專利名稱:使用(-)-尼伐地平對映體減少淀粉狀蛋白沉積、淀粉狀蛋白神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及治療腦致淀粉樣變(amyloidogenic)疾病例如阿爾茨海默病的病理 生理作用的方法。更具體地說,該方法包括施用尼伐地平的(_)對映體以對抗患有與腦淀 粉樣變相關(guān)的疾病例如阿爾茨海默病的動物或人腦中的病理生理作用,并且與尼伐地平的 外消旋混合物相比抗高血壓副作用減少。
背景技術(shù):
相關(guān)領(lǐng)域的描述阿爾茨海默病(AD)是最常見的衰老性神經(jīng)變性障礙,累及約1 %超過65歲的人 口。這種疾病的特征性特點(diǎn)包括胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、胞外實(shí)質(zhì)老年斑和腦血管沉積物在 腦中的進(jìn)行性蓄積。老年斑和腦血管沉積物的主要成分是39-43個氨基酸的β-淀粉樣肽 (Α β ),其通過蛋白水解衍生自淀粉樣前體蛋白(APP) — 一種跨膜糖蛋白。APP是具有590-680個氨基酸胞外氨基末端結(jié)構(gòu)域和約55個氨基酸胞質(zhì)尾區(qū)的單 一-跨膜蛋白。來自21號染色體上的APP基因的信使RNA進(jìn)行可變剪接,產(chǎn)生8種可能的 同工型,其中3種同工型(695、751和770個氨基酸的同工型)在腦中占優(yōu)。APP通過稱作 α-、β-和Y-分泌酶的3種酶活性進(jìn)行蛋白酶解加工。α-分泌酶在Αβ結(jié)構(gòu)域的第17 個氨基酸處裂解ΑΡΡ,從而釋放用于分泌的可溶性大氨基末端片段α-ΑΡΡ。因?yàn)棣?分泌 酶在Αβ結(jié)構(gòu)域內(nèi)裂解,所以這種裂解排除了 Αβ形成?;蛘?,APP可以被β-分泌酶裂解 以確定Αβ的氨基末端和生成可溶性氨基末端片段β-ΑΡΡ。隨后Y-分泌酶對APP的胞內(nèi) 羧基末端結(jié)構(gòu)域的裂解導(dǎo)致生成多種肽,最常見的兩種是40個氨基酸的Αβ (Αβ 40)和42 個氨基酸的Αβ (Αβ42)。Αβ40占分泌的Αβ的90-95%,是從腦脊液中回收的占優(yōu)勢種類 (Seubert 等人,Nature,359 :325_7,1992)。相反,小于 10 % 的分泌的 A β 是 Αβ42。盡管 A β 42產(chǎn)生較少,但是A β 42是在斑塊中發(fā)現(xiàn)的占優(yōu)勢的種類并且在最初沉積,這可能是由 于其形成不溶性淀粉狀蛋白聚集物比Αβ 40更快所導(dǎo)致的(Jarrett等人,Biochemistry, 32:4693-7,1993)。認(rèn)為Αβ在腦中的異常蓄積是由APP超表達(dá)或加工改變所導(dǎo)致的。由此認(rèn)為Αβ肽在AD的病理學(xué)中起關(guān)鍵作用,因?yàn)榕cAD的家族型相關(guān)的所有突 變均導(dǎo)致這些來自APP的肽的加工改變。實(shí)際上,Αβ的不溶性或聚集的原纖維在腦中的 沉積物是AD所有形式的突出的神經(jīng)病理學(xué)特征,與受試者的遺傳素質(zhì)無關(guān)。隨Αβ沉積同時出現(xiàn)的是在AD腦中存在炎性途徑的顯著活化,包括Αβ沉積物 中和Αβ沉積物周圍的促炎細(xì)胞因子和急性期反應(yīng)物的產(chǎn)生(McGeer等人,J Leukocyte Biol. ,65 :409-15,1999)。認(rèn)為腦的駐留先天免疫細(xì)胞(即小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)的活化與該 炎性級聯(lián)密切相關(guān)。已經(jīng)證實(shí),反應(yīng)性小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子例如炎性蛋白和急性期反應(yīng)物例如α 1-抗胰凝乳蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長因子β、載脂蛋白E和補(bǔ)體因子,已經(jīng) 證明它們均定位于A β斑塊,促進(jìn)A β斑塊“凝聚”或成熟(Nilsson等人,J. Neurosci. 21 1444-5,2001),并且在高水平時促進(jìn)神經(jīng)變性。流行病學(xué)研究已經(jīng)顯示,使用非留體抗炎 藥(NSAIDS)的患者的 AD 風(fēng)險下降高達(dá) 50% (Rogers 等人,Neurobiol. Aging 17 :681_6, 1996),進(jìn)行NSAID治療的AD患者死亡后評價已經(jīng)證明風(fēng)險下降與活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì) 胞數(shù)量減少相關(guān)(Mackenzie 等人,Neurology 50:986-90,1998)。此外,當(dāng)對 Tg APPsw 小 鼠(即阿爾茨海默病小鼠模型)給予NSAID(布洛芬)時,這些動物顯示出與小神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞活化減少相關(guān)的Αβ沉積物、星形細(xì)胞增多和營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎減少(Lim等人, J. Neurosci. 20 :5709_14,2000)。因此,在AD腦中炎性過程的產(chǎn)物可以加劇AD病狀。此外,有證據(jù)表明AD腦中的 活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不清除Αβ,通過促進(jìn)Αβ原纖維生成和作為結(jié)果的老年斑沉積而 致病(Wegiel 等人,Acta Neuropatho 1. (Berl.) 100 :356_64,2000)。還已經(jīng)表明,AD發(fā)病機(jī)制是由A β的神經(jīng)特性特性所致。A β的細(xì)胞毒性首先在來 自嚙齒動物腦的初級細(xì)胞培養(yǎng)物中被確認(rèn),并且在人細(xì)胞培養(yǎng)物中也得到了確認(rèn)。Mattson 等人的工作(J. Neurosci.,12 =376-389,1992)顯示在興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸存在下A β導(dǎo) 致胞內(nèi)鈣直接病理性增加,認(rèn)為它通過其第二信使活性的顯著增加而對細(xì)胞極具毒性。美國專利申請No. 2005/0009885 (2005年1月13日)(Mullan等人)公開了使用 尼伐地平減少Αβ沉積的方法以及使用尼伐地平診斷腦致淀粉樣變疾病的方法。然而,美 國專利4,338,322描述了尼伐地平的抗高血壓作用。在愛爾蘭,尼伐地平(NIVADIL )已 經(jīng)被管理部門批準(zhǔn)以8mg/天的劑量或者如果使用8mg/天的劑量無法達(dá)到足夠的抗高血壓 作用以16mg/天的劑量治療高血壓。還可參見美國專利5,508,413,其公開了尼伐地平的 (+)_對映體的抗高血壓作用。外消旋的尼伐地平及其對人類個體的局部腦血流的影響在 Hanyu ^A (Nuclear Medicine Communications, vol. 28, no. 4, % 281-287 Μ, 2007 ^Ξ 4 月)中有報道。盡管存在上述報道,但是對預(yù)防腦變性(其是AD的標(biāo)志)的無情進(jìn)展存在需求, 其中所述預(yù)防用治療上有效的治療解決Αβ沉積、Αβ神經(jīng)毒性、小神經(jīng)膠質(zhì)活化的炎癥和 在AD患者中觀察到的APP改變或超表達(dá),并且副作用例如不希望的或過度的血壓下降很輕 微。發(fā)明概述為了滿足這一需求,本發(fā)明提供了在患有腦致淀粉樣變疾病例如阿爾茨海默病 (AD)的動物或人中減少Αβ沉積、Αβ神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生(microgliosis)的方 法,通過對所述動物或人施用治療有效量的對映體富集的(-)_尼伐地平來進(jìn)行。本發(fā)明特 別是提供了與相同量的外消旋的尼伐地平相比降血壓作用減輕的對映體富集的(-)_尼伐 地平的施用。此外,對映體富集的(-)_尼伐地平的施用與外消旋的尼伐地平或(+)_尼伐 地平的施用相比允許劑量增加,這是由于降血壓作用減輕所致。例如,本文給出的數(shù)據(jù)證明 了針對(-)_對映體用FPL64176攻擊時的基線主動脈收縮,它與(_)_對映體相比于外消旋 混合物或表現(xiàn)出血管活性(即拮抗誘導(dǎo)的血管收縮)的(+)_對映體而言血管活性降低相 關(guān)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,在所施用的組合物中(-)_對映體以過量存在,且對映體過量優(yōu) 選是90%或90%以上、95%或95%以上,更優(yōu)選是98%或98%以上,包括100%,至多達(dá)純度的可檢測限。本發(fā)明還提供了在患有外傷性腦損傷的動物或人中減少Αβ沉積、Αβ神經(jīng)毒性 和小神經(jīng)膠質(zhì)增生的風(fēng)險的方法,通過在頭部損傷后對所述動物或人施用治療有效量的對 映體富集的(-)_尼伐地平和此后繼續(xù)進(jìn)行對映體富集的(-)_尼伐地平治療達(dá)預(yù)定的時間 期限來進(jìn)行。本發(fā)明特別是提供了與相同量的外消旋的尼伐地平相比降血壓作用減輕的對 映體富集的(-)_尼伐地平的施用。此外,對映體富集的(-)_尼伐地平的施用與外消旋的 尼伐地平的施用相比允許劑量增加,這是由于降血壓作用減輕所致。在優(yōu)選的實(shí)施方案中, 在所施用的組合物中(_)-對映體以過量存在,且對映體過量優(yōu)選是90 %或90 %以上、95 % 或95%以上,更優(yōu)選是98%或98%以上,包括100%,至多達(dá)純度的可檢測限。本發(fā)明還提供了在被診斷為具有發(fā)生腦致淀粉樣變疾病或病癥的風(fēng)險的動物或 人中降低發(fā)生腦致淀粉樣變疾病或病癥的風(fēng)險或減緩腦致淀粉樣變疾病或病癥的發(fā)作或 進(jìn)展或穩(wěn)定腦致淀粉樣變疾病或病癥的癥狀的方法,包括對所述動物或人施用治療有效量 的對映體富集的(-)_尼伐地平,其中對映體富集的(-)_尼伐地平的施用在發(fā)生腦致淀粉 樣變疾病或病癥的風(fēng)險被診斷后開始。本發(fā)明特別是提供了與相同量的外消旋的尼伐地平 相比降血壓作用減輕的對映體富集的(-)_尼伐地平的施用。此外,對映體富集的(-)_尼 伐地平的施用與外消旋的尼伐地平的施用相比允許劑量增加,這是由于降血壓作用減輕所 致。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,在所施用的組合物中(-)_對映體以過量存在,且對映體過量優(yōu) 選是90%或90%以上、95%或95%以上,更優(yōu)選是98%或98%以上,包括100%,至多達(dá)純 度的可檢測限。本發(fā)明提供了治療腦致淀粉樣變疾病的臨床特性(包括一種或一種以上或所有 與腦致淀粉樣變疾病相關(guān)的認(rèn)知和行為特征)的方法。例如,就AD而言,這類特征可以包 括非限制性的癥狀列表,例如深度記憶喪失、執(zhí)行熟知的任務(wù)有困難、語言有問題、定向障 礙、判斷力下降、抽象思維受損、個性、心境或行為改變、和/或在一系列認(rèn)知測試中的特征 性評分。這類認(rèn)知測試包括韋克斯勒記憶量表修訂版(Wechsler Memory ScaleRevised) (WMS-R)、臨床癡呆分級評定(Clinical Dementia Rating) (CDR)、簡易精神狀態(tài)檢查 (Mini-Mental State Examination) (MMSE)和/或阿爾茨海默病評定量表-認(rèn)知子量表 (Alzheimer' s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale)(ADAS)。本發(fā)明提供了可以產(chǎn)生特定臨床結(jié)果的用對映體富集的(-)_尼伐地平進(jìn)行的治 療。一個治療終點(diǎn)是受腦致淀粉樣變疾病侵害的那些個體的一種或一種以上疾病癥狀的 可測量的改善。所述改善可導(dǎo)致患者無癥狀,或者可反映出與治療前的一種或一種以上癥 狀相比在能力上改善。或者,一個治療終點(diǎn)可以是維持基線癥狀水平。換言之,該終點(diǎn)表示 疾病或者疾病的一種或一種以上癥狀持續(xù)穩(wěn)定或在一定時間期限中穩(wěn)定。此外,一個治療 終點(diǎn)可以是與未治療的對照組相比疾病進(jìn)展的速度降低。此外,治療可以包括對被認(rèn)為具 有發(fā)生腦致淀粉樣變疾病的風(fēng)險、但尚未臨床表現(xiàn)出一種或一種以上癥狀的個體進(jìn)行預(yù)治 療。所提及的疾病的“治療”還包括一種或一種以上癥狀的治療,其中該治療是姑息性的, 而非治愈性的。本發(fā)明還提供了處理可移植神經(jīng)元干細(xì)胞的方法,包括在將干細(xì)胞移植入患有腦 致淀粉樣變疾病例如AD的動物或人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前對神經(jīng)干細(xì)胞施用一定量的對映 體富集的(-)_尼伐地平。所施用的量是實(shí)現(xiàn)所需的細(xì)胞保護(hù)作用的量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,在所施用的組合物中(-)_對映體以過量存在,且對映體過量優(yōu)選是90%或90%以上、 95%或95%以上,更優(yōu)選是98%或98%以上,包括100%,至多達(dá)純度的可檢測限。附圖簡述
圖1是說明使用4G8免疫染色技術(shù)獲得的長期施用尼伐地平對TgAPPsw小鼠腦的 不同區(qū)域中Αβ沉積(Αβ負(fù)荷)的影響的棒形圖。圖2是說明使用測定CD45+小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的CD45免疫染色技術(shù)獲得的長 期施用尼伐地平對TgAPPsw小鼠3個腦區(qū)域中小神經(jīng)膠質(zhì)活化的影響的棒形圖。圖3是說明在用脂多糖(LPS)體外活化24小時的N9鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中尼伐地 平對小神經(jīng)膠質(zhì)活化的影響的棒形圖。小神經(jīng)膠質(zhì)活化是根據(jù)用ELISA測定的TNF-α產(chǎn) 量(pg/ml)確定的。圖4是說明使用被30 μ M預(yù)聚集的A β 1-40 (AgA β )處理3天的HPNC細(xì)胞獲得的 尼伐地平施用對Αβ神經(jīng)毒性的影響的棒形圖。神經(jīng)毒性是通過測量從細(xì)胞中釋放的乳酸 脫氫酶(LDH)的量來評價的。圖5Α和5Β是說明使用被APPsw轉(zhuǎn)染的人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞獲得的尼伐地平對APP 加工的影響的棒形圖。將細(xì)胞用50ηΜ和250ηΜ尼伐地平處理24小時(圖5Α)和48小時 (圖5Β)。通過ELISA測量培養(yǎng)基中A β 1-40的產(chǎn)生。圖6是顯示尼伐地平的純對映體形式(尼伐地平1和尼伐地平2)以及兩種對映體 等比例的混合物(m+N2)在處理24小時后對7W WT 4 751中國倉鼠卵巢細(xì)胞產(chǎn)生々0 1-40 的影響的劑量響應(yīng)曲線。兩種對映體以類似方式顯示出劑量依賴性地抑制Aβ 1-40產(chǎn)生。圖7是顯示尼伐地平的純對映體形式(尼伐地平1和尼伐地平2)以及兩種對 映體等比例的混合物(Ν1+Ν2)在處理24小時后對7W WT ΑΡΡ751中國倉鼠卵巢細(xì)胞產(chǎn)生 Αβ 1-420的影響的劑量響應(yīng)曲線。注意到純對映體尼伐地平2和尼伐地平的外消旋混合物 (Ν1+Ν2)在低劑量下輕度刺激A β 1-42,而對映體尼伐地平1無這種作用。圖8是顯示尼伐地平對映體分離的手性色譜圖。Nilva_Peak_l對應(yīng)于㈠-尼伐 地平(尼伐地平1) ;Nilva_Peak_2對應(yīng)于(+)_尼伐地平(尼伐地平2)。Nilva_10表示尼 伐地平原始外消旋混合物,將其包括在圖中是出于說明目的。圖9顯示了(-)_尼伐地平(尼伐地平1)和(+)_尼伐地平(尼伐地平2)對 FPL64176誘導(dǎo)的大鼠主動脈血管收縮的影響。數(shù)據(jù)顯示(+) _尼伐地平完全拮抗FPL64176 誘導(dǎo)的血管收縮,而(-)_尼伐地平不影響L-型鈣通道激動劑的血管作用,這表明(+)-尼 伐地平是L-型鈣通道阻滯劑,而(_)-尼伐地平無這種作用。圖10是說明(-)-尼伐地平對93-周齡Tg APPsw小鼠腦A01-40和A β 1-42水平 的影響的棒形圖。將動物每天用(-)_尼伐地平(10mg/kg體重)腹膜內(nèi)處理,處理4天。圖11是說明(-)_尼伐地平的緩慢釋放對70-周齡Tg APPsw小鼠腦A β 1_42水平 的影響的棒形圖。將動物用皮下植入的生物可降解的丸劑處理26天。圖12說明了使用含有一層人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的24-孔半透明0. 4 μ m 膜插入物的血腦屏障體外模型。在不同的時間點(diǎn)評估熒光素-β淀粉狀蛋白1-42向頂部 隔室的遷移。圖13是顯示(-)_尼伐地平對腦Αβ跨血腦屏障清除的體外影響的棒形圖。A = 頂部,B=底外側(cè)。
圖14是顯示(_)-尼伐地平和尼伐地平外消旋混合物對腦A β跨血腦屏障清除的 體外影響的比較的棒形圖。A =頂部,B =底外側(cè)。圖15是顯示通過小鼠血漿A β水平測量的(-)_尼伐地平對腦Αβ跨血腦屏障清 除的體內(nèi)影響的棒形圖。圖16是顯示生物可降解的(-)_尼伐地平丸劑對腦Αβ跨血腦屏障清除的體內(nèi)影 響的棒形圖。圖17Α和17Β顯示了(+)-尼伐地平和(_)-尼伐地平在藥物劑量范圍內(nèi)的血管作 用特性的比較。優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供了用于在動物或人中解決腦變性(其是某些腦致淀粉樣變疾病例如 阿爾茨海默病(AD)的標(biāo)志)的無情進(jìn)展的預(yù)防方法和治療方法,通過施用對映體富集的 ㈠_尼伐地平(異丙基3-甲基2-氰基-1,4- 二氫-6-甲基-4-(間-硝基苯基)-3,5-吡 啶-二甲酸酯;MW 385.4)來進(jìn)行。本發(fā)明的方法包括治療、預(yù)防和改善癥狀。除非另有具體規(guī)定,否則本文所用的術(shù)語尼伐地平是指外消旋混合物。本文所用 的術(shù)語“對映體富集的”是指一種化合物,其是其中(-)_對映體以過量存在且優(yōu)選以90% 或90%以上、95%或95%以上、更優(yōu)選98%或98%以上、包括100%、至多達(dá)純度的可檢 測限的程度存在的對映體混合物。例如,可通過使用手性HPLC方法進(jìn)行的檢測來測定純 度。在一個實(shí)施方案中,通過用主要組分減去次要組分來計(jì)算對映體過量。例如,具有98% (-)-對映體和2% (+)-對映體的對映體混合物將被計(jì)算為(_)-對映體96%對映體過量。特定地,本發(fā)明的一個實(shí)施方案提供了在患有腦致淀粉樣變疾病或病癥的動物或 人中減少Αβ沉積、Αβ神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生的方法,通過對所述動物或人施用治療 有效量的對映體富集的(-)_尼伐地平來進(jìn)行。因?yàn)榇蟛糠帜X致淀粉樣變疾病例如AD是慢 性的進(jìn)行性的頑固性腦癡呆,所以考慮到對映體富集的(-)_尼伐地平治療的期限將持續(xù) 長達(dá)動物或人的終生。腦致淀粉樣變疾病或病癥包括但不限于阿爾茨海默病、外傷性腦損 傷和腦淀粉樣血管病。在另一個實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了治療傳染性海綿狀腦病、瘙癢病或 Gerstmann-Straussler-Scheinker 綜合征的方法。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中,提供了在患有外傷性腦損傷(TBI)的動物或人中 降低A β沉積、A β神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生的風(fēng)險的方法,通過在TBI后對所述動物或 人施用治療有效量的對映體富集的(-)_尼伐地平和此后繼續(xù)對映體富集的(-)_尼伐地平 治療達(dá)預(yù)定時間期限來進(jìn)行??紤]用于這些患有TBI的動物或人的對映體富集的(-)-尼 伐地平的治療期限能持續(xù)約1小時_5年,優(yōu)選約2周-3年,最優(yōu)選約6個月-12個月。在另一個實(shí)施方案中,提供了治療腦致淀粉樣變疾病的臨床特性(包括一種或一 種以上或所有與腦致淀粉樣變疾病相關(guān)的認(rèn)知和行為特征)的方法。例如,就AD而言,這類 特征可以包括非限制性的癥狀列表,例如深度記憶喪失、執(zhí)行熟知的任務(wù)有困難、語言有問 題、定向障礙、判斷力下降、抽象思維受損、個性、心境或行為改變、和/或在一系列認(rèn)知測 試中的特征性評分。這類認(rèn)知測試包括韋克斯勒記憶量表修訂版(WMS-R)、臨床癡呆分級評 定(CDR)、簡易精神狀態(tài)檢查(MMSE)和/或阿爾茨海默病評定量表-認(rèn)知子量表(ADAS)。在一個或一個以上實(shí)施方案中,使用對映體富集的(-)_尼伐地平進(jìn)行的治療可以產(chǎn)生特定的臨床結(jié)果。一個治療終點(diǎn)是受腦致淀粉樣變疾病侵害的那些個體的一種或一 種以上疾病癥狀的可測量的改善。這種改善可導(dǎo)致患者無癥狀,或者可反映出與治療前的 一種或一種以上癥狀相比在能力上改善?;蛘撸粋€治療終點(diǎn)可以是維持基線癥狀水平。 換言之,該終點(diǎn)表示疾病或者疾病的一種或一種以上癥狀持續(xù)穩(wěn)定或在一定時間期限中穩(wěn) 定。此外,一個治療終點(diǎn)可以是與未治療的對照組相比疾病進(jìn)展的速度降低。此外,治療可 以包括對被認(rèn)為具有發(fā)生腦致淀粉樣變疾病的風(fēng)險、但尚未臨床表現(xiàn)出一種或一種以上癥 狀的個體進(jìn)行預(yù)治療。所提及的疾病的“治療”還包括一種或一種以上癥狀的治療,其中該 治療是姑息性的,而非治愈性的。根據(jù)本發(fā)明的方法任選以單位劑型施用于患有腦致淀粉樣變疾病或患有外傷性 腦損傷的動物或人以及以確定動物或人發(fā)生腦致淀粉樣變疾病的風(fēng)險和/或診斷動物或 人的腦致淀粉樣變疾病為目的所施用的對映體富集的(-)_尼伐地平的治療有效量可以為 約0. 05mg-20mg/天,優(yōu)選約2mg_15mg/天,更優(yōu)選約4mg_12mg/天,最優(yōu)選約8mg/天。日 劑量可以每天以單一單位劑量的形式或分成2、3或4個單位劑量施用。在另一個實(shí)施方案 中,對映體富集的(-)_尼伐地平的治療有效量為大于16mg/天,直至最大耐受劑量限。例 如,對映體富集的(-)_尼伐地平的治療有效量可以為16mg/天-約20mg/天?;蛘撸瑢τ丑w 富集的(-)_尼伐地平的治療有效量可以為約20mg/天、約30mg/天、約40mg/天、約50mg/ 天、約75mg/天、約IOOmg/天、約125mg/天、約150mg/天、約175mg/天、約200mg/天、約 225mg/ 天、約 250mg/ 天、約 275mg/ 天、約 300mg/ 天、約 325mg/ 天、約 350mg/ 天、約 375mg/ 天、約400mg/天、約425mg/天、約450mg/天、約475mg/天、約500mg/天、或者高達(dá)最大耐 受劑量/天,以及位于上述用量之間的任意整數(shù)量或其它量。范圍可以改變。例如,非限制 性范圍包括 20、40、60、80 或 IOOmg/ 天的下限端點(diǎn)和 50、100、150、200、250、300 和 500mg/ 天的上限端點(diǎn),也可以用上述用量內(nèi)的任意整數(shù)量或其它量作為端點(diǎn)。不希望受理論約束,認(rèn)為抗高血壓作用可限制外消旋尼伐地平的最大耐受量。在 本發(fā)明的一個實(shí)施方案中,在施用對映體富集的(-)_尼伐地平后,對映體富集的(-)_尼伐 地平的治療有效量以選自小于約30%、小于約20%、小于約10%、小于約5%和小于約
的治療前血壓的量降低血壓??梢砸愿鞣N方式測量血壓。例如,可以以毫米汞柱將血壓測 量為收縮壓或舒張壓?;蛘?,可以根據(jù)公式2/3舒張壓+1/3收縮壓讀數(shù)計(jì)算血壓。在一個實(shí)施方案中, 連續(xù)監(jiān)測血壓并且相對于時間進(jìn)行積分,得到曲線下面積(AUC)的單一值。可以將血壓的 變化與正常群體進(jìn)行比較,或可以將血壓的變化與治療個體治療前的血壓進(jìn)行比較。在一 個實(shí)施方案中,在治療期后測量治療后的血壓,此時已經(jīng)建立了血壓的穩(wěn)態(tài)變化。例如,可 以在治療約1周、治療約4周、治療約12周、治療約6個月等之后測量治療后的血壓。在一 個實(shí)施方案中,對具有正常血壓或低血壓的人或動物施用對映體富集的(-)_尼伐地平。在 一個實(shí)施方案中,對高血壓的人或動物施用對映體富集的(-)_尼伐地平。在人中,正常血 壓視為約90/50mm Hg-約135/90mm Hg。低于正常范圍的人血壓被視為低血壓。在另一個實(shí)施方案中,將本發(fā)明的治療劑施用于高血壓患者,或者施用于患者,無 論其血壓水平如何。高血壓患者可以同時用抗高血壓藥治療。高于正常范圍的人血壓被視 為高血壓??梢栽跇?biāo)準(zhǔn)獸醫(yī)手冊中找到各種動物的正常范圍。在一個實(shí)施方案中,血壓位于正常范圍中,該正常范圍是天然的或因藥物干預(yù)例如施用另外的抗高血壓藥所致。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中是預(yù)處理可植入的人或異種神經(jīng)元干細(xì)胞的方法, 通過在將細(xì)胞移植入可患有腦致淀粉樣變疾病例如AD的動物或人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前對 所述神經(jīng)元干細(xì)胞施用治療有效量的對映體富集的(-)_尼伐地平來進(jìn)行。據(jù)推測,神經(jīng)元 干細(xì)胞自身將不具有明顯的Αβ沉積。然而,如果神經(jīng)元植入旨在針對Αβ-負(fù)荷環(huán)境,則 神經(jīng)元干細(xì)胞的預(yù)處理應(yīng)通過降低Aβ濃度和由此降低其中的Αβ -毒性而增強(qiáng)植入的神 經(jīng)元在其新環(huán)境中存活的能力。被施用用于預(yù)處理神經(jīng)元干細(xì)胞的對映體富集的(-)_尼 伐地平的治療有效量可以為約1ηΜ-3 μ Μ,優(yōu)選約10ηΜ-2 μ Μ,最優(yōu)選約IOOnM-I μ Μ。已知當(dāng) 涉及分化成特定細(xì)胞類型如神經(jīng)元細(xì)胞時,干細(xì)胞提供了可更新來源的替代細(xì)胞和組織的 能力以治療疾病和病癥,例如阿爾茨海默病、帕金森病或脊髓損傷。當(dāng)將這類細(xì)胞移植/植 入患者時,適當(dāng)?shù)氖遣粌H用對映體富集的(-)_尼伐地平預(yù)處理細(xì)胞,而且還在植入后開始 用對映體富集的(-)_尼伐地平對患者進(jìn)行治療性治療。認(rèn)為本發(fā)明的方法可以用已知的AD轉(zhuǎn)基因動物模型例如PDAPP和TgAPPsw小鼠模 型進(jìn)行測試,然后再測試其在治療、預(yù)防和/或抑制與人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中淀粉狀蛋白沉積、 Aβ神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生相關(guān)的病癥方面的功效。這類AD轉(zhuǎn)基因動物模型使用本領(lǐng) 域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建,例如,如美國專利5,487,992 ;5, 464,764 ;5, 387,742 ;5, 360,735 ; 5,347,075 ;5,298,422 ;5,288,846 ;5,221,778 ;5,175,385 ;5,175,384 ;5,175,383 ;和 4,736,866中所述的那樣構(gòu)建。對映體富集的(-)_尼伐地平可以通過各種途徑施用于患者,包括胃腸外、口服或 腹膜內(nèi)途徑。胃腸外施用包括下列途徑靜脈內(nèi)施用;肌內(nèi)施用;間質(zhì)(interstitial)施 用;動脈內(nèi)施用;皮下施用;眼內(nèi)施用;顱內(nèi)施用;鞘內(nèi)施用;心室內(nèi)施用;滑膜內(nèi)施用;經(jīng) 上皮施用,包括透皮施用、經(jīng)由吸入肺施用、眼科施用、舌下施用和口含施用;局部施用,包 括眼科施用、皮膚施用、眼施用、直腸施用或經(jīng)由吹入或霧化鼻吸入施用??诜┯玫膶τ丑w富集的(-)_尼伐地平可以包封在硬或軟殼明膠膠囊中或壓制 成片劑。還可以將對映體富集的(-)_尼伐地平與賦形劑摻和并且以可攝入的片劑、含片、 藥片(troche)、膠囊、小藥囊、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等形式使用。此外,對 映體富集的(-)_尼伐地平可以是粉末或顆粒的形式、在水性液體或非水性液體中的溶液 或混懸液的形式、或者水包油型或油包水型乳劑的形式。片劑、藥片、丸劑、膠囊等還可以含有例如,粘合劑,例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉 米淀粉;凝膠化賦形劑,例如磷酸二鈣;崩解劑,例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等;潤 滑劑,例如硬脂酸鎂;甜味劑,例如蔗糖、乳糖或糖精;或者矯味劑??梢詫⒒钚猿煞峙渲瞥?單位劑型或非單位劑型或者以單位劑型或非單位劑型的形式施用。當(dāng)單位劑型是膠囊時, 它除了含有上述物質(zhì)外還可以含有液體載體。各種其它物質(zhì)可以作為包衣存在,后者用以 調(diào)整劑量單位的物理形式。例如,可以將片劑、丸劑或膠囊用蟲膠、糖或這二者包衣。糖漿 劑或酏劑可以含有尼伐地平、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥 基苯甲酸丙酯、染料和矯味劑。另外,可以將對映體富集的(-)_尼伐地平摻入持續(xù)釋放制 劑和配制物中??梢詫τ丑w富集的(-)_尼伐地平通過胃腸外或腹膜內(nèi)途徑施用于CNS。可以制 備游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽形式的尼伐地平在水與合適的表面活性劑例如羥丙基纖維素的混合物中的溶液。還可以制備其在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中以及在油中的分 散液。在普通貯存和使用條件下,這些制劑可以含有防腐劑和/或抗氧化劑,以防止微生物 的生長或化學(xué)降解。所需要的(-)_尼伐地平對映體在其手性中心上具有(R)構(gòu)型。本文提供的化合物 可以是對映體純的或與一些量的(+) (S)-尼伐地平的立體異構(gòu)體混合物。應(yīng)當(dāng)理解的是, 本文公開的對映體富集的(-)_尼伐地平涵蓋任何旋光活性形式、多晶型物或立體異構(gòu)形 式或其混合物,它們優(yōu)選具有本文所述的有用特性,在本領(lǐng)域中眾所周知如何制備旋光活 性形式和如何使用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)或使用本領(lǐng)域眾所周知的其它類似試驗(yàn)測定活性。 本文所用的術(shù)語“對映體富集的”是指一種化合物,其是其中(-)_對映體以過量存在且優(yōu) 選以90%或90%以上、95%或95%以上、更優(yōu)選98%或98%以上、包括100%、至多達(dá)純度 的可檢測限的程度存在的對映體混合物。例如,通過用手性HPLC方法進(jìn)行檢測可以測定純 度。能用于獲得化合物的旋光異構(gòu)體的方法的實(shí)例包括以下方法i)晶體的物理分離一一種技術(shù),其中各對映體的肉眼可見的晶體被手工分離。如 果存在獨(dú)立的對映體晶體,即該物質(zhì)是聚集物且晶體在視覺上是不同的,則可以使用該技 術(shù);ii)同時結(jié)晶一一種技術(shù),其中各對映體從外消旋物溶液中分別結(jié)晶出來,只有當(dāng) 外消旋物是固態(tài)聚集物時是可能的;iii)酶法拆分一一種技術(shù),其中利用對映體與酶的不同反應(yīng)速率來部分或完全分 離外消旋物;iv)酶法不對稱合成,即其中合成的至少一個步驟使用酶促反應(yīng)以獲得所需對映 體的對映體純的或?qū)τ丑w富集的合成前體的合成技術(shù);ν)化學(xué)不對稱合成一一種合成技術(shù),其中在產(chǎn)生產(chǎn)物不對稱性(即手性)的條件 下由非手性前體合成所需對映體,其可以使用手性催化劑或手性助劑來實(shí)現(xiàn);vi)非對映體分離一一種技術(shù),其中外消旋化合物、前體或半合成中間體與將各對 映體轉(zhuǎn)換成非對映體的對映體純的試劑(手性助劑)反應(yīng)。然后利用它們目前更為不同的 結(jié)構(gòu)差異通過色譜法或結(jié)晶法分離所得到的非對映體,之后除去手性助劑,得到所需的對 映體(例如參見 FujisawaPharmaceutical Co.,Ltd 的美國專利 5,508, 413);vii) 一級_和二級_不對稱轉(zhuǎn)化一一種技術(shù),其中來自外消旋物的非對映體平衡 至與所需對映體相比非對映體在溶液中占優(yōu)勢,或其中與所需的對映體相比非對映體優(yōu)先 結(jié)晶,打破平衡,使得最終所有物質(zhì)基本上從所需的對映體轉(zhuǎn)化成結(jié)晶性非對映體。然后從 非對映體中釋放所需的對映體;viii)動力學(xué)拆分一這種技術(shù)是指利用對映體與手性非外消旋試劑或催化劑在動 力學(xué)條件下的不相等的反應(yīng)速率來實(shí)現(xiàn)外消旋物的部分或完全拆分(或部分拆分的化合 物的進(jìn)一步拆分);ix)從非外消旋前體進(jìn)行對映體特異性合成一一種合成技術(shù),其中從非手性原料 獲得所需的對映體且其中立體化學(xué)完整性在合成過程中不受損害或僅受到極小程度的損 害;χ)手性液相色譜法一一種技術(shù),其中利用其與固定相的不同相互作用在液體流動相中分離外消旋物的對映體。固定相可以由手性物質(zhì)制成或者流動相可以含有另外的手性 物質(zhì)以引起不同相互作用;xi)手性氣相色譜法一一種技術(shù),其中將外消旋物揮發(fā),利用它們在氣態(tài)流動相中 與含有固定的非外消旋手性吸附相的柱的不同相互作用分對映體;xii)用手性溶劑提取一一種技術(shù),其中利用一種對映體優(yōu)先溶于特定手性溶劑中 分離對映體;和xiii)跨手性膜轉(zhuǎn)運(yùn)一一種技術(shù),其中使外消旋物與薄膜屏障接觸。該屏障典型地 分離兩種可混溶的流體,其中一種流體含有外消旋物,驅(qū)動力例如濃度或壓力差導(dǎo)致優(yōu)先 跨膜屏障轉(zhuǎn)運(yùn)。作為僅允許外消旋物的一種對映體通過的膜的非外消旋手性特性的結(jié)果發(fā) 生分離。xiv)液相色譜法一一種技術(shù),其中利用它們相對于手性固定相而言的分配系數(shù)差 異在正相溶劑系統(tǒng)中分離對映體。該技術(shù)用于產(chǎn)生本文所述的(-)_尼伐地平和(+)_尼伐 地平的旋光活性制備物(參見圖8)。已經(jīng)如下分離了尼伐地平的對映體尼伐地平1(-)_尼伐地平 文獻(xiàn)值[a]D20+222.4° (c = 1. 0,MeOH)測定值[a]D25+170.1° (c = 0. 05,MeOH)在 Satoh,Y. ;Okumura, K. ;Shiokawa, Y. Chem. Pharm. Bull. 42(4)950-952(1994) 中報道了尼伐地平對映體的旋光度的文獻(xiàn)值。關(guān)于分離的化合物的對映體純度的數(shù)據(jù),參 見圖5。術(shù)語“約”意指在所述量的士 10%內(nèi)或在測定記數(shù)的實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)。術(shù)語“基本由… 組成的組合物”用于涵蓋其中活性藥物成分如所述的那樣的組合物。在一個實(shí)施方案中,術(shù) 語“基本由…組成”排除了未列出的活性藥物成分,但不排除藥學(xué)上可接受的介質(zhì)、載體或文獻(xiàn)值[a]D2°-219.6° (c = 1. 0,MeOH)測定值[a]D20-99.0° (c = 0. 057,MeOH)尼伐地平2
稀釋劑或者配制活性藥物成分的方式。在一個實(shí)施方案中,例如,在治療方法中,術(shù)語“基本 由…組成”可涵蓋作為用于該特定適應(yīng)癥的僅有的治療劑施用一種或一種以上活性藥物成 分,但是不排除由于其它原因或適應(yīng)征而施用的治療劑。
實(shí)施例在下面的非限制性實(shí)施例中更具體地描述了本發(fā)明的用于在患有與淀粉樣變相 關(guān)的疾病例如AD的動物或人中減少Aβ的病理作用的方法。實(shí)施例1-5提供了用于比較 目的的外消旋尼伐地平的數(shù)據(jù)。尼伐地平對映體的色譜純化通過高效液相色譜法(HPLC)使用改性纖維素固定相(ChiralTechnologiesjest Chester, PA)實(shí)現(xiàn)尼伐地平的兩種對映體的色譜純化。色譜條件如下柱內(nèi)徑IOmm ;柱長 250mm;流動相95 5體積比的己烷與乙醇;流速2. 5ml/min ;柱溫7°C。使用以信號為基 礎(chǔ)的級分收集將外消旋尼伐地平重復(fù)進(jìn)樣,得到本文所述實(shí)施例的純化的對映體。參見圖 8。實(shí)施例1尼伐地平對A β沉積(淀粉狀蛋白負(fù)荷)的長期施用 使用4G8抗-A β單克隆抗體免疫染色技術(shù)檢驗(yàn)長期施用尼伐地平對TgAPPsw小鼠 腦不同區(qū)域中Αβ沉積(淀粉狀蛋白負(fù)荷)的影響。鑒于其對Αβ沉積的定量分析而言穩(wěn) 健的信號和最佳結(jié)果,選擇4G8免疫技術(shù)用于測定A β負(fù)荷。簡言之,如之前(NakagawaJ 等人,Exp. Neurol. , 163 =244-252,2000)所述對石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查。將切片 在二甲苯中脫石蠟,在一系列乙醇和去離子水中水化,通過將切片浸入88%甲酸中60min 進(jìn)行抗原回收步驟,此后對Αβ進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查。用水洗滌切片,使用新制備的甲 醇(150ml)與過氧化氫(33%,30ml)混合物淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。根據(jù)銷售商(Vector Laboratories,Burlingame,Calif.)的說明書使用抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物法。通過 測定Αβ染色陽性的腦區(qū)域的百分比評價淀粉狀蛋白負(fù)荷。陰性對照包括對切片應(yīng)用相同 的免疫組織化學(xué)方案,不同的是使用免疫前血清,而非一抗。將TgAPPsw小鼠分成接受有效 量的尼伐地平的實(shí)驗(yàn)組(η = 7)和接受介質(zhì)的對照組(η = 5)。如圖1中所示,使用尼伐地平進(jìn)行治療與對照組相比在視皮質(zhì)中減少了約62%的 Αβ負(fù)荷、與對照組相比在頂葉皮層中減少了約65%的Αβ負(fù)荷、與對照組相比在運(yùn)動皮質(zhì) 中減少了約58%的Αβ負(fù)荷、與對照組相比在梨形皮質(zhì)中減少了約58%的Αβ負(fù)荷、與對 照組相比在海馬的CAl區(qū)中減少了約52%的Αβ負(fù)荷,與對照組相比在海馬的CA2-CA3區(qū) 中減少了約50%的Αβ負(fù)荷。實(shí)施例2尼伐地平對小神經(jīng)膠質(zhì)活化的長期施用使用CD45免疫染色技術(shù)在小鼠腦的三個區(qū)域中檢驗(yàn)長期施用尼伐地平對TgAPPsw 小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)活化的影響。簡言之,在低溫恒溫器腦切片上進(jìn)行⑶45 (小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物)的 免疫組織化學(xué)檢查。通過在4°C下與抗CD45鼠單克隆抗體(Chemicon International) 一 起孵育過夜對CD45-陽性小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫固定,然后應(yīng)用生物素化的兔抗小鼠二抗30分鐘。使用二氨基聯(lián)苯胺色原底物完成CD45的檢測,所述二氨基聯(lián)苯胺色原底物在 ⑶45-陽性小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上產(chǎn)生棕色細(xì)胞表面染色。如圖2中所示,當(dāng)與對照組相比時,以有效劑量施用的尼伐地平治療在海馬中減 少了約33%的小神經(jīng)膠質(zhì)活化、在頂葉皮層中減少了約43%的小神經(jīng)膠質(zhì)活化,在運(yùn)動皮 質(zhì)中減少了約27%的小神經(jīng)膠質(zhì)活化。實(shí)施例3尼伐地平施用對小神經(jīng)膠質(zhì)活化的影響在用脂多糖(LPS)體外活化24小時的N9鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中檢驗(yàn)?zāi)岱サ仄綄π?神經(jīng)膠質(zhì)活化的影響。N9鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是充分表征的來源于胚胎小鼠腦的清除劑鼠小 神經(jīng)膠質(zhì)克隆。通過用ELISA測定的TNF-α產(chǎn)生(pg/ml)來確定小神經(jīng)膠質(zhì)活化的程度。 如圖3中所示,未用LPS活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(對照組細(xì)胞)產(chǎn)生了約40pg/ml TNF- α。 在50ηΜ尼伐地平存在下小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生約40pg/ml TNF-α。將尼伐地平施用增加10 倍(500ηΜ)不改變TNF-α產(chǎn)生。在1 μ g/ml LPS存在下小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生約820pg/ml TNF-α,與對照組細(xì)胞和施用尼伐地平的細(xì)胞相比增加約95%。在1 μ g/ml LPS+50nM尼 伐地平二者均存在下小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生約670pg/ml TNF-a。LPS+500nM尼伐地平施用 將TNF-a產(chǎn)生降低至約610pg/ml。因此,尼伐地平對抗了約20-25%的LPS-誘導(dǎo)的小神 經(jīng)膠質(zhì)活化。實(shí)施例4尼伐地平施用對A β神經(jīng)毒性的影響使用用30 μ M預(yù)聚集的A β 1-40 (AgA β )處理3天的人神經(jīng)元祖細(xì)胞(HNPC)檢驗(yàn) 尼伐地平施用(IOnM和IOOnM)對Αβ神經(jīng)毒性的影響。HNPC細(xì)胞在用環(huán)AMP處理后易于 分化成神經(jīng)元。將環(huán)AMP (ImM) (Sigma)加入到培養(yǎng)基中,將HNPC細(xì)胞在37°C下、在不含血 清的條件下孵育48小時或48小時以上。正如通過使用抗微管相關(guān)蛋白MAP-2抗體染色大 部分細(xì)胞所證實(shí)的那樣,該培養(yǎng)基使得祖細(xì)胞分化成神經(jīng)元譜系的細(xì)胞。通過測定從細(xì)胞 中釋放的乳酸脫氫酶(LDH ;在所有細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)酶)的量評價神經(jīng)毒性。如圖4中所示,使用AgAii處理的細(xì)胞比用尼伐地平處理的細(xì)胞LDH釋放增加約 44%。當(dāng)與AgAii —起加入IOnM尼伐地平時,LDH釋放沒有改變。然而,當(dāng)尼伐地平的給 藥劑量從10倍增加至IOOnM時,LDH釋放量減少了約44%。實(shí)施例5尼伐地平施用對APP加工的影響使用用APPswR染的人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞檢驗(yàn)?zāi)岱サ仄綄PP加工的影 響。使用50nM和250nM尼伐地平將細(xì)胞處理24和48小時,通過使用商購人A β 1-40 ELISA(Biosource, CA)測定培養(yǎng)基中A β 1-40的產(chǎn)生。如圖5Α中所示,處理24小時后,50ηΜ尼伐地平減少了 Αβ 1-40產(chǎn)生約9%,而 250ηΜ尼伐地平減少了 A β 1-40產(chǎn)生約15%。處理48小時后(圖5Β),50ηΜ尼伐地平減少 了 Αβ 1-40產(chǎn)生約18%,而250ηΜ尼伐地平減少了 Aβ 1-40產(chǎn)生約5%。實(shí)施例6可變劑量的外消旋的和分離的尼伐地平對映體對A β水平的影響處理24小時后使用7W WT ΑΡΡ751中國倉鼠卵巢細(xì)胞檢驗(yàn)?zāi)岱サ仄郊儗τ丑w形式、(_) _尼伐地平(尼伐地平1)和(+)“尼伐地平(尼伐地平2)(圖8)以及兩種對映體 的混合物(等比例)對Αβ 1-40和Αβ 1-42產(chǎn)生的影響。通過分別使用商購人Aβ 1-40 ELISA (Biosource,CA)和商購人 A β 1-42 ELISA (Biosource, CA)測定培養(yǎng)基中 A β 1-40 和 Aβ 1-42的產(chǎn)生。如圖6中所示,兩種對映體以類似方式顯示劑量依賴性地抑制A β 1-40產(chǎn)生。然 而,(+)_尼伐地平(尼伐地平2)和尼伐地平外消旋混合物(m+N2)在低劑量下輕度刺激 A β 1-42,而(-)_尼伐地平(尼伐地平1)不顯示出這種作用(圖7)。實(shí)施例7分離的尼伐地平對映體對大鼠主動脈血管收縮的影響檢驗(yàn)?zāi)岱サ仄郊儗τ丑w形式、(-)_尼伐地平(尼伐地平1)和(+)_尼伐地 平(尼伐地平2)(圖8)對FPL64176誘導(dǎo)的大鼠主動脈血管收縮的影響。將正常雄性 Sprague-Dawley大鼠(7-8個月齡)人道地實(shí)施安樂死,將新剖離的大鼠主動脈分割成 3-mm的環(huán)并且在容器浴儀器中的掛鉤上懸掛在Kreb緩沖液中。這些掛鉤與等長傳感器連 接,所述等長傳感器與MacLab系統(tǒng)連接。將主動脈環(huán)在組織浴系統(tǒng)中平衡2小時,每30min 更換一次Kreb緩沖液。對每一個主動脈環(huán)施加2g基線張力。在加入1 μ M FPL64176 (2, 5- 二甲基-4[2-(苯基甲基)苯甲?;鵠-IH-吡咯-3-甲酸甲酯)(一種有效的選擇性的 L-型鈣通道激動劑)之前2分鐘用IOOnM (-)-尼伐地平(尼伐地平1)、IOOnM (+)-尼伐地 平(尼伐地平2)預(yù)處理主動脈環(huán)或不進(jìn)行處理。使用FPL64176使主動脈環(huán)收縮30分鐘。 測定與基線相比的收縮量(單位g)并且計(jì)算所有這類值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。如圖9中所示,(+)_尼伐地平完全拮抗FPL64176誘導(dǎo)的血管收縮,而(_)_尼伐 地平不產(chǎn)生L-型鈣通道激動劑的血管作用,這表明(+)_尼伐地平是L-型鈣通道阻滯劑, 而(-)_尼伐地平無這種作用。本文提供的數(shù)據(jù)證明了針對(-)_對映體用FPL64176攻擊 時的基線主動脈收縮,其與(-)_對映體相比于外消旋混合物或顯示血管活性(即拮抗誘導(dǎo) 的血管收縮)的(+)_對映體而言血管活性降低相關(guān)。實(shí)施例8(-)-尼伐地平對腦Aβ水平的影響檢驗(yàn)分離的(-)_尼伐地平對腦Αβ 1-40和Αβ 1-42水平的影響。給93-周齡的 雄性轉(zhuǎn)基因APPsw小鼠(Tg APPsw品系2576)每天腹膜內(nèi)注射10mg/Kg體重的溶于DMSO的 (-)_尼伐地平(η = 4)或相同體積的(η = 4)介質(zhì)(100 μ L)。治療4天后,在末次注射 后1小時將動物人道地實(shí)施安樂死,采集其腦并且速凍在液氮中。將腦在4°C下在含有IX 蛋白酶抑制劑合劑IV(Calbi0Chem,CA)的蒸餾水中勻化并且在4°C下以14,OOOrpm離心 30min。將沉淀物重新混懸于等體積的溶于Tris HCl緩沖液(pH = 8)的胍5M中并且在 室溫下孵育1小時。使用BCA方法(Biorad,CA)測定胍處理的樣品中的蛋白質(zhì)濃度。通 過ELISA(Biosource,CA)評價Aβ 1-40和Αβ 1_42水平并且以每毫克蛋白質(zhì)中Aβ 1-40或 A β 1-42的pg數(shù)報道結(jié)果。如圖10中所示,給TgAPPsw小鼠每天以10mg/kg體重的劑量施用(_)-尼伐地平, 施用4天,與對照組動物相比,導(dǎo)致腦中A β 1-42水平(pg/ml)下降26%、腦中A β 1_40水 平下降43%。實(shí)施例9
15
緩慢釋放(-)_尼伐地平對腦Αβ水平的影響檢驗(yàn)緩慢釋放㈠-尼伐地平對腦A β 1-42水平的影響。給66周齡的TgAPPsw (Tg APPsw品系2576)皮下植入確保持續(xù)緩慢釋放30mg(-)_尼伐地平/Kg體重/天的(-)-尼 伐地平生物可降解丸劑(η = 5)、確保釋放56mg/Kg/天的(_) _尼伐地平生物可降解丸劑 (η = 6)或釋放安慰劑的丸劑(η = 6),釋放期為30天。丸劑植入后26天,將動物人道 地實(shí)施安樂死,采集其腦并且速凍在液氮中。將腦在4°C下在含有IX蛋白酶抑制劑合劑 IV(Calbiochem,CA)的蒸餾水中勻化并且在4°C下以14,OOOrpm離心30min。將上清液重新 混懸于等體積的溶于Tris HCl緩沖液(pH = 8)的胍5M中并且在室溫下孵育1小時。使 用BCA方法(Biorad,CA)測定胍處理的樣品中的蛋白質(zhì)濃度。通過ELISA(Biosouree,CA) 評價A β 1-42水平并且以每毫克蛋白質(zhì)中A β 1-42的pg數(shù)報道結(jié)果。如圖11中所示,與植入安慰劑丸劑的小鼠相比,給TgAPPsw小鼠施用緩慢釋放的 (-)_尼伐地平導(dǎo)致被給予30mg/Kg/天緩慢釋放(-)_尼伐地平丸劑的小鼠腦A β 1-42水平 下降2倍,而在用56mg/Kg/天緩慢釋放丸劑處理的動物中觀察到A β 1-42下降2. 5倍。實(shí)施例10(-)_尼伐地平對跨血腦屏障腦A β水平清除的影響體外模型使用體外和體內(nèi)模型檢驗(yàn)了(-)_尼伐地平對跨血腦屏障(BBB)腦Αβ水平清除 的影響。體外模型如圖12中所示。將含有2μΜ熒光素-β-淀粉狀蛋白(1-42)的內(nèi)皮細(xì) 胞培養(yǎng)基(ECM,ScienCell Research Laboratories) (3)放入底外側(cè)(供體)隔室。使膜的 頂(接收)側(cè)接觸在ECM中的各種二氫吡啶(DHP)化合物(1、5和10 μ M) (2)。在0時對供 體隔室取樣以建立每組中熒光素-β-淀粉狀蛋白(1-42)的初始濃度。在插入物與含有熒 光淀粉狀蛋白的孔接觸后,在直至90分鐘的不同時間點(diǎn)從頂部隔室采集樣品(1)以評價熒 光素-β-淀粉狀蛋白(1-42)跨人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)單層(4)的運(yùn)動(底外側(cè)至 頂部)。使用BioTek Synergy HT多檢測微量培養(yǎng)板讀取器(multi-detection microplate reader) (ffinooski, VT)分析樣品(λ ex = 485nm 禾口 λ em = 516nm)的熒光素-β-淀粉狀 蛋白(1-42)。使用方程Papp = l/AC。*(dQ/dt)確定熒光素-β -淀粉狀蛋白(1-42)的表 觀滲透率(Papp),其中A表示膜的表面積,C。是底外側(cè)供體隔室中熒光素- β -淀粉狀蛋白 (1-42)的初始濃度,dQ/dt是在給定時間期限中頂部接收隔室中熒光素-β-淀粉狀蛋白 (1-42)的量(polli)。將在(-)_尼伐地平存在下熒光素淀粉狀蛋白(1-42)的Papp 與對照孔相比較并且以百分比表示。如圖13中所示,(-)_尼伐地平在血腦屏障體外模型中劑量依賴性地刺激A β從 腦側(cè)⑶向外周側(cè)㈧轉(zhuǎn)運(yùn)。還用體外模型檢驗(yàn)了(-)_尼伐地平相比于尼伐地平外消旋混合物對跨BBB腦Αβ 清除的體外影響。在這些實(shí)驗(yàn)中使用了與上述方案類似的方案,主要不同是為了比較目的 加入外消旋混合物。如圖14中所示,(-)_尼伐地平和尼伐地平外消旋混合物在體外模型 中均劑量依賴性地刺激A β跨血腦屏障(B)向外周㈧轉(zhuǎn)運(yùn)。體內(nèi)模型使用體內(nèi)模型檢驗(yàn)了(-)-尼伐地平對腦々0水平跨BBB清除的影響。使用3%異 氟烷/氧混合物通過吸入麻醉野生型雌性B6/S幾小鼠。在麻醉下,給小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射介質(zhì)(DMSO)或(-)_尼伐地平。i.p.注射后5分鐘,以腦功能區(qū)定位方式給小鼠腦室 內(nèi)區(qū)域中注射3μ 1人β-淀粉狀蛋白(1-42) (ImM在DMSO中的溶液)(前鹵后3mm,前鹵側(cè) 1.0mm,腦表面以下4mm)。注射人β-淀粉狀蛋白(1_42)后10分鐘,對小鼠實(shí)施安樂死。 采集血漿樣品并且使用用于人淀粉狀蛋白(1-42)的夾心ELISA分析人β-淀粉狀蛋 白(1-42)。將采集自(-)_尼伐地平處理的小鼠的血漿樣品中淀粉狀蛋白(1-42)水平 與僅接受介質(zhì)的那些小鼠比較。另外,使用皮下植入(-)_尼伐地平的生物可降解丸劑或安 慰劑并且在植入丸劑后13天接受腦內(nèi)注射Αβ 1-42的動物進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)。所有使用動物 的實(shí)驗(yàn)均用按照實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會(Institutional Animal Care and Use Committee) 批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。如圖15中所示,尼伐地平外消旋混合物和(-)_尼伐地平都增加體內(nèi)Αβ跨血腦 屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。2mg/Kg體重的(-)_尼伐地平刺激Αβ從腦向血液的清除達(dá)2倍,在5mg/Kg 體重的劑量下達(dá)4倍,而尼伐地平外消旋混合物在2mg/Kg體重劑量下增加A β清除達(dá)4倍。圖16是說明使用皮下植入(-)_尼伐地平的生物可降解丸劑或安慰劑并且植入丸 劑后13天接受腦內(nèi)注射Αβ 1-42的動物獲得的(-)_尼伐地平對腦Αβ水平跨BBB清除的 影響的棒形圖。如圖16中所示,與植入安慰劑丸劑的對照小鼠相比,30mg/Kg體重/天的劑 量的生物可降解丸劑確保的(-)_尼伐地平緩慢釋放使腦內(nèi)Aβ清除增加3倍。這些(-)_尼伐地平對腦Αβ水平跨血腦屏障(BBB)清除的影響的體外和體內(nèi)研 究揭示了潛在的治療相關(guān)結(jié)果。數(shù)據(jù)表明,(-)_尼伐地平對清除的影響是增加腦Αβ跨BBB 遷移。這源于所觀察到的施用(-)_尼伐地平后血清Αβ水平增加。如圖17Α和B中所示,在FPL64176大鼠主動脈血管收縮模型中,在表現(xiàn)出血管作 用特性之前,可以以比(+)_尼伐地平高得多的劑量施用(-)_尼伐地平??偟慕Y(jié)論就不同尼伐地平對映體的作用而言,兩種對映體以類似方式劑量依賴性地抑制 Αβ 1-40產(chǎn)生,但是(+)_尼伐地平和外消旋尼伐地平在低劑量下輕度刺激Aβ 1-42。(-)-尼 伐地平對Αβ 1-42的影響較低,無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。例如參見圖6和7。還令人驚奇地發(fā)現(xiàn) (+)-尼伐地平完全拮抗FPL64176-誘導(dǎo)的血管收縮,而(_)-尼伐地平不拮抗FPL64176-誘 導(dǎo)的L-型鈣通道激動劑的血管收縮作用。本文所給出的數(shù)據(jù)證明了針對(-)_對映體用 FPL64176攻擊時的基線主動脈收縮,其與(_)_對映體比外消旋混合物或顯示出血管活性 (即拮抗誘導(dǎo)的血管收縮)的(+)_對映體相比血管活性降低相關(guān)。(-)_尼伐地平對腦Αβ 水平的影響的評價顯示,在僅治療4天后在TgAPPsw小鼠中施用(-)_尼伐地平(10mg/kg體 重/天)產(chǎn)生了 26%的Αβ 1-42腦水平降低(pg/ml)和43%的Αβ 1_40腦水平降低。如 圖11中所示,與植入安慰劑丸劑的小鼠相比,給TgAPPsw小鼠施用緩慢釋放(-)_尼伐地平 達(dá)26天導(dǎo)致給藥30mg/Kg/天(-)_尼伐地平緩慢釋放丸劑的小鼠腦A β 1-42水平降低2 倍,而在用56mg/Kg/天緩慢釋放丸劑處理的動物中觀察到A β 1-42降低2. 5倍。(-)_尼伐地平對腦Αβ水平跨血腦屏障(BBB)清除的影響的體外和體內(nèi)研究還產(chǎn) 生了出乎意料的和令人鼓舞的結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示(-)_尼伐地平對這種清除的影響是增加腦 Αβ跨BBB遷移。這源于所觀察到的施用(-)-尼伐地平后血清々0水平增加。根據(jù)上述數(shù)據(jù)能推知,給患有腦致淀粉樣變疾病例如AD的動物或人施用對映體 富集的(-)_尼伐地平能顯著降低腦關(guān)鍵區(qū)域中Aβ沉積的量(其特征性地證明了該類病理性沉積物的豐度),并且減少腦中已經(jīng)沉積的A β的量,同時沒有不必要地影響血壓或其 它可能的副作用。另外,對映體富集的(-)_尼伐地平的施用可對抗Αβ的神經(jīng)毒性作用 (其被認(rèn)為是造成AD中所觀察到的廣泛的和破壞性的神經(jīng)元破壞的原因),并且減少小神 經(jīng)膠質(zhì)活化(其導(dǎo)致在AD患者的腦中觀察到的特征性炎性反應(yīng)),同時副作用減少。最后, 對映體富集的(-)_尼伐地平治療可以降低患有腦致淀粉樣變疾病例如AD的動物或人腦中 已經(jīng)沉積的Αβ濃度,同時沒有不希望的副作用。 對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是,可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況 下對本發(fā)明的方法進(jìn)行各種調(diào)整和改變。因此,本發(fā)明包括所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的變型和 變體及其等效方案。將本文所引述的所有參考文獻(xiàn)引入作為參考。
權(quán)利要求
在患有腦致淀粉樣變疾病或病癥的動物或人中減少Aβ沉積、Aβ神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生的方法,其包括對所述動物或人施用治療有效量的對映體富集的(-)-尼伐地平。
2.在患有外傷性腦損傷的動物或人中降低Αβ沉積、Αβ神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生 所導(dǎo)致的腦致淀粉樣變疾病或病癥風(fēng)險的方法,其包括對所述動物或人施用治療有效量的 對映體富集的(-)_尼伐地平,其中對映體富集的(-)_尼伐地平施用在急性頭部損傷后開 始。
3.在被診斷為具有發(fā)生腦致淀粉樣變疾病或病癥的風(fēng)險的動物或人中降低發(fā)生腦致 淀粉樣變疾病或病癥的風(fēng)險的方法,其包括對所述動物或人施用治療有效量的對映體富集 的(-)_尼伐地平。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中所述腦致淀粉樣變疾病或病癥選自阿爾茨海 默病、外傷性腦損傷和腦淀粉樣血管病。
5.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中所述對映體富集的(-)_尼伐地平的治療有效 量選自約0. 05-20mg/天、約2-15mg/天、約4_12mg/天和約8mg/天。
6.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中所述對映體富集的(-)_尼伐地平的治療有效 量選自16-最大耐受劑量、16-50、約16、約20、約30、約40、約50、約100、約300和約500mg/ 天。
7.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中在施用對映體富集的(-)_尼伐地平后所述對 映體富集的(-)_尼伐地平的治療有效量以選自小于治療前血壓的約20%、小于治療前血 壓的約10%、小于治療前血壓的約5%和小于治療前血壓的約的量降低血壓,其中血壓 是通過連續(xù)監(jiān)測和對時間進(jìn)行曲線下面積級分計(jì)算的,并且其中治療后血壓是在足以實(shí)現(xiàn) 穩(wěn)態(tài)結(jié)果的治療期后測定的。
8.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中對映體富集的(-)_尼伐地平被施用于血壓在 正常范圍或在低血壓范圍的人或動物。
9.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中對映體富集的(-)_尼伐地平被施用于血壓在 高血壓范圍的人或動物。
10.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中對映體富集的量選自大于約95%、大于約 98%和約100%,至多達(dá)檢測限。
11.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中用所述治療有效量的對映體富集的(-)-尼 伐地平進(jìn)行治療的治療期限選自長達(dá)動物或人的終生、1小時_5年、1天-12個月、1周-6 個月、2周-4周、2周-3年和6個月-12個月。
12.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中對映體富集的(-)_尼伐地平以單位劑型被 施用,所述單位劑型選自硬或軟殼明膠膠囊、片劑、藥片、小藥囊、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿 劑、糯米紙囊劑、粉末、顆粒、溶液和乳劑。
13.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中所述施用是胃腸外施用、口服施用或腹膜 內(nèi)施用,并且任選地其中胃腸外施用途徑選自靜脈內(nèi)施用;肌內(nèi)施用;間質(zhì)施用;動脈內(nèi)施 用;皮下施用;眼內(nèi)施用;顱內(nèi)施用;鞘內(nèi)施用;心室內(nèi)施用;滑膜內(nèi)施用;經(jīng)上皮施用,包 括透皮施用、經(jīng)由吸入肺施用、眼科施用、舌下施用和口含施用;局部施用,包括眼科施用、 皮膚施用、眼施用、直腸施用和經(jīng)由吹入或霧化鼻吸入施用,任選選自氣霧劑、霧化器和噴霧器。
14.在患有腦致淀粉樣變疾病或病癥的動物或人中治療腦致淀粉樣變疾病或病癥的方 法,其包括對所述動物或人施用基本由治療有效量的對映體富集的(-)_尼伐地平和藥學(xué) 上可接受的載體組成的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了在患有腦致淀粉樣變疾病,例如阿爾茨海默病(AD)的動物或人中減少Aβ沉積、Aβ神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生的方法,通過對所述動物或人施用治療有效量的二氫吡啶化合物尼伐地平的(R)-對映體、也稱作(-)-尼伐地平來進(jìn)行。還提供了在患有外傷性腦損傷的動物或人中降低Aβ沉積、Aβ神經(jīng)毒性和小神經(jīng)膠質(zhì)增生的風(fēng)險的方法,通過在外傷性腦損傷后施用(-)-尼伐地平和此后繼續(xù)治療達(dá)預(yù)定時間期限來進(jìn)行。
文檔編號A61K31/44GK101883564SQ200880118761
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月5日
發(fā)明者D·帕里斯, M·J·穆蘭, R·A·艾維三世 申請人:阿爾茨海默病學(xué)會美國公司