專利名稱：結(jié)合mcp-1的核酸及其用途的制作方法
結(jié)合MCP-1的核酸及其用途本發(fā)明涉及結(jié)合MCP-I的核酸及其分別用于制備藥劑(medicament)和診斷劑的 用途。人 MCP-I (單核細(xì)胞化學(xué)吸弓I 蛋白-1 (monocyte chemoattractantprotein-1)； 備選名稱為MCAF[單核細(xì)胞趨化禾口活化因子(monocytechemoattracting and activating factor)]、CCL2、SMC-CF[平滑肌細(xì)胞集落刺激因子]、HC_11、LDCF、GDCF、TSG_8、SCYA2、A2 ； SwissProt登錄號為P13500)由三個研究組獨立地表征(Matsushimal988 ;Rollins 1989 ； Yoshimura 1989)。它由76個氨基酸組成，并且像所有趨化因子一樣以肝素結(jié)合位點為特 點。兩個分子內(nèi)二硫鍵賦予該分子以穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)。此外，MCP-I在其氨基末端攜帶有 焦谷氨酸。位于Thr 71處的是潛在的0-聯(lián)糖基化位點。另外的MCP家族成員既存在于人 中(MCP-2、-3、-4)也存在于小鼠中(MCP-2、-3、-5)。人蛋白質(zhì)與人MCP-I具有大約70% 的同源性。MCP-I 的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過NMR(Handel 1996)和X-射線(Lubkowski 1997)進(jìn)行了解 析。MCP-I單體具有典型的趨化因子折疊，其中氨基末端的半胱氨酸后面接著是在希臘鑰匙 基序(Greek keymotif)中導(dǎo)致三個反平行β _折疊片的長環(huán)。該蛋白質(zhì)終止于疊加在這 三個β折疊片上的α螺旋(PDB數(shù)據(jù)登錄號1D0K)。盡管通常保持了來自不同哺乳動物物種的MCP-I形式的三維結(jié)構(gòu)，但氨基酸序列 在進(jìn)化過程中并未得到特別良好地保守。序列比對結(jié)果表明，在前76個氨基酸中人和鼠 MCP-I (也稱為JE)之間的總體序列相似性為55%。除了氨基酸序列，鼠MCP-I與人MCP-I 的區(qū)別在于分子大小(鼠MCP-I有125個氨基酸)和糖基化程度。鼠MCP-I含有49-氨基 酸的羧基末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在人MCP-I中不存在并且不是體外生物活性所必需的。人 MCP-I與來自下面的MCP-I具有如下百分比的相同氨基酸‘ MWi (Macaca mulatta)MCP-I97%·歐洲野豬(Sus scrofa) MCP-I79%·家馬(Equus cabalIus)78%·家犬(Canis familiar is) MCP-I76%·穴兔(Oryctolagus cuniculus)MCP-I75%·家牛(Bos Taurus)72% 智人(Homo sapiens)MCP-371%·智人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子64% 智人 MCP-262%·小家鼠(Mus musculus)MCP-I55%'IiiCfI (Rattus norvegicus)MCP-I55%考慮到這種高程度的趨異性，可能有必要產(chǎn)生嚙齒動物MCP-I的拮抗劑用于在嚙 齒動物模型中成功地實施藥理學(xué)研究。MCP-I是強效的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞的引誘 劑。多種細(xì)胞類型，例如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，以及眾多腫瘤細(xì)胞均表達(dá)MCP-I (Baggiolini 1994)。它的 表達(dá)受到幾種類型的促炎劑，例如IL-I β、TNF- α、IFN- γ、LPS (脂多糖)和GM-CSF刺激。在混雜的趨化因子網(wǎng)絡(luò)中相當(dāng)與眾不同的是，MCP-I在其受體使用上是高度特異 的，只以高親和力與趨化因子受體CCR2結(jié)合。像所有趨化因子受體一樣，CCR2是G蛋白偶 聯(lián)受體(GPCR) (Dawson2003)。CCR2看來似乎由于編碼羧基末端區(qū)域的mRNA的可變剪接而 表達(dá)成兩種稍微不同的形式(CCR2a和CCR2b) (Charo 1994)。這些受體在單核細(xì)胞、骨髓前 體細(xì)胞和激活的T細(xì)胞中表達(dá)(Myersl995 ；Qin 1996)。MCP-I與轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞中的 受體的解離常數(shù)是260pM，該值與在單核細(xì)胞上測得的值相一致(Myers 1995 ；Van Riper 1993)。用MCP-I激活在經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞上的CCR2b，在濃度為90pM時抑制腺苷酸環(huán) 化酶，并且在稍微更高的濃度時動員細(xì)胞內(nèi)的鈣，這看似不依賴于磷脂酰肌醇的水解。對腺 苷酸環(huán)化酶和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的影響受到百日咳毒素的強烈抑制，這意味著Gi型異源三聚體 G-蛋白參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Myers 1995)。MCP-I參與將單核細(xì)胞募集入發(fā)炎的組織中。在那里，定居巨噬細(xì)胞釋放趨化因子 例如MCP-I及其他，和細(xì)胞因子例如TNF、IL-I β及其他，它們激活內(nèi)皮細(xì)胞以表達(dá)一批粘 著分子。所產(chǎn)生的“粘性”內(nèi)皮導(dǎo)致血管中的單核細(xì)胞沿著它的表面滾動。在這里，單核細(xì) 胞遇到內(nèi)皮表面上遞呈的MCP-1，其結(jié)合單核細(xì)胞上的CCR2并將它們激活。這最終導(dǎo)致被 牢固地捕獲，單核細(xì)胞沿著內(nèi)皮擴散，并移行入周圍組織中，在那里單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì) 胞并遷移至最大MCP-I濃度的位點。MCP-I是趨化因子家族的成員，該家族是一類小的(約8_14kDa)、結(jié)合肝素的、大 多數(shù)為堿性的且在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子的家族。它們主要在發(fā)炎的組織中形成并調(diào)節(jié)白血球 (白細(xì)胞)的募集、激活和增殖(Baggiolini 1994 ；Springer 1995 ；Schall 1994)。趨化因 子選擇性地誘導(dǎo)嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì) 胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的趨化性。除了它們的趨化效應(yīng)，它們還可以在應(yīng)答細(xì)胞中選擇性地發(fā) 揮其他作用，如改變細(xì)胞形狀，瞬時升高游離的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，脫粒，上調(diào)整聯(lián)蛋白， 形成生物活性脂質(zhì)例如白三烯、前列腺素、血栓烷，或呼吸爆發(fā)(釋放活性氧類別來破壞致 病微生物或腫瘤細(xì)胞)。因此，通過引起另外的促炎介質(zhì)的釋放以及白細(xì)胞向感染或炎癥位 點的趨化性和外滲，趨化因子引發(fā)炎性應(yīng)答逐步升級?；谒膫€保守的半胱氨酸殘基中的前兩個的排列，將趨化因子分成四類其中所 述半胱氨酸串聯(lián)的CC或β -趨化因子，其中所述半胱氨酸由一個另外的氨基酸殘基隔開 的CXC或α-趨化因子，只具有一個二硫橋的XC或γ趨化因子(迄今為止，淋巴細(xì)胞趨 化因子(lymphotactin)是唯一的代表)，以及特征為在所述半胱氨酸之間有3個氨基酸殘 基的CX3C-趨化因子(迄今為止已知唯一的該類型的成員是膜結(jié)合的fractalkin(Bazan 1997))。CXC趨化因子主要作用于嗜中性白細(xì)胞，特別是在它們的氨基末端處攜帶有氨基 酸序列ELR的那些CXC趨化因子。對于嗜中性白細(xì)胞具有活性的CXC趨化因子的實例是 IL-8、GRO-α、GRO-β 和 GRO-γ、ΝΑΡ-2、ΕΝΑ-78 和 GCP-2。CC 趨化因子作用于更多類別 的白細(xì)胞上，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞以及T和B淋巴細(xì)胞 (Oppenheim 1991 ；Baggiolinil994 ；Miller 1992 Jose 1994 ；Ponath 1996a)。這些趨化 因子的實例是 1-309、MCP-I、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-I α 和 MIP-β、RANTES 和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子。趨化因子通過屬于七跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs ；Murphy2000)超家族的受體起 作用。一般而言，趨化因子和趨化因子受體的相互作用是趨于混雜的，因為一個趨化因子可 以結(jié)合許多趨化因子受體，并且反而言之，單個趨化因子受體可以與幾種趨化因子相互作 用。一些已知的CC趨化因子的受體包括結(jié)合MIP-I α和RANTES的CCRl (Neote 1993 ；Gao 1993)；結(jié)合包括 MCP-l、MCP-2、MCP-3 和 MCP-4 在內(nèi)的趨化因子的 CCR2(Charo 1994 ；Myers 1995 ；Gongl997 ；Garcia-Zepeda 1996)；結(jié)合包括嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、RANTES和MCP-3 在內(nèi)的趨化因子的CCR3 (Ponath 1996b)；已經(jīng)發(fā)現(xiàn)響應(yīng)于MCP-I、MIP-I α和RANTES而產(chǎn) 生信號的CCR4(Power 1995)；以及已經(jīng)顯示響應(yīng)于MIP-I α和MIP-β及RANTES而產(chǎn)生信 號的 CCR5 (Boring 1996 ；Raport 1996 ；Samson 1996)。如上所述，MCP家族的所有四個成員(1-4)都結(jié)合CCR2，而MCP_2、MCP_3和MCP-4 還可以與 CCRl 和 CCR3 相互作用(Gongl997 ；Heath 1997 ；Uguccioni 1997)，并且在 MCP-2 的情況下可以與CCR5相互作用(Ruffing 1998)。顯示出與MCP家族具有高同源性的另一 種CC趨化因子是嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子，其最初從獲自受變應(yīng)原攻擊的、致敏的豚鼠的支 氣管肺泡灌洗液中分離出來(Josel994)。已經(jīng)顯示出，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子也能夠激活 CCR2(Martinelli 2001)。作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的問題是提供與MCP-I特異性地相互作用的工具(means)，并 且所述工具適合于分別預(yù)防和/或治療慢性疾病和慢性病癥。更具體而言，作為本發(fā)明的 基礎(chǔ)的問題是提供與MCP-I特異性地相互作用的基于核酸的工具，并且所述核酸適合于分 別預(yù)防和/或治療慢性疾病和慢性病癥。作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的另外一個問題是提供用于制備用于治療疾病的診斷劑的工 具，由此所述疾病分別是慢性疾病和慢性病癥。與上述特定問題相結(jié)合，慢性疾病和慢性病癥分別優(yōu)選是慢性呼吸道疾病、慢性 腎疾病和全身性紅斑狼瘡。作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的這些和其他的問題通過所附的獨立權(quán)利要求的主題而得以 解決。優(yōu)選的實施方案可以從從屬權(quán)利要求中獲得。作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的問題通過獨立權(quán)利要求的主題而得以解決。優(yōu)選的實施方案 受從屬權(quán)利要求的支配。更具體而言，在第一個方面，這也是所述第一個方面的第一個實施方案，作為本發(fā) 明的基礎(chǔ)的問題通過能夠結(jié)合MCP-I的核酸分子得以解決，由此該核酸分子用于作為用于 治療和/或預(yù)防慢性疾病或慢性病癥的藥劑使用，所述慢性疾病或慢性病癥優(yōu)選選自慢性 呼吸道疾病、慢性腎疾病和全身性紅斑狼瘡。在第二個方面，這也是所述第二個方面的第一個實施方案，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的 問題通過能夠結(jié)合MCP-I的核酸分子得以解決，由此該核酸分子用于作為用于診斷慢性疾 病或慢性病癥的診斷劑使用，所述慢性疾病或慢性病癥優(yōu)選選自慢性呼吸道疾病、慢性腎 疾病和全身性紅斑狼瘡。在第一個和第二個方面的第二個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第一個實施方案的一個實施方案，慢性呼吸道疾病選自肺炎、肺和胸膜炎癥、胸膜炎、胸腔 積液、狼瘡肺炎、慢性彌漫性間質(zhì)性肺疾病、肺栓塞、肺出血、肺萎縮綜合征、肺高壓和慢性阻塞性肺疾病及其組合。在第一個和第二個方面的第三個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第一個和第二個實施方案的一個實施方案，肺高壓選自與左側(cè)心臟病相關(guān)的肺高壓、與肺 病和/或低氧血癥相關(guān)的肺高壓、由于慢性血栓形成和/或栓塞疾病的肺高壓、肺動脈高 壓，優(yōu)選特發(fā)性肺動脈高壓、膠原酶(collagenose)相關(guān)的肺動脈高壓、家族性肺動脈高 壓、與其他疾病相關(guān)的肺動脈高壓、和與靜脈(veneous)或毛細(xì)血管疾病相關(guān)的肺動脈高 壓。在第一個和第二個方面的第四個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第一個、第二個和第三個實施方案的一個實施方案，慢性阻塞性肺疾病是與肺血管牽涉相 關(guān)或不相關(guān)的慢性阻塞性肺疾病。在第一個和第二個方面的第五個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第一個、第二個、第三個和第四個實施方案的一個實施方案，慢性阻塞性肺疾病選自慢性支 氣管炎和肺氣腫。在第一個和第二個方面的第六個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第一個實施方案的一個實施方案，慢性腎疾病選自狼瘡腎炎、膜性增生性腎小球腎炎、膜性 腎小球腎炎、IgA腎病、鏈球菌感染后腎小球腎炎、急進(jìn)性腎小球腎炎、腎病綜合征、局灶性 節(jié)段性腎小球硬化癥、糖尿病腎病、腎病綜合征、和腎病綜合征，優(yōu)選狼瘡腎炎。在第一個和第二個方面的第七個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第一個、第二個、第三個、第四個、第五個和第六個實施方案的一個實施方案，該核酸選自IA 型核酸、IB型核酸、2型核酸、3型核酸、4型核酸和具有根據(jù)SEQ. ID. No. 87至115中任一個 的核酸序列的核酸。在第一個和第二個方面的第八個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第七個實施方案的一個實施方案，2型核酸以5’- > 3’方向包含第一序列段盒B1A、第二序 列段盒B2和第三序列段盒B1B，由此第一序列段盒BlA和第三序列段盒BlB任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈 結(jié)構(gòu)，第一序列段盒BlA包含選自ACGCA、CGCA和GCA的核苷酸序列， 第二序列段盒B2包含核苷酸序列CSUCCCUCACCGGUGCAA⑶GAAGCCGYGGCUC，并且第三序列段盒BlB包含選自UGCGU、UGCG和UGC的核苷酸序列。在第一個和第二個方面的第九個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第八個實施方案的一個實施方案，第二序列段盒B2包含核苷酸序列C⑶CCCUCACCGGUGCAA⑶GAAGCCGUGGCUC。在第一個和第二個方面的第十個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的 第八個和第九個實施方案的一個實施方案，a)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列ACGCA，并且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列UGCGU ；或者b)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列CGCA，并且
第三序列段盒BlB包含核苷酸序列UGCG ；或者c)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GCA，并且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列UGC或UGCG。在第一個和第二個方面的第十一個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第八個、第九個和第十個實施方案的一個實施方案，第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GCA。在第一個和第二個方面的第十二個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第八個、第九個、第十個和第十一個實施方案的一個實施方案，優(yōu)選第一個和第二個方面 的第十一個實施方案，第三序列段盒BlB包含核苷酸序列UGCG。在第一個和第二個方面的第十三個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第八個、第九個、第十個、第十一個和第十二個實施方案的一個實施方案，所述核酸包含 根據(jù) SEQ. ID. No 37、SEQ. ID. Nol 16、SEQ. ID. No 117 和 SEQ. ID. No 278 的核酸序列。在第一個和第二個方面的第十四個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第一個、第二個、第三個、第四個、第五個、第六個和第七個實施方案的一個實施方案，所 述3型核酸以5’ - > 3’方向包含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2A、第三序列段盒B3、 第四序列段盒B2B、第五序列段盒B4、第六序列段盒B5A、第七序列段盒B6、第八序列段盒 B5B和第九序列段盒B1B，由此第一序列段盒BlA和第九序列段盒BlB任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈 結(jié)構(gòu)，第二序列段盒B2A和第四序列段盒B2B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈 結(jié)構(gòu)，第六序列段盒B5A和第八序列段盒B5B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈 結(jié)構(gòu)，第一序列段盒BlA包含選自⑶RCUGC、GKSYGC, KBBSC和BNGC的核苷酸序列，第二序列段盒B2A包含核苷酸序列GKMGU，第三序列段盒B3包含核苷酸序列KRRAR，第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC，第五序列段盒B4包含選自CURYGA、CUffAUGA, CffRMGACff和UGCCA⑶G的核苷酸序 列，第六序列段盒B5A包含選自GGY和CWGC的核苷酸序列，第七序列段盒B6包含選自YAGA、CKAAU和CCUUUAU的核苷酸序列，
第八序列段盒B5B包含選自GCYR和GCWG的核苷酸序列，并且第九序列段盒BlB包含選自GCAGCAC、GCRSMC, GSVVM和GCNV的核苷酸序列。在第一個和第二個方面的第十五個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第十四個實施方案的一個實施方案，第三序列段盒B3包含核苷酸序列GAGAA或Mkkkk0在第一個和第二個方面的第十六個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的第十四個和第十五個實施方案的一個實施方案，第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAGCGA⑶或CAACGA⑶。在第一個和第二個方面的第十七個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第十四個、第十五個和第十六個實施方案的一個實施方案，第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAGCGA⑶，并且盒B3包含核苷酸序列UAAAA。在第一個和第二個方面的第十八個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第十四個、第十五個和第十六個實施方案的一個實施方案，第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAACGA⑶，并且第三序列段盒B3包含核苷酸序 歹Ij GAGAA。在第一個和第二個方面的第十九個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第十四個、第十五個、第十六個、第十七個和第十八個實施方案的一個實施方案，第七序列段盒B6包含核苷酸序列UAGA0在第一個和第二個方面的第二十個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第十四個、第十五個、第十六個、第十七個、第十八個和第十九個實施方案的一個實施方 案，a)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列⑶RCUGC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GCAGCAC ；或者b)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GKSYGC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GCRSMC ；或者c)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列KBBSC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GSVVM ；或者d)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列BNGC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GCNV。在第一個和第二個方面的第二十一個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第二十個實施方案的一個實施方案，a)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GUGCUGC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GCAGCAC ；或者b)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GUGCGC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GCGCAC ；或者c)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列KKSSC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GSSMM ；或者d)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列SNGC，
并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GCNS。在第一個和第二個方面的第二十二個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第二十一個實施方案的一個實施方案，第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GGGC，并且第九序列段盒BlB包含核苷酸序列GCCC。在第一個和第二個方面的第二十三個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第十四個、第十五個、第十六個、第十七個、第十八個、第十九個、第二十個、第二十一個 和第二十二個實施方案的一個實施方案，第二序列段盒B2A包含核苷酸序列GKMGU，并且第 四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC。在第一個和第二個方面的第二十四個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第二十三個實施方案的一個實施方案，第二序列段盒B2A包含核苷酸序列GUAGU，并且 第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACUAC。在第一個和第二個方面的第二十五個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第十四個、第十五個、第十六個、第十七個、第十八個、第十九個、第二十個、第二十一 個、第二十二個、第二十三個和第二十四個實施方案的一個實施方案，a)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列GGY，并且第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCYR ；或者b)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列CWGC，并且第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCWG。在第一個和第二個方面的第二十六個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第二十五個實施方案的一個實施方案，第六序列段盒B5A包含核苷酸序列GGC，并且第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCCG。在第一個和第二個方面的第二十七個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第十四個、第十五個、第十六個、第十七個、第十八個、第十九個、第二十個、第二十一 個、第二十二個、第二十三個、第二十四個、第二十五個和第二十六個實施方案，優(yōu)選第一個 方面和第二個方面的第二十五個和第二十六個實施方案的一個實施方案，第六序列段盒 B5A與第八序列段盒B5B的核苷酸GCY雜交。在第一個和第二個方面的第二十八個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第十四個、第十五個、第十六個、第十七個、第十八個、第十九個、第二十個、第二十一 個、第二十二個、第二十三個、第二十四個、第二十五個、第二十六個和第二十七個實施方案 的一個實施方案，所述核酸包含根據(jù)SEQ. ID. No 56的核酸序列。在第一個和第二個方面的第二十九個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第十四個、第十五個、第十六個、第十七個、第十八個、第十九個、第二十個、第二十一個、第二十二個、第二十三個、第二十四個、第二十五個、第二十六個和第二十七個實施方案 的一個實施方案，所述核酸包含選自根據(jù)SEQ. ID. No 57至61、SEQ. ID. No 67至71和SEQ. ID. No 73的核酸序列的核酸序列。在第一個和第二個方面的第三十個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第一個、第二個、第三個、第四個、第五個、第六個和第七個實施方案的一個實施方案，所 述4型核酸以5’ - > 3’方向包含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B1B， 由此第一序列段盒BlA和第三序列段盒BlB任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈 結(jié)構(gòu)， 第一序列段盒BlA包含選自AGC⑶⑶U、GCGCGAG、CSKSUU, GUGUU和U⑶U的核苷酸 序列；第二序列段盒B2 包含選自 AGNDRDGBKGCiURGYARGUAAAG、AG⑶GGCiUGGUAGUAAGUAAAG 和CAG⑶GGCiUGGUAGAAUGUAAAGA的核苷酸序列，并且第三序列段盒BlB包含選自GNCASGCU、CUCGC⑶C、GRSMSG, GRCAC和GGCA的核苷
酸序列。在第一個和第二個方面的第三十一個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十個實施方案的一個實施方案，a)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GUGUU，并且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列GRCAC ；b)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列GCGCGAG，并且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列⑶CGCGUC ；或者c)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列CSKSUU，并且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列GRSMSG，或者d)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列UGUU，并且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列GGCA，或者e)第一序列段盒BlA包含核苷酸序列AGCGUGDU，并且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列GNCASG⑶。在第一個和第二個方面的第三十二個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十一個實施方案的一個實施方案，第一序列段盒BlA包含核苷酸序列CSKSUU，并 且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列GRSMSG。在第一個和第二個方面的第三十三個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十二個實施方案的一個實施方案，第一序列段盒BlA包含核苷酸序列CCGCUU，并 且第三序列段盒BlB包含核苷酸序列GGGCGG。在第一個和第二個方面的第三十四個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的第三十個、第三十一個、第三十二個和第三十三個實施方案的一個實施方案，第二序列段盒B2包含核苷酸序列AG⑶GG⑶GGUAGUAAGUAAAG。在第一個和第二個方面的第三十五個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十個、第三十一個、第三十二個、第三十三個和第三十四個實施方案的一個實施方 案，所述核酸包含根據(jù)SEQ. ID. No 80和SEQ. ID. No 81的核酸序列。在第一個和第二個方面的第三十六個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第一個、第二個、第三個、第四個、第五個、第六個和第七個實施方案的一個實施方案， 所述IA型核酸以5’ ->3’方向包含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒 B3、第四序列段盒B4、第五序列段盒B5、第六序列段盒B6和第七序列段盒B1B，由此第一序列段盒BlA和第七序列段盒BlB任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈 結(jié)構(gòu)，第一序列段盒BlA包含核苷酸序列AGCRUG，第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCCGGW，第三序列段盒B3包含核苷酸序列⑶R，第四序列段盒B4包含核苷酸序列RYA, 第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGRCGCGAYC，第六序列段盒B6包含核苷酸序列UGCAAUAAUG或URYAWUUG，并且第七序列段盒BlB包含核苷酸序列CRYG⑶。在第一個和第二個方面的第三十七個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十六個實施方案的一個實施方案，第一序列段盒BlA包含核苷酸序列AGCGUG。在第一個和第二個方面的第三十八個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十六個和第三十七個實施方案的一個實施方案，第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCCGGU。在第一個和第二個方面的第三十九個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十六個、第三十七個和第三十八個實施方案的一個實施方案，第三序列段盒B3包含核苷酸序列⑶G。在第一個和第二個方面的第四十個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第三十六個、第三十七個、第三十八個和第三十九個實施方案的一個實施方案， 第四序列段盒B4包含核苷酸序列GUA。在第一個和第二個方面的第四十一個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十六個、第三十七個、第三十八個、第三十九個和第四十個實施方案的一個實施方 案，第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGGCGCGACC。在第一個和第二個方面的第四十二個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十六個、第三十七個、第三十八個、第三十九個、第四十個和第四十一個實施方案 的一個實施方案，第六序列段盒B6包含核苷酸序列UACAUUUG。在第一個和第二個方面的第四十三個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面的第三十六個、第三十七個、第三十八個、第三十九個、第四十個、第四十一個和第四十二 個實施方案的一個實施方案，第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CACG⑶。在第一個和第二個方面的第四十四個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第三十六個、第三十七個、第三十八個、第三十九個、第四十個、第四十一個、第四十二 個和第四十三個實施方案的一個實施方案，所述核酸包含根據(jù)SEQ. ID. No 21的核酸序列。在第一個和第二個方面的第四十五個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第一個、第二個、第三個、第四個、第五個、第六個和第七個實施方案的一個實施方案， 所述1B型核酸以5’ - > 3’方向包含第一序列段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒 B3、第四序列段盒B4、第五序列段盒B5、第六序列段盒B6和第七序列段盒B1B，由此第一序列段盒B1A和第七序列段盒B1B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈 結(jié)構(gòu)，第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGYRUG，第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCAG⑶或CCAGY，第三序列段盒B3包含核苷酸序列⑶G，第四序列段盒B4包含核苷酸序列AUG，第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGGCGCGACC第六序列段盒B6包含核苷酸序列CAUUUUA或CAUUUA，并且第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CAYRCU。在第一個和第二個方面的第四十六個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第四十五個實施方案的一個實施方案，第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUG。在第一個和第二個方面的第四十七個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第四十五個和第四十六個實施方案的一個實施方案，第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCAGU。在第一個和第二個方面的第四十八個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第四十五個、第四十六個和第四十七個實施方案的一個實施方案，第六序列段盒B6包含核苷酸序列CAUUUUA。在第一個和第二個方面的第四十九個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第四十五個、第四十六個、第四十七個和第四十八個實施方案的一個實施方案，第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CACG⑶。在第一個和第二個方面的第五十個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第四十五個、第四十六個、第四十七個、第四十八個和第四十九個實施方案的一個實施方 案，所述核酸包含根據(jù)SEQ. ID. No 28和SEQ. ID. No 27的核酸序列。在第一個和第二個方面的第五十一個實施方案中，這也是第一個方面和第二個 方面的第一個至第五十個實施方案中任何一個的實施方案，所述MCP-1選自猴MCP-1、馬 MCP-1、兔 MCP-1、牛 MCP-1、犬 MCP-1、豬 MCP-1 和人 MCP-1。在第一個和第二個方面的第五十二個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第一個至第五十一個實施方案中任何一個的實施方案，所述核酸能夠結(jié)合人MCP-1。
在第一個和第二個方面的第五十三個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第一個至第五十二個實施方案中任何一個，優(yōu)選第一個方面和第二個方面的第五十二 個實施方案的實施方案，MCP-1具有根據(jù)SEQ ID No. 1的氨基酸序列。在第一個和第二個方面的第五十四個實施方案中，這也是第一個方面和第二 個方面的第一個至第五十三個實施方案中任何一個的實施方案，所述核酸包含修飾物 (modification)，由此所述修飾物優(yōu)選為高分子量部分和/或由此所述修飾物優(yōu)選允許改 變根據(jù)權(quán)利要求1至54中任一項的核酸在動物或人體內(nèi)，優(yōu)選人體內(nèi)的停留時間方面的特 征。在第一個和第二個方面的第五十五個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第五十四個實施方案的一個實施方案，所述修飾物選自HES部分、PEG部分、生物可降 解修飾及其組合。在第一個和第二個方面的第五十六個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第五十五個實施方案的一個實施方案，所述修飾物是由直鏈或分支的PEG組成的PEG 部分，由此所述PEG部分的分子量優(yōu)選為大約20，000至120，OOODa,更優(yōu)選大約30，000至 80，OOODa，和最優(yōu)選大約40，OOODa。在第一個和第二個方面的第五十七個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第五十五個實施方案的一個實施方案，所述修飾物是HES部分，由此優(yōu)選地，所述HES 部分的分子量為大約10，000至200，OOODa，更優(yōu)選大約30，000至170. OOODa，和最優(yōu)選大 約 150，OOODa。在第一個和第二個方面的第五十八個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第五十四個、第五十五個、第五十六個和第五十七個實施方案的一個實施方案，所述修 飾物經(jīng)由連接體偶聯(lián)至所述核酸，由此所述連接體是連接體或生物可降解連接體。在第一個和第二個方面的第五十九個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第五十四個、第五十五個、第五十六個、第五十七個和第五十八個實施方案的一個實施 方案，所述修飾物在所述核酸的5’ -末端核苷酸和/或所述核酸的3’ -末端核苷酸處偶聯(lián) 至所述核酸，和/或偶聯(lián)至在所述核酸的所述5’ -末端核苷酸和所述3’ -末端核苷酸之間 的核苷酸。在第一個和第二個方面的第六十個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方面 的第一個至第五十九個實施方案中任何一個的實施方案，所述核酸的核苷酸或形成所述核 酸的核苷酸是L-核苷酸。在第一個和第二個方面的第六十一個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第一個至第六十個實施方案中任何一個的實施方案，所述核酸是L-核酸。在第一個和第二個方面的第六十二個實施方案中，這也是第一個方面和第二個方 面的第一個至第六十個實施方案中任何一個的實施方案，能夠結(jié)合MCP-1的所述核酸的所 述部分由L-核苷酸組成。在第三個方面，這也是所述第三個方面的第一個實施方案，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的 問題通過藥物組合物得以解決，所述藥物組合物包含如第一個和第二個方面的任何一個實 施方案中限定的核酸分子和任選地另外的組成成分，由此所述另外的組成成分選自藥學(xué)上 可接受的賦形劑、藥學(xué)上可接受的載體和藥學(xué)活性試劑，并且由此所述藥物組合物用于治
20療和/或預(yù)防慢性疾病或慢性病癥。在第三個方面的第二個實施方案中，這也是第三個方面的第一個實施方案的一個 實施方案，所述藥物組合物包含如第一個和第二個方面的任何一個實施方案中限定的核酸 分子和藥學(xué)上可接受的載體。在第三個方面的第三個實施方案中，這也是第三個方面的第一個和第二個實施方 案的一個實施方案，所述慢性疾病或慢性病癥如前述權(quán)利要求中任一項中限定的。在第三個方面的第四個實施方案中，這也是第三個方面的第一個、第二個和第三 個實施方案的一個實施方案，所述藥物組合物包含第二種藥學(xué)活性試劑，由此此類第二種 藥學(xué)活性試劑是免疫抑制劑。在第三個方面的第五個實施方案中，這也是第三個方面的第四個實施方案的一個 實施方案，所述免疫抑制劑作為分開的劑量單位包含在所述藥物組合物中。在第三個方面的第六個實施方案中，這也是第三個方面的第四個和第五個實施方 案的一個實施方案，所述藥物組合物比包含免疫抑制劑作為單一療法的藥物組合物包含更 少的免疫抑制劑。在第三個方面的第七個實施方案中，這也是第三個方面的第四個、第五個和第六 個實施方案的一個實施方案，所述免疫抑制劑的劑量單位包含少于作為單一療法使用時所 述免疫抑制劑的劑量單位。在第三個方面的第八個實施方案中，這也是第三個方面的第六個和第七個實施方 案的一個實施方案，實施于第三個方面的第六個和第七個實施方案的免疫抑制劑的減少是 至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或 至少90%，優(yōu)選至少75%。在第三個方面的第九個實施方案中，這也是第三個方面的第四個、第五個、第六 個、第七個和第八個實施方案的一個實施方案，所述免疫抑制劑選自環(huán)磷酰胺和麥考酚酸在第三個方面的第十個實施方案中，這也是第三個方面的第一個、第二個、第三 個、第四個、第五個、第六個、第七個、第八個和第九個實施方案，更優(yōu)選第三個方面的第八 個和第九個實施方案的一個實施方案，所述慢性疾病是狼瘡腎炎和/或肺炎。在第三個方面的第十一個實施方案中，這也是第三個方面的第一個、第二個和第 三個實施方案的一個實施方案，所述藥物組合物包含第二種藥學(xué)活性試劑，由此此類第二 種藥學(xué)活性試劑是抗炎劑。在第三個方面的第十二個實施方案中，這也是第三個方面的第十一個實施方案的 一個實施方案，所述抗炎劑作為分開的劑量單位包含在所述藥物組合物中。在第三個方面的第十三個實施方案中，這也是第三個方面的第十一個和第十二個 實施方案的一個實施方案，所述藥物組合物比包含抗炎劑作為單一療法的藥物組合物包含 更少的抗炎劑。在第三個方面的第十四個實施方案中，這也是第三個方面的第十一個、第十二個 和第十三個實施方案的一個實施方案，所述抗炎劑的劑量單位包含少于作為單一療法使用 時所述免疫抑制劑的劑量單位。在第三個方面的第十五個實施方案中，這也是第三個方面的第十三個和第十四個實施方案的一個實施方案，實施于第三個方面的第十三個和第十四個實施方案的免疫抑制 劑的減少是至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至 少80 %或至少90 %，優(yōu)選至少75 %。在第三個方面的第十六個實施方案中，這也是第三個方面的第十一個、第十二個、 第十三個、第十四個和第十五個實施方案的一個實施方案，所述抗炎劑選自地塞米松和羅 氟司特，優(yōu)選地所述抗炎劑是地塞米松。在第三個方面的第十七個實施方案中，這也是第三個方面的第十一個、第十二個、 第十三個、第十四個、第十五個和第十六個實施方案，優(yōu)選第三個方面的第十五個和第十六 個實施方案的一個實施方案，所述慢性疾病是慢性呼吸道疾病和更優(yōu)選地C0PD。在第四個方面，這也是所述第四個方面的第一個實施方案，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的 問題通過如第一個和第二個方面的實施方案1至62中任何一個所限定的核酸分子得以解 決，用于在用于治療患有慢性疾病或慢性病癥或處于發(fā)展慢性疾病或慢性病癥的危險中的 受試者的方法中，由此該方法包括-給所述受試者施用藥學(xué)活性量的核酸分子。在第四個方面的第二個實施方案中，所述慢性疾病或慢性病癥如前述權(quán)利要求中 任一項中限定。在第四個方面的第三個實施方案中，這也是第四個方面的第一個和第二個實施方 案的一個實施方案，該方法進(jìn)一步包括步驟-給所述受試者施用免疫抑制劑。在第四個方面的第四個實施方案中，這也是第四個方面的第三個實施方案的一個 實施方案，在治療過程中施用的免疫抑制劑的量小于作為單一療法將施用于受試者的免疫 抑制劑的量。在第四個方面的第五個實施方案中，這也是第四個方面的第四個實施方案的一個 實施方案，所述免疫抑制劑的量減少至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、 至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %，優(yōu)選至少75 %。在第四個方面的第六個實施方案中，這也是第四個方面的第一個、第二個、第三 個、第四個和第五個實施方案的一個實施方案，所述免疫抑制劑選自環(huán)磷酰胺和麥考酚酸在第四個方面的第七個實施方案中，這也是第四個方面的第一個、第二個、第三 個、第四個、第五個和第六個實施方案，并且更具體地第四個方面的第五個和第六個實施方 案的一個實施方案，所述慢性疾病是慢性腎疾病，優(yōu)選狼瘡腎炎和/或肺炎。在第四個方面的第八個實施方案中，這也是第四個方面的第一個和第二個實施方 案的一個實施方案，該方法進(jìn)一步包括步驟-給所述受試者施用抗炎劑。在第四個方面的第九個實施方案中，這也是第四個方面的第八個實施方案的一個 實施方案，在治療過程中施用的抗炎劑的量小于作為單一療法將施用于受試者的免疫抑制 劑的量。在第四個方面的第十個實施方案中，這也是第四個方面的第九個實施方案的一個 實施方案，所述免疫抑制劑的量減少至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %，優(yōu)選至少75 %。在第四個方面的第十一個實施方案中，這也是第四個方面的第八個、第九個和第 十個實施方案的一個實施方案，所述抗炎劑選自地塞米松和羅氟司特，優(yōu)選地所述抗炎劑 是地塞米松。在第四個方面的第十二個實施方案中，這也是第四個方面的第八個、第九個、第十 個和第十一個實施方案，并且更具體地第四個方面的第十個和第十一個實施方案的一個實 施方案，所述慢性疾病是慢性呼吸道疾病，優(yōu)選C0PD。在第五個方面，這也是所述第五個方面的第一個實施方案，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的 問題通過如第一個和第二個方面的實施方案1至62中任何一個所限定的核酸分子的使用 得以解決，用于制備用于治療和/或預(yù)防慢性疾病或慢性病癥的藥劑。在第五個方面的第二個實施方案中，所述疾病或病癥是如與第一個和第二個方面 的實施方案1至62中任何一個結(jié)合限定的疾病或病癥。在第五個方面的第三個實施方案中，這也是第五個方面的第一個和第二個實施方 案的一個實施方案，所述藥劑用于人醫(yī)學(xué)或用于獸醫(yī)學(xué)。在第六個方面，這也是所述第六個方面的第一個實施方案，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的 問題通過用于診斷慢性疾病或慢性病癥的方法得以解決，所述方法包括下述步驟-使來自受試者的樣品與如第一個和第二個方面的實施方案1至62中任何一個所 限定的核酸分子接觸，所述受試者待測試是否患有慢性疾病或慢性病癥或處于發(fā)展慢性疾 病或慢性病癥的危險中；和-直接或間接檢測是否形成包含MCP-1和所述核酸分子的復(fù)合物。在第六個方面的第二個實施方案中，所述慢性疾病或慢性病癥是如與第一個和第 二個方面的實施方案1至62中任何一個結(jié)合限定的慢性疾病或慢性病癥。在第七個方面，這也是所述第七個方面的第一個實施方案，作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的 問題通過如第一個和第二個方面的實施方案1至62中任何一個所限定的核酸分子的使用 得以解決，用于制備用于診斷如與第一個和第二個方面的實施方案1至62中任何一個結(jié)合 限定的慢性疾病或慢性病癥的診斷劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下述實施方案和特征也可以與本文描述的特征和實施 方案結(jié)合，特別是與如受與其附著的權(quán)利要求支配的方面和實施方案結(jié)合加以實現(xiàn)。如本文所使用的，術(shù)語慢性疾病和慢性病癥優(yōu)選指慢性呼吸道疾病、慢性腎疾病 和全身性紅斑狼瘡。優(yōu)選地，如本文所使用的，術(shù)語慢性呼吸道疾病包含肺炎、肺和胸膜 炎癥、胸膜炎、胸腔積液、狼瘡肺炎、慢性彌漫性間質(zhì)性肺疾病、肺栓塞、肺出血、肺萎縮綜合 征、肺高壓和慢性阻塞性肺疾病及其組合。更優(yōu)選地，術(shù)語肺高壓包含與左側(cè)心臟病相關(guān) 的肺高壓、與肺病和/或低氧血癥相關(guān)的肺高壓、由于慢性血栓形成和/或栓塞疾病的肺高 壓、肺動脈高壓，優(yōu)選特發(fā)性肺動脈高壓、膠原酶相關(guān)的肺動脈高壓、家族性肺動脈高壓、與 其他疾病相關(guān)的肺動脈高壓、和與靜脈或毛細(xì)血管疾病相關(guān)的肺動脈高壓。另外，術(shù)語慢性 阻塞性肺疾病優(yōu)選包含與肺血管牽涉相關(guān)或不相關(guān)的慢性阻塞性肺疾病。最后，術(shù)語慢性 阻塞性肺疾病優(yōu)選包含選自慢性支氣管炎和肺氣腫。此外，術(shù)語慢性腎疾病優(yōu)選包含狼瘡 腎炎、膜性增生性腎小球腎炎、膜性腎小球腎炎、IgA腎病、鏈球菌感染后腎小球腎炎、急進(jìn) 性腎小球腎炎、腎病綜合征、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥、糖尿病腎病、腎病綜合征、和腎病綜合征，優(yōu)選狼瘡腎炎。如本文所述的根據(jù)本發(fā)明的核酸的特征可以在本發(fā)明的任一方面中實現(xiàn)，其中所 述核酸單獨或者以任何組合使用。人以及鼠MCP-I分別是具有根據(jù)SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2的氨基酸序列的堿
性蛋白質(zhì)?？梢澡b定出對于MCP-I的短的且高親和力結(jié)合性的核酸這一發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的， 這是因為Eaton等人(1997)觀察到針對堿性蛋白質(zhì)的適體(aptamer)(即結(jié)合靶分子的 D-核酸)的產(chǎn)生通常是非常困難的，因為這種類型的靶產(chǎn)生了高但非特異性的信噪比。這 種高信噪比起因于由核酸對堿性靶(例如MCP-1)所顯示的高的非特異性親和力。如在權(quán)利要求書和實施例1中更詳細(xì)概述的，本發(fā)明人能夠更令人驚訝地鑒定出 許多不同的結(jié)合MCP-I的核酸分子，由此大多數(shù)核酸可以根據(jù)核苷酸序列段(其在本文中 也稱為盒)來表征?；谒龊泻湍承┙Y(jié)構(gòu)特征及元件，可以分別對各種結(jié)合MCP-I的核 酸分子進(jìn)行分類。如此確定的各種類別在本文中也稱為類型，并且更具體而言，稱為IA型、 IB型、2型、3型和4型。根據(jù)本發(fā)明的核酸或其序列段或其任何一個或多個部分在原則上可以彼此雜交， 這在本發(fā)明內(nèi)。在此類雜交后，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，此類雜交可以特 別在體外和/或體內(nèi)條件下發(fā)生或不發(fā)生。此外，在此類雜交的情況下，不一定是下述情 況雜交在2個序列段的完整長度上發(fā)生，其中至少基于關(guān)于堿基配對的規(guī)則，此類雜交和 因此雙鏈結(jié)構(gòu)的形成在原則上可以發(fā)生。如本文優(yōu)選使用的，雙鏈結(jié)構(gòu)是通過2條或更多 條分開的鏈或單鏈的2個空間上分開的序列段形成的分子或結(jié)構(gòu)的部分，由此存在至少1 個、優(yōu)選2個或更多個堿基對，其優(yōu)選依照沃森_克里克堿基配對規(guī)則進(jìn)行堿基配對。本領(lǐng) 域技術(shù)人員還應(yīng)認(rèn)識到，其他堿基配對例如Hoogsten堿基配對可以存在此類雙鏈結(jié)構(gòu)中 或形成此類雙鏈結(jié)構(gòu)。在一個優(yōu)選實施方案中，如本文所使用的，術(shù)語排列意指與本文公開的核酸結(jié)合 在本文中描述的結(jié)構(gòu)或功能特征或元件的次序或順序。根據(jù)本發(fā)明的核酸是核酸分子，這在本發(fā)明內(nèi)。在這個范圍內(nèi)，術(shù)語核酸和核酸分 子在本文中以同義方式使用，如果沒有表明與此相反。在本申請的一個實施方案中，核酸和 因此核酸分子包含這樣的核酸分子，其特征在于形成核酸分子的所有相鄰核苷酸通過一個 或超過一個共價鍵彼此連接或相連。更具體而言，此類核苷酸各自與2個其他核苷酸連接 或相連，優(yōu)選通過磷酸二酯鍵或其 他鍵，形成相鄰核苷酸序列段。然而，在此類排列中，2個 末端核苷酸，即優(yōu)選在5'末端處和在3'末端處的核苷酸，僅在下述前提下各自與單個核 苷酸連接此類排列是線性而不是環(huán)狀排列，并且因此是線性而不是環(huán)狀分子。在本申請的另一個實施方案中，核酸和因此核酸分子包含至少2組相鄰核苷酸， 由此在每個相鄰核苷酸組內(nèi)，每個核苷酸與2個其他核苷酸連接或相連，優(yōu)選通過磷酸二 酯鍵或其他鍵，形成相鄰核苷酸的序列段。然而，在此類排列中，2個末端核苷酸，即優(yōu)選在 5'末端處和在3'末端處的核苷酸，各自僅與單個核苷酸連接。然而，在此類排列中，2組 相鄰核苷酸不通過這樣的共價鍵彼此連接或相連，所述共價鍵通過共價鍵使一組的一個核 苷酸與另一個或其他組的一個核苷酸連接，優(yōu)選在所述2個核苷酸之一的糖部分和所述2 個核苷酸或核苷中另一個的磷部分之間形成的共價鍵。然而，在一個備選實施方案中，2組相鄰核苷酸通過這樣的共價鍵彼此連接或相連，所述共價鍵通過共價鍵使一組的一個核苷 酸與另一個或其他組的一個核苷酸連接，優(yōu)選在所述2個核苷酸之一的糖部分和所述2個 核苷酸或核苷中另一個的磷部分之間形成的共價鍵。優(yōu)選地，至少2組相鄰核苷酸不通過 任何共價鍵連接。在另一個優(yōu)選實施方案中，至少2個組通過不同于磷酸二酯鍵的共價鍵 連接。在另外一個實施方案中，至少2個組通過其為磷酸二酯鍵的共價鍵連接。根據(jù)本發(fā)明的核酸還應(yīng)該包括與本文所公開的特定序列基本同源的核酸。術(shù)語基 本同源應(yīng)該理解為，同源性為至少75 %，優(yōu)選85 %，更優(yōu)選90 %，和最優(yōu)選大于95 %、96 %、 97%、98%或 99%。存在于根據(jù)本發(fā)明的核酸中的同源核苷酸的實際百分比將取決于存在于該核酸 中的核苷酸的總數(shù)。修飾百分比可以基于存在于該核酸中的核苷酸的總數(shù)。同源性可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式來測定。更具體而言，然后基于所指定 的程序參數(shù)，用序列比較算法來計算出一個或多個測試序列相對于參考序列的序列同一性 百分比。測試序列優(yōu)選是這樣的序列或核酸分子，即所述序列或核酸分子據(jù)稱被測試或待 測試它是否與另一個核酸分子同源(如果同源的話，同源到什么程度)，由此這種另一個 核酸分子也稱為參考序列。在一個實施方案中，參考序列是如本文所描述的核酸分子，更 優(yōu)選為具有根據(jù)SEQ. ID. NO. 10-129、132-256和278-282中任一個的序列的核酸分子。用 于比較的最佳序列比對可以例如通過下列方法來進(jìn)行Smith & Waterman的局部同源性 算法(Smith & Waterman (1981))，Needleman & Wunsch 的同源性比對算法(Needleman & ffunsch, 1970), Pearson & Lipman 的相似性搜索方法(Pearson & Lipman，1988)，這些算法 的計算機化實施(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr. , Madison, Wis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)，或目測檢查。適合于測定序列同一性百分比的算法的一個實例是在基本局部比對搜索工具 (basic local alignment search tool，在下文中稱為“BLAST”)中使用的算法，參見，例如 Altschul等人(Altschul等人，1990 ；和Altschul等人，1997)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟 件是通過國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnologylnformation，在 下文中稱為“NCBI”)可公開獲得的。在使用從NCBI可獲得的軟件(例如BLASTN(用于核 苷酸序列)和BLASTP(用于氨基酸序列))進(jìn)行的序列同一性測定中所采用的默認(rèn)參數(shù)在 McGinnis 等人(McGinnis 等人，2004)中描述。術(shù)語本發(fā)明的核酸或根據(jù)本發(fā)明的核酸還應(yīng)該包括包含本文所公開的核酸序列 或其部分的那些核酸，優(yōu)選地至這樣的程度，即所述核酸或所述部分參與結(jié)合MCP-1。如本 文優(yōu)選使用的，術(shù)語本發(fā)明的核酸在一個實施方案中還應(yīng)該包括適合于結(jié)合選自MCP-2、 MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的任何分子的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會公認(rèn)，根 據(jù)本發(fā)明的個別核酸將結(jié)合一個或幾個此類分子。在一個實施方案中，此類核酸是本文所 描述的核酸分子之一，或者其衍生物和/或代謝產(chǎn)物，由此此類衍生物和/或代謝產(chǎn)物優(yōu)選 為與本文所描述的核酸分子相比較而言截短的核酸。截短可以涉及本文所公開的核酸的任 一個末端或兩個末端。此外，截短可以涉及所述核酸的內(nèi)部核苷酸序列，即其可以分別涉及 在5’和3’末端核苷酸之間的一個或多個核苷酸。此外，截短應(yīng)該包括來自本文所公開的 核酸序列的少至單個核苷酸的缺失。截短還可以涉及一個或多個本發(fā)明核酸的超過一個的 序列段，由此該序列段可以少至一個核苷酸長。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過用常規(guī)試驗或者通過使用或采用本文所描述的方法(優(yōu)選如本文實施例部分中所描述的方法)來測定根據(jù) 本發(fā)明的核酸的結(jié)合，優(yōu)選與選自MCP-I、MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的 分子的結(jié)合。除非明確地說明與此相反，在本發(fā)明的一個實施方案范圍內(nèi)的是，無論何時當(dāng) 本文提及根據(jù)本發(fā)明的核酸結(jié)合至MCP-I或與MCP-I結(jié)合時，這也適用于根據(jù)本發(fā)明的核 酸結(jié)合至選自MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的任何分子或與之結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是D-核酸或L-核酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸是L-核酸。 另外，還可能的是，核酸的一個或幾個部分作為D-核酸存在，或者核酸的至少一個或幾個 部分是L-核酸。術(shù)語核酸的“部分”應(yīng)該表示少至一個核苷酸。此類核酸在本文中通常分 別稱作D-核酸和L-核酸。因此，在一個特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸由L-核 苷酸組成并包含至少一個D-核苷酸。此類D-核苷酸優(yōu)選附著至與定義根據(jù)本發(fā)明的核 酸的序列段不同的部分，優(yōu)選為其中涉及與該核酸的其他部分相互作用的該核酸的那些部 分。優(yōu)選地，此類D-核苷酸分別附著在根據(jù)本發(fā)明的任何序列段的末端和任何核酸的末端 處。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，此類D-核苷酸可以用作間隔物或連接體，其優(yōu)選地 使修飾物例如PEG和HES附著至根據(jù)本發(fā)明的核酸。同樣也在本發(fā)明的實施方案的范圍內(nèi)的是，本文描述的核酸分子中的每一個和任 何一個就其一個或多個核酸序列而言整體局限于一個或多個特定的核苷酸序列。換言之， 術(shù)語“包括”在這樣的實施方案中應(yīng)該解釋為包含或由…組成的含義。也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，根據(jù)本發(fā)明的核酸是更長的核酸的部分，由此該更長的 核酸包含幾個部分，由此至少一個此類部分是根據(jù)本發(fā)明的核酸或其部分。這些更長的核 酸的一個或多個其他部分可以是一個或幾個D-核酸或一個或幾個L-核酸。任何組合都可 以與本發(fā)明結(jié)合使用。更長的核酸的這些一個或多個其他部分，單獨地或合在一起，以其整 體或以特定組合，可以表現(xiàn)出不同于結(jié)合(優(yōu)選結(jié)合MCP-1)的功能。一種可能的功能是允 許與其他分子(由此此類其他分子優(yōu)選地與MCP-I不同)相互作用，例如，用于固定、交聯(lián)、 檢測或擴增。在本發(fā)明的一個另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸包含幾個本發(fā)明核酸， 作為個別或組合的部分。包含幾個本發(fā)明核酸的此類核酸也由術(shù)語更長的核酸所涵蓋。如本文所使用的，L-核酸是由L-核苷酸組成的核酸，優(yōu)選完全由L-核苷酸組成 的核酸。如本文所使用的，D-核酸是由D-核苷酸組成的核酸，優(yōu)選完全由D-核苷酸組成 的核酸。如果沒有明確表明與此相反，則術(shù)語核酸和核酸分子在本文中以可互換的方式使用。此外，如果沒有表明與此相反，則任何核苷酸序列在本文中以5’ 一 3’的方向示
出ο無論本發(fā)明的核酸由D-核苷酸組成、由L-核苷酸組成還是由兩者的組合(該組 合是例如隨機的組合，或者是由至少一個L-核苷酸和至少一個D-核酸組成的序列段的限 定序列)組成，所述核酸可以由一個或多個脫氧核糖核苷酸、一個或多個核糖核苷酸或其 組合組成。因為幾種原因，將本發(fā)明的核酸設(shè)計成L-核酸是有利的。L-核酸是天然存在的核 酸的對映體。然而，由于核酸酶的廣泛存在，D-核酸在含水溶液中并且特別是在生物系統(tǒng)或生物樣品中不是非常穩(wěn)定的。天然存在的核酸酶，特別是來自動物細(xì)胞的核酸酶不能降 解L-核酸。因此，L-核酸的生物半衰期在此類系統(tǒng)(包括動物和人體)中顯著增加。由 于缺乏L-核酸的可降解性，不產(chǎn)生核酸酶降解產(chǎn)物，并且因而沒有觀察到由其產(chǎn)生的副作 用。該方面界定了事實上所有其他化合物(其用于治療涉及MCP-1的存在的疾病和/或病 癥)的L-核酸。通過不同于沃森-克里克堿基配對的機制特異性地結(jié)合靶分子的L-核酸， 或者部分或完全由L-核酸組成的適體(尤其是參與該適體與靶分子結(jié)合的該適體的那些 部分)也稱為鏡像異構(gòu)體(spiegelmer)。也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，本發(fā)明的核酸(在本文中也稱為根據(jù)本發(fā)明的核酸) 可以作為單鏈或雙鏈核酸存在，不論它們作為D-核酸、L-核酸或D，L-核酸存在或者它們 是DNA或RNA。通常，本發(fā)明的核酸是表現(xiàn)出由一級序列限定的二級結(jié)構(gòu)并因而也可以形成 三級結(jié)構(gòu)的單鏈核酸。然而，本發(fā)明的核酸也可以是雙鏈的，這意味著彼此互補或部分互補 的兩條鏈相互雜交。這賦予核酸以穩(wěn)定性，特別是，如果核酸是以天然存在的D-形式而不 是以L-形式存在，則其將是有利的?？梢孕揎棻景l(fā)明的核酸。此類修飾可以涉及核酸的單個核苷酸并且是本領(lǐng)域 熟知的。此類修飾物的實例尤其描述于Venkatesan(Venkatesan 2003) ；Kusser (Kusser 2000) ；Aurup(Aurup 1994) ；Cummins(Cummins 1995) ；Eaton 等人(Eaton 1995) ；Green 等人(Green 1995) ；Kawasaki 等人(Kawasaki 1993) ；Lesnik 等人(Lesnik 1993)；和 Miller&Kragel (Miller 1993)中。此類修飾物可以是在組成核酸的單個核苷酸的2，位置 處的H原子、F原子或者0-CH3基團或NH2-基團。此外，根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包含至少 一個LNA核苷酸。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸由LNA核苷酸組成。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸可以是多分體(multipartite)核酸。如本 文所使用的，多分體核酸是由至少兩條核酸鏈組成的核酸。這至少兩條核酸鏈形成功能單 元，由此該功能單元是靶分子的配體。所述至少兩條核酸鏈可以衍生自任何本發(fā)明的核酸， 其通過切割核酸以產(chǎn)生兩條鏈，或者通過合成與本發(fā)明的即整體核酸的第一個部分相對應(yīng) 的一個核酸和與整體核酸的第二個部分相對應(yīng)的另一個核酸。公認(rèn)的是，切割和合成兩者 均可用于產(chǎn)生其中存在如上文例示的超過兩條鏈的多分體核酸。換言之，所述至少兩條核 酸鏈通常不同于互補且相互雜交的兩條鏈，盡管在各個核酸部分之間可能存在一定程度的 互補性。最后，也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，實現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明的核酸的完全閉合(即環(huán)狀的) 結(jié)構(gòu)，即，根據(jù)本發(fā)明的核酸是閉合的，優(yōu)選通過共價連接閉合，由此更優(yōu)選地，此類共價連 接在如本文所公開的核酸序列的5’末端和3’末端之間發(fā)生。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的核酸表現(xiàn)出非常有利的KD值范圍。測定結(jié)合常數(shù)的一種可能性是利用所謂的biacore裝置，其也是本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的。如本文所使用的，親和力也通過利用如實施例中所描述的“pull-down測定法”來 測量。為了表示根據(jù)本發(fā)明的核酸與靶(在當(dāng)前情況下為MCP-1)之間的結(jié)合強度的合適 量度是所謂的Kd值，該值以及用于測定它的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。根據(jù)本發(fā)明的核酸通過某個KD值來表征。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的核酸所顯示的Kd 值低于1 P M。大約1 y M的Kd值被認(rèn)為是核酸與靶非特異性結(jié)合的特征。如本領(lǐng)域技術(shù) 人員將公認(rèn)的，一組化合物(例如根據(jù)本發(fā)明的核酸)的KD值在某個范圍內(nèi)。上述的大約IpM的KD是優(yōu)選的KD值上限。結(jié)合靶的核酸的KD的優(yōu)選下限可以是約10pM或更高。在 本發(fā)明范圍內(nèi)的是，獨個核酸與MCP-1結(jié)合的KD值優(yōu)選在這一范圍內(nèi)。優(yōu)選的范圍可以通 過選擇該范圍內(nèi)的任意第一個數(shù)字和該范圍內(nèi)的任意第二個數(shù)字來限定。優(yōu)選的上限值是 250nM 和 100nM，優(yōu)選的下限值是 50nM、10nM、InM、100pM 和 10pM。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以具有任意的長度，只要它們?nèi)匀荒軌蚪Y(jié)合靶分子。本 領(lǐng)域?qū)⒐J(rèn)，存在有根據(jù)本發(fā)明的核酸的優(yōu)選長度。通常，長度在15和120個核苷酸之間。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將公認(rèn)，在15和120之間的任何整數(shù)是根據(jù)本發(fā)明的核酸的可能長度。根 據(jù)本發(fā)明核酸的長度的更優(yōu)選的范圍是約20至100個核苷酸、約20至80個核苷酸、約20 至60個核苷酸、約20至50個核苷酸和約30至50個核苷酸的長度。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，本文所公開的核酸包含這樣的部分，所述部分優(yōu)選為高 分子量部分和/或優(yōu)選使得能夠改變所述核酸尤其是在動物體內(nèi)(優(yōu)選在人體內(nèi))的停留 時間方面的特征。此類修飾物的特別優(yōu)選的實施方案是根據(jù)本發(fā)明的核酸的PEG化和HES 化。如本文所使用的，PEG表示聚(乙二醇)，而HES表示羥乙基淀粉。如本文所優(yōu)選使用 的，PEG化是根據(jù)本發(fā)明的核酸的修飾，其中該修飾由附著至根據(jù)本發(fā)明的核酸的PEG部分 組成。如本文所優(yōu)選使用的，HES化是根據(jù)本發(fā)明的核酸的修飾，其中該修飾由附著至根據(jù) 本發(fā)明的核酸的HES部分組成。這些修飾物以及用此類修飾物來修飾核酸的方法在歐洲專 利申請EP 1 306 382和國際專利申請W02005/074993中描述，所述專利申請的公開內(nèi)容在 此通過提及整體合并。優(yōu)選地，由高分子量部分組成或包含高分子量部分的修飾物的分子量為約2，000 至250，OOODa,優(yōu)選20，000至200，OOODa。在PEG作為此類高分子量部分的情況下，分子量 優(yōu)選為20，000至120，OOODa,更優(yōu)選40，000至80，OOODa。在HES作為此類高分子量部分 的情況下，分子量優(yōu)選為約20，000至200，OOODa,更優(yōu)選40，000至150，OOODa。HES修飾過 程例如在德國專利申請DE 12004006249. 8和國際專利申請W02002080979中描述，所述專 利申請的公開內(nèi)容在此通過提及整體合并。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，PEG和HES中的任一可以以直鏈或分支的形式使用，如在 專利申請W02005/074993、W02002/080979和PCT/EP02/11950中進(jìn)一步描述的。原則上，此 類修飾可以在本發(fā)明的核酸分子的任何位置處進(jìn)行。優(yōu)選地，此類修飾在5’ -末端核苷酸 上、在3’ -末端核苷酸上和/或在該核酸分子的5’核苷酸和3’核苷酸之間的任何核苷酸 上進(jìn)行。該修飾物并且優(yōu)選PEG和/或HES部分，可以或直接或通過連接體附著至本發(fā)明 的核酸分子上。同樣也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子包含一個或多個修 飾物，優(yōu)選一個或多個PEG和/或HES部分。在一個實施方案中，單個連接體分子將超過 一個的PEG部分或HES部分附著至根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。在本發(fā)明中使用的連接體可 以本身是直鏈的或支化的。這種類型的連接體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在專利申請 W02005/074993 和 PCT/EP02/11950 中進(jìn)一步描述。在一個優(yōu)選實施方案中，連接體是生物可降解連接體。生物可降解連接體允許改 變根據(jù)本發(fā)明的核酸尤其在動物體內(nèi)(優(yōu)選在人體內(nèi))的停留時間方面的特征，由于修飾 物從根據(jù)本發(fā)明的核酸中的釋放。生物可降解連接體的使用可以允許更好的控制根據(jù)本 發(fā)明的核酸的停留時間。此類生物可降解連接體的一個優(yōu)選實施方案是如國際專利申請W02006/052790、W02008/034122、W02004/092191 和 W02005/099768 中描述但不限于其的生 物可降解連接體，由此在國際專利申請W02004/092191和W02005/099768中，連接體是聚合 寡核苷酸藥物前體的部分，所述聚合寡核苷酸藥物前體由如本文所描述的一個或兩個修飾 物、核酸分子和兩者之間的生物可降解連接體組成。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，修飾物是生物可降解修飾物，由此所述生物可降解修飾 物可以直接或通過連接體附著至本發(fā)明的核酸分子。生物可降解修飾物允許改變根據(jù)本發(fā) 明的核酸尤其在動物體內(nèi)(優(yōu)選在人體內(nèi))的停留時間方面的特征，由于修飾物從根據(jù)本 發(fā)明的核酸中的釋放。生物可降解修飾物的使用可以允許更好的控制根據(jù)本發(fā)明的核酸的 停留時間。此類生物可降解修飾物的一個優(yōu)選實施方案是如國際專利申請W02002/065963、 W02003/070823.W02004/113394和W02000/41647中描述但不限于其的生物可降解修飾物， 在TO2000/41647中優(yōu)選第18頁，第4至24行。更優(yōu)選地，生物可降解修飾物是分別如國 際專利申請W02004/113394和W02000/41647中描述的生物可降解PEG或生物可降解聚乙 醇酸(縮寫PLGA)。不希望受任何理論的束縛，看起來通過用高分子量部分例如聚合物并且更特別是 本文所公開的聚合物(其優(yōu)選為生理學(xué)上可接受的)來修飾根據(jù)本發(fā)明的核酸，改變了分 泌動力學(xué)。更具體而言，看起來由于這種經(jīng)修飾的本發(fā)明核酸的分子量增加并且由于該核 酸不經(jīng)歷代謝(特別是在L形式時)，減少了從動物體內(nèi)，優(yōu)選從哺乳動物體內(nèi)，和更優(yōu)選從 人體內(nèi)的分泌。由于分泌通常通過腎臟發(fā)生，因此本發(fā)明人推測經(jīng)如此修飾的核酸的腎小 球濾過率與不具有這種類型的高分子量修飾的核酸相比較顯著減小，這導(dǎo)致在體內(nèi)的停留 時間增加。與之相關(guān)，特別值得注意的是，盡管具有這種高分子量修飾，但是根據(jù)本發(fā)明的 核酸的特異性沒有受到有害的影響。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的核酸具有令人驚訝的特 征(該特征通常不能從藥物學(xué)活性化合物中預(yù)期)，從而使得不需要具有持續(xù)釋放性質(zhì)的 藥物制劑以提供持續(xù)釋放。相反，以它們包含高分子量部分的修飾形式，根據(jù)本發(fā)明的核酸 可以像這樣用作持續(xù)釋放制劑。在這種情況下，如本文所公開的核酸分子的一種或多種修 飾和經(jīng)如此修飾的核酸分子以及任何包含其的組合物可以提供不同的，優(yōu)選受控的藥物動 力學(xué)及其生物分布。這還包括在循環(huán)中的停留時間和分配到組織中。此類修飾在專利申請 PCT/EP02/11950 中進(jìn)一步描述。然而，同樣也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，本文所公開的核酸不包含任何修飾，并且特 別是不包含高分子量修飾例如PEG化或HES化。當(dāng)核酸顯示出優(yōu)先分配到體內(nèi)的任何靶器 官或組織時，或當(dāng)需要在施用后從體內(nèi)快速清除核酸時，這種實施方案是特別優(yōu)選的。具有 至體內(nèi)的任何靶器官或組織的優(yōu)先分配譜如本文公開的核酸將允許在靶組織中建立有效 的局部濃度，同時保持低的核酸全身濃度。這將使得能夠使用低劑量，這不但從經(jīng)濟學(xué)觀點 來說是有利的，而且還減少了其他組織對于該核酸試劑的非必需的暴露，從而降低了潛在 的副作用風(fēng)險。在施用后如本文所公開的核酸從體內(nèi)的快速清除在使用核酸或包括其的藥 劑的體內(nèi)成像和特定治療性給藥需求的情況下可能是需要的，各自根據(jù)本發(fā)明。本發(fā)明的核酸(其在本文中也稱為根據(jù)本發(fā)明的核酸)和/或根據(jù)本發(fā)明的拮抗 劑可用于產(chǎn)生或制備藥劑。根據(jù)本發(fā)明的此類藥劑或藥物組合物包含任選地與其他藥物學(xué) 活性化合物組合在一起的至少一種本發(fā)明的核酸，由此本發(fā)明的核酸優(yōu)選地其本身用作藥 學(xué)活性化合物。在優(yōu)選的實施方案中，此類藥劑至少包含藥學(xué)上可接受的載體。此類載體可以是例如水、緩沖液、PBS、葡萄糖溶液(優(yōu)選5%葡萄糖的鹽平衡溶液)、淀粉、糖、明膠或 任何其他可接受的載體物質(zhì)。此類載體通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將 公認(rèn)，本發(fā)明藥劑的任何實施方案、用途和方面或者與之相關(guān)的實施方案、用途和方面也可 應(yīng)用于本發(fā)明的藥物組合物，并且反之亦然。用根據(jù)本發(fā)明的或根據(jù)本發(fā)明制備的核酸、藥物組合物和藥劑來進(jìn)行治療和/或 預(yù)防的適應(yīng)癥、疾病和病癥起因于MCP-I直接或間接參與的分別的致病機理。然而，還可以 治療 和預(yù)防MCP-2、MCP-3、MCP-4和/或嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子直接或間接參與了其致病機 理的那些適應(yīng)癥、疾病和病癥。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，特別是根據(jù)本發(fā)明的 那些核酸可以在這種范圍內(nèi)使用，即用于更廣義地涉及MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì) 胞趨化因子的疾病，所述核酸分別與MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子相互作 用或結(jié)合。更具體而言，此類用途尤其起因于MCP-I的表達(dá)模式，這暗示了其在特征為單核 細(xì)胞浸潤的人疾病中起重要作用。這種細(xì)胞浸潤存在于許多炎性疾病和自身免疫疾病中。在動物模型中，已經(jīng)顯示，MCP-I在局灶性缺血后(Kim 1995 ；Wang 1995)和在實 驗性自身免疫性腦脊髓炎期間(Hulkower 1993 ；Ransohoff 1993 ；Banisor 2005)在腦中 表達(dá)。MCP-I可能是在由這些動物模型舉例說明的疾病過程(例如中風(fēng)和多發(fā)性硬化癥) 中靶向單核細(xì)胞的重要趨化因子。大量的證據(jù)支持這樣的觀點，即MCP-1/CCR2軸在單核細(xì)胞的趨化過程中并因而 在慢性炎癥中具有獨特的作用(i)MCP-l或CCR2缺陷型小鼠顯示出顯著減少的巨噬細(xì)胞 趨化應(yīng)答而在其他方面表現(xiàn)正常(Kuziel 1997 ；Kurihara 1997 ；Boring 1997 ；Lu 1998)。 (ii)，盡管在體外與其他趨化因子呈現(xiàn)出功能冗余，但在幾種炎癥模型中僅MCP-I效應(yīng)子 功能的喪失就足以損害單核細(xì)胞的運輸(Lloyd 1997 ；Furuichi 2003 ；Egashira 2002 ； Galasso 2000 ；Ogata 1997 ；Kennedyl998 ；Gonzalo 1998 ；Kitamoto 2003)。 (iii)，$i午 多炎性疾病中MCP-I的水平升高。事實上，MCP-I被認(rèn)為在許多具有和沒有明顯炎性組分 的疾病中起作用，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Koch 1992 ；Hosakal994 ；Akahoshi 1993 ；Harigai 1993 ；Rollins 1996)、腎疾病(Wadal996 ；Viedt 2002)、血管成形術(shù)后再狹窄(Economou 2001)、變態(tài)反應(yīng)和哮喘(Alam 1996 ；Holgate 1997 ；Gonzalo 1998)、癌癥(Salcedo2000 ； Gordillo 2004)、動脈粥樣硬化(Nelken 1991 ；Yla-Herttualal991 ；Schwartz 1993 ； Takeya 1993 ；Boring 1998)、牛皮癬(Vestergaard 2004)、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥(Huang 2001)、 特應(yīng)性皮炎(Kaburagi 2001)、結(jié)腸炎(Okuno 2002)、子宮內(nèi)膜異位(Jolicoeur2001)、 眼色素層炎(Tuaillon 2002)、視網(wǎng)膜病癥(Nakazawa 2007)、特發(fā)性肺纖維化和結(jié)節(jié)病 (Iyonaga 1994)以及多肌炎 / 皮肌炎(DeBleecker 2002)。使用抗-MCP-I試劑或CCR2拮抗劑的治療性干預(yù)將會影響過量的炎性單核細(xì)胞運 輸，但可以保留基本的巨噬細(xì)胞運輸，從而避免全面的免疫抑制和增加的感染風(fēng)險(Dawson 2003)。另外，基于對于炎癥過程的分子機制和對于局部分泌的炎癥介質(zhì)的相互作用的不 斷增加的認(rèn)識，已經(jīng)鑒定了用于治療腎病的新靶(Holdsworth 2000 ；Segerer 2000)。那些 靶之一是MCP-I，對于所述的那些靶，存在大量的有關(guān)在合適的動物模型中用特異性拮抗劑 進(jìn)行的表達(dá)和干預(yù)研究方面的數(shù)據(jù)。這種蛋白質(zhì)對于將免疫細(xì)胞募集到腎臟炎癥的位點來說具有廣泛地非冗余的作用。免疫細(xì)胞對腎臟的浸潤被認(rèn)為在各種類型的腎病的發(fā)展中是 結(jié)構(gòu)性腎損傷和腎功能衰退的主要機制。所有類型的腎細(xì)胞在體外受到刺激時可以表達(dá)趨化因子，包括MCP-I (Segerer 2000)；存在大量在體外引發(fā)MCP-I表達(dá)的刺激，包括細(xì)胞因子、氧自由基、免疫復(fù)合物和脂 質(zhì)介質(zhì)。在大鼠和小鼠的健康腎臟中，MCP-I不表達(dá)，但是其在急性和慢性的腎臟炎癥嚙 齒動物模型的過程中容易被上調(diào)，所述模型包括免疫復(fù)合物性腎小球腎炎、急進(jìn)性腎小球 腎炎、增生性腎小球腎炎、糖尿病性腎病、梗阻性腎病或急性腎小管壞死(Segerer 2000 ； Anders2003)。MCP-I在嚙齒動物中的表達(dá)數(shù)據(jù)與在人腎臟活組織檢查中所發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)的表 達(dá)非常相關(guān)(Rovin 1994 ；Cockwell 1998 ;Wadal999)。此外，人腎臟中的腎表達(dá)與疾病活 動度(disease activity)相關(guān)，并且在合適的治療導(dǎo)致疾病緩解時降低(Amarm 2003)。腎小球的單核細(xì)胞浸潤與患有糖尿病性腎病的患者中的彌漫性腎小球硬化的發(fā) 展有關(guān)。MCP-I在腎小球內(nèi)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的募集和聚集中起重要作用(Banba 2000； Morii 2003)。局部產(chǎn)生的MCP-I看來似乎特別是參與了腎小管間質(zhì)損害的起始和進(jìn)展，如在使 用患有腎毒性血清誘導(dǎo)的腎炎(NSN)的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的實驗中所證明的。主要是在血管 內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和浸潤的單核細(xì)胞(在間質(zhì)損害中)中檢測到了 MCP-1。MCP-I 介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的激活與下列觀念相一致=MCP-I促進(jìn)了腎小管間質(zhì)性炎癥(其為 進(jìn)行性腎病的標(biāo)志)(Wada 2001 ；Viedt 2002)。由于在一方面的MCP-I和另一方面的MCP-2、MCP-3、MCP_4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因 子之間的同源性，根據(jù)本發(fā)明的核酸，至少它們中分別與MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒 細(xì)胞趨化因子結(jié)合或與之相互作用的那些核酸通?？梢杂糜谥委?、預(yù)防和/或診斷任何這 樣的疾病，在所述疾病中分別有MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的直接或間 接的參與。如本文優(yōu)選使用的，參與表示，如果各個參與該疾病的分子被阻止發(fā)揮其與該疾 病的根本致病機理相關(guān)的功能中的一種、幾種或全部，則該疾病將會被治愈或其程度將會 減輕或其發(fā)作將會被阻止；至少此類疾病的癥狀或任何指示物(indicator)將分別得到減 輕和改善，從而使得所述癥狀和指示物分別與在未患該疾病或不具有形成此類疾病的風(fēng)險 的受試者中所觀察到的一種或多種相同或相近。當(dāng)然，由于根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合MCP-I的核酸與人或鼠MCP-I相互作用或與之結(jié)合， 因此技術(shù)人員通常將會理解，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合MCP-I的核酸可以容易地用于治療、預(yù)防 和/或診斷人和動物的如本文所描述的任何疾病。因此，單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白(MCP)家族的這些成員，即MCP-2、MCP_3、MCP-4和 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子，與MCP-I具有高度的序列相似性。盡管不是排它性的，嗜酸性粒細(xì) 胞趨化因子、MCP-2、MCP-3和MCP-4經(jīng)由CCR3 (人嗜酸性粒細(xì)胞上的特征性的趨化因子受 體)相互作用(Heath 1997)。CCR3受體在贅生性病狀，例如皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(Kleinhans 2003)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Kouno 2004)或腎細(xì)胞癌(Johrer 2005)中被上調(diào)。更具體而言，增加的嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平與哮喘診斷和受損的肺功能直接 相關(guān)(Nakamura 1999)。已經(jīng)在特應(yīng)性和非特應(yīng)性哮喘中均觀察到嗜酸性粒細(xì)胞趨化因 子在過敏性炎癥位點處的表達(dá)增加(Ying 1997 ；Ying 1999)。此外，編碼MCP-2和MCP-4的mRNA在各種組織中組成性地表達(dá)；但是它們在這些背景下的生理功能是未知的。血 漿MCP-2水平在膿毒癥中與MCP-I —起增加(Bossinkl995) ；MCP-3的表達(dá)在哮喘中發(fā) 生(Humbert 1997)。最后，在動脈粥樣硬化的脈管的腔表面上可以發(fā)現(xiàn)MCP-4 (Berkhout 1997)。因此，可以用根據(jù)本發(fā)明的藥劑進(jìn)行治療和/或預(yù)防的疾病和/或病癥和/或患 病狀況包括但不限于炎性疾病，自身免疫疾病，自身免疫性腦脊髓炎，中風(fēng)，急性和慢性多 發(fā)性硬化癥，慢性炎癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腎病，再狹窄，血管成形術(shù)后再狹窄，急性和慢性 變態(tài)反應(yīng)，原發(fā)性和繼發(fā)性免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)，哮喘，結(jié)膜炎，支氣管炎，癌癥，動脈粥樣 硬化，動脈硬化性心血管心力衰竭或中風(fēng)，牛皮癬，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，特應(yīng)性 皮炎，結(jié)腸炎，子宮內(nèi)膜異位，眼色素層炎，視網(wǎng)膜病癥，包括黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離、糖尿病 性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、色素性視網(wǎng)膜炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和漿液性中 心性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變；特發(fā)性肺纖維化，特發(fā)性和/或膠原酶相關(guān)的肺動脈高壓，結(jié)節(jié) 病，多肌炎，皮肌炎，避免免疫抑制，降低感染風(fēng)險，膿毒癥，腎臟炎癥，腎小球腎炎，急進(jìn)性 腎小球腎炎，增生性腎小球腎炎，糖尿病性腎病，梗阻性腎病，急性腎小管壞死，和彌漫性腎 小球硬化，全身性紅斑狼瘡，慢性支氣管炎，貝赫切特病，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)JII 畸病之后的過早動脈粥樣硬化，心肌梗死，肥胖癥，慢性肝病，佩羅尼病，急性脊髓損傷，肺 或腎移植，心肌炎，阿爾茨海默病和神經(jīng)病，乳腺癌，胃癌，膀胱癌，卵巢癌，錯構(gòu)瘤，結(jié)腸直 腸癌，結(jié)腸腺瘤，胰腺炎，具有或沒有肺脈管牽涉的慢性阻塞性肺部疾病(COPD)，和炎性腸 病例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎。特別優(yōu)選的慢性腎疾病是狼瘡腎炎，優(yōu)選用于聯(lián)合療法。狼瘡腎炎是由全身性紅斑狼瘡(縮寫SLE)引起的腎臟的炎癥，并且也稱為狼瘡腎 小球腎炎，是腎小球腎炎的一個類型或形式。腎小球腎炎也稱為腎小球的腎炎，是特征在于 腎中的腎小球或小血管炎癥的腎病。SLE也稱為狼瘡是慢性自身免疫疾病，導(dǎo)致炎癥和組織損傷。除腎外，SLE還可以 影響機體的任何部分，但最通常損害心、關(guān)節(jié)、皮膚、肺、血管、肝和神經(jīng)系統(tǒng)。肺的損傷變得 表現(xiàn)在慢性呼吸道疾病例如肺炎，肺表現(xiàn)可以包括肺和胸膜炎癥，這可以引起胸膜炎、胸腔 積液、狼瘡肺炎、慢性彌漫性間質(zhì)性肺疾病、肺高壓、肺栓塞、肺出血和肺萎縮綜合征。狼瘡腎炎的診斷一般取決于血液測試、尿分析、X射線、腎的超聲掃描和/或腎活 組織檢查。世界衛(wèi)生組織基于活組織檢查已將狼瘡腎炎分成5個類別，所有這些應(yīng)由如本文 所使用的術(shù)語狼瘡腎炎所涵蓋。這個分類法在1982年定義并且在1995年修改。-I類是最低限度的膜性腎小球腎炎，其在光學(xué)顯微鏡檢查下是組織學(xué)正常的，但 在電子顯微鏡檢查下具有腎小球膜沉積物。-II類基于膜性增生性狼瘡腎炎的發(fā)現(xiàn)。這種形式通常對用皮質(zhì)類固醇的治療完 全響應(yīng)。-III類是局灶性增生性腎炎，并且通常對用高劑量皮質(zhì)類固醇的治療成功響應(yīng)。-IV類是彌漫性增生性腎炎。這種形式主要用皮質(zhì)類固醇和免疫抑制藥品進(jìn)行治療。
32
-V類是膜性腎炎并且特征在于極度水腫和蛋白質(zhì)喪失。-VI類腎小球硬化癥。其他類型或形式的腎疾病腎小球腎炎是-膜性增生性腎小球腎炎(縮寫MPGN)，由腎臟腎小球膜中的沉積物和基膜(縮寫 GBM)增厚引起的一類腎小球腎炎，激活補體且損傷腎小球；-膜性腎小球腎炎(縮寫MGN)，也稱為膜性腎病，進(jìn)展緩慢的腎疾??；-IgA腎病變，遍及全世界的最常見的腎小球腎炎；該疾病由腎小球的中心——腎 小球膜中免疫球蛋白A(縮寫IgA)以斑點形式沉積而獲得其名稱。-鏈球菌感染后腎小球腎炎，在鏈球菌感染后腎中的腎小球(腎小球腎炎)或小血 管病癥；-急進(jìn)性腎小球腎炎(縮寫RPGN)，一種腎的綜合征，當(dāng)未進(jìn)行治療時，其快速進(jìn)展 為急性腎衰竭并且在數(shù)月內(nèi)死亡。在50%的病例中，RPGN與潛在疾病例如古德帕斯徹綜合 征、全身性紅斑狼瘡或韋格納肉芽腫病相關(guān)；其余病例是特發(fā)性的；-腎病綜合征(或急性腎病綜合征)，其更正確地意指與影響腎的病癥，更具體而 言腎小球病癥相關(guān)的征兆集合；-局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥，兒童和青少年中的腎病綜合征的病因，以及成人中 的腎衰竭的主要病因；-糖尿病腎病，也稱為基_威(Kimmelstiel-Wilson)二氏綜合征和毛細(xì)管間腎小 球腎炎，是由腎臟腎小球中的毛細(xì)血管的血管病引起的進(jìn)行性腎疾病。它的特征在于腎病 綜合征和結(jié)節(jié)性腎小球硬化癥。它是由于長期糖尿病，并且是許多西方國家中關(guān)于透析的 主要原因；-腎病綜合征，是其中腎受損傷的非特異性病癥，促使其將大量蛋白質(zhì)(>3. 5克 /天/l. 73m2體表面積)泄漏到尿內(nèi)；-間質(zhì)性腎炎(或腎小管間質(zhì)性腎炎)，是影響腎臟腎小管周圍的間質(zhì)的腎炎形 式。這種疾病可以是急性或慢性的。存在MCP-1及其分別的趨化因子受體CCR2在自身免疫組織損害例如SLE的臨 床表現(xiàn)中起關(guān)鍵作用的非常強烈的證據(jù)(Gerard &Rollins 2001)。例如，對于MCP-1或 CCR2基因缺陷的MRLW_小鼠得到保護(hù)不受狼瘡樣自身免疫(Perez de Lema 2005， Teschl999)。因此，MCP-1/CCR2軸可能代表用于例如狼瘡腎炎的有希望的治療靶。慢性呼吸道疾病也稱為慢性肺疾病或慢性肺部疾病，是肺的氣道和其他結(jié)構(gòu)例如 如肺脈管系統(tǒng)的慢性疾病。最常見慢性呼吸道疾病中的一些是哮喘、慢性阻塞性肺疾病 (縮寫C0PD)、呼吸道變態(tài)反應(yīng)、職業(yè)性肺部疾病和肺高壓。慢性阻塞性肺疾病(縮寫C0PD)是特征在于來自肺的氣流持續(xù)堵塞的肺部疾病。 它是診斷標(biāo)準(zhǔn)以下的，威脅生命的肺部疾病，其干擾正常呼吸并且不是完全可逆的。C0PD包 括少數(shù)肺部疾病最常見的是慢性支氣管炎和肺氣腫。具有C0PD的許多人具有這兩種疾 病。肺氣腫是對于在氣道頂端處的氣囊的損傷，這使得機體難以獲取其需要的氧。在慢性 支氣管炎期間，氣道是受刺激的、紅色的，并且制造太多粘性粘液。氣道的壁是腫脹的并且 部分堵塞空氣經(jīng)過。MCP-1在C0PD和/或C0PD發(fā)展中的牽涉迄今為止仍不明了。De Boer和同事發(fā)現(xiàn)在具有COPD的目前或以往抽煙者的外周肺組織的半定量分析中1.5倍高水平的 MCP-ImRNA (De Boer 2000)?；谒麄兊慕Y(jié)果，作者假定在COPD中MCP-I可能牽涉巨噬細(xì) 胞和肥大細(xì)胞召募到氣道上皮中。Traves等人(Traves 2002)發(fā)現(xiàn)在唾液中而不是在支 氣管肺泡灌洗(縮寫B(tài)AL)液中增加水平的MCP-1，并且假定MCP-I牽涉單核細(xì)胞和嗜中性 白細(xì)胞遷移到氣道內(nèi)，促成與COPD相關(guān)的增加的炎癥負(fù)荷(Traves 2002)。然而，在2006 年，Ko等人(Ko 2006)測定具有COPD患者的呼出呼吸冷凝物。他們未發(fā)現(xiàn)在COPD患者中 升高的MCP-I水平(Ko 2006)。盡管MCP-I牽涉炎癥過程以及引起炎癥的單核細(xì)胞和/或嗜中性白細(xì)胞的召募， 但仍未完全明了 MCP-I是否牽涉COPD和/或COPD的發(fā)展。令人驚訝的是，如本發(fā)明的實施 例11中所示，在廣泛用于就COPD治療中的有用性篩選物質(zhì)的公認(rèn)動物模型中，結(jié)合MCP-I 的鏡像異構(gòu)體的施用導(dǎo)致到肺內(nèi)的細(xì)胞浸潤的減少?；诒旧暾堉兴镜臄?shù)據(jù)，結(jié)合MCP-I 的鏡像異構(gòu)體適合于在慢性呼吸道疾病優(yōu)選COPD的治療中具有作用，單獨或聯(lián)合療法的 一個元素，優(yōu)選在與類固醇藥品優(yōu)選地塞米松的聯(lián)合療法中。結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體與 地塞米松或其他類固醇藥品的聯(lián)合療法利用2種獨立的作用方式，以便治療慢性呼吸道疾 病例如COPD。
肺脈管結(jié)構(gòu)和功能中的改變在具有COPD的患者中是高度普遍的(Peinado 2008)，此處指定為具有肺脈管牽涉的C0PD。脈管畸形損害氣體交換，并且可能導(dǎo)致肺高壓， 這是與COPD患者中減少的存活相關(guān)的主要因素之一(Peinado 2008)。在起始疾病階段時 已鑒定肺循環(huán)中的改變，提供其發(fā)病機制的新了解。由吸煙產(chǎn)物或炎癥元素的作用產(chǎn)生的 內(nèi)皮細(xì)胞損傷和機能障礙目前被認(rèn)為是起始導(dǎo)致肺高壓的事件順序的主要改變(Peinado 2008)。肺高壓(縮寫PH)是肺動脈、肺靜脈或肺毛細(xì)血管(統(tǒng)稱為肺脈管系統(tǒng))中的血 壓中的增加，導(dǎo)致呼吸短促、眩暈、昏厥和其他癥狀，所有這些通過費力而惡化。PH可以是具 有明顯減少的運動耐量和心力衰竭的嚴(yán)重疾病。自從1973年以后，進(jìn)行了原發(fā)性PH和繼 發(fā)性 PH 之間的區(qū)別(Hatano & Strasser 1975)。原發(fā)性PH是特征在于在不存在已知病因的情況下緩慢增加的肺血管阻力的綜合 征，如果不進(jìn)行治療，那么其通常導(dǎo)致在4年內(nèi)的死亡(Rubin 1997)。繼發(fā)性PH起因于持續(xù)血管收縮和對于肺血管床的結(jié)構(gòu)改變(Hopkins 2002)。負(fù) 責(zé)這些改變的主要刺激是慢性肺泡缺氧、慢性炎癥和過度剪應(yīng)力(Voelker 1995)。^fc 2003 ^ M T ^ ^ 7 3rd World Symposium on PulmonaryArterial Hypertension,以基于疾病機制的新發(fā)現(xiàn)修改分類法。由這個團體發(fā)展的修改系統(tǒng)提供用 于理解肺高壓的目前框架(Simonneau2004)-WHO組I-肺動脈高壓(縮寫PAH)〇特發(fā)性肺動脈高壓(縮寫IPAH)〇家族性肺動脈高壓(縮寫FPAH)〇與其他疾病相關(guān)的肺動脈高壓(縮寫APAH)，由此其他疾病是膠原血管病(例如 硬皮病)、全身和肺循環(huán)之間的先天性分流、門靜脈高壓、HIV感染、藥品、毒素或其他疾病 或病癥。〇與靜脈或毛細(xì)血管疾病相關(guān)的肺動脈高壓。
-WHO組II-與左側(cè)心臟病相關(guān)的肺高壓〇心房或心室疾病〇心瓣膜病(例如二尖瓣狹窄)-WHO組III-與肺部疾病和/或低氧血癥相關(guān)的肺高壓〇慢性阻塞性肺疾病(縮寫C0PD)，間質(zhì)性肺疾病(縮寫ILD)〇睡眠障礙性呼吸，肺泡通氣不足〇對于高海拔高度的長期暴露〇發(fā)育肺畸形 -WHO組IV-由于慢性血栓形成和/或栓塞疾病的肺高壓〇在近端或遠(yuǎn)端肺動脈中的肺栓塞〇其他物質(zhì)例如腫瘤細(xì)胞或寄生蟲的栓塞形成-WHO組V-混雜的近年來已開發(fā)了許多試劑用于原發(fā)性和繼發(fā)性PAH 前列腺環(huán)素衍生物例如依前 列醇，內(nèi)皮素受體拮抗劑例如波生坦和5型磷酸二酯酶例如西地那非(Torres 2007)。與健康對照相比較，MCP-I水平在具有特發(fā)性肺動脈高壓或原發(fā)性肺高壓的患者 中是升高的。這些結(jié)果暗示MCP-I對于肺高壓發(fā)展的貢獻(xiàn)(Itoh 2006，)。如實施例12中 所示，在廣泛用于就肺高壓治療中的有用性篩選物質(zhì)的動物模型中，結(jié)合MCP-I的鏡像異 構(gòu)體顯示對PH的正面作用。因此，結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體可用作用于治療PH的試劑。在其他實施方案中，所述藥劑包含另外的藥物學(xué)活性試劑。此類另外的藥物學(xué)活 性化合物尤其是(但不限于此)已知能控制血壓和糖尿病的那些，例如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE)抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑。在另外的實施方案中，所述另外的藥物學(xué)活性化合 物也可以是減少免疫細(xì)胞浸潤至慢性炎癥位點中或一般地抑制過度的免疫應(yīng)答(所述過 度的免疫應(yīng)答存在于慢性炎癥位置中并導(dǎo)致組織損傷)的那些化合物中的一種。此類化合 物可以是但不限于類固醇或免疫抑制劑，并且優(yōu)選選自皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松、甲潑尼 龍、氫化可的松、地塞米松)和通用免疫抑制劑(例如環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素、苯丁酸氮芥、硫唑 嘌呤、他克莫司或嗎替麥考酚酸酯)。另外，T-細(xì)胞共刺激的更特異的阻斷劑，如CD154或 ⑶40或⑶28或⑶86或⑶80的阻斷劑；或者T-細(xì)胞和/或B-細(xì)胞耗竭劑，如抗-⑶20試 劑，可用于其他實施方案。最后，另外的藥物學(xué)活性試劑可以是任何其他趨化因子的活性的 調(diào)節(jié)劑，其可以是趨化因子激動劑或拮抗劑或者趨化因子受體激動劑或拮抗劑。備選地，或 另外地，此類另外的藥物學(xué)活性試劑是其他的根據(jù)本發(fā)明的核酸。備選地，所述藥劑包含至 少多于一種這樣的核酸，所述核酸結(jié)合不同于MCP-I的靶分子或者顯示出與根據(jù)本發(fā)明的 核酸的功能不同的功能。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，原則上將所述藥劑備選地或另外地用于預(yù)防任何在所述藥劑 用于治療所述疾病的用途方面所公開的疾病。因此，各自的標(biāo)記物，即各自疾病的各自標(biāo)記 物，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選地，各自的標(biāo)記是MCP-I。備選地和/或另外地，各自的 標(biāo)記選自MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子。另外一組標(biāo)記物選自血漿中的自 身反應(yīng)性抗體(例如抗-dsDNA抗體)或類風(fēng)濕因子。在本發(fā)明的藥劑的一個實施方案中，將這種藥劑與用于任何本文所公開的疾病 (特別是，將使用本發(fā)明的藥劑進(jìn)行治療的那些疾病)的其他治療聯(lián)合使用。
“聯(lián)合療法”(或“綜合療法(co-therapy) ”)包括施用本發(fā)明的藥劑和至少另一種 試劑作為具體治療方案的一部分，以期望從這些治療劑即本發(fā)明的藥劑和所述另一種試劑 的共同作用中提供有益效應(yīng)。這種聯(lián)合的有益效應(yīng)包括但不限于由治療劑的聯(lián)合而產(chǎn)生的 藥物動力學(xué)或藥效動力學(xué)共同作用。這些治療劑的聯(lián)合施用通常在限定的時間內(nèi)完成(通 常為數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天或數(shù)周，這取決于所選擇的組合)?！奥?lián)合療法”意在包括(但通常不包括)施用兩種或更多種這些治療劑作為分開 的單一療法方案的一部分，所述單一療法方案偶然地地和不定地導(dǎo)致本發(fā)明的聯(lián)合?！奥?lián)合 療法”旨在包括以連續(xù)的方式施用這些治療劑，也就是說，其中每種治療劑在不同的時間施 用，以及以基本上同時的方式施用這些治療劑或所述治療劑中的至少兩種。基本上同時施 用可以例如通過下列方式來完成將具有固定比例的每種治療劑的單個膠囊或者將多個關(guān) 于每種治療劑的單膠囊施用給受試者。在一個優(yōu)選實施方案中，慢性疾病是慢性腎疾病且更優(yōu)選狼瘡腎炎，或慢性肺疾 病且更優(yōu)選肺炎，這使用聯(lián)合療法進(jìn)行治療。此種聯(lián)合療法利用如本文所公開的核酸分子 和免疫抑制劑的組合。優(yōu)選地，免疫抑制劑選自環(huán)磷酰胺和麥考酚酸酯。環(huán)磷酰胺(Cytoxan、Neosar、Rev immune的通用名稱)也稱為環(huán)磷酰胺 (cytophosphane)，是氮芥烷化劑，來自oxazophorines組。環(huán)磷酰胺的靜脈內(nèi)和口服施用 已成為用于治療狼瘡腎小球腎炎的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(Steinberg 1991)。環(huán)磷酰胺是“藥物前體”， 其在肝臟中轉(zhuǎn)化成具有化學(xué)治療活性的活性形式。事實上，環(huán)磷酰胺的使用受潛在的嚴(yán)重 毒性作用的限制，所述毒性作用包括骨髓抑制、出血性膀胱炎、機會致病菌感染、惡性疾病 和早產(chǎn)兒性腺衰竭(Boumpas 1995)。與用單獨的皮質(zhì)類固醇的治療相比較，用與皮質(zhì)類 固醇相組合的間歇性靜脈內(nèi)環(huán)磷酰胺的治療的臨床試驗顯示更大的長期腎存活，但并非總 體存活(Austin 1986 ；Valeri 1994 ；Lehman 1989 ；Boumpas 1992)。另外，在接受環(huán)磷酰 胺的18至57%患者中報告無法達(dá)到緩解，這與增加的進(jìn)展至腎衰竭的速率相關(guān)(Korbert 2000 ；Gourley 1996 ；Ionnidis 2000 ；Mok 2004)。麥考酚酸酯是免疫抑制劑，由此它在肝臟中代謝成活性部分霉酚酸。它抑制肌 苷一磷酸脫氫酶，該酶控制在B和T淋巴細(xì)胞增殖中使用的嘌呤合成的從頭途徑中的鳥 嘌呤一磷酸合成速率。麥考酚酸酯批準(zhǔn)用于預(yù)防移植排斥，已在具有對于環(huán)磷酰胺難治 的狼瘡腎炎的患者中和在無法耐受環(huán)磷酰胺的患者中使用(Dooley 1990 ；Gaubitz 1999 ； Kingdon 2001 ；Karim 2002)。在4周試驗中，麥考酚酸酯在誘導(dǎo)狼瘡腎炎的緩解中比靜脈 內(nèi)環(huán)磷酰胺更有效(Ginzler 2005)。然而，2種藥品各自與顯著的發(fā)病率和死亡率相關(guān)。例如，在Aspreva Lupus Management Study (ALMS)試驗中，麥考酚酸酯在27. 7 %中引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，并且在 4. 9%中引起治療相關(guān)死亡，而環(huán)磷酰胺分別在22. 8%和2. 8%的治療患者中引起嚴(yán)重不 良反應(yīng)和治療相關(guān)死亡(Appel 2007)。大多數(shù)嚴(yán)重不良反應(yīng)和死亡涉及由于環(huán)磷酰胺和麥 考酚酸酯的非特異性免疫抑制作用的感染(Appel 2007)。特異性阻斷自身免疫炎癥的新型 藥品可能允許減少目前治療方案的毒性，通過替換環(huán)磷酰胺和麥考酚酸酯或通過在組合中 使用時允許顯著劑量減少。與此類聯(lián)合療法結(jié)合，免疫抑制劑的總體量的顯著減少是可能的，而仍達(dá)到療效。 免疫抑制劑的總體量的顯著減少可能通過在每次施用時減少免疫抑制劑的量來實現(xiàn)，或通過在疾病治療中減少免疫抑制劑的施用頻率來實現(xiàn)。不管實踐所述2個選擇中的哪一個， 在任何情況下，與僅施用免疫抑制劑而不是免疫抑制劑與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的組合時 在患者治療中施用的免疫抑制劑的總體量相比較，在治療過程中施用于患者的免疫抑制劑 的總體量是減少的。與所述疾病的治療結(jié)合免疫抑制劑作為唯一的藥學(xué)活性試劑的此類施 用，在本文中也稱為單一療法。此類減少的程度取決于特定免疫抑制劑和特定疾病，以及待 治療患者的個人特征。在任何情況下，與分別的免疫抑制劑作為單一療法的使用相比較，根 據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合療法伴隨更少的副作用。使用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子作為一種藥學(xué)活性試劑的聯(lián)合療法的一個進(jìn)一步優(yōu) 選的實施方案，是與慢性呼吸道疾病的治療結(jié)合的聯(lián)合療法，由此所述慢性呼吸道疾病優(yōu) 選是C0PD。在所述聯(lián)合療法中連同根據(jù)本發(fā)明的核酸分子一起使用的試劑是抗炎劑。優(yōu)選 地，抗炎劑選自地塞米松和羅氟司特；更優(yōu)選地所述抗炎劑是地塞米松。每種治療劑的順次施用或基本上同時施用可以通過任何合適的途徑來實現(xiàn)，包括 但不限于局部途徑、口服途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑和經(jīng)過粘膜組織的直接吸收。治療劑 可以通過相同的途徑或通過不同的途徑施用。例如，所選擇的聯(lián)合的第一種治療劑可以通 過注射施用而該聯(lián)合中的其他治療劑可以局部施用。備選地，例如，所有治療劑可以局部施用或者所有治療劑可以通過注射施用。治療 劑的施用順序不是嚴(yán)格重要的，除非另外說明。“聯(lián)合療法”還可以包括將如上所述的治療 劑以與其他生物活性成分的進(jìn)一步聯(lián)合形式進(jìn)行施用。如果聯(lián)合療法還包括非藥物治療， 則該非藥物治療可以在任何合適的時間進(jìn)行，只要能實現(xiàn)從治療劑和非藥物治療的聯(lián)合的 共同作用中獲得有益效應(yīng)。例如，在適當(dāng)?shù)那闆r下，當(dāng)非藥物治療在時間上距離治療劑的施 用可能有幾天或甚至幾周時，仍然能夠達(dá)到有益效應(yīng)。如在上述通用術(shù)語中所概述的，根據(jù)本發(fā)明的藥劑原則上可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的任何形式施用。優(yōu)選的施用途徑是全身性施用，更優(yōu)選地，其通過腸胃外施用，優(yōu)選 通過注射施用來進(jìn)行。備選地，藥劑可以局部施用。其他施用途徑包括肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下、 經(jīng)口、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或肺部施用，優(yōu)先選擇侵入性最低并同時確保效力的施用途徑。腸胃外施用通常用于皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和輸注。另外，一種用于腸胃外施用 的方法采用了本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)的植入，其確保維持恒定的劑量 水平。此外，本發(fā)明的優(yōu)選藥劑可以通過局部使用合適的鼻內(nèi)媒介物(vehicle)、吸入劑 來以鼻內(nèi)形式進(jìn)行施用，或者可以采用那些本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的透皮貼劑的形式通過 經(jīng)皮途徑進(jìn)行施用。為了以透皮遞送系統(tǒng)的形式施用，在整個給藥方案過程中，劑量的施用 將(當(dāng)然)是連續(xù)的而不是間歇性的。其他優(yōu)選的局部制劑包括乳膏劑、軟膏劑、洗劑、氣 霧噴霧劑和凝膠劑，其中活性成分的濃度的范圍通常將是0.01%至15% (w/w或w/v)。本發(fā)明的藥劑將通常包含溶解或分散于可藥用介質(zhì)中的有效量的治療活性成分， 包括但不限于本發(fā)明的核酸分子?？伤幱媒橘|(zhì)或載體包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包 衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。對于藥物學(xué)活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和試劑 是本領(lǐng)域熟知的。補充的活性成分也可以摻入本發(fā)明的藥劑中。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及藥物組合物。此類藥物組合物包含至少一種根據(jù)本 發(fā)明的核酸并且優(yōu)選包含可藥用媒介物。此類媒介物可以是本領(lǐng)域使用的和/或已知的任
37何媒介物或任何粘合劑。更特別地，此類粘合劑或媒介物是任何在關(guān)于本文所公開的藥劑 的制備時所論述的粘合劑或媒介物。在進(jìn)一步的實施方案中，藥物組合物包含另外的藥物 學(xué)活性試劑。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道藥劑和藥物組合物的制備。通常，此類組 合物可以制備成注射劑(作為液體溶液或懸浮液)；制備成適合于在注射前溶解或懸浮于 液體中的固體形式；制備成用于口服施用的片劑或其他固體劑；制備成定時釋放膠囊；或 制備成當(dāng)前使用的任何其他形式，包括滴眼劑、乳膏劑、洗劑、油膏劑、吸入劑等。由外科醫(yī) 生、內(nèi)科醫(yī)生或衛(wèi)生保健工作者使用無菌制劑(例如基于鹽水的洗液)來處理手術(shù)區(qū)中的 特殊區(qū)域也是特別有用的。組合物也可以通過微型裝置、微顆?；蚝＞d遞送。在配制后，藥劑將以與劑量制劑相容的方式并以藥理學(xué)有效的量施用。制劑容易 地以各種劑型，例如上述的可注射溶液的類型進(jìn)行施用，但是也可以采用藥物釋放膠囊等。在這個背景中，待施用的活性成分的量和組合物的體積取決于待治療的個體或受 試者。對于施用而言所必需的活性化合物的具體量取決于從業(yè)者的判斷，并且對于每個個 體是特殊的。通常利用對于分散活性化合物而言所必需的最小體積的藥劑。合適的施用方案也 是可變的，但是典型的是最初施用所述化合物并監(jiān)測結(jié)果，然后以進(jìn)一步的時間間隔提供 進(jìn)一步的受控劑量。例如，對于以片劑或膠囊(例如明膠膠囊)形式的口服施用，活性藥物成分即本發(fā) 明的核酸分子和/或任何另外的藥物學(xué)活性試劑(在本文中也稱為治療劑或活性化合物) 可以與口服的、無毒的、可藥用的惰性載體例如乙醇、甘油、水等相組合。而且，當(dāng)期望或需 要時，也可以將合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入混合物中。合適的粘合劑包括 淀粉，硅酸鎂鋁，淀粉菜，明膠，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，天然 糖類例如葡萄糖或0 “乳糖，玉米增甜劑，天然和合成的樹膠例如阿拉伯膠、黃蓍膠或藻酸 鈉，聚乙二醇，蠟等。在這些劑型中使用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸 鈉、乙酸鈉、氯化鈉、二氧化硅、滑石、硬脂酸、它的鎂鹽或鈣鹽和/或聚乙二醇等。崩解劑包 括但不限于，淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽、或泡騰混 合物等。稀釋劑包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纖維素和/或甘氨酸。本發(fā)明的藥劑還可以以諸如定時釋放和持續(xù)釋放片劑或膠囊、丸劑、粉劑、顆粒 劑、酏劑、酊劑、混懸劑、糖漿劑和乳劑的口服劑型來進(jìn)行施用。有利地由脂肪乳濁液或懸浮 液制備栓劑。藥物組合物或藥劑可以是經(jīng)滅菌的和/或含有佐劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑 或乳化劑、溶液促進(jìn)劑(solution promoter)、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑。另外，它 們還可以包含其他在治療上有價值的物質(zhì)。組合物根據(jù)傳統(tǒng)的混合、?；虬卜椒▉碇?備，并且通常含有約0. 至75%，優(yōu)選約至50%的活性成分。液體的(特別是可注射的)組合物可以例如通過溶解、分散等來制備。將活性化 合物溶解于在藥物學(xué)上純的溶劑(例如水、鹽水、含水右旋糖、甘油、乙醇等)中或與之混合 從而形成可注射的溶液或懸浮液。另外，可以配制適合于在注射前溶解于液體中的固體形 式。對于固體組合物，賦形劑包括藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。還可以用例如聚亞烷基二醇如丙二醇作為載體將上文 限定的活性化合物配制成栓劑。在一些實施方案中，栓劑有利地由脂肪乳濁液或懸浮液制 備。各自地，本發(fā)明的藥劑和核酸分子也可以以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)例如小單層囊泡、大 單層囊泡和多層囊泡的形式施用。脂質(zhì)體可以由各種磷脂(包含膽固醇、硬脂胺或磷脂酰 膽堿)組成。在一些實施方案中，將脂質(zhì)成分的薄膜與藥物水溶液水合以形成包囊該藥物 的脂質(zhì)層，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可以作為用本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建的與親脂化 合物或非免疫原性高分子量化合物的復(fù)合物來提供本文所描述的核酸分子。另外，脂質(zhì)體 可以在它們的表面上攜帶有此類核酸分子，以便用于靶向和在內(nèi)部攜帶細(xì)胞毒性試劑來介 導(dǎo)細(xì)胞殺死。核酸相關(guān)的復(fù)合物的實例在美國專利號6，011，020中提供。各自地，本發(fā)明的藥劑和核酸分子也可以與作為可靶向的藥物載體的可溶聚合物 相偶聯(lián)。此類聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基-甲基丙烯酰胺-苯 酚、聚羥乙基天冬酰胺苯酚(polyhydroxyethylaspanamid印henol)或聚環(huán)氧乙烷聚賴氨 酸，其用棕櫚酰殘基取代。此外，各自地，本發(fā)明的藥劑和核酸分子可以偶聯(lián)至一類可用于 實現(xiàn)藥物的受控釋放的可生物降解的聚合物，例如聚乳酸、聚￡ “己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚 原酸酯、聚縮醛類、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯類以及水凝膠的交聯(lián)或兩親性的嵌段共聚 物。需要時，各自待施用的藥物組合物和藥劑還可以含有較少量的非毒性輔助物質(zhì)， 例如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖劑以及其他物質(zhì)例如乙酸鈉和三乙醇胺油酸酯。各自使用本發(fā)明的核酸分子和藥劑的給藥方案可以根據(jù)多種因素進(jìn)行選擇，包括 患者的類型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)學(xué)狀況；待治療的病狀的嚴(yán)重度；施用途徑；患者 的腎和肝的功能；以及所采用的具體適體或其鹽。普通醫(yī)師或獸醫(yī)能夠容易地確定和規(guī)定 對于預(yù)防、對抗或阻止病狀進(jìn)展而言所需的藥物的有效量。在治療本文所公開的任何疾病中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的有效血漿水平的范圍優(yōu)選 為 500fM 至 500 u M。各自地，本發(fā)明的核酸分子和藥劑可優(yōu)選地以單次日劑量、每兩天或每三天、每 周、每兩周、以單次月劑量或者每三個月進(jìn)行施用。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本文所描述的藥劑組成了本文所公開的藥物組合物。在另外的方面，本發(fā)明涉及用于治療需要這種治療的受試者的方法，由此該方法 包括施用藥物學(xué)活性量的至少一種根據(jù)本發(fā)明的核酸。在一個實施方案中，受試者患有疾 病或處于發(fā)展出該疾病的風(fēng)險中，由此該疾病是任何本文所公開的那些，特別是在關(guān)于任 何根據(jù)本發(fā)明的核酸用于制備藥劑的用途時所公開的那些疾病中的任何一種。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的核酸以及拮抗劑不僅可用作藥劑或用于制備藥劑，而且 還可用于美容目的，特別是與MCP-1參與發(fā)炎的區(qū)域性皮膚損害有關(guān)的美容目的。因此，根 據(jù)本發(fā)明的核酸、藥劑和/或藥物組合物可用于治療或預(yù)防的其他病狀或疾病是發(fā)炎的區(qū) 域性皮膚損害。如本文優(yōu)選使用的，診斷或診斷劑或診斷工具適合于直接或間接地檢測MCP-1，優(yōu) 選如本文所描述的MCP-1，和更優(yōu)選如本文在關(guān)于本文所描述的各種病癥和疾病時所描述 的MCP-1。然而，就根據(jù)本發(fā)明的核酸分子也結(jié)合MCP-2、MCP-3、MCP-4和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子中的任何、一些或所有來說，此類核酸分子還可以分別用于診斷致病機理直接或間 接地與MCP-2、MCP-3、MCP-4和/或嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的過表達(dá)或過度活性相關(guān)或相關(guān) 聯(lián)的疾病和病癥。該診斷適合于檢測和/或隨訪任何各自在本文中所描述的病癥和疾病。 此類檢測通過根據(jù)本發(fā)明的核酸與MCP-I的結(jié)合而成為可能?？梢灾苯踊蜷g接地檢測這種 結(jié)合。相應(yīng)的方法和工具是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。尤其是，根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包含 標(biāo)記，所述標(biāo)記使得能夠檢測根據(jù)本發(fā)明的核酸，優(yōu)選結(jié)合至MCP-I的核酸。此類標(biāo)記優(yōu)選 選自放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記和熒光標(biāo)記。原則上，所有已知的對于抗體而開發(fā)的測定法都可 用于根據(jù)本發(fā)明的核酸，但是將靶結(jié)合性抗體替換成了靶結(jié)合性核酸。在使用未標(biāo)記的靶 結(jié)合性抗體的抗體_測定法中，檢測優(yōu)選通過二抗來進(jìn)行，所述二抗用放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記 和熒光標(biāo)記進(jìn)行修飾并且在其Fc-片段處結(jié)合該靶結(jié)合性抗體。在核酸，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明 的核酸的情形中，核酸用這樣的標(biāo)記進(jìn)行修飾，其中優(yōu)選地，這種標(biāo)記選自生物素、Cy-3和 Cy-5，并且這種標(biāo)記通過針對此類標(biāo)記的抗體例如抗生物素抗體、抗Cy3抗體或抗Cy5抗體 進(jìn)行檢測，或者在標(biāo)記是生物素的情況下，該標(biāo)記通過天然結(jié)合生物素的鏈霉抗生物素蛋 白或抗生物素蛋白進(jìn)行檢測。繼而，將此類抗體、鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白優(yōu)選地 用相應(yīng)的標(biāo)記例如放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記進(jìn)行修飾(如同二抗一樣)。在另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子通過第二種檢測工具進(jìn)行檢測或分 析，其中所述檢測工具是分子信標(biāo)。分子信標(biāo)的方法學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。簡而言 之，核酸探針(其也稱為分子信標(biāo))是待檢測的核酸樣品的反向互補序列并因而能夠與待 檢測的核酸樣品的部分雜交。在結(jié)合至核酸樣品后，分子信標(biāo)的熒光基團分開，這導(dǎo)致熒光 信號的變化，優(yōu)選為強度的變化。這種變化與存在的核酸樣品的量相關(guān)。應(yīng)認(rèn)識到，用根據(jù)本發(fā)明的核酸來檢測MCP-I將特別使得能夠檢測如本文所定義 的 MCP-I。關(guān)于MCP-I的檢測，優(yōu)選的方法包括下列步驟(a)提供樣品，其待就MCP-I的存在進(jìn)行檢測，(b)提供根據(jù)本發(fā)明的核酸，(c)讓所述樣品與所述核酸反應(yīng)，優(yōu)選在反應(yīng)容器中進(jìn)行反應(yīng)，由此步驟(a)可以在步驟(b)之前進(jìn)行，或者步驟(b)可以在步驟(a)之前進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供了另外的步驟d)，其在于檢測樣品與核酸的反應(yīng)。 優(yōu)選地，將步驟b)的核酸固定至表面。該表面可以是反應(yīng)容器例如反應(yīng)管、平板上的孔的 表面，或者可以是包含于該反應(yīng)容器中的裝置(例如珠)的表面。將核酸固定至該表面可 以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段來完成，包括但不限于非共價或共價連接。優(yōu)選地， 通過在表面和核酸之間的共價化學(xué)鍵來建立連接。然而，同樣也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，將核 酸間接地固定至表面，由此這種間接固定涉及使用另外的組分或一對相互作用配偶體。這 種另外的組分優(yōu)選為與待固定的核酸特異性地相互作用的化合物(其也稱為相互作用配 偶體)，并因而介導(dǎo)核酸附著至該表面。相互作用配偶體優(yōu)選選自核酸、多肽、蛋白質(zhì)和抗 體。優(yōu)選地，相互作用配偶體為抗體，更優(yōu)選為單克隆抗體。備選地，相互作用配偶體為核 酸，優(yōu)選為功能性核酸。更優(yōu)選地，此類功能性核酸選自適體、鏡像異構(gòu)體和至少與該核酸 部分互補的核酸。在另外的備選的實施方案中，核酸與表面的結(jié)合由多分體相互作用配偶 體(multi-partite interaction partner)介導(dǎo)。這種多分體相互作用配偶體優(yōu)選為由第一個成員和第二個成員組成的一對相互作用配偶體或一個相互作用配偶體，由此第一個成 員包含在該核酸中或與其連接，而第二個成員連接至該表面或包含在該表面內(nèi)。多分體相 互作用配偶體優(yōu)選選自包括生物素和抗生物素蛋白、生物素和鏈霉抗生物素蛋白、以及生 物素和中性親和素(neutravidin)的相互作用配偶體對。優(yōu)選地，該相互作用配偶體對的 第一個成員是生物素。該方法的優(yōu)選的結(jié)果是形成了 MCP-1和所述核酸的經(jīng)固定的復(fù)合物，由此更優(yōu)選 地，檢測到所述復(fù)合物。在實施方案范圍內(nèi)的是，從該復(fù)合物中檢測出MCP-1。符合這一需要的相應(yīng)的檢測工具是例如任何對于MCP-1的那個/那些部分特異的 檢測工具。特別優(yōu)選的檢測工具是選自核酸、多肽、蛋白質(zhì)和抗體的檢測工具，所述檢測工 具的產(chǎn)生是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述用于檢測MCP-1的方法還包括將樣品從已經(jīng)優(yōu)選地用于實施步驟c)的反應(yīng) 容器中移除。在另外的實施方案中，所述方法還包括將MCP-1的相互作用配偶體固定在表面 (優(yōu)選如上定義的表面)上的步驟，由此該相互作用配偶體是如本文中定義的，和優(yōu)選如上 面在關(guān)于相應(yīng)的方法時所定義的，并且更優(yōu)選在它們的各種實施方案中包括核酸、多肽、蛋 白質(zhì)和抗體。在這個實施方案中，特別優(yōu)選的檢測工具是根據(jù)本發(fā)明的核酸，由此此類核酸 可優(yōu)選為經(jīng)標(biāo)記的或未標(biāo)記的。在此類核酸為經(jīng)標(biāo)記的情況下，它可以直接或間接地被檢 測。這種檢測也可以涉及第二種檢測工具的使用，所述第二種檢測工具也優(yōu)選選自核酸、多 肽、蛋白質(zhì)和在本文所描述的各種實施方案中的具體形式。此類檢測工具優(yōu)選為對于根據(jù) 本發(fā)明的核酸是特異性的。在更優(yōu)選的實施方案中，第二種檢測工具是分子信標(biāo)。在優(yōu)選 的實施方案中，所述核酸或所述第二種檢測工具或兩者可以包含檢測標(biāo)記。所述檢測標(biāo)記 優(yōu)選選自生物素、溴脫氧尿苷標(biāo)記、洋地黃毒苷標(biāo)記、熒光標(biāo)記、UV-標(biāo)記、放射性標(biāo)記和螯 合劑分子。備選地，所述第二種檢測工具與優(yōu)選由該核酸所含有、由該核酸所包含或附著至 該核酸的檢測標(biāo)記相互作用。特別優(yōu)選的組合如下檢測標(biāo)記是生物素而第二種檢測工具是針對生物素的抗體，或其中檢測標(biāo)記是生物素而第二種檢測工具是抗生物素蛋白或攜帶抗生物素蛋白的分 子，或其中檢測標(biāo)記是生物素而第二種檢測工具是鏈霉抗生物素蛋白或攜帶鏈霉抗生物素 蛋白的分子，或其中檢測標(biāo)記是生物素而第二種檢測工具是中性鏈霉抗生物素蛋白或攜帶中性鏈霉 抗生物素蛋白的分子，或者其中檢測標(biāo)記是溴脫氧尿苷而第二種檢測工具是針對溴脫氧尿苷的抗體，或其中檢測標(biāo)記是洋地黃毒苷而第二種檢測工具是針對洋地黃毒苷的抗體，或其中檢測標(biāo)記是螯合劑而第二種檢測工具是放射性核素，由此所述檢測標(biāo)記優(yōu)選附著 至所述核酸。將公認(rèn)的是，這種類型的組合也可以應(yīng)用于其中核酸附著至表面的實施方案。 在這種實施方案中，檢測標(biāo)記優(yōu)選附著至相互作用配偶體。最后，同樣也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，用第三種檢測工具檢測第二種檢測工具，優(yōu) 選地，第三種檢測工具是酶，更優(yōu)選地為在檢測第二種檢測工具時顯示出酶促反應(yīng)的酶，或 者第三種檢測工具是用于檢測輻射(更優(yōu)選地，由放射性核素發(fā)射的輻射)的工具。優(yōu)選地，第三種檢測工具特異性地檢測第二種檢測工具和/或與第二種檢測工具相互作用。此外，在將MCP-1的相互作用配偶體固定在表面上并將根據(jù)本發(fā)明的核酸優(yōu)選加 入至在相互作用配偶體和MCP-1之間形成的復(fù)合物中的實施方案之中，可以將樣品從反應(yīng) 體系中移除，更優(yōu)選地從在其中進(jìn)行步驟c)和/或d)的反應(yīng)容器中移除。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸包含熒光部分，并且由此該熒光部分的熒 光在所述核酸與MCP-1之間形成復(fù)合物和在所述核酸與游離的MCP-1之間形成復(fù)合物時是 不同的。在另外的實施方案中，所述核酸是根據(jù)本發(fā)明的核酸的衍生物，由此所述核酸的 衍生物包含至少一種腺苷的熒光衍生物以替換腺苷。在優(yōu)選的實施方案中，所述腺苷的熒 光衍生物是亞乙烯基腺苷。在另外的實施方案中，利用熒光來檢測由根據(jù)本發(fā)明的核酸的衍生物和MCP-1組 成的復(fù)合物。在所述方法的一個實施方案中，信號在步驟(c)或步驟(d)中產(chǎn)生，并且優(yōu)選地， 所述信號與樣品中MCP-1的濃度相關(guān)。在一個優(yōu)選的方面，所述測定法可以在96孔板中進(jìn)行，其中將成分固定在如上描 述的反應(yīng)容器中并且將孔用作反應(yīng)容器。本領(lǐng)域技術(shù)人員將公認(rèn)，至少就根據(jù)本發(fā)明的核酸也結(jié)合至MCP-2、MCP-3、MCP-4 和/或嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子或與之結(jié)合來說，上文中所描述的內(nèi)容也適用于MCP-2、 MCP-3、MCP-4和/或嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，如本文所公開的用于檢測樣品中的MCP-1的方法還可以 作為用于診斷疾病例如如本文更詳細(xì)地描述的慢性疾病和慢性病癥的方法應(yīng)用。本發(fā)明的核酸可以進(jìn)一步用作用于藥物設(shè)計的起始材料。主要存在兩種可能的方 法。一種方法是篩選化合物文庫，而此類化合物文庫優(yōu)選為低分子量化合物文庫。在一個實 施方案中，所述篩選是高通量篩選。優(yōu)選地，高通量篩選是在基于靶的測定法中對化合物進(jìn) 行快速且有效的試錯法(trial-and-error)評估。該分析最好是通過比色測量法來進(jìn)行。 與之相關(guān)使用的文庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。備選地，根據(jù)本發(fā)明的核酸可用于藥物的合理設(shè)計。優(yōu)選地，合理藥物設(shè)計是設(shè)計 藥物學(xué)先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。從靶的三維結(jié)構(gòu)開始，用計算機程序把包含許多不同化合物的結(jié)構(gòu)的數(shù) 據(jù)庫搜索一遍，所述三維結(jié)構(gòu)通常通過諸如X射線晶體學(xué)或核磁共振光譜學(xué)之類的方法來 確定。該選擇通過計算機來完成，隨后可在實驗室中測試所確定的化合物。合理藥物設(shè)計可以從任何根據(jù)本發(fā)明的核酸開始，并涉及與本發(fā)明核酸的結(jié)構(gòu)相 似的或與本發(fā)明核酸的結(jié)構(gòu)中的介導(dǎo)結(jié)合的部分相同的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選三維結(jié)構(gòu)。在任何情況 下，此類結(jié)構(gòu)仍然顯示出與本發(fā)明的核酸相同或相似的結(jié)合特征。在合理藥物設(shè)計中的進(jìn) 一步的步驟中或作為備選的步驟，優(yōu)選地用不同于核苷酸和核酸的化學(xué)基團來模擬結(jié)合至 神經(jīng)遞質(zhì)的所述核酸的那些部分的三維結(jié)構(gòu)。通過這種模擬，可以設(shè)計出不同于所述核酸 的化合物。此類化合物優(yōu)選為小分子或肽。在例如通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的競爭性測定法來篩選化合物文庫的情況 下，可以發(fā)現(xiàn)合適的MCP-1類似物、MCP-1激動劑或MCP-1拮抗劑。這種競爭性測定法可以 如下建立。將本發(fā)明的核酸，優(yōu)選作為結(jié)合靶的L-核酸的鏡像異構(gòu)體偶聯(lián)至固相。為了鑒定MCP-1類似物，可以將經(jīng)標(biāo)記的MCP-1加入至該測定法。潛在的類似物將與MCP-1分子 競爭結(jié)合該鏡像異構(gòu)體，這將伴隨有通過相應(yīng)標(biāo)記獲得的信號的減少。篩選激動劑或拮抗 劑可以涉及使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞培養(yǎng)測定法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以包含至少一種或幾種本發(fā)明的核酸。另外，試劑盒可以 包含至少一種或幾種陽性或陰性對照。陽性對照可以例如是MCP-1，特別是針對其來選擇本 發(fā)明核酸或本發(fā)明核酸與其結(jié)合的MCP-1，優(yōu)選以液體形式。陰性對照可以例如是根據(jù)類似 于MCP-1的生物物理學(xué)性質(zhì)而限定的肽，但是其不會被本發(fā)明的核酸所識別。此外，所述試 劑盒可以包含一種或幾種緩沖液。各種成分可以以干燥或凍干的形式，或者以溶解于液體 中的形式包含在試劑盒中。試劑盒可以包括一個或幾個容器，所述容器繼而可以包含一種 或幾種該試劑盒的成分。在另外的實施方案中，試劑盒包括說明書或說明書散頁，其將有關(guān) 如何使用試劑盒及其各種成分的信息提供給使用者。應(yīng)當(dāng)理解這類試劑盒同樣并且特別適 合于診斷和檢測如本文所描述的慢性疾病和慢性病癥。根據(jù)本發(fā)明的核酸的藥物學(xué)和生物分析測定主要用于評估它在幾種人體和非人 體的體液、組織和器官中的藥物動力學(xué)和生物動力學(xué)特性。為這個目的，可以使用任何本文 所公開的和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的檢測方法。在本發(fā)明的另外的方面，提供了用于檢測根 據(jù)本發(fā)明的核酸的夾心雜交測定法。在該檢測測定法中，使用了捕獲探針和檢測探針。捕 獲探針與根據(jù)本發(fā)明的核酸的第一個部分互補，而檢測探針與根據(jù)本發(fā)明的核酸的第二個 部分互補。捕獲探針和檢測探針都可以由DNA核苷酸、經(jīng)修飾的DNA核苷酸、經(jīng)修飾的RNA 核苷酸、RNA核苷酸、LNA核苷酸和/或PNA核苷酸形成。因此，捕獲探針包含與根據(jù)本發(fā)明的核酸的5’ -末端互補的序列段，而檢測探針 包含與根據(jù)本發(fā)明的核酸的3’-末端互補的序列段。在該情況下，將捕獲探針經(jīng)由其5’-末 端固定至表面或基質(zhì)，由此該捕獲探針可以在其5’-末端處直接固定，或者經(jīng)由在其5’-末 端和表面或基質(zhì)之間的連接體進(jìn)行固定。然而，原則上，連接體可以連接至捕獲探針的每個 核苷酸。連接體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親水性連接體形成，或者由D-DNA核苷酸、經(jīng) 修飾的D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、經(jīng)修飾的D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、 L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、經(jīng)修飾的L-RNA核苷酸、經(jīng)修飾的L-DNA核苷酸和/或L-LNA 核苷酸形成。備選地，捕獲探針包含與根據(jù)本發(fā)明的核酸的3’ -末端互補的序列段，而檢測探 針包含與根據(jù)本發(fā)明的核酸的5’-末端互補的序列段。在該情況下，捕獲探針經(jīng)由其3’-末 端固定至表面或基質(zhì)，由此該捕獲探針可以在其3’-末端處直接固定，或者經(jīng)由在其3’-末 端和表面或基質(zhì)之間的連接體進(jìn)行固定。然而，原則上，連接體可以連接至與根據(jù)本發(fā)明的 核酸互補的序列段的每個核苷酸。連接體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親水性連接體形 成，或者由D-DNA核苷酸、經(jīng)修飾的D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、經(jīng)修飾的D-RNA核苷酸、 D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、經(jīng)修飾的L-RNA核苷酸、經(jīng)修飾的 L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成?？梢耘c根據(jù)本發(fā)明的核酸雜交的捕獲探針和檢測探針的核苷酸數(shù)目是可變的并 且可依賴于捕獲和/或檢測探針和/或根據(jù)本發(fā)明的核酸自身的核苷酸數(shù)目?？膳c根據(jù)本 發(fā)明的核酸雜交的捕獲探針和檢測探針的核苷酸總數(shù)目的最大值應(yīng)該是根據(jù)本發(fā)明的核 酸所包含的核苷酸數(shù)目。檢測探針和捕獲探針的核苷酸的最小數(shù)目(2至10個核苷酸)應(yīng)該使得能夠分別與根據(jù)本發(fā)明的核酸的5’ _末端或3’ _末端雜交。為了實現(xiàn)在根據(jù)本發(fā) 明的核酸和存在于所分析的樣品中的其他核酸之間的高的特異性和選擇性，捕獲探針和檢 測探針的核苷酸總數(shù)目應(yīng)該是或者最多為根據(jù)本發(fā)明的核酸所包含的核苷酸數(shù)目。此外，檢測探針優(yōu)選攜帶有如本文先前所描述的可檢測的標(biāo)記物分子或標(biāo)記。原 則上，標(biāo)記或標(biāo)記物分子可以連接至檢測探針的每個核苷酸。優(yōu)選地，標(biāo)記或標(biāo)記物位于檢 測探針的5’ -末端或3’ -末端，由此在與根據(jù)本發(fā)明的核酸互補的檢測探針內(nèi)的核苷酸和 所述標(biāo)記之間可以插入連接體。連接體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的親水性連接體形成， 或者由D-DNA核苷酸、經(jīng)修飾的D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、經(jīng)修飾的D-RNA核苷酸、D-LNA 核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、經(jīng)修飾的L-RNA核苷酸、經(jīng)修飾的L-DNA 核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。根據(jù)本發(fā)明的核酸的檢測可以如下進(jìn)行將根據(jù)本發(fā)明的核酸以其一端與捕獲探針雜交，并且以其另一端與檢測探針雜 交。然后，通過例如一個或多個洗滌步驟來移除未結(jié)合的檢測探針。隨后可以測量結(jié)合的 檢測探針的量，所述檢測探針優(yōu)選攜帶有標(biāo)記或標(biāo)記物分子，如例如在通過引用合并入本 文的W0/2008/052774中更詳細(xì)地概述的。如本文優(yōu)選使用的，術(shù)語“治療”在一個優(yōu)選的實施方案中額外地或備選地包括預(yù) 防和/或隨訪。如本文優(yōu)選使用的，如果沒有指出與此相反，術(shù)語“疾病”和“病癥”應(yīng)該以可交換 的方式使用。如本文使用的，術(shù)語“包含”優(yōu)選地?zé)o意于限制該術(shù)語前面的主題或由該術(shù)語所描 述的主題。然而，在一個備選的實施方案中，術(shù)語“包含”應(yīng)該以容納的含義理解，并因而理 解為限制了該術(shù)語前面的主題或由該術(shù)語所描述的主題。本文所使用的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子和靶分子MCP-I的各個序列標(biāo)識號、化學(xué)性
質(zhì)，其實際序列以及內(nèi)部參考號概括在下表中。


圖1顯示了結(jié)合人MCP-1的相關(guān)RNA配體的序列比對，其中指明了在一個優(yōu)選的 實施方案中以其整體對于結(jié)合人MCP-1來說不可缺少的序列基序(“1A型”)；圖2顯示了結(jié)合人MCP-1的相關(guān)RNA配體以及RNA配體180-D1-002的衍生物的 序列比對，其中指明了在一個優(yōu)選的實施方案中以其整體對于結(jié)合人MCP-1來說不可缺少 的序列基序(“1B型”)；圖3顯示了結(jié)合人MCP-1的相關(guān)RNA配體的序列比對，其中指明了在一個優(yōu)選的 實施方案中以其整體對于結(jié)合人MCP-1來說不可缺少的序列基序(“2型”)；圖4顯示了結(jié)合人MCP-1的相關(guān)RNA配體的序列比對，其中指明了在一個優(yōu)選的 實施方案中以其整體對于結(jié)合人MCP-1來說不可缺少的序列基序(“3型”)；圖5顯示了 RNA配體178-D5和181-A2 (序列基序“3型”的人MCP-1RNA配體)的 衍生物；圖6顯示了結(jié)合人MCP-1的相關(guān)RNA配體的序列比對，其中指明了在一個優(yōu)選的 實施方案中以其整體對于結(jié)合人MCP-1來說不可缺少的序列基序(“4型”)(其他序列)；圖7顯示了幾種不同的結(jié)合人MCP-1的RNA配體的序列的表格，其不能與MCP-1 結(jié)合性序列基序“ 1A型”、“ 1B型”、“2型”、“3型”或“4型”相關(guān)；圖8顯示了結(jié)合至鼠MCP-1的RNA配體188-A3-001和189-G7-001的衍生物的比 對；圖9顯示了適體D-N0X-E36與生物素化的人D-MCP-1在室溫和37°C下的結(jié)合分析 的結(jié)果，表示為隨生物素化的人D-MCP-1濃度而變化的適體結(jié)合；圖10顯示了適體D-mN0X-E36與生物素化的鼠D_MCP_1在37°C下的結(jié)合分析的結(jié) 果，表示為隨生物素化的鼠D-MCP-1濃度而變化的適體結(jié)合；圖11顯示了在THP-1細(xì)胞中MCP-1誘導(dǎo)的Ca++_釋放，其中獲得了關(guān)于人MCP-1 的劑量-反應(yīng)曲線，其中表明半數(shù)有效濃度(halfeffective concentration,EC50)為大約 3nM，表示為隨人MCP-1濃度而變化的相對于空白的熒光差異；圖12顯示了鏡像異構(gòu)體N0X-E36在鈣釋放測定法中的效力；細(xì)胞用與各種量的鏡 像異構(gòu)體N0X-E36在37°C下預(yù)孵育的3nM人MCP-1進(jìn)行刺激，表示為隨N0X-E36濃度而變 化的對照的百分比；圖13顯示了鏡像異構(gòu)體mN0X_E36在鈣釋放測定法中的效力；細(xì)胞用與各種量的 鏡像異構(gòu)體mN0X-E36在37°C下預(yù)孵育的5nM鼠MCP-1進(jìn)行刺激，表示為隨mN0X_E36濃度 而變化的對照的百分比；圖14顯示了人MCP-1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的趨化性，其中在THP-1細(xì)胞朝向各種 MCP-1濃度遷移3小時后，獲得了關(guān)于MCP-1的劑量-反應(yīng)曲線，表示為隨人MCP-1濃度而 變化的相比于對照而言的X倍增加；圖15顯示了鏡像異構(gòu)體N0X-E36在趨化性測定法中的效力；讓細(xì)胞朝向與各種 量的鏡像異構(gòu)體N0X-E36在37°C下預(yù)孵育的0. 5nM人MCP-1遷移，表示為隨鏡像異構(gòu)體 N0X-E36濃度而變化的對照的百分比；圖16顯示了鏡像異構(gòu)體mN0X_E36在趨化性測定法中的效力；讓細(xì)胞朝向與各種 量的鏡像異構(gòu)體N0X-E36在37°C下預(yù)孵育的0. 5nM鼠MCP-1遷移，表示為隨鏡像異構(gòu)體 mN0X-E36濃度而變化的對照的百分比；
圖17顯示了 Biacore 2000傳感圖(sensorgram)，其指明了鏡像異構(gòu)體N0X-E-36 與人MCP-1 (其通過胺偶聯(lián)過程固定在PioneerFl傳感器芯片上)結(jié)合的KD值，表示為隨 時間而變化的響應(yīng)(RU)；圖18顯示了 Biacore 2000傳感圖，其指明了鏡像異構(gòu)體N0X-E36與人MCP-家族 蛋白質(zhì)(huMCP-l、huMCP-2、huMCP-3)和人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(其通過胺偶聯(lián)過程分別 固定在PioneerFl和CM4傳感器芯片上)的結(jié)合，表示為隨時間而變化的響應(yīng)(RU)；圖19顯示了 Biacore 2000傳感圖，其指明了鏡像異構(gòu)體N0X-E36與來自不同物 種的 MCP-1 (犬 MCP-1、猴 MCP-1、人 MCP-1、豬 MCP-1、兔 MCP-1、小鼠 MCP-1、大鼠 MCP-1)(其 中不同形式的MCP-1通過胺偶聯(lián)過程分別固定在PioneerFl和CM4傳感器芯片上)的結(jié)合， 表示為隨時間而變化的響應(yīng)(RU)；圖20顯示了 Biacore 2000傳感圖，其指明了鏡像異構(gòu)體181-A2-018與人 MCP-1 (其通過胺偶聯(lián)過程固定在CM4傳感器芯片上)結(jié)合的KD值，表示為隨時間而變化的 響應(yīng)(RU)；圖21顯示了 Biacore 2000傳感圖，其指明了鏡像異構(gòu)體181-A2-018與人MCP-家 族蛋白質(zhì)(huMCP-l、huMCP-2、huMCP-3)和人嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(其通過胺偶聯(lián)過程分 別固定在PioneerFl和CM4傳感器芯片上)的結(jié)合，表示為隨時間而變化的響應(yīng)(RU)；圖22顯示了 Biacore 2000傳感圖，其指明了鏡像異構(gòu)體181-A2-018與來自不同 物種的 MCP-1 (犬 MCP-1、猴 MCP-1、人 MCP-1、豬 MCP-1、兔 MCP-1、小鼠 MCP-1、大鼠 MCP-1) (其中不同形式的MCP-1通過胺偶聯(lián)過程分別固定在PioneerFl和CM4傳感器芯片上)的 結(jié)合，表示為隨時間而變化的響應(yīng)(RU)；圖23顯示了來自不同哺乳動物物種的MCP-1以及人MCP-2、MCP-3和嗜酸性粒細(xì) 胞趨化因子(僅位置1-76)的Clustal ff比對；圖24A顯示了概括了 N0X-E36和181-A2-018對于來自不同哺乳動物物種的MCP-1 以及人MCP-2、MCP-3和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的結(jié)合特異性的表格；圖24B顯示了概括了通過Biacore分析測定的N0X-E36的選擇性的表格，其中生 物素化的N0X-E36固定在傳感器芯片表面上，并且分析了一組各種CC和CXC趨化因子與 N0X-E36的結(jié)合；圖24C顯示了通過Biacore分析測定的N0X-E36與趨化因子相互作用的動力學(xué)分 析，其中所述趨化因子共價固定在CM5傳感器芯片表面上并注射入各種濃度的N0X-E36，并 且用BiaEvaluation軟件來分析N0X-E36的結(jié)合行為；圖24D顯示了用MIP-1 a刺激的THP-1細(xì)胞的趨化性劑量-反應(yīng)曲線，半數(shù)有效 濃度為約0. 2nM ；圖24E顯示了 N0X-E36對于由MIP-1 a誘導(dǎo)的趨化性的抑制。N0X-E36對于由 MIP-1 a誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的趨化性沒有影響；圖25顯示了鏡像異構(gòu)體N0X-E36-3，-PEG在鈣釋放測定法中的效力；將細(xì)胞用與 各種量的鏡像異構(gòu)體N0X-E36-3，-PEG在37°C下預(yù)孵育的3nM人MCP-1進(jìn)行刺激，表示為 隨鏡像異構(gòu)體N0X-E36-3’ -PEG濃度而變化的對照的百分比；圖26顯示了鏡像異構(gòu)體N0X-E36-3，-PEG在趨化性測定法中的效力；讓細(xì)胞朝向 與各種量的鏡像異構(gòu)體N0X-E36-3，-PEG在37°C下預(yù)孵育的0. 5nM人MCP-1遷移，表示為隨N0X-E36-3，-PEG濃度而變化的對照的百分比；圖27A顯示了鏡像異構(gòu)體N0X-E36-5，-PEG在鈣釋放測定法中的效力；將細(xì)胞用與各種量的鏡像異構(gòu)體N0X-E36-5，-PEG在37°C下預(yù)孵育的3nM人MCP-I進(jìn)行刺激，表示 為隨鏡像異構(gòu)體N0X-E36-5’ -PEG濃度而變化的對照的百分比；圖27B顯示了鏡像異構(gòu)體N0X-E36-5，-PEG在趨化性測定法中的效力；讓細(xì)胞朝 向與各種量的鏡像異構(gòu)體N0X-E36-5，-PEG在37°C下預(yù)孵育的0. 5nM人MCP-I遷移，表示 為隨鏡像異構(gòu)體N0X-E36-5’ -PEG濃度而變化的對照的百分比；圖28顯示了在THP-I細(xì)胞中由鼠MCP-1誘導(dǎo)的Ca++-釋放，其中獲得了關(guān)于鼠 MCP-I的劑量-反應(yīng)曲線，其中表明半數(shù)有效濃度(EC50)為大約5nM，表示為隨鼠MCP-I濃 度而變化的相對于空白的熒光差異；圖29顯示了抗-鼠MCP-I的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36_3，-PEG在鈣釋放測定法中的 效力；細(xì)胞用與各種量的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3，-PEG在37°C下預(yù)孵育的3nM鼠MCP-I進(jìn) 行刺激，表示為隨鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’ -PEG濃度而變化的對照的百分比；圖30顯示了鼠MCP-I誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的趨化性，其中在THP-1細(xì)胞朝向各種 mMCP-1濃度遷移3小時后，獲得了關(guān)于mMCP-1的劑量-反應(yīng)曲線，表示為隨鼠MCP-I濃度 而變化的相比于對照而言的X倍增加；圖31顯示了抗_鼠MCP-I的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36_3，-PEG在趨化性測定法中的 效力；讓細(xì)胞朝向與各種量的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3，-PEG在37°C下預(yù)孵育的0. 5nM鼠 MCP-I遷移，表示為隨抗-鼠的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’-PEG濃度而變化的對照的百分比；圖 32 顯示了 Biacore 2000 傳感圖(sensorgram)，其指明 了適體 D-mN0X_E36 與 鼠D-MCP-I (其通過胺偶聯(lián)過程固定在PioneerFl傳感器芯片上)結(jié)合的KD值，表示為隨 時間而變化的響應(yīng)(RU)；圖33顯示了 Biacore 2000傳感圖，其指明了適體D-mN0X_E36與人D-MCP-1和鼠 D-MCP-I (其中所述兩種不同形式的D-MCP-I通過胺偶聯(lián)過程分別固定在PioneerFl和CM4 傳感器芯片上)的結(jié)合，表示為隨時間而變化的響應(yīng)(RU)；圖34顯示了 24周齡的MRLlpr/lpr小鼠的腎臟切片，其如所示的用過碘酸-希 夫(PAS)、Mac-2(巨噬細(xì)胞)的抗體和CD3(T細(xì)胞)的抗體進(jìn)行染色；所述圖像是每 個組中7-12只小鼠的代表(原始放大倍數(shù)PAS :X100，PAS插圖X400，Mac2 :X400， CD3 X 100)；圖35顯示了表格，其圖解說明了在不同組的24周齡的MRLlpr/lpr小鼠中腎功能 參數(shù)和組織學(xué)檢查結(jié)果；圖36顯示了組織學(xué)變化的定量，其通過在來自所有組的小鼠的銀染色切片上實 施的形態(tài)計量法來進(jìn)行；A，間隙體積指數(shù)(interstitialvolume index) ；B，腎小管擴張指 數(shù)(tubular dilation index)；和C，腎小管細(xì)胞損傷指數(shù)(tubular cell damage index), 被計算為高倍視野的百分比并表示成平均值士SEM;圖37顯示了通過Kaplan-Meier分析計算出的各個治療組的MRLwipir小鼠的存 活；圖38顯示了 CC-趨化因子CCL2和CCL5的腎mRNA表達(dá)，其通過使用從每個組的5 只小鼠中匯集的總腎RNA經(jīng)實時RT-PCR來測定，其中每組小鼠的RNA水平按照各自的18SrRNA表達(dá)來表示；圖39顯示了通過用mN0X-E36-3，PEG進(jìn)行治療引起肺病理學(xué)減少；從24周齡的 所有組中制備肺組織，并半定量地進(jìn)行評分；用mN0X-E36和mN0X-E36-3’ PEG進(jìn)行治療減 少了 MRLWlIff小鼠中的細(xì)支氣管周炎癥；所述圖像是每個組中7-11只小鼠的代表；原始放 大倍數(shù)X 100 ；圖40顯示了 24周齡的MRLlp"lpir小鼠的皮膚狼瘡表現(xiàn)，其通常出現(xiàn)在面部或頸部 區(qū)域(左邊的小鼠)，其在用抗_mCCL2鏡像異構(gòu)體治療的小鼠(右邊的小鼠)中較少發(fā)生；圖41顯示了在24周齡的MRLWlpr小鼠中血清和組織學(xué)檢查結(jié)果；圖42顯示了在該研究過程中在血漿中PEG化的和未PEG化的抗_mCCL2鏡像異構(gòu) 體的藥物動力學(xué)，表示為作為時間的函數(shù)的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36的血漿濃度；圖43顯示了在24周齡的用媒介物治療的或用mN0X-E36_3，PEG-治療的MRLlp〃lpir 小鼠中在骨髓和外周血中的CCR2的流式細(xì)胞術(shù)；數(shù)據(jù)顯示為在每個組的5只小鼠中，在骨 髓或外周血中CCR2陽性細(xì)胞的平均百分比士SEM ；圖 44 顯示 了在用 PoC-PEG 治療的(白色柱)和用 mN0X-E36_3，PEG (mN0X-E36_P) 治療的(黑色柱)IK db/db小鼠中的血清CCL2水平，其在所示的不同時間點通過ELISA來 測定；數(shù)據(jù)是平均值 士SEM ；*，p < 0. 05, mN0X-E36-3' PEG (mN0X-E36-P)對 PoC-PEG ；圖45顯示了在未治療的或者用P0C-PEG或確切地說mN0X-E36_3，PEG治療的db/ db小鼠的腎小球和間質(zhì)中，Mac-2和Ki-67陽性細(xì)胞的浸潤的數(shù)目；圖46顯示了在6個月大的db/db小鼠中的糖尿病性腎小球硬化；將來自不同組 的小鼠的腎切片用過碘酸-希夫進(jìn)行染色，并對來自每個腎切片的15個腎小球就糖尿病性 腎小球硬化的程度進(jìn)行評分；所述圖像顯示了分級至所示的各自得分的代表性腎小球，原 始放大倍數(shù)為400X ；所述解說明了每個組(n = 7-10)中所有小鼠的每個得分的平均 百分比 士SEM ；*，p < 0. 05，用 mN0X-E36-3，PEG(mN0X-E36_P)治療的 IK db/db 小鼠對用 PoC-PEG (PoC-P)治療的 IK db/db 小鼠；圖47顯示了在6個月大的用mN0X-E36-3，PEG (mN0X-E36-P)治療的和用 PoC-PEG (PoC-P)治療的IK db/db小鼠中的腎小球濾過率(GFR)；在所述研究的末期，在用 PoC-PEG治療的和用mN0X-E36-3，PEG治療的IK db/db小鼠中，通過FITC-菊粉清除動力 學(xué)來測定GFR ；圖48顯示了 6個月大的db/db小鼠的腎小管萎縮和間隙體積；銀染色的腎切片 的圖像圖解說明了來自各個組的代表性腎臟(原始放大倍數(shù)為100X)；值表示每個組中的 7-10只小鼠的各自形態(tài)計量分析指數(shù)的平均值士SEM ；*,p< 0. 05, 2K db/db對BKS野生型 小鼠；#，p < 0. 05，1K 對 2K db/db 小鼠；卞，p < 0. 05，用 mN0X-E36_3，PEG(mN0X-E36_PEG) 治療的IK db/db小鼠對用PoC-PEG治療的lKdb/db小鼠；圖49顯示了 db/db小鼠的腎CCL2mRNA表達(dá)，其通過使用從每個組的6_10只小鼠 中匯集的總腎RNA經(jīng)實時RT-PCR來測定；每組小鼠的mRNA水平按照各自的18S rRNA表達(dá) 來表示；禾口圖50顯示了如通過免疫染色所測定的在db/db小鼠腎臟中的空間CCL2表達(dá)；所 述圖像圖解說明了來自所示各個組的6個月大的小鼠的腎臟的代表性切片(原始放大倍 數(shù)，200X)。
67
圖 51A-E 顯示在用媒介物、revmN0X-E36-3' -PEG、mN0X-E36_3，-PEG、CYC 低、CYC 高、CYC 低 +mN0X-E36-3，-PEG 或 MMF 處理 MRLlpr/lpr 小鼠后，MRLlpr/lpr 小鼠中的狼瘡 腎炎標(biāo)記物，由此如由Austin等人(Austin等人1984)所述在PAS染色的腎切片上測定關(guān) 于DPLN的活性指數(shù)(圖51A)和慢性指數(shù)(圖51B)；并且由此測定在24周大的MRLlpr/ lpr小鼠的腎切片中的腎小球巨噬細(xì)胞的平均數(shù)目(圖51C) (15個腎小球中的Mac2+細(xì)胞 /切片)，分別在24周大的MRLlpr/lpr小鼠的腎切片中的間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)目(圖51D)或 T細(xì)胞數(shù)目(圖51E)(15個高倍視野中的Mac2+或⑶3+細(xì)胞/切片)；圖52顯示來自24周大MRLlpr/lpr小鼠的過碘酸-希夫染色的肺切片的肺損傷 的半定量評分；圖53A顯示在LPS攻擊后24小時在BAL液體中的總細(xì)胞數(shù)目(xlO6/動物；平均 值士SEM ；與陽性對照組相比較，*p < 0. 05, **p < 0. 01)，由此動物在LPS攻擊前用媒介物 (陽性對照)、地塞米松、羅氟司特或結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’ -PEG或在清潔 空氣攻擊前用媒介物(陰性對照)進(jìn)行處理；圖53B顯示在LPS攻擊后24小時在BAL液體中的嗜中性白細(xì)胞的絕對數(shù)目(平 均值士SEM ；與陽性對照組相比較，**p < 0. 01)，由此動物在LPS攻擊前用媒介物(陽性對 照)、地塞米松、羅氟司特或結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’-PEG或在清潔空氣攻擊 前用媒介物(陰性對照)進(jìn)行處理；圖54A顯示健康動物或在用MCT/媒介物或MCT/結(jié)合MCP-1的鏡像 mN0X-E36-3’ -PEG處理后動物的右側(cè)心臟肥大；由此讀數(shù)是右心室重量至左心室加上隔膜 重量 RV/(LV+S)；圖54B顯示健康動物或在用MCT/媒介物或MCT/結(jié)合MCP-1的鏡像 mN0X-E36-3，-PEG處理后動物的右心室收縮壓(RSVP [mmHg])。實施例1 結(jié)合人MCP-1的核酸使用生物素化的人D-MCP-1作為靶，可以產(chǎn)生幾種結(jié)合人MCP-1的核酸，該核酸的 核苷酸序列在圖1至7中描繪。這些核酸如下進(jìn)行表征采用使用生物素化的人D-MCP-1 的競爭性或直接pull-down測定法在適體(即D-核酸)水平上進(jìn)行表征(實施例4)，或者 通過使用Biacore 2000裝置進(jìn)行的表面等離子體共振測量法(實施例7)、體外細(xì)胞培養(yǎng)物 Ca++-釋放測定法(實施例5)或體外趨化性測定法(實施例6)在鏡像異構(gòu)體水平(即具 有天然構(gòu)型的MCP-1 (L-MCP)的L-核酸)上進(jìn)行表征。如此產(chǎn)生的核酸分子顯示出不同的序列基序，四種主要的類型在圖1和圖 2(1A/1B型)、圖3(2型)、圖4和圖5(3型)以及圖6 (4型)中定義。另外的不能相互相關(guān) 并且不能與本文所描述的不同序列基序相關(guān)的結(jié)合MCP-1的核酸在圖7中列出。對于核苷 酸序列基序的定義，使用了 IUPAC縮寫以用于不確定的核苷酸S強G或C
W弱A或U
R嘌呤G或A
Y嘧啶C或U
K酮基G或U
M亞氨基A或C
B 非 A C 或^G;D 非 C A 或G 或U;H 非 G A 或C 或U;V 非 U A 或C 或G;N全部 A或G或C或U。如果未指明與此相反，則任何核酸序列或者序列段和盒的序列都分別以5’_ > 3’ 的方向顯示。IA型結(jié)合MCP-I的核酸(圖1)如在圖1中所描繪的，所有IA型的結(jié)合MCP-I的核酸的序列都包含幾個序列段或 盒，由此盒[Β Α|和|BIB丨.是可以相互雜交的5’ -和3’ -末端序列段。然而，在該分子中
并非一定給出這種雜交，如在生理條件下實際存在的。盒M、B3、B4、_:和盒B6的側(cè)翼為
盒_和盒_。采用使用生物素化的人D-MCP-I的直接和競爭性pull-down測定法，在適體水 平上表征這些核酸，以便根據(jù)它們的結(jié)合行為對它們進(jìn)行分級(實施例4)。將選擇出的 序列合成為鏡像異構(gòu)體(實施例3)，并使用天然構(gòu)型的MCP-I (L-MCP)在體外細(xì)胞培養(yǎng)物 Ca++-釋放測定法中進(jìn)行測試(實施例5)。所定義的盒的序列在IA型的結(jié)合MCP-I的核酸之間可能不同，這影響了對MCP-I 的結(jié)合親和力。基于對被概括為IA型結(jié)合MCP-I的核酸的不同的結(jié)合MCP-I的核酸所進(jìn)
行的結(jié)合分析，如下描述的盒|B1A|、M、B3、B4、運g、B6和！BlB丨以及它們的核苷酸序列獨
個地和更優(yōu)選地以其整體對于結(jié)合MCP-I來說是必需的·盒[Β Α I:和運111是可以相互雜交的5’ -和3’ -末端序列段；其中|BIA丨是
X^rug 丨,優(yōu)選 IX^cgugI;并且其中掃 ib|.是 I^ygcuI，優(yōu)選 |5acgcu|;·盒型，其是 CCCGGff,優(yōu)選 CCCGGU ； 盒B3，其是⑶R，優(yōu)選GUG ；
盒 B4，其是 RYA，優(yōu)選 GUA ；·盒 g5~1,其是 Igggggrcgcgayc |，優(yōu)選 GGGGGGCGCGACCl； 盒 B6，其是 UGCAAUAAUG 或 URYAWUUG，優(yōu)選 UACAUUUG ；如在圖1中所描繪的，稱為176-ElOtrc的核酸分子具有最好的對MCP-I的結(jié)合 親和力(在pull-down測定法中作為適體，Kd為5nM ；以及在體外細(xì)胞培養(yǎng)物Ca++-釋放測
定法中作為鏡像異構(gòu)體，IC50為4-5nM)，并因此可以構(gòu)成最佳序列以及序列元件|B1A|、M、
B3、B4、§§、Be和|bib|的最佳組合。IB型結(jié)合MCP-I的核酸(圖2) 如在圖2中所描繪的，所有IB型的序列都包含幾個序列段或盒，由此盒|bia丨和盒 B2,其是 CCAGCU 或 CCAGY,優(yōu)選 CCAGU ； 盒B3，其是⑶G ； 盒B4，其是AUG ；
1是可以相互雜交的5’ -和3’ -末端序列段，并且盒M、B3、B4、_:和盒B6的側(cè)翼
為盒|B1A|:和盒g(shù)ig。然而，在該分子中并非一定給出這種雜交，如在生理條件下實際存 在的。采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接和競爭性pull-down測定法，在適體水 平上表征這些核酸，以便根據(jù)它們的結(jié)合行為對它們進(jìn)行分級(實施例4)。將選擇出的 序列合成為鏡像異構(gòu)體(實施例3)，并使用天然構(gòu)型的MCP-l(L-MCP)在體外細(xì)胞培養(yǎng)物 Ca++-釋放測定法中進(jìn)行測試(實施例5)。所定義的盒的序列在1B型的結(jié)合MCP-1的核酸之間可能不同，這影響了對MCP-1 的結(jié)合親和力?；趯Ρ桓爬?B型結(jié)合MCP-1的核酸的不同的結(jié)合MCP-1的核酸所進(jìn)
行的結(jié)合分析，如下描述的盒|@、M、B3、B4、g|、B6和[BIB丨以及它們的核苷酸序列獨
個地和更優(yōu)選地以其整體對于結(jié)合MCP-1來說是必需的 盒[BIA|:和運H|，其可以相互雜交；其中IBIAI是|AGYRUG|，優(yōu)選 AGCGUGl;并且 |BIB|是 I^XYRCU 丨，優(yōu)選 tACGCUl。
盒 B6，其是 CAUUUUA 或 CAUUUA，優(yōu)選 CAUUUUA。如在圖2中所描繪的，稱為176_C9trc的核酸具有最好的對MCP-1的結(jié)合親和力 (在pull-down測定法中作為適體，Kd為5nM ；以及在體外細(xì)胞培養(yǎng)物Ca++-釋放測定法中作
為鏡像異構(gòu)體，IC50為4-5nM)，并因此可以構(gòu)成最佳序列以及序列元件|B1 A|、B2. B3、B4、
§|、B6和|B1B[的最佳組合。2型結(jié)合MCP-1的核酸(圖3)如在圖3中所描繪的，所有2型的序列都包含幾個序列段或盒，由此盒[B1A|:和采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接和競爭性pull-down測定法，在適體水 平上表征這些核酸，以便根據(jù)它們的結(jié)合行為對它們進(jìn)行分級(實施例4)。將選擇出的 序列合成為鏡像異構(gòu)體(實施例3)，并使用天然構(gòu)型的MCP-l(L-MCP)在體外細(xì)胞培養(yǎng)物 Ca++-釋放測定法(實施例5)或體外趨化性測定法(實施例6)中進(jìn)行測試。所定義的盒的序列在3型的結(jié)合MCP-1的核酸之間可能不同，這影響了對MCP-1 的結(jié)合親和力?；趯Ρ桓爬?型結(jié)合MCP-1的核酸的不同的結(jié)合MCP-1的核酸所進(jìn)行
的結(jié)合分析，如下描述的盒運1X1、墜和|B1B丨以及它們的核苷酸序列獨個地和更優(yōu)選地以
其整體對于結(jié)合MCP-1來說是必需的
盒 B5，其是 GGGGGGCGCGACC
·盒[B1A|:和運15|，其是可以相互雜交的5’ -和3’ -末端序列段；其中|BIA|.
是R^GCA丨而IBIB丨.是Iugcgu丨，或者IBI Α丨是I^GCA丨而^Ig是IUGCGI，或者 Ibia丨.是丨gcaI而Ibib丨是[[Tgcg丨或IugcI;優(yōu)選地，Ibia丨是|gca]而IbibI是 Iugc^; 念 B2,其是 CSUCCCUCACCGGUGCAA⑶GAAGCCGYGGCUC,優(yōu)詵 C⑶CCCUCACCGGUGCAA⑶ GAAGCCGUGGCUC。如在圖3中所描繪的，稱為180-D1-002的核酸以及180-D1-002的衍生物例如 180-Dl-011、180-Dl-012、180-Dl-035 和 180-D1_036( = N0X-E36)具有最好的對 MCP-1 的 結(jié)合親和力(在pull-down測定法或競爭性pull-down測定法中作為適體，Kd < InM)，并
因此可以構(gòu)成最佳序列以及序列元件@ Ι]、Β2和[BIB I的最佳組合。對于核酸分子D-N0X-E36 (D-180-D1-036 ；SEQ. ID NO. 159)，測得解離常數(shù)(Kd)在 室溫(RT)下為890士65pM而在37°C下為146士 13pM(實施例4 ；圖9)。相應(yīng)的鏡像異構(gòu)體 N0X-E36(180-Dl-036 ；SEQ. ID NO. 37)在體外Ca++-釋放測定法中顯示出3_4nM的抑制濃度 (IC50)(實施例5 ；圖12)，和在體外趨化性測定法中顯示出約0. 5nM的抑制濃度(IC50)(實 施例 6 ；圖 15)。對于 N0X-E36 的 PEG 化的衍生物 N0X-E36-3，PEG 和 N0X-E36-5，PEG,在 Ca++-釋放測定法中測定出約3nM的IC5(I(實施例5 ；圖25和圖27A)，和在趨化性測定法中 測定出< InM的IC50 (實施例6 ；圖26和圖27B)。3型結(jié)合MCP-I的核酸(圖4+5)如在圖4和圖5中所描繪的，所有3型的序列包含幾個序列段或盒，由此三對盒是 3型結(jié)合MCP-I的核酸所特征性的。盒|B1 A I和^[5]以及盒以及盒B5A和B5B 具有相互雜交的能力。然而，在該分子中并非一定給出這種雜交，如在生理條件下實際存在 的。非雜交性核苷酸位于這些可能雜交的序列元件之間，其被定義為盒B3、盒B4和盒[|^1。采用使用生物素化的人D-MCP-I的直接和競爭性pull-down測定法，在適體水平 上表征這些核酸，以便根據(jù)它們的結(jié)合行為對它們進(jìn)行分級(實施例4)。將選擇出的序列 合成為鏡像異構(gòu)體(實施例3)，并使用天然構(gòu)型的MCP-I (L-MCP)在體外趨化性測定法(實 施例6)中或通過Biacore測量法(實施例7)進(jìn)行測試。所定義的盒的序列在3型的結(jié)合MCP-I的核酸之間可能不同，這影響了對MCP-I 的結(jié)合親和力?；趯Ρ桓爬?型結(jié)合MCP-I的核酸的不同的結(jié)合MCP-I的核酸所進(jìn)行
的結(jié)合分析，如下描述的盒j5I^|、B2A> B3、B2B, B4、B5A、H@、B5B、§@以及它們的核苷
酸序列獨個地和更優(yōu)選地以其整體對于結(jié)合MCP-I來說是必需的·盒[β α丨和西II，其是可以相互雜交的5’ -和3’ -末端序列段；其中|ΒΙΑ I.是
GURCUGC I而是丨GCAGCACl;優(yōu)選地，掃IA I是丨GUGCUGC [Μ^ ΒΙ 是玩 AGCACl;或者|bia 1 是 Igksygc 丨而 Ibib 是 ^crsmcI;優(yōu)選地，[β α 1 是GUGCGC 丨而|B1B 丨是丨GCGCACl;
或者 |B1A 1 是極BBSC | 而
是丨GSVVM丨;優(yōu)選地，|B1A 1是
KKSSC 丨而 是 IGSSMM丨
或者|B1A |■是&NGC丨而|B1B丨.是|GCNV|;優(yōu)選地，|B1A |.是丨SNG^I而
].是丨GCN§|;最優(yōu)選地，^IX]是|GGGC |而|B1B丨,是 盒m和S2S，其是可以相互雜交的序列段其中B2A是GKMGU而B2B是ACKMC 優(yōu)選地，S2A是GUAGU而■是ACUAC ； 盒 B3，其是 KRRAR，優(yōu)選 UAAAA 或 GAGAA ； 盒 B4，其是 CURYGA 或 CUWAUGA 或 CWRMGACW 或 UGCCA⑶G，優(yōu)選 CAGCGACU 或 CAACGACU ； B5A和B5B，其是可以相互雜交的序列段；其中B5A是GGY而B5B是GCYR，其中 GCY可以與B5A的核苷酸雜交；或者B5A是CWGC而B5B是GCWG ；優(yōu)選地，B5A是GGC而B5B 是 GCCG ； 盒 |jg，其是或 l^j^HiJl 或 l^^^^tj優(yōu)選!m^l^l如在圖4和圖5中所描繪的，稱為178-D5的核酸及其衍生物178-D5-030以及稱為 181-A2 的核酸及其衍生物 181-A2-002、181-A2-004、181-A2-005、181-A2-006、181-A2-007、 181-A2-017、181-A2-018、181-A2-019、181-A2-020、181-A2-021 和 181-A2-023 具有最好的 對MCP-1的結(jié)合親和力。178-D5和178-D5-030在直接或競爭性pull-down測定法中作為 適體進(jìn)行評估(實施例4)，其KD為約500pM。在相同的實驗設(shè)置下，測定出181-A2的Kd 約100pM。通過Biacore分析(實施例7)，181-A2及其衍生物對于MCP-1的KD經(jīng)測定為 200-300pM。在使用培養(yǎng)細(xì)胞的Ca++釋放測定法和趨化性測定法(分別為實施例5和6)中， 測得178-D5和181-A2兩者的IC50為約500pM。因此，178-D5和181-A2以及它們的衍生物
可以構(gòu)成最佳序列以及序列元件gj^]、B2A> B3.B2B, B4、B5A,[B6^ B5B和^BIB丨的最佳組
口 O4型結(jié)合MCP-1的核酸(圖6)如在圖6中所描繪的，所有4型的序列都包含幾個序列段或盒，由此盒|B1A丨和采用使用生物素化的人D-MCP-1的直接pull-down測定法，在適體水平上表征這 些核酸，以便根據(jù)它們的結(jié)合行為對它們進(jìn)行分級(實施例4)。將選擇出的序列合成為鏡 像異構(gòu)體(實施例3)，并使用天然構(gòu)型的MCP-1 (L-MCP)在體外細(xì)胞培養(yǎng)物Ca++-釋放測定 法(實施例5)和/或趨化性測定法(實施例6)中進(jìn)行測試。所定義的盒的序列在4型的結(jié)合MCP-1的核酸中可能不同，這影響了對MCP-1的 結(jié)合親和力。基于對被概括為4型結(jié)合MCP-1的核酸的不同的結(jié)合MCP-1的核酸所進(jìn)行的
結(jié)合分析，如下描述的盒|bia|、m和[BIB丨以及它們的核苷酸序列獨個地和更優(yōu)選地以
其整體對于結(jié)合MCP-1來說是必需的
·盒|bia丨和IBIB丨，其是可以相互雜交的5’ -和3’ -末端序列段；其中j
是 |agcgug5^1 而 Ibib 1 是 Igncasg^I;或者運 Χ]是 Igcgcgag 1
而 IBIB 丨.是 IcucgcgucI;或者 |ΒΙ Α 丨.是 |5SKSUU 1 而 gig 是 1
者[Bi Al·是 I^iiJGUU I 而 是丨 GRCACl;或者 ^IXI 是 ItfGUU 丨而[BlB 丨.是 IGGCA丨；優(yōu)選地，Ibia丨是I^ksuu j而是丨GRSMS^I;最優(yōu)選的[Β Α 是 CCGCUU MBIB |.是 |5^GCGG|;以及·盒型，其是 AGNDRDGBKG⑶RGYARGUAAAG 或 AG⑶GG⑶GGUAGUAAGUAAAG 或 CAG⑶GG⑶GGUAGAAUGUAAAGA,優(yōu)選 AG⑶GG⑶GGUAGUAAGUAAAG。如在圖6中所描述的，稱為174-D4-004和166-A4-002的核酸具有最好的對MCP-I 的結(jié)合親和力(在體外細(xì)胞培養(yǎng)物Ca++釋放測定法中作為鏡像異構(gòu)體，IC5tl為2-5nM)，并
因此可以構(gòu)成最佳序列以及序列元件IsiAj、μ和|BIB I的最佳組合。另外，鑒定了 29個其他的結(jié)合MCP-I的核酸，它們不能通過已對于1_4型結(jié)合 MCP-I的核酸而顯示的核苷酸序列元件的組合來描述。這些序列在圖7中列出。應(yīng)當(dāng)理解，任何在圖1至圖7中顯示的序列都是根據(jù)本發(fā)明的核酸，包括它們的那 些截短形式，而且還包括它們的那些延伸形式，但是條件是各自如此截短和延伸的核酸分 子仍然能夠結(jié)合靶。實施例2 結(jié)合鼠MCP-I的核酸使用生物素化的鼠D-MCP-I作為靶，可以產(chǎn)生幾種與之結(jié)合的核酸分子。這些核 酸分子的序列分析的結(jié)果可從圖8中獲得。采用使用生物素化的鼠D-MCP-I的pull-down測定法，在適體水平上表征這些核 酸，以便根據(jù)它們的結(jié)合行為對它們進(jìn)行分級(實施例4)。將選擇出的序列合成為鏡像異 構(gòu)體(實施例3)，并使用天然構(gòu)型的MCP-I (L-MCP)在體外細(xì)胞培養(yǎng)物Ca++-釋放測定法 (實施例5)或趨化性測定法(實施例6)中進(jìn)行測試。如在圖8中所描繪的，D-188-A3-001和D-189-G7-001以及它們的衍生物在 pull-down測定法中以亞納摩爾濃度的Kd結(jié)合D-MCP-I (圖8)。對于D-mN0X-E36 ( = D-188-A3-007 ；SEQ. ID NO. 244)，測得在 37 "C 下解離常數(shù) (Kd)為 0. 1-0. 2nM(實施例 4 ；圖 10)。相應(yīng)的鏡像異構(gòu)體 mN0X_E36 (188-A3-007 ；SEQ. ID NO. 122)在體外Ca++-釋放測定法中顯示出約12nM的抑制濃度(IC50)(實施例5 ；圖13)，和 在體外趨化性測定法中顯示出約7nM的抑制濃度(IC5tl)(實施例6 ；圖16)。對于mN0X_E36 的PEG化的衍生物mN0X-E36-3，PEG (SEQ. ID NO. 254)，在Ca++-釋放測定法中測定出約8nM 的IC50(實施例5 ；圖29)，和在趨化性測定法中測定出約3nM的IC50(實施例6 ；圖31)。應(yīng)當(dāng)理解，任何在圖1至圖7中顯示的序列都是根據(jù)本發(fā)明的核酸，包括它們的那 些截短形式，而且還包括它們的那些延伸形式，但是條件是各自如此截短和延伸的核酸分 子仍然能夠結(jié)合靶。實施例3 適體和鏡像異構(gòu)體的合成和衍生化小規(guī)模合成
禾lj用 2，TBDMS RNA 亞磷酰胺化學(xué)(M. J. Damha, K. K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology,第 20 卷 Protocols foroligonucleotides and analogs,編輯 S. Agrawal,第 81-114 頁，HumanaPress Inc. 1993)，使用 ABI 394 合成儀(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA，USA)，通過固相合成來制備適體和鏡像異構(gòu)體。D-和L-構(gòu)型 的 Yk (N-Bz) -、rC (Ac) -、rG (N-ibu)-和 rU_ 亞磷酰胺購自 ChemGenes，Wilmington, MA。適 體和鏡像異構(gòu)體通過凝膠電泳進(jìn)行純化。大規(guī)模合成加修飾禾lj用 2，TBDMS RNA 亞磷酰胺化學(xué)(M. J. Damha, K. K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology,第 20 卷 Protocols foroligonucleotides and analogs,編輯
S.Agrawal，第 81-114 頁，HumanaPress Inc. 1993)，使用 AktaPilotlOO合成儀(Amersham Biosciences ；General Electric Healthcare, Freiburg)，通過固相合成來制備鏡像異構(gòu) 體 N0X-E36。L-rA (N_Bz) -、L-rC (Ac) -、L-rG (N-ibu)-和 L_rU_ 亞磷酰胺購自 ChemGenes， Wilmington, MA。5’ -氨基-修飾劑購自 American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, USA)。未修飾的鏡像異構(gòu)體的合成開始于L-riboG修飾的CPG，孔徑為 1000 A (Link Technology,Glasgow,UK)；對于 3，_NH2_ 修飾的鏡像異構(gòu)體，使用 3，-氨基 修飾劑-CPG，1000 A (ChemGenes, Wilmington, MA)。對于偶聯(lián)(每次循環(huán)15分鐘)，使用 0. 3M在乙腈中的芐硫基四唑(CMS-Chemicals，Abingdon，UK)和3. 5當(dāng)量的各自0. 1M在乙 腈中的亞磷酰胺溶液。使用氧化封端循環(huán)。其他用于寡核苷酸合成的標(biāo)準(zhǔn)溶劑和試劑購自 Biosolve (Valkenswaard, NL)。合成鏡像異構(gòu)體，DMT-0N ；在去保護(hù)后，使用 Sourcel5RPC 介 質(zhì)(Amersham)，通過制備型RP-HPLC(Wincott F等人，(1995)Nucleic Acids Res 23:2677) 進(jìn)行純化。用80%乙酸除去5，DMT-基團(在室溫下30分鐘)。隨后，加入2M NaOAc水溶 液，并使用5K再生纖維素膜(Millipore，Bedford，MA)通過切向流過濾來對鏡像異構(gòu)體進(jìn) 行脫鹽。N0X-E36 的 PEG 化為了延長鏡像異構(gòu)體在體內(nèi)的血漿停留時間，將鏡像異構(gòu)體N0X-E36在3’ -末端 或5，-末端處共價偶聯(lián)至40kDa聚乙二醇(PEG)部分。N0X-E36 的 3，-PEG 化為了 PEG化(關(guān)于PEG化方法的技術(shù)細(xì)節(jié)，可參見歐洲專利申請EP 1 306 382)， 將純化的3’ -氨基修飾的鏡像異構(gòu)體溶解于H20(2. 5ml)、DMF(5ml)和緩沖液A (5ml ；通過 混合檸檬酸 H20[7g]、硼酸[3. 54g]、磷酸[2. 26ml]和1M NaOH[343ml]并加入H20以達(dá)到 1L的終體積來制備；用1M HC1調(diào)節(jié)pH = 8. 4)的混合物中。用1M NaOH使鏡像異構(gòu)體溶液的pH達(dá)到8. 4。然后，在37°C下以4份(每份0. 6 當(dāng)量)每 30 分鐘添加 40kDa PEG-NHS 酯(NektarTherapeutics，Huntsville, AL)，直至達(dá) 到75至85%的最大收率。在添加PEG-NHS酯的過程中，用1M NaOH將反應(yīng)混合物的pH保 持在8-8. 5。將該反應(yīng)混合物與4ml尿素溶液(8M) ,4ml緩沖液A和4ml緩沖液B (0. 1M的在H20 中的乙酸三乙基銨)混合，并加熱至95°C 15分鐘。然后，采用乙腈梯度(緩沖液B ；緩沖液 C 0. 1M的在乙腈中的乙酸三乙基銨)，使用Source 15RPC介質(zhì)(Amersham)，通過RP-HPLC 來純化PEG化的鏡像異構(gòu)體。在5%緩沖液C處洗脫過量的PEG，在10-15%緩沖液C處洗脫PEG化的鏡像異構(gòu)體。將純度>95% (這通過HPLC來評估)的產(chǎn)物級分合并，并與40ml 3MNa0AC相混合。通過切向流過濾(5K再生纖維素膜，Millipore，Bedford ΜΑ)對PEG化的 鏡像異構(gòu)體進(jìn)行脫鹽。N0X-E36 的 5，-PEG 化為了 PEG化(關(guān)于PEG化方法的技術(shù)細(xì)節(jié)，可參見歐洲專利申請EP 1 306 382)， 將純化的5’ -氨基修飾的鏡像異構(gòu)體溶解于H2O (2. 5ml)、DMF (5ml)和緩沖液A (5ml ；通過 混合檸檬酸-H2O[7g]、硼酸[3. 54g]、磷酸[2. 26ml]和IM NaOH[343ml]并加入水以達(dá)到IL 的終體積來制備；用IM HCl調(diào)節(jié)pH = 8. 4)的混合物中。用IM NaOH使鏡像異構(gòu)體溶液的pH達(dá)到8. 4。然后，在37°C下以6份(每份0. 25 當(dāng)量)每 30 分鐘添加 40kDa PEG-NHS 酯(NektarTherapeutics，Huntsville, AL)，直至達(dá) 到75至85%的最大收率。在添加PEG-NHS酯的過程中，用IM NaOH將反應(yīng)混合物的pH保 持在8-8. 5。將該反應(yīng)混合物與4ml尿素溶液(8M)和4ml緩沖液B (0. IM的在H2O中的乙酸三 乙基銨)混合，并加熱至95°C 15分鐘。然后，采用乙腈梯度(緩沖液B;緩沖液C :0. IM的 在乙腈中的乙酸三乙基銨)，使用Source 15RPC介質(zhì)(Amersham)，通過RP-HPLC來純化PEG 化的鏡像異構(gòu)體。在5%緩沖液C處洗脫過量的PEG，在10-15%緩沖液C處洗脫PEG化的 鏡像異構(gòu)體。將純度>95% (這通過HPLC來評估)的產(chǎn)物級分合并，并與40ml 3M NaOAC 相混合。通過切向流過濾(5K再生纖維素膜，Millipore, Bedford ΜΑ)對PEG化的鏡像異 構(gòu)體進(jìn)行脫鹽。實施例4 結(jié)合常數(shù)的測定(Pull-Down測定法)直接pul 1-down測定法分別在20或37°C下，在pull-down測定法中測量適體對D-MCP-I的親和力。使用 [Y -32P] -feia W ATP (Hartmann Analytic, Braunschweig, Germany), 通過 Τ4 (Invitrogen，Karlsruhe, Germany)對適體進(jìn)行5’ -磷酸標(biāo)記。經(jīng)標(biāo)記的適體的比放射性 為200，000-800, OOOcpm/pmoL·在變性和復(fù)性后將適體在37°C下以20pM的濃度與不同量 的生物素化的 D-MCP-I —起于選擇緩沖液(20mM Tris-HCl pH7. 4 ；137mM NaCl ；5mM KCl ； ImM MgCl2 ；ImM CaCl2 ；0. 1% [w/vol]Tween-20)中孵育4-12小時以便在低濃度下達(dá)到平 衡。用 10μ g/ml 人血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Steinheim, Germany)和 10 μ g/ml 酵母 RNA(Ambion,Austin,USA)補充選擇緩沖液，以便防止結(jié)合伴侶吸附至所使用的塑料器具或 固定基質(zhì)的表面。生物素化的D-MCP-I的濃度范圍被設(shè)定為SpM至IOOnM ；總反應(yīng)體積為 Imlo將肽和肽-適體復(fù)合物固定在1. 5μ 1 Streptavidin Ultralink Plus顆粒(Pierce Biotechnology, Rockford,USA)上，所述顆粒已用選擇緩沖液預(yù)平衡并重懸于6 μ 1的總體 積中。顆粒在相應(yīng)的溫度下于熱混勻器中保持懸浮30分鐘。在分離上清液并適當(dāng)洗滌后， 在閃爍計數(shù)器中對固定的放射性進(jìn)行定量。將結(jié)合百分比對生物素化的D-MCP-I的濃度進(jìn) 行繪圖，并且通過使用軟件算法(GRAFIT ；Erithacus Software ；Surrey U. K.)并假定1 1 的化學(xué)計量來獲得解離常數(shù)。競爭性pull-down測定法為了比較不同的結(jié)合D-MCP-I的適體，實施競爭性分級測定法。為達(dá)到此目的，將 可獲得的最具親和力的適體進(jìn)行放射性標(biāo)記(參見上文)并用作參考。在變性和復(fù)性后，將它在一定的條件下于37°C與生物素化的D-MCP-1在1ml選擇緩沖液中進(jìn)行孵育，所述條 件導(dǎo)致在NeutrAvidin瓊脂糖或Str印tavidin Ultralink Plus (兩者都來自Pierce)上 固定和洗滌之后大約5-10%的與所述肽的結(jié)合(無競爭)。將過量的變性和復(fù)性的未標(biāo)記 的D-RNA適體變體以不同的濃度(如2、10和50nM)與經(jīng)標(biāo)記的參考適體一起加入，以便進(jìn) 行平行的結(jié)合反應(yīng)。待檢測的適體與參考適體競爭結(jié)合靶，從而減少了結(jié)合信號，信號減少 的情況取決于它們的結(jié)合特征。在該測定法中發(fā)現(xiàn)的最具活性的適體隨后可以作為新的參 考以用于其他適體變體的比較分析。實施例5 :Ca++-釋放測定法中抑制濃度的測定將THP-1 細(xì)胞(DSMZ, Braunschweig)以 0. 3xl06/ml 的細(xì)胞密度，在 37°C禾口 5% C02下，在具有GlutaMAXdnvitrogen)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，該培養(yǎng)基另外還含 有10%胎牛血清、50單位/ml青霉素、50 u g/ml鏈霉素和50 y M0 -巰基乙醇。于37°C在0. 2ml薄型(low profile)96-管板中，在Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中 將鏡像異構(gòu)體與重組人MCP-1 (Bachem) 一起孵育15至60分鐘，所述Hanks平衡鹽溶液含 有l(wèi)mg/ml牛血清白蛋白、5mM丙磺舒和20mM HEPES(HBSS+)( “刺激溶液”)。為了用鈣指示劑染料進(jìn)行加載，將細(xì)胞以300xg離心5分鐘，重懸于4ml指示劑染 料溶液(10iiM fluo-4[分子探針]、0. 08%pluronicl27[分子探針]，于HBSS+中)中，并 在37°C下孵育60分鐘。隨后，加入11ml HBSS+，并如上所述離心細(xì)胞，用15ml HBSS+洗滌 一次，然后再重懸于HBSS+中以使細(xì)胞密度為1. lX106/ml。向黑色96-孔板的每個孔中加 入90iU該細(xì)胞懸浮液。在Fluostar Optima多檢測平板讀取器(BMG)中以485nm的激發(fā)波長和520nm的 發(fā)射波長測量熒光信號。對于多個樣品的平行測量，同時記錄96-孔平板的(垂直的)一 排孔。進(jìn)行時間延遲為4秒的最初3次讀取以用于確定基線。然后，中斷記錄，并將平板從 該裝置中取出。用多道移液器將10yl刺激溶液加入孔中，然后將平板再次移進(jìn)裝置中并 繼續(xù)測量。總共，進(jìn)行時間間隔為4秒的20次記錄。對于每個孔，測定最大熒光值和基線值之間的差異，并對MCP-1濃度進(jìn)行繪圖，或 者在關(guān)于由鏡像異構(gòu)體抑制鈣釋放的實驗中，對鏡像異構(gòu)體的濃度進(jìn)行繪圖。人MCP-1的半數(shù)最大有效濃度(EC5(1)的測定在用各種濃度的hMCP-1刺激THP-1細(xì)胞并將最大信號和基線信號之間的差異進(jìn) 行繪圖后，獲得了人MCP-1的劑量-反應(yīng)曲線，其表明半數(shù)有效濃度(EC5(i)為約2-4nM(圖 11)。該濃度被用于進(jìn)一步的關(guān)于由鏡像異構(gòu)體抑制Ca++-釋放的實驗。鼠MCP-1的半數(shù)最大有效濃度(EC5(i)的測定在用各種濃度的mMCP-1刺激THP-1細(xì)胞并將最大信號和基線信號之間的差異進(jìn) 行繪圖后，獲得了鼠MCP-1的劑量-反應(yīng)曲線，其表明半數(shù)有效濃度(EC5Q)為約5nM (圖28)。 該濃度被用于進(jìn)一步的關(guān)于由鏡像異構(gòu)體抑制Ca++-釋放的實驗。實施例6 在趨向性測定法中抑制濃度的測定將如上所述進(jìn)行生長的THP-1細(xì)胞離心，在HBH(HBSS，含有l(wèi)mg/ml牛血清白蛋白 和20mM HEPES)中洗滌一次，并以3xl06個細(xì)胞/ml進(jìn)行重懸浮。將100 u 1該懸浮液加 入具有5iim孔的Transwell插入物(inserts) (Corning, #3421)中。在較低的區(qū)室中，在 加入細(xì)胞之前，將MCP-1與各種濃度的鏡像異構(gòu)體一起于37°C在600 u 1 HBH中預(yù)孵育20至30分鐘。允許細(xì)胞在37°C下遷移3小時。隨后，移去插入物，并將60 μ 1在磷酸鹽緩 沖鹽水中的440 μ M刃天青(Sigma)加入至較低的區(qū)室中。在37°C下孵育2. 5小時后，在 FluostarOptima多檢測平板讀取器(BMG)中以544nm的激發(fā)波長和590nm的發(fā)射波長測量熒光。人MCP-I的半數(shù)最大有效濃度(EC5tl)的測定在THP-I細(xì)胞向各種濃度的人MCP-I遷移3小時后，獲得了人MCP-I的劑量-反應(yīng)曲線，其表明最大有效濃度為約InM，并且在更高的濃度時活性減少(圖14)。對于進(jìn)一 步的關(guān)于由鏡像異構(gòu)體抑制趨化性的實驗，使用的MCP-I濃度為0. 5nM。鼠MCP-I的半數(shù)最大有效濃度(EC5tl)的測定在THP-I細(xì)胞向各種濃度的鼠MCP-I遷移3小時后，獲得了鼠MCP-I的劑量-反 應(yīng)曲線，其表明最大有效濃度為約1-3ηΜ，并且在更高的濃度時活性減少(圖30)。對于進(jìn) 一步的關(guān)于由鏡像異構(gòu)體抑制趨化性的實驗，使用的鼠MCP-I濃度為0. 5nM。實施例7 通過表面等離子體共振測量進(jìn)行的結(jié)合分析7. 1 評估 N0X-E36、181-A2-018 和 mN0X_E36 的特異件使用Biacore 2000 裝置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)來分析核酸與人 MCP-I和相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)合。當(dāng)偶聯(lián)通過胺基團來實現(xiàn)時，將蛋白質(zhì)針對水透析1-2小時 (Millipore VSWP混合的纖維素酯；孔尺寸為0. 025 μ M)以去除干擾性的胺。在蛋白質(zhì)偶 聯(lián)之前，通過以5 μ 1/分鐘的流速注射35 μ 1 0. 4Μ NHS和0. IM EDC的1 1稀釋物來活 化PioneerFl或CM4傳感器芯片(Biacore AB)。然后以2 μ 1/分鐘的流速注射入濃度為 0. l-l.Syg/ml的趨化因子，直到裝置的響應(yīng)在1000-2000RU(相對單位)的范圍內(nèi)。通 過以5 μ 1/分鐘的流速注射35 μ 1鹽酸乙醇胺溶液(ρΗ 8. 5)來使未反應(yīng)的NHS酯去活 化。將傳感器芯片用結(jié)合緩沖液預(yù)處理兩次，并以10 μ 1/分鐘平衡1-2小時直到基線看起 來穩(wěn)定。對于所有蛋白質(zhì)，通過一系列在選擇緩沖液(TriS-HCl，20mM;NaCl，137mM;KCl， 5mM ；CaCl2, ImM ；MgCl2, ImM ；Tween 20,0. 1% [w/v] ；ρΗ 7.4)中濃度為 1000、500、250、125、 62. 5,31. 25和OnM的鏡像異構(gòu)體注射液來評估動力學(xué)參數(shù)和解離常數(shù)。在所有實驗中，在 37°C下用Kinject命令來進(jìn)行分析，所述命令定義了在10 μ 1/分鐘的流速下締合時間為 180秒而解離時間為360秒。數(shù)據(jù)分析和解離常數(shù)(Kd)的計算采用BIAevaluation 3. 0軟 件(BIACOREAB，Uppsala，Sweden)來進(jìn)行，其使用了 Langmuir 1 1化學(xué)計量擬合算法。7. L 1N0X-E36 和 181-A2~018(人-MCP-1 特異性核酸)僅對于人MCP-1，描述了所有的傳感圖(分別為圖17和20)；對于其他蛋白質(zhì)，為 了清晰的目的，只顯示了使用125nM鏡像異構(gòu)體濃度獲得的傳感圖(圖18/19和21/22)。N0X-E36 · hMCP-Ι相互作用的分析將重組人MCP-I按照生產(chǎn)商的建議(胺偶聯(lián) 方法)固定在PioneerFl傳感器芯片上，直到建立1381RU(相對單位)的儀器響應(yīng)。測得 的N0X-E36與人MCP-I結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)為約890pM(圖17)。181-A2-018 · hMCP-Ι相互作用的分析將重組人MCP-I按照生產(chǎn)商的建議(胺 偶聯(lián)方法)固定在CM4傳感器芯片上，直到建立3111RU(相對單位)的儀器響應(yīng)。測得的 181-A2-018與人MCP-I結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)為約370pM(圖20)。為了測定N0X-E36和181-A2-018的特異性，將各種人MCP-1家族蛋白質(zhì)以及人 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子固定在PioneerFl和CM4傳感器芯片上(hMCP-1，1754RU ；hMCP-2,1558RU ；hMCP-3,1290RU ；嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子，1523RU)。動力學(xué)分析顯示，N0X-E36以 5-10nM的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合至嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和hMCP-2 ；hMCP-3不被識別(圖18 和24A)。與之相反，181-A2-018結(jié)合嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、hMCP-2和hMCP_3，但是親和 力略有降低(10-20nM ；圖21和24A)。使用在PioneerFl和CM4傳感器芯片上的經(jīng)胺偶聯(lián)固定的來自人(1460RU)、猴 (1218RU)、豬(1428RU)、狗(1224RU)、兔(1244RU)、大鼠(1267RU)和小鼠(1361RU)的MCP-1 來評估N0X-E36和181-A2-018的物種間交叉反應(yīng)性。動力學(xué)分析顯示，N0X-E36以相當(dāng) 的0. 89-1. 2nM的解離常數(shù)(KD)結(jié)合至人、猴、豬和犬MCP-1，但是不識別來自小鼠、大鼠和 兔的MCP-1 (圖19和24A)。181-A2-018以相當(dāng)?shù)?. 5-0. 6nM的解離常數(shù)(KD)結(jié)合至人 和猴MCP-1，但是以低得多的親和力結(jié)合豬、兔和犬MCP-1。N0X-A2-018不識別大鼠和小鼠 MCP-1 (圖 22 禾口 24A)。序列以及在來自不同物種的MCP-1蛋白質(zhì)和密切相關(guān)的人蛋白質(zhì)之間的以相同 氨基酸百分比表示的同源性程度在圖23中描述；計算出的N0X-E36和181-A2-018的KD值 在圖24A中以表格形式顯示。7. 1. 2mN0X~E36 (鼠 MCP-1 特異件核酸)為了分析mN0X-E36的結(jié)合行為，將3759RU的合成的、生物素化的鼠D-MCP-1 (流 動池(flow cell) 3)和3326RU的生物素化的人D-MCP-1 (流動池4)分別固定在綴合有鏈 霉抗生物素蛋白的傳感器芯片(Biacore AB,Freiburg,Germany)上。使用Kinject命令來 注射500、250、125、62. 5,31. 25和OnM的mN0X_E36適體(D-RNA)溶液，所述命令定義了締 合時間為180秒而解離時間為360秒。將流動池1用作緩沖液和葡聚糖基質(zhì)對照(Biacore SA-芯片表面)，而在流動池2上，固定非特異性的D-肽以測定適體的非特異性結(jié)合。圖 32顯示了 D-N0X-E36結(jié)合至鼠D-MCP-1的動力學(xué)的傳感圖，計算出的解離常數(shù)(KD)為 200-300pM。mN0X-E36不結(jié)合人D-MCP-1 (圖33)；為了清晰的目的，只顯示了使用125nM鏡 像異構(gòu)體獲得的傳感圖。7. 2評估N0X-E36的選擇性通過將5’生物素化的N0X-E36固定在Str印tavidin(SA-芯片)上，利用表面等 離子體共振分析來評估N0X-E36的選擇性。在流動池(FC) 1上的352RU的N0X-E36和相同 量的在FC2上的5’-末端生物素化的非功能性對照鏡像異構(gòu)體(P0C)通過鏈霉抗生物素蛋 白/生物素的結(jié)合來進(jìn)行固定。將FC3用作表面對照以測定與葡聚糖-SA傳感器表面的非 特異性結(jié)合。注射lOOnM的一組來自所有四個亞群(CC、CXC、CX3C和XC)的人趨化因子360秒， 并允許復(fù)合物在10 u 1/分鐘的流速和37°C下解離360秒。將在締合(響應(yīng)1 ；相互作用的 程度)后和在解離(響應(yīng)2，相互作用的親和力)后的響應(yīng)單位進(jìn)行繪圖。在每次注射后， 用240s的含0. 1% Tween的1M氯化鈉使芯片表面再生；隨后允許固定的鏡像異構(gòu)體在生 理條件(走樣緩沖液)下重折疊2分鐘。將每種趨化因子的注射重復(fù)3次。CXCL1、CXCL2、 CXCL6和CXCL9顯示出與核糖核酸和芯片葡聚糖表面的非特異性結(jié)合。只有關(guān)于CCL2/ MCP-1、CCL8/MCP-2、CCL11/ 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、CCL3/MIP1 a 和 CXCL7/NAP-2 才能夠 檢測到與固定的N0X-E36的特異性高親和力結(jié)合(圖24B)。MCP-2和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因 子被N0X-E36結(jié)合這一發(fā)現(xiàn)由于這些趨化因子和MCP-1之間具有62%和70%的相對較高的同源性而并不令人驚訝，對于未預(yù)料到的陽性CCL3/MIP-1 α和CXCL7/NAP-2，已經(jīng)分別 實施或目前正在建立有關(guān)功能性抑制的體外測試。最后，Ν0Χ-Ε36和 CCL2/MCP-1、CCL8/MCP_2、CCLll/ 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、CCL3/ MIPl α、CXCL7/NAP-2、CCL7/MCP-3及CCL13/MCP-4之間的相互作用的動力學(xué)參數(shù)在“反向 的(inverted)”體系中進(jìn)行了測定。這里，固定趨化因子，并注射游離的N0X-E36 (關(guān)于詳 細(xì)的方案，參見7.1)。動力學(xué)數(shù)據(jù)概括于圖24C中。7. 3體外評估抗-MIP-I α功能件Biacore測量已經(jīng)顯示出Ν0Χ-Ε36與MIP-I α的交叉反應(yīng)性。應(yīng)該通過采用功能 性的、基于細(xì)胞培養(yǎng)的體外測定法來檢驗Ν0Χ-Ε36與MIP-I α的純粹的Biacore結(jié)合是否 也轉(zhuǎn)化為功能性，如拮抗作用。為了達(dá)到該目的，實施使用THP-I細(xì)胞的趨化性實驗，所述THP-I細(xì)胞可通過 MIP-I α來進(jìn)行刺激。將如上所述進(jìn)行生長的THP-I細(xì)胞離心，在HBH(HBSS，含有l(wèi)mg/ml 牛血清白蛋白和20mMHEPES)中洗滌一次，并以3xl06個細(xì)胞/ml進(jìn)行重懸浮。將100 μ 1該 懸浮液加入具有5μπι孔的Transwell插入物(Corning, #3421)中。在較低的區(qū)室中，在 加入細(xì)胞之前，將MIP-I α與各種濃度的鏡像異構(gòu)體一起于37°C在600 μ 1 HBH中預(yù)孵育 20至30分鐘。允許細(xì)胞在37°C下遷移3小時。隨后，移去插入物，并將60 μ 1在磷酸鹽緩 沖鹽水中的440 μ M刃天青(Sigma)加入至較低的區(qū)室中。在37°C下孵育2. 5小時后，在 Fluostar Optima多檢測平板讀取器(BMG)中以544nm的激發(fā)波長和590nm的發(fā)射波長測 量熒光。在THP-I細(xì)胞向各種濃度的人MIP-I α遷移3小時后，獲得了人MIP-I α的劑 量_反應(yīng)曲線，其表明半數(shù)最大有效濃度為約InM，并且在更高的濃度時活性減少(圖 24D)。對于進(jìn)一步的關(guān)于由鏡像異構(gòu)體抑制趨化性的實驗，使用的ΜΙΡ-Ια濃度為0. 5ηΜ。使用0. 5nM MIP-I α的刺激，實施用于測定Ν0Χ-Ε36對趨化性的抑制的實驗?？?以清楚地顯示，N0X-E36不抑制由MIP-lα誘導(dǎo)的趨化性，直至ΙμΜ MIP-I α的最高測試 濃度。作為陽性對照，平行實施了使用MCP-I作為刺激物的各自實驗(圖24E)。實施例8 用抗-mMCP-1鏡像異構(gòu)體治療MRLwipir小鼠中的狼瘡樣疾病阻斷促炎介質(zhì)已變成為一種成功的用于治療慢性炎癥的方法(Steinman 2004)。 除了 TNF和白細(xì)胞介素外，CC-趨化因子也是對于特異性拮抗作用的重要候選物，因為 CC-趨化因子介導(dǎo)白細(xì)胞從血管內(nèi)腔募集至炎癥位點(Baggiolini 1998, Luster 2005)。 存在非常強的證據(jù)表明，MCP-I ( = CCL2)及其各自的趨化因子受體CCR2在自身免疫性組織 損傷(例如全身性紅斑狼瘡的臨床表現(xiàn))中起至關(guān)重要的作用(Gerard & Rollins 2001)。 例如，Ccl2或Ccr2基因缺陷的MRLwipir小鼠受到保護(hù)而免于狼瘡樣自身免疫(Perez de Lema 2005，Tesch 1999)。因此，CCL2/CCR2軸可代表具有前景的治療靶，例如對于狼瘡 腎炎。實際上，延遲的基因療法或轉(zhuǎn)移經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(兩者都導(dǎo)致原位產(chǎn)生NH2-截短的 MCP-1)顯著減少了 MRLwiltt小鼠中的自身免疫性組織損傷?？墒牵祟悓嶒灧椒ㄓ捎诳刂?不住的拮抗劑產(chǎn)生和腫瘤形成而不能用于人(Hasegawa 2003, Shimizu 2004)。因此，仍然 需要開發(fā)在體內(nèi)具有有利的藥物動力學(xué)特性曲線的新型CCL2拮抗劑。在該實施例中顯示 了，用抗_mCCL2鏡像異構(gòu)體mN0X-E36或mN0X-E36_3’ PEG阻斷鼠CCL2將適合用于治療狼 瘡腎炎和全身性紅斑狼瘡的其他疾病表現(xiàn)。最近開始的mCCL2鏡像異構(gòu)體療法有效改善了
79MRL1pr7lpr小鼠中的狼瘡腎炎、自身免疫性支氣管周炎和狼瘡樣皮膚疾病，而不受與治療性 CCL2/CCR2阻斷相關(guān)的任何先前問題的支配。動物和實驗方案從Harlan Winkelmann(Borchen, Germany)獲得 10 周齡的雌性 MRL1pr7lpr 小鼠， 并將其以12小時的光照和黑暗循環(huán)保持在正常居住條件下。可以隨意獲得水和標(biāo)準(zhǔn) 食物(Ssniff，Soest, Germany)。在14周齡時，將12只小鼠的組如下每周三次接受皮 下注射在5%葡萄糖中的鏡像異構(gòu)體(注射體積為4ml/kg) :mN0X-E36,1.5ymol/kg； mN0X-E36-3，PEG，0. 9 μ mol/kg ；無功能的對照鏡像異構(gòu)體 PoC (5，-UAAGGAAACUCG⑶CUGAUG CGGUAGCGCUGUGCAGAGCU-3，)，1. 9 μ mol/kg ；PoC_PEG，0. 9 μ mol/kg ；媒介物(5% 葡萄糖)。 從分別在注射后3或24小時每周取自眶后竇的血樣中測定mN0X-E36和mN0X-E36_3，PEG 的血漿水平。血漿樣品中的鏡像異構(gòu)體水平通過如實施例8中描述的夾心雜交方法的改進(jìn) 形式來進(jìn)行測定。在年齡的第24周結(jié)束時，通過頸脫位法處死小鼠。全身性狼瘡的評估通過半定量評分來記錄皮膚損害(Schwarting 2005)。計算出脾和腸系膜淋巴 結(jié)團塊(bulk)與總體重的重量比作為與狼瘡相關(guān)的淋巴組織增生綜合征的標(biāo)志。在實 驗期結(jié)束時，通過在吸入醚進(jìn)行全身麻醉下從眶后靜脈叢抽血來收集每只動物的血樣和 尿樣。在實驗結(jié)束時收集每只動物的血樣和尿樣，并如以前所描述的(Pawar 2006)測定 尿白蛋白/肌酸酐比率和血清dsDNA自身抗體IgG同種型滴度。在24周時，通過在單次 推注后 5、10、15、20、35、60 和 90 分鐘時的血菜 FITC-菊粉(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)的清除動力學(xué)來測定腎小球濾過率(GFR) (Qi 2004)。熒光以485nm的激發(fā)進(jìn) 行測定，并以535nm的發(fā)射進(jìn)行讀取。使用非線性回歸曲線擬合軟件(GraphPad Prism, GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)，基于二室模型來計算 GFR。使用對于 IL-6、 IL-12p40(OptEiA,BDPharmingen)禾Π IFN-α (PBL Biomedical Labs, USA)的商業(yè) ELISA 試劑盒來測定 血清細(xì)胞因子水平。將來自所有小鼠的腎臟和肺在10%緩沖的福爾馬林中固定，處理，并 包埋于石蠟中。按照常規(guī)方案制備用于銀染色和過碘酸-希夫染色的5-μ m切片(Anders 2002)。使用如關(guān)于狼瘡腎炎所描述的活性指數(shù)和慢性指數(shù)(Austin 1984)對腎臟損害的 嚴(yán)重度進(jìn)行分級，并且如以前描述的(Anders 2002)進(jìn)行腎間質(zhì)損傷的形態(tài)計量法。將支 氣管周圍炎癥的嚴(yán)重度半定量地分級為0-4。對于免疫染色，將經(jīng)福爾馬林固定的且用石 蠟包埋的組織切片脫蠟并再水化。通過3%過氧化氫來阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶，并且在 高壓滅菌烘箱中于抗原提取溶液(Vector，Burlingame，CA)中進(jìn)行抗原提取(retrieval)。 使用抗生物素蛋白/生物素阻斷試劑盒(Vector)來阻斷生物素。將載玻片與一抗一起孵 育1小時，之后與生物素化的二抗(抗大鼠IgG，Vector)和ABC試劑(Vector) —起孵育。 在孵育步驟之間，在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌載玻片。將具有金屬增強作用的3’ 3’ 二氨基 聯(lián)苯胺(DAB，Sigma，Taufkirchen，Germany)用作檢測體系，產(chǎn)生了黑色產(chǎn)物。將甲基綠用 作復(fù)染劑，將載玻片脫水并放置在 Histomount (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) 中。使用下列一抗大鼠抗_Mac2(巨噬細(xì)胞，Cederlane，Ontario，Canada，1 50)、抗-小 鼠 CD3(1 100，克隆 500A2，BD)、抗-小鼠 IgGJl 100，M32015，Caltag Laboratories, Burlingame, CA，USA)、抗一小鼠 IgG2a(1 100，M32215，Caltag)、抗-小鼠 C3 (1 200，GAM/C3c/FITC, Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Netherlands)。陰性對照 包括與相應(yīng)的同種型抗體一起孵育。陰性對照包括用相應(yīng)的同種型抗體進(jìn)行孵育。對于定 量分析，計數(shù)在15個皮質(zhì)腎小球/切片中的腎小球細(xì)胞。在15個皮質(zhì)腎小球切片上，對腎 小球Ig和C3c沉積物在0-3范圍內(nèi)進(jìn)行評分。RNA的制備和實時定量(TaciMan) RT-PCR將來自每只小鼠的腎組織在液氮中速凍并在-80°C下貯存。從每只動物中，如所 描述的(Anders 2002)進(jìn)行總腎RNA的制備和逆轉(zhuǎn)錄。引物和探針來自PE Biosystems, ffeiterstadt, Germany。所使用的用于檢測 Ccl2、Ccl5 和 18S rRNA 的引物(300nM)，預(yù)先 開發(fā)的TaqMan測定法試劑，來自PE Biosystems。流式細(xì)胞術(shù)在該研究結(jié)束時，從所有組的小鼠中獲得總血樣和骨髓樣品。使用FACScalibur 儀器和先前經(jīng)表征的MC21抗-mCCR2抗體(Mack2001)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。將生物素化的 抗-大鼠IgG抗體(BDBiosciences)用于檢測。將大鼠IgG2b(BD Biosciences)用作同種 型對照。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)表示為平均值士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。組之間的比較用單變量AN0VA來完 成。將Posthoc Bonferroni校正用于多重比較。p < 0. 05的值被認(rèn)為是表明了統(tǒng)計學(xué)顯著性。夾心雜交測定法基于如Drolet等人，2000 (Pharm Res 17 1503)所描述的測定法，通過夾心雜交 測定法來定量樣品中的鏡像異構(gòu)體量。平行收集血樣以跟蹤N0X-E36的血漿清除。制備所 選擇的組織用以測定鏡像異構(gòu)體濃度。雜交平板的制備將鏡像異構(gòu)體mN0X_E36通過使用未驗證的夾心雜交測定法來進(jìn)行定量。簡而言 之,將在0. 5M磷酸鈉、ImM EDTA(pH 8. 5)中的0. 75mM mN0X_E36捕獲探針(Seq. ID. No 281) 在 4°C下固定至白色的 DNA-BIND 96 孔板(Corning Costar, Wiesbaden, Germany)過夜。將 孔洗滌兩次并在37°C下用在0. 25M磷酸鈉、ImM EDTA(pH8. 5)中的0. 5%w/v BSA封閉3小 時，再次洗滌并在4°C下貯存直到使用。在雜交前，將孔預(yù)先升溫至37°C，并用預(yù)先升溫的 洗滌緩沖液(3XSSC，0. 5% [w/v]十二烷基肌氨酸鈉，pH 7. 0 ；預(yù)先制備無月桂酰基肌氨酸 鈉的20X儲液[3M NaCl,0. 3M檸檬酸鈉]，并相應(yīng)地進(jìn)行稀釋)洗滌兩次。樣品的制備將所有樣品一式兩份地進(jìn)行測定。將血漿樣品在冰上解凍，渦旋振蕩，并在冷卻的 臺式離心機中簡短地進(jìn)行離心。將組織勻漿物在室溫下解凍，并在最大速度和室溫下離心 5分鐘。只移出5 yl的每種樣品用于測定法，并隨后將其放回冷凍室進(jìn)行貯存。按照下列 方案，在室溫下將樣品用雜交緩沖液(8nM mN0X-E36檢測探針[Seq. ID :282]，在洗滌緩沖 液中)進(jìn)行稀釋1 305 ill樣品+145 ill雜交緩沖液1 30020 u 1 1 30 +180 u 1 雜交緩沖液1 300020 ill 1 300 +180 ii 1 雜交緩沖液
81
1 3000020 μ 1 1 3000 +180 μ 1 雜交緩沖液。檢測所有的樣品稀釋液。將mN0X-E36標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋成跨越0_4nM范圍的8_點 校準(zhǔn)曲線。不制備和檢測QC樣品。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品與所研究樣品的那個相同。 雜交和檢測將樣品在95°C下加熱10分鐘，并冷卻至37°C。將鏡像異構(gòu)體/檢測探針復(fù)合 物在37°C下與經(jīng)固定的捕獲探針退火30分鐘。通過分別用洗滌緩沖液和lXTBST(20mM Tris-Cl, 137mM NaCl，0. 1 % Tween 20,pH 7. 5)洗滌兩次來除去未結(jié)合的鏡像異構(gòu)體。在室 溫下，通過在IXTBST中以1 5000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白堿性磷酸酶來檢測雜交的復(fù) 合物1小時。為了除去未結(jié)合的綴合物，將孔用IXTBST和20mM Tris-CLlmM MgCl2,pH 9.8 再次洗滌(每孔洗滌兩次)。最后，用100ml CSDP底物(Applied Biosystems,Darmstadt, Germany)充滿孔，并在室溫下孵育45分鐘。在FLUOstar Optima微量培養(yǎng)板讀取器(BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany)上測量化學(xué)發(fā)光。數(shù)據(jù)分析將下面經(jīng)測定的樣品稀釋物用于定量數(shù)據(jù)分析大鼠EDTA 血漿1 2000。作為背景信號，減去從媒介物組(沒有施用鏡像異構(gòu)體)獲得的數(shù)據(jù)。對于鏡像異構(gòu)體N0X-36、N0X-E36-5，-PEG和N0X-E36_3，-PEG，也以類似的方式進(jìn) 行如本文所描述的夾心雜交測定法，其中必須使用相應(yīng)的N0X-E36捕獲探針(Seq. ID 255) 和相應(yīng)的N0X-E36檢測探針(Seq. ID 256)(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果mN0X-E36-3，PEG改善MRLwipir小鼠的存活和腎病雌性MRLwilff小鼠發(fā)展出并隨后死于增生性免疫復(fù)合物性腎小球腎炎，這與人類 中的彌散性增生性狼瘡腎炎驚人地相似。在該治療性研究設(shè)計中，在年齡的第14至24周 時，將待治療的MRL11^lpir小鼠用pEG化的和未PEG化的抗_mCCL2鏡像異構(gòu)體、peg化的和未 PEG化的對照(〃 PoC" )_鏡像異構(gòu)體或媒介物進(jìn)行治療。這時，媒介物、PoC或PoC-PEG 治療的MRLwilff小鼠顯示出彌散性增生性腎小球腎炎，其特征在于腎小球巨噬細(xì)胞浸潤以 及混合的腎小球周和間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤物(其由腎小球和間質(zhì)的Mac2-陽性巨噬細(xì)胞和 間質(zhì)的⑶3-陽性淋巴細(xì)胞組成)(圖34和35)。mN0X-E36-3’ PEG改善了狼瘡腎炎的活性 指數(shù)和慢性指數(shù)以及前面提及的腎臟炎癥的標(biāo)志(圖35)。未PEG化的分子mN0X-E36對 于慢性指數(shù)以及間質(zhì)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞計數(shù)的效果較小(圖35)。通過在經(jīng)媒介物、PoC和 PoC-PEG治療的小鼠中的腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化的匯合面積來進(jìn)一步說明了晚期慢性腎 病(圖34)。通過將形態(tài)計量法應(yīng)用于定量這些變化，發(fā)現(xiàn)PEG化的和未PEG化的mN0X-E36 減少了間隙體積、腎小管細(xì)胞損傷和腎小管擴張，這些都是慢性腎病的嚴(yán)重度和預(yù)后的標(biāo) 志(圖36)。mN0X-E36-3' PEG,而不是未PEG化的mN0X_E36，改善了 50%死亡率(圖37)。 因此，mN0X-E36-3’ PEG可以減少腎巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤物的數(shù)目，并改善MRLlpirApir小 鼠的狼瘡腎炎和(腎)存活。為了研究用mN0X-E36和mN0X-E36_3’ PEG治療是否會影響 MRL1pr7lpr小鼠中的腎內(nèi)炎癥，實施實時RT-PCR來評估促炎趨化因子CCL2和CCL5的表達(dá)水 平，先前表明在腎病的發(fā)展過程中，CCL2和CCL5的表達(dá)水平在MRL11^b小鼠的腎臟中被逐 漸上調(diào)(Perez de Lema 2001)。與經(jīng)媒介物治療的對照相比較，在年齡的第14至24周用mN0X-E36 和 mN0X-E36_3，PEG 進(jìn)行治療減少了 CCL2 和 CCL5mRNA 的腎表達(dá)(圖 38)?？?CCL2鏡像異構(gòu)體在MRLWlltt小鼠中減少腎外的自身免疫性組織損傷在MRLWllff小鼠中，皮膚和肺通常也受自身免疫性組織損傷的影響。在經(jīng)媒介 物治療的小鼠中，自身免疫性肺病的特征在于中等的細(xì)支氣管周的和血管周的炎性細(xì)胞浸 潤物，并且在60%的小鼠中觀察到皮膚損害(圖39、40和35)。分別與經(jīng)媒介物、PoC和 PoC-PEG治療的MRLWlpi:小鼠相比較，mN0X-E36和mN0X-E36_3，PEG兩者都減少了支氣管 周的炎癥和皮膚疾病(圖39、40和35)。因此，CCL2-特異性鏡像異構(gòu)體的效果不局限于狼 瘡腎炎，而是延伸到MRLWlItt小鼠中的自身免疫性組織損傷的其他表現(xiàn)。mN0X-E36和在MRLlpirApir小鼠中的淋巴組織增生綜合征、dsDNA自身抗體及血清細(xì) 胞因子水平雌性小鼠發(fā)展出了淋巴組織增生綜合征，其特征在于嚴(yán)重的脾腫大以及 頸部、腋窩、腹股溝和腸系膜淋巴結(jié)團塊。mN0X-E36和mN0X-E36_3’ PEG兩者都對MRLlpirApir 小鼠中的脾重量和淋巴結(jié)重量沒有影響(圖41)。MRLlpr/lpr小鼠中的自身免疫的特征在于針 對多種核抗原(包括dsDNA)的自身抗體的產(chǎn)生。在24周齡的MRLlp〃lpir小鼠中，血清dsDNA IgG，IgGp IgG2a、IgG2b自身抗體以高水平存在。mN0X-E36和mN0X-E36-3，PEG兩者都對任 一種這些DNA自身抗體沒有影響(圖41)。在經(jīng)媒介物治療的MRLWlIff小鼠中的狼瘡樣疾 病的特征在于升高的IFN-a、IL-12p40和IL-6的血清水平。mN0X_E36和mN0X-E36_3，PEG 兩者都對任一種這些炎癥介質(zhì)沒有影響(圖41)。因此，這兩種mN0X-E36變體都不影響 MRLlpr/lpr小鼠中的淋巴組織增生、抗-dsDNA IgG產(chǎn)生和血清細(xì)胞因子水平。MRLlpr/lpr 小鼠中 mN0X-E36 和 mN0X-E36_3，PEG 的血漿水平以一周的間隔測定mN0X-E36和mN0X-E36_3，PEG血漿水平，以便在MRLlp〃lpir小 鼠的進(jìn)行性腎病過程中監(jiān)控藥物暴露。在該研究的整個過程中，在注射后3小時的平均 mN0X-E36血漿水平和在注射后24小時的平均mN0X-E36_3，PEG血漿水平分別為約300nM 和1 ii M(圖42)。因此，PGE化增加了 mN0X-E36的血漿水平，并且MRLWlIff小鼠的進(jìn)行性腎 病沒有調(diào)節(jié)這兩種鏡像異構(gòu)體的藥物動力學(xué)。mN0X-E36-3' PEG阻斷單核細(xì)胞從骨髓中滲出據(jù)顯示，細(xì)菌感染過程中單核細(xì)胞從骨髓中的滲出涉及趨化因子受體 CCR2(Serbina 2006)，但是CCL2在自身免疫情形中的作用仍然是假定的。因此，在24周齡 MRLWlIff小鼠的經(jīng)mN0X-E36-3’PEG和媒介物治療的組的小鼠中，檢查了外周血和骨髓中的 CCR2-陽性單核細(xì)胞群體。用mN0X-E36-3，PEG進(jìn)行治療使骨髓中的CCR2陽性細(xì)胞百分比 從13%增加至26%，而它使外周血中的該群體從26%減少至11% (圖43)。這些數(shù)據(jù)支持 了 CCL2對于在MRLWlIff小鼠的自身免疫性疾病過程中CCR2陽性細(xì)胞從骨髓中逃逸出的作 用?？偨Y(jié)通過應(yīng)用鏡像異構(gòu)體技術(shù)，產(chǎn)生了新的且特異性的mCCL2拮抗劑，其在體外和體 內(nèi)有效地阻斷mCCL2。事實上，最近出現(xiàn)的使用CCL2鏡像異構(gòu)體進(jìn)行治療在小鼠 中顯著改善了晚期狼瘡樣自身免疫性組織損傷。這些數(shù)據(jù)支持了 CCL2在慢性炎性組織損 傷中的中心作用，并將CCL2鏡像異構(gòu)體鑒定為新的用于自身免疫組織損傷的治療劑。實施例9 :使用抗-mMCP-1鏡像異構(gòu)體治療在經(jīng)單側(cè)腎切除的糖尿病小鼠中的糖尿病性腎病糖尿病性腎病依然是終末期腎病的最主要原因，因為靶向血管緊張素依賴性的病 理機制常常不能防止疾病的進(jìn)展(Zimmet 2001 ；Ritzl999 ；United States Renal Data System 2004 ；Svensson 2003)。因此，對于糖尿病性腎病的治療方法需要加入其他治療策略。來自最近的實驗研究的數(shù)據(jù)將糖尿病性腎病的發(fā)展與腎內(nèi)炎癥相關(guān)聯(lián)(Galkina 2006 ；Mora 2005 ；Meyer 2003 ；Tuttle 2005)。例如，嗎替麥考酚酸酯、甲氨蝶呤或輻射 減少了患有經(jīng)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病性腎病的大鼠中的尿白蛋白排泄和腎小球硬化 (Yozai 2005 ；Utimura 2003)。然而，糖尿病性腎病中的腎內(nèi)炎癥的分子和細(xì)胞機制依然 很難表征?；加刑悄虿⌒阅I病的患者具有增加的炎癥的急性期標(biāo)記物的血清水平，但這可 能并不可代表腎內(nèi)炎癥(Dalla Vestra2005 ；Navarro 2003)?；加刑悄虿⌒阅I病的患者 將高水平的CC-趨化因子單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白1 (MCP-1/CCL2)排泄于尿中，這可能對 于腎內(nèi)炎癥來說是更特異的(Morii 2003 ；Tashiro 2002 ；Takebayashi 2006)。事實上， MCP-1/CCL2是由暴露于高的葡萄糖濃度或高級糖基化終產(chǎn)物的人腎小球膜細(xì)胞所表達(dá)的 (Ihm 1998 ；Yamagishi 2002)。CCL2參與白細(xì)胞從血管內(nèi)募集至血管外區(qū)室(即腎小球禾口 腎間質(zhì))中這一復(fù)雜的多步驟過程(Baggiolini 1998)。實際上，巨噬細(xì)胞浸潤物是人和實 驗性的糖尿病性腎小球硬化及腎小管間質(zhì)損傷中的普遍發(fā)現(xiàn)(Bohle 1991 ；Furuta 1993 ； Chow 2007)。Ccl2-缺陷型1型或2型糖尿病小鼠具有更低的腎小球巨噬細(xì)胞計數(shù)，這與 較少的腎小球損傷相關(guān)(Chow 2004 ；Chow 2006)。在這些研究中，還證實了 CCL2對于1型 和2型糖尿病性腎病的腎小球病理學(xué)的功能性作用。因此，CCL2可能代表了對于糖尿病 性腎病的潛在的治療靶，并且具有有利的藥物動力學(xué)特性曲線的合適CCL2拮抗劑在該疾 病情形中應(yīng)當(dāng)被證實是有效的。在該實施例中，我們報導(dǎo)了 PEG化的抗-CCL2鏡像異構(gòu)體 mN0X-E36-3，PEG在患有晚期糖尿病性腎病的2型糖尿病db/db小鼠中的效果。我們顯示， 抗CCL2-鏡像異構(gòu)體應(yīng)該適合用于治療糖尿病性腎病。動物和實驗方案5 周齡的雄性 C57BLKS db/db 或 C57BLKS 野生型小鼠從 Taconic (Ry，Denmark)獲 得，并將其在研究期間圈養(yǎng)于具有過濾蓋的籠中，采用12小時黑暗/光照循環(huán)并且可不受 限制地攝取食物和水。將籠、草墊、小巢(nestlets)、食物和水在使用前通過高壓滅菌法進(jìn) 行滅菌。在6周齡時，如以前所描述的(Bower 1980)，在db/db和野生型小鼠中通過Icm的 脅腹切口實施單側(cè)腎切除術(shù)(“1K”小鼠)或假手術(shù)(“2K”小鼠)。在假手術(shù)組的小鼠中， 腎臟保留在原位。10周后，在4個月大時，將IK db/db小鼠分成兩組，其每周3次接受使用 在 5%葡萄糖中的 mN0X-E36-3，PEG 或 PoC-PEG(劑量，0. 9 μ mol/kg ；注射體積，lml/kg)的 皮下注射。讓該治療持續(xù)8周(直到6個月大)，到那時，將動物處死并獲得組織以用于組 織病理學(xué)評估。所有的實驗操作過程都已經(jīng)得到當(dāng)?shù)卣畽C構(gòu)的批準(zhǔn)。糖尿病性腎病的評估如所描述的(Anders 2002)，在石蠟包埋的切片上實施所有免疫組織學(xué)研究。將下 列抗體用作一抗大鼠抗_Mac2(腎小球巨噬細(xì)胞，Cederlane, Ontario, Canada, 1 50)、 抗-Ki-67 (細(xì)胞增殖，Dianova，Hamburg, Germany, 1 25)。對于組織病理學(xué)評估，從每只小 鼠中，將腎臟的一部分在磷酸鹽緩沖鹽水中的10%福爾馬林中進(jìn)行固定，并包埋于石蠟中。按照供應(yīng)商(Bio-Optica，Milano, Italy)的說明書，將3 u m_切片用高碘酸-希夫試劑或 銀進(jìn)行染色。腎小球硬化損害通過如下采用由不知情的觀察者進(jìn)行半定量評分來評估分 別地,0 =無損害，1 =< 25%硬化，2 = 25-49%硬化，3 = 50-74%硬化，4 = 75-100%硬 化。每個切片分析15個腎小球。如以前描述的(Anders 2002)，通過將100個點的網(wǎng)格疊 合在10個非重疊的皮質(zhì)區(qū)域上來測定間隙體積指數(shù)和腎小管擴張指數(shù)。由不知情的觀察 者在15個高倍視野(hpf，400X)中測定間質(zhì)細(xì)胞計數(shù)。從脫石蠟的腎小球中進(jìn)行RNA制 備和實時定量(TaciMan)RT-PCR。在 60°C下于裂解緩沖液(10mMTris_HCl、0. ImM EDTA,2% SDS和20 u g/ml蛋白酶K)中孵育16小時后，實施基于苯酚-氯仿的RNA提取。將腎小球 RNA溶解于lOiil無RNA酶的水中。如所描述的(Anders 2002，Cohen 2002)，從總器官和 腎小球RNA中實施逆轉(zhuǎn)錄和實時RT-PCR。關(guān)于靶和管家基因由ddH20組成的對照是陰性的。 用于mCcl2、Gapdh和18S rRNA的寡核苷酸引物(300nM)和探針(100nM)是來自PE的預(yù) 先開發(fā)的TaqMan測定法試劑。引物和探針來自ABI Biosystems, ffeiterstadt, Germany。 通過在單次推注后5、10、15、20、35、60和90分鐘時的血漿FITC-菊粉(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)的清除動力學(xué)來測定腎小球濾過率(GFR) (Qi 2004)。熒光以485nm 的激發(fā)進(jìn)行測定，并以535nm的發(fā)射進(jìn)行讀取。使用非線性回歸曲線擬合軟件(GraphPad Prism, GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)，基于二室模型來計算 GFR。將所有數(shù)據(jù) 都表示為平均值士 SEM。使用AN0VA來進(jìn)行組的比較，并且此后將Bonferroni校正用于多 重比較。p < 0. 05的值被認(rèn)為是表明了統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)果mN0X-E36-3' PEG減少了經(jīng)單側(cè)腎切除的db/db小鼠中的腎小球巨噬細(xì)胞計數(shù)和 總體腎小球硬化當(dāng)功能性CCL2的缺乏與db/db小鼠中腎小球巨噬細(xì)胞募集的減少有關(guān)(Chow 2007)并且mN0X-E36-3’ PEG能夠在體外和體內(nèi)阻斷CCL2-介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞募集，則 mN0X-E36-3，PEG應(yīng)當(dāng)削弱患有晚期2型糖尿病性腎病的db/db小鼠中的腎巨噬細(xì)胞募集。 為了檢驗這一假設(shè)，我們在4個月大的經(jīng)單側(cè)腎切除的(“IK" )db/db小鼠中開始皮下 注射mN0X-E36-3，PEG或PoC-PEG。該治療持續(xù)8周，到那時，收集組織以用于評估糖尿病 性腎病。在這一過程中，mN0X-E36-3' PEG治療沒有顯著影響白細(xì)胞或血小板計數(shù)、血糖水 平或體重，而白細(xì)胞或血小板計數(shù)、血糖水平或體重在所有db/db小鼠組中都相比非糖尿 病BLKS小鼠而言顯著升高(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，mN0X-E36-3' PEG增加了 IK db/db 小鼠中的CCL2血清水平，這表明CCL2拮抗劑使CCL2保留在循環(huán)中(圖44)。與我們的假 設(shè)相一致，與經(jīng)PoC-PEG或媒介物治療的db/db小鼠相比較，mN0X-E36-3，PEG使腎小球巨 噬細(xì)胞的數(shù)目顯著減少了 40%，這與在經(jīng)mN0X-E36-3，PEG治療的db/db小鼠的腎小球內(nèi) Ki-67陽性增殖性細(xì)胞數(shù)目較低相關(guān)(圖45)。這些發(fā)現(xiàn)與IK db/db小鼠中總體糖尿病性 腎小球硬化的顯著改善有關(guān)(圖46)。實際上，mN0X-E36-3，PEG治療使IK db/db小鼠中的 糖尿病性腎小球硬化減輕至在年齡相當(dāng)?shù)奈唇?jīng)腎切除的(“2K" )db/db小鼠中所存在的 腎小球硬化的程度(圖46)。這些發(fā)現(xiàn)顯示，由mN0X-E36-3，PEG引起的CCL2-依賴性腎小 球巨噬細(xì)胞募集的延遲阻斷可在2型糖尿病db/db小鼠中預(yù)防總體糖尿病性腎小球硬化。mN0X-E36-3，PEG 改善 了 IK db/db 小鼠中的 GFRmN0X-E36_3，PEG治療對于IK db/db小鼠中的糖尿病性腎小球硬化的有益效果應(yīng)當(dāng)與更好的GFR相關(guān)。我們在db/db小鼠中分析了作為GFR的標(biāo)志的FITC-菊粉清除動力 學(xué)(Qi 2004)。與db/db小鼠中正常的大約250ml/分鐘的GFR(Qi 2004)相比較，我們發(fā)現(xiàn) 在注射了 PoC-PEG的6個月大的IK db/db小鼠中GFR降低為112士23ml/分鐘(圖47)。 mN0X-E36-3，PEG 治療在 IK db/db 小鼠中將 GFR 顯著改善至 231 士30ml/分鐘(p < 0. 001)， 這暗示阻斷CCL2-依賴性腎小球巨噬細(xì)胞募集也可以改善2型糖尿病小鼠中的腎功能。mN0X-E36-3' PEG減少了 lKdb/db小鼠中的間質(zhì)巨噬細(xì)胞計數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷人的晚期糖尿病性腎病與顯著數(shù)量的間質(zhì)巨噬細(xì)胞和腎小管間質(zhì)損傷相關(guān) (Bohle 1991)。在2K db/db小鼠中，間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤物和顯著的腎小管間質(zhì)損傷不在8 月齡之前出現(xiàn)(Chow 2007)。在db/db小鼠中，早期單側(cè)腎切除術(shù)加速了腎小管間質(zhì)病理學(xué) 的發(fā)展(NiniChuk2005)，因而我們對間質(zhì)巨噬細(xì)胞、腎小管擴張和間隙體積進(jìn)行定量以作 為6月齡的所有組的小鼠中腎小管間質(zhì)損傷的標(biāo)志。在這時，與2K db/db小鼠相比較，1K db/db小鼠顯示出間質(zhì)巨噬細(xì)胞的數(shù)目增加以及腎小管擴張和間隙體積顯著升高(圖45， 圖48)。mN0X-E36-3，PEG治療使IK db/db小鼠中的間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)目減少了 53%，而且 還減少了腎小管擴張和間隙體積(圖45，圖48)。因此，阻斷CCL2-依賴性腎巨噬細(xì)胞募集 還可預(yù)防2型糖尿病db/db小鼠中的腎小管間質(zhì)損傷。mN0X-E36-3' PEG 減少了 IK db/db 小鼠中 Ccl2 的腎表達(dá)巨噬細(xì)胞浸潤物增強了組織損傷中的炎癥應(yīng)答，例如局部的CCL2表達(dá)。因此，我 們假定，腎巨噬細(xì)胞的與mN0X-E36-3’ PEG相關(guān)的減少應(yīng)該與較低的腎CCL2表達(dá)有關(guān)。我 們利用實時RT-PCR來定量db/db小鼠中CCL2的mRNA表達(dá)。與年齡相當(dāng)?shù)慕?jīng)PoC-PEG治 療的小鼠相比較，mN0X-E36-3，PEG減少了 6個月大的IK db/db小鼠腎臟中的CCL2的mRNA 水平(圖49)。為了進(jìn)一步評估CCL2的空間表達(dá)，我們在腎切片上進(jìn)行了對于CCL2蛋白質(zhì) 的免疫染色。與2K db/db小鼠或2K野生型小鼠相比較，在IK db/db小鼠中，CCL2的表達(dá) 在腎小球、腎小管和間質(zhì)細(xì)胞中明顯提高(圖50)。與經(jīng)媒介物或PoC-PEG治療的IK db/ db小鼠相比較，mN0X-E36-3’ PEG明顯減少了在所有這些區(qū)室中的CCL2染色。這些數(shù)據(jù)表 明，用mN0X-E36-3，PEG阻斷CCL2-依賴性腎巨噬細(xì)胞募集減少了 lKdb/db小鼠中CCL2的 局部表達(dá)?？偨Y(jié)炎癥促進(jìn)人糖尿病性腎病的發(fā)展這一概念逐漸變得為人所接受(Tuttle 2005)， 這使得MCP-1/CCL2作為潛在的靶來治療該疾病成為焦點。在該實施例中，我們已經(jīng)顯 示，用mN0X-E36-3’ PEG治療經(jīng)單側(cè)腎切除的糖尿病小鼠在6月齡時減少了腎小球(和間 質(zhì))的巨噬細(xì)胞數(shù)目，這與較少的增殖性腎小球細(xì)胞相關(guān)。另外，用mN0X-E36-3’ PEG治 療使CCL2mRNA的腎/腎小球表達(dá)明顯減少。此外，治療組中較少數(shù)目的腎小球巨噬細(xì)胞 和腎小球增殖性細(xì)胞與保護(hù)免于總體腎小球硬化以及與顯著改善的腎小球濾過率有關(guān)。 mN0X-E36-3’ PEG對于糖尿病小鼠中的腎小球病理學(xué)和腎功能的有益效果與在其他腎小球 損傷模型中使用其他CCL2拮抗劑的那些研究(Lloyd 1997, Hasegawa 2003，Tang 1996， ffenzel 1997，F(xiàn)ujinakal997, Schneider 1999)相一致。引人注意的是，CCL2 阻斷的延遲 發(fā)生也減少了 IK db/db小鼠中的間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)目，這與較少的腎小管間質(zhì)病理學(xué)相關(guān)?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實了 CCL2為具有前景的用于糖尿病性腎病的治療靶，并暗示了 用鏡像異構(gòu)體起始CCL2阻斷(即使在疾病的晚期)仍然具有保護(hù)作用。
實施例10 :mN0X-E36-3' -PEG允許環(huán)磷酰胺的劑量減少，以控制MRLlp〃lpir小鼠中 的彌漫性增生性狼瘡腎炎和肺炎人彌漫性增生性狼瘡腎炎(縮寫DPLN)的控制需要用環(huán)磷酰胺(縮寫CYC)或麥 考酚酸酯(縮寫MMF)的有效免疫抑制。2種藥品各自與顯著發(fā)病率和死亡率相關(guān)(Appel 2007)。大多數(shù)嚴(yán)重不良事件和死亡涉及由于CYC和MMF的非特異性免疫抑制作用的感染 (Appel 2007)。特異性阻斷自身免疫炎癥的新型藥品可能允許減少目前治療方案的毒性， 通過替換CYC和MMF或通過在組合中使用時允許顯著劑量減少。實驗研究已揭示MCP-1及其受體CCR2在自身免疫組織損害例如全身性紅斑狼瘡 (縮寫SLE)的表現(xiàn)中具有關(guān)鍵作用(Gerard 2001)；例如，已證實具有實驗性SLE的MCP-1 或0^2缺陷的1 1；1^11":小鼠受保護(hù)以免0 1^( 6儀2 2005 ；Tesch 1999)。用抗MCP-1鏡像 異構(gòu)體mN0X-E36-3’-PEG作為單一療法的MCP-1阻斷的有利作用已在體內(nèi)用雌性MRLlpirApir 小鼠得到證實；從14周大開始用mN0X-E36-3，-PEG處理10周顯著改善DPLN，如實施例9中 所示。盡管療效是明確顯著的，但仍不明了與CYC或MMF的功效相比較，mN0X-E36-3’ -PEG 的功效如何。為了評估與完全劑量CYC等價的療效——這有效抑制免疫系統(tǒng)——也可以用 低劑量CYC加上mN0X-E36-3’ -PEG的組合來達(dá)到，執(zhí)行第二種體內(nèi)研究。動物和實驗方案從Harlan ffinkelmann (Borchen, Germany)獲得 7 周齡的雌性 MRLlpr/lpir 小鼠，并 將其以12小時的光照和黑暗循環(huán)保持在正常居住條件下?？梢噪S意獲得水和標(biāo)準(zhǔn)食物 (Ssniff，Soest，Germany)。從14周齡開始，小鼠如下注射10周(A)，5%葡萄糖s. c.(媒 介物組)；(B),0. 89umol/kg PEG 化的對照鏡像異構(gòu)體 revmN0X-E36s. c. ； (C),0. 89umol/ kg mN0X-E36-3，-PEG s. c. ； (D)，30mg/kg/4 周 CYC i. p. (CYC 低)；(E)，30mg/kg/ 周 CYC i. p. (CYC 高)；(F), 0. 89 u mol/kg mN0X-E36_3，-PEG 加上 30mg/kg/4 周 CYC (組合)和(G)， 100mg/kg/天MMF 口服(Roche，Mannheim, Germany)。所有媒介物或鏡像異構(gòu)體注射給予 3x/周。在10周處理結(jié)束時，通過頸脫位法處死小鼠。所有實驗操作根據(jù)德國動物管理和 倫理法來執(zhí)行并且得到當(dāng)?shù)卣?dāng)局批準(zhǔn)。全身性狼瘡的評估計算出脾和腸系膜淋巴結(jié)團塊(bulk)與總體重的重量比作為與狼瘡相關(guān)的淋巴 組織增生綜合征的標(biāo)志。如以前所描述的(PaWar2006)測定尿白蛋白/肌酸酐比率。將來 自所有小鼠的腎臟和肺在10%緩沖的福爾馬林中固定，處理，并包埋于石蠟中。按照常規(guī) 方案制備用于高碘酸-希夫染色的5-ym切片(Anders 2002)。使用如關(guān)于人狼瘡腎炎所 描述的活性指數(shù)和慢性指數(shù)(Austin 1984)對腎臟損害的嚴(yán)重度進(jìn)行分級。由不知情觀察 者將支氣管周圍炎癥的嚴(yán)重度半定量地分級為0-4。如以前描述的(Anders 2002)進(jìn)行免 疫染色。使用下列一抗大鼠抗_Mac2(巨噬細(xì)胞，Cederlane，Ontario，Canada，1 50)、 抗-小鼠⑶3(1 100，克隆500A2，BD)。陰性對照包括與相應(yīng)的同種型抗體一起孵育。計 數(shù)在15個皮質(zhì)腎小球/切片中的腎小球細(xì)胞。通過高倍視野(縮寫hpf)計數(shù)間質(zhì)細(xì)胞。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值士平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。組之間的比較用單變量AN0VA來完 成。將Posthoc Bonferroni校正用于多重比較。p < 0. 05的值被認(rèn)為是表明了統(tǒng)計學(xué)顯著性。
用mN0X-E36-3，-PEG的添加(Add-on)療法改善每月CYC對MRLlp〃lpir小鼠的腎疾 病的作用雌性MRLWllff小鼠發(fā)展類似于人中的DPLN的增生性免疫復(fù)合物腎小球腎炎。 MRLlpr/lpr小鼠從14周齡到24周齡用CYC、MMF、鏡像異構(gòu)體或媒介物進(jìn)行處理。這代表治療 性處理方案，因為在14周齡時，MRLlp〃1Iff小鼠顯示具有活性得分指數(shù)4. 1 士 1. 1的DPLN。在 這個年齡時，不存在小管間質(zhì)性區(qū)室的主要畸形(未顯示)。在處理10周后，媒介物和對照 鏡像異構(gòu)體處理的小鼠揭示DPLN伴隨腎小球細(xì)胞過多、腎小球基質(zhì)擴張、局灶性 簇壞死(focal tuftnecrosis)以及混合的腎小球外周和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤。每周CYC和 每月CYC加上mN0X-E36-3’ -PEG在改善狼瘡腎炎的活性和慢性指數(shù)中是同等有效的(圖 51A和51B)。mN0X-E36和單獨的低劑量CYC以及MMF較不有效，但仍顯著改善狼瘡腎炎的 活性和慢性指數(shù)。因此，將mN0X-E36-3’ -PEG加入基于每月CYC的方案中對于MRLWlpir小 鼠的DPLN與每周CYC治療一樣有效。mN0X-E36和每月CYC對MRLWlpir小鼠的腎中的免疫細(xì)胞浸潤的減少具有累加作用免疫細(xì)胞浸潤促成狼瘡腎炎中的腎損傷(Vielhauer 2006)，并且MCP-1介導(dǎo)T細(xì) 胞和巨噬細(xì)胞召募至MRLWlpi:小鼠(Tesch 1999)。因此假定mN0X-E36_3，-PEG/每月CYC 組合的累加作用可能涉及小鼠中受損的巨噬細(xì)胞和間質(zhì)T細(xì)胞召募。腎小球和間 質(zhì)巨噬細(xì)胞和間質(zhì)T細(xì)胞(Mac2+巨噬細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞)通過免疫染色的評估揭示每周 CYC和每月CYC加上mN0X-E36在減少MRLlp〃lpr小鼠的腎臟中的腎小球以及間質(zhì)Mac2+巨噬 細(xì)胞數(shù)目中是同等有效的(圖51C和51D)。mN0X-E36-3，-PEG和單獨的每月CYC以及MMF 較不有效，但仍顯著減少2個區(qū)室中的巨噬細(xì)胞(圖51C和51D)。對于間質(zhì)⑶3陽性T細(xì) 胞數(shù)目同樣發(fā)現(xiàn)這點(圖3E)。因此，mN0X-E36-3，-PEG和每月CYC對MRLWlpr小鼠的腎 病理學(xué)的累加作用與間質(zhì)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞以及腎小球巨噬細(xì)胞的顯著減少相關(guān)，這類似 于每周CYC的作用。mN0X-E36-3' -PEG和每月CYC對MRLWlpir小鼠中的肺損傷的減少具有累加作用自身免疫支氣管周炎是MRL1-11"小鼠中的狼瘡樣全身性自身免疫的另一種表 現(xiàn)。每周CYC在控制MRLlpiVl1"小鼠中的肺損傷中比每月CYC更有效。然而，每月CYC加上 mN0X-E36與每周CYC —樣有效(圖52)。令人驚訝的是，MMF對MRLWlpir小鼠中的肺損傷 沒有作用。總結(jié)數(shù)據(jù)證實在14周齡時(當(dāng)自身免疫組織損傷已建立的時間點(Tesch 1999 ； Perez 2001))起始的mN0X_E36和低劑量CYC處理的組合在抑制MRLlpir"pir小鼠中的DPLN和 肺損傷中與高劑量CYC —樣有效?？傊?，與CYC組合的MCP-1的抑制允許顯著的CYC劑量 減少，這避免CYC的嚴(yán)重免疫毒性作用，盡管等效控制自身免疫組織損傷如DPLN。這個新型 概念可能幫助減少具有DPLN和自身免疫疾病的潛在其他嚴(yán)重表現(xiàn)的患者中的嚴(yán)重和潛在 威脅生命的CYC毒性，所述自身免疫疾病牽涉MCP-1依賴性免疫細(xì)胞浸潤。實施例11 :C0PD篩選研究——通過用結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’-PEG 處理減少到肺內(nèi)的細(xì)胞浸潤慢性呼吸道疾病的異質(zhì)群體包括慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病(縮寫C0PD) 和哮喘。來自受C0PD和哮喘影響的患者的肺組織學(xué)顯示巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的顯著氣道浸
88潤，在COPD中主要是嗜中性白細(xì)胞并且在哮喘中主要是嗜酸性粒細(xì)胞。在臨床研究中，這 些炎癥參數(shù)已顯示與肺功能中的減少和對于非特異性刺激擴大的支氣管收縮(氣道高反 應(yīng)性[縮寫AHR])相關(guān)。少數(shù)體內(nèi)模型模仿COPD的慢性炎癥，提供經(jīng)過許多天的肺功能檢 查，并且刺激與嗜中性白細(xì)胞增多癥和AHR相關(guān)的粘液分泌過多。已顯示大鼠/人單次暴 露于脂多糖(縮寫LPS)引起急性肺嗜中性白細(xì)胞增多癥和AHR。LPS的吸入引起與COPD 類似的進(jìn)一步特征，即肺功能中的進(jìn)行性下降、持續(xù)AHR、和支氣管肺泡液體中的嗜中性炎 癥細(xì)胞群體、連同一氧化氮生產(chǎn)過剩。衍生自炎癥細(xì)胞激活、召募和LPS的介質(zhì)被認(rèn)為誘導(dǎo) 上皮增殖、通透性和粘液高酸分泌性表型。在這篇報告中描述的研究中，使用細(xì)菌LPS的攻擊模型用于評估結(jié)合MCP-I的鏡 像異構(gòu)體mN0X-E36-3’-PEG在LPS誘導(dǎo)的大鼠肺炎癥模型中的療效。所有動物用LPS進(jìn)行 攻擊用于誘導(dǎo)急性呼吸道炎癥。執(zhí)行用結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’ -PEG、地塞 米松(藥理學(xué)參考物質(zhì)1)和羅氟司特(藥理學(xué)參考物質(zhì)2)以不同劑量的治療干預(yù)。
地塞米松是類固醇激素的糖皮質(zhì)激素類別的有效合成成員。它充當(dāng)抗炎劑以及免 疫抑制劑(I)，抗炎糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)脂皮質(zhì)素-1 (膜聯(lián)蛋白-1)合成，這隨后與細(xì)胞膜結(jié) 合，阻止磷脂酶2與其底物花生四烯酸接觸；這導(dǎo)致減少的類花生酸產(chǎn)生。環(huán)加氧酶(C0X-1 和C0X-2)表達(dá)也得到抑制，使該效應(yīng)成為可能。換言之，炎癥中的2種主要產(chǎn)物——前列 腺素和白三烯受糖皮質(zhì)激素作用的抑制。糖皮質(zhì)激素也刺激脂皮質(zhì)素-1逸出至細(xì)胞外間 隙，其中它與白細(xì)胞膜受體結(jié)合，并且抑制各種炎癥事件上皮粘附，遷出，趨化現(xiàn)象，噬菌 作用，呼吸爆發(fā)，以及各種炎癥介質(zhì)從嗜中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞中的釋放(溶酶 體酶、細(xì)胞因子、組織型纖溶酶原激活物、趨化因子等)。(II)，免疫抑制糖皮質(zhì)激素抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。它們通過抑制許多細(xì)胞因子 基因發(fā)揮作用，其中最重要的是IL-2基因，這因此減少T細(xì)胞增殖。除阻止T細(xì)胞增殖外， 另一種眾所周知的效應(yīng)是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的凋亡。該效應(yīng)在仍駐留在胸腺中的幼T細(xì)胞中 更顯著，但也影響外周T細(xì)胞。最后，糖皮質(zhì)激素抑制體液免疫，促使B細(xì)胞表達(dá)更少量的 IL-2和IL-2受體。這減少B細(xì)胞克隆擴增和抗體合成。減少量的IL-2還引起更少的T淋 巴細(xì)胞被激活。羅氟司特是充當(dāng)磷酸二酯酶PDE-4的選擇性、長效抑制劑的藥品。它具有抗炎作 用并且處于作為用于治療肺的炎癥病狀的口服施用藥品的開發(fā)中，所述肺的炎癥病狀例如 哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺氣腫。雖然發(fā)現(xiàn)羅氟司特在臨床試驗中有效，但它產(chǎn)生幾種劑 量限制性副作用，包括惡心、腹瀉和頭痛，并且繼續(xù)嘗試開發(fā)，以使副作用的發(fā)生降到最低 同時保留臨床功效。動物和飼養(yǎng)在這個研究以及建立的LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中使用雄性SpragueDawley大鼠。大 鼠通過 Harlan ffinkelmann, Borchen, Germany 以 5 周齡(約 80-1 IOg)供應(yīng)，并且在 7 周 齡時開始研究。動物圈養(yǎng)在Makrolon (聚碳酸酯)籠(2只大鼠/籠)中，并且在常規(guī) 實驗室條件下維持?；\和軟木墊(softwood bedding)材料(Ssniff 3/4，Soest，Germany) 每周更換2次。電子監(jiān)控動物室的溫度和相對濕度，并且在連續(xù)基礎(chǔ)上記錄。限制對于 溫度設(shè)為22 士 2 °C，并且對于相對濕度設(shè)為55 士 15 %。12小時黑暗/光照循環(huán)用于通過自動定時裝置的光調(diào)節(jié)。作為飲食使用以丸劑形式的商品化食物(Ssniff R/M-H V1534， Ssniff'SpeziaIdiateil,Soest,Germany)?？刹皇芟拗频財z取食物和飲用水(Stadtwerke Hannover)。在隨機化和第一次致敏前，允許動物調(diào)整并且變得適應(yīng)實驗室的環(huán)境2周。在該 研究中使用的動物未顯示其健康狀況的任何下降征兆。所有動物在其籠中每天進(jìn)行觀察。材料結(jié)合MCP-1 的鏡像異構(gòu)體 mN0X-E36-3’ PEG用于mN0X-E36-3’ -PEG的媒介物用于灃射用涂的5%葡萄糖溶液LPS 來自大腸埃希桿菌(Escherichia coli)0111 :B4 的脂多糖(Sigma/Aldrich， 批號76K4085)。工作溶液在應(yīng)用當(dāng)天時新鮮制備。藥理學(xué)參考物質(zhì)(1)地塞米松二氫化磷酸(dihydrogenphosphat)鈉溶液， Ratiopharm批號H224164mg/mL溶液。母液在打開后在冰箱中貯藏7天。工作溶液在應(yīng)用 當(dāng)天時新鮮制備。藥理學(xué)參考物質(zhì)(2)羅氟司特(選擇性PDE4抑制劑，批號K429927)。工作溶液 在應(yīng)用當(dāng)天時新鮮制備。用于地塞米松的媒介物DulbeCC0，s磷酸鹽緩沖鹽水(縮寫DPBS) -0. 0095M(P04) 不含Ca++禾口 Mg++研究的執(zhí)行所有動物在其第一次致敏前進(jìn)行稱重和隨機化考慮到其重量，將它們平等地分 配至各10只動物的組。在分配至組后，檢查平均體重的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(士SD)，并且在每 個組內(nèi)以及在組之間低于20%。動物的體重個別進(jìn)行測量且記錄。在研究第1天時，通過吸入執(zhí)行LPS攻擊，導(dǎo)致約2. 93 ii g LPS的沉積劑量。在 LPS攻擊前(陽性對照)或清潔空氣攻擊(陰性對照)1小時，陽性和陰性對照組的動物用 媒介物(5%葡萄糖)進(jìn)行i. v.處理。藥理學(xué)對照(1)中的動物在LPS攻擊前18和1小時 i.p.接受2mg/kg地塞米松；藥理學(xué)對照(2)中的那些動物胃內(nèi)接受600 yg羅氟司特/動 物。使用結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’-PEG的處理在LPS攻擊前1小時通過靜脈 內(nèi)注射以 4 個不同劑量完成(0. 02mg/kg ；0. 2mg/kg ；2mg/kg ；20mg/kg)。攻擊后24小時，用過量戊巴比妥鈉無痛處死動物，并且收集支氣管肺泡灌洗(縮 寫B(tài)AL)。動物的肺灌洗5次，每次用5. 0ml冰冷的0. 9% NaCl。對于BAL的評估，第一次灌 洗的上清液在通過離心使細(xì)胞沉降后進(jìn)行等分。這之后，合并來自所有灌洗的細(xì)胞，并且在 收集后緊接著進(jìn)行離心(以1，200U/分鐘10分鐘)。使細(xì)胞重懸浮于lmLPBS中，并且在 Casyd細(xì)胞計數(shù)器中自動計數(shù)。根據(jù)Pappenheim制備細(xì)胞斑點(Cytospots)且染色，以 評估細(xì)胞分類計數(shù)。通過計數(shù)400細(xì)胞的總數(shù)目/細(xì)胞斑點分析肺中的炎癥狀態(tài)，包括巨 噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目。統(tǒng)計方法為了檢驗組之間的顯著差異，使用非參數(shù)檢驗。對于多重比較(> 2個組)，執(zhí)行 Anova檢驗和非參數(shù)Durmett檢驗。具有p < 0. 05的差異視為顯著性的。結(jié)果如預(yù)期的，與陽性對照組相比較，BAL中的總細(xì)胞數(shù)目在陰性對照組中明顯減少。用20mg/kg結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3，-PEG的處理導(dǎo)致陽性對照組在BAL中 41 %的總細(xì)胞數(shù)目顯著減少。使用地塞米松的處理誘導(dǎo)71 %的細(xì)胞數(shù)目減少，而羅氟司特 未顯示任何顯著作用(參見圖53A)。吸入LPS攻擊誘導(dǎo)通過BAL中71. 8%的嗜中性白細(xì)胞粒細(xì)胞的嗜中性白細(xì)胞增多 癥表示的肺中的炎癥。在陰性對照組中未經(jīng)處理的動物的肺灌洗液不包含任何嗜中性白細(xì) 胞粒細(xì)胞。使用地塞米松和2或20mg/kg結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3，-PEG的處 理導(dǎo)致顯著減少的嗜中性白細(xì)胞數(shù)目。2mg/kg mN0X-E36-3’ -PEG已使嗜中性白細(xì)胞數(shù)目 減少約42%，并且20mg/kg mN0X-E36-3，-PEG導(dǎo)致約48%的嗜中性白細(xì)胞減少。與陽性對 照組相比較，羅氟司特處理不影響支氣管肺泡灌洗中的嗜中性白細(xì)胞的絕對和相對量(參 見圖53B)。結(jié)論關(guān)于BAL中的不同細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果正面證實在肺中急性LPS誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答的誘 導(dǎo)。LPS攻擊的大鼠用地塞米松的治療性處理顯示在暴露于LPS后顯著阻止炎癥應(yīng)答。對 于用結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’-PEG處理的動物也獲得顯著的療效?；谌绫?文顯示的數(shù)據(jù)，結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體具有在慢性呼吸道疾病優(yōu)選C0PD的治療中使用的 潛力，單獨或在聯(lián)合療法中，優(yōu)選在與地塞米松的聯(lián)合療法中。結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體與 地塞米松的聯(lián)合療法利用2種獨立的作用方式，以便治療慢性呼吸道疾病例如C0PD。實施例12 結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36在實驗性肺高壓中的作用完成如本文所描述的研究，以便測定結(jié)合MCP-1的鏡像異構(gòu)體mN0X_E36對大鼠中 建立的野百合堿誘導(dǎo)的肺高壓模型中的血液動力學(xué)和重塑的作用。肺動脈高壓(縮寫PAH)通過在靜止時平均肺動脈壓> 20mmHg的升高、血管重塑 和右心室肥大進(jìn)行限定。特發(fā)性PAH也稱為原發(fā)性肺高壓(縮寫PPH)通常出現(xiàn)在年輕女性 中，如果未治療，導(dǎo)致在3年內(nèi)由于右心衰竭的死亡。該疾病嚴(yán)重度的關(guān)鍵是肺血管重塑， 特征在于肺動脈平滑肌細(xì)胞(縮寫PASMC)的增殖和遷移。在PAH的晚期也可以觀察到新 生內(nèi)膜損害，作為內(nèi)皮細(xì)胞增殖的結(jié)果。所觀察到的病理狀態(tài)是潛在自身永存的，具有在疾 病進(jìn)展中發(fā)揮作用的生長因子和炎癥介質(zhì)的同時失調(diào)。作為肺高壓的嚙齒類模型的野百合堿這個模型成功地預(yù)測了用于臨床肺高壓的所有現(xiàn)代治療的臨床結(jié)果，包括類前列 腺素、磷酸二酯酶抑制劑和內(nèi)皮素受體拮抗劑。此外，它提供用于PAH的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)研究的 機會。在野百合堿模型中，大鼠被給予雙吡咯烷類生物堿毒素野百合堿的單次皮下注射。該 毒素產(chǎn)生炎癥肺血管病，在3-4周后導(dǎo)致顯著的肺高壓。關(guān)于這個模型的讀數(shù)包括右心室 壓、全身壓力、右心室/左心室+隔膜重量比率(RV/[LV+S])和肺血管重塑。動物從 Charles River Laboratories (SulzfeId, Germany)獲得成年雄性 Sprague Dawley 大鼠(300_350g 體重)。根據(jù) National Institutesof Health Guidelines on the Use of Laboratory Animals 執(zhí)行實驗。實驗方案生命內(nèi)(In-life)操作將野百合堿(縮寫MCT ；Sigma,Deishofen)溶解于1M HC1 中，用NaOH調(diào)整至pH 7. 4，并且如所述的以60mg/kg體重的劑量作為單次皮下注射進(jìn)行施用。對照大鼠接受等體積的等滲鹽水。對于慢件干預(yù)件研究，將灃射MCT的大鼠隨機化，以通過皮下注射接受作為安慰 劑的5%葡萄糖(η = 10)或結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36_3，-PEG (對于2和20mg/ kg的2種劑量分別為η = 10)，每周3次。處理在注射MCT后3周(當(dāng)預(yù)期肺高壓完全建 立時的時間點)起始。動物被處理另外2周的持續(xù)時間，即總共6次注射。在第35天時， 測定血液動力學(xué)參數(shù)且制備組織。血液動力學(xué)對干血液動力學(xué)參數(shù)的測量，俥大鼠麻醉。然后，大鼠接受阿托品的 i.m.注射(250 μ g/kg體重)，以使制備期間的血管迷走神經(jīng)副作用降到最低。使大鼠切開 氣管并且用60/分鐘頻率通風(fēng)。呼氣末正壓設(shè)為Icm H20。左頸動脈插入套管用于動脈壓 監(jiān)控，并且通過右頸靜脈插入右心導(dǎo)管，用于由流體填充力傳感器測量右心室壓。組織制備在放血后，肺用等滲鹽水以22cm H20的恒壓經(jīng)由肺動脈進(jìn)行沖洗。右 肺在門處進(jìn)行結(jié)扎，在液氮中速凍，并且貯藏于-80°C ；左葉用Zamboni’ s固定劑以22cm H20的壓力經(jīng)由肺動脈灌注5分鐘。使組織在福爾馬林(4% )中在4°C下固定12小時，并 且隨后轉(zhuǎn)移到0. IM磷酸鹽緩沖液內(nèi)。右側(cè)心臟肥大評估為了評估右心室肥大，取出心臟且切開。計算出右心室重量與 左心室加上隔膜重量的比率RV/(LV+S)。統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)作為平均值士SEM給出。對于多重比較，組之間的差異通過ANOVA和 Student-Newman-Keuls事后檢驗進(jìn)行評估。結(jié)果如預(yù)期的，與健康動物相比較，MCT/安慰劑處理的動物顯示右側(cè)心臟肥大中明顯 和統(tǒng)計上顯著的增加。然而，MCT/安慰劑處理的動物顯示約0. 61的RV/(LV+S)，健康大鼠 僅具有約0. 23。結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3’ -PEG代替安慰劑的施用導(dǎo)致對于 2mg/kg MCT處理的動物約0. 39的顯著減少的右側(cè)心臟肥大，并且對于20mg/kg mN0X-E36 約0. 45 (參見圖54A)。與右側(cè)心臟肥大相一致，在MCT/安慰劑處理的大鼠中所測量的右心室收縮壓增 至69mmHg (健康動物，29mmHg)。用結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36_3，-PEG代替安慰劑 的處理導(dǎo)致對于2mg/kg mN0X-E36-3，PEG約46mmHg的顯著減少的右心室收縮壓，并且對于 20mg/kg mN0X-E36-3，PEG 約 49mmHg (圖 54B)。結(jié)論在MCT/安慰劑處理的大鼠中關(guān)于右側(cè)心臟肥大和右心室收縮壓的結(jié)果正面證實 通過MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓。結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體mN0X-E36-3，-PEG對MCT處理的大鼠 的施用顯著阻止右側(cè)心臟肥大和右心室收縮壓。因此，結(jié)合MCP-I的鏡像異構(gòu)體是用于治 療肺高壓的有希望的試劑。參考文獻(xiàn)如果未表明與此相反，本文所引用的文獻(xiàn)的完整參考文獻(xiàn)資料(其公開內(nèi)容通過 提及合并)如下Akahoshi T，Wada C，Endo H，Hirota K，Hosaka S，Takagishi K，Kondo H， Kashiwazaki S，Matsushima K(1993). Expression ofmonocyte chemotactic and
92activating factor in rheumatoid arthritis. Regulation of its production in synovial cells by interleukin—1 andtumor necrosis factor. Arthritis Rheum. 36 762Alam R,York J，Moyars M，Stafford S，Grant JA,Lee J，F(xiàn)orsythe P，Sim T，Ida N(1996). Increased MCP—l， RANTES, andMIP-1a in bronchoalveolar lavage fluid of allergic asthmaticpatients. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153 :1398Altschul SF，Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ(1990)，Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215(3) :403-10.Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z， MillerW, Lipman DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST :a newgeneration of protein database search programs. Nucleic Acids Res. Sep 1 ；25 (17) :3389_402.Amann B，Tinzmann R，Angelkort B (2003). ACE inhibitorsimprove diabetic nephropathy through suppression of renal MCP-1. Diabetes Care 26:2421Anders HJ,Vielhauer V Frink M,Linde Y,Cohen CD,BlattnerSM,Kretzler M， Strutz F，Mack M，Grone HJ，Onuffer J，Horuk R，Nelson PJ，Schl6ndorff D (2002). A chemokine receptor CCR-1antagonist reduces renal fibrosis after unilateral ureter ligation. J. Clin. Invest. 109 :251Anders HJ, Vielhauer V, Schlondorff D (2003). Chemokines andchemokine receptors are involved in the resolution or progression ofrenal disease. Kidney Int. 63 401Appel G，Dooley MA, Ginzler EM, Isenberg D，Jayne D，Solomons N，Wolfs D. (2007). Mycophenolate mofetil compared withintravenous cyclophosphamide as induction therapy for lupusnephritis :Aspreva Lupus Management Study(ALMS) results. J AmSoc Nephrol 18 :SA_FC057[abstract]Aurup H Tuschl T，Benseler F，Ludwig J,Eckstein F. (1994). Oligonucleotide duplexes containing 2 ' -amino-2 ' -deoxycytidines thermal stability and chemical reactivity. Nucleic Acids Res 22:20Austin HA 3rd， Muenz LR, Joyce KM, Antonovych TT， Balow JE (1984). Diffuse proliferative lupus nephritis -identification ofspecific pathologic features affecting renal outcome. Kidney Int. 25 :689Austin HA III， Klippel JH, Balow JE,等 A Therapy of lupusnephritis controlled trial of prednisone and cytotoxic drugs. (1986)N Engl J Med 314 614-619.Baggiolini M(1998) Chemokines and leukocyte traffic. Nature392 565Baggiolini M，Dewald B，Moser B. (1994). Interleukin-8 andrelated chemotactic cytokines-CXC and CC chemokines. Adv. Immunol. 55 97Banba N, Nakamura T, Matsumura M, Kuroda H, Hattori Y, Kasai K(2000). Possible relationship of monocyte chemoattractantprotein—1 with diabetic nephropathy. Kidney Int. 58 :684
Banisor I，Leist TP，Kalman B (2005) Involvement of ^ -chemokines in the development of inflammatory demyelination. J. Neuroinflammation 2:7Bazan JF，Bacon KB，Hardiman G, Wang W,Soo K，Rossi D，Greaves DR，Zlotnik A，Schall TJ (1997). A new class ofmembrane-bound chemokine with a CX3C motif. Nature 385 :640Berkhout TA(1997). J Biol Chem 272 16404Bohle A,Wehrmann M，Bogenschutz 0，Batz C，Muller CA，Muller GA(1991). The pathogenesis of chronic renal failure indiabetic nephropathy. Investigation of 488 cases of diabeticglomerulosclerosis. Pathol. Res. Pract. 187 251Boring L，Gosling J，Chensue SW，Kunkel SL，F(xiàn)arese RV Jr,Broxmeyer HE,Charo IF(1997). Impaired monocyte migration andreduced type 1 (Thl)cytokine responses in C-C chemokine receptor 2knockout mice. J. Clin. Invest. 100 :2552Boring L，Gosling J，Cleary M，Charo IF (1998). Decreased lesionformation in CCR2-/-mice reveals a role for chemokines in theinitiation of atherosclerosis. Nature 394:894Boring L, Gosling J, Monteclaro FS, Lusis AJ, Tsou CL, CharoIF(1996). Molecular cloning and functional expression of murine JE (monocyte chemoattractant protein 1)and murine macrophageinflammatory protein lalpha receptors :evidence for two closelylinked C_C chemokine receptors on chromosome 9. J. Biol. Chem. 271 7551Bossink AW Paemen L,Jansen PM Hack CE Thijs LG,VanDamme J(1995). Plasma levels of the chemokines monocytechemotactic proteins—1 and_2 are elevated in human sepsis. Blood86 :3841Boumpas DT， Austin HA III， Fessler BJ, Balow JE, Klippel JH, Lockshin MD. Systemic lupus erythematosus :emerging concepts (1995).Part I. Renal， neuropsychiatric, cardiovascular, pulmonary, and hematologic disease. Ann Intern Medl22 :940-950.Boumpas DT，Austin HA III,Vaughn EM，等人(1992)Controlledtrial of pulse methylprednisolone versus two regimens of pulsecyclophosphamide in severe lupus nephritis. Lancet 340 :741_745.Bower G, Brown DM, Steffes MW, Vernier RL, Mauer SM(1980). Studies of the glomerular mesangium and thejuxtaglomerular apparatus in the genetically diabetic mouse. Lab. Invest. 43 :333Charo IF, Myers SJ，Herman A，F(xiàn)ranci C, Connolly AJ, CoughlinSR(1994). Molecular cloning and functional expression of twomonocyte chemoattractant protein 1 receptors reveals alternativesplicing of the carboxyl-terminal tails. Proc. Natl Acad. Sci. USA91 2752Chow F，Ozols E，Nikolic-Paterson DJ，Atkins RC，Tesch GH(2004). Macrophages in mouse type 2 diabetic nephropathy Correlation with diabetic state and progressive renal injury.Kidneylnt. 65 116
Chow FY, Nikolic-Paterson DJ, Ma FY, Ozols E, Rollins BJ, Tesch GH(2007). Monocyte chemoattractant protein—l—induced tissueinflammation is critical for the development of renal injury but nottype 2 diabetes in obese db/db mice. Diabetologica 50 :471Chow FY， Nikolic-Paterson DJ，Ozols E，Atkins RC，Rollin BJ，Tesch GH(2006). Monocyte chemoattractant protein-1 promotes thedevelopment of diabetic renal injury in streptozotoein-treated mice. Kidney Int. 69 :73Cockwell P, Howie AJ, Adu D, Savage C0(1998). In situ analysisof C-C chemokine mRNA in human glomerulonephritis. Kidney Int. 54 827Cohen CD， Grone HJ， Grone EF，Nelson PJ， Schlondorff D， KretzIer M(2002). Laser microdissection and gene expressionanalysis on formaldehyde-fixed archival tissue. Kidney Int.61 125Cummins LL Owens SR, Risen LM, Lesnik EA, Freier SM, McGee D， Guinosso CJ, Cook PD. (1995). Characterization of fully2' -modified oligoribonucleotide hetero-and homoduplexhybridization and nuclease sensitivity. Nucleic Acids Res 23 2019Dalla Vestra M， Mussap M， Gallina P， Bruseghin M， CernigoiAM， Sailer A， Plebani M，F(xiàn)ioretto P (2005). Acute-phase markers ofinflammation and glomerular structure in patients with type 2diabetes. J. Am. Soc. Nephrol. 16 Suppl 1 :S78Dawson J, Miltz W, Mir AK, Wiessner C (2003). Targetingmonocyte chemoattractant protein-1 signalling indisease. Expert Opin. Ther. Targets 7 35De Bleecker 幾，De Paepe B，Vanwalleghem IE，Schroder JM(2002). Differential expression of chemokines in inflammatorymyopathies. Neurology 58 1779De Boer WI, Sont JK, van Schadewijk A，Stolk J，van Krieken JH, Hiemstra PS. (2000)Monocyte chemoattractant protein 1， interleukin8， and chronic airways inflammation in COPD(2000)J Pathol. 190(5) :619_26Dooley MA, Cosio FG, Nachman PH,等人 Mycophenolate mofetiltherapy in lupus nephritis :clinical observations. (1999)J Am SocNephrol 10:833-839·Drolet DW, Nelson J, Tucker CE, Zack PM， Nixon K， Bolin R， Judkins MB, Farmer JA, Wolf JL, Gill SC, Bendele RA(2000). Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growthfactor aptamer(NX1838)following inj ection into the vitreous humorof rhesus monkeys. Pharm. Res. 17 :1503Eaton BE, Gold L, Hicke BJ, Janj ic N， Jucker FM, Sebosta DP， Tarasow TM, Willis MC，Zichi DA (1997). Bioorg MedChem 5:1087Eaton BE，Gold L，Zichi DA. (1995). Letr s get specific :therelationship between specificity and affinity. Chem Biol2 :633Economou E， Tousoulis D， Katinioti A， Stefanadis C， Trikas A， PitsavosC，Tentolouris C，Toutouza MG，Toutouzas P(2001). Chemokines in patients with ischaemic heart disease and the effect ofcoronary angioplasty. Int. J. Cardiol. 80 55Egashira K，Zhao Q，Kataoka C，Ohtani K，Usui M，Charo IF, Nishida K，Inoue S，Katoh M，Ichiki T，Takeshita A (2002). Importance of monocyte chemoattractant protein—1 pathway inneointimal hyperplasia after periarterial injury in mice and monkeys. Circ. Res. 90 :1167Fujinaka H，Yamamoto T，Takeya M，F(xiàn)eng L，Kawasaki K，Yaoita E，Kondo D， Wilson CB，Uchiyama M，Kihara I (1997).Suppression of anti-g1omeru1ar basement membrane nephritis byadministration of anti-monocyte chemoattractant protein-1 antibodyin WKY rats. J. Am. Soc. Nephrol. 8 1174Furuichi K，Wada T，Iwata Y，Kitagawa K，Kobayashi K_I，Hashimoto H， Ishiwata Y，Tomosugi N，Mukaida N，Matsushima K，Egashira K，Yokoyama H(2003). Gene therapy expressingamino-terminal truncated monocyte chemoattractant protein-lprevents renal ischemia—reperfusion injury. J. Am. Soc. Nephrol. 14 :1066Furuta T，Saito T，Ootaka T，Soma J，Obara K，Abe K，Yoshinaga K(1993). The role of macrophages in diabeticglomerulosclerosis. Am. J. Kidney Dis.21 :480Galasso JM,Liu Y,Szaflarski J, Warren JS,Silverstein FS (2000). Monocyte chemoattractant protein-1 is a mediator of acuteexcitotoxic injury in neonatal rat brain. Neuroscience 101 :737Galkina E，Ley K (2006). Leukocyte recruitment and vascularinjury in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Nephrol. 17 :368_377Gao JL Kuhns DB,Tiffany HL McDermott D，Li X Francke U,Murphy PM(1993). Structure and functional expression of the humanmacrophage inflammatory protein 1 alpha/RANTES receptor. J. Exp. Med. 177 1421Garcia-Zepeda EA，Combadiere C，Rothenberg ME,Sarafi MN,Lavigne F，Hamid Q，Murphy PM，Luster AD (1996). Humanmonocyte chemoattractant protein(MCP)-4 is a novel CC chemokinewith activities on monocytes, eosinophils， and basophils induced inallergic and nonallergic inflammation that signals through the CCchemokine receptors(CCR)-2and-3. J. Immunol. 157 :5613Gaubitz M， Schorat A， Schotte H， Kern P， Domschke W. (1999)Mycophenolate mofetil for the treatment of systemic lupuserythematosus :an open pilot trial. Lupus 8 :731-736.Gerard C，Rollins，BJ (2001) Chemokines and disease. Nat. Immunol. 2 108Gong X，Gong W，Kuhns DB，Ben-Baruch A，Howard 0M，WangJM(1997). Monocyte chemotactic protein-2(MCP-2)uses CCR1 andCCR2B as its functional receptors. J. Biol.Chem. 272:11682Gonzalo JA， Lloyd CM， Wen D， Albar JP， Wells TNC， ProudfootA， Martinez-A C，Dorf M，Bjerke T，Coyle A J, Gutierrez—Ramos JC (1998) .The coordinated actionof CC chemokines in the lungorchestrates allergic inflammation and airway hyperresponsiveness. J. Exp. Med. 188 :157Gordillo GM，Onat D，Stockinger M，Roy S，Atalay M，Beck FM，Sen CK(2004). A key angiogenic role of moncyte chemoattractantprotein-lin hemangioendothelioma proliferation. Am. J. Physiol. CellPhysiol. 287 :C866Gourley MF, Austin HA III， Scott D， 入(1996)Methylprednisolone and cyclophosphamide,alone or in combination，in patients with lupus nephritis. Ann Intern Med 125 :549_557.Green LS 等人(1995) .Chem Biol 2 683Handel TM，Domaille PJ(1996) Heteronuclear(1H，13C，15N)NMR assignments and solution structure of the monocytechemoattractant protein-1(MCP-1)dimer. Biochemistry 35 :6569Harigai M，Hara M，Yoshimura T，Leonard EJ，Inoue K, Kashiwazaki S (1993). Monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)in inflammatory joint diseases and its involvement in the cytokinenetwork of rheumatoid synovium. Clin. Immunol. Immunopathol. 69 :83Hasegawa H，Kohno M，Sasaki M，Inoue A，I to MR，Terada M，Hieshima K， Maruyama H，Miyazaki J，Yoshie 0，Nose M，F(xiàn)ujita S(2003). Antagonist of monocyte chemoattractant protein 1ameliorates the initiation and progression of lupus nephritis and renalvasculitis in MRL/lpr mice. Arthritis Rheum. 48 2555Hatano S，Strasser R (1975) Primary pulmonary hypertension. Geneva :World Heath Organization.Heath H，Qin S，Rao P，Wu L，LaRosa G，Kassam N，Ponath PD，Mackay CR. (1997). Chemokine receptor usage by human eosinophils. The importance of CCR3 demonstrated using an antagonisticmonoclonal antibody. J Clin Invest 99:178Holdsworth SR，Kitching AR，Tipping PG (2000). Chemokines astherapeutic targets in renal disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 9 :505Hoigate ST，Bodey KS,Janezic A,Frew AJ，Kaplan AP，TeranLM(1997). Release of RANTES， MIP—1a ， and MCP—1 into asthmaticairways following endobronchial allergen challenge. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 :1377Hopkins N，McLoughlin P (2002)The structural basis ofpulmonary hypertension in chronic lung disease :remodelling,rarefaction or angiogenesis ？ J Anat. 201 (4) :335_48.Hosaka S， Akahoshi T， Wada C， Kondo H. (1994).Expression ofthe chemokine superfamily in rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol97 451Huang DR， Wang J， Kivisakk P， Rollins BJ, Ransohoff RM(2001). Absence of monocyte chemoattractant protein 1 in miceleads to decreased local macrophage recruitment and antigen—specificT helper cell type 1 immune response in experimental autoimmuneencephalomyelitis. J. Exp. Med. 193 :713
97
Hulkower K，Brosnan CF，Aq uino DA, Cammer W, KulshresthaS，Guida MP， Rapoport DA, Berman JW (1993) Expression of CSF-1，c_fms，and MCP-1 in the central nervous system of rats withexperimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 150 2525Humbert M，Ying S，Corrigan C，Menz G，Barkans J，Pfister R，Meng Q，Van Damme J，Opdenakker G，Durham SR，Kay AB(1997).Bronchial mucosal expression of the genes encoding chemokinesRANTES and MCP—3 in symptomatic atopic and nonatopicasthmatics -relationship to the eosinophi1-active cytokines interleukin (IL)-5,granulocyte macrophage-colony-stimulating factor,and IL-3. Am J Respir Cell Mol Biol 16 1Ihm CG,Park JK，Hong SP，Lee TW，Cho BS，Kim MJ，Cha DR，Ha H(1998). A high glucose concentration stimulates the expressionof monocyte chemotactic peptide lin human mesangial cells. Nephron79 33Ioannidis JPA, Boki KA, Katsorida EM ^A (2000)Remission, relapse, and re-remission of proliferative lupus nephritis treated withcyclophosphamide. Kidney Int 57 :258_264.Itoh T,Nagaya N,Ishibashi-Ueda H,Kyotani S，0ya H，Sakamaki F,Kimura H， Nakanishi N(2006)， Increased plasmamonocyte chemoattractant protein-1 level in idiopathic pulmonaryarterial hypertension, Respirology. 11(2) 158-63.Iyonaga K， Takeya M， Saita N， Sakamoto 0， Yoshimura T， AndoM， Takahashi K(1994) Monocyte chemoattractant protein-1 inidiopathic pulmonary fibrosis and other interstitial lung diseases. Hum. Pathol. 25 455Johrer K，Zelle-Rieser C,Perathoner A,Moser P，Hager M，Ramoner R，Gander H，Holtl L，Bartsch G，Greil R，Thurnher M(2005) Up-regulation of functional chemokine receptor CCR3 inhuman renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 11 :2459Jolicoeur C，Lemay A，Akoum A(2001). Comparative effect ofdanazol and a GnRH agonist on monocyte chemotactic protein-1expression by endometriotic cells. Am. J. Reprod. Immunol. 45 :86Jose PJ， Griffiths-Johnson DA, Collins PD， Walsh DT， Moqbel R， Totty NF, Truong 0，Hsuan JJ,Williams TJ (1994). Eotaxin :a potenteosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model ofallergic airways inflammation. J. Exp. Med. 179 881Kaburagi Y，Shimada Y，Nagaoka T，Hasegawa M，Takehara K，Sato S (2001). Enhanced production of CC_chemokines(RANTES，MCP_1，MIP_1a ，MIP_13 ，and eotaxin) in patients with atopicdermatitis. Arch. Dermatol. Res. 293 350Karim MY， Alba P， Cuadrado MJ,等人(2002)Mycophenolatemofetil for systemic lupus erythematosus refractory to otherimmunosuppressive agents. Rheumatology(Oxford) 41 :876_882.Kawasaki AM 等人(1993). J Med Chem 36 831
Kennedy KJ, Strieter RM, Kunkel SL, Lukacs Nff，Karpus WJ(1998). Acute and relapsing experimental autoimmuneencephalomyelitis are regulated by differential expression of the CCchemokines macrophage inflammatory protein-1α and monocytechemotactic protein-1. J. Neuroimmunol. 91 :98Kim JS，Gautam SC，Chopp M，Zaloga C，Jones ML，Ward PA, Welch KM(1995). Expression of monocyte chemoattractant protein-land macrophage inflammatory protein-1 after focal cerebral ischemiain the rat. J. Neuroimmunol. 56 127Kingdon EJ, McLean AG， Psimenou E，·入(2001) The safety andefficacy of MMF in lupus nephritis :a pilot study. Lupus 10:606-611.Kitamoto S，Egashira K(2003). Anti-monocyte chemoattractantprotein-1 gene therapy for cardiovascular diseases. Expert Rev.Cardiovasc. Ther. 1 393Kleinhans M， Tun-Kyi A， Gilliet M， Kadin ME, Dummer R， BurgG, and Nestle FO(2003). Functional expression of the eotaxinreceptor CCR3in CD30+cutaneous T-cell lymphoma. Blood 101:1487Ko FW, Lau CY，Leung TF，Wong GW, Lam CW, Hui DS (2006) Exhaled breath condensate levels of 8—isoprostane， growth relatedoncogene alpha and monocyte chemoattractant protein-1 in patientswith chronic obstructive pulmonary disease. Respir Med. 100(4) :630_8·Koch AE，Kunkel SL，Harlow LA, Johnson B，Evanoff HL，Haines GK，Burdick MD, Pope RM, Strieter RM(1992)· Enhancedproduction of monocyte chemoattractant protein-1 in rheumatoidarthritis. J. Clin. Invest. 90 772Korbet SM, Lewis EJ, Schwartz MM， Reichlin M， Evans J， Rohde RD. (2000) Factors predictive of outcome in severe lupusnephritis. Am J Kidney Dis 35: 904-914.Kouno J， Nagai H， Nagahata T， Onda M， Yamaguchi H， AdachiK， Takahashi H， Teramoto A，and Emi M(2004) · Up-regulation of CCchemokine，CCL3L1，and receptors， CCR3，CCR5 in humanglioblastoma that promotes cell growth. J Neurooncol 70:301Kurihara T,Warr G,Loy JiBravo R(1997). Defects inmacrophage recruitment and host defense in mice lacking the CCR2chemokine receptor. J. Exp. Med. 186 :1757Kusser W(2000). Chemically modified nucleic acid aptamers forin vitro selections :evolving evolution. J Biotechnol 74 :27_38Kuziel WAiMorgan SJiDawson TCiGriffin SiSmithies O,LeyK,Maeda N(1997). Severe reduction in leukocyte adhesion andmonocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2. Proc. Natl Acad. Sci. U S A 94:12053Lehman TJiSherry DDiWagner-Weiner L, ^A (1989) Intermittent intravenous cyclophosphamide therapy for lupusnephritis. J Pediatr 114 :1055-1060.Lesnik EA，Guinosso CJ，Kawasaki AM，Sasmor H，Zounes M，Cummins LL，Ecker DJ, Cook PD,Freier SM. (1993).01igodeoxynucleotides containing 2 ' —O—modified adenosine synthesisand effects on stability of DNA :RNA duplexes. Biochemistry 32:7832Lloyd CM，Minto AW, Dorf ME，Proudfoot A，Wells TNC，SalantDJ， Gutierrez-Ramos JC (1997). RANTES and monocytechemoattractant protein-1 (MCP-1) play an important role in theinflammatory phase of crescentic nephritis, but only MCP-1 isinvolved in crescent formation and interstitial fibrosis. J. Exp. Med. 185 1371Lu BB，Rutledge BJ，Gu L，F(xiàn)iorillo J，Lukacs NW，Kunkel SL,North R,Gerard C， Rollins BJ (1998) Abnormalities in monocyterecruitment and cytokine expression in monocyte chemoattractantprotein—1 deficient mice. J. Exp. Med. 187 601Lubkowski J, Bujacz G，Boque L, Domaille PJ, Handel TM, Wlodawer A(1997). The structure of MCP-1in two crystal formsprovides a rare example of variable quaternary interactions. NatStruct Biol 4 :64Mack M，Cihak J，Simonis C,Luckow B，Proudfoot AE，Plachy J，Bruhl H，F(xiàn)rink M, Anders HJ, Vielhauer V, Pf irstinger J, Stangassinger M, Schlondorff D (2001). Expression andcharacterization of the chemokine receptors CCR2and CCR5in mice. J. Immunol. 166 :4697Martinelli R，Sabroe I，LaRosa G，Williams TJ，Pease JE. TheCC chemokine eotaxin (CCL11)is a partial agonist of CC chemokinereceptor 2b. J Biol Chem 276 42957Matsushima K，Morishita K，Yoshimura T，Lavu S，Kobayashi Y，Lew W, Appella E，Kung HF，Leonard EJ，Oppenheim JJ (1989). Molecular cloning of a human monocyte-derived neutrophilchemotactic factor(MDNCF)and the induction of MDNCF mRNA byinterleukin 1 and tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 167 1883McGinnis S, Madden TL(2004). BLAST :at the core of apowerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32(Web Server issue) :W20-5.Meyer TW(2003). Immunosuppression for diabetic glomerulardisease ？ Kidney Int. 63 :377Miuer LE 等人(1993). J Physiol 469 213Miller MD，Krangel MS(1992). Biology and biochemistry of thechemokines a family of chemotactic and inflammatory cytokines. Crit. Rev. Immunol. 12 17Mok CC, Ying KY，Tang S，等人 Predictors and outcome of renalflares after successful cyclophosphamide treatment for diffuseproliferative lupus glomerulonephritis. (2004)Arthritis Rheum50 :2559_2568.Mora C,Navarro JF(2005). The role of inflammation as apathogenic factor in the development of renal disease in diabetes. Curr. Diab. Rep. 5 399Morii T,Fujita H,Narita T,Shimotomai T,Fujishima H,Yoshioka N，Imai H， Kakei M，Ito S(2003). Association of monocytechemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabeticnephropathy. J. Diabetes Complications 17:11Murphy PM，Baggiolini M，Charo IF，Hebert CA，Horuk R，Matsushima K，Miller
100LH, Oppenheim JJ, Power CA (2000). International union of pharmacology. XXII. Nomenclature forchemokine receptors. Pharmtacol. Rev. 52 145Myers SJ, Wong LM, Charo IF(1995). Signal transduction andligand specificity of the human monocyte chemoattractant protein-lreceptor in transfected embryonic kidney cells. J. Biol. Chem. 270 5786Nakamura H，Weiss ST，Israel EiLuster ADiDrazen JM,LillyCM(1999). Eotaxin and impaired lung function in asthma. Am JRespir Crit Care Med 160:1952Nakazawa T，Hisatomi T，Nakazawa C，Noda K，Maruyama K，She H，Matsubara A, Miyahara S, Nakao S, Yin Y, Benowitz L, Hafezi-Moghadam A, Miller JW(2007). Monocyte chemoattractantprotein 1 mediated retinal detachment-induced photoreceptorapoptosis. Proc Natl. Acad. Sci. U S A 104:2425Navarro JF, Mora C，Maca M，Garca J (2003). Inflammatoryparameters are independently associated with urinary albumin in type2diabetes mellitus. Am. J. Kidney Dis. 42 53Needleman & Wunsch(1970)，A general method applicable to thesearch for similarities in the amino acid sequence of two proteins. JMol Biol. 48 (3) 443-53.Nelken NAiCoughlin SRiGordon DiWilcox JN(1991). Monocytechemoattractant protein-1 in human atheromatous plaques. J. Clin. Invest. 88 1121Neote K, DiGregorio D， Mak JY, Horuk R, Schall TJ (1993).Molecular cloning, functional expression, and signaling characteristicsof a C-C chemokine receptor. Cell 72:415Ninichuk V， Gross 0， Reichel C， Khandoga A， Pawar RD, CiubarR， Segerer S，Belemezova E，Radomska E，Luckow B，de Lema GP, Murphy PM, Gao JL, Henger A， Kretzler M，Horuk R，Weber M，Krombach F，Schlondorff D，Anders HJ(2005). Delayed chemokinereceptor 1 blockade prolongs survival in collagen 4A3_deficient micewith Alport disease. J. Am. Soc. Nephrol. 16 :977Ogata H, Takeya M, Yoshimura T, Takagi K, Takahashi K (1997).The role of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)in the pathogenesis of collagen-induced arthritis in rats. J. Pathol. 182 106Okuno T，Andoh A，Bamba S，Araki Y，F(xiàn)ujiyama Y，F(xiàn)ujiyama M，Bamba T (2002). Interleukin-I β and tumor necrosis factor-α induce chemokine and matrix metalloproteinase gene expression inhuman colonic subepithelial myofibroblasts. Scand. J. Gastroenterol. 37 :317Oppenheim JJ, Zachariae CO，Mukaida N，Matsushima K (1991) · Properties of the novel proinflammatory supergene “ intercrine “ cytokine family. Annu. Rev. Immunol. 9 :617Pawar RD, Patole PS, Zecher D，Segerer S，Kretzler M， Schlondorff D , Anders HJ(2006). Toll-like receptor-7modulatesimmune complex glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 17 :141
Pearson & Lipman (1988)，Improved tools for biologicalsequence comparison. Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85 2444Peinado VI， Pizarro S， BarberaJA.Pulmonary VascularInvolvement in C0PD (2008) Chest. 134 :808_814Perez de Lema G，Maier H，F(xiàn)ranz TJ，Escribese M，Chilla mS，Segerer S， Camarasa N，Schmid H，Banas B，Kalaydj iev S，Busch DH，Pfeffer K，Mampaso F， Schl6lldorff D，Luckow B (2005). Chemokinereceptor CCR2 deficiency reduces renal disease and prolongs survivalin MRL/lpr lupus-prone mice. J. Am. Soc. Nephrol. 16 3592Perez de Lema G，Maier H，Nieto E，Vielhauer V，Luckow B，Mampaso F， Schlondorff D (2001).Chemokine expression precedes inflammatory cell infiltration and chemokine receptor and cytokineexpression during the initiation of murine lupus nephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 12 1369Ponath PD，Qin S，Post TW，Wang J，Wu L，Gerard NP，NewmanW，Gerard C，Mackay CR(1996b). Molecular cloning andcharacterization of a human eotaxin receptor expressed selectively oneosinophils. J. Exp. Med. 183 2437Ponath PD，Qin S，Ringler DJ，Clark-Lewis I, Wang J，Kassam N，Smith H，Shi X，Gonzalo JA,Newman W,Gutierrez-Ramos JC，Mackay CR(1996a). Cloning of the human eosinophilchemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, andfunctional properties suggest a mechanism for the selectiverecruitment of eosinophils. J. Clin. Invest. 97 604Power CA，Meyer A，Nemeth K，Bacon KB，Hoogewerf A J, Proudfoot AE，Wells TN(1995). Molecular cloning and functionalexpression of a novel CC chemokine receptor cDNA from a humanbasophi1ic cell line. J. Biol. Chem. 270 19495Qi Z, Whitt LMehta A, Jin J, Zhao M, Harris RC, Fogo AB, Breyer MD (2004). Serial determination of glomerular filtration ratein conscious mice using FITC-inulin clearance. Am. J. Physiol. RenalPhysiol. 286 :F590Qin S,LaRosa G，Campbell JJ，Smith-Heath H，Kassam N,Shi X，Zeng L，Buthcher EC，Mackay CR (1996). Expression of monocytechemoattractant protein-1 and interleukin—8 receptors on subsets of Tcells -correlation with transendothelial chemotactic potential. Eur. J. Immunol. 26 :640Ransohoff RM，Hamilton TA，Tani M，Stoler MH，Shick HE,Major JA，Estes ML， Thomas DM,Tuohy VK. (1993). Astrocyteexpression of mRNA encoding cytokines IP-10 and JE/MCP-1 inexperimental autoimmune encephalomyelitis FASEB J 7 :592Raport CJ， Gosling J， Schweickart VL, Gray PW， Charo IF (1996). Molecular cloning and functional characterization of a novelhuman CC chemokine receptor (CCR5)for RANTES，MIP-1 0，andMIP-1 a J. Biol. Chem. 271 :17161Ritz E, Rychlik I, Locatelli F, Halimi S(1999). End-stage renalfailure in type 2 diabetes :A medical catastrophe of worldwidedimensions. Am. J. KidneyDis. 34 795-808Rollins BJ(1996).Monocyte chemoattractant protein 1 :apotential regulator of monocyte recruitment in inflammatory disease. Mol. Med. Today 2:198Rollins BJ, Stier P， Ernst T， Wong GG(1989). The humanhomolog of the JE gene encodes a monocyte secretory protein. Mol. Cell Biol. 9 4687Rovin BH，Rumancik M，Tan L，Dickerson J(1994). Glomerularexpression of monocyte chemoattractant protein—1 in experimentaland human glomerulonephritis. Lab. Invest. 71 :536Rubin LJ(1997)Primary pulmonary hypertension. N Engl J Med. 336(2) :111_7Ruffing N，Sullivan N，等人(1998) CCR5has an expandedligand-binding repertoire and is the primary receptor used by MCP_2on activated T cells.Cell Immunol 189:160Salcedo R，Ponce ML，Young HA, Wasserman K, Ward JM，Keinman HK，Oppenheim J J, Murphy WJ(2000). Human endothelialcells express CCR2and respond to MCP-1 direct role of MCP—1 inangiogenesis and tumor progression. Blood 96 :34Samson M，Labbe 0，Mollereau C，Vassart G，Parmentier M(1996). Molecular cloning and functional expressionof a new humanCC—chemokine receptor gene. Biochemistry 35 :3362Schall TJ，Bacon KB(1994) Chemokines，leukocyte trafficking，and inflammation. Curr. Opin. Immunol. 6 :865Schneider A，Panzer U，Zahner G，Wenzel U，Wolf G，Thaiss F，Helmchen U， Stahl RA(1999). Monocyte chemoattractant protein-lmediates collagen deposition in experimental glomerulonephritis bytransforming growth factor-beta. Kidney Int. 56 135Schwarting A，Paul K，Tschirner S，Menke J，Hansen T，BrennerW, Kelly VR， Relle M，Galle PR(2005). Interferon-beta :a therapeuticfor autoimmune lupus in MRL-Faslpr mice. J. Am. Soc. Nephrol. 16 :3264Schwartz CJ,Valente AJ,Sprague EA(1993). A modern view ofatherogenesis. Am. J. Cardiol. 71 :9BSegerer S，Nelson PJ， Schlondorff D (2000). Chemokines, chemokine receptors， and renal disease :from basic science topathophysiologic and therapeutic studies. J. Am. Soc. Nephrol. 11 :152Shimizu S，Nakashima H，Masutani K，Inoue Y，Miyake K，Akahoshi M， Tanaka Y，Egashira K，Hirakata H，Otsuka T，HaradaM(2004). Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapyattenuates nephritis in MRL/lpr mice. Rheumatology(Oxford)43 1121Simonneau G，GalieN，Rubin LJ,等人(2004). Clinicalclassification of pulmonary hypertension" . J. Am. Coll. Cardiol. 43 (12Suppl S) :5S_12S.Smith & Waterman (1981)，Adv. Appl. Math. 2 482
103
Springer TA(1995). Traffic signals on endothelium forlymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Annu. Rev. Physiol. 57 827Steinberg AD, Steinberg SC. Long-term preservation of renalfunction in patients with lupus nephritis receiving treatment thatincludes cyclophosphamide versus those treated with prednisone only. (1991)Arthritis Rheum 34 :945_950.Steinman L(2004). Immune therapy for autoimmune diseases. Science 305 212Svensson M， Sundkvist G， Arnqvist HJ， Bjork E， Blohme G， Bolinder J， Henricsson M，Nystrom L,Torffvit 0,Waernbaum I,Ostman J,Eriksson JW(2003) Signs of nephropathy may occur earlyin young adults with diabetes despite modern diabetes management :Results from the nationwide population-based Diabetes IncidenceStudy in Sweden (DISS). Diabetes Care 26:2903Takebayashi K，Matsumoto S，Aso Y，Inukai T (2006).Association between circulating monocyte chemoattractant protein-land urinary albumin excretion in nonobese Type 2 diabetic patients. J. Diabetes Complications 20:98Takeya M，Yoshimura T，Leonard EJ，Takahashi K(1993). Detection of monocyte chemoattractant protein—1 in humanatherosclerotic lesions by an anti-monocyte chemoattractant protein-lmonoclonal antibody. Hum. Pathol. 24 :534Tang WW, Qi M, Warren JS (1996).Monocyte chemoattractantprotein 1 mediates glomerular macrophage infiltration in anti—GBMAb GN. Kidney Int. 50 665Tashiro K， Koyanagi I， Saitoh A， Shimizu A， Shike T， Ishiguro C， Koizumi M，F(xiàn)unabiki K，Horikoshi S，Shirato I，Tomino Y(2002) Urinary levels of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)andinterleukin-8(IL-8)，and renal injuries in patients with type 2 diabeticnephropathy. J. Clin. Lab. Anal. 16 1Tesch GH， Maifert S， Schwarting A， Rollins BJ, Kelley VR(1999). Monocyte chemoattractant protein 1-dependent leukocytic infiltratesare responsible for autoimmune disease in MRL-Fas (lpr)mice. J. Exp. Med. 190 1813Torres F(2007)Systematic review of randomised， double-blindclinical trials of oral agents conducted inpatients with pulmonaryarterial hypertension. Int J Clin Pract. 61(10) 1756-65.Traves SL，Culpitt SV，Russell RE，Barnes PJ，Donnelly LE (2002) Increased levels of the chemokines GROalpha and MCP—1 insputum samples from patients with C0PD. Thorax. 57(7) :590_5.Tuaillon N，Shen de F，Berger RB，Lu B，Rollins BJ，Chan CC (2002) MCP-1 expression in endotoxin-induced uveitis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 1493Tuttle KR(2005) Linking metabolism and immunology :diabeticnephropathy is an inflammatory disease. J. Am. Soc. Nephrol. 16 1537Uguccioni M，Mackay CR 等人 (1997). High expression of thechemokine receptor CCR3 in human blood basophils. Role inactivation by eotaxin，MCP—4，and other chemokines. J Clin InvestlOO 1137
United States Renal Data System(2004). Annual data report !Incidence and prevalence 2004. Am. J. Kidney Dis. 45 :S77Utimura R，F(xiàn)ujihara CK, Mattar AL, Malheiros DM，Noronha IL, Zatz R(2003). Mycophenolate mofetil prevents the development ofglomerular injury in experimental diabetes. Kidney Int. 63 209Valeri A， Radhakrishnan J， Estes D，等人(1994)Intravenouspulse cyclophosphamide treatment of severe lupus nephritis :aprospective five-year study. Clin Nephrol 42:71-78.Van Riper GiSiciliano SiFischer PAiMeurer RiSpringer MSiRosen H(1993). Characterization and species distribution of highaffinity GTP—coupled receptors for human rantes and monocytechemoattractant protein 1. J. Exp. Med. 177 :851Venkatesan N 等人(2003). Curr Med Chem 10 1973Vestergaard C， Just H， Baumgartner Nielsen J， Thestrup-Pedersen K， Deleuran M(2004). Expression of CCR2 onmonocytes and macrophages in chronically inflamed skin in atopicdermatitis and psoriasis. Acta Derm. Venereol. 84 353Viedt C, Orth SR (2002). Monocyte chemoattractant protein-1(MCP-I) in the kidney :does it more than simply attract monocytes ？ Nephrol. Dial. Transplant. 17 2043Vielhauer V，Anders HJ (2006). Blockade of chemokine-mediatedtissue injury in lupus nephritis.Endocr Metab Immune Disord DrugTargets. 6(4) :313-21.Voelkel NF, Tuder RM. (1995)Cellular and mo1ecu1armechanisms in the pathogenesis of severe pulmonary hypertension (1995)Eur Respir J. 8 (12) :2129_38.Wada T，F(xiàn)uruichi K，Segada-Takaeda C，Ahimizu M，Sakai N，Takeda Si， Takasawa K，Kida H，Kobayashi KI，Mukaida N，OhmotoY，Matsushima K，Yokoyama H(1999). MIP-I α and MCP-1contribute to crescents and interstitial lesions in human crescenticglomerulonephritis. Kidney Int. 56 995Wada T，Yokoyama H，F(xiàn)uruichi K，Kobayashi KI，Harada K，Naruto M， Su SB，Akiyama M，Mukaida N，Matsushima K(1996). Intervention of crescentic glomerulonephritis by antibodies tomonocyte chemotactic and activating factor (MCAF/MCP-1). FASEBJ. 10 1418Wada T，Yokoyama H，Matsushima K，Kobayashi KI (2001). Chemokines in renal diseases. Int. Immunopharmaco1. 1 :637Wang X，Yue TL, Barone FC, Feuerstein GZ(1995). Monocytechemoattractant protein-lmessenger RNA expression in rat ischemiccortex. Stroke 26 :661Wenzel U, Schneider A, Valente AJ, Abboud HE, Thaiss F, Helmchen UM, Stahl RA (1997). Monocyte chemoattractant protein-lmediates monocyte/macrophage influx in anti-thymocyteantibody-induced glomerulonephritis. Kidney Int.51 770Yamagishi S， Inagaki Y， Okamoto T， Amano S， Koga K， Takeuchi M， Makita Z(2002). Advanced glycation endproduct-induced apoptosis and overexpressionof vascular endothelialgrowth factor and monocyte chemoattractant protein—1 inhuman-cultured mesangial cells. J. Biol. Chem. 277 20309Ying S，Meng Q，Zeibecoglou K，Robinson DS，Macfarlane A，Humbert M，Kay AB(1999).Eosinophil chemotactic chemokines(eotaxin, eotaxin-2，RANTES，monocyte chemoattractant protein-3 (MCP-3)，and MCP-4)，and C_C chemokine receptor 3 expression inbronchial biopsies from atopic and nonatopic (Intrinsic) asthmatics. JImmunol 163 :6321Ying S，Robinson DS, Meng Q，Rottman J，Kennedy R，RinglerDJ，Mackay CR，Daugherty BL，Springer MS，Durham SR，WilliamsTJ, Kay AB (1997). Enhanced expression of eotaxin and CCR3 mRNAand protein in atopic asthma. Association with airwayhyperresponsiveness and predominant co-localization of eotaxinmRNA to bronchial epithelial and endothelial cells.Eur J Immunol27 3507Yla-Herttuala S,Lipton BA,Rosenfeld ME,Sarkioja T,Yoshimura T，Leonard EJ,Witztum JL，Steinberg D (1991). Expression of monocyte chemoattractant protein 1 inmacrophage-rich areas of human and rabbit atherosclerotic lesions. Proc. Natl Acad. Sci. U S A88 5252Yoshimura T，Robinson EA，Tanaka S，Appella E，Leonard EJ (1989). Purification and amino acid analysis of two human monocytechemoattractants produced by phytohemagglutinin—stimulated humanblood mononuclear leukocytes. J. Immunol. 142 1956Yozai K，Shikata K，Sasaki M，Tone A，0hga S,Usui H，0kada S,Wada J,Nagase R，Ogawa D，Shikata Y，Makino H(2005). Methotrexate prevents renal injury in experimental diabetic rats viaanti-inflammatory actions. J. Am. Soc. Nephrol. 16 3326Zimmet P,Alberti KG,Shaw J (2001). Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature 414:782在說明書、權(quán)利要求書和/或附圖中公開的本發(fā)明的特征(分開地和以其任何組 合)可以是用于以本發(fā)明的各種形式來實現(xiàn)本發(fā)明的材料。
權(quán)利要求
能夠結(jié)合MCP-1的核酸分子，由此該核酸分子用作用于治療和/或預(yù)防慢性疾病或慢性病癥的藥劑，所述慢性疾病或慢性病癥優(yōu)選選自慢性呼吸道疾病、慢性腎疾病和全身性紅斑狼瘡。
2.能夠結(jié)合MCP-1的核酸分子，由此該核酸分子用作用于診斷慢性疾病或慢性病癥的 診斷劑，所述慢性疾病或慢性病癥優(yōu)選選自慢性呼吸道疾病、慢性腎疾病和全身性紅斑狼 瘡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸分子，由此慢性呼吸道疾病選自肺炎、肺和胸膜炎癥、胸 膜炎、胸腔積液、狼瘡肺炎、慢性彌漫性間質(zhì)性肺疾病、肺栓塞、肺出血、肺萎縮綜合征、肺高 壓和慢性阻塞性肺疾病及其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分子，由此肺高壓選自與左側(cè)心臟病相關(guān)的肺高壓、與肺病 和/或低氧血癥相關(guān)的肺高壓、由于慢性血栓形成和/或栓塞疾病的肺高壓、肺動脈高壓， 優(yōu)選特發(fā)性肺動脈高壓、膠原酶相關(guān)的肺動脈高壓、家族性肺動脈高壓、與其他疾病相關(guān)的 肺動脈高壓、和與靜脈或毛細(xì)血管疾病相關(guān)的肺動脈高壓。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分子，由此慢性阻塞性肺疾病是具有或沒有肺血管牽涉的慢 性阻塞性肺疾病。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或5的核酸分子，由此慢性阻塞性肺疾病選自慢性支氣管炎和肺氣腫。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項的核酸分子，由此慢性腎疾病選自狼瘡腎炎、膜性增生 性腎小球腎炎、膜性腎小球腎炎、IgA腎病、鏈球菌感染后腎小球腎炎、急進(jìn)性腎小球腎炎、 腎病綜合征、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥、糖尿病腎病、腎病綜合征、和腎病綜合征，優(yōu)選狼 瘡腎炎。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸分子，由此所述核酸選自1A型核酸、1B型核酸、2型核 酸、3型核酸、4型核酸和具有根據(jù)SEQ. ID. No. 87至115中任一個的核酸序列的核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的核酸分子，由此所述2型核酸以5’- > 3’方向包含第一序列段 盒B1A、第二序列段盒B2和第三序列段盒B1B，由此第一序列段盒B1A和第三序列段盒B1B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)，第一序列段盒B1A包含選自ACGCA、CGCA和GCA的核苷酸序列，第二序列段盒B2包含核苷酸序列CSUCCCUCACCGGUGCAA⑶GAAGCCGYGGCUC，并且第三序列段盒B1B包含選自UGCGU、UGCG和UGC的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸分子，由此第二序列段盒B2包含核苷酸序列CGUCCXUCACCG GUGCAA⑶GAAGCCGUGGCUC。
11.根據(jù)權(quán)利要求9至10中任一項的核酸分子，由此a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列ACGCA，并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCGU ；或者b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CGCA，并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCG ；或者c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCA，并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGC或UGCG。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項的核酸分子，由此 第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCA。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項的并且優(yōu)選權(quán)利要求12的核酸分子，由此 第三序列段盒B1B包含核苷酸序列UGCG。
14.根據(jù)權(quán)利要求9至13中任一項的分子，由此所述核酸包含根據(jù)SEQ.ID. No 37、 SEQ. ID. No 116、SEQ. ID. No 117 和 SEQ. ID. No 278 的核酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求8的核酸分子，由此所述3型核酸以5’- > 3’方向包含第一序列段 盒B1A、第二序列段盒B2A、第三序列段盒B3、第四序列段盒B2B、第五序列段盒B4、第六序列 段盒B5A、第七序列段盒B6、第八序列段盒B5B和第九序列段盒B1B，由此第一序列段盒B1A和第九序列段盒B1B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)， 第二序列段盒B2A和第四盒B2B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)， 第六序列段盒B5A和第八盒B5B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)， 第一序列段盒B1A包含選自⑶RCUGC、GKSYGC、KBBSC和BNGC的核苷酸序列， 第二序列段盒B2A包含核苷酸序列GKMGU， 第三序列段盒B3包含核苷酸序列KRRAR， 第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC，第五序列段盒B4包含選自CURYGA、CUWAUGA、CWRMGACW和UGCCA⑶G的核苷酸序列，第六序列段盒B5A包含選自GGY和CWGC的核苷酸序列，第七序列段盒B6包含選自YAGA、CKAAU和CCUUUAU的核苷酸序列，第八序列段盒B5B包含選自GCYR和GCWG的核苷酸序列，并且第九序列段盒B1B包含選自GCAGCAC、GCRSMC、GSVVM和GCNV的核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的核酸分子，由此第三序列段盒B3包含核苷酸序列GAGAA或UAAAA。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的核酸分子，由此第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAGCGACU或CAACGACU。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項的核酸分子，由此第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAGCGA⑶，并且盒B3包含核苷酸序列UAAAA。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項的核酸分子，由此第五序列段盒B4包含核苷酸序列CAACGACU，并且第三序列段盒B3包含核苷酸序列 GAGAA。
20.根據(jù)權(quán)利要求15至19中任一項的核酸分子，由此 第七序列段盒B6包含核苷酸序列UAGA。
21.根據(jù)權(quán)利要求15至20中任一項的核酸分子，由此a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列⑶RCUGC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCAGCAC ；或者b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GKSYGC，并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCRSMC ；或者c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列KBBSC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GSVVM ；或者d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列BNGC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCNV。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的核酸分子，由此a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGCUGC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCAGCAC ；或者b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGCGC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCGCAC ；或者c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列KKSSC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GSSMM ；或者d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列SNGC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCNS。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的核酸分子，由此 第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GGGC， 并且第九序列段盒B1B包含核苷酸序列GCCC。
24.根據(jù)權(quán)利要求15至23中任一項的核酸分子，由此第二序列段盒B2A包含核苷酸序 列GKMGU，并且第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACKMC。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的核酸分子，由此第二序列段盒B2A包含核苷酸序列GUAGU，并且 第四序列段盒B2B包含核苷酸序列ACUAC。
26.根據(jù)權(quán)利要求15至25中任一項的核酸分子，由此a)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列GGY， 并且第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCYR ；或者b)第六序列段盒B5A包含核苷酸序列CWGC， 并且第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCWG。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的核酸分子，由此 第六序列段盒B5A包含核苷酸序列GGC， 并且第八序列段盒B5B包含核苷酸序列GCCG。
28.根據(jù)權(quán)利要求15至27優(yōu)選26至27中任一項的核酸分子，由此第六序列段盒B5A 與第八序列段盒B5B的核苷酸GCY雜交。
29.根據(jù)權(quán)利要求15至18和20至28中任一項的核酸分子，由此所述核酸包含根據(jù) SEQ. ID. No 56的核酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求15至17和19至28中任一項的核酸分子，由此所述核酸包含選自根 據(jù)SEQ. ID. No 57至61、SEQ. ID. No 67至71和SEQ. ID. No 73的核酸序列的核酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求8的核酸分子，由此所述4型核酸以5’- > 3’方向包含第一序列段 盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B1B，由此第一序列段盒B1A和第三序列段盒B1B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)， 第一序列段盒B1A包含選自AGC(iUa)U、GCGCGAG、CSKSUU、(;U(;UU和U⑶U的核苷酸序列； 第二序列段盒 B2 包含選自 AGNDRDGBKG⑶RGYARGUAAAG、AG⑶GG⑶GGUAGUAAGUAAAG 和 CAG⑶GG⑶GGUAGAAUGUAAAGA的核苷酸序列，并且第三序列段盒B1B包含選自GNCASGCU、CUCGC⑶C、GRSMSG、GRCAC和GGCA的核苷酸序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的核酸分子，由此a)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GUGUU， 并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRCAC ；b)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列GCGCGAG， 并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列⑶CGCGUC ；或者c)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CSKSUU， 并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRSMSG，或者d)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列UGUU， 并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GGCA，或者e)第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUGDU， 并且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GNCASG⑶。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的核酸分子，由此第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CSKSUU，并 且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GRSMSG。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的核酸分子，由此第一序列段盒B1A包含核苷酸序列CCGCUU，并 且第三序列段盒B1B包含核苷酸序列GGGCGG。
35.根據(jù)權(quán)利要求31至34中任一項的核酸分子，由此 第二序列段盒B2包含核苷酸序列AG⑶GG⑶GGUAGUAAGUAAAG。
36.根據(jù)權(quán)利要求31至35中任一項的核酸分子，由此所述核酸包含根據(jù)SEQ.ID. No 80和SEQ. ID. No 81的核酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求8的核酸分子，由此所述1A型核酸以5’- > 3’方向包含第一序列 段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B3、第四序列段盒B4、第五序列段盒B5、第六序列 段盒B6和第七序列段盒B1B，由此第一序列段盒B1A和第七序列段盒B1B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)，第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCRUG，第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCCGGW，第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUR，第四序列段盒B4包含核苷酸序列RYA,第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGRCGCGAYC，第六序列段盒B6包含核苷酸序列UGCAAUAAUG或URYAWUUG，并且第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CRYG⑶。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的核酸分子，由此 第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUG。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38的核酸分子，由此 第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCCGGU。
40.根據(jù)權(quán)利要求37至39中任一項的核酸分子，由此 第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUG。
41.根據(jù)權(quán)利要求37至40中任一項的核酸分子，由此 第四序列段盒B4包含核苷酸序列GUA。
42.根據(jù)權(quán)利要求37至41中任一項的核酸分子，由此 第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGGCGCGACC。
43.根據(jù)權(quán)利要求37至42中任一項的核酸分子，由此 第六序列段盒B6包含核苷酸序列UACAUUUG。
44.根據(jù)權(quán)利要求37至43中任一項的核酸分子，由此 第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CACG⑶。
45.根據(jù)權(quán)利要求37至44中任一項的核酸分子，由此所述核酸包含根據(jù)SEQ.ID. No 21的核酸序列。
46.根據(jù)權(quán)利要求8的核酸分子，由此所述1B型核酸以5’- > 3’方向包含第一序列 段盒B1A、第二序列段盒B2、第三序列段盒B3、第四序列段盒B4、第五序列段盒B5、第六序列 段盒B6和第七序列段盒B1B，由此第一序列段盒B1A和第七序列段盒B1B任選地相互雜交，由此在雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)，第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGYRUG，第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCAGCU或CCAGY，第三序列段盒B3包含核苷酸序列GUG，第四序列段盒B4包含核苷酸序列AUG，第五序列段盒B5包含核苷酸序列GGGGGGCGCGACC第六序列段盒B6包含核苷酸序列CAUUUUA或CAUUUA，并且第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CAYRCU。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的核酸分子，由此第一序列段盒B1A包含核苷酸序列AGCGUG。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或47的核酸分子，由此第二序列段盒B2包含核苷酸序列CCAGU。
49.根據(jù)權(quán)利要求46至48中任一項的核酸分子，由此第六序列段盒B6包含核苷酸序列CAUUUUA。
50.根據(jù)權(quán)利要求46至49中任一項的核酸分子，由此第七序列段盒B1B包含核苷酸序列CACG⑶。
51.根據(jù)權(quán)利要求46至50中任一項的核酸分子，由此所述核酸包含根據(jù)SEQ.ID. No 28和SEQ. ID. No 27的核酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求1至51中任一項的核酸分子，由此所述MCP-1選自猴MCP-1、馬 MCP-1、兔 MCP-1、牛 MCP-1、犬 MCP-1、豬 MCP-1 和人 MCP-1。
53.根據(jù)權(quán)利要求1至52中任一項的核酸分子，由此所述核酸能夠結(jié)合人MCP-1。
54.根據(jù)權(quán)利要求1至53中任一項的，優(yōu)選權(quán)利要求53的核酸分子，由此所述MCP-1 具有根據(jù)SEQ. ID. No. 1的氨基酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求1至54中任一項的核酸分子，由此所述核酸包含修飾物，由此所述修 飾物優(yōu)選為高分子量部分和/或由此所述修飾物優(yōu)選允許改變根據(jù)權(quán)利要求1至54中任 一項的核酸在動物或人體內(nèi)，優(yōu)選人體內(nèi)的停留時間方面的特征。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的核酸分子，由此所述修飾物選自HES部分、PEG部分、生物可降 解修飾及其組合。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的核酸分子，由此所述修飾物是由直鏈或分支的PEG組成的PEG 部分，由此所述PEG部分的分子量優(yōu)選為大約20，000至120，OOODa,更優(yōu)選大約30，000至 80，OOODa，和最優(yōu)選大約40，OOODa。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的核酸分子，由此所述修飾物是HES部分，由此優(yōu)選地，所述HES 部分的分子量為大約10，000至200，OOODa,更優(yōu)選大約30，000至170. OOODa,和最優(yōu)選大 約 150，OOODa。
59.根據(jù)權(quán)利要求55至58中任一項的核酸分子，由此所述修飾物經(jīng)由連接體偶聯(lián)至所 述核酸，由此所述連接體是連接體或生物可降解連接體。
60.根據(jù)權(quán)利要求55至59中任一項的核酸分子，由此所述修飾物在所述核酸的5’-末 端核苷酸和/或所述核酸的3’ -末端核苷酸處偶聯(lián)至所述核酸，和/或偶聯(lián)至在所述核酸 的所述5’ -末端核苷酸和所述3’ -末端核苷酸之間的核苷酸。
61.根據(jù)權(quán)利要求1至60中任一項的核酸分子，由此所述核酸的核苷酸或形成所述核 酸的核苷酸是L-核苷酸。
62.根據(jù)權(quán)利要求1至61中任一項的核酸分子，由此所述核酸是L-核酸。
63.根據(jù)權(quán)利要求1至61中任一項的核酸分子，由此能夠結(jié)合MCP-1的所述核酸的所 述部分由L-核苷酸組成。
64.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至63中任一項限定的核酸分子和任選地另外的組 成成分，由此所述另外的組成成分選自藥學(xué)上可接受的賦形劑、藥學(xué)上可接受的載體和藥 學(xué)活性試劑，并且由此所述藥物組合物用于治療和/或預(yù)防慢性疾病或慢性病癥。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含如權(quán)利要求1至63中任一項中限定的核酸分子和藥學(xué)上可接受的載體。
66.根據(jù)權(quán)利要求64和65中任一項的藥物組合物，其中所述慢性疾病或慢性病癥如前 述權(quán)利要求中任一項中限定的。
67.根據(jù)權(quán)利要求64至66中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含第二種藥 學(xué)活性試劑，由此此類第二種藥學(xué)活性試劑是免疫抑制劑。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的藥物組合物，其中所述免疫抑制劑作為分開的劑量單位包含在 所述藥物組合物中。
69.根據(jù)權(quán)利要求67至68中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物比包含免疫抑 制劑作為單一療法的藥物組合物包含更少的免疫抑制劑。
70.根據(jù)權(quán)利要求67至69中任一項的藥物組合物，其中所述免疫抑制劑的劑量單位包 含少于作為單一療法使用時所述免疫抑制劑的劑量單位。
71.根據(jù)權(quán)利要求69至70中任一項的藥物組合物，其中根據(jù)權(quán)利要求69至70中任 一項的免疫抑制劑的減少是至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %，優(yōu)選至少75 %。
72.根據(jù)權(quán)利要求67至71中任一項的藥物組合物，其中所述免疫抑制劑選自環(huán)磷酰胺 和麥考酚酸酯。
73.根據(jù)權(quán)利要求64至72中任一項的，并且更具體而言權(quán)利要求71和72中任一項的 藥物組合物，其中所述慢性疾病是狼瘡腎炎和/或肺炎。
74.根據(jù)權(quán)利要求64至66中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含第二種藥 學(xué)活性試劑，由此此類第二種藥學(xué)活性試劑是抗炎劑。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的藥物組合物，其中所述抗炎劑作為分開的劑量單位包含在所述 藥物組合物中。
76.根據(jù)權(quán)利要求74至75中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物比包含抗炎劑 作為單一療法的藥物組合物包含更少的抗炎劑。
77.根據(jù)權(quán)利要求74至76中任一項的藥物組合物，其中所述抗炎劑的劑量單位包含少 于作為單一療法使用時所述免疫抑制劑的劑量單位。
78.根據(jù)權(quán)利要求76至77中任一項的藥物組合物，其中根據(jù)權(quán)利要求76至77中任 一項的免疫抑制劑的減少是至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %，優(yōu)選至少75 %。
79.根據(jù)權(quán)利要求74至78中任一項的藥物組合物，其中所述抗炎劑選自地塞米松和羅 氟司特，優(yōu)選地所述抗炎劑是地塞米松。
80.根據(jù)權(quán)利要求74至79中任一項的，并且更具體而言權(quán)利要求78和79中任一項的 藥物組合物，其中所述慢性疾病是慢性呼吸道疾病和更優(yōu)選地C0PD。
81.如權(quán)利要求1至63中任一項限定的核酸分子，用于在用于治療患有慢性疾病或慢 性病癥或處于發(fā)展慢性疾病或慢性病癥的危險中的受試者的方法中，由此所述方法包括-給所述受試者施用藥學(xué)活性量的核酸分子。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的核酸分子，其中所述慢性疾病或慢性病癥如前述權(quán)利要求中任 一項中限定的。
83.根據(jù)權(quán)利要求81至82中任一項的核酸分子，其中所述方法進(jìn)一步包括步驟“給所述受試者施用免疫抑制劑。
84.根據(jù)權(quán)利要求83的核酸分子，其中在治療過程中施用的免疫抑制劑的量小于作為 單一療法將施用于受試者的免疫抑制劑的量。
85.根據(jù)權(quán)利要求84的核酸分子，其中所述免疫抑制劑的量減少至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，優(yōu)選至少 75%。
86.根據(jù)權(quán)利要求81至85中任一項的核酸分子，其中所述免疫抑制劑選自環(huán)磷酰胺和麥考酚酸酯。
87.根據(jù)權(quán)利要求81至86中任一項的，并且更具體而言權(quán)利要求85和86中任一項的 核酸分子，其中所述慢性疾病是慢性腎疾病，優(yōu)選狼瘡腎炎和/或肺炎。
88.根據(jù)權(quán)利要求81至82中任一項的核酸分子，其中所述方法進(jìn)一步包括步驟_給所述受試者施用抗炎劑。
89.根據(jù)權(quán)利要求88的核酸分子，其中在治療過程中施用的抗炎劑的量小于作為單一 療法將施用于受試者的免疫抑制劑的量。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的核酸分子，其中所述免疫抑制劑的量減少至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，優(yōu)選至少 75%。
91.根據(jù)權(quán)利要求88至90中任一項的核酸分子，其中所述抗炎劑選自地塞米松和羅氟 司特，優(yōu)選地是地塞米松。
92.根據(jù)權(quán)利要求88至91中任一項，并且更具體而言權(quán)利要求90和91中任一項的核 酸分子，其中所述慢性疾病是慢性呼吸道疾病，優(yōu)選C0PD。
93.如權(quán)利要求1至63中任一項中限定的核酸分子，在制備用于治療和/或預(yù)防慢性 疾病或慢性病癥的藥劑中的用途。
94.根據(jù)權(quán)利要求93的用途，其中所述疾病或病癥是如前述權(quán)利要求中任一項中限定 的疾病或病癥。
95.根據(jù)權(quán)利要求93至94中任一項的用途，其中所述藥劑用于人醫(yī)學(xué)或用于獸醫(yī)學(xué)。
96.用于診斷慢性疾病或慢性病癥的方法，所述方法包括下述步驟-使來自受試者的樣品與如與權(quán)利要求1至63中任一項中限定的核酸分子接觸，所述 受試者待測試是否患有慢性疾病或慢性病癥或處于發(fā)展慢性疾病或慢性病癥的危險中；和-檢測是否形成包含MCP-1和所述核酸分子的復(fù)合物。
97.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，其中所述慢性疾病或慢性病癥是如前述權(quán)利要求中任一 項中限定的慢性疾病或慢性病癥。
98.如權(quán)利要求1至63中任一項中限定的核酸分子，在制備用于診斷如與如前述權(quán)利 要求中任一項中限定的慢性疾病或慢性病癥的診斷劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合MCP-1的核酸分子，由此該核酸分子用于作為用于治療和/或預(yù)防慢性疾病或慢性病癥的藥劑使用，所述慢性疾病或慢性病癥優(yōu)選選自慢性呼吸道疾病、慢性腎疾病和全身性紅斑狼瘡。
文檔編號A61K31/00GK101878305SQ200880118455
公開日2010年11月3日 申請日期2008年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者C·馬什, D·尤爾伯格, F·雅羅施, K·布赫納, S·克魯斯曼, W·普爾施克 申請人:諾松制藥股份公司