專利名稱：用于治療干眼病的方法和組合物的制作方法
用于治療干眼病的方法和組合物本申請要求2007年11月16日遞交的美國臨時專利申請60/988，623的優(yōu)先權(quán)， 其公開的內(nèi)容在此明確引入作為參考。發(fā)明背景 干眼病或干眼癥是一種引起疼痛和不適的病癥。對于大部分個體而言，每天中的 眨眼和液體補充提供了一個清潔舒適的眼睛表面。在干眼病患者中，眼睛表面變得非常敏 感，從而引起疼痛和刺激。干眼病的病因?qū)W尚不清楚，但關(guān)于該病癥的起因有許多理論。一 種理論認(rèn)為是腺體缺陷，其中，分泌液體來補充在眨眼、流淚和蒸發(fā)中損失的液體的眼睛腺 體功能下降，分泌出的液體量不足。干眼病的另一種可能的起因涉及結(jié)膜和角膜的神經(jīng)。這 些神經(jīng)要么變得不敏感從而導(dǎo)致眨眼校少并引起干燥，要么變得過于敏感，從而直接引起 疼痛和干眼病癥狀的刺激特征的增加。慢性炎癥可能是干眼病的另一個致病或誘導(dǎo)因素， 無論炎癥發(fā)作的起因是什么。眼睛的感染可引起干眼病，由感染引起的炎癥會造成淚腺管 堵塞。自身免疫病癥(機體錯誤地將其自身的組織識別為外來組織)可能會使眼組織受到 免疫學(xué)攻擊，因此也可能是干眼病的致病因素之一。在一類這樣的自身免疫病癥——干燥 綜合征中，眼干(以及口干)是免疫細(xì)胞攻擊產(chǎn)生眼淚和唾液的外分泌腺所引起的標(biāo)志性 癥狀。據(jù)估計，干燥綜合征僅在美國就影響著4百萬人，是第二常見的自身免疫疾病。干眼 病的其它可能的致病因素包括激素或維生素的不足或過量。事實上，干眼病有可能是多種 不同病癥的結(jié)果，其中的任何一種或多種都可能在任何個體患者中引起疾病。無論其致病因素是什么，大部分干眼病患者都希望能夠緩解這些疼痛和不適的癥 狀。為此，已經(jīng)嘗試了很多方法，其范圍從手術(shù)到處方藥再到非處方滴眼液產(chǎn)品?？晒┻x擇 的手術(shù)包括通過閉合鼻淚管來暫時或永久性地除去正常的排液途徑。暫時性閉合采用被稱 為淚小點塞(punctal plugs)的裝置。開發(fā)出的用于治療干眼病的非手術(shù)裝置包括用于增 加眼睛濕度的濕氣室。治療劑旨在治療根本的生理學(xué)狀況，從而減輕干眼病的嚴(yán)重程度或 者完全消除干眼病，其可以是滴眼液形式的也可以不是滴眼液形式的。但是，到目前為止， FDA僅批準(zhǔn)了一種用于治療干眼病的治療劑。雖然這些治療或改善方法可為某些患者提供 益處，但這些方案需要患者承擔(dān)很大的風(fēng)險、花費和/或不便。對于干眼病患者，一種方便 的、相對廉價并且低風(fēng)險性的治療是人工淚液產(chǎn)品。這些局部制劑通常在需要時以滴眼液 的形式應(yīng)用，以補充或修補淚膜。因此，從最根本的意義上講，人工淚液只是另一種增加眼 睛濕度的方法。雖然它們在某些情況下可提供癥狀上的緩解，但卻很少能夠改變?nèi)魏胃?的眼睛或角膜病狀。對于干眼病的起因或病因?qū)W的一條相對新的研究路線研究了角膜中的金屬蛋白 酶類的潛在作用。金屬蛋白酶是一組蛋白水解酶類，其特征在于它們需要在其活性位點結(jié) 合金屬離子例如Zn2+或Ca2+以使其具有催化活性。已知金屬蛋白酶(MMP)參與涉及組織重 構(gòu)的過程。因此，在生理學(xué)上，MMP在腫瘤轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育和傷口愈合中起作用。有大約20 種已知的MMP，它們似乎在結(jié)構(gòu)上均彼此關(guān)聯(lián)，有大約40%的氨基酸同源性。以前，各MMP 是根據(jù)被認(rèn)定的它們的主要底物來命名(例如，⑴膠原酶，其降解間質(zhì)膠原(I，II和III 型)；(ii) IV型膠原酶和明膠酶，其降解4型基膜膠原和明膠(變性的明膠)；(iii)基質(zhì)溶素，其降解多種底物，包括蛋白聚糖、層粘連蛋白、明膠和纖連蛋白)或者有時根據(jù)酶的細(xì) 胞來源來命名(例如，多形核白細(xì)胞明膠酶)。最后發(fā)現(xiàn)，這些酶中的大部分可以裂解多種 底物，包括其它家族成員的無活性的多肽形式(酶原)，并且這些酶還可以降解非基質(zhì)蛋白 例如髓磷脂堿蛋白和α-1-抗胰蛋白酶。在結(jié)構(gòu)上，大部分MMP具有一個催化結(jié)構(gòu)域、一個 羧基末端血液結(jié)合素樣結(jié)構(gòu)域(血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域)和一個在酶激活過程中被裂解的前結(jié) 構(gòu)域。H. Nagase等人在1992年發(fā)表的文章中為當(dāng)時已知的MMP提供了數(shù)字命名和圖表(例如ΜΜΡ-1、ΜΜΡ-2等)，后來發(fā)現(xiàn)的MMP沿襲了這一系統(tǒng)。作為生理學(xué)組織重構(gòu)劑， ΜΜΡ-9(明膠酶-B，IV-B型膠原酶)可以降解多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜成分。ΜΜΡ-9 似乎通過如下方式在介導(dǎo)炎癥中起作用將炎癥細(xì)胞因子白介素IL-Ιβ轉(zhuǎn)化成其活性的 分泌形式、催化腫瘤壞死因子(TNFa)的翻譯后活化、增強IL-8、進程趨化因子的活性以及 降解絲氨酸蛋白酶抑制劑。此外，ΜΜΡ-9可能還在自身免疫中起作用，因為它可以促進自身 免疫抗體結(jié)合位的發(fā)展。已證實在干燥綜合征患者的淚液中，ΜΜΡ-9的局部活性升高。許多 研究證實，在患有潰瘍性角膜炎的人類和其它哺乳動物的淚液膜中，明膠酶、包括ΜΜΡ-9的 活性與正常角膜的淚液膜相比有顯著增加。還研究了明膠酶在潰瘍性角膜炎的發(fā)病中的作 用。用ΜΜΡ-9敲除小鼠進行的研究證實，ΜΜΡ-9缺乏使角膜上皮屏障破壞對實驗誘導(dǎo)的干 眼病有了一定程度的耐受性。在為了提供能夠在體內(nèi)抑制各種MMP活性的治療劑所進行的嘗試中，許多不同的 研究組織合成了大量新的化學(xué)實體。在這些合理化設(shè)計的MMP抑制劑中，有許多已經(jīng)通過 了多種臨床前的障礙并且在許多被認(rèn)為與MMP有關(guān)的疾病中表現(xiàn)為潛在的治療劑。但不幸 的是，在臨床試驗中，這些化合物中有許多并沒有象期望的那樣有效，例如廣譜MMP抑制劑 馬立馬司他(ΒΒ-2516)和MMP-I選擇性抑制劑托卡特(Ro 32-3555)。它們未能獲得成功的 原因之一是明顯的副作用，例如肌肉骨骼毒性，特別是對于廣譜抑制劑而言。另一個問題是 缺乏改善疾病的效力，以托卡特為例，其在兔關(guān)節(jié)炎模型中獲得的鼓舞人心的結(jié)果無法在 人類試驗中重現(xiàn)。事實上，英國Biotech的馬立馬司他是至少五個失敗的III期臨床試驗 的受試對象，Bayer和Pfizer均已終止了 III期MMP抑制劑試驗。最近發(fā)現(xiàn)了一個新的明膠結(jié)合位點，其是MMP-9的血液結(jié)合素亞單位的一部分。國際公開號WO 95/2969涉及用于眼淚替代療法的組合物，其中含有細(xì)胞因子和 生長因子，特別是TGF3 8。美國專利6，444，791 (Quay)涉及使用蛋白酶抑制劑、包括α 2_巨球蛋白和 α 1-蛋白酶抑制劑治療圓錐形角膜的方法。美國專利4，923，700 (Kaufman)涉及人工淚液系統(tǒng)，包括粘蛋白型顆粒和脂質(zhì)型 材料的水性混懸液。粘蛋白型顆粒由膠原、明膠和/或血清形成。美國專利6，455，583 (Pflugfelder等人)涉及局部使用四環(huán)素來減輕與延遲的眼 淚清潔有關(guān)的炎癥。發(fā)明概述現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將相對少量的天然肽蛋白酶抑制劑摻入到眼科可接受的 載體例如在人工淚液型組合物中所用的載體中時，會顯示出明顯的對金屬蛋白酶的抑制作 用。此外，還出人意料地發(fā)現(xiàn)，所形成的組合物可以增加角膜上皮細(xì)胞的活力并減輕其干燥。本發(fā)明涉及MMP抑制型局部眼科組合物，其在眼科可接受的載體中含有蛋白酶抑制性 肽底物。本發(fā)明還涉及治療干眼病的方法，包括向眼睛表面施用在眼科可接受的載體中含 有蛋白酶抑制性肽底物的組合物。
本發(fā)明的第一組實施方案涉及局部用眼科組合物，其含有蛋白酶抑制性肽底物和 眼科可接受的載體。該組實施方案中的一個優(yōu)選的實施方案是在眼科可接受的載體中的蛋 白酶抑制性肽底物和半乳甘露聚糖。另一個優(yōu)選的實施方案是含有明膠和半乳甘露聚糖的 局部用眼科組合物。本發(fā)明的其它實施方案包括含有半乳甘露聚糖和卵巨球蛋白、半乳甘 露聚糖和膠原以及半乳甘露聚糖和酪蛋白的組合物。優(yōu)選的半乳甘露聚糖是HP-瓜爾膠。本發(fā)明的第二組實施方案涉及治療干眼病的方法，包括向眼睛表面施用有效量的 MMP-9抑制性肽底物。在優(yōu)選的實施方案中，肽底物的量足以抑制MMP-9達至少50%。不希望受到任何理論的束縛，據(jù)信蛋白酶抑制性肽底物可以抑制蛋白酶例如 MMP-9的活性，從而降低蛋白酶作用于通常存在于眼組織中的內(nèi)源性底物從而引起干眼病 的能力。通過該方式，它們可以減輕MMP-9或其它眼蛋白酶的直接損傷作用。蛋白酶抑制性 肽底物對蛋白酶例如MMP-9的部分或全部抑制作用可以是間接的，即，以變構(gòu)型抑制的方 起作用。蛋白酶抑制性肽底物的大小或分子量可以影響該抑制作用的效力。此外，蛋白酶 抑制性肽底物還可以為變敏感的眼睛表面組織提供直接或間接的抗炎作用以及抗組織重 構(gòu)作用。這些作用被認(rèn)為是通過肽底物與MMP酶、特別是MMP-9的相互作用所介導(dǎo)的。此 外，本發(fā)明的某些實施方案還可以通過使蛋白酶抑制性肽緩釋來延長這些治療作用。例如， 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，將蛋白酶抑制性肽底物與HP-瓜爾膠和硼酸鹽組合形 成凝膠該凝膠可以增強淚膜穩(wěn)定性并防止眼表面干燥。此外，該凝膠還可以捕獲蛋白酶抑 制性肽底物，從而使底物保留在淚膜中，導(dǎo)致活性更為持久。蛋白酶抑制性肽底物還可以作 為可溶性粘蛋白的支架以形成明膠-粘蛋白凝膠基體，從而增強淚膜的穩(wěn)定性。附圖概述

圖1顯示了明膠A在Tricine緩沖液中對MMP-9的劑量響應(yīng)性抑制。圖2顯示了 0. 1 % w/v的明膠A與粘滑劑聚合物組合顯示出對MMP-9的明顯的抑 制作用。圖3顯示了摻入Systane中的明膠A對MMP-9的劑量響應(yīng)性抑制。圖4顯示了在新淚然滴眼液(Tears Naturale II)中的明膠A對MMP-9的劑量響 應(yīng)性抑制。圖5顯示了明膠A對細(xì)菌膠原酶的劑量響應(yīng)性抑制。圖6顯示了在Systane中的明膠A對細(xì)菌膠原酶的劑量響應(yīng)性抑制。圖7顯示了在新淚然滴眼液(Tears Naturale II)中的明膠A對細(xì)菌膠原酶的劑 量響應(yīng)性抑制。圖8顯示了明膠A與粘滑劑聚合物組合顯示出不同程度的對細(xì)菌膠原酶的抑制作用。圖9顯示了當(dāng)用包含明膠A的人工淚液產(chǎn)品處理時，能夠防止干燥并且細(xì)胞活力 增強。圖10顯示了 α -2巨球蛋白對ΜΜΡ-9的劑量響應(yīng)性抑制。圖11顯示了重組人明膠8. 5kD對MMP-9的劑量響應(yīng)性抑制。
圖12顯示了重組人膠原對MMP-9的劑量響應(yīng)性抑制。發(fā)明詳述除非另有說明，否則本文中使用的下列術(shù)語應(yīng)被理解為具有如下含義術(shù)語“蛋白酶”包括催化肽鍵裂解的酶。代表性的蛋白酶包括膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶。術(shù)語“蛋白酶抑制性肽底物”包括在根本上表現(xiàn)出肽的性質(zhì)的物質(zhì)，S卩，由一個或 多個氨基酸鏈組成并且具有作為蛋白酶的底物的特性的物質(zhì)。代表性的蛋白酶抑制性肽底 物包括明膠、α-2巨球蛋白、卵巨球蛋白、酪蛋白和膠原。術(shù)語“ΜΜΡ”是指基質(zhì)金屬蛋白酶(酶)。術(shù)語“ΜΜΡ-9”是指被稱為基質(zhì)金屬蛋白酶_9的酶。術(shù)語“半乳甘露聚糖”是指從含有甘露糖和/或半乳糖部分作為主要結(jié)構(gòu)成分的 天然樹膠或類似的天然或合成樹膠得到的多糖。術(shù)語“CMC”是指羧甲基纖維素及其鹽。術(shù)語“HPMC”是指羥丙甲基纖維素。術(shù)語“HP-瓜爾膠”是指羥丙基瓜爾膠。優(yōu)選具有低摩爾取代的(例如，低于0. 6) 的羥丙基瓜爾膠。術(shù)語“眼睛表面”是指可以從外表接觸到的眼睛組織，非限制性的代表性實例包括
角膜、結(jié)膜、穹窿和鞏膜。術(shù)語“抑制量”是指無毒但又足以提供所需活性的抑制性物質(zhì)的量。術(shù)語“眼科可接受的載體”是指具有與眼組織生理相容性的物理性質(zhì)(例如PH和 /或滲透性)的成分?，F(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將相對少量的天然肽蛋白酶抑制劑摻入到人工淚液型組 合物中時會顯示出明顯的對金屬蛋白酶的抑制作用。更出人意料的是，蛋白酶抑制性肽底 物的量可以非常低，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)濃度低達0.的蛋白酶抑制性肽底物(其一種實施 方案是明膠)可以對MMP-9產(chǎn)生大于50%的抑制作用。蛋白酶抑制性肽底物的實例包括明膠、α-2巨球蛋白、卵巨球蛋白、膠原和酪蛋 白，以下將對它們進行進一步的描述。但是，應(yīng)當(dāng)理解，也可以使用其它蛋白酶抑制性肽底 物，并且它們也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。明膠是通過將得自動物結(jié)締組織的膠原部分水解所產(chǎn)生的蛋白?？赏ㄟ^商業(yè)渠道 獲得兩種類型的明膠:Α型得自酸處理的前體，而B型得自堿處理的前體。兩種類型的明膠 都是各種MMP的底物，可以作為MMP的競爭性抑制劑。α -2巨球蛋白是一種由肝臟產(chǎn)生的存在于血液中的大蛋白，其能夠滅活多種蛋白 酶，包括金屬蛋白酶。據(jù)報道，該滅活機制是35氨基酸區(qū)域，其起到蛋白酶的“誘餌”的作 用當(dāng)?shù)鞍酌附Y(jié)合并裂解該區(qū)域時，其便被綁定在α-2巨球蛋白上。所形成的復(fù)合物隨后 被巨噬細(xì)胞從血液中清除。酪蛋白是一種存在于奶酪和牛奶中的磷蛋白。酪蛋白含有相對高數(shù)量的脯氨酸殘 基，因此具有很少的二級或三級結(jié)構(gòu)。雖然其相對疏水，但卻很容易在稀的堿和鹽溶液中分 散。卵巨球蛋白也稱為卵固蛋白，是一種由四個通過二硫鍵成對連接的亞單位組成的糖蛋白。已證實其對各種類型的蛋白酶、包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶 和金屬蛋白酶具有廣譜抑制活性。膠原是動物中的主要的蛋白質(zhì)，其占總蛋白含量的約25%，并且是結(jié)締組織中的 主要的蛋白質(zhì)。它是一種長的纖維狀蛋白，形成了堅韌的束或纖維，后者一起形成提供組織 和細(xì)胞構(gòu)架的細(xì)胞外基質(zhì)。在某些細(xì)胞內(nèi)部也發(fā)現(xiàn)了膠原。膠原通常以三螺旋的形式存在， 稱為原膠原。原膠原的部分水解產(chǎn)生了明膠。
用于本發(fā)明的蛋白酶抑制性肽底物通常來自于動物。例如，來自牛或豬的皮膚或 骨頭的明膠是當(dāng)今藥物產(chǎn)品中使用的最主要的形式。需要進行粗加工以提供盡可能均勻和 純凈的產(chǎn)物以用于所需的用途(口服、胃腸外、裝置)。不存在傳染性海綿狀腦病(TSR)和瘋 牛病(BSE)的膠原和/或明膠可從多個供應(yīng)商購買到，包括例如Gelita(Sergeant Bluff, Iowa)和Rousselot (Sobel Company, Dubuque, Iowa)。使用通過合成和/或重組技術(shù)生產(chǎn) 的材料是另一種選擇。例如，F(xiàn)ibrogen(San Francisco,California)利用重組酵母系統(tǒng)生 產(chǎn)全合成的明膠和膠原。這些合成的材料在一致性(批次間的一致性、確定的分子量以及 物理化學(xué)性質(zhì))、用戶化(預(yù)定的特性、設(shè)計的分子)和生物相容性以及安全性(誘導(dǎo)免疫 應(yīng)答的風(fēng)險下降，消除了污染)方面具有一定的優(yōu)勢。本發(fā)明的組合物和方法包括足以抑制金屬蛋白酶的量的蛋白酶抑制性肽底物。優(yōu) 選的金屬蛋白酶是MMP-9。蛋白酶抑制性肽底物的量可隨具體的底物而變化，但通常的量 為約0. 010%至10%重量/體積(w/v)，更優(yōu)選約0. 05%至1. 0% (w/v)，最優(yōu)選約0. 05% 至0. 25 % (w/v)。MMP的抑制百分比優(yōu)選大于約50 %，更優(yōu)選大于約60 %，仍更優(yōu)選大于約 70%。在本發(fā)明的一個實施方案中，將蛋白酶抑制性肽底物與現(xiàn)有的干眼病制劑例如含 有潤滑聚合物系統(tǒng)的SYSTANE 潤滑滴眼液(AlconLaboratories，Inc.)組合。SYSTANE 的聚合保護是通過粘滑劑(聚乙二醇400和丙二醇)、HP-瓜爾膠以及患者的天然眼淚的相 互作用來實現(xiàn)的。當(dāng)HP-瓜爾膠與天然眼淚混合時，發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。HP-瓜爾膠與疏水性 表面結(jié)合，形成了稠度像凝膠一樣的網(wǎng)絡(luò)。HP-瓜爾膠還可以使粘滑系統(tǒng)在眼睛表面保持更 長的時間。本發(fā)明的一個實施方案是含有半乳甘露聚糖、硼酸鹽和明膠的組合物?？捎糜诒?發(fā)明的半乳甘露聚糖通常來自于瓜爾膠、槐豆膠和塔拉膠。此外，半乳甘露聚糖還可以通過 經(jīng)典的合成途徑獲得或通過化學(xué)修飾天然的半乳甘露聚糖獲得。本文所用的術(shù)語“半乳甘露聚糖”是指從上述天然樹膠或含有甘露糖和/或半乳 糖部分作為主要結(jié)構(gòu)成分的類似的天然或合成樹膠得到的多糖。本發(fā)明的優(yōu)選的半乳甘露 聚糖是由通過(1-6)連接鍵連接的(1-4)-β-D-吡喃甘露糖基單元和α-D-吡喃半乳糖基 單元的直鏈組成的。對于優(yōu)選的半乳甘露聚糖，D-半乳糖與D-甘露糖的比例可以改變，但 通常是約1 2至1 4。最優(yōu)選D-半乳糖與D-甘露糖的比例為約1 2的半乳甘露聚 糖。此外，在“半乳甘露聚糖”的定義中還包括其它化學(xué)修飾的多糖的改變形式。例如，可以 對本發(fā)明的半乳甘露聚糖進行羥乙基、羥丙基和羧甲基羥丙基取代。當(dāng)需要軟凝膠時，對半 乳甘露聚糖的非離子型取代例如含有烷氧基和烷基(C1-C6)基團的取代是特別優(yōu)選的(例 如羥丙基取代)。特別優(yōu)選在非順式羥基位的取代。由半乳甘露聚糖的非離子取代所形成 的成分的例子是摩爾取代為約0. 4的羥丙基瓜爾膠。也可以對半乳甘露聚糖進行陰離子取代。當(dāng)需要強響應(yīng)凝膠時，陰離子取代是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的某些實施方案中可以使用硼酸鹽化合物?？捎糜诒景l(fā)明組合物中的硼 酸鹽化合物包括硼酸及其可藥用鹽例如硼酸鈉(硼砂)和硼酸鉀。本文所用的術(shù)語“硼酸 鹽”是指硼酸的所有藥學(xué)上適用的形式。由于其在生理學(xué)PH下的良好的緩沖能力和公知的 安全性以及與各種藥物和防腐劑之間的相容性，硼酸鹽是眼科制劑中的常用賦形劑。硼酸 本身還具有抑菌和抑制真菌的特性，因此有助于組合物的防腐。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是含有0. 01%至5% (w/v)的明膠、約0. 1至5% (w/ ν)的一種或多種半乳甘露聚糖和約0.05至5% (w/v)的硼酸鹽的組合物。優(yōu)選地，組合 物含有0. 01%至1. 0% (w/v)的明膠、0. 2至2. 0% (w/v)的半乳甘露聚糖和0. 1至2. 0% (w/v)的硼酸鹽化合物。最優(yōu)選地，組合物含有0.05%至0.5% (w/v)的明膠、0.3至0.8% (w/v)的半乳甘露聚糖和0.25至 1.0% (w/v)的硼酸鹽化合物。具體的量將隨著所需的具 體膠凝特性而改變。通常，可以對明膠、硼酸鹽或半乳甘露聚糖的濃度進行調(diào)節(jié)，從而在凝 膠化時(即給藥后)能夠達到適宜的組合物粘度。調(diào)節(jié)明膠、硼酸鹽或半乳甘露聚糖的濃 度可以在給定的PH下提供更強或更弱的膠凝作用。如果需要強烈膠凝的組合物，則可增加 明膠、硼酸鹽或半乳甘露聚糖的濃度。如果需要弱膠凝的組合物，例如部分膠凝的組合物， 則可降低明膠、硼酸鹽或半乳甘露聚糖的濃度。其它因素也可影響本發(fā)明組合物的膠凝特 性，例如組合物中其它成分例如鹽、防腐劑、螯合劑等的性質(zhì)和濃度。通常，優(yōu)選的本發(fā)明的 非凝膠組合物，即，不會被眼睛凝膠化的組合物的粘度為約5至lOOOcps。通常，優(yōu)選的本發(fā) 明的凝膠組合物，即，可被眼睛凝膠化的組合物的粘度為約50至50，OOOcps。最早的也是最為成功的人工淚液記載于美國專利4，039，662 (Hecht等人)。該溶 液已經(jīng)以淚然(TEARS NATURALE )潤滑滴眼液(AlconLaboratories，Inc.，F(xiàn)ort Worth, Texas)的形式上市多年。在Hecht等人的上述美國專利4，039，662中記載并要求保護的溶 液以及相應(yīng)的市售產(chǎn)品使用了羥丙甲基纖維素、右旋糖酐70和苯扎氯銨的獨特組合。在該 產(chǎn)品的改進形式(目前以新淚然(TEARS NATURALE II Polyquad ')潤滑滴眼液(Alcon Laboratories, Inc.)的名稱銷售)中，將苯扎氯銨用聚季銨鹽(polyquaternium-1)代 替，后者是聚合物型抗微生物劑/防腐劑。可用于本發(fā)明的一種有機緩沖液的例子是Tricine，也稱為N-[三(羥甲基)甲 基]甘氨酸。有機緩沖液同時具有堿性和酸性基團，因此是兩性離子型的；在生理學(xué)PH條 件下，這些緩沖液同時攜帶正電荷和負(fù)電荷。在隱形眼鏡和眼科溶液的情況下，需要加入各種試劑來增強與眼睛的相容性。為 了避免刺痛或刺激，使溶液的張力和PH在生理學(xué)范圍內(nèi)(例如張力為200-350m0smOle，pH 為6. 5-8. 5)是非常重要的。為此，經(jīng)常加入各種緩沖劑和滲透劑。最簡單的滲透劑是氯化 鈉，因為它是人淚液中最主要的溶質(zhì)。此外，還可加入丙二醇、乳果糖、海藻糖、山梨醇、甘露 醇或其它滲透劑來替代部分或全部氯化鈉。此外，可以使用各種緩沖液系統(tǒng)例如檸檬酸鹽、 磷酸鹽(Na2HP04、NaH2PO4和KH2PO4的適宜混合物)、硼酸鹽(硼酸、硼酸鈉、四硼酸鉀、偏硼 酸鉀及混合物)、碳酸氫鹽、氨丁三醇以及其它適宜的含氮緩沖液(例如ACES、BES、BICINE、 BIS-Tris、BIS-TrisPropane、HEPES、HEPPS、咪唑、MES、M0PS、PIPES、TAPS、TES、Tricine)來 確保約pH 6. 5至8. 5的生理學(xué)pH。本發(fā)明的蛋白酶抑制性肽底物組合物可與一種或多種選自據(jù)信可在治療干眼病中產(chǎn)生有益效果的其它治療劑類型的另外的治療劑例如抗生素、免疫抑制劑和抗炎劑聯(lián) I=I O可包括在本發(fā)明組合物中的抗炎劑包括留體類或非留體類藥物(NSAID)。NSAID 的例子包括但不限于酮咯酸氨丁三醇(Acular · )、吲哚美辛、氟比洛芬鈉、奈帕芬胺、溴芬 酸、舒洛芬和雙氯芬酸(Voltaren )。皮質(zhì)類固醇的例子包括但不限于瑞美松龍、氫化可 的松、氟氫可的松、氟米龍、氯替潑諾、曲安縮松、地塞米松、潑尼松龍、可的松、醛固酮、甲羥 松和倍他米松。性類固醇的例子包括基于雄激素、雌激素和/或孕激素的那些。抗生素的例子包括但不限于四環(huán)素、多西環(huán)素和化學(xué)修飾的四環(huán)素類、β -內(nèi)酰胺 抑制劑例如頭孢西丁、亞胺培南和其它噻烯霉素衍生物、氯霉素、新霉素、羧芐青霉素、粘菌 素、青霉素G、多粘菌素B、萬古霉素、頭孢唑啉、頭孢噻啶、利福霉素、短桿菌肽、桿菌肽、磺 胺類、依諾沙星、氧氟沙星、西諾沙星、司帕沙星、甲砜霉素、萘啶酸、甲苯磺酸妥舒沙星、氟 諾沙星、三水合吡哌酸、吡咯酸、氟羅沙星、金霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、諾氟沙星、 磺胺醋酰、磺胺異噁唑、妥布霉素、莫西沙星和左氧氟沙星。免疫抑制劑的例子包括例如環(huán)孢菌素類例如環(huán)孢菌素A和子囊霉素類例如 Π(-506、雷帕霉素和他克莫司。也可將其它成分加入到本發(fā)明的組合物中。所述成分通 常包括滲透壓調(diào)節(jié)劑、螯合劑、藥物活性劑、增溶劑、防腐劑、PH調(diào)節(jié)劑和載體。對于特定 的加工過程，也可加入其它聚合物或單體物質(zhì)例如聚乙二醇和甘油?？捎糜诒景l(fā)明組合物 的滲透劑包括鹽類例如氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣；非離子型滲透劑可包括丙二醇和甘油； 螯合劑可包括EDTA及其鹽；增溶劑可包括Cremophor EL 和吐溫80 ；其它載體可包括 Amberlite IRP-60 ；ρΗ調(diào)節(jié)劑可包括鹽酸、Tris、三乙醇胺和氫氧化鈉；適宜的防腐劑可 包括苯扎氯銨、聚季銨鹽-1和聚六亞甲基雙胍。以上所列的實例是為了說明的目的而給出 的，并非窮舉性的?？捎糜谏鲜瞿康牡钠渌噭┑睦邮茄劭浦苿┲泄牟⑶野ㄔ诒?發(fā)明的范圍內(nèi)。以下實施例進一步說明了本發(fā)明的各種實施方案。提供這些實施例是為了幫助更 好地理解本發(fā)明而不是要限制本發(fā)明的范圍。實施例1 若無另外說明，在本實施例以及隨后的實施例中，MMP活性是用對MMP-I、_2和_9 敏感的熒光探針底物進行測定的，包括DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH和DNP-Pro -Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-Lys (N-Me-Abz) -NH2。這些熒光探針底物測定是本領(lǐng)域公知的， 例如參見Bickett 等人，Analytical Biochemistry 212,58-64(1993)和 Netzel-Arnett 等 人，Analytical Biochemistry 195，86-92 (1991)，這兩篇文章均引入本文作為參考。在進 行測定前，將pro-MMP-9用對氨基苯基醋酸汞激活，并且無需進行細(xì)菌膠原酶激活。為了進 行測定，制備濃度為0. ImM的底物在DMSO中的儲備溶液，并且所有存在或不存在抑制劑的 酶活性測定均在含有 0. 2MNaCl、10mM CaCl2,50mM ZnSOjP 0. 05% Bri j_35 的 50mM Tricine 緩沖液，PH 7. 5中在室溫下進行。(Bri j-35是一種可購買到的聚氧乙烯十二烷基醚表面 活性劑)。總樣品體積為200μ1，在96孔微量培養(yǎng)板中進行。用針對所用的特定底物而設(shè) 定在適宜的激發(fā)/發(fā)射波長(即，λ ex = 280nm ； λ em = 360nm和λ ex = 280nm ； λ em = 360nm)下的微量培養(yǎng)板熒光讀數(shù)器(FLx800I型，Bio-Tek Instrument)每隔1分鐘記錄一 次熒光變化，共記錄10分鐘。酶活性用每分鐘的熒光變化表示，其是在10分鐘內(nèi)關(guān)于酶反應(yīng)所記錄的熒光-時間線性直線的斜率。用不含抑制劑樣品的速率減去抑制劑樣品的速率 然后除以不含抑制劑樣品的速率并乘以100%計算出抑制％。進行該測定來研究明膠A抑制MMP-9活性的潛力。在該研究中，MMP-9的濃度 為360 μ U/測定(在Tricine緩沖液中)，所用的明膠為明膠A(Sigma目錄號1890-50G， 標(biāo)簽號014K0077，來自豬皮膚的酸提取物)，所用的底物為MMP-2/MMP-9熒光探針底物 I (Calbiochem 目錄號 44215，標(biāo)簽號 B47246 ；肽結(jié)構(gòu)=DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Ar g-OH) 20 μ M/測定。明膠A在Tricine緩沖液中表現(xiàn)出對MMP-9活性的劑量響應(yīng)性抑制。 從0.01%開始到最高0.2% (w/v)，觀察到了抑制作用的成比例增加。在0.2%后，抑制作 用停止增加。在圖1中以圖解的方式描述了該結(jié)果。
實施例2 進行該實驗來研究明膠A與各種粘滑劑聚合物一起使用時抑制MMP-9活性的潛 力。為此，選擇在實施例1中產(chǎn)生約59 %抑制作用的0. 1 % w/v明膠Α。匪P-9 = Calbiochem 目錄號444231 ；標(biāo)簽號B56458 ；人嗜中性粒細(xì)胞。所用活性為200 μ U/測定。明膠=明 膠A。Sigma目錄號1890-50G，標(biāo)簽號014Κ0077(來自豬皮膚的酸提取物)。測定緩沖液 =50mM Tricine,pH 7. 5，含 0. 2M NaCl, IOmM CaCl20 底物=MMP-1/MMP-9 熒光探針底物。 Calbiochem目錄號44221，標(biāo)簽號B54710。MWt，1077. 2 ；測定中的濃度為1 μ M。肽結(jié)構(gòu)= DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)_NH2。Ex，365nm ；Em,450nm。該研究的結(jié)果表明，濃度為0.1% w/v的明膠A與0.18% w/v HP-瓜爾膠、0.3% w/v HPMC和0. 5% w/v CMC的組合能夠分別對MMP-9產(chǎn)生74. 8%,71. 8%和79. 的抑制 作用，如圖2所示。實施例3 下一系列的實驗研究了當(dāng)將明膠-A摻入到兩種代表性的人工淚液中時對MMP-9 活性的抑制能力。為此，選擇了稱為Systane和新淚然(TearsNaturale II)的兩種人工淚 液。對于該系列的實驗，將從0. 01%至0. 20% (w/v)的各種濃度的明膠-A摻入到兩種市售 的Systane和新淚然(Tears NaturaleII)溶液中。使用與實施例2所述相同的酶和底物 進行測定，并采用相同的方法。該實驗的結(jié)果表明，當(dāng)將明膠-A摻入到Systane和新淚然 (TearsNaturale II)溶液中時，其表現(xiàn)出對MMP-9活性的劑量響應(yīng)性抑制，當(dāng)在Systane中 時，0.01% w/v及以上的濃度可以產(chǎn)生大于50%的抑制作用；當(dāng)在新淚然(Tears Naturale II)中時，0.05% w/v及以上的濃度可以產(chǎn)生大于50%的抑制作用。在圖3和4中以圖解 的方式描述了這些實驗結(jié)果。實施例4 進行該實驗來研究明膠A對細(xì)菌膠原酶的抑制作用。細(xì)菌膠原酶是一種外毒素， 其在細(xì)菌性疾病的發(fā)病機理中協(xié)助破壞細(xì)胞外結(jié)構(gòu)。為了進行實驗，在含有0.2M NaCl, IOmM CaCl2^ZnSO4 和 Brij-35 的 50mM Tricine 緩沖液(pH 7. 5)中制備從 0. 05%至 0. 8% (w/v)的各種濃度的明膠Α。通過用熒光譜儀在25°C下記錄熒光變化10分鐘來測定細(xì)菌膠 原酶的活性?；钚杂妹糠昼姷臒晒庾兓瘉肀硎?。細(xì)菌膠原酶和底物I的濃度分別為20單 位/測定和20 μ M/測定。所用的膠原酶是Clostridop印tidase (Sigma目錄號C-7657 ；標(biāo) 簽號107H8632)。所用的明膠是明膠A (Sigma目錄號1890-50G，標(biāo)簽號014K0077，來自豬皮 膚的酸提取物)。所用的底物是MMP-2/MMP-9熒光探針底物I (Calbiochem目錄號44215，標(biāo)簽號B47246 ；肽結(jié)構(gòu)=DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)。結(jié)果表明，需要濃度在 0.4% w/v以上的明膠A來對細(xì)菌酶產(chǎn)生50%以上的抑制作用，而濃度為0. 05%至0. (w/v)的明膠A則可以輕易地對MMP-9產(chǎn)生50%以上的抑制作用。因此，明膠A對細(xì)菌膠 原酶的抑制似乎并不像對MMP-9那樣有效。在圖5中以圖解的方式描述了該實驗的結(jié)果。實施例5 該實驗研究了當(dāng)將明膠-A摻入到人工淚液產(chǎn)品中時對細(xì)菌膠原酶的抑制能力。 對于該系列實驗，將從0. 05%至0. 25% (w/v)的各種濃度的明膠-A摻入到市售的Systane 和新淚然(Tears Naturale II)溶液中。使用與實施例4所述相同的方法和底物進行測 定。結(jié)果表明，當(dāng)將明膠-Α摻入到人工淚液產(chǎn)品Systane和新淚然(Tears Naturale II) 中時，也可以對細(xì)菌膠原酶產(chǎn)生劑量響應(yīng)性抑制。但是，其效力較低，在兩種人工淚液中，均 需要濃度大于0. 25% w/v的明膠來產(chǎn)生50%的抑制作用，在圖6和7中以圖解的方式描述 了這些實驗結(jié)果。實施例6 進行該實驗來研究明膠A與各種粘滑劑聚合物一起使用時抑制細(xì)菌膠原酶活性 的潛力。為此，將濃度為0. 1 % w/v的明膠A與HP-瓜爾膠、CMC和HPMC組合。使用與實施 例4所述相同的方法和底物進行測定。結(jié)果表明，與0. 18% HP-瓜爾膠組合產(chǎn)生了 51%的 抑制，而與0. 3% HPMC和0. 5% CMC組合僅分別產(chǎn)生了 24%和21 %的抑制作用，結(jié)果如圖 8所示。實施例7 這些實驗研究了明膠A提供干燥保護和增強人角膜上皮細(xì)胞活力的能力。在這些 研究中，用本文所述的Alamar Blue法測定CEPI 17人角膜上皮細(xì)胞。使人角膜上皮細(xì)胞系 (CEPI 17, Alcon Laboratories Inc.)在96孔微量培養(yǎng)板中生長至匯合。從試驗孔中除去 培養(yǎng)液并加入100 μ 1各種試驗溶液。含有培養(yǎng)液的對照孔保持不變。將板子放回保溫箱中 60分鐘。保溫后，將所有的孔抽取并用200 μ 1每孔的HyQ緩沖液(改良的Dulbecco磷酸 鹽緩沖液，Hyclone 目錄號 SH30028. 02)沖洗一次。將 Alamar Blue (Biosource，DALl 100) 在HyQ中進行1/10稀釋并將100 μ 1加入至各孔中并在37°C進行保溫。保溫4小時后，將板 子用激發(fā)光設(shè)定在560nm并且發(fā)生光設(shè)定在590nm的熒光微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(FLxSOO型， Bio-Tek Instrument)讀數(shù)。通過將樣品的平均熒光除以對照的平均熒光并乘以100%來 計算細(xì)胞活力％。為了測定干燥保護作用，采用類似方法，該方法包括15分鐘的預(yù)保溫期和30分 鐘的干燥期。在預(yù)保溫后，將除對照孔之外的所有試驗孔進行抽吸。將對照孔用Parafilm 覆蓋。將板子放在向下吹氣流的罩子中30分鐘以對細(xì)胞進行干燥。干燥后，將所有的孔用 200 μ 1 HyQ洗滌一次。用在細(xì)胞活力測定法中所述的Alamar Blue測定法分析細(xì)胞的活 力。通過將樣品的平均熒光除以對照的平均熒光并乘以100%來計算干燥保護。該實驗的結(jié)果表明，將明膠A摻入各種人工淚液產(chǎn)品、包括Systane、新淚然 (Tears Naturale II)和GenTeal Mild中時，似乎對細(xì)胞提供了更好的干燥保護并增強了 細(xì)胞的活力。在圖9中以圖解的方式給出了該實驗結(jié)果。
實施例8 進行該實驗來研究α-2巨球蛋白抑制MMP-9活性的能力。通過用熒光譜儀在25°C下記錄熒光變化10分鐘來測定MMP-9的活性。活性用每分鐘的熒光變化來表示。使用 360 μ U/測定的MMP-9 (Calbiochem目錄號444231，標(biāo)簽號Β56458 ；人中性白細(xì)胞)。α 2-巨 球蛋白(Sigma目錄號Μ-6159，標(biāo)簽號118Η7606 ；來自人胎盤)。所用底物為MMP-2/MMP-9 熒光探針底物IlO μ M/測定(Calbiochem目錄號44215，標(biāo)簽號Β47246 ；肽結(jié)構(gòu)=DNP-Pr o-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)。結(jié)果表明α -2-巨球蛋白以劑量響應(yīng)的方式抑制ΜΜΡ-9 活性。在圖10中以圖解的方式描述了該實驗結(jié)果。實施例9 進行該實驗來測定已知大小的重組明膠抑制ΜΜΡ-9活性的效果。通過用熒光譜儀 在25°C下記錄熒光變化10分鐘來測定MMP-9的活性。活性用每分鐘的熒光變化來表示。使 用濃度為 200 μ U/ 測定的在 Tricine 緩沖液(50mMTricine，pH 7. 5，含有 0. 2M NaClUOmM CaCl2)中的MMP-9 (Calbiochem目錄號444231，標(biāo)簽號B56458 ；人中性白細(xì)胞)。所用的明 膠為重組人明膠8. 5kD (FibroGen，標(biāo)簽號04AE001R-01)。所用底物為MMP-1/MMP-9熒光探 針底物(Calbiochem 目錄號 44221，標(biāo)簽號 B54710 ；肽結(jié)構(gòu)=DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -H is-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2 ；Ex 365nm ;Em450nm)。用量 1.0 μ M/測定。在該測定中，需要 0.15%至0.25% (w/v)的重組人明膠8. 5kD來獲得50%以上的抑制作用。在圖11中以圖 解的方式描述了該實驗結(jié)果。實施例10 進行該實驗來測定I型重組人膠原抑制MMP-9活性的效果。通過用熒光譜儀在 25°C下記錄熒光變化10分鐘來測定MMP-9的活性。活性用每分鐘的熒光變化來表示。使 用濃度為 200 μ U/ 測定的在 Tricine 緩沖液(50mMTricine，pH 7. 5，含有 0. 2M NaClUOmM CaCl2)中的MMP-9 (Calbiochem目錄號444231，標(biāo)簽號B56458 ；人中性白細(xì)胞)。所用的膠 原為I型重組人膠原(FibroGen，標(biāo)簽號04AE001R-01)。所用底物為MMP-1/MMP-9熒光探 針底物(Calbiochem 目錄號 44221，標(biāo)簽號 B54710 ；肽結(jié)構(gòu)=DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -H is-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2 ；Ex 365nm ;Em450nm)。用量 1.0 μ M/測定。在該測定中，需要 0.03%至0.04% (w/v)的I型重組人膠原來獲得50%以上的抑制作用。在圖12中以圖解 的方式描述了該實驗結(jié)果。實施例11 以下是本發(fā)明的兩種人工淚液的實施例。化合物量％ (w/v)_Systane新淚然(Tears Naturale II)_明膠0. 10. 1硼酸1. 0η/ρ硼酸鈉η/ρ0. 35HPMCη/ρ0. 3羥丙基瓜爾膠 0. 18η/ρ丙二醇0.3η/ρPEG-4000.4η/ρ
右旋糖酐70η/ρ0.1氯化鈉0.10.6氯化鉀0. 120. 12氯化鈣(二水合物)0.0053η/ρ氯化鎂(六水合物)0.0064η/ρ聚季銨鹽-10. 0010.001氫氧化鈉/鹽酸 至ρΗ7.0至ρΗ7·4純凈水適量至100% 適量至100%
權(quán)利要求
一種局部用眼科組合物，其在眼科可接受的載體中含有蛋白酶抑制性肽底物。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其還含有半乳甘露聚糖。
3.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物能夠抑制蛋白酶MMP-9。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的組合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物選自明膠、a-2-巨球 蛋白、卵巨球蛋白、膠原和酪蛋白。
5.權(quán)利要求2所述的組合物，其中的半乳甘露聚糖包括HP-瓜爾膠。
6.治療干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用含有有效量的蛋白酶抑制性肽底物的組 合物。
7.治療干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用含有抑制MMP-9有效量的蛋白酶抑制性 肽底物的組合物。
8.權(quán)利要求6或7所述的方法，其中的蛋白酶抑制性肽底物選自明膠、a-2-巨球蛋 白、卵巨球蛋白、膠原和酪蛋白。
9.治療干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用含有有效量的蛋白酶抑制性肽底物和半 乳甘露聚糖的組合物。
10.治療干眼病的方法，其包括向眼睛表面施用MMP-9抑制量的權(quán)利要求1所述的組合物。
11.權(quán)利要求1所述的組合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物以大于約0.05%并且小于 約0. 25%的量存在。
12.權(quán)利要求11所述的組合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物是以大于約0.05% w/v的量存在的明膠。
13.權(quán)利要求11所述的組合物，其中的蛋白酶抑制性肽底物是以大于約0.03% w/v的量存在的膠原。
14.權(quán)利要求11所述的組合物，其中的底物是以大于約0.015%w/v的量存在的 a-2-球蛋白。
15.權(quán)利要求1、2、3、4、5或11任意一項所述的組合物，其還包含選自抗生素、抗炎劑和 免疫抑制劑的治療劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有蛋白酶抑制性肽底物的眼科組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶抑制性肽底物是明膠。該組合物還可含有半乳甘露聚糖。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，該組合物含有明膠、半乳甘露聚糖和硼酸鹽。本發(fā)明還描述了施用這些組合物抑制蛋白酶MMP-9的方法、向眼睛局部施用該組合物、特別是治療干眼病的方法。
文檔編號A61K8/55GK101861187SQ200880116145
公開日2010年10月13日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者D·L·梅多斯, 洪博學(xué) 申請人:愛爾康研究有限公司