專利名稱：新型的低分子化硫酸軟骨素及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的低分子化硫酸軟骨素及其用途。更詳細(xì)而言，涉及具有如下利用性的低分子化硫酸軟骨素及其的下述用途作為針對因長期使用含有葡萄糖、其多 糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液而導(dǎo)致的腹膜損傷的抑制劑的利用性；作為腹膜透析液 中的滲透壓物質(zhì)的利用性等。
背景技術(shù)：
針對終末期腎衰竭患者的人工透析療法大致分為血液透析療法和腹膜透析療法。 其中，腹膜透析療法是如下方法將含有葡萄糖、其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的高滲透析液注 入到腹腔內(nèi)，利用腹膜的半透膜功能，以除去體內(nèi)過剩的廢物、水、電解質(zhì)。腹膜透析療法與 血液透析療法相比，具有飲食、活動的限制較少、對循環(huán)動力學(xué)帶來的影響較低、殘余腎功 能保全能力較高、回歸社會容易等很多優(yōu)點(diǎn)。然而，近年來，腹膜透析療法的長期進(jìn)行導(dǎo)致 的各種障礙、例如伴隨腹膜功能降低的除水不良、廢物的除去不足正成為嚴(yán)重的問題。該 腹膜功能的降低與下述原因關(guān)系密切作為滲透壓物質(zhì)被包含在腹膜透析液中的葡萄糖與 蛋白質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生的糖化終極產(chǎn)物(AGE :advanced glycation end product)、AGE與具 有其受體的細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞暴露于高濃度的葡萄糖中而產(chǎn)生的活性氧物種(ROS :reactive oxygen species)0為了解決以上的問題，迄今為止一直在探索抑制葡萄糖、其多糖體導(dǎo)致的腹膜功 能降低的物質(zhì)，探索代替葡萄糖、其多糖體的新的滲透壓物質(zhì)，作為其候補(bǔ)物質(zhì)，已經(jīng)提出 了硫酸化糖胺聚糖中的硫酸軟骨素(cs =Chondroitin sulfate)(例如專利文獻(xiàn)1、非專利 文獻(xiàn)1)。專利文獻(xiàn)1 日本特開平1-151462號公報(bào)非專利文獻(xiàn)1 大野卓志、今田聰雄“腹膜透析液浸透壓物質(zhì)i L· 二 > K α < f >硫酸&用0 ^ ^ ^ O有用性(使用硫酸軟骨素作為腹膜透析液滲透壓物質(zhì)的有用性)” 透析會志、30(1) :65，199
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題硫酸軟骨素為生物體內(nèi)的物質(zhì)，因此生物體適應(yīng)性很高，像肝素類那樣對血液凝 固系統(tǒng)的影響幾乎沒有，因而在安全性方面也認(rèn)為有希望。然而，在使用動物模型的評價(jià) 中，有報(bào)道稱硫酸軟骨素具有腹膜功能的保護(hù)作用(非專利文獻(xiàn)1)，也有報(bào)道稱沒有那樣 的保護(hù)作用(須山一穗、熊野和雄、酒井糾“超濾功能降低大鼠模型中的超濾降低抑制物質(zhì) 的探索”日腎會志、37 (9) :491，1995)，現(xiàn)狀是關(guān)于其有用性還沒有一致的見解。另外，根據(jù) 硫酸基的結(jié)合位置的不同，硫酸軟骨素中存在硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C、硫酸軟骨素D、 硫酸軟骨素E這幾個(gè)種類，而且結(jié)構(gòu)上的多樣性也顯著。因此認(rèn)為，基于結(jié)構(gòu)上的多樣性， 還會產(chǎn)生功能性的多樣性，但迄今為止，在本發(fā)明人所知道的范圍內(nèi)還不存在闡明腹膜透析療法中硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的報(bào)告。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種在腹膜透析療法中有用的新型硫酸軟骨素。用于解決問題的方案本發(fā)明人鑒于上述問題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特定的分子量和特定的組 成二糖單元(constituent disaccharideunit)占總體的特定比例的低分子化硫酸軟骨素， 基于其優(yōu)異的AGE生成抑制作用、活性氧清除作用，作為針對因長期使用含有葡萄糖、其多 糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液而導(dǎo)致的腹膜損傷的抑制劑、作為腹膜透析液中的滲透 壓物質(zhì)等是有用的。基于上述見解而完成的技術(shù)方案1的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素，其特征在 于，其重均分子量為1000 20000，且下述結(jié)構(gòu)式所示的組成二糖單元占總體的65% 100% (摩爾比)。- [4GlcA β l-3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基， β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸 化。)另外，本發(fā)明的技術(shù)方案2的腹膜透析液的特征在于，其配合有技術(shù)方案1所述的 低分子化硫酸軟骨素。另外，本發(fā)明的技術(shù)方案3的腹膜透析液配合劑的特征在于，其以技術(shù)方案1所述 的低分子化硫酸軟骨素作為有效成分。另外，本發(fā)明的技術(shù)方案4的、針對含有葡萄糖和/或其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的 腹膜透析液導(dǎo)致的腹膜損傷的抑制劑，其特征在于，以技術(shù)方案1所述的低分子化硫酸軟 骨素作為有效成分。另外，本發(fā)明的技術(shù)方案5的AGE(糖化終極產(chǎn)物)生成抑制劑的特征在于，其以 技術(shù)方案1所述的低分子化硫酸軟骨素作為有效成分。另外，本發(fā)明的技術(shù)方案6的活性氧清除劑的特征在于，其以技術(shù)方案1所述的低 分子化硫酸軟骨素作為有效成分。另外，本發(fā)明的技術(shù)方案7的脂質(zhì)過氧化抑制劑的特征在于，其以技術(shù)方案1所述 的低分子化硫酸軟骨素作為有效成分。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可提供具有下述利用性的低分子化硫酸軟骨素作為針對因長期使 用含有葡萄糖、其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液而導(dǎo)致的腹膜損傷的抑制劑的利用 性；作為腹膜透析液中的滲透壓物質(zhì)的利用性等。


圖1是表示實(shí)施例3的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效 果(抑制除水率降低作用)的圖表。圖2是表示實(shí)施例4的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效 果(抑制腹膜脂質(zhì)過氧化作用)的圖表。圖3是表示實(shí)施例7的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效果(與公知的AGE生成抑制劑比較)的圖表。圖4是表示實(shí)施例8的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效 果(與公知的活性氧清除劑比較)的圖表。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素具有下述利用性作為針對因長期使用含有葡萄 糖、其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液而導(dǎo)致的腹膜損傷(peritoneal disorder)的 抑制劑的利用性；作為腹膜透析液中的滲透壓物質(zhì)的利用性等，本發(fā)明的低分子化硫酸軟 骨素特征在于，其重均分子量為1000 20000，且下述結(jié)構(gòu)式所示的組成二糖單元占總體 的65% 100% (摩爾比)。- [4GlcA β l-3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙酰基-D-半乳糖胺殘基， β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸 化。)本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素例如可以如下進(jìn)行調(diào)制以下述結(jié)構(gòu)式所示的 組成二糖單元占總體的65% 100% (摩爾比)的硫酸軟骨素C(軟骨素6-硫酸)作 為起始原料，按照重均分子量變?yōu)?000 20000、優(yōu)選變?yōu)?000 18000的方式進(jìn)行 低分子化。作為這樣的起始原料硫酸軟骨素C，例如可以使用來源于大青鯊(Prionace glauca)的硫酸軟骨素C(生化學(xué)工業(yè)株式會社的商品名Chondroitin sulfate C，sodium salt(sharkcartilage)，SG)。其低分子化可以通過本身公知的硫酸軟骨素的低分子化方 法來進(jìn)行，即使用鹽酸的化學(xué)分解法、使用綿羊睪丸透明質(zhì)酸酶的酶分解法、以及日本特開 2004-43645號公報(bào)中記載的電子射線照射分解法等。另外，起始原料的下述結(jié)構(gòu)式所示的 組成二糖單元的占有率不一定必須為總體的65 %以上(摩爾比)，只要是可通過分級純化 來獲取65%以上(摩爾比)級分的原料，也可以不到65% (摩爾比)。另外，本發(fā)明的低分 子化硫酸軟骨素可以是化學(xué)合成的，也可以是從鯊魚等生物體組織的培養(yǎng)物、發(fā)酵物中提 取得到的。- [4GlcA β l-3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基， β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸 化。)本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素具有優(yōu)異的AGE生成抑制作用、活性氧清除作用。 因此，通過配合到含有葡萄糖、其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液中，可以作為對長 期使用這樣的腹膜透析液而導(dǎo)致的起因于葡萄糖、其多糖體的腹膜損傷(例如脂質(zhì)過氧化 等)的抑制劑而發(fā)揮效果。另外，本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素也可以作為腹膜透析液中 的滲透壓物質(zhì)而配合到腹膜透析液中。將本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素配合到含有葡萄糖、其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的 已知的腹膜透析液中時(shí)，可以按照其濃度為0.01% (w/v) (w/v)的方式配合。另外， 配合本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素作為滲透壓物質(zhì)來代替葡萄糖、其多糖體，從而調(diào)制腹 膜透析液時(shí)，可以按照其濃度為(w/v) 10% (w/v)的方式配合，與鈉、鎂、鈣、氯、乳酸等已知的腹膜透析液的構(gòu)成成分一起構(gòu)成腹膜透析液。另外，本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素所具有的AGE生成抑制作用對于糖尿病、各 種糖尿病并發(fā)癥(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性腎病、糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病性 血管病變)等的治療有效，活性氧清除作用對于癌、白內(nèi)障、動脈硬化、阿爾茨海默病、哮喘 等的治療有效。因此，本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素也可以作為用于治療這樣的疾病的有 效成分來使用。這種情況下，可以對患者經(jīng)口或非經(jīng)口投與根據(jù)癥狀的程度、年齡和體重等 而適當(dāng)設(shè)定的投與量的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素。其投與方法可以通過本身公知的制 劑形態(tài)進(jìn)行。實(shí)施例以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明的解釋不受以下記載的限定。 另外，該實(shí)施例中分子量用“kDa”表示(IkDa = IOOODa)。實(shí)施例1 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素的調(diào)制(其1)以來源于大青鯊的硫酸軟骨素C(重均分子量30kDa，生化學(xué)工業(yè)株式會社的商 品名Chondro it in sulfate C, sodium salt (shark cartilage), SG)作為起始原料，將其 Ig溶解于PBS(pH5. 3)50mL中。在該溶液中添加綿羊睪丸透明質(zhì)酸酶(Sigma公司制type V) 10萬U，在37°C下進(jìn)行酶反應(yīng)。經(jīng)時(shí)采集反應(yīng)液的一部分，通過GPC-HPLC進(jìn)行分析，調(diào) 查低分子化的程度。達(dá)到目標(biāo)分子量后將反應(yīng)液煮沸，使酶反應(yīng)停止。沒有達(dá)到目標(biāo)分子 量時(shí)，進(jìn)一步將綿羊睪丸透明質(zhì)酸酶添加到反應(yīng)液中進(jìn)行酶反應(yīng)，達(dá)到目標(biāo)分子量后將反 應(yīng)液煮沸使酶反應(yīng)停止。這樣獲得的目標(biāo)分子量級分如下進(jìn)行純化在反應(yīng)結(jié)束液中添加 活性炭，在50°C下反應(yīng)1小時(shí)，然后將反應(yīng)液過濾，接著添加醋酸鈉三水合物，然后添加乙 醇，獲得沉淀物，將所得沉淀物用乙醇洗滌后，干燥。通過以上的方法，得到重均分子量為 lOkDa、且-[4GlcA3 l_3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA 表示 D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc 表 示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S) 表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元占總體的74.0% (摩爾比)的 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素白色粉末(組成二糖的組成的詳細(xì)內(nèi)容如表1所述)。另外，組成二糖的組成的分析如下進(jìn)行取100 μ L測定用試樣(約200 μ g/mL)， 添加IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH8. 0) 40 μ L和軟骨素酶ABC (83mU ；生化學(xué)工業(yè)株式會社 制)，使總量為200μ L，在37°C下反應(yīng)3小時(shí)，將反應(yīng)液用截留分子量為10000的超濾器過 濾，對濾液進(jìn)行HPLC (柱子株式會社YMC制的YMC凝膠PA-120)(實(shí)施例2也同樣)分析。[表 1] OS__6S__4S__SD__SB__SE
CSCIOkDa 1.0__740__RO__IOJ__-__0.9OS :-[461οΑβ l-3GalNAc β 1]-6S :-[4GlcA β l_3GalNAc (6S) β 1]-4S :-[4GlcAβ l_3GalNAc(4S) β 1]-SD :-[4GlcA (2S) β l_3GalNAc (6S) β 1]-SB :-[4GlcA (2S) β l_3GalNAc (4S) β 1]-SE :_[4GlcA3 l_3GalNAc (4S，6S) β 1]-
(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基， β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(2S)、(4S)和(6S)表示該單糖殘基中 的2、4和6位被硫酸化。)實(shí)施例2 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素的調(diào)制(其2)以來源于大青鯊的硫酸軟骨素C(重均分子量30kDa、生化學(xué)工業(yè)株式會社的商 品名Chondroitin sulfate C，sodium salt (shark cartilage)，SG)作為起始原料，根據(jù) 日本特開2004-43645號公報(bào)記載的方法對其照射照射能量為200kGy的電子射線，得到重 均分子量為lOkDa、且-[4GlcA0 l_3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘 基，GalNAc表示N-乙酰基-D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4 糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元占總體的73. 0% (摩爾比)的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素白色粉末(組成二糖的組成的詳細(xì)內(nèi)容如表2 所述)。[表 2] (式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基， β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(2S)、(4S)和(6S)表示該單糖殘基中 的2、4和6位被硫酸化。)實(shí)施例3 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效果(其1)(實(shí)驗(yàn)方法)對于8周齡的Wistar系雄性大鼠，在乙醚麻醉下以1天1次、15mL/個(gè)體進(jìn)行7 天腹腔內(nèi)反復(fù)投與以0. (w/v)的濃度溶解有待測物的Midpeliq 250(商品名，f 株式會社制的葡萄糖濃度為2. 5% (w/v)的腹膜透析液)。對照組(Control)同樣地投與 Midpeliq 250。最終投與后第二天實(shí)施腹膜平衡試驗(yàn)，評價(jià)腹膜功能。即，以60mL/kg向腹 腔內(nèi)注入Midpeliq 250，4小時(shí)后回收腹腔內(nèi)殘留液。測定回收液量，評價(jià)腹膜的超濾能力 (除水率)。另外，待測物如下所述。(a)在實(shí)施例2的方法中通過照射照射能量為300kGy的電子射線調(diào)制的重均分子 量為7kDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSC7kDa)(b)在實(shí)施例2的方法中通過照射照射能量為200kGy的電子射線調(diào)制的重均分子 量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSClOkDa)(c)在實(shí)施例2的方法中通過照射照射能量為IOOkGy的電子射線調(diào)制的重均分子量為17kDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSC17kDa)(d)作為起始原料使用的來源于大青鯊的硫酸軟骨素C (重均分子量30kDa，生化 學(xué)工業(yè)株式會社的商品名Chondro it in sulfate C, sodium salt (shark cartilage), SG) (CSC30kDa)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果) 如圖1所示。由圖1可知，重均分子量為7kDa、10kDa、17kDa的本發(fā)明的低分子 化硫酸軟骨素，確認(rèn)到相對于對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的腹膜保護(hù)效果，作為起始原料使用 的重均分子量為30kDa的來源于鯊魚肩軟骨的硫酸軟骨素C沒有確認(rèn)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的 效果(圖中，正常組的記載是不進(jìn)行腹膜透析液的投與時(shí)的結(jié)果)。另外，以來源于鯊魚鰭 軟骨的硫酸軟骨素C (重均分子量20kDa)作為起始原料，使用鹽酸將其水解而調(diào)制的重均 分子量為lOkDa、且-[4GlcAi3 l-3GalNAc(6S) β1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基， GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷 鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元占總體的59.0% (摩 爾比)的低分子化硫酸軟骨素也未確認(rèn)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的效果(通過另外的實(shí)驗(yàn))。實(shí)施例4 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效果(其2)(實(shí)驗(yàn)方法)對于8周齡的Wistar系雄性大鼠，在乙醚麻醉下以1天1次、15mL/個(gè)體進(jìn)行7 天腹腔內(nèi)反復(fù)投與以0. 1% (w/v)的濃度溶解有通過實(shí)施例1的方法調(diào)制的重均分子量為 IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSClOkDa)作為待測物的Midpeliq 250(商品名， f 株式會社制的葡萄糖濃度為2.5% (w/v)的腹膜透析液)。對照組(Control)也同 樣地投與Midpeliq 250。最終投與后第二天采集腹膜(大網(wǎng)膜)，通過硫代巴比妥酸法對 組織中的過氧化脂質(zhì)含量進(jìn)行定量，以腹膜脂質(zhì)過氧化抑制作用為指標(biāo)，從而來評價(jià)待測 物的腹膜保護(hù)效果。(實(shí)驗(yàn)結(jié)果)如圖2所示。由圖2可知，重均分子量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素， 確認(rèn)到相對于對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的腹膜保護(hù)效果(圖中，正常組的記載是沒有進(jìn)行腹 膜透析液的投與時(shí)的結(jié)果)。實(shí)施例5 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素的AGE生成抑制作用(實(shí)驗(yàn)方法)根據(jù)T Kiho 等的方法(Biosci Biotechnol Biochem68 :200，2004)實(shí)施實(shí)驗(yàn)。即， 在含有500mM葡萄糖和lOmg/mL牛血清白蛋白的0. IM磷酸緩沖液(pH7. 4)中以0. 1 % (w/ ν)的濃度溶解待測物，在37°C下孵育4周。4周后，以激發(fā)光波長355nm、測定波長460nm 測定AGE發(fā)出的熒光值，測量AGE生成量，通過下述計(jì)算式計(jì)算出AGE生成抑制率。[數(shù)學(xué)式1]
廣 添加待測物的熒光值 、
AGE生成抑制率(%) = 1--X 100
、 未添加待測物的熒光值 )(實(shí)驗(yàn)結(jié)果)
如表3所示。另外，待測物如以下所述。另外，作為陽性對照物使用ImM的氨基胍 (公知的AGE生成抑制劑)。(a)通過實(shí)施例1的方法調(diào)制的重均分子量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟 骨素(CSClOkDa)(b)通過同樣的方法由來源于鯨魚的硫酸軟骨素A (重均分子量30kDa，生化學(xué)工 業(yè)株式會社的商品名Chondroitinsulfate A, sodium salt (Whale cartilage), SG)調(diào)制 的重均分子量為lOkDa、且基本上不含(20% 30% )-[461οΑβ l_3GalNAc (6S) β 1]-(式 中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示 β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示 的組成二糖單元的低分子化硫酸軟骨素(CSAlOkDa)(c)通過同樣的方法由來源于墨魚的硫酸軟骨素E (重均分子量75kDa，生化學(xué)工
WlSi Bn^ Chondroitinsulfate E, sodium salt (squid cartilage)) 白勺 重均分子量為lOkDa、且基本上不含(10% 20% )-[461οΑβ l_3GalNAc (6S) β 1]-(式中， GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3 糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成 二糖單元的低分子化硫酸軟骨素(CSElOkDa)(d)在實(shí)施例2的方法中通過對來源于雞冠的硫酸皮膚素(重均分子量40kDa) 照射照射能量為200kGy的電子射線而調(diào)制的重均分子量為lOkDa、且基本上不含(10%以 下)-[4GlcA0 l-3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙 ?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該 單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元的低分子化硫酸皮膚素(DSlOkDa)[表 3] 由表3可知，只有重均分子量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素 (CSClOkDa)具有與陽性對照物氨基胍相媲美的AGE生成抑制作用。實(shí)施例6 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素的活性氧清除作用(實(shí)驗(yàn)方法)根據(jù)Olga T 等的方法(Toxicological Science 76 =376,2003)實(shí)施實(shí)驗(yàn)。即，將 分化成中性粒細(xì)胞樣的HL-60細(xì)胞以2X IO6細(xì)胞/mL懸浮于培養(yǎng)液中，將所得細(xì)胞懸浮液 以50 μ L/孔添加到96孔板中后，以50 μ L/孔添加待測物(終濃度0. 03%,0. 1%,0.3% w/v)0另外，以50 μ L/孔添加培養(yǎng)液作為陰性對照。分別以50 μ L/孔添加作為RO S檢測 用熒光底物的L-012 (終濃度100 μ M ；和光純藥工業(yè)株式會社制)和作為RO S生成刺激劑 的佛波醇酯(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，Sigma公司制，終濃度5ng/mL)后，在5% CO2孵化箱內(nèi)在37°C下孵育25分鐘。添加培養(yǎng)液代替佛波醇酯作為背景并同樣地進(jìn)行 孵育。孵育結(jié)束后，用ARVOSX 1420Multilabel counter(PerkinElmer公司制)測定發(fā)光 強(qiáng)度(CPS)，通過下述計(jì)算式計(jì)算出ROS清除率。[數(shù)學(xué)式2] (實(shí)驗(yàn)結(jié)果)如表4和表5所示。另外，待測物如下所述。另外，使用20nM的星形孢菌素(公 知的佛波醇酯信號抑制劑)作為陽性對照物。[表 4](a)通過實(shí)施例1的方法調(diào)制的重均分子量為IkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨 素(CSClkDa)(b)通過實(shí)施例1的方法調(diào)制的重均分子量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟 骨素(CSClOkDa)(c)作為起始原料使用的來源于大青鯊的硫酸軟骨素C (重均分子量30kDa，生化 學(xué)工業(yè)株式會社的商品名Chondro it in sulfate C, sodium salt (shark cartilage), SG) (CSC30kDa)(d)使用軟骨素(重均分子量5kDa、生化學(xué)工業(yè)株式會社的商品名 Chondroitin sodium salt)作為起始原料通過同樣的方法調(diào)制的重均分子量為lkDa、且不 含-[4GlcA0 l-3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙 ?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該 單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元的低分子化軟骨素(ChlkDa)(e)作為起始原料使用的軟骨素(Ch5kDa)(f)使用來源于鯨魚的硫酸軟骨素A(重均分子量30kDa、生化學(xué)工業(yè)株 式會社的商品名Chondroitin sulfate A, sodiumsalt(Whale cartilage), SG) 作為起始原料通過同樣的方法調(diào)制的重均分子量為lkDa、且基本上不含(20% 30% )-[461οΑβ l-3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA 表示 D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc 表示 N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表 示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元的低分子化硫酸軟骨素(CSAlkDa)(g)與(f)同樣地調(diào)制的重均分子量為5kDa的低分子化硫酸軟骨素(CSA5kDa)(h)與(f)同樣地調(diào)制的重均分子量為IOkDa的低分子化硫酸軟骨素(CSAlOkDa)(i)作為起始原料使用的來源于鯨魚的硫酸軟骨素A(CSA30kDa)(j)使用來源于墨魚的硫酸軟骨素E (重均分子量75kDa、生化學(xué)工業(yè)株式會社的 商品名Chondro it in sulfate Ε, sodiumsalt (squid cartilage))作為起女臺原 14 通過同樣 的方法調(diào)制的重均分子量為5kDa、且基本上不含(10% 20% )-[461οΑβ l_3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3 表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元的低分子化硫酸軟骨素(CSE5kDa)(k)與(j)同樣地調(diào)制的重均分子量為IOkDa的低分子化硫酸軟骨素(CSElOkDa)(1)與(j)同樣地調(diào)制的重均分子量為25kDa的低分子化硫酸軟骨素(CSE25kDa)(m)作為起始原料使用的來源于墨魚的硫酸軟骨素E(CSE75kDa) (η)使用來源于雞冠的硫酸皮膚素(重均分子量40kDa)作為起始原料在實(shí)施 例2的方法中通過照射照射能量為300kGy的電子射線調(diào)制的、重均分子量為5kDa、且基本 上不含(10%以下)-[4GlcAi3 l-3GalNAc (6S) β 1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基， GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷鍵，β 1-4表示β 1-4糖 苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖單元的低分子化硫酸皮 膚素(DS5kDa)(ο)與(η)同樣地通過照射照射能量為200kGy的電子射線調(diào)制的重均分子量為 IOkDa的低分子化硫酸皮膚素(DSlOkDa)(ρ)作為起始原料使用的來源于雞冠的硫酸皮膚素(DS40kDa)(q)重均分子量為 900kDa、且不含 _[4GlcA0 l_3GalNAc(6S) β 1] _(式中，GlcA 表 示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β 1-3表示β 1-3糖苷 鍵，β 1-4表示β 1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)所示的組成二糖 單元的來源于雞冠的透明質(zhì)酸(生化學(xué)工業(yè)株式會社制)(HA900kDa)[表 5](a)在實(shí)施例2的方法中通過照射照射能量為300kGy的電子射線調(diào)制的重均分子 量為7kDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSC7kDa)(b)在實(shí)施例2的方法中通過照射照射能量為200kGy的電子射線調(diào)制的重均分子 量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSClOkDa)(c)在實(shí)施例2的方法中通過照射照射能量為IOOkGy的電子射線調(diào)制的重均分子 量為17kDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSC17kDa)[表 4]
陽性對照物一 濃度 ROS清除率 星形抱菌素__20nM__98.1%由表4可知，只有重均分子量為IkDa和IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素 (CSClkDa和CSClOkDa)具有優(yōu)異的ROS清除率，CSClOkDa的ROS清除率與陽性對照物星形 孢菌素的ROS清除率相媲美。另外，由表5可知，本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素的活性氧清 除作用依賴于濃度。實(shí)施例7 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效果(與公知 的AGE生成抑制劑的比較)(實(shí)驗(yàn)方法)對于8周齡的Wistar系雄性大鼠，在乙醚麻醉下以1天1次、15mL/個(gè)體進(jìn)行7天腹腔內(nèi)反復(fù)投與以規(guī)定的濃度溶解有待測物的Midpeliq 250(商品名，r > 株式會社 制的葡萄糖濃度為2. 5% (w/v)的腹膜透析液)。對照組(Control)同樣地投與Midpeliq 250。最終投與后第二天實(shí)施腹膜平衡試驗(yàn)，評價(jià)腹膜功能。即，以60mL/kg向腹腔內(nèi)注入 Midpeliq 250，4小時(shí)后回收腹腔內(nèi)殘留液。測定回收液量，評價(jià)腹膜的超濾能力(除水 率)。另外，測定回收液中的葡萄糖濃度，評價(jià)腹膜透過性。另外，待測物如下所述。(a)通過實(shí)施例2的方法照射照射能量為200kGy的電子射線調(diào)制的重均分子量為 IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSClOkDa)濃度0.1% (w/v)
(b)公知的AGE生成抑制劑氨基胍濃度0. 1 % (w/v)(c)公知的AGE生成抑制劑吡哆胺濃度0. 05% (w/v)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果)如圖3所示。由圖3可知，重均分子量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素， 相對于對照組，確認(rèn)到在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的腹膜保護(hù)效果，其效果比公知的AGE生成抑制劑 氨基胍和吡哆胺的效果更優(yōu)異(圖中，正常組的記載是沒有進(jìn)行腹膜透析液的投與時(shí)的結(jié) 果)。實(shí)施例8 本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素在腹膜透析時(shí)的腹膜保護(hù)效果(與公知 的活性氧清除劑的比較)(實(shí)驗(yàn)方法)與實(shí)施例7同樣地評價(jià)腹膜的超濾能力(除水率)和腹膜透過性。另外，待測物 如下所述。(a)通過實(shí)施例2的方法照射照射能量為200kGy的電子射線調(diào)制的重均分子量為 IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素(CSClOkDa)濃度0.1% (w/v)(b)公知的活性氧清除劑L-抗壞血酸濃度0. 5mM(c)公知的活性氧清除劑Trolox 濃度0. 5mM(d)公知的活性氧清除劑N-乙?；?L-半胱氨酸濃度IOmM(實(shí)驗(yàn)結(jié)果)如圖4所示。由圖4可知，重均分子量為IOkDa的本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素， 相對于對照組，確認(rèn)到在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的腹膜保護(hù)效果，其效果比公知的活性氧清除劑的 效果更優(yōu)異(圖中，正常組的記載是沒有進(jìn)行腹膜透析液的投與時(shí)的結(jié)果)。腹膜透析液調(diào)制例1:根據(jù)常規(guī)方法調(diào)制由以下組成構(gòu)成的腹膜透析液。葡萄糖2.5(w/v%)鈉135. 0(mEq/L)鎂1.5(mEq/L)鈣4. 0 (mEq/L)氯105. 5 (mEq/L)乳酸35. 0 (mEq/L)本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素 0.1(w/v%)滲透壓比(相對于生理鹽水) 約1. 4 1. 6
pH6.3 7.3腹膜透析液調(diào)制例2:根據(jù)常規(guī)方法調(diào)制由以下組成構(gòu)成的腹膜透析液。本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素2. 5(w/v% )鈉135. 0(mEq/L)
鎂1.5(mEq/L)鈣4.0(mEq/L)氯105.5(mEq/L)乳酸35. 0(mEq/L)滲透壓比(相對于生理鹽水) 約1. 4 1. 6pH6. 3 7. 3產(chǎn)業(yè)上的可利用件本發(fā)明可提供具有下述利用性的低分子化硫酸軟骨素作為針對因長期使用含有 葡萄糖、其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液而導(dǎo)致的腹膜損傷的抑制劑的利用性；作 為腹膜透析液中的滲透壓物質(zhì)的利用性等，從以上方面來看，具有產(chǎn)業(yè)上的可利用性。
權(quán)利要求
一種低分子化硫酸軟骨素，其特征在于，其重均分子量為1000～20000，且下述結(jié)構(gòu)式所示的組成二糖單元以摩爾比計(jì)占總體的65％～100％，-[4GlcAβ1-3GalNAc(6S)β1]-式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β1-3表示β1-3糖苷鍵，β1-4表示β1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。
2.一種腹膜透析液，其特征在于，其配合有權(quán)利要求1所述的低分子化硫酸軟骨素。
3.一種腹膜透析液配合劑，其特征在于，其以權(quán)利要求1所述的低分子化硫酸軟骨素 作為有效成分。
4.一種針對含有葡萄糖和/或其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液導(dǎo)致的腹膜損 傷的抑制劑，所述抑制劑的特征在于，其以權(quán)利要求1所述的低分子化硫酸軟骨素作為有 效成分。
5.一種糖化終極產(chǎn)物(AGE advanced glycation endproduct)生成抑制劑，其以權(quán)利 要求1所述的低分子化硫酸軟骨素作為有效成分。
6.一種活性氧清除劑，其特征在于，其以權(quán)利要求1所述的低分子化硫酸軟骨素作為 有效成分。
7.一種脂質(zhì)過氧化抑制劑，其特征在于，其以權(quán)利要求1所述的低分子化硫酸軟骨素 作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供一種具有下述利用性的低分子化硫酸軟骨素作為針對因長期使用含有葡萄糖、其多糖體作為滲透壓物質(zhì)的腹膜透析液而導(dǎo)致的腹膜損傷的抑制劑的利用性；作為腹膜透析液中的滲透壓物質(zhì)的利用性等。作為其解決手段，本發(fā)明的低分子化硫酸軟骨素的特征在于，其重均分子量為1000～20000，且下述結(jié)構(gòu)式所示的組成二糖單元占總體的65％～100％(摩爾比)。-[4GlcAβ1-3GalNAc(6S)β1]-(式中，GlcA表示D-葡萄糖醛酸殘基，GalNAc表示N-乙?；?D-半乳糖胺殘基，β1-3表示β1-3糖苷鍵，β1-4表示β1-4糖苷鍵，(6S)表示該單糖殘基中的6位被硫酸化。)。
文檔編號A61K31/737GK101883794SQ20088011878
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月1日
發(fā)明者前田浩, 后藤幸夫, 小島一弘 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社