專利名稱：高濃度脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及均一的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物。本發(fā)明還涉及濃縮溶液中脫乙酰 殼多糖_核酸復(fù)合物的方法，以及高濃縮的均一的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的制品。
背景技術(shù)：
脫乙酰殼多糖是一種N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的無(wú)毒的陽(yáng)離子聚 合物。脫乙酰殼多糖可以與核酸形成復(fù)合物并用做轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA運(yùn)輸載體。生產(chǎn)脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的濃縮溶液存在困難。增加混合溶液中脫乙酰殼 多糖和核酸的濃度會(huì)導(dǎo)致沉淀以及因此產(chǎn)生的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物大小上的非期 望的變化。此外，增加制備的溶液中脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的濃度會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物聚集 以及從溶液中沉淀。使用順流混合器產(chǎn)生包含DNA和凝聚劑(例如，聚陽(yáng)離子碳水化合物)的均一顆 粒，已經(jīng)有報(bào)道(U. S. 6，537，813)。為產(chǎn)生此類顆粒，可將DNA和凝聚劑溶液同時(shí)和單獨(dú)通 過(guò)混合器引入流體，混合器包括提供混合和顆粒形成的靜態(tài)或動(dòng)態(tài)混合器。據(jù)報(bào)道在引入 和混合過(guò)程中，保持DNA和冷凝劑的適當(dāng)比例很重要，而且電中性的顯著偏離可導(dǎo)致過(guò)程 中不完全凝聚或顆粒聚集。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的發(fā)明人克服了本領(lǐng)域產(chǎn)生在科研和醫(yī)學(xué)中有多種應(yīng)用的含高濃縮脫乙 酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物的障礙。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含大小均一的復(fù) 合物，所述復(fù)合物即使在高濃度下也不聚集或沉淀，并在各種條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定性。此外， 如同形成時(shí)，優(yōu)選的本發(fā)明的組合物是等滲的。在保持復(fù)合物穩(wěn)定性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)等滲，對(duì)于 藥學(xué)和治療領(lǐng)域的應(yīng)用是非常理想的。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了通過(guò)不需要、不包含靜態(tài)或動(dòng) 態(tài)混合器的在線混合(in line mixing)過(guò)程產(chǎn)生脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的方法。此 外，可以使用這些方法制備具有明顯背離中性的電荷(即ζ電位)的穩(wěn)定的復(fù)合物。令人 驚訝的是，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)改變?cè)诰€混合的原料體積來(lái)控制粒度(particle size) 和顆粒均勻性，而不需改變DNA和脫乙酰殼多糖的比例或基本上不改變混合溶液中DNA和 脫乙酰殼多糖的濃度。因此，一方面，本發(fā)明提供了包含水合的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物。組 合物中脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物被高度濃縮，其該組合物的核酸濃度大于約0. 5mg/ml, 其中，該組合物基本上不含沉淀的復(fù)合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物是包含脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物顆粒的分散體系。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物是等滲的。在其他實(shí)施方案中，組合物可以是高滲或 低滲的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物具有濃度為至少約0. 6mg/ml，優(yōu)選至少約0. 75mg/ ml，更優(yōu)選至少約1. Omg/ml，再優(yōu)選至少約1. 2mg/ml，最優(yōu)選至少約1. 5mg/ml的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物還包含聚集抑制劑，優(yōu)選的實(shí)施方案聚集抑制劑為 糖，優(yōu)選蔗糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含濃度小于約80mM，更優(yōu)選小于約60mM，更優(yōu)選 小于約40mM，再優(yōu)選小于約20mM的平衡陰離子(counter anion)的。優(yōu)選的，平衡陰離子
為醋酸離子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的平均多分散性指數(shù) (average polydispersity index, "PDI “)小于約0. 5，更優(yōu)選小于約0. 4，更優(yōu)選小于約 0.3，再優(yōu)選小于約0.2。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物的N P比例為至少約2 1，更優(yōu)選至少約5 1， 更優(yōu)選至少約10 1，再優(yōu)選至少約15 1，更優(yōu)選至少約20 1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物包含具有平均小于約3000個(gè)，更優(yōu)選小于約2000 個(gè)，更優(yōu)選小于約1500個(gè)，再優(yōu)選小于約1000個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選小于約500個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選 小于約100個(gè)，再進(jìn)一步優(yōu)選小于約50個(gè)氨基葡萄糖單體單元的脫乙酰殼多糖分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物包含平均分子量小于約500kDa，更優(yōu)選小于約 250kDa，更優(yōu)選小于約150kDa，再優(yōu)選小于約IOOkDa,進(jìn)一步優(yōu)選小于約50kDa，更進(jìn)一步 優(yōu)選小于約25kDa的脫乙酰殼多糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中復(fù)合物的平均直徑小于約750nm，更優(yōu)選小于約 500nm，更優(yōu)選小于約250nm，再優(yōu)選小于約200nm，進(jìn)一步優(yōu)選小于約150nm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物主要由脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物和聚集抑制劑組 成。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物主要由脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物組成。一方面，本發(fā)明提供了濃縮脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系的方法。該方法 包括提供未濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物分散體系，并使用濃縮方法，優(yōu)選切向流動(dòng) 過(guò)濾，濃縮脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系，以產(chǎn)生濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物 分散體系。優(yōu)選地，未濃縮的分散體系包含聚集抑制劑。這種濃縮過(guò)程在基本上保持小分 子(如聚集抑制劑)的濃度的同時(shí)大大提高了脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的濃度，從而得 到濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮意味著使分散體系濃縮至少2倍，更優(yōu)選至少5倍，更 優(yōu)選至少6倍，再優(yōu)選至少7倍，進(jìn)一步優(yōu)選至少8倍，更進(jìn)一步優(yōu)選至少9倍，最優(yōu)選至少 10倍。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚集抑制劑為糖，優(yōu)選蔗糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，未濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物分散體系包含平衡陰 離子，優(yōu)選醋酸離子，且濃縮方法不選擇性濃縮平衡陰離子。在濃縮的分散體系中，平衡陰 離子的富集程度不如核酸的富集程度大。優(yōu)選的，濃縮的分散體系中平衡陰離子的濃度基 本上不大于未濃縮的分散體系中的濃度。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮的分散體系中核酸的濃度為至少約0. 5mg/ml，更優(yōu)選 至少約0. 6mg/ml，更優(yōu)選至少約0. 75mg/ml，再優(yōu)選至少約1. Omg/ml，進(jìn)一步優(yōu)選至少約 1. 2mg/ml，最優(yōu)選至少約1. 5mg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用在線混合來(lái)制備未濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物 分散體系。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，未濃縮的分散體系的體積為至少10mL，更優(yōu)選至少約 50mL，更優(yōu)選至少約500mL，再優(yōu)選至少約1L，進(jìn)一步優(yōu)選至少約2L，更進(jìn)一步優(yōu)選至少約 3L，再進(jìn)一步優(yōu)選至少約4L，又進(jìn)一步優(yōu)選至少約5L，繼續(xù)進(jìn)一步優(yōu)選至少約10L。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，未濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系的平均PDI 小于約0. 5，更優(yōu)選小于約0. 4，更優(yōu)選小于約0. 3，再優(yōu)選小于約0. 2。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系的平均PDI小 于約0. 5，更優(yōu)選小于約0. 4，更優(yōu)選小于約0. 3，再優(yōu)選小于約0. 2。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物的N P比例為至少約2 1，更優(yōu)選至少約5 1， 更優(yōu)選至少約10 1，再優(yōu)選至少約15 1，進(jìn)一步優(yōu)選至少約20 1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物包含具有平均小于約3000個(gè)，更優(yōu)選小于約2000 個(gè)，更優(yōu)選小于約1500個(gè)，再優(yōu)選小于約1000個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選小于約500個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選 小于約100個(gè)，再進(jìn)一步優(yōu)選小于約50個(gè)氨基葡萄糖單體單元的脫乙酰殼多糖分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物包含平均分子量小于約500kDa，更優(yōu)選小于約 250kDa，更優(yōu)選小于約150kDa，再優(yōu)選小于約IOOkDa,進(jìn)一步優(yōu)選小于約50kDa，更進(jìn)一步 優(yōu)選小于約25kDa的脫乙酰殼多糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中復(fù)合物的平均直徑小于約750nm，更優(yōu)選小于約 500nm，更優(yōu)選小于約250nm，再優(yōu)選小于約200nm，進(jìn)一步優(yōu)選小于約150nm。一方面，本發(fā)明提供了本文公開(kāi)的方法所產(chǎn)生的濃縮的脫乙酰殼多糖核酸復(fù)合 物。一方面，本發(fā)明提供了調(diào)整通過(guò)混合脫乙酰殼多糖和核酸溶液形成的脫乙酰殼多 糖-核酸復(fù)合物的特性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)整脫乙酰殼多糖-核 酸復(fù)合物直徑的方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了調(diào)整脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物 ζ電位的方法。該方法包括改變用于產(chǎn)生復(fù)合物的脫乙酰殼多糖或核酸溶液的體積，而不 改變核酸與脫乙酰殼多糖的比例或混合溶液中核酸和脫乙酰殼多糖的濃度。在優(yōu)選的是實(shí) 施方案中，該方法包括在線混合脫乙酰殼多糖和核酸原料溶液?！矫妫景l(fā)明提供了包含水合的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的藥物組合物，組 合物中核酸的濃度大于約0. 5mg/ml，其中脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物包含治療性核酸構(gòu)建 體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物的核酸的濃度為至少約0. 6mg/ml，更優(yōu)選至少 約0. 75mg/ml，更優(yōu)選至少約1. Omg/ml，再優(yōu)選至少約1. 2mg/ml，最優(yōu)選至少約1. 5mg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物包含聚集抑制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚集抑 制劑為糖，優(yōu)選蔗糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物具有濃度小于約80mM，更優(yōu)選小于約60mM，更 優(yōu)選小于約40mM，再優(yōu)選小于約20mM的平衡陰離子。優(yōu)選地，平衡陰離子為醋酸離子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物是等滲的。在其他實(shí)施方案中，組合物可以是高 滲或低滲的。一方面，本發(fā)明提供了制備濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物分散體系的方法， 包括在線混合脫乙酰殼多糖和核酸溶液以形成未濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散 體系，隨后使用TFF濃縮未濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系以產(chǎn)生濃縮的脫乙 酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，TFF使分散體系濃縮至少2倍，更優(yōu)選至少5倍，更優(yōu)選至 少6倍，再優(yōu)選至少7倍，進(jìn)一步優(yōu)選至少8倍，更進(jìn)一步優(yōu)選至少9倍，最優(yōu)選至少10倍。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮的分散體系中核酸的濃度為至少約0. 5mg/ml，更優(yōu)選 至少約0. 6mg/ml，更優(yōu)選至少約0. 75mg/ml，再優(yōu)選至少約1. Omg/ml，進(jìn)一步優(yōu)選至少約 1. 2mg/ml，最優(yōu)選至少約1. 5mg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，濃縮的分散體系具有濃度小于約80mM，更優(yōu)選小于約 60mM,更優(yōu)選小于約40mM，再優(yōu)選小于約20mM的平衡陰離子。優(yōu)選地，平衡陰離子為醋酸離子。優(yōu)選地，濃縮的分散體系包含聚集抑制劑。聚集抑制劑優(yōu)選為糖，更優(yōu)選為蔗糖。優(yōu)選地，濃縮的分散體系是等滲的，在另外的實(shí)施方案中，濃縮的分散體系可以是 高滲或低滲的。附圖簡(jiǎn)述

圖1表示制造IL批次的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系以及隨后進(jìn)行TFF 濃縮的典型過(guò)程示意2是小規(guī)模在線混合過(guò)程的示意圖。注射器不含聚丙烯乳膠，且每個(gè)容量可調(diào) 整至高達(dá)60mL。兩個(gè)精密注射泵驅(qū)動(dòng)注射器。管為內(nèi)徑(ID)1/16英寸的鉬金硫化硅膠 (platinum cured silicone) 0混合連接處顯示為Y，但也可以是Τ。結(jié)構(gòu)的混合連接材料 為聚丙烯。圖3是制備IOL脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物分散體系的中等規(guī)模在線混合過(guò)程示 意圖。對(duì)于更小的批次規(guī)模，對(duì)所有的管道均進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。管道直徑為0.48cm(3/16英 寸)。顯示了以2 1的體積比混合的DNA 脫乙酰殼多糖的泵流量(pump flow rate)。圖是4TFF濃縮過(guò)程的示意圖。圖5是中等規(guī)模過(guò)程產(chǎn)生的且以不同比例混合的復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染的結(jié)果圖。圖6是通過(guò)與10%蔗糖小規(guī)?；旌虾涂焖賂FF制備的復(fù)合物在室溫下的穩(wěn)定性 圖。圖7表示改變DNA和脫乙酰殼多糖原料的體積對(duì)復(fù)合物直徑和PDI的影響?？刂?體積比例可以控制粒度。組合物在表10中有描述。所有的最終產(chǎn)品是N40-C75。發(fā)明詳述“脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物”、“脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物顆?！被颉皬?fù)合物”意 指包含多個(gè)脫乙酰殼多糖分子(每個(gè)分子為氨基葡萄糖單體的聚合物)和多個(gè)核酸分子 的復(fù)合物。脫乙酰殼多糖單體包括衍生物，衍生物包括與配體相連的脫乙酰殼多糖。“衍 生物”可以應(yīng)當(dāng)理解為包括以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的種類寬泛的聚合物，這類聚合物包括 共價(jià)修飾的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖單元，以及結(jié)合其他單元或連接于其他部分的以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的聚合物。衍生物往往基于對(duì)氨基葡萄糖的羥基或 氨基的修飾。脫乙酰殼多糖衍生物的例子包括但不限于，三甲基化脫乙酰殼多糖、聚乙二 醇化脫乙酰殼多糖(PEGylatedchitosan)、巰基化脫乙酰殼多糖(thiolated chitosan)、 半乳糖化脫乙酰殼多糖、烷基化脫乙酰殼多糖、結(jié)合PEI的脫乙酰殼多糖、精氨酸修飾的 脫乙酰殼多糖、糖醛酸修飾的脫乙酰殼多糖等。有關(guān)脫乙酰殼多糖衍生物的進(jìn)一步教 導(dǎo)，參見(jiàn)，例如〃 Non-viral Gene Therapy (非病毒基因療法)〃 ,K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (editors), Springer-Verlag Tokyo, 2005, ISBN4-431-25122-7 的 63-74 頁(yè)； Zhu et al. ,Chinese Science Bulletin，December2007，vol. 52 (23)，pp. 3207—3215 ；以及 Varma et al. , Carbohydrate Polymers55(2004)77-93。本文所用的脫乙酰殼多糖聚合物的“平均重量”是指平均分子量?！捌胶怅庪x子”是指能與帶有電荷的脫乙酰殼多糖胺產(chǎn)生靜電相互作用的陰離子。 優(yōu)選的平衡陰離子包括醋酸離子和氯離子。脫乙酰殼多糖可以按照2007年3月30日提交的U. S. S. N. 11/694，852所描述的 方法制備，該將申請(qǐng)的全部能容通過(guò)引用明確并入。也可以使用脫乙酰殼多糖衍生物，脫乙 酰殼多糖衍生物包括包含配體部分的衍生物。脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的組合物一方面，本發(fā)明提供了脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物，該組合物包含水合 的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物。組合物中的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物被高度濃縮，核酸 濃度大于約0.5mg/ml。組合物基本上不含復(fù)合物沉淀。本文所用的“基本上不含”復(fù)合物 沉淀是指組合物中基本上不含目視可見(jiàn)的顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物具有濃度為至少約 0. 6mg/ml，更優(yōu)選至少約0. 75mg/ml，更優(yōu)選至少約1. 0mg/ml，再優(yōu)選至少約1. 2mg/ml，最 優(yōu)選至少約1.5mg/ml的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中基本上不含未復(fù)合的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物是分散體系。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，分散體系是等滲的。在保持復(fù)合物穩(wěn)定性的同時(shí)獲得等滲性，在配制藥物組 合物中是非常理想的，因此這些優(yōu)選的組合物非常適于藥物配制和治療應(yīng)用。在其他實(shí)施方案中，組合物可以是高滲或低滲的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物還包含聚集抑制劑。 聚集抑制劑是能部分或全部減少?gòu)?fù)合物聚集和/或沉淀，并能通過(guò)濃縮方法，優(yōu)選通過(guò)切 向流動(dòng)過(guò)濾(“TFF”)，濃縮脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的試劑。盡管其他聚集抑制劑，例 如能夠減少?gòu)?fù)合物沉淀以及能濃縮脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的其他糖也可以使用，但高 度優(yōu)選的聚集抑制劑是蔗糖。其他聚集抑制劑的實(shí)例包括但不限于海藻糖、甘油、果糖、葡 萄糖、以及其他還原糖和非還原糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的聚集抑制劑為蔗糖。脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分 散體系中蔗糖的濃度優(yōu)選按重量計(jì)為約3% -20%。最優(yōu)選蔗糖的濃度提供等滲組合物。脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的組合物中復(fù)合物的分子大小優(yōu)選是均一的。因此， 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物具有低的平均多分散性指數(shù) (“PDI”)。在特別優(yōu)化的實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的分散體系的PDI小于 約0. 5，更優(yōu)選小于約0. 4，更優(yōu)選小于約0. 3，再優(yōu)選小于約0. 2。
優(yōu)選地，組合物中脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的大小基本上穩(wěn)定。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，本發(fā)明的組合物包含這樣的復(fù)合物，其在室溫下6小時(shí)(hr)，更優(yōu)選12小時(shí)，更優(yōu) 選24小時(shí)，再優(yōu)選48小時(shí)，平均直徑增加小于100%，更優(yōu)選小于50%，更優(yōu)選小于25%。優(yōu)選地，在冷環(huán)境中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的大小基本上穩(wěn)定。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，本發(fā)明包含這樣的復(fù)合物，其在2-8攝氏度下6小時(shí)，更優(yōu)選12小時(shí)，更優(yōu)選24 小時(shí)，再優(yōu)選48小時(shí)，平均直徑增加小于100%，更優(yōu)選小于50%，更優(yōu)選小于25%。優(yōu)選地，在冷凍-解凍條件下，組合物的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的大小基本上 穩(wěn)定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含這樣的組合物，其在-20到-80攝氏度的冷凍中解 凍后，在室溫下6小時(shí)，更優(yōu)選12小時(shí)，更優(yōu)選24小時(shí)，再優(yōu)選48小時(shí)，平均直徑增加小于 100%,更優(yōu)選小于50%，更優(yōu)選小于25%。脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物包含核酸成分和脫乙酰殼多糖成分。本發(fā)明的核酸通 常含有磷酸二酯鍵，盡管某些情況下為了多種目的，如穩(wěn)定性和保護(hù)，包括有替代骨架或其 它修飾或部分的核酸類似物。所考慮的其他核酸類似物包括帶有非核主鏈的類似物。此外， 可以制備天然存在的核酸、類似物以及它們兩者的混合物。核酸可以是單鏈的或雙鏈的，或 含有部分雙鏈或單鏈序列。核酸包括但不限于DNA、RNA以及雜合體，其中核酸含有各種脫 氧核糖核苷酸與核糖核苷酸的任何組合，以及堿基的任何組合，所述堿基包括尿嘧啶、腺嘌 呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤。核酸包括任何 形式的DNA、任何形式的RNA，包括三鏈體、雙鏈體或單鏈體、反義、siRNA、核酶、脫氧核酶、 多核苷酸、寡核苷酸、嵌合體及其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸成分包含治療性核酸。治療性核酸包含治療性RNA，它是 能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮治療效果的RNA分子。治療性RNA包括反義RNA、siRNA、短的發(fā) 夾RNA、酶性RNA。治療性核酸包括用于形成三鏈體分子的核酸、蛋白結(jié)合核酸、核酶、脫氧 核酶和小核苷酸分子。治療性核酸也包括編碼治療性蛋白質(zhì)的核酸，包括細(xì)胞毒性蛋白和前體藥物；核 酶；它們的反義或互補(bǔ)物；或其他此類分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸成分包括治療性核酸構(gòu)建體。治療性核酸構(gòu)建體是能 夠發(fā)揮治療效果的核酸構(gòu)建體。治療性核酸構(gòu)建體可以包含編碼治療性蛋白質(zhì)的核酸以及 產(chǎn)生治療性RNA轉(zhuǎn)錄物的核酸。治療性RNA是能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮治療效果的RNA分 子。治療性RNA包括反義RNA、siRNA、短的發(fā)夾RNA、酶性RNA。治療性核酸包括用于形成 三鏈體分子的核酸、蛋白結(jié)合核酸、核酶、脫氧核酶和小核苷酸分子。治療性核酸可以實(shí)現(xiàn) 用于基因治療，作為有缺陷的基因的替代物或增強(qiáng)劑或者通過(guò)編碼治療性產(chǎn)物補(bǔ)償特定基 因產(chǎn)物的缺乏。治療性核酸也可以抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。治療性核酸可以編碼全部或部分 翻譯產(chǎn)物，或者通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)存在的DNA重組發(fā)揮作用，由此取代有缺陷的部分基因。 它也可以編碼蛋白的一部分并通過(guò)基因產(chǎn)物的共同抑制來(lái)發(fā)揮其效果。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，治療性核酸選自U. S. S. N 11/694，852所公開(kāi)的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物包含具有平均小于約3000個(gè)，更優(yōu)選小于約2000 個(gè)，更優(yōu)選小于約1500個(gè)，再優(yōu)選小于約1000個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選小于約500個(gè)，更進(jìn)一步優(yōu)選 小于約100個(gè)，再進(jìn)一步優(yōu)選小于約50個(gè)氨基葡萄糖單體單元的脫乙酰殼多糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合物包含平均重量小于約500kDa，更優(yōu)選小于約250kDa，更優(yōu)選小于約150kDa，再優(yōu)選小于約IOOkDa,進(jìn)一步優(yōu)選小于約50kDa，更進(jìn)一步 優(yōu)選小于約25kDa的脫乙酰殼多糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中復(fù)合物的平均直徑小于750nm，更優(yōu)選小于 500nm，更優(yōu)選小于約250nm，再優(yōu)選小于約200nm，進(jìn)一步優(yōu)選小于約150nm。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖成分的平均分子量在3kDa和250kDa之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖成分的平均分子量大于或等于250kDa。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖成分的平均分子量小于或等于3kDa。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的N P比例在約2 1和約 100 1之間，更優(yōu)選在約5 1和約90 1之間，更優(yōu)選在約10 1和約90 1之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的N P比例大于或等于90 1。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的N P比例小于或等于10 1。在一個(gè)實(shí)施方案中，在pH為5時(shí)，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的平均ζ電位在 +30mV 禾Π +50mV 之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，在pH值為5時(shí)，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的平均ζ電位小 于或等于+30mV。在一個(gè)實(shí)施方案中，在pH值為5時(shí)，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的平均ζ電位大 于或等于+50mV。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的平均直徑小于225nm。在一個(gè)實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的平均直徑大于或等于225nm。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的pH值小于6. 5，更優(yōu)選小于6. 0，最優(yōu)選在約4. 5和 約5. 5之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的pH值大于或等于6. 5。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物的pH值小于或等于4. 5。在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合物中脫乙酰殼多糖分子的脫乙酰程度大于約70%，更優(yōu) 選大于約75 %，更優(yōu)選大于約80 %，再優(yōu)選大于約85 %，進(jìn)一步優(yōu)選大于約90 %，更進(jìn)一步 優(yōu)選大于約95 %，最優(yōu)選至少98 %。在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合物中脫乙酰殼多糖的脫乙酰程度小于或等于70%。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物基本上由脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物和聚集抑 制劑組成。這樣的組合物可以包括平衡陰離子和其他賦形劑，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物基本上由脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物組成。 這樣的組合物可以包括平衡陰離子和其他賦形劑，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物選自U. S. S. N 11/694，852所公開(kāi)的復(fù)合物。制備方法在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的高濃度脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合 物，通過(guò)濃縮未濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系制備。未濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物的核酸濃度優(yōu)選小于0. 5mg/ml。盡管其他的方法，如將核酸或脫乙酰殼多糖溶液滴人另一種溶液中以形成混合溶 液的方法，也可以使用，但未濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系優(yōu)選通過(guò)在線混合方法制備。然而，在線混合方法適于制備大體積均一的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物，該 復(fù)合物的平均PDI優(yōu)選小于0. 5，更優(yōu)選小于約0. 4，再優(yōu)選小于約0. 3，進(jìn)一步優(yōu)選小于約 0. 2。在線混合是一個(gè)公知的過(guò)程，其中兩股(或更多股)流體被匯聚成單股。在線 混合在下面進(jìn)行了示例。有關(guān)在線混合的其他公開(kāi)內(nèi)容，可參見(jiàn)，例如U. S. 6，251，599和 6，537，813，在此將每一篇都通過(guò)引用全文并入。盡管可以使用如靜態(tài)混合器和動(dòng)態(tài)混合器的混合器，但此類裝置會(huì)導(dǎo)致本發(fā)明方 法所形成的復(fù)合物的PDI增加。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，不使用此類混合器進(jìn)行 在線混合。在本發(fā)明中，切向流動(dòng)過(guò)濾(“TFF”)是濃縮未濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物 分散體系的優(yōu)選方法。在TFF操作中，脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系在泵的驅(qū)動(dòng)下 通過(guò)半滲透膜的表面，同時(shí)向膜的方向施加壓力以驅(qū)使一部分流體穿過(guò)膜。小于膜孔的分 子穿過(guò)膜并被作為滲透液收集。滲透溶質(zhì)包括但不限于鹽、離子、糖和微生物防腐劑。體太 大而不能穿過(guò)膜的分子實(shí)體，包括脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物，被保留在流體中，作為保留 物被再循環(huán)。使用TFF，復(fù)合物濃度可以被增加許多倍，得到高濃縮的復(fù)合物分散體系。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，高濃縮的復(fù)合物分散體系是等滲的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，未濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物分散體系包括糖，優(yōu) 選蔗糖。如下文所述，發(fā)現(xiàn)蔗糖是防止?jié)饪s過(guò)程中顆粒聚集的聚集抑制劑。此外，蔗糖是有 效的防凍劑，DNA濃度為約lmg/mL并含有多達(dá)15%的蔗糖的示例性冷凍復(fù)合物分散體系穩(wěn) 定可長(zhǎng)達(dá)至少1個(gè)月。使用TFF濃縮未濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物在下文進(jìn)行了示例。通過(guò)操作原料體積改變脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的特性令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，在保持脫乙酰殼多糖核酸比例基本上不變并保持脫乙酰殼 多糖和核酸的混合濃度基本上不變的情況下，可以調(diào)整通過(guò)混合核酸和脫乙酰殼多糖形成 的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的特性。特別是，發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變脫乙酰殼多糖和核酸原料溶 液的體積比，可以改變通過(guò)混合這兩種溶液形成的復(fù)合物的特性。因此，一方面，本發(fā)明提供了調(diào)整通過(guò)混合核酸和脫乙酰殼多糖形成的脫乙酰殼 多糖-核酸復(fù)合物的特性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)整脫乙酰殼多糖-核 酸復(fù)合物直徑的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)整脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合 物ζ電位的方法。該方法包括改變用于產(chǎn)生復(fù)合物的脫乙酰殼多糖和核酸溶液的體積，而 基本上不改變核酸與脫乙酰殼多糖的比例或混合溶液中核酸和脫乙酰殼多糖的濃度。在優(yōu) 選的實(shí)施例中，該方法包括在線混合脫乙酰殼多糖和核酸的原料溶液。粉末制劑本發(fā)明的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物包括粉末。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了干粉形式的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物。在優(yōu)選的實(shí)施例里，干粉 形式的的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物通過(guò)使本發(fā)明的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物 分散體系脫水產(chǎn)生。使用方法除了治療性應(yīng)用外，本發(fā)明在期望穩(wěn)定核酸或期望增加核酸濃度的任何時(shí)候通常都是有用的。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，在程序進(jìn)行中的任何時(shí)候，核酸的穩(wěn)定性都很重要，該程序 危機(jī)核酸結(jié)構(gòu)的完整性和功能性。藥物制劑本發(fā)明也提供了“藥學(xué)上可接受的”或“生理上可接受”的包含本發(fā)明的脫乙酰殼 多糖_核酸復(fù)合物的組合物的制劑。此類制劑可以體內(nèi)給予個(gè)體以實(shí)施治療方法。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”和“生理上可接受”的是指優(yōu)選在不產(chǎn)生過(guò)度 的不良副作用(如惡心、腹部疼痛、頭痛等)的情況下，可以給予個(gè)體的載體、稀釋劑、賦形 劑等。此類給藥制品包括無(wú)菌水性或非水性溶液、懸液以及乳劑。藥物制劑可以由與向個(gè)體給藥相容的載體、稀釋劑、賦形劑、溶劑、分散介質(zhì)、包 衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等制成。此類制劑可以包含在片劑(包衣或不 包衣)、膠囊劑(硬的或軟的)、微球、乳劑、粉劑、顆粒、晶體、懸液、糖漿或酏劑中。也可以 存在輔助性活性化合物和防腐劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體等。藥物制劑經(jīng)配制，可以與其既定的給藥途徑相容。例如，對(duì)于口服給藥而言，組合 物可以與賦形劑混合，以片劑、錠劑或膠囊如明膠膠囊的形式使用。藥學(xué)上相容的粘合劑， 和/或佐劑材料也可以包括于口服制劑中。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有下列任何 一種成分，或類似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳 糖；崩解劑如褐藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes ； 助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精或調(diào)味劑如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或調(diào)味料。制劑也可以包括載體以保護(hù)組合物避免快速降解或從體內(nèi)排出，例如控釋制劑， 包括植入和微膠囊送遞系統(tǒng)。例如，可以使用延時(shí)材料，如單獨(dú)使用單硬脂酸甘油酯或硬脂 酸甘油酯，或使用其與蠟的組合。也可考慮栓劑和其他直腸給藥制劑(如通過(guò)灌腸給藥的制劑)。其他有關(guān)直腸給 藥方式，參見(jiàn)，例如，Song et al. ,Mucosal drug delivery :membranes,methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. CarrierSyst. ,21 :195-256, 2004 ；Wearley, Recent progress in protein and peptidedelivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst.，8 :331_394，1991。適于給藥的其他藥物制劑在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，也可以用于本發(fā)明的組合物和方 法中(參見(jiàn),例如,Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物學(xué))(1990) 18th ed. ， Mack Publishing Co. ， Easton, Pa. ；The MerckIndex( 克胃弓| ) (1996) 12th ed.， Merck Publishing Group,ffhitehouse,N. J.；以及Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (固體劑型的制藥學(xué)原理)，Technonic Publishing Co. , Inc. , Lancaster, Pa.，(1993))。給藥許多種給藥途徑中的任何途徑都是可能的，并且具體給藥途徑的選擇部分取決于 目標(biāo)組織。注射器、內(nèi)窺鏡、瘺管、插管、導(dǎo)管和其他器械都可用于給藥。盡管預(yù)防或抑制病癥、疾病或狀況的進(jìn)展或惡化是滿意的結(jié)果，但治療個(gè)體的劑 量或“有效量”優(yōu)選足以以可測(cè)量或檢測(cè)的程度改善狀況的一個(gè)、幾個(gè)個(gè)或全部癥狀。因此， 在通過(guò)在目標(biāo)組織中表達(dá)治療性核酸可治療的狀況或病癥的情況下，所產(chǎn)生的用以改善本 發(fā)明的方法可治療的狀況的治療性RNA或蛋白質(zhì)的量，取決于狀況和期望的結(jié)果，并且可以由技術(shù)人員很容易地確定。適宜的用量取決于所治療的狀況、期望的治療效果以及單個(gè) 個(gè)體(如，個(gè)體、性別、年齡等帶來(lái)的生物利用度差異)。有效量可以通過(guò)測(cè)量相關(guān)的生理效 果來(lái)確定。本發(fā)明也考慮了獸醫(yī)應(yīng)用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療非人類哺 乳動(dòng)物的方法，其包括將本發(fā)明的以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的納米顆粒給予需要治療的非人 類哺乳動(dòng)物?？诜o藥本發(fā)明的復(fù)合物可以口服給藥?？诜o藥包括吞服，使組合物進(jìn)入胃腸道。本發(fā) 明的組合物也可以直接向胃腸道給藥。適于口服給藥的制劑包括固體制劑如片劑、包含顆粒的膠囊、液體或粉劑、錠劑 (包括液體填充的)、咀嚼劑(chew)、多粒子和納米顆粒、凝膠、薄膜、栓劑和噴霧劑。液體制劑包括懸液、溶液、糖漿和酏劑。液體制劑可以通過(guò)固體加水復(fù)原制備。片劑劑型通常含有崩解劑，崩解劑的例子包括乙醇鈉淀粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲 基纖維素鈣、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、微晶纖維素、 低烷基取代羥丙基纖維素、淀粉、預(yù)糊化淀粉和海藻酸鈉。通常，崩解劑含量為藥劑重量的 1% _25%，優(yōu)選為藥劑重量的5% -20%。粘合劑通常用于賦予片劑制劑粘合性能。適宜的粘合劑包括微晶纖維素、明膠、 糖、聚乙二醇、天然及合成樹(shù)膠、聚乙烯吡咯烷酮、預(yù)糊化淀粉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基 纖維素。片劑還可以含有稀釋劑，如乳糖(一水合、噴霧干燥一水合、無(wú)水等)、甘露醇、木糖 醇、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、微晶纖維素、淀粉和二水合雙磷酸鈣。片劑也可任選地包含表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉和吐溫80 (po 1 ysorbate 80)，以及助流劑如二氧化硅和滑石。當(dāng)存在時(shí)，表面活性劑含量可以為片劑重量的 0. 2% _5%，助流劑含量可以為片劑重量的0. 2% -1%。片劑通常含有潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂富馬酸鈉和硬脂酸鎂 與十二烷基硫酸鈉的混和物。潤(rùn)滑劑含量通常為片劑重量的0. 25% _10%，優(yōu)選為片劑重 量的 0. 2% -3%。其他可能含有的成分包括抗氧化劑、著色劑、調(diào)味劑、防腐劑和味道掩蔽劑。片劑混和物可以直接或者通過(guò)輥?zhàn)訅撼善瑒??？蛇x地，片劑混和物或部分混和物 在制成片劑前可以進(jìn)行濕、干或熔化制粒、熔化凝結(jié)或擠壓。最終的制劑可以包含一層或多 層，可以是包衣的或者不包衣的，也可以是封裝的。片劑制劑在Pharmaceutical Dosage Forms Tablets (藥物劑型片劑)，Vol. 1， by H. Lieberman and L. Lachman (Marcel Dekker, New York, 1980)中做了討論。人用或獸用口腔溶解薄膜(consumable oral film)通常是柔韌的水溶性或水膨 脹性薄膜劑型，其可以快速溶解或粘膜粘附，通常包含成膜聚合物、粘合劑、溶劑、保濕劑、 增塑劑、穩(wěn)定劑或乳化劑、粘度改性劑和溶劑。制劑中的某些成分可以履行一種以上的功 能。本發(fā)明也包括包含本發(fā)明組合物的多顆粒珠(multiparticulate bead)。其他可能含有的成分包括抗氧化劑、著色劑、調(diào)味劑和增味劑、防腐劑、唾液刺激 劑、冷卻劑、共溶劑(包括油)、潤(rùn)膚劑、膨化劑、抗泡劑、表面活性劑和味道掩蔽劑。
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本發(fā)明的薄膜通常通過(guò)蒸發(fā)干燥覆蓋在可剝離的背面支持物或紙上的含水薄膜 制備。此過(guò)程可以在烘箱或烘道內(nèi)完成，通常在組合的包衣干燥器中完成，或通過(guò)冷凍干燥 或真空干燥完成。口服給藥固體制劑經(jīng)配制，可以成為即釋型和/或調(diào)釋型，調(diào)釋型制劑包括，延遲 釋放、緩釋、脈動(dòng)釋放、控釋、靶向釋放和程序化釋放。其他的釋放技術(shù)，如高能分散體系、滲透和包衣顆粒是公知的。非腸道給藥本發(fā)明的復(fù)合物也可以直接給藥進(jìn)入血流、進(jìn)入肌肉、進(jìn)入內(nèi)臟器官。適宜的非腸 道給藥方法包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱骨內(nèi)、肌肉和皮 下。適宜的非腸道給藥裝置包括針(包括微針)注射器，無(wú)針注射器和輸注技術(shù)。非腸道制劑通常為可以含有賦形劑如鹽、碳水化合物和緩沖劑的水性溶液，但對(duì) 于某些應(yīng)用而言，更適宜配制成無(wú)菌非水性溶液或者配制成與適合的載體如無(wú)菌、無(wú)熱源 水結(jié)合使用的干燥形式。在無(wú)菌條件下制備非腸道制劑，如，通過(guò)凍干可以，很容易使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)完成?？梢酝ㄟ^(guò)使用適當(dāng)?shù)呐渲萍夹g(shù)比如加入增溶劑，增加在制備非腸道用溶液時(shí)所用 的復(fù)合物的溶解性。非腸道給藥制劑可以制成即釋型和/或調(diào)釋型，調(diào)釋型制劑包括，延遲釋放、緩 釋、脈動(dòng)釋放、控釋、靶向釋放和程序化釋放。本發(fā)明的復(fù)合物可以制成固體、半固體或觸變 液體，用于作為提供活性復(fù)合物的調(diào)控釋放的植入庫(kù)給藥。局部給藥本發(fā)明的復(fù)合物也可以對(duì)皮膚或粘膜局部給藥，即皮膚給藥或透皮給藥。這種給 藥方式的典型制劑包括凝膠、水凝膠、洗液、溶液、乳劑、藥膏、撒粉劑(dusting powder)、敷 料劑、泡沫劑、薄膜、皮膚貼劑、晶片(wafer)、植入物、海綿、纖維、繃帶和微乳液。局部給藥的其他方式包括通過(guò)電穿孔送遞、電離子透入、超聲波透入、超聲波導(dǎo)入 和微針或無(wú)針(如Powderject ，Bioject 等)注射。局部給藥制劑可以制成即釋型和/或調(diào)釋型。調(diào)釋型制劑包括，延遲釋放、緩釋、 脈動(dòng)釋放、控釋、靶向釋放和程序化釋放。吸入/鼻腔給藥本發(fā)明的復(fù)合物也可以通過(guò)鼻腔內(nèi)或者吸入給藥，通常是以來(lái)自干粉吸入器的 干粉形式(單獨(dú)或以組合物形式使用，如與乳糖組成干的混合物，或者作為混合的顆粒成 分)，或在使用或不使用適宜的推進(jìn)劑的情況下作為來(lái)自加壓的容器、泵、噴霧器、霧化器或 噴氣器的氣溶膠噴霧。用于吸入器或吹藥器內(nèi)的藥囊、氣泡、藥筒可以被制成含有本發(fā)明的復(fù)合物的粉 末、適宜的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉和改性劑如L-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸鎂組合物。吸入/鼻腔內(nèi)給藥制劑可以制成即釋型和/或調(diào)釋型。調(diào)釋型制劑包括，延遲釋 放、緩釋、脈動(dòng)釋放、控釋、靶向釋放和程序化釋放。直腸/陰道內(nèi)給藥本發(fā)明的復(fù)合物也可以直腸或陰道給藥，例如，以栓劑、陰道栓劑(pressary)或灌腸劑的形式。可可油是一種傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)，但多種替代物也可以酌情使用。直腸/陰道給藥制劑可以制成即釋型和/或調(diào)釋型。調(diào)釋型制劑包括，延遲釋放、 緩釋、脈動(dòng)釋放、控釋、靶向釋放和程序化釋放。眼部/耳部給藥本發(fā)明的復(fù)合物也可以向眼或耳直接給藥，通常是以滴劑的形式。其他適于眼部 或耳部給藥的制劑包括藥膏、可生物降解(如可吸收凝膠海綿，膠原蛋白)和非生物降解 (如硅)的植入物、晶片、鏡片和顆粒系統(tǒng)。制劑也可以使用離子透入法送遞。眼部/耳部給藥可以制成即釋型和/或調(diào)釋型，調(diào)釋型制劑包括，延遲釋放、緩釋、 脈動(dòng)釋放、控釋、靶向釋放和程序化釋放。
實(shí)施例實(shí)施例1 制備濃度高達(dá)250 μ g/mL的復(fù)合物隨后濃縮至大于lmg/mL示例性的試劑、濃度和比例說(shuō)明見(jiàn)圖1和下文的描述。使用注射泵和高速蠕動(dòng)泵、硅膠管和聚丙烯T型接頭測(cè)試簡(jiǎn)單的小規(guī)模在線混合 設(shè)備。這個(gè)過(guò)程使用23mer/98% DDA脫乙酰殼多糖(即平均有23個(gè)單體(氨基葡萄糖) 的脫乙酰殼多糖聚合物，98%脫乙酰)，在20的N/P比例下，制備DNA終濃度高達(dá)250 μ g/mL 的復(fù)合物。結(jié)果表明，復(fù)合物的粒度和PDI可以通過(guò)控制原料的濃度、體積混合比以及DNA 和脫乙酰殼多糖溶液的流速來(lái)緊密控制。另外，發(fā)現(xiàn)在DNA和脫乙酰殼多糖原料中加入蔗 糖通過(guò)降低粒度和PDI而有助于制造過(guò)程。加入蔗糖也防止了濃縮過(guò)程顆粒聚集。DNA濃 度為約lmg/mL且含有高達(dá)15%的蔗糖的冷凍復(fù)合物可以保持穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)至少一個(gè)月。此外， 在線混合過(guò)程可以容易的從50mL調(diào)整至高達(dá)2L，并保持低的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值粒度 =士9%，PDI = 士6%。 復(fù)合物命名規(guī)定各項(xiàng)目指的是脫乙酰殼多糖的類型、N/P比例、乙酸含量、pH值和DNA濃度。有詳 細(xì)描述的示例在表1中給出。表1 復(fù)合制劑命名規(guī)定實(shí)例 在線混合流程圖1中表示制造IL批次以及隨后TFF濃縮的典型過(guò)程的方框圖。小規(guī)模在線混合測(cè)試簡(jiǎn)單的小規(guī)模在線混合設(shè)備，該設(shè)備使用注射泵、內(nèi)徑1/16英寸的硅膠管、 內(nèi)徑3/32英寸的T形聚丙烯接頭。帶有容量為3mL的注射器的設(shè)備的示意圖如圖2所示。 注意此設(shè)備的最大注射器容積為60mL。此過(guò)程用于在20的N/P比例下，使用24mer/98% DDA脫乙酰殼多糖制備DNA終濃度為150yg/mL的復(fù)合物。DNA和脫乙酰殼多糖原料以 21的體積比混合以產(chǎn)生均一的復(fù)合物制劑。中等規(guī)模在線混合測(cè)試簡(jiǎn)單的中等規(guī)模在線混合設(shè)備，該設(shè)備使用蠕動(dòng)泵、內(nèi)徑3/16英寸的硅膠 管、內(nèi)徑3/16英寸的聚丙烯接頭。帶有Y型接頭的設(shè)備示意圖如圖3所示。注意此設(shè)備的最 大輸出體積僅受原料管體積的限制。此過(guò)程用于在20的N/P比例下，使用24mer/98% DDA 脫乙酰殼多糖制造DNA終濃度為150 μ g/mL的復(fù)合物。DNA和脫乙酰殼多糖原料以2 1 的體積比混合以產(chǎn)生均一的復(fù)合物制劑。TFF 過(guò)程進(jìn)行TFF研究之前，根據(jù)制造商的說(shuō)明書沖洗和清理中空纖維過(guò)濾器。按照示意 圖(圖4)所示，安裝TFF系統(tǒng)并清除殘留的水以進(jìn)行濃縮。在關(guān)閉滲透閥并完全打開(kāi)背壓閥之后，將DNA-脫乙酰殼多糖復(fù)合物添加到產(chǎn)品貯液器中。通過(guò)打開(kāi)泵、完全打開(kāi)滲透閥 并隨后調(diào)整背壓閥以適應(yīng)濾器進(jìn)口壓，啟動(dòng)濃縮。在濃縮過(guò)程中，在天平上觀察收集到的滲 透液的量，以用于確定何時(shí)達(dá)到DNA濃度目標(biāo)。參見(jiàn)下面的公式
當(dāng)體積減少目標(biāo)達(dá)到以后，關(guān)閉滲透閥并完全打開(kāi)背壓閥，以停止?jié)饪s過(guò)程。清 洗管中殘留的液體并收集終產(chǎn)品后，這種TFF濃縮后的產(chǎn)品的樣品被送交分析測(cè)試并通過(guò) PicoGreen測(cè)定檢測(cè)DNA濃度。剩余產(chǎn)品儲(chǔ)存在4°C下，直至檢測(cè)分析測(cè)試完成，然后及時(shí) 使用或冷凍保存。分析測(cè)試顆粒分級(jí)使用馬爾文納米光散射儀(Zetasizer Nano light scattering instrument)測(cè) 量粒度。通常，樣品不稀釋或在IOmM NaCl (最少0. 4mL)中稀釋20倍并裝入一次性比色皿。 馬爾文納米光散射儀的程序設(shè)為在三次3分鐘(min)測(cè)量之前，在25°C下將樣品溫育3分 鐘。將Z-平均直徑和多分散性(PDI)報(bào)告為標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。馬爾文納米光散射儀的程 序也可以設(shè)為就粘度和折射率解析樣品的組成。ζ 電位使用馬爾文納米光散射儀測(cè)量ζ電位。通常，將未稀釋的樣品裝進(jìn)馬爾文納米光 散射儀的折疊的毛細(xì)管池(最小0. 8mL)。馬爾文納米光散射儀的程序設(shè)為在重復(fù)測(cè)量(重 復(fù)次數(shù)由馬爾文納米光散射儀軟件自動(dòng)確定)之前，在25°C下將樣品溫育3分鐘。將ζ電 位值報(bào)告為標(biāo)準(zhǔn)偏差(η = 3)。馬爾文納米光散射儀的程序也可以就粘度和介電常數(shù)解析 最終樣品的組成。冷凍的短期穩(wěn)定性為研究短期穩(wěn)定性，最終復(fù)合物產(chǎn)品被冷凍并保藏在適合的溫度下(-20°C、-3(TC 或-80°C )。在一些情況下，將樣品在干冰或乙醇浴中快速冷凍，并保藏在適合的溫度下。在 適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，將樣品解凍至室溫，按所述進(jìn)行分析。使用PicoGreen 定量 DNA在使用Pic0Green測(cè)定測(cè)量DNA之前，必須使用脫乙酰殼多糖酶使全部的DNA從 復(fù)合物釋放。釋放之后，使用合適的DNA限制性進(jìn)行DNA消化，使超螺旋DNA質(zhì)粒線性化。脫乙酰殼多糖酶消化為確保DNA的完全釋放，復(fù)合物在37°C下、pH 5. 5的150mMNaOAc中稀釋至50μ 1以獲得濃度為0. 909-1. 818mM的脫乙酰殼多糖(對(duì)于C(24， 98)-N20-cl000顆粒，樣品通常稀釋1/70和1/35以獲得目標(biāo)脫乙酰殼多糖濃度)。50 μ 1 稀釋的復(fù)合物使用50 μ 1 4. 44U/mL的脫乙酰殼多糖酶37°C下消化2小時(shí)。EcoRl 消化溫育之后，將* χ μ L脫乙酰殼多糖酶消化的產(chǎn)物添加到5 μ LEcoRl和5 μ LEcoRl 緩沖液中，并使用MilliQ水使終體積至50 μ L。(調(diào)整樣品體積* X μ L，以使DNA終濃度為 4ng/yL，通常，對(duì)C(24，98)-N20-cl000的顆粒樣品，樣品體積χ為25 μ L)。EcoRl樣品隨后在37°C下溫育30分鐘。PicoGreen 測(cè)定PicoGreen Quant-iT ds DNA HS檢測(cè)試劑盒提供了兩種緩沖液(Α和B)和兩個(gè)標(biāo) 準(zhǔn)品(1和2)。緩沖液A在緩沖液B中1 20稀釋以制備溶液“A/B”。標(biāo)準(zhǔn)品1和2使用 溶液A/B稀釋20倍(10 μ L加入200 μ L)。標(biāo)準(zhǔn)品1和2的終濃度分別為0和IOng/ μ L。用溶液Α/Β使10-20 μ L EcoRl消化產(chǎn)物的終體積至200 μ L，簡(jiǎn)單渦旋，在室溫 (RT)下溫育2分鐘然后按照制造商的說(shuō)明書在Qubit熒光計(jì)上測(cè)量熒光。凝膠電泳為了檢驗(yàn)捕獲到復(fù)合物中的DNA，對(duì)樣品進(jìn)行凝膠電泳。將l_5yL樣品等分試樣 (目標(biāo)為800ng DNA)與2yL Tracklt加樣緩沖液混合并用水使終體積至10 μ L。標(biāo)準(zhǔn)泳 道加入超螺旋DNA序列梯(DNA ladder)。將樣品在120V電壓下、在含有溴化乙錠(50 μ g/ ml)的0.8%脂糖凝膠中解析45分鐘。凝膠使用FluorChem成像系統(tǒng)成像。體外轉(zhuǎn)染通常，293T-K細(xì)胞與復(fù)合物制劑的體外轉(zhuǎn)染包括兩個(gè)步驟制備細(xì)胞以及隨后的 轉(zhuǎn)染。293T-K細(xì)胞的維持293T-K細(xì)胞承蒙在UBC的Dr. Kieffer' s實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，按以下方法制備。使用 SV40T抗體轉(zhuǎn)化人類腎細(xì)胞，在含有10%胎牛血清(FBS)以及青霉素/鏈霉素的高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(Dulbecco' sModified Eagle Medium, DMEM)中培養(yǎng)，并維持 匯合率在80%以下。用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的制備按以下方法制備用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染的前一天，將293T-K細(xì)胞添加到6孔組 織培養(yǎng)板(3X IO5細(xì)胞/孔)中的3mL完全培養(yǎng)基(高葡萄糖DMEM+10% FBS+青霉素/鏈 霉素)中。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，通過(guò)使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞一次，用ImLO. 05%胰蛋白酶 使細(xì)胞胰蛋白酶化，添加ImL完全培養(yǎng)基并使用血球計(jì)數(shù)器對(duì)IOyL進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)確定兩個(gè) 選定孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染按以下方法進(jìn)行。首先去除每個(gè)孔中的培養(yǎng)基然后往每個(gè)孔中添加ImL Opti-men (使用HCl將pH調(diào)至5. 0，并用0. 2um過(guò)濾器過(guò)濾)，輕輕攪拌然后去除(一次洗 滌6個(gè)孔以防止細(xì)胞移動(dòng))。往每個(gè)孔中再小心的添加ImL Opti-men，不要使細(xì)胞移動(dòng)。接 下來(lái)，向每個(gè)孔中添加復(fù)合物樣品(目標(biāo)為2yg DNA)，攪拌并在37°C下溫育2小時(shí)。溫育 后，去除培養(yǎng)基并用2mL完全培養(yǎng)基取代，在37°C下重新溫育。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)后，去除上 清并儲(chǔ)存在_20°C，用于隨后的SEAP測(cè)定。SEAP 測(cè)定使用SEAP化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒進(jìn)行SEAP測(cè)定，所有用于測(cè)定的試劑在使用前在 25°C下平衡30分鐘。在加入了 0. 牛血清白蛋白和50%的甘油的IX試劑盒的稀釋緩 沖液中將胎盤堿性磷酸酶溶解至lmg/mL，然后使用DMEM通過(guò)10倍連續(xù)稀釋至0. 01pg/uL。 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和解凍的樣品1份在4份稀釋緩沖液中，在65°C熱滅活30分鐘，冰上溫育2分 鐘，離心(室溫下16100Xrcf2分鐘)并將上清轉(zhuǎn)移到新管中。25°C平衡5分鐘后，一式兩份，向Microlite-I板的每個(gè)孔中添加50 μ L樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。隨后向每個(gè)孔中添加滅活緩 沖液(50 μ L)并在不產(chǎn)生氣泡的情況下輕輕地吹吸混合，并溫育5分鐘。在5分鐘的溫浴 過(guò)程中，準(zhǔn)備底物/增強(qiáng)劑，比例為底物增強(qiáng)劑1 19。將底物/增強(qiáng)劑添加到每個(gè)孔 中，溫育20分鐘，然后在光度計(jì)中以1秒鐘的整合時(shí)間對(duì)平板進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果快速在線混合C(23，98)-N40_c75+TFF使用中等規(guī)模在線混合系統(tǒng)以不同的流速90、210、270和420mL/min制備復(fù)合物。 該混合系統(tǒng)也使用了在線靜態(tài)混合裝置以評(píng)估裝置的效用。該系統(tǒng)不含有任何賦形劑。在 本研究中復(fù)合物的起始DNA濃度為0. 075mg/mL,隨后用TFF濃縮至0. 25mg/mL。根據(jù)計(jì)算出的在線靜態(tài)混合裝置的雷諾值選擇流速(表2)，雷諾值決定了在給定 的流速下實(shí)現(xiàn)溶液最優(yōu)混合的最小要素?cái)?shù)。下面的公式基于制造商的說(shuō)明書。
Re =雷諾值，Q =流速(加侖/分鐘)，S=比重，μ =粘度，D=管內(nèi)徑計(jì)算出的在線靜態(tài)混合裝置的雷諾值 表3表示混合終流速的增加導(dǎo)致Z-平均粒度和PDI的增加。使用TFF濃縮對(duì)粒 度、PDI、ζ電位、粘度(表3)或體外轉(zhuǎn)染(圖3)沒(méi)有明顯影響。表3 以不同速率混合的中等規(guī)模制備的復(fù)合物的大小、PDI、ζ電位 在線混合和TFF沉淀為得到至少lmg/mL的DNA濃度，我們?cè)噲D在0. 15mg/mL的DNA濃度下混合復(fù)合物 然后TFF濃縮至lmg/mL。然而，在這些研究過(guò)程中，濃縮步驟之后觀察到了明顯的沉淀(數(shù) 據(jù)未顯示)。這發(fā)生在小規(guī)模混合(3mL/分鐘和23mL/分鐘)和中等規(guī)?；旌?210mL/分 鐘和420mL/分鐘)中。在復(fù)合物形成過(guò)程中加入蔗糖以防止沉淀為除去TFF過(guò)程中的沉淀問(wèn)題，我們?cè)诨旌闲纬蓮?fù)合物前，向脫乙酰殼多糖和DNA 原料中加入了各種賦形劑(10wt%蔗糖、0. 09wt%甲基苯甲酸酯、0. 01wt%羥基苯甲酸丙 酯)。沒(méi)有使用靜態(tài)混合裝置。發(fā)現(xiàn)加入賦形劑防止了 TFF濃縮過(guò)程中顆粒的聚集和沉淀。 此外，發(fā)現(xiàn)不使用靜態(tài)混合裝置使PDI和顆粒穩(wěn)定性得到了改善。過(guò)程更新的小規(guī)模批次在混合前，使用含10%蔗糖的DNA和脫乙酰殼多糖原料制備小規(guī)模批次，使用 90mL/分鐘(剪切速率7200S—1)的再循環(huán)速率進(jìn)行TFF濃縮。TFF后，粒度小于200nm，而 且沒(méi)有沉淀。粒度列于表4。表4 在室溫下18小時(shí)后，大小趨于約140nm而且在室溫下3天后仍沒(méi)有觀察到沉淀 (圖6)。此外，TFF后的樣品在-20°C或-80°C冷凍/解凍后也沒(méi)有沉淀。在室溫下24小 時(shí)后，從-20°C和_80°C解凍的顆粒分別趨于約160nm和150nm(表5)。此外，體外轉(zhuǎn)染測(cè)定 顯示，該批次具有生物效能(數(shù)據(jù)未顯示)。表5使用了 10%蔗糖的小規(guī)?；旌弦约翱焖賂FF 冷凍-解凍 過(guò)程更新的中等規(guī)模批次使用所有上面所述的過(guò)程變化在與蔗糖溶液混合前過(guò)濾DNA原料；在混合前DNA 和脫乙酰殼多糖原料就含10%蔗糖；使用90mL/分鐘(剪切速率TZOOS—1)的再循環(huán)速率進(jìn) 行TFF濃縮，來(lái)制備驗(yàn)證性中等規(guī)模批次。此外，制備了不含蔗糖和對(duì)羥基苯甲酸酯的對(duì)照 批次。在非賦形劑(對(duì)照)批次中，TFF過(guò)程中和過(guò)程后很容易觀察到沉淀(數(shù)據(jù)未顯 示)。而在賦形劑批次中，直到DNA濃度超過(guò)約1. 5mg/mL也沒(méi)有觀察到沉淀。表6 包括賦形劑的復(fù)合物批次的參數(shù) 中等規(guī)模0.8L示范批次我們測(cè)試在線混合過(guò)程和TFF過(guò)程到達(dá)0. 8L批次規(guī)模的可擴(kuò)縮性 (scalability)。混合復(fù)合物至體積達(dá)到0. 8L，然后通過(guò)TFF濃縮至1. lmg/mL。該研究通 過(guò)在混合過(guò)程的最初、中間、結(jié)尾取多份5mL混合的復(fù)合物的等分試樣來(lái)檢測(cè)混合過(guò)程的 均一性。TFF過(guò)程使用850cm2的料筒(cartridge，而以前的小規(guī)模TFF研究使用73cm2的 料筒)且包括了在裝瓶和-30°C冷凍前濃縮產(chǎn)品在4°C的保存時(shí)間測(cè)試。測(cè)試在線混合過(guò)程的均一性在混合過(guò)程的最初、中間、結(jié)尾的25ml中收集多份5mL的樣品，以測(cè)定混合過(guò)程中
23的均一性。結(jié)果表明最初的混合樣品在120nm左右開(kāi)始，并且在混合15mL后，穩(wěn)定至80nm。表7 中等規(guī)模在線混合的均一性 之前所有樣品都在-30°C下冷凍、解凍然后進(jìn)行分析?！癇”表示混合過(guò)程開(kāi)始(最 初的25mL)的5mL樣品，順序?yàn)閺?到5?！癕”表示混合過(guò)程中間(在約400mL時(shí)開(kāi)始)的 5mL樣品，順序?yàn)閺?到5?！癊”表示混合過(guò)程結(jié)尾(在約750mL時(shí)開(kāi)始)的5mL樣品，順序 為從1到5。測(cè)試TFF終產(chǎn)品的保存時(shí)間在TFF過(guò)程完成之后，將TFF終產(chǎn)品等分成9 X IOmL的等分試樣(在20mL褐色玻 璃瓶中)并密封。這些瓶隨后經(jīng)歷各種保存時(shí)間，以模擬典型的生產(chǎn)保存條件 解凍產(chǎn)品的結(jié)果顯示，產(chǎn)品在4°C下經(jīng)過(guò)24小時(shí)保存時(shí)間仍具有良好的穩(wěn)定性。 另外，對(duì)于“4h@4°C，然后-30°C ”的樣品，解凍后經(jīng)過(guò)7小時(shí)的穩(wěn)定性也表明，相比起始材 料，顆粒穩(wěn)定性增加不到10%。表8 之前所有樣品都在-30°C下冷凍、解凍然后進(jìn)行分析。中等規(guī)模 2L 工程運(yùn)行(Mid-Scale 2L Engineering Run)我們測(cè)試在線混合過(guò)程和TFF過(guò)程到達(dá)2L批次大小的可擴(kuò)縮性?；旌蠌?fù)合物至體 積達(dá)到2L，然后通過(guò)TFF濃縮至1. lmg/mL。本研究也通過(guò)在混合過(guò)程的最初(25ml丟棄)、 中間、結(jié)尾取多份5mL混合的復(fù)合物的等分試樣物來(lái)重復(fù)檢測(cè)混合過(guò)程的均一性。TFF過(guò)程 使用850cm2的料筒且包括在裝瓶和-30°C冷凍前終濃縮產(chǎn)品在4°C的過(guò)夜保存測(cè)試。通常，復(fù)合物的物理特性很好地落入預(yù)期范圍和限度內(nèi)。表 9 所有的樣品是新鮮的或先前冷凍于_30°C (如所示)，將其解凍然后進(jìn)行分析帶有賦形劑的在線混合的可擴(kuò)縮性下文是在兩種規(guī)模四種批次體積(表10)下通過(guò)在線混合制造的復(fù)合物批次的 物理特性的概要。所有的批次為C(24，98)-N20-cl50-pH4. 8-Sucl5% -PbnO. 1%0混合比 例為DNA 脫乙酰殼多糖2 1。小規(guī)模和中等規(guī)模混合的總流速分別為23. 3mL/分鐘和 210mL/分鐘(在這些速度下，兩種規(guī)模混合通過(guò)管的線性流速是相等的)。表10 經(jīng)調(diào)整的混合批次的物理特性
通過(guò)凝膠電泳測(cè)試DNA捕獲測(cè)試了多種復(fù)合物制劑的游離的DNA存在情況，以確定是否所有DNA都被脫乙酰 殼多糖捕獲?？偟膩?lái)說(shuō)，在任何測(cè)試的制劑中沒(méi)有觀察到游離的DNA(數(shù)據(jù)未顯示)。復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染對(duì)兩種制劑進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，以比較滴注法(drip method，如U. S. S. N. 11/694，852) 和在線混合方法制備的復(fù)合物。在線混合法的平均轉(zhuǎn)染效率比滴注法高約11%。 最終的復(fù)合物制劑為C (23，98)-MO-AclO. 5_pH4. 8_c75。對(duì)于在線混合批次來(lái)說(shuō)， DNA 脫乙酰殼多糖的體積混合比例為2 1，輸出流速為3mL/min。變動(dòng)原料體積比例改變復(fù)合物大小和PDI使用本文描述的方法，根據(jù)表11，制備組合物。表11 按本文所述分析制品的粒度和PDI。結(jié)果顯示在圖7中，并證實(shí)了在基本上保持脫 乙酰殼多糖和DNA混合比例并基本上保持脫乙酰殼多糖和DNA的混合濃度的同時(shí)，可以通 過(guò)改變?cè)象w積控制粒度。在此通過(guò)引用將所有參考文獻(xiàn)全文并入。
權(quán)利要求
組合物，包含水合的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物，其中所述組合物的核酸的濃度大于或等于0.5mg/mL。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物基本上不含復(fù)合物沉淀。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含濃度大于0.75mg/mL的核酸。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含大于1.Omg/mL的核酸濃度。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含濃度大于1.2mg/mL的核酸。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含濃度大于1.5mg/mL的核酸。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含聚集抑制劑。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含濃度小于約SOmM的平衡陰離子。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述復(fù)合物平均直徑小于750nm。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述復(fù)合物N P比例大于或等于2 1。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述復(fù)合物包含平均分子量小于500kDa的脫乙 酰殼多糖分子。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述復(fù)合物包含具有小于3000個(gè)氨基葡萄糖單 體單元的脫乙酰殼多糖分子。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，基本上由所述的水合的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物和 聚集抑制劑組成。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的平均多分散性 指數(shù)小于0.5。
15.如權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物是等滲的。
16.濃縮脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的方法，包括提供未濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù) 合物分散體系，并使用濃縮方法濃縮未經(jīng)濃縮的脫乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物分散體系以形 成濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物分散體系，其中所述組合物的核酸的濃度大于或等于 0. 5mg/mL，且其中所述組合物基本上不含復(fù)合物沉淀。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述未濃縮的分散體系包括初始濃度的聚集抑制劑。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述濃縮步驟在所述的濃縮的分散體系中基本上 保持所述聚集抑制劑的所述初始濃度。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述濃縮方法是切向流動(dòng)過(guò)濾。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中使用在線混合制備所述未濃縮的脫乙酰殼多 糖-核酸復(fù)合物分散體系。
21.使用權(quán)利要求16所述的方法產(chǎn)生的濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的分散體系。
22.藥物組合物，包含水合的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物，其中所述組合物的核酸的濃 度大于或等于0. 5mg/mL,且其中所述脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物包含治療性核酸構(gòu)建體。
23.如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物是等滲的。
24.改變?cè)谕ㄟ^(guò)混合脫乙酰殼多糖溶液和核酸溶液產(chǎn)生的混合分散體系中所形成的脫 乙酰殼多糖_核酸復(fù)合物的直徑的方法，包括在基本上不改變脫乙酰殼多糖與核酸混合比 例并基本上不改變混合分散體系中脫乙酰殼多糖或核酸濃度的情況下，改變脫乙酰殼多糖或核酸分散體系的體積。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的混合溶液通過(guò)在線混合所述脫乙酰殼多糖 溶液和所述核酸溶液產(chǎn)生，其中調(diào)整所述脫乙酰殼多糖溶液和所述核酸溶液的流速以保持 混合流通速率和保持脫乙酰殼多糖與核酸的混合濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了高濃縮的脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物的組合物和分散體系，以及產(chǎn)生這種組合物和分散體系的方法?；旌厦撘阴ざ嗵?核酸復(fù)合物的方法包括，在線混合脫乙酰殼多糖溶液和核酸溶液，隨后任選地用聚集抑制劑進(jìn)一步濃縮脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物分散體系。還提供了改變脫乙酰殼多糖-核酸復(fù)合物直徑的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101873867SQ200880117777
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者卡洛斯·弗利特, 安東尼·鐘, 艾瑞克·C·栗, 高峻 申請(qǐng)人:恩根尼公司