8-羥 基-2，-脫氧鳥(niǎo)苷(S-OHdG)的水平。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中將所述組合物配制用于口服。
5.權(quán)利要求4的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種口服可接受載體和添加劑。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中將所述組合物配制用于表面施用。
7.權(quán)利要求6的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種表面可接受載體和添加劑。
8.一種提高柳提取物的階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑酶增強(qiáng)活性的方法，該方法包括提供具有第一水平的P2D或抗氧化劑酶增強(qiáng)活性的柳提取物； 對(duì)所述提取物分級(jí)，以便獲得兩種或更多種級(jí)分； 選擇具有0. 5或更大的Rf值的級(jí)分； 測(cè)定所述級(jí)分的P2D或抗氧化劑酶增強(qiáng)活性；并且若級(jí)分具有比P2D或抗氧化劑酶增強(qiáng)活性的第一水平高的P2D或抗氧化劑酶增強(qiáng)活性 水平，則選擇該級(jí)分。
9.權(quán)利要求8的方法，其中對(duì)所述提取物分級(jí)包括使用一種或多種選自下組的方法 柱層析、液液分級(jí)、和固液分級(jí)。
10.一種鑒定提高階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑酶基因在細(xì)胞中表達(dá)的化合物的方 法，該方法包括(a)提供表達(dá)(i)P2D或抗氧化劑酶基因或(ii)包含P2D或抗氧化劑酶基因啟動(dòng)子的 報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；(b)提供植物提取物的級(jí)分；(c)使所述細(xì)胞與所述級(jí)分接觸；并(d)檢測(cè)所述級(jí)分對(duì)所述P2D或抗氧化劑酶基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響， 其中提高所述P2D或抗氧化劑酶基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分包含提高階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑酶基因在細(xì)胞中表達(dá)的化合物。
11.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括(e)選擇提高所述P2D或抗氧化劑酶基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi) 所述級(jí)分，以便生成兩種或更多種亞級(jí)分；(f)提供表達(dá)P2D或抗氧化劑酶基因或包含P2D基因啟動(dòng)子的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；(g)使所述細(xì)胞與所述亞級(jí)分接觸；并(h)檢測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述P2D或抗氧化劑酶基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響， 其中提高所述P2D或抗氧化劑酶基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的亞級(jí)分包含提高階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑酶基因在細(xì)胞中表達(dá)的化合物。
12.權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)步驟(e)至(h)，直至獲得純化的化合物。
13.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括將所述純化的化合物配制用于口服。
14.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括將所述純化的化合物配制用于表面施用。
15.權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)、成纖維細(xì)胞、或秀麗隱桿線蟲(chóng)中的細(xì)胞。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物提取物是柳提取物。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述秀麗隱桿線蟲(chóng)中的細(xì)胞是ASI細(xì)胞。
18.權(quán)利要求8-12任一項(xiàng)的方法，其中所述P2D基因選自下組谷氨酸-半胱氨酸連 接酶修飾物亞基(GCLM)，谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)，而所述抗氧化劑酶基 因是超氧化物歧化酶1 (SODl)。
19.權(quán)利要求8或10的方法，進(jìn)一步包括(e)選擇提高所述P2D或抗氧化劑酶基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi) 所述級(jí)分，以便生成兩種或更多種亞級(jí)分；(f)提供表達(dá)F0X01基因或包含F(xiàn)0X01基因啟動(dòng)子的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；(g)使所述細(xì)胞與所述亞級(jí)分接觸；(h)檢測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響；并選擇提高所述 F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的亞級(jí)分。
20.權(quán)利要求8或10的方法，進(jìn)一步包括(e)選擇提高所述P2D或抗氧化劑酶基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi) 所述級(jí)分，以便生成兩種或更多種亞級(jí)分；(f)使細(xì)胞與所述亞級(jí)分接觸；(g)檢測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述細(xì)胞中的8-羥基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(S-OHdG)水平的影響；并選擇降低所述細(xì)胞中的8-OHdG水平的亞級(jí)分。
21.一種鑒定提高叉頭框01 (F0X01)基因在細(xì)胞中表達(dá)的化合物的方法，該方法包括(a)提供表達(dá)(i)F0X01基因或(ii)包含F(xiàn)0X01基因啟動(dòng)子的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；(b)提供茶提取物級(jí)分和柳提取物級(jí)分之一種或多種；(c)使所述細(xì)胞與所述級(jí)分接觸；并(d)檢測(cè)所述級(jí)分對(duì)所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響，其中提高所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分包含提高F0X01在細(xì)胞中表達(dá)的 化合物。
22.權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括(e)選擇提高所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的級(jí)分，并進(jìn)一步分開(kāi)所述級(jí)分，以 便生成兩種或更多種亞級(jí)分；(f)提供表達(dá)F0X01基因或包含F(xiàn)0X01基因啟動(dòng)子的報(bào)告物構(gòu)建體的細(xì)胞；(g)使所述細(xì)胞與所述亞級(jí)分接觸；并(h)檢測(cè)所述亞級(jí)分對(duì)所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的影響，其中提高所述F0X01基因或報(bào)告物構(gòu)建體表達(dá)的亞級(jí)分包含提高F0X01在細(xì)胞中表達(dá) 的化合物。
23.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)步驟(e)至(h)，直至獲得純化的化合物。
24.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包括將所述純化的化合物配制用于口服。
25.權(quán)利要求21-23任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)、成纖維細(xì)胞、或秀麗隱桿線蟲(chóng)中的細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述秀麗隱桿線蟲(chóng)中的細(xì)胞是ASI細(xì)胞。
27.一種提高細(xì)胞中的階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑酶基因增強(qiáng)活性的方法，該方 法包括對(duì)所述細(xì)胞施用有效量的植物提取物或其活性級(jí)分。
28.一種提高細(xì)胞中的階段II解毒酶(P2D)或抗氧化劑酶基因增強(qiáng)活性的方法，該方 法包括對(duì)所述細(xì)胞施用有效量的包含植物提取物或其活性級(jí)分的組合物。
29.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述植物提取物是柳提取物。
30.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述提取物降低對(duì)所述細(xì)胞的氧化損害。
31.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述細(xì)胞在活的哺乳動(dòng)物中，并且所述提取物降低 所述哺乳動(dòng)物組織中的氧化損害。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞是皮膚細(xì)胞，并且所述提取物降低對(duì)所述哺乳 動(dòng)物皮膚的氧化損害。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞是皮膚細(xì)胞，并且所述提取物降低源自于暴露 于紫外放射的所述哺乳動(dòng)物皮膚中的色素沉著。
34.權(quán)利要求33的方法，其中在暴露于紫外放射前將所述植物提取物應(yīng)用至所述哺乳 動(dòng)物的皮膚。
全文摘要
提供了增強(qiáng)階段II解毒或抗氧化劑酶轉(zhuǎn)錄的Nrf2(SKN-1)激活的方法和組合物(包含植物提取物(例如柳提取物)或其活性級(jí)分)，以及用于鑒定提高那些酶的Nrf2調(diào)節(jié)的別的化合物的方法。
文檔編號(hào)A61K47/00GK101854953SQ200880115463
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者T·基思·布萊克韋爾, 前田真理子, 后藤昌史, 松本元伸, 牧野武利, 疇地里衣, 石角篤 申請(qǐng)人:喬斯林糖尿病中心股份有限公司;太陽(yáng)星光齒磨公司