專利名稱：：抗rsvg蛋白抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可與呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白所包含的具有重要功能的表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗體，當(dāng)給予人類對象時其免疫原性很小。這些抗體可用于增強(qiáng)人類對象抗RSV感染的耐受性以及降低已感染的個體體內(nèi)的感染水平或減輕RSV感染所引起的癥狀。背景領(lǐng)域從全球來說，其中包括美國、歐洲、澳大利亞和日本，長期以來RSV感染都是一個大問題。對于早產(chǎn)兒、幼兒和老年人來說，RSV感染尤其麻煩，對于那些免疫系統(tǒng)功能下降的成年人來說也是如此。據(jù)估計，1歲以下的兒童中至少約有2/3，1-4歲的幾乎所有兒童都至少感染過一次RSV，其中大多數(shù)都會康復(fù)，無需繼續(xù)醫(yī)學(xué)觀察。然而，5-10%的患者會發(fā)生慢性嚴(yán)重感染，這個因素被認(rèn)為可在后期誘發(fā)兒童出現(xiàn)喘鳴和哮喘樣癥狀。RSV有兩個主要的表面糖蛋白，F(xiàn)和G。目前唯一上市的抗RSV單克隆抗體只被批準(zhǔn)用于預(yù)防早產(chǎn)兒感染RSV，是抗F蛋白的抗體。該抗體的名稱是帕利珠單抗(Synagis,MedImmune制造)，其作用廣譜，因為不同病毒株之間的F蛋白的序列是保守的。但是，G蛋白是相當(dāng)易變的，除了中央“CX3C”區(qū)之外，該區(qū)在近100個測序的病毒株中幾乎不發(fā)生變異。該區(qū)包含一個已被證明可與CX3C趨化因子(fractalkine)受體相互作用的基序。這種相互作用被認(rèn)為是導(dǎo)致RSV感染病程延長的原因，其機(jī)制是通過抑制抗病毒的有效免疫反應(yīng)Tripp，R.A等，NatureImmunology(2001)2:732_738。研究證明，該區(qū)Toll-樣受體4的拮抗劑，這被認(rèn)為也會抑制有效免疫反應(yīng):Polack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2005)1028996-9001；Shingai等，Int，1Immunology(2008)電子版，7月8日。人們起初試圖通過疫苗免疫的方式預(yù)防RSV感染，結(jié)果適得其反。用甲醛滅活的RSV或用RSVG糖蛋白作為疫苗免疫以后，疾病和肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥癥狀加重，這是由上面所提到的G蛋白上被稱為CX3C區(qū)的保守序列引起的，該區(qū)可模擬趨化因子CX3C趨化因子的作用。(Haynes，L.M等，J.Virol.(2003)77:9831-9844.)。利用抗G蛋白的抗體誘導(dǎo)獲得性免疫通常被認(rèn)為不現(xiàn)實，因為該蛋白的序列在不同病毒株之間缺乏保守性后來同一研究小組證實，RSV感染或疫苗免疫引起的抗G蛋白抗體反應(yīng)和G蛋白與CX3C趨化因子CX3C受體的結(jié)合被抑制以及和RSVG蛋白介導(dǎo)的白細(xì)胞趨化作用的調(diào)節(jié)有關(guān)(Harcourt,J.L等，J.I.D.(2004)1901936-1940)，這種結(jié)合被抑制后會對T細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生不良影響(Harcourt,J.L等，J.Immunol.(2006)176:1600-1608)。最近研制的疫苗研究已避免了甲醛固定疫苗相關(guān)疾病發(fā)生惡化的情況，但是研究發(fā)現(xiàn)新疫苗所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)很快就會消退(數(shù)周到數(shù)月)，這與對天然RSV的免疫記憶能力差是一致的Yu等，J.Virol.(2008)82:2350-2357。這種病毒與其他病毒不同，通常會重復(fù)感染。G蛋白的免疫抑制特性可能是產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因?？笹蛋白的單克隆抗體已有20多年的歷史。Anderson，L.J.等，J.Virol.(1988)62:4232-4238描述了F和G蛋白單克隆抗體(mAb)混合物以及單一mAb中和RSV的能力。后來Sullender，W.，Virol.(1995)209:70_79通過抗原性分析研究了結(jié)合G蛋白相關(guān)的mAb，被稱為131-2G。研究發(fā)現(xiàn)，這個抗體既可以結(jié)合A型RSV，也可以結(jié)合B型RSV，這是RSV的兩個主要病毒株。另外，Mekseepralard,C.等，J.Gen.Virol.(2006)87:1267_1273總結(jié)了較早發(fā)表的文章，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予抗F和G蛋白的抗體可在嚙齒類動物模型中產(chǎn)生抗實驗性感染的獲得性保護(hù)作用。這些文章包括Routledge等，J.Gen.Virol.(1988)69293-303；Stott,E.J.等，J.Virol.(1986)60:607_613；Taylor,G.等，Immunol.(1994)52:137_142；以及Walsh,Ε.Ε.等，Infect.Immun.(1984)43:756-758。在后續(xù)文章中，Mekse印ralard等人發(fā)現(xiàn)抗G蛋白的特異性單克隆抗體(1C2)需要糖基化才能在體外存在補(bǔ)體的情況下或者在用于小鼠體內(nèi)時中和病毒。作者注意到G蛋白的173-186位氨基酸是保守的，1C2就是抗這個保守區(qū)的；但是制備無免疫原性抗體的方法，即將小鼠Fab嵌合到人Fc區(qū)，還是相當(dāng)不成熟的。另外，Corbeil，S.等，Vaccine(1996)14:521_525證明，補(bǔ)體系統(tǒng)參與用小鼠單克隆抗體18A2B2被動免疫小鼠再感染RSV之后產(chǎn)生的保護(hù)作用，盡管這種抗體在體外沒有顯示出中和能力。PCT出版物WO00/43040描述了抗P物質(zhì)抗體在減輕RSV感染相關(guān)的呼吸道炎癥中的應(yīng)用。P物質(zhì)是一種已知的促炎癥反應(yīng)介導(dǎo)因子，給予RSV的G蛋白可提高其產(chǎn)生量，無G蛋白或中央保守區(qū)帶有功能缺陷點突變的RSV突變株缺乏P物質(zhì)的產(chǎn)生=Haynes等，JVirol(2003)77:9831_9844。美國專利出版物2006/0018925描述了能夠阻斷G蛋白CX3C區(qū)與其受體相互作用的抗體和小肽，并要求了二者的權(quán)利。這些組合物被認(rèn)為可用于調(diào)節(jié)RSV感染和誘導(dǎo)免疫。盡管該專利也建議利用人源化的小鼠抗體來證明這些抗體的治療和預(yù)防價值，但是實際上這種人源化形式的抗體還未被制備和描述出來。PCT出版物W02007/101441描述了一種用于治療RSV感染的重組多克隆抗體，被稱為Symphogen。重組多克隆抗體由分離自人血清的不同單克隆抗體組成。該出版物的表5描述了據(jù)說可與位于A亞型RSVG蛋白的164-176位氨基酸位置上的“保守區(qū)”結(jié)合的12種單克隆抗體。根據(jù)檢測結(jié)果，其中5種抗體與G蛋白有親和性，親和性的大小在100-500pM范圍內(nèi)。這些抗體中有兩個抗體經(jīng)蝕斑減少中和試驗(PRNT)檢測發(fā)現(xiàn)具有中和能力；其中一個的EC5tl值約為2.5μg/ml，另一個根本沒有顯示出中和特性。
發(fā)明內(nèi)容從最近感染過RSV的人類供者中已經(jīng)鑒定出了可與RSVG蛋白而不是F蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體，其中包括與A型和B型病毒株都發(fā)生免疫反應(yīng)的那些抗體。另外，最初由Anderson等，J.Virol.(1988)62:4232_4238描述的小鼠抗G蛋白抗體經(jīng)過改造后可使其在給予人類對象時產(chǎn)生免疫排斥的幾率達(dá)到最低。本發(fā)明的抗體可用于治療藥物，也可用于提高人類對象對RSV的耐受性。更特殊的是，抗A亞型G蛋白160-176位內(nèi)保守基序的抗體是有治療效果的，可將已感染的對象體內(nèi)的病毒清除，并且能夠減輕RSV感染所導(dǎo)致的呼吸道炎癥，以及可用于預(yù)防。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及能結(jié)合A型RSVG蛋白約160-176位內(nèi)的表位的單克隆抗體或其免疫反應(yīng)性片段，該抗體在給予人類對象時免疫原性很小。這些抗體在標(biāo)準(zhǔn)蝕斑形成試驗中顯示出中和RSV的中和能力，在這種試驗中的EC5tl<500ng/ml，優(yōu)選<200ng/ml，更優(yōu)選的是<lOOng/ml。本發(fā)明的抗體還與RSV-A2的G蛋白有親和性，親和性<InM，優(yōu)選<500pM，更優(yōu)選的是<ΙΟΟρΜ。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體可與RSVG蛋白所包含的CX3C趨化因子基序的30個以內(nèi)的殘基結(jié)合，或者直接與趨化因子基序的至少一部分結(jié)合，該區(qū)在RSV的多個病毒株之間具有高度的氨基酸一致性。CX3C趨化因子基序處于RSV-A2病毒株的約182-186位氨基酸以及其他病毒株G蛋白的相應(yīng)位置上。研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體可與之結(jié)合的相關(guān)區(qū)包含在RSV-A2G蛋白的160-176位殘基之內(nèi)或其他病毒株G蛋白的相應(yīng)位置內(nèi)。這個區(qū)在A病毒株內(nèi)是高度保守的，A和B病毒株之間也僅有幾個氨基酸的差異。一個特別保守的區(qū)的序列是HFEVFNFVPCSIC，處于RSVA2的164-176位置內(nèi)。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體可結(jié)合包含序列FEVFNF或序列VFNFVPCSIC的表位。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體與保守氨基酸的這個區(qū)有免疫反應(yīng)性，因此與該病毒的A型和B型病毒株的G蛋白有免疫反應(yīng)性，因而也與大多數(shù)病毒株的G蛋白有免疫反應(yīng)性。為了能用于本發(fā)明的治療RSV感染或增強(qiáng)對RSV的耐受性的方法，本發(fā)明的單克隆抗體或其片段可與A型和B型的多個病毒株有免疫反應(yīng)性，單個單克隆抗體也足以產(chǎn)生理想的效果。另外，需要治療的對象或者需要產(chǎn)生耐受性的對象可接受多種單克隆抗體，特別是當(dāng)方案中的一種抗體與A型病毒株具有更高的反應(yīng)性，而另一種抗體與B型病毒株有更高的反應(yīng)性時。本發(fā)明還包括用于預(yù)防或治療的藥物組合物，其中包括降低炎癥反應(yīng)，該組合物包含本發(fā)明的單個抗體或免疫反應(yīng)性片段作為活性劑，或者本發(fā)明的不超過兩個抗體或片段作為活性劑。本發(fā)明的其他方面包括使用抗體治療人類對象RSV感染或誘導(dǎo)這些對象對RSV耐受的方法。本發(fā)明的單克隆抗體可利用重組方法制備，因此本發(fā)明還包括用于制備單克隆抗體的重組材料以及用于制備這些抗體的細(xì)胞系或永生細(xì)胞以及非人多細(xì)胞有機(jī)體或其細(xì)胞或微生物細(xì)胞。在一個實施方式中，來源于人類對象的細(xì)胞被改造成“永生化”的形式，其中這些細(xì)胞已經(jīng)過修飾使其分泌抗體的時間足夠長，從而能被鑒定并克隆相關(guān)的編碼序列。附圖簡述圖1顯示的是直方圖，說明了人類對象體內(nèi)抗各種RSV抗原的抗體以ppm計的頻度。理想的非病毒株依賴性的抗G表型(Gab)是相當(dāng)稀有的，總體上看約占百萬分之十(ppm)，某些對象甚至低于lppm?！盎旌稀笔侵缚贵w既結(jié)合F又結(jié)合G;F和G沒有序列同源性，結(jié)合可能是因為它們有相同的糖鏈決定簇。圖2A是RSVG蛋白的示意圖，圖中顯示的是CX3C區(qū)和保守二硫鍵的位置。圖例對所有病毒株都一樣，盡管不同病毒株之間位置的特殊編號可能有些許不同。圖2B顯示的是RSV感染對象來源的血清抗體與一組重疊的12-聚RSVG蛋白來源的肽的結(jié)合情況，說明中央保守區(qū)的免疫原性很低。圖2C顯示的是一組超過75個RSV病毒株G蛋白功能位置的多態(tài)性頻度，說明中央保守區(qū)是非常保守的，在替代剪接位點可形成可溶性形式的G蛋白。圖3顯示的是針對重疊序列肽陣列的示例性鼠單克隆抗體(131-2G)的探測結(jié)果。該工作鑒定出了mAb結(jié)合的表位。在所描述的例子中，表位位于CX3C基序的30個殘基之內(nèi)。圖4A-4D圖A和圖B分別代表兩個供者血樣的總結(jié)圖。圖A顯示的是具有有用的Ga/Gb交叉反應(yīng)性克隆頻率的供者。圖B顯示的是沒有該特征的供者。圖中的各點代表與三個探針的相對結(jié)合，其中的探針用于單個克隆分泌抗體足跡。圖C是單一EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的分泌蛋白足跡的定量模式。圖D顯示的是轉(zhuǎn)化抗體基因的HEK193細(xì)胞的4個子代細(xì)胞的模式，其中抗體基因來源于圖C的細(xì)胞。這個模式與圖C中的模式一致，分析的精確度根據(jù)圖D的重復(fù)數(shù)據(jù)定義。圖5A-5B顯示的本發(fā)明的代表性抗體的重鏈(A區(qū))和輕鏈(B區(qū))的序列。圖6A-6F顯示的是確定本發(fā)明兩種抗體的親和力的Biacore結(jié)果。如圖E和圖F所示，抗體3D3可結(jié)合G蛋白，且未顯示恰好可檢測的關(guān)閉率。圖A和圖D顯示的是抗體與傳感器表面的結(jié)合。圖B和圖E顯示的是當(dāng)Ga蛋白流過表面時傳感器信號增強(qiáng)，Ga蛋白可被結(jié)合抗體捕獲，當(dāng)用緩沖液洗滌表面時結(jié)合的Ga蛋白從表面去吸附，此時信號減弱。同樣，圖C和圖F顯示了Ga蛋白的開放率(on-rate)和關(guān)閉率(off-rate)。圖7是本發(fā)明的各種抗體與SynagisF蛋白結(jié)合抗體相比較的結(jié)合曲線，結(jié)果是利用活病毒包被的微孔板通過ELISA試驗確定的。圖8是X軸上G蛋白的親和力對Y軸上與病毒的結(jié)合能力所做的曲線圖。兩種能力是相關(guān)聯(lián)的，雖然3D3與活病毒的親和力略低于預(yù)測值。圖9A和9B顯示的是幾種抗體與A2和A5病毒株結(jié)合能力的比較。圖10顯示的是中和試驗的結(jié)果。結(jié)果以蝕斑數(shù)對抗體μg值作圖的方式顯示。圖11顯示的是本發(fā)明的抗體3G12與Synagis在中和RSV病毒株B的能力方面的比較。圖12顯示的是本發(fā)明的兩種抗體與Synagis商用抗體在預(yù)防活性方面的比較。圖13A-13C顯示的是mAb131-2G在RSV感染后小鼠模型中的治療效果(在感染后第3天治療)，其中包括病毒載量(A區(qū))以劑量依賴性的方式降低，以及顯示肺部炎癥減輕的其他指標(biāo)NK細(xì)胞和PMN細(xì)胞(B區(qū))以及干擾素Y(IFNY)(C區(qū))。圖14顯示的是以低劑量的3G12、3D3或Synagis抗體治療后小鼠模型內(nèi)病毒滴度的時程，說明了本發(fā)明的高親和力抗體的巨大優(yōu)勢。圖15是根據(jù)抗體對RSV感染小鼠肺內(nèi)RSV拷貝數(shù)的效應(yīng)而繪制的劑量/效應(yīng)曲線，其中小鼠在感染后第3天進(jìn)行治療。圖16顯示的是Synagis、3D3和3G12在感染后期以及感染后第3天進(jìn)行治療后降低病毒載量的能力比較。圖17顯示的是對照抗體、抗F抗體和抗G抗體對RSV感染小鼠肺內(nèi)的BAL細(xì)胞的效應(yīng)。在感染后第3天進(jìn)行治療。圖18A和18B顯示的是當(dāng)感染后第3天給予抗體時，抗GmAb的F(ab，)2免疫特異性片段在抑制RSV感染小鼠的炎癥方面與完整mAb—樣有效，但是卻不能降低病毒載量。圖19A-19C顯示的是在給予抗體后的不同時間點，從預(yù)防性給藥(_1天)到感染后第3天和第5天，抗GmAb對BAL內(nèi)IFNγ的影響。圖20顯示的是感染RSV的老年患者體內(nèi)的抗RSVG蛋白中央保守區(qū)的抗體滴度。根據(jù)臨床體征和癥狀的嚴(yán)重程度來篩選患者，分為重度或輕度。疾病嚴(yán)重的患者檢測不到抗中央保守區(qū)的抗體。實現(xiàn)本發(fā)明的樽式在本文中，術(shù)語“治療”是指減輕已感染RSV的對象體內(nèi)的病毒負(fù)擔(dān)，或者緩解該患者的疾病癥狀。這種癥狀包括支氣管炎、呼吸道炎癥、肺阻塞和呼吸困難。術(shù)語“賦予耐受性”是指預(yù)防性效應(yīng)，其中一旦感染RSV，病毒感染的嚴(yán)重程度至少可降低?！坝郎?xì)胞”是指傳代次數(shù)明顯高于未修飾原代分離細(xì)胞時還能存活的細(xì)胞。當(dāng)用于本發(fā)明時，“永生化”并不一定意味著細(xì)胞能在一個很長的時期內(nèi)持續(xù)分泌抗體，只表示細(xì)胞的存活時間長于原代細(xì)胞培養(yǎng)物。抗體分泌的持續(xù)時間只需足以完成其鑒定和編碼核苷酸序列的回收就可以。術(shù)語“給予人類對象時免疫原性很低”是指給予人時的反應(yīng)與人抗體或人源化抗體給予這類人時產(chǎn)生的反應(yīng)類似。已知人抗體或人源化抗體可在5-10%的被治療人群內(nèi)激發(fā)反應(yīng)。即使抗體來源于人也會發(fā)生這種情況，因為所激發(fā)的免疫反應(yīng)中存在一定水平的背景“噪音”。免疫反應(yīng)可以是體液免疫，也可以是細(xì)胞免疫，或者二者都存在。更特別的是，研究發(fā)現(xiàn)在這部分個體中細(xì)胞因子的水平升高。術(shù)語“RSVG蛋白的保守區(qū)”是指包含CX3C區(qū)任何一側(cè)的50個氨基酸以內(nèi)的氨基酸序列，優(yōu)選30個氨基酸，更優(yōu)選的是20個氨基酸，在圖2Α中說明了特殊病毒株的保守區(qū)。保守區(qū)大多位于G蛋白CX3C特異區(qū)的上游部分。因此，以病毒株Α2的RSVG蛋白為例來說，可用于本發(fā)明抗體的保守區(qū)從約160位殘基開始延伸到188位殘基，優(yōu)選160-176。本發(fā)明的抗體有多種理想特性。首先，它們能與多種RSV病毒株來源的G蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，通常與A型和B型病毒株來源的G蛋白都能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。其次，它們與G蛋白有相當(dāng)高的親和力，其中有些抗體的親和力范圍<2ρΜ。因此，本發(fā)明的抗體的親和力至少ΙΟηΜ，優(yōu)選InM，更優(yōu)選的是500pM，更優(yōu)選的是100pM、50pM、IOpM或ΙρΜ，以及這些優(yōu)選范例點之間的所有數(shù)值。Synagis:是一種抗F蛋白的商品化抗體，其親和力約為5nM。據(jù)估計，具有較高親和力的抗F蛋白抗體NumaXTM(莫它維珠單抗(motavizumab))的親和力約為50pM。本發(fā)明的抗體顯示出了作為治療藥物的優(yōu)越能力，并且顯示能夠在感染高峰時降低肺內(nèi)的病毒計數(shù)。它們在感染按照自有時程發(fā)展時也顯示出了這種能力。這一點對于RSV感染恢復(fù)期的對象來說尤其重要，因為此時對象依然能夠繼續(xù)散發(fā)病毒，因此能夠在臨床治療后感染其他對象。抗體及其片段也可用于治療感染癥狀，其中包括肺內(nèi)的炎癥。本發(fā)明的抗體通過兩種典型方式獲得。在一種方法中，首先測定現(xiàn)有的上述單克隆抗體131-2G的序列，已知該抗體與G蛋白的保守區(qū)是免疫反應(yīng)性的，然后通過將人恒定區(qū)與經(jīng)過修飾的人可變區(qū)(重鏈和輕鏈)融合在一起。根據(jù)與131-2G抗體可變區(qū)的高同源性來選擇可變區(qū)，然后進(jìn)行修飾以插入131-2G的超級可變區(qū)氨基酸。一般來說，當(dāng)可以確定如何正確選擇替代氨基酸時使用這種人源化方法。對于131-2G來說，原始雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)一個以上的輕鏈，因此需要確定實際上哪一個輕鏈負(fù)責(zé)結(jié)合RSV保守基序。本發(fā)明的發(fā)明者已對此進(jìn)行了確認(rèn)，在一個實施方式中，本發(fā)明抗體的例子是人源化形式的mAbl31-2G0在另一種方法中，本發(fā)明的抗體回收自感染RSV的人類供者，使用的方法為US7，413，868,PCT出版物WO2005/045396和WO2008/008858所描述的專利性CellSpot方法，本文已納入作為參考。在這個方法中，共分析了40例RSV感染供者的樣品，每個血樣得到約500，000個抗體產(chǎn)生細(xì)胞。因此，共分析了約20，000,000個不同的B細(xì)胞，檢測它們是否能夠分泌G蛋白保守區(qū)特異性的抗體。其中只有約10%的供者具有可用頻度的Ga/Gb特異性克隆(即，病毒株非依賴性的)，即使最高頻度的樣品，這種克隆的含量也只有約1/50，000細(xì)胞?？傊?，理想細(xì)胞的頻度約為0.003%，這種頻度太低，無法通過標(biāo)準(zhǔn)方法回收，但是利用CellSpot可以很容易地做到。圖1顯示的是24位供者對RSV抗原的反應(yīng)性光譜。如該圖所示，即使體內(nèi)的抗體與A和B病毒株來源的G蛋白都有交叉反應(yīng)的那些個體，這些抗體的發(fā)生率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于與F蛋白或與Ga或Gb單獨有免疫反應(yīng)性的抗體。有奇高數(shù)量的克隆既識別F蛋白又識別G蛋白(被稱為“混合物”)，這可能是因為它們都識別共有的糖類決定簇。這種抗糖類抗體的親和力通常都很低，因此被排除在進(jìn)一步考慮之外。這個隊列的供者體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的最高親和力的抗體來自一個供者，其親和力為ΙρΜ，該供者的Ga/Gb特異性克隆頻度極低，約為lppm。也就是說，如果不全面篩選所有供者的所有細(xì)胞根本不可能發(fā)現(xiàn)這個極佳克隆。為了執(zhí)行這種篩選，用EB病毒使B細(xì)胞永生化，并根據(jù)上述方法(參見實施例2的詳細(xì)描述)進(jìn)行評價。鑒定出成功的B細(xì)胞，獲得編碼已鑒定的單克隆抗體的核苷酸序列并測序。然后通過重組方法操作這些序列，用于在哺乳動物細(xì)胞系內(nèi)生產(chǎn)抗體。G蛋白功能的一個重要方面在于分泌形式的蛋白質(zhì)s(G)，是通過50位殘基附近的另一剪接位點產(chǎn)生的。病毒經(jīng)過改造后不表達(dá)s(G)會導(dǎo)致肺浸潤性細(xì)胞的水平下降(Maher等，MicrobesInfect.(2004)6:1049_1055)。與此相反，用s(G)刺激小鼠可提高IL-5的產(chǎn)生和肺嗜酸性粒細(xì)胞增多(Johnson等，JVirol(1998)72=2871-2880)相應(yīng)的，抑制s(G)的活性對于有效治療RSV是非常重要的。要達(dá)到此目的需要高親和力的抗體，這在本領(lǐng)域是大家所熟知的(例如，美國專利7，083，950)。由于中央保守區(qū)與s(G)作為免疫調(diào)節(jié)因子的功能有特殊關(guān)系，因此抗S(G)的有效抗體應(yīng)該以此基序為靶位。我們在檢測RSV感染對象來源的人B細(xì)胞群時，我們無偏向地搜索了能結(jié)合A病毒株和B病毒株來源的G蛋白的抗體(Ga/Gb交叉反應(yīng)性抗體)。由于檢測是全面的(40例對象，每例檢測了約500，000B細(xì)胞)，一個明顯的現(xiàn)象是所有能結(jié)合適于作圖的線性表位的Ga/Gb交叉反應(yīng)性抗體都能識別中央保守區(qū)內(nèi)彼此幾個殘基內(nèi)的表位。已知這個區(qū)是弱免疫原性的，如圖2B所總結(jié)的那樣(Plotnicky-Gilquin等，Virology(2002)303:130_137)，這與本文所報道的該區(qū)高親和力克隆的低頻度相一致。我們通過檢查已發(fā)表的來源于75個以上的RSV分離株的G蛋白序列對該區(qū)的特征進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定。蛋白質(zhì)的大多數(shù)殘基在這個集合中都顯示出了數(shù)種到多種多態(tài)性。其中有兩個區(qū)明顯沒有多態(tài)性能產(chǎn)生s(G)的另一剪接位點和所有Ga/Gb交叉反應(yīng)性抗體都能結(jié)合的中央保守區(qū)(圖2C)。也就是說，我們發(fā)現(xiàn)高度保守的區(qū)對于功能性來說是關(guān)鍵的，也是低免疫原性的。有多種機(jī)制造成了這種低免疫原性，例如，缺少適于有效提呈該區(qū)給組織相容性抗原以便于展示給免疫系統(tǒng)其余組分的臨近蛋白酶催化裂解位點。無論何種機(jī)制，這個意外的結(jié)果是清楚的那些能夠存活的病毒顯示出對該區(qū)的低免疫原性。因此我們預(yù)測，通過被動轉(zhuǎn)移合適的抗體來激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗該區(qū)的活性將會成功，這在我們的動物模型中已經(jīng)得到驗證。另一剪接位點雖然同樣保守，但是其免疫原性通常不低，這說明其重要性僅僅與S(G)的產(chǎn)生有關(guān)，因此它不適于用作獲得性免疫治療的靶位。本發(fā)明的人抗體或人源化抗體可通過常規(guī)重組技術(shù)制備，例如用中國倉鼠卵巢細(xì)胞或其他真核細(xì)胞系制備，如昆蟲細(xì)胞。另外，也可利用已知的技術(shù)在植物和轉(zhuǎn)基因動物中制備重組材料，其中包括抗體，例如在牛奶中，或者在微生物中或在植物或昆蟲來源的單細(xì)胞系統(tǒng)中。另外，由于編碼抗體的核苷酸序列是可用的，因此也可以利用重組方法(或通過蛋白酶催化處理蛋白本身)制備能結(jié)合相同表位的相關(guān)片段如？油1(油’)2或&片段，抗體可以制備成單鏈形式。生產(chǎn)重組抗體所用的許多技術(shù)都是本領(lǐng)域熟知的。為了用于治療，重組制備的抗體或片段可用合適的賦形劑制成藥物組合物，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法給藥。藥物組合物可包含本發(fā)明的單克隆抗體或片段作為唯一活性成分，尤其是與A和B病毒株來源的G蛋白都有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體或片段。另外，僅有的活性成分也可以是兩種單克隆抗體，其中一種與A病毒株G蛋白有更強(qiáng)的反應(yīng)性，而另一種與B病毒株G蛋白有更強(qiáng)的反應(yīng)性。在所有這些例子中，也可以包含其他治療因子，其中包括一種或多種與F蛋白有免疫反應(yīng)性的抗體，或者能有效抗RSV或炎癥的其他治療因子。因此，組合物中也可以包含抗炎癥藥物如留體類和非留體類抗炎癥化合物。另外，化合物可包括營養(yǎng)物質(zhì)如維生素或抗體之外的其他任何有益化合物。在一個實施方式中，在需要給予制劑以提高對感染的耐受性時，可以使用完整抗體，其中包括含補(bǔ)體的Fc區(qū)。一般來說，人類對象的抗體給藥劑量為0.01-20mg/kg，或者在0.01-5mg/kg范圍內(nèi)，或者這些范圍內(nèi)的中間劑量。在一個實施方式中，給藥劑量范圍為0.l-1.0mg/kg。分?jǐn)?shù)天、數(shù)周或數(shù)月重復(fù)給藥也是有益的。也可以在1、2、5或10年后提供加強(qiáng)免疫。在另一實施方式中，為了獲得療效以降低病毒載量，也可以使用完整抗體，其中包括含補(bǔ)體的Fc區(qū)。這種方案的給藥劑量為0.001-50mg/kg，或者該范圍內(nèi)的中間值，如0.01、1或10mg/kg。也可以采用重復(fù)給藥的方式。治療藥物應(yīng)在確診感染后立刻給予，雖然在數(shù)天內(nèi)給藥也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也可以采用重復(fù)給藥的方式。為了減輕肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)，可以只給予抗體的免疫特異性片段。其劑量與完整抗體相同。給予免疫特異性片段和完整抗體的混合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的抗體組合物通常通過注射給藥，一般來說是靜脈注射。因此優(yōu)選胃腸外途徑給藥。但是任何可行的給藥模式都包括在內(nèi)。用于抗體組合物給藥的制劑可利用本領(lǐng)域熟知的常見方式制備。標(biāo)準(zhǔn)處方集中可以找到合適的制劑，如《雷明頓藥學(xué)》(ReminRtonsPharmaceuticalSciences)，最新版，賓西法尼亞州默克出版公司(MackPublishingCo.，Easton,PA)，本文已納入作為參考。制劑通常是適于胃腸外途徑給藥的那些制劑，如等滲溶液，其中包含緩沖液、抗氧化劑等，以及包含轉(zhuǎn)移載體如脂質(zhì)體、微粒和納米顆粒的乳化劑。理想的方案和制劑依賴于參與醫(yī)師的判斷以及對象的特定狀況。給藥劑量取決于對象的年齡、一般健康狀況和感染的嚴(yán)重程度，如果有感染的話。下面所提供的實施例是用于說明而不是限制本發(fā)明。實施例1131-2G的克降和人源化mAb131-2G的克隆和測序。按照廠家的說明書從131-2G雜交瘤中提取總mRNA(RNeasy試劑盒加拿大QSC公司(QiagenSantaClarita,Ca))。設(shè)計7個家族特異性5’VyFRl引物用于靶向Ig的VHl到VH7基因家族，其中一個共有的3’CyI引物用于擴(kuò)增131-2G的重鏈可變區(qū)并測序。一個共有的5’Vk引物用于擴(kuò)增Vk家族的每一個成員，一個κ恒定區(qū)特異性的反向引物用于擴(kuò)增κ輕鏈并測序。利用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從IOOng總RNA中擴(kuò)增VH和VL轉(zhuǎn)錄子。131-2G雜交瘤需要兩個PCR反應(yīng)一個反應(yīng)用于輕鏈κ(κ)，一個反應(yīng)用于、重鏈(r)。QIAGEN—步RT-PCR試劑盒用于擴(kuò)增(恰根公司(Qiagen)，目錄號210212)。禾Ij用恒定區(qū)特異性的引物對提取的PCR產(chǎn)物直接測序。利用V-BASE2比較衍生序列與已知種系IgV-和J-區(qū)的DNA序列，并將VH和VL基因與小鼠種系基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。序列分析從核苷酸序列信息中獲得131-2G重鏈和輕鏈的V和J基因有關(guān)的數(shù)據(jù)。根據(jù)序列數(shù)據(jù)設(shè)計131-2GIgVH和VK鏈前導(dǎo)序列特異性的新引物對。V基因的用途和序列分析131-2G的重鏈基因來源于VHl種系基因家族，D區(qū)的種系基因是DSP2.2，J區(qū)來源于JH3種系。輕鏈基因來源于Vκ1(κ1Α5)和Jκ4種系基因家族。131-2G使用了Irfi_VJ558VHl家族的V區(qū)段MGffSWIFLFLLSGTAGVHSE1ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAGVQLQQSGPELVKPGTSVKIS61GTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAACTTCAGTGAAGATATCCCKASGYSFTGFTMNWVKQSH121TGCAAGGCTTCTGGTTATTCATTCACTGGCTTCACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGKNLEffFGLINPFNGNTGYN181GGAAAGAACCTTGAGTGGTTTGGACTTATTAATCCTTTCAATGGTAATACTGGCTACAACQKFKGKATLTVDKSSSTAFM241CAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCTTCCAGCACAGCCTTCATGELLSLTSEDSAVYYCARSGK301GAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGAAAASYDYEAffFTYWGQGTLVTVS361TCCTATGATTACGAGGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTA421GCA131-2G使用IgKV1亞組的V區(qū)段DIVMTQTTLSLPVSLGNQAS1GATATTGTGATGACACAAACTACACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAAATCAAGCCTCCISCRSSQTIVHTNGNTYLEW61ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGACCATTGTACATACTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF121TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATTTACAAAGTTTCCAACCGATTTSGVPDRFSGSGSGTDFILNI181TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCATACTCAATATCSRVEAEDLGVYYCFQGSHVP241AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCAFTFGSGTKLEIKR301TTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGAmAb131-2G的人源化?？贵w(Ab)與其同種抗原(Ag)的結(jié)合是高特異性的相互作用。這種特異性取決于Ab結(jié)合位點和抗原決定簇之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性。組成Ab結(jié)合位點的殘基主要來自于超級可變區(qū)和補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)；有時候來自于非超級可變區(qū)(框架區(qū))的殘基會影響整個區(qū)的結(jié)構(gòu)，因此也會影響結(jié)合位點。小鼠VH基因區(qū)段群的容量二倍于人，與人IgH位點相比其中包含更多的功能基因。小鼠位點和人位點之間沒有很大的相似性。VH和VL區(qū)頭兩個CDR的主鏈構(gòu)型形成一小群結(jié)構(gòu)，被稱為極限結(jié)構(gòu)。特定極限結(jié)構(gòu)的存在主要是由CDR的長度以及序列特定位點上的關(guān)鍵殘基決定的。在人VHl和小鼠VHl家族之間，VHl家族(VH11-2)具有共同的極限結(jié)構(gòu)。根據(jù)131-2G重鏈和輕鏈的序列分析結(jié)果和131-2G使用IgH_VJ558家族和IgK1家族的V區(qū)段的事實，將兩個鏈進(jìn)行比對并與人VHl和Vκ1家族的成員比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與人VH1-8和Vk1-18的種系序列分別有70%和77%的序列一致性。這些種系用作人源化131-2GmAb的人框架。mAb1312G表位定位。RSV裂解物和純化Ga蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示131-2G可識別線性表位。利用一組RSV-GA2蛋白序列來源的重疊肽對131-2G的結(jié)合區(qū)進(jìn)行表位定位。圖2A是G蛋白序列的示意圖，其中包括保守CX3C基序的定位。為了獲得精細(xì)的表位定位圖，對一個Ga來源的12-聚肽家族進(jìn)行逐個堿基掃描。這種肽的陣列可與Iyg/ml的131-2GmAb雜交。通過過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體染色然后利用超級信號化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(美國皮爾斯公司(Pierce，RockfordIL,USA))來檢測131-2G的結(jié)合。如圖3所示，131-2G抗體可與RSV-Ga蛋白上的8個連續(xù)肽反應(yīng)，其位置為157-176。131-2G識別的表位在肽序列(157)SKPNNDFHFEVF(169)和(169)HFEVFNFVPCSI(176)內(nèi)。根據(jù)8個肽的共有序列，可以將131-2G的結(jié)合區(qū)定位在164-168位殘基。有三種方法可用于確定131-2G及其人mAb類似物的親和力特征。第一種方法是利用ELISA測定固定量的抗體與系列稀釋的抗原的結(jié)合信號。這種滴定曲線的中點就是親和力的近似值。對于131-2G來說，中點為4nM。第二種方法是在商業(yè)分析實驗室中通過Biacore分析測定131-2G的親和力；根據(jù)開放率和關(guān)閉率的比值，經(jīng)過計算得出親和力為7nM。第三種方法是，用血清白蛋白稀釋CellSpot磁珠上的Ga蛋白可降低多拷貝蛋白與抗體足跡相互作用的機(jī)會。根據(jù)所得到的原始信號多齒親和力效應(yīng)的抑制作用可以分析出一組克隆相對于已知標(biāo)準(zhǔn)品的親和力大小次序。這種親和力數(shù)值可用于比較人抗體和131-2G以及有效篩選高親和力的克隆。如果有來源一致的G蛋白抗原，所有這些方法都可以得到改進(jìn)。在我們最初的研究中，抗原是從病毒感染的細(xì)胞中提取的。由于用這種方法制備出的抗原質(zhì)量差異較大，因此我們開發(fā)出了一種重組表達(dá)系統(tǒng)用于制備G蛋白，結(jié)果證明這種系統(tǒng)更可靠。實施例2分泌抗RSV-Ga/Gb抗體的人B細(xì)胞的分離來自于40位確診感染RSV的成人的外周血單個核細(xì)胞用于篩查產(chǎn)生抗病毒抗體的人B細(xì)胞。具有抗RSV附著G蛋白的理想抗體的對象用于抗RSV-G特異性mAb的克隆。篩查的結(jié)果是約有10%的對象所包含的理想細(xì)胞的頻度超過1/100，000。然而，即使頻度更低的那些對象也是有意義的，事實上，所鑒定出的具有最高親和力的抗體來自于一個理想B細(xì)胞頻度極低的供者，其頻度約為lppm。為了完成稀有理想細(xì)胞的篩查和回收，我們使用了以前所描述的CellSpot技術(shù)。CellSpot分析方法通過捕獲單個細(xì)胞分泌的IgG作為細(xì)胞附近的足跡從而有效地將ELISA等價分析方法縮小成一個臨近單細(xì)胞維度的虛擬孔。這樣就可以很容易地分析數(shù)百萬個細(xì)胞。另外，利用顯微復(fù)合試劑(組合染色的熒光膠乳微球，參見US6，642，062)可以確定每一個克隆所分泌的抗體足跡的詳細(xì)特征，其中包括利用多種生化探針確定特異性和/或親和力。定量分析的保真度足以確保從篩查群體中回收到極其稀有的理想細(xì)胞，克隆的表達(dá)細(xì)胞所具有的表型與最初的鑒定結(jié)果一致。篩選標(biāo)準(zhǔn)是與被稱為Ga和Gb的兩個主要病毒株來源的G蛋白家族都能結(jié)合，但是不與F蛋白(另一種主要病毒包被蛋白)結(jié)合?？寺〉挠H和力大小次序可通過用血清白蛋白稀釋磁珠上的抗原來確定。這種稀釋將降低與分泌的IgG足跡多齒結(jié)合的機(jī)會(“親和力”效應(yīng))，因此可用于篩選較高的內(nèi)在親和力。G蛋白從感染兩種RSV病毒株中的一種或另一種的Vero細(xì)胞中純化。在用于人B細(xì)胞時，方法始于用標(biāo)準(zhǔn)磁珠分離方法耗竭PBMC內(nèi)的非B細(xì)胞。細(xì)胞以106/ml的濃度重懸在IMDM/20%HI-FCS中；添加1100稀釋度的EBV(從感染的B95-8細(xì)胞上清中得到的沉淀物)，細(xì)胞在37°C孵育2小時。洗去過量的病毒，以2X106/ml的濃度培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基為IMDM、20%HI-FCS、20%巨細(xì)胞瘤條件培養(yǎng)基、2μg/mlCpG(0DN2006)和lOng/mlIL-10，細(xì)胞只用于篩查，或者利用磁珠陽性篩選方法篩選表面IgG。細(xì)胞接種到照射的人肺細(xì)胞(MRC-5，5000個細(xì)胞/孔)上，密度為200-300細(xì)胞/孔，培養(yǎng)基為IMDM、20%HI-FCS、20%巨細(xì)胞瘤條件培養(yǎng)基、2μg/mlCpG(0DN2006)和lOng/mllL-lO。培養(yǎng)基每2-3天更換一次。在第6天時，孔內(nèi)的一半內(nèi)容物用于CellSpot分析。通過篩查結(jié)果呈現(xiàn)陽性的少數(shù)孔內(nèi)的剩余細(xì)胞稀釋到10、5、1和0.5個細(xì)胞/孔，滋養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)條件同上。4-5天后這些有限稀釋的培養(yǎng)板再用ELISA或CellSpot分析。有限稀釋的陽性孔的內(nèi)容物利用RT-PCR處理以回收編碼抗體重鏈和輕鏈的多聚核苷酸。從解凍PBMC到通過RT-PCR回收編碼mRNA序列需要10-12天。圖4顯示的是該試驗的示例性數(shù)據(jù)。A區(qū)和B區(qū)分別說明了理想和非理想供者血樣的CellSpot模式。初次檢測時得到的理想克隆的模式顯示在C區(qū)，D區(qū)顯示的是HEK293細(xì)胞分泌的抗體重復(fù)模式，其中細(xì)胞轉(zhuǎn)化了該細(xì)胞來源的cDNA克隆抗體。在分析精確度內(nèi)模式是一致的，這說明已經(jīng)成功地回收了理想克隆。如圖1所示，大多數(shù)抗RSV抗體是針對F蛋白的，或者針對F和G共有的抗原決定簇(最大的可能是糖類，因為兩個蛋白沒有序列同源性)。大多數(shù)G蛋白特異性抗體只結(jié)合Ga或只結(jié)合Gb，這與已知的G蛋白的高序列變異性相一致。總共篩查了約2千萬個B細(xì)胞。通過RT-PCR回收12個最有希望的抗體?？傮w來說，理想克隆的頻度低于百萬分之一，需要5千萬次以上的ELISA等價分析才能發(fā)現(xiàn)那些稀有克隆。因此，CellSpot技術(shù)能更全面地篩查克隆，更有實用性。得到的克隆的質(zhì)量優(yōu)于更有限篩選所發(fā)現(xiàn)的那些克隆，高質(zhì)量組的共有特征顯示出了理想抗體的意外特性。實施例3抗RSV-Ga/Gb人抗體的克降利用半巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增陽性ELISA孔的重排Ig重鏈和Ig輕鏈基因。為了擴(kuò)增推測的未知V基因重排序列，構(gòu)建家族特異性V基因引物的集合，這些引物可識別人Ig位點內(nèi)的幾乎所有V基因區(qū)段。5’引物與Cy、CK和CX基因區(qū)段特異性引物的混合物一起使用。通過比較不同子代細(xì)胞的V基因擴(kuò)增序列可以確定有限稀釋的RSV-G特異性B細(xì)胞的克隆形成能力，擴(kuò)增出的全長V基因重排序列克隆到IgG表達(dá)載體內(nèi)。這種方法還可用于解決其他問題，例如，V-、D-和J-基因的用途和體細(xì)胞突變是否存在以及體細(xì)胞突變的模式。方法。利用商用RNA純化試劑盒(RNeasy；恰根公司(德國))從人分離的B細(xì)胞提取總mRNA。利用總RNA制備物和寡核苷酸引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。每個樣品運行三個PCR反應(yīng)一個用于擴(kuò)增輕鏈κ(κ)，一個用于擴(kuò)增輕鏈λ(λ)，一個用于擴(kuò)增γ重鏈(γ)。QIAGEN—步RT-PCR試劑盒用于擴(kuò)增(恰根公司，目錄號210212)。在偶聯(lián)RT-PCR反應(yīng)中，利用RT酶的獨特混合物(Omniscript和Sensiscript)合成cDNA，引物為C-κ丄-λ相應(yīng)的或Cγ基因的CHl區(qū)共有序列相應(yīng)的反義序列特異性的引物，RT在50°C運行1小時，隨后用高特異性和高敏感性的HotStarTaqDNA聚合酶PCR擴(kuò)增cDNA。所有PCR反應(yīng)都用5’正義引物的混合物。弓丨物序列根據(jù)VH、VK和VL前導(dǎo)序列設(shè)計。PCR反應(yīng)在95°C運行15分鐘進(jìn)行初始熱啟動，然后運行20個循環(huán)，每個循環(huán)包括95°C運行30秒(變性)、60°C運行45秒(復(fù)性)、72°C運行1分鐘(延伸)。用于檢測可變區(qū)Ig片段并將其克隆到表達(dá)載體內(nèi)的巢式PCR。在第二輪中，使用一管5μ1第一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。所用的引物包含5’BglII和3’XbaI限制性酶切位點。PCR運行30個循環(huán)。第一輪和第二輪擴(kuò)增所用的條件一致。用瓊脂糖凝膠分離反應(yīng)產(chǎn)物，每種產(chǎn)物上載5μ1，然后用溴化乙錠染色。據(jù)估計，擴(kuò)增VH和VL重排片段得到的V-CPCR產(chǎn)物分別為500bp和450bp。在凝膠上出現(xiàn)約500bp大小的PCR條帶說明結(jié)果是陽性的。純化PCR產(chǎn)物(Qiagen凝膠純化試劑盒，目錄號28704)，提取出的PCR產(chǎn)物用恒定區(qū)特異性的引物直接測序?？寺∑蔚男蛄型ㄟ^測定為重組生產(chǎn)而制備的質(zhì)粒的序列來確定。圖5A顯示的分離自人類對象的本發(fā)明抗體的重鏈氨基酸序列和人源化131-2G的氨基酸序列，其中包括可變區(qū)、D和J結(jié)合區(qū)、框架區(qū)(FR)和補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)。圖中所列的所有抗體與來源于A病毒株和B病毒株的G蛋白都有免疫反應(yīng)性，只有抗體3F9除外，這個抗體只和來源于A病毒株的G蛋白有免疫反應(yīng)性。圖5B顯示的是這些抗體的輕鏈具有相似的序列信息。序列表中的破折線代表不同長度的基因序列的排列校正。消化上述PCR片段，然后克隆到攜帶人Yl的恒定區(qū)或者人κ或λ的恒定區(qū)的各個表達(dá)載體內(nèi)，用于在體外用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)抗體。編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到293(人腎)細(xì)胞系(因維曲根公司(Invitrogen))內(nèi)。表達(dá)質(zhì)粒用陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(293feCtinTM;因維曲根公司)轉(zhuǎn)導(dǎo)。每一個轉(zhuǎn)染反應(yīng)用20μg純化質(zhì)粒，40μL293fectin與ImLOpti-MEM(因維曲根公司)混合，混合前在室溫下孵育5分鐘，在室溫下放置20分鐘使其形成復(fù)合物。DNA-293feCtin復(fù)合物添加到3XIO6細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞接種到90mm培養(yǎng)皿內(nèi)，在37°C、8%C02中培養(yǎng)。在最后階段，轉(zhuǎn)染后72小時收獲上清，通過離心(3，000g,15min，4°C0回收分泌的抗體。實施例4本發(fā)明抗體的表位作圖和親和力測定利用實施例1所描述的在先領(lǐng)域131-2G抗體表位作圖有關(guān)的技術(shù)可以確定本發(fā)明抗體的相應(yīng)表位。利用實施例1所描述的mAb131-2G有關(guān)的方法確定本發(fā)明抗體的親和力。如下面的表1所示，三個抗體可與構(gòu)型表位結(jié)合，即，通過結(jié)合重疊肽無法對其定位。表中還列出了定位到特異性序列上的本發(fā)明的抗體。表中還列出了親和力常數(shù)，該常數(shù)是利用重組Ga和Gb蛋白有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)Biacore分析確定的，根據(jù)測定的開放率和關(guān)閉率計算出來，表示為pM。這些抗體中的兩個抗體的數(shù)據(jù)顯示在圖6中。A、B和C區(qū)顯示的是3G12的結(jié)合數(shù)據(jù)，D、E和F區(qū)顯示3D3的數(shù)據(jù)。第一行顯示的是用抗體加載生物傳感器芯片，中間行顯示的Ga蛋白流過芯片然后用緩沖液洗滌產(chǎn)生的信號，下一行顯示的是Gb蛋白的信號。信號的增強(qiáng)程度可用于計算開放率，而洗滌期間信號的下降程度可用于計算關(guān)閉率。開放率和關(guān)閉率的比值為親和力常數(shù)Kd。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>圖7顯示的是使用活病毒進(jìn)行ELISA所得到的結(jié)果以及利用標(biāo)準(zhǔn)辣根過氧化物酶試驗評價結(jié)合活性所得到的結(jié)果。各種來源的病毒制備物用于包被培養(yǎng)板，病毒制備物用PH9.6的碳酸鹽緩沖液配制，包被量為IO5PFU/孔，在4°C過夜。在室溫下培養(yǎng)板用PBST配制的5%牛奶(mik)封閉1小時?？贵w的系列稀釋液添加到孔內(nèi)，抗體用封閉緩沖液稀釋，在室溫下作用1小時。為了檢測，用封閉緩沖液按12000稀釋羊抗鼠Fcγ-HRP(杰克遜免疫公司(Jacksonlmmuno.))，添加到孔內(nèi)，室溫下作用1小時。培養(yǎng)板用PBST全面洗滌。在450nm處測定底物TMB的生成物。如圖7所示，3D3能與活病毒良好結(jié)合，本發(fā)明的其他多種抗體也是如此。Synagis抗體的親和力較弱，結(jié)果顯示即使是104ng/ml的抗體與活病毒也沒有結(jié)合。圖8顯示的是抗體與重組蛋白的結(jié)合能力和與活病毒的結(jié)合能力的相關(guān)性。圖9A和9B是兩張圖，證明本發(fā)明的抗體與A2病毒株和A5病毒株的結(jié)合能力是相似的，其結(jié)果來自于上述分析方法。圖9A顯示的是3D3和3G12與Synagis相比，與病毒株A2能良好結(jié)合。PAB是商品化的抗所有RSV蛋白的多克隆羊抗體(開米肯公司(Chemicon)，目錄號AB1128)。圖9B顯示的是這些抗體也能與病毒株A5結(jié)合；需要說明的是，其X軸上的單位與圖9A是不同的。同樣的試驗顯示本發(fā)明的抗體可與多種臨床分離株結(jié)合。實施例6中和試驗本發(fā)明所選擇的抗體在體外中和病毒的能力利用標(biāo)準(zhǔn)蝕斑試驗測定。HEp2細(xì)胞以2XIO5細(xì)胞/孔的濃度接種到12-孔板上。第二天，用培養(yǎng)基制備系列稀釋的抗體。將約200PFU/孔的RSV添加到抗體內(nèi)，同時加入兔補(bǔ)體血清，室溫孵育1小時。然后將200μ1/孔抗體_病毒混合物添加給ΗΕρ2細(xì)胞，室溫孵育2小時使其感染。感染期過后，去除培養(yǎng)基，所有孔內(nèi)都添加包含甲基纖維素的培養(yǎng)基。培養(yǎng)板在35°C孵育6天，然后按如下方法固定細(xì)胞并染色，計數(shù)蝕斑數(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)層上吸去甲基纖維素，用100%甲醇在室溫下固定細(xì)胞30分鐘。然后用PBS配制的5%牛奶洗滌培養(yǎng)板三次。添加1500稀釋的一抗(羊抗RSV多克隆抗體(開米肯公司，目錄號ABl128))，抗體用PBS+5%乳蛋白的稀釋，孵育1小時。然后加入1500稀釋的二抗(ImmunoPure的兔抗羊抗體IgG(H+L)，標(biāo)記有過氧化物酶)(TS公司(ThermoScientific)，目錄號31402)，抗體用含5%乳蛋白的PBS稀釋，孵育1小時。培養(yǎng)板用IxPBS洗滌三次。加入一步氯化萘酚底物(I-St印Chloronaphtholsubstrate)(皮爾斯公司，目錄號34012)后可以看到蝕斑，200μL/孔，反應(yīng)10分鐘。培養(yǎng)板用水漂洗，在空氣中干燥。計數(shù)每個孔內(nèi)的蝕斑數(shù)。圖10顯示的是每微克(μg)人抗體所對應(yīng)的蝕斑的絕對數(shù)的結(jié)果，其中也包括Synagis抗體的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)說明在被檢測的抗體中，3D3的活性最高。3G12的IC5tl為15ng/ml，對應(yīng)于這個試驗其親和力為ΙΟΟρΜ，而Synagis商用抗體的IC5tl為300ng/ml，對應(yīng)的親和力為2nM。結(jié)果還顯示Synagis和本發(fā)明的抗G抗體在這些條件下沒有協(xié)同效應(yīng)。圖11顯示的是3G12抗體與Synagis相比對B病毒株的中和作用。中和數(shù)據(jù)(對照的％)是根據(jù)每個試驗的160-180個蝕斑絕對數(shù)計算出來的。體外親和力為IpM到5nM(表1)的本發(fā)明的抗體的EC5tl值在lO-lOOng/ml之間。實施例7抗G抗體在小鼠體內(nèi)的預(yù)防效應(yīng)我們檢測了本發(fā)明的抗體、Synagis以及人IgGl預(yù)防小鼠感染RSV的能力。在感染前的-1天，對照組小鼠腹腔注射培養(yǎng)基和PBS。實驗組小鼠分別注射0.15、1.5和15mg/kg抗體hlgGl(無免疫性的同種型對照抗體)或3G12、3D3或Synagis。這個劑量約等于3μg、30yg禾口300μg/小鼠。在第0天，小鼠通過鼻內(nèi)給藥接種IXlO6PfuRSV長病毒株。在第0天和第5天，收集支氣管肺泡灌洗液(BAL)和血清，同時測定體重、肺重量、肺葉切片內(nèi)的pfu、病毒載量(通過qPCR測定)、肺組織學(xué)、總白細(xì)胞數(shù)、FACS和肺內(nèi)的IFNγ。圖12顯示的是利用上述蝕斑試驗所得到的肺內(nèi)病毒載量的結(jié)果。圖12的數(shù)據(jù)說明在該試驗中，3G12和3D3與Synagis—樣有效。(Synagis用于人時的劑量通常為15mg/kg)。實施例8抗RSV-Ga/Gb抗體的治療效果試驗證明，針對RSV-G保守基序的抗體具有治療效果。在第0天，小鼠鼻內(nèi)給予106pfuRSV,然后在第3天時腹腔注射3mg/kg的抗體，在第5天和第7天檢測支氣管肺泡灌洗液內(nèi)的病毒載量。在這個模型中，感染比在人體內(nèi)更容易被自然清除。然而，與不能結(jié)合RSV的對照抗體相比，抗體治療可以劑量依賴性的方式導(dǎo)致病毒被加速清除(圖13A)。每個治療組包含5只動物，結(jié)果是有統(tǒng)計學(xué)意義的。如WO00/43040所述，抗P物質(zhì)的抗體在減輕RSV導(dǎo)致的肺部炎癥方面是有益的，在動物模型中病程延長，這是RSV感染的一個重要臨床特征。P物質(zhì)的表達(dá)上調(diào)依賴于活化的G蛋白(Haynes,L.M.等，J.Virol.(2003)77:9831-9844)。我們還觀察到用本發(fā)明的抗體治療后肺部感染的指標(biāo)下降，其中包括炎癥性NK和PMN細(xì)胞數(shù)量減少(圖13B)以及細(xì)胞因子如IFNy含量降低(圖13C)。在另一個試驗中，小鼠通過鼻內(nèi)給藥接種IO6PfuRSVA-型長病毒株。在第3天，包含4-5只小鼠的各組進(jìn)行如下處理第1組在第0天未進(jìn)行病毒感染的對照組用PBS處理。第2組在第0天接種RSV的陰性對照組在第3天時用PBS處理。第3組在第0天接種RSV，腹腔注射用生理鹽水配制的Synagis抗體，劑量為1、10或IOOyg/只，或者0.05、0.5或5mg/kg。第4組在第0天接種RSV，使用與第3組相同的方案給予mAb3D3。第5組在第0天接種RSV，使用與第3和4組相同的方案給予mAb3G12。在第0、3、5、7和10天收集肺和BAL液。另外，測定體重、肺重量、肺葉切片內(nèi)的pfu、通過qPCR測定病毒載量、肺組織學(xué)、總白細(xì)胞數(shù)、FACS和BAL內(nèi)的IFNγ。10μgmAb給藥組的qPCR結(jié)果顯示在圖14中。如圖所示，用劑量相對較低的抗體處理時，Synagis-處理組和未處理組小鼠的病毒滴度是相似的，而在第5天感染達(dá)到峰值時，3D3處理組和3G12處理組小鼠的病毒滴度卻大大降低。這個試驗證明體外的高親和力與體內(nèi)的高活性是相關(guān)的。圖15顯示的是劑量反應(yīng)曲線，證明在第7天時濃度比Synagis更低的3G12和3D3能夠降低RSV拷貝數(shù)，結(jié)果是通過qPCR測定的。3D3的活性尤其高，這與其在體外具有較高的親和力是一致的。同樣，在第10天通過qPCR測定病毒數(shù)時，雖然在這個時間點病毒滴度很低，這是因為有小鼠免疫系統(tǒng)的自然清除作用，但是各個劑量濃度的3D3的活性都比Synagis高約100倍，如圖16所示。這個試驗證明了高親和力抗體的實用性，即使在抗原濃度下降時這種抗體也是有效的。該疾病在人體內(nèi)的病程要遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于在小鼠體內(nèi)的病程，這樣就更有必要在延長的期間內(nèi)使用抗體繼續(xù)中和病毒。在其他試驗中，小鼠分為抗GmAb處理組和抗FmAb處理組，每組4只小鼠，每個試驗重復(fù)三次。在第0天免疫小鼠，在第3天用抗體治療小鼠，在第3、5和7天時測定各項療效指標(biāo)。支氣管肺泡灌洗液(BAL)內(nèi)的炎癥細(xì)胞數(shù)是一項療效指標(biāo)，三組的測量結(jié)果顯示在圖17中。Y軸上的點代表每個肺內(nèi)的BAL細(xì)胞數(shù)，從0到140X103。結(jié)果顯示，與同種型對照非免疫抗體相比，在第5天時抗FmAb能降低BAL細(xì)胞數(shù)/肺，而抗GmAb能夠更明顯地降低BAL細(xì)胞計數(shù)。到第7天時，感染按自己本身的進(jìn)程發(fā)展。圖18A禾口18B顯示的是抗GmAb(小鼠131-2G)和抗GF(ab，)2的療效比較，其中抗GF(ab’)2是通過用胃蛋白酶裂解該抗體并利用固化的蛋白A去除Fc段而獲得的。試驗證明，補(bǔ)體對抗G抗體的體外抗病毒效應(yīng)是十分重要的，這在圖18A中得到了確認(rèn)，其中抗病毒效應(yīng)表示為pfu/g肺組織。試驗按實施例6所述進(jìn)行?？笹抗體的F(ab’)2片段缺少補(bǔ)體介導(dǎo)活性所必須的IgG的Fc段，在降低病毒載量方面不如對照有效，而抗GmAb是非常有效的。然而，當(dāng)以炎癥作為結(jié)果的測定值時，如圖18B所示，抗GmAb的？(油’)2片段與完整抗體一樣有效。這個試驗說明對G蛋白的中和作用是減輕呼吸道炎癥的關(guān)鍵。由于病毒可主動分泌可溶性的G蛋白，并且對于可溶性因子的中和來說高親和力結(jié)合是十分重要的，因此，預(yù)計本發(fā)明的高親和力抗體尤其可用于抗炎治療。圖19A、B和C顯示的是在給予抗GmAb后，抗GmAb對BAL內(nèi)IFNγ表達(dá)量的影響，該細(xì)胞因子可作為呼吸道炎癥的標(biāo)志物。在所有例子中，無免疫性的對照抗體不能使抑制伴隨呼吸道炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的IFNy分泌量升高。但是如果在第-1天(Α區(qū))、第3天(B區(qū))甚至第5天(C區(qū))給予抗GmAb,則在給藥后第7天使IFNγ的水平明顯降低。這個試驗說明可利用抗RSVG蛋白保守基序的抗體治療病毒載量峰值過后的炎癥反應(yīng)。實施例9感染對象的內(nèi)源件抗體的特異件利用如下合成肽檢測血清樣品的免疫反應(yīng)性，其中血清樣品來自于4位患嚴(yán)重Ac-Lvs-Pro-Asn-Asn-Asp-Phe-His-Phe-Glu-Val-Phe-Asn-Phe-Val-Pro-Cyp-Ser-Ile-Cys-Ser-Asn-Asn-Pro-Thr-C|ys-Trp-Ala-IIe-Cyb-Lys-Arg-Ile-NH2(二硫鍵如圖所示)這個肽代表了RSVA2病毒株G蛋白的保守區(qū)。試驗利用實施例5所描述的ELISA方法完成。抗體與該肽的免疫反應(yīng)性水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，疾病較輕的對象所顯示的病毒滴度要高于病情嚴(yán)重的對象(參見圖20)。這些結(jié)果說明與G蛋白這個部分有免疫反應(yīng)性的抗體可有效減輕感染.權(quán)利要求一種分離的單克隆抗體(mAb)或其免疫反應(yīng)性片段，所述抗體或片段(a)能結(jié)合呼吸道合胞病毒(RSV)A2病毒株G蛋白160-176位殘基之內(nèi)的表位，(b)當(dāng)給予人類對象時其免疫原性很小，以及(c)經(jīng)蝕斑減少中和試驗(PRNT)試驗檢測，其中和作用的EC50小于500ng/ml。2.如權(quán)利要求1所述的mAb或片段，其與RSVA2的G蛋白的親和力為至少InM。3.如權(quán)利要求1或2所述的mAb或片段，其還能結(jié)合RSVB型病毒株G蛋白上的相應(yīng)表位。4.如權(quán)利要求1所述mAb，其為完整抗體的形式。5.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的mAb或片段，其為人源化131-2G或其免疫特異性片段，或者是1F12、3G12、1A5、3D3、1G1、2B11、5D8、2D10、3F9、1D4、1G8、6A12或10C6或其免疫特異性片段。6.如權(quán)利要求5所述的mAb，其為完整抗體。7.—種藥物組合物，該組合物包含作為唯一活性成分的如權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體或片段以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。8.—種藥物組合物，該組合物包含作為唯一活性劑的如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或片段和與RSVB型病毒株G蛋白有免疫反應(yīng)性的另一種單克隆抗體或片段以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。9.一種藥物組合物，該組合物包含作為唯一活性劑的如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或片段和與RSV有免疫反應(yīng)性的抗體之外的其他藥物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述其他藥物是抗RSV藥。11.一種藥物組合物，該組合物包含作為唯一活性劑的如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或片段和與RSVB型病毒株G蛋白有免疫反應(yīng)性的另一種單克隆抗體或其片段以及與RSV有免疫反應(yīng)性的抗體之外的其他化合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述其他藥物是抗RSV藥。13.如權(quán)利要求7-12中任一項所述的藥物組合物，還包含與RSVF蛋白有免疫反應(yīng)性的一種或多種單克隆抗體或其片段。14.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的mAb，其特征在于，該mAb對感染RSV的人類對象有治療效果。15.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的mAb或片段，其能減輕感染RSV的人類對象的呼吸道炎癥。16.一種或多種核酸分子，其包含編碼如權(quán)利要求1-6中任一項所述的mAb或片段的第一核苷酸序列，或者一種或多種核酸分子，其包含與所述第一核苷酸序列的全長互補(bǔ)的第二核苷酸序列。17.產(chǎn)生如權(quán)利要求1-6中任一項所述mAb或片段的重組宿主細(xì)胞或永生化細(xì)胞。18.如權(quán)利要求17所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞。19.一種制備mAb或其免疫反應(yīng)性片段的方法，該方法包括培養(yǎng)如權(quán)利要求17所述的細(xì)胞以及回收所述mAb或片段。20.一種能產(chǎn)生如權(quán)利要求1-6中任一項所述的mAb或片段的非人轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物。21.一種治療感染RSV的對象中的RSV的方法，該方法包括給予需要這種治療的對象以及感染RSV的對象有效量的如權(quán)利要求1-6中任一項所述的mAb或片段。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該方法能降低病毒載量。23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，其中所述對象是人。24.一種治療感染RSV的對象中的RSV的方法，該方法包括給予需要這種治療的對象以及感染RSV的對象有效量的如權(quán)利要求7-12中任一項所述的藥物組合物。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，該方法能降低病毒載量。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述對象是人。27.一種提高人類對象對RSV感染的耐受性的方法，該方法包括給予需要這種耐受性的人類對象有效量的如權(quán)利要求1-6中任一項所述的mAb或片段。28.一種提高人類對象對RSV感染的耐受性的方法，該方法包括給予需要這種耐受性的人類對象有效量的如權(quán)利要求7-12中任一項所述的藥物組合物。全文摘要能與RSVG蛋白的保守表位結(jié)合并且在給予人類對象時免疫原性很小的各種單克隆抗體和片段，可用于治療RSV感染。文檔編號A61K39/42GK101808663SQ200880117420公開日2010年8月18日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日發(fā)明者B·基特,E·J·科拉瑞尼,L·M·高瓦,O·福德申請人:特雷利斯生物科學(xué)股份有限公司