專利名稱：含高濃度抗體的溶液制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含抗體的制劑，尤其涉及穩(wěn)定的含高濃度抗體的溶液制劑。
背景技術(shù)：
近年來，開發(fā)出各種抗體制劑供于實(shí)用，但很多抗體制劑是作為靜脈注射用制劑 來使用的。另一方面，由于醫(yī)療現(xiàn)場的實(shí)際需求，開發(fā)作為可以自己注射的皮下注射用含抗 體的制劑的呼聲越來越高。一方面單次抗體施用量較大(約100 200mg)，另一方面通常皮下注射液量有限， 因此在設(shè)計(jì)皮下注射用含抗體的制劑時(shí)，有必要將施用液中的抗體高濃度化。因此要用比 凍干前更少容量的水將凍干制劑再溶解，制成高濃度溶液制劑，所謂利用凍干濃縮技術(shù)制 備的高濃度制劑現(xiàn)已被廣泛使用。但是，對于不需再溶解工序就可使用的方便的溶液制劑 的需求也很大。另外，在制備凍干制劑時(shí)，由于添加糖等凍結(jié)保護(hù)劑導(dǎo)致制劑粘度增大，一 般認(rèn)為不適于作皮下注射用制劑，如果是溶液制劑的話，就能夠避免這個(gè)問題。含高濃度抗體的溶液，由于蛋白質(zhì)大分子特性及分子間相互作用導(dǎo)致其具有形成 自體粘度較高溶液的傾向。另外，將蛋白質(zhì)以高濃度的溶液保存時(shí)，存在以生成不溶性及/ 或可溶性凝集體為首的劣化現(xiàn)象的問題，應(yīng)預(yù)防。特別是抗體制劑，以溶液狀態(tài)保存時(shí)，容 易生成聚合體及不溶性凝集體。另外，溶液制劑長時(shí)間保存時(shí)，也有由于天冬酰胺以外的其 他氨基酸殘基發(fā)生脫酰胺化導(dǎo)致抗體分子喪失生理活性的問題。通常，為了使蛋白制劑在長期保存以后也能保證活性成分損失較少，需要采用各 種手段，將活性成分與各種添加劑溶解在緩沖液中來得到穩(wěn)定化制劑。但是，尤其是防止在 含高濃度抗體的溶液制劑中生成抗體二聚體及發(fā)生脫酰胺化的技術(shù)仍不完善。因此，對于一種含高濃度抗體的制劑存在需求，此種制劑的特點(diǎn)是長期保存時(shí)能 夠抑制二聚體的生成及脫酰胺化的發(fā)生、穩(wěn)定、適于皮下施用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明擬解決的技術(shù)課題本發(fā)明的目的是提供一種含高濃度抗體的制劑，此種制劑的特點(diǎn)是長期保存時(shí)可 以抑制二聚體的生成及脫酰胺化的發(fā)生、穩(wěn)定、適于皮下施用。解決課題的技術(shù)方案為了達(dá)成上述目的，經(jīng)過銳意努力的研究，本發(fā)明的發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)通過添加精氨 酸這種氨基酸及其鹽作為穩(wěn)定劑，可以得到一種穩(wěn)定的含高濃度抗體的溶液制劑，進(jìn)而完 成本發(fā)明。即本發(fā)明提供以下內(nèi)容。(1)穩(wěn)定的含抗體的溶液制劑，其特征在于，含有精氨酸和甲硫氨酸。(2) (1)的溶液制劑，其還含有組氨酸緩沖劑。(3)⑴或⑵的溶液制劑，其還含有表面活性劑。
(4) (1) (3)的溶液制劑，其中所述抗體濃度為50mg/mL以上。(5) (1) (3)的溶液制劑，其中所述抗體濃度為lOOmg/mL以上。(6) (1) (3)的溶液制劑，其中所述抗體濃度為120mg/mL以上。(7) (1) (6)的溶液制劑，其中所述抗體為抗白細(xì)胞介素_6受體抗體。(8)穩(wěn)定的含抗白細(xì)胞介素_6受體抗體的溶液制劑，其特征在于，含有精氨酸或 甲硫氨酸。(9) (1) (8)的溶液制劑，其中所述抗體為人源化抗體或人抗體。(10) (1) (9)的溶液制劑，其還含有色氨酸。 (11) (1) (10)的溶液制劑，其中所述溶液制劑的pH為4 8。(12) (1) (11)的溶液制劑，其中所述精氨酸的含量為50 1500mM。(13) (1) (12)的溶液制劑，其粘度為2 15mPa · S。(14) (1) (13)的溶液制劑，其中所述溶液制劑于22 28°C至少6個(gè)月穩(wěn)定。(15)⑴ (13)的溶液制劑，其特征在于，抗體二聚體的生成被抑制。(16) (1) (13)的溶液制劑，其特征在于，抗體分子的脫酰胺化被抑制。(17) (1) (13)的溶液制劑，其被皮下施用。(18) (1) (13)的溶液制劑，其中所述溶液制劑的制備過程中不包括凍干工序而 被制備出。(19)抑制含抗體的溶液制劑的抗體分子的脫酰胺化的方法，包括向所述溶液中 添加精氨酸。(20)抑制含抗體的溶液制劑的抗體二聚體生成的方法，包括向所述溶液中添加 精氨酸和甲硫氨酸。發(fā)明效果不需要通過凍干濃縮進(jìn)行重構(gòu)及再溶解等工序，就可以提供含高濃度抗體的溶液 制劑。本發(fā)明的含高濃度抗體的溶液制劑可在溶液狀態(tài)下長期穩(wěn)定保存，由于在制備過程 中不包括凍干工序，因此不需要添加作為凍干保護(hù)劑的糖類等。附圖簡述[

圖1]示實(shí)施例1典型的層析圖。[圖2]示實(shí)施例1凝膠過濾層析法(SEC)的評價(jià)結(jié)果。[圖3]示實(shí)施例1凝膠過濾層析法(SEC)的評價(jià)結(jié)果。[圖4]示實(shí)施例2典型的層析圖。[圖5]示實(shí)施例2離子交換層析法(IEC)的評價(jià)結(jié)果。[圖6]示實(shí)施例2離子交換層析法(IEC)的評價(jià)結(jié)果。[圖7]示實(shí)施例3凝膠過濾層析法(SEC)的評價(jià)結(jié)果。[圖8]示實(shí)施例3離子交換層析法(IEC)的評價(jià)結(jié)果。實(shí)施方式以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。在本發(fā)明中，含抗體的溶液制劑是指，含有抗體作為活性成分、以可以施用給人等 動(dòng)物的方式制備的溶液制劑，尤指在制備過程中不包含凍干工序而制備出的溶液制劑。本發(fā)明的含抗體的溶液制劑是指含高濃度抗體的溶液制劑，抗體濃度優(yōu)選50mg/mL以上，更優(yōu)選100mg/mL以上、更優(yōu)選120mg/mL以上、更優(yōu)選150mg/mL。特別是到目前為 止，尚無含有120mg/mL以上，優(yōu)選150mg/mL以上的抗體的溶液制劑被實(shí)用化的例子，因此 通過本發(fā)明的配方可以首次實(shí)現(xiàn)這類含高濃度抗體的溶液制劑的實(shí)用化。另外，從制備的角度來看，本發(fā)明的含抗體的溶液制劑的抗體濃度上限一般在 300mg/mL,優(yōu)選250mg/mL，更優(yōu)選200mg/mL。因此，本發(fā)明的含高濃度抗體的溶液制劑的 抗體濃度優(yōu)選50 300mg/mL，更優(yōu)選100 300mg/mL，更優(yōu)選120 250mg/mL，特別優(yōu)選 150 200mg/mL。本發(fā)明中使用的抗體只要可與所欲抗原結(jié)合，就無特定限制，可為多克隆抗體，也 可為單克隆抗體，但出于穩(wěn)定生產(chǎn)均質(zhì)抗體考慮，優(yōu)選單克隆抗體。
作為在本發(fā)明中使用的單克隆抗體，不僅可為人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、羊、駱駝、 猴等動(dòng)物源單克隆抗體，也包括嵌合抗體、人源化抗體、雙特異抗體等經(jīng)人工改造的基因重 組型抗體。而且，對抗體免疫球蛋白類別也無特定限制，可為IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 等)、IgA、IgD、IgE、IgM等任一類別，但優(yōu)選IgG及IgM。另外，本發(fā)明的抗體不僅包括全抗體，也包含F(xiàn)v、Fab、F(ab)2等抗體片段，及將抗 體可變區(qū)用多肽接頭等接頭連接的單價(jià)或二價(jià)以上的單鏈Fv(SCFv、Sc(Fv)2或scFv 二聚 體等雙體抗體(Diabody)等)等低分子化抗體等。 上述本發(fā)明的抗體，可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，基本可以使用公知方法如下制備。即，將所欲抗原或表 達(dá)所欲抗原的細(xì)胞用作致敏抗原，將其通過常規(guī)免疫方法免疫，再通過常規(guī)細(xì)胞融合法將 得到的免疫細(xì)胞與公知的母細(xì)胞融合，使用常規(guī)篩選法篩選出單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞(雜交 瘤)而進(jìn)行制備。雜交瘤可以參照Milstein等人采用的方法(Kohler. G. andMilstein，C.， Methods Enzymo 1. (1981)73:3-46)進(jìn)行制備。當(dāng)抗原的免疫原性低時(shí)，可通過結(jié)合白蛋白 等具有免疫原性的巨大分子而進(jìn)行免疫。此外，從雜交瘤克隆抗體基因，整合到合適的載體中，再將其導(dǎo)入宿主，可用使用 基因重組技術(shù)產(chǎn)生的基因重組型抗體(如，參考Carl，A. K. Borrebaeck，James，W. Larrick， THERAPEUTICM0N0CL0NAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom byMACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具體而言，從雜交瘤的mRNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成抗體可變區(qū)(V區(qū))的 cDNA。如果能夠得到編碼目的抗體V區(qū)的DNA，將其與編碼所欲抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA 連接，并將其整合到表達(dá)載體中。另外，也可將編碼抗體V區(qū)的DNA整合到含有抗體C區(qū)的 DNA的表達(dá)載體中。以可用表達(dá)調(diào)控區(qū)(如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子)調(diào)控的方式整合到待表達(dá)的表 達(dá)載體中，然后，可通過用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來表達(dá)抗體。本發(fā)明中，為了達(dá)到降低對人的異種抗原性等目的，可以使用經(jīng)人工改造的基因 重組型抗體，如嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體等。這些經(jīng)改造抗體可以通 過已知的方法制備。嵌合抗體是由人以外的哺乳動(dòng)物(如小鼠)的抗體重鏈、輕鏈的可變區(qū) 與人的抗體重鏈、輕鏈的恒定區(qū)構(gòu)成的抗體，可以通過將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA與編 碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其整合到表達(dá)載體中，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞來產(chǎn)生的方法得到。人源化抗體也稱重構(gòu)(reshaped)抗體，是將人以外哺乳動(dòng)物(如小鼠)抗體的 互補(bǔ)決定區(qū)(CDR ；complementarity determining region)移植至人抗體互補(bǔ)決定區(qū)而得 到的抗體，已知其常規(guī)基因重組手法。具體而言，用制成具有與末端部重疊的部分的數(shù)個(gè)寡核苷酸，通過PCR法合成了設(shè)計(jì)成連接了鼠抗體的⑶R和人抗體的構(gòu)架區(qū)(framework region ；FR)的DNA序列。通過將所得DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，然后整合到表 達(dá)載體中，再導(dǎo)入宿主來產(chǎn)生的方法得到(參考?xì)W洲專利申請公開EP 239400、國際專利申 請公開WO 96/02576)。通過⑶R連接的人抗體FR，可以選擇互補(bǔ)決定區(qū)形成良好的抗原結(jié) 合位點(diǎn)的。根據(jù)需要，為了使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成合適的抗原結(jié)合位點(diǎn)，還可以置 換抗體可變區(qū)構(gòu)架區(qū)的氨基酸(Sato, K. et al.，Cancer Res. (1993)53,851-856)。另外，已知人抗體的獲得方法。如下舉例，用所欲抗原或表達(dá)所欲抗原的細(xì)胞體外致敏人淋巴細(xì)胞，將致敏淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞(如U266)融合，就可以得到具有抗原 結(jié)合活性的所欲人抗體(參考特公平1-59878)。另外，可通過用抗原免疫具有全套人抗體 基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來獲得所欲人抗體(參考國際專利申請公開W093/12227、W092/03918、 W094/02602、W094/25585、W096/34096、W096/33735)。再者，也已知使用人抗體庫，通過淘 選獲得人抗體的技術(shù)。如，可通過將人抗體可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展示 法在噬菌體表面表達(dá)而篩選出結(jié)合抗原的噬菌體。如果分析被篩選出的噬菌體的基因，就 可確定編碼結(jié)合抗原的人抗體可變區(qū)的DNA序列。當(dāng)清楚了與抗原結(jié)合的scFv的DNA的 序列時(shí)，就可以制備出包含所述序列的合適的表達(dá)載體，進(jìn)而可以獲得人抗體。上述方法 也已廣為人知，可以參考 W092/01047，W092/20791, W093/06213, W093/11236, W093/19172, W095/01438, W095/15388。將抗體基因分離出來導(dǎo)入到適當(dāng)宿主中制備抗體時(shí)，可以將適當(dāng)?shù)乃拗髋c表達(dá)載 體組合使用。使用真核細(xì)胞作為宿主時(shí)，可使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞。作為動(dòng)物細(xì) 胞，已知(1)哺乳類細(xì)胞(如CH0、C0S、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、HeLa、Ver0)、⑵兩棲類 細(xì)胞(如非洲爪蟾卵母細(xì)胞)或(3)昆蟲細(xì)胞(如Sf9、Sf21、Tn5)等。作為植物細(xì)胞，已 知例如煙草屬(如源于煙草(Nicotianatabacum)的細(xì)胞)，可對其進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。作 為真菌細(xì)胞，已知例如酵母(如酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)))、霉菌(如曲霉菌屬(Aspergillus)(例如黑曲霉(Aspergillus niger)))。 使用原核細(xì)胞時(shí)有使用細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。細(xì)菌細(xì)胞可例舉大腸桿菌(E.coli)、枯草芽 孢桿菌。通過用目的基因轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞，并體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，就可以得到抗體。另外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段、低分子化抗體及抗體修飾物。例如作為抗 體片段或低分子化抗體，可舉例Fab、F (ab’)2、Fv或H鏈與L鏈的Fv通過適當(dāng)?shù)慕宇^連接 得到的單價(jià)或二價(jià)以上單鏈 Fv (scFv、sc (Fv)2 等)(Huston，J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. (1988)85,5879-5883)。具體而言，可以是抗體經(jīng)酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶) 處理得到抗體片段，也可以是構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入表達(dá)載體以后，在適 當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)來得到抗體片段(例如，參考Co, Μ. S. et al.，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976 ；Better, Μ.and Horwitz, Α. H.，Methods Enzymol. (1989) 178,476-496 ； Pluckthun,A. and Skerra,A. ,Methods Enzymol. (1989) 178,497-515 ；Lamoyi,E. ,Methods Enzymol. (1986) 121,652-663 ；Rousseaux, J.etal. , Methods Enzymol. (1986) 121， 663-669 ；Bird, R. E.and Walker, B. W.，Trends Biotechnol. (1991)9，132—137)。作為抗體修飾物，可使用結(jié)合了聚乙二醇(PEG)等各種分子的抗體。本發(fā)明的“抗 體”中包括這些抗體修飾物。欲得到所述抗體修飾物，可對所得抗體進(jìn)行化學(xué)修飾而得到。 本領(lǐng)域已建立了這些方法。
作為本發(fā)明的制劑中所含抗體，可舉例為抗組織因子抗體、抗IL-6受體抗體、抗 IL-6抗體、HMl. 24抗原單克隆抗體、抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗PTHrP抗體)、抗磷脂 酰肌醇蛋白聚糖-3抗體、抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM3抗體、抗TPO受體激動(dòng)劑抗體、凝血因子VIII替 代抗體、抗⑶3抗體、抗⑶20抗體、抗GPIIb/IIIa抗體、抗TNF抗體、抗⑶25抗體、抗EGFR 抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗⑶33抗體、抗⑶52抗體、抗IgE抗體、抗⑶Ila抗 體、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體、抗AXL抗體等，對此沒有限定。作為本發(fā)明中使用的重構(gòu)人源化抗體，優(yōu)選人源化抗白細(xì)胞介素6(IL_6)受體抗 體(證11-1或1 ^)(參考國際專利申請公開1092-19759)、人源化抗腿1.24抗原單克隆抗 體(參考國際專利申請公開W098-14580)、人源化抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗PTHrP抗 體)(參考國際專利申請公開W098-13388)、人源化抗組織因子抗體(參考國際專利申請公 開恥99-51743)、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3人源化化61!^抗體(參考國際專利申請PCT/ JP05/013103)等。作為本發(fā)明中使用的人源化抗體，尤其優(yōu)選人源化抗IL-6受體抗體。作為人IgM抗體，優(yōu)選抗神經(jīng)節(jié)苷脂GM3重組型人IgM抗體(參考國際專利申請 公開 W005-05636)。
作為低分子化抗體，優(yōu)選抗TPO受體激動(dòng)劑雙體抗體(參考國際專利申請公開 W002-33072)、抗CD47激動(dòng)劑雙體抗體(參考國際專利申請公開WOO1-66737)等。本發(fā)明人們?yōu)榱嗽u價(jià)含高濃度抗體的樣品在保存時(shí)的穩(wěn)定性，采用熱加速實(shí)驗(yàn)及 光加速實(shí)驗(yàn)來研究各種添加劑的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含有作為氨基酸的精氨酸的緩沖液中 溶解高濃度抗體制成的溶液，與未添加精氨酸的溶液相比，二聚體的生成量較低，因此認(rèn)為 精氨酸作為抑制二聚體生成的穩(wěn)定劑是有效的。其次，在含精氨酸及甲硫氨酸的緩沖溶液 中溶解高濃度抗體制成的溶液中，即便精氨酸與甲硫氨酸的合計(jì)濃度比單獨(dú)精氨酸時(shí)濃度 低，仍觀察到相同的二聚體生成抑制效果，因此得出，精氨酸與甲硫氨酸并用可產(chǎn)生協(xié)同效 果。此外發(fā)現(xiàn)，通過添加精氨酸可以抑制抗體分子的脫酰胺化。這些研究結(jié)果在本說明書 后述的實(shí)施例中以實(shí)驗(yàn)結(jié)果例示，實(shí)施例中用含180mg/mL人源化抗IL-6受體抗體的樣品 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。即，通過含有作為穩(wěn)定劑的精氨酸，可以制得抗體二聚體生成減少、并能防止脫酰 胺化發(fā)生的穩(wěn)定的抗體制劑。因此，本發(fā)明第一實(shí)施方式的特征在于向溶液中添加精氨酸， 涉及由此抑制含抗體的溶液制劑生成抗體二聚體或抑制脫酰胺化。并且，作為穩(wěn)定的含抗 體的溶液制劑的實(shí)施方式，其特征是緩沖液中含有抗體及精氨酸。而且，如上所述，本發(fā)明 的含抗體的溶液制劑，通過進(jìn)一步含有甲硫氨酸，由精氨酸與甲硫氨酸聯(lián)用而發(fā)揮協(xié)同效 應(yīng)。因此，本發(fā)明第二實(shí)施方式的特征在于向溶液中添加精氨酸與甲硫氨酸，尤其涉及抑制 含抗體的溶液制劑生成抗體二聚體。并且，作為穩(wěn)定的含抗體的溶液制劑的實(shí)施方式，其特 征是緩沖液中含有抗體及精氨酸與甲硫氨酸。作為本發(fā)明中使用的精氨酸，可使用單體、其衍生物、其鹽中的任一種，尤其優(yōu)選 是L-精氨酸或其鹽。作為本發(fā)明中使用的甲硫氨酸，可使用單體、其衍生物、其鹽中的任一 種，尤其優(yōu)選是L-甲硫氨酸或其鹽。本發(fā)明的含抗體的溶液制劑中，在未添加甲硫氨酸二只含有精氨酸的情況下，精 氨酸的量優(yōu)選50 1500mM，較優(yōu)選100 IOOOmM,更優(yōu)選200 700mM。如果本發(fā)明的含 抗體的溶液制劑中，同時(shí)含有精氨酸及甲硫氨酸時(shí)，精氨酸與甲硫氨酸的合計(jì)濃度為50 1200mM，例如，優(yōu)選精氨酸的量為40 IOOOmM且甲硫氨酸的量為10 200mM ；較優(yōu)選精氨 酸的量為50 700mM且甲硫氨酸的量為10 IOOmM,更優(yōu)選精氨酸的量為100 300mM且 甲硫氨酸的量為10 50mM。
使用作為用于維持溶液pH的物質(zhì)的緩沖劑來配制緩沖液。本發(fā)明的含高濃度抗 體的溶液制劑中，溶液的PH優(yōu)選pH4 8，較優(yōu)選5. O 7. 5，更優(yōu)選5. 5 7. 2，再更優(yōu)選 6. O 6. 5?？捎糜诒景l(fā)明的緩沖劑是能夠調(diào)節(jié)此范圍的pH，且是醫(yī)藥可接受的緩沖劑。 這類緩沖劑在溶液制劑領(lǐng)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，磷酸鹽(鈉或鉀)、碳酸氫鈉 等無機(jī)鹽；檸檬酸鹽(鈉或鉀)、醋酸鈉、琥珀酸鈉等有機(jī)酸鹽；此外，還可使用如磷酸、碳 酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、葡萄糖酸等的酸類。更可以使用Tris類及MES、M0PS、HEPES之 類的優(yōu)良緩沖劑、組氨酸(如組氨酸鹽酸鹽)、甘氨酸等。本發(fā)明的含高濃度抗體的溶液制 劑中，緩沖液優(yōu)選組氨酸緩沖液或甘氨酸緩沖液，尤其優(yōu)選組氨酸緩沖液。緩沖液的濃度一 般為1 500mM，優(yōu)選5 IOOmM,更優(yōu)選10 20mM。使用組氨酸緩沖液的情況下，緩沖液 優(yōu)選含5 25mM組氨酸，更優(yōu)選10 20mM組氨酸。本發(fā)明的“穩(wěn)定的”含高濃度抗體的溶液制劑，在冷藏溫度(2 8°C )下至少放置 12個(gè)月，優(yōu)選2年，更優(yōu)選3年；或在室溫(22 28°C )下至少放置3個(gè)月，優(yōu)選6個(gè)月，更 優(yōu)選1年，而觀察不到明顯變化。例如，在5°C保存2年后二聚體的量及分解物的量之和應(yīng) 低于5. 0%以下，優(yōu)選2%以下，更優(yōu)選1. 5 %以下；或在25°C保存6個(gè)月后，二聚體的量及 分解物的量之和應(yīng)低于5. 0%以下，優(yōu)選2%以下，更優(yōu)選1. 5%以下。本發(fā)明的制劑還可以含有表面活性劑。作為表面活性劑，可舉例為 非離子表面活性劑，例如山梨坦脂肪酸酯(山梨坦單辛酸酯、山梨坦單月桂酸酯、山梨坦單棕櫚酸酯等)；甘油脂肪酸酯(甘油單辛酸酯、甘油單肉豆寇酸酯、甘油單硬脂酸酯等)；聚甘油脂肪酸酯(十甘油單硬脂酸酯、十甘油雙硬脂酸酯、十甘油亞油酸酯等)；聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯(聚氧乙烯山梨坦單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨坦單油酸 酯、聚氧乙烯山梨坦單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨坦單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨坦三油酸酯、 聚氧乙烯山梨坦三硬脂酸酯等)；聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸 酯等)；聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯等)；聚乙二醇脂肪酸酯(聚乙二醇雙硬脂酸酯等)；聚氧乙烯烷基醚(聚氧乙烯十二烷基醚等)；聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(聚氧乙烯聚氧丙烯二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、 聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等)；聚氧乙烯烷基苯基醚(聚氧乙烯壬基苯基醚等)；聚氧乙烯硬化蓖麻子油(聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯硬化蓖麻子油(聚氧乙烯 氫蓖麻子油)等)；聚氧乙烯蜂蠟衍生物(聚氧乙烯山梨醇蜂蠟等)；聚氧乙烯羊毛脂衍生物(聚氧乙烯羊毛脂等)；
具有HLB6 18的聚氧乙烯脂肪酸酰胺(聚氧乙烯硬脂酸酰胺等)； 陰離子表面活性劑，例如具有碳原子數(shù)為10 18的烷基的烷基硫酸鹽(十六烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸 鈉、油醇硫酸鈉等)；環(huán)氧乙烷平均加成摩爾數(shù)為2 4、烷基碳原子數(shù)為10 18的聚氧乙烯烷基醚硫 酸鹽(聚氧乙烯十二烷基硫酸鈉等)；烷基碳原子數(shù)為8 18的烷基磺基琥珀酸酯鹽(十二烷基磺基琥珀酸酯鈉等)； 天然表面活性劑，例如 卵磷脂、甘油磷脂；鞘磷脂類(鞘磷脂等)；碳原子數(shù)為12 18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。本發(fā)明的制劑中可添加這些表面活性劑中的一種，或添加這些表面活性劑中2種 以上的組合。優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯及聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚，尤其 優(yōu)選為聚山梨酸酯20、21、40、60、65、80、81、85及Pluronic型表面活性劑，最優(yōu)選為聚山梨 酸酯 20、80 及 PluronicF-68 (泊洛沙姆 188)。向本發(fā)明的抗體制劑中添加的表面活性劑添加量一般為0. 0001 10% (w/v)，優(yōu) 選0. 001 5%，更優(yōu)選0. 005 3%。作為本發(fā)明的其他方面，本發(fā)明的制劑優(yōu)選由以下成分實(shí)際構(gòu)成A)抗IL-6受體抗體B)精氨酸及/或甲硫氨酸，及作為任意追加成分，可進(jìn)一步添加其他氨基酸(例 如，色氨酸)C)緩沖劑、及D)表面活性劑。所謂的“實(shí)際構(gòu)成”是指不含后述可任意添加成分(如懸浮劑、助溶劑、等滲劑、保 存劑、吸附防止劑、稀釋劑、賦形劑、PH調(diào)節(jié)劑、無痛化劑、含硫還原劑、抗氧化劑等添加到通 常制劑中的成分)以外的成分。上述(B)的“精氨酸及/或甲硫氨酸，及作為任意追加成分，可進(jìn)一步添加其他氨 基酸(例如，色氨酸)”是指，作為制劑中可以含有的添加劑的氨基酸種類包括(b_l)精氨 酸；(b_2)精氨酸及甲硫氨酸；(b-3)甲硫氨酸的情況；也有再含有別的氨基酸的情況。作 為別的氨基酸，優(yōu)選例如色氨酸，作為色氨酸，可以使用單體、氣衍生物、其鹽中的任一種， 特別優(yōu)選為L-色氨酸或其鹽。本發(fā)明制劑可根據(jù)需要適當(dāng)添加懸浮劑、助溶劑、等滲劑、保存劑、吸附防止劑、稀 釋劑、賦形劑、PH調(diào)節(jié)劑、無痛化劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。作為懸浮劑，可舉例甲基纖維素、聚山梨酸酯80、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、西黃 蓍膠粉、羧甲基纖維素鈉、聚氧乙烯山梨坦單月桂酸酯等。作為助溶劑，可舉例聚氧乙烯硬化蓖麻子油、聚山梨酸酯80、煙酰胺、聚氧乙烯 山梨坦單月桂酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。作為等滲劑，可舉例氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。
作為保存劑，可舉例對羥基安息香酸甲酯、對羥基安息香酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。作為吸附防止劑，可舉例人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、乙烯氧化物·丙烯氧化 物的共聚物、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯硬化蓖麻子油、聚乙二醇等。作為含硫還原劑，可舉例N-乙酰基半胱氨酸、N"乙?；桶腚装彼?、硫辛酸、 硫雙乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、碳 原子數(shù)為1 7的硫代鏈烷酸等具有巰基的物質(zhì)等。作為抗氧化劑，可舉例異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚、α -生育 酚、醋酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸 氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷 酸鈉等螯合劑。本發(fā)明的含抗體的溶液制劑通常采用非經(jīng)口施用途徑，例如通過注射劑(皮下 注射、靜脈注射、肌肉注射等)、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)肺等施用，但也可以經(jīng)口施用。作為皮 下注射用制劑，每次的抗體施用量很大(約100 200mg)，但另一方面注射液量也有限制， 因此本發(fā)明制劑尤其適用于皮下注射用。本發(fā)明的含抗體的溶液制劑的滲透壓比優(yōu)選為約0. 5 4，較優(yōu)選約0. 7 2，更 優(yōu)選約1。本發(fā)明的含抗體的溶液制劑的粘度優(yōu)選為約2 15mPa · s,更優(yōu)選約4 10mPa*s，但本發(fā)明的粘度是通過使用錐體-平板式粘度計(jì)的旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)法(第15次修訂 日本藥典一般試驗(yàn)法2. 53粘度測定法)測定的。在本發(fā)明中，從后述實(shí)施例的結(jié)果來看，單獨(dú)添加精氨酸、或添加精氨酸和甲硫氨 酸、或單獨(dú)添加甲硫氨酸均可得到即使長期保存抗體二聚體的生成量與脫酰胺化發(fā)生都較 少的穩(wěn)定的溶液制劑。作為本發(fā)明的其他實(shí)施方式，提供抑制含抗體的溶液制劑發(fā)生脫酰胺化的方法， 包括向溶液中添加精氨酸或其鹽。此外，作為其他實(shí)施方式，還提供抑制含抗體的溶液制劑生成抗體二聚體的方法， 包括向溶液中添加精氨酸與甲硫氨酸。在上述兩種方法中，所述抗體優(yōu)選為是人源化抗體或人抗體的抗白細(xì)胞介素_6 受體抗體。以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。然而這些實(shí)施例僅旨在說明本發(fā) 明，無意限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例抗體樣品抗IL-6受體人源化抗體是通過使用國際專利申請公開W092/19759號(hào)公報(bào)實(shí)施例 10中記載的人延伸因子I α啟動(dòng)子，按照特開平8-99902號(hào)公報(bào)參考例2中記載的方法制 成的人源化抗體。此外，在實(shí)施例的表中有時(shí)記作MRA。實(shí)施例1 由精氨,si禾 π
評價(jià)了精氨酸與甲硫氨酸的組合對含有抗IL-6受體人源化抗體的溶液制劑的穩(wěn) 定化的影響。本研究中為了評價(jià)精氨酸與甲硫氨酸的組合的效果，配制了樣品No. Al A9的評 價(jià)樣品。各評價(jià)樣品的配方如下所述。表1-1配方
為評價(jià)溶液制劑的穩(wěn)定性，對各樣品進(jìn)行熱加速試驗(yàn)(40°C保存3個(gè)月及25°C保 存6個(gè)月)。并用凝膠過濾層析法(SEC)對熱加速前后抗體的純度進(jìn)行評價(jià)。分析條件如 下所述。凝膠過濾層析法將樣品直接用作測定溶液。取測定溶液1 μ L，用液相層析法按下述條件進(jìn)行測定，通過自動(dòng)分析法測定二聚 體(Dimer)、單體(Monomer)、低分子量分解物(LMW)的峰面積，進(jìn)而求得它們的量(％ )。表1-2分析條件層析柱TSKgelG3000Sffxl 7. 8mm I. D. X 30cm(T0S0H)移動(dòng)相pH7. 0的磷酸緩沖液(含有300mmol/L氯化鈉及0. 05%疊氮化鈉的pH7. 0 的50mmol/L磷酸緩沖液)樣品注入量抗IL-6受體人源化抗體約180 μ g
流量lmL/分鐘檢測波長280nm數(shù)1計(jì)算式各峰合計(jì)面積=單體(Monomer)的峰面積+ 二聚體(Dimer)的峰面積+低分子量分解物(LMW)的峰面積二聚體量(Dimer) (% ) = ( 二聚體峰面積/各峰合計(jì)面積)X 100低分子量分解物(LMW) (% )=(低分子量分解物的峰面積/各峰合計(jì)面積)X 100典型的層析圖如圖1所示。本實(shí)施例中得到的凝膠過濾層析法(SEC)評價(jià)結(jié)果如表1及圖2、3所示。從中可 以看到，添加了精氨酸的樣品(樣品No. A2 A6)在40°C 3個(gè)月及25°C 6個(gè)月的加速試驗(yàn) 中，二聚體的量比沒有添加精氨酸的樣品(樣品No. Al)低，由此可以判斷，精氨酸具有抑 制二聚體生成的作用。并且，可以看到二聚體的量的降低與精氨酸添加量成比例關(guān)系。另 一方面，向精氨酸(IOOmM)中添加甲硫氨酸的樣品(樣品No. A7 A9)經(jīng)過40°C 3個(gè)月及 25°C 6個(gè)月的加速試驗(yàn)，其二聚體的生成量比作為全穩(wěn)定化劑濃度幾乎相同的精氨酸濃度 為150mM的樣品(樣品No. A3，A4)低，而與精氨酸濃度為300mM的樣品(樣品No. A6)相 等。該結(jié)果表明通過精氨酸與甲硫氨酸組合產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)，可以起到抑制二聚體生成的 效果。此外，未檢測到精氨酸及甲硫氨酸對低分子量分解物的量的影響。表1-3表 1 實(shí)施例2 由精氨酸所致的脫酰胺化的抑制效果
評價(jià)精氨酸對含有抗IL-6受體人源化抗體的溶液制劑的脫酰胺化的抑制效果。本研究中關(guān)于精氨酸與甲硫氨酸，配制了添加量不同的樣品No. AlO A15及樣品 No. A16 A18的評價(jià)樣品。各評價(jià)樣品的配方如下所述。表2-1配方
為評價(jià)溶液制劑的穩(wěn)定性，對各樣品進(jìn)行熱加速試驗(yàn)(40°C保存3個(gè)月及25°C保 存6個(gè)月)。并用離子交換層析法(IEC)對熱加速前后抗體的純度進(jìn)行評價(jià)。分析條件如 下所述。離子交換層析法向樣品中加入純凈水，配制ImL中含約Img當(dāng)量的抗IL-6受體人源化抗體的液體 作為各樣品的測定溶液。取測定溶液30 μ L，用液相層析法按下述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過自動(dòng)分析法測得各 自的峰面積，再通過面積百分率法求出MRA前、MRA主、MRA亞-1、MRA亞-2、MRA R-U IQ(H)-MRA、2Q(H)-MRA 及其他物質(zhì)(Others)的量(％ )。MRA前是以比主成分短的保留時(shí)間洗脫出的峰的總和，其中包含以抗IL-6受體人 源化抗體脫酰胺體為主的多種分解物。此前峰的生成量少，則說明可以抑制本抗體的脫酰胺化。表2-2分析條件
層析柱ProPacWCX-10 4 X 250mm (DIONEX)移動(dòng)相A液pH6. 1 的 25mmol/L MES 緩沖液B 液:pH6. 1 的 25mmol/L MES 緩沖液(含 250mmol/L 氯化鈉)樣品注入量抗IL-6受體人源化抗體約30 μ g流量0.5mL/分鐘檢測波長280nm數(shù)2計(jì)算式各峰合計(jì)面積=MRA前的峰面積合計(jì)+MRA主的峰面積+MRA亞_1的峰面積 +MRA亞-2的峰面積+MRA亞-3的峰面積+MRA R-I的峰面積+IQ(H)-MRA的峰面積合計(jì) +2Q (H)-MRA的峰面積合計(jì)+其他物質(zhì)(Others)的峰面積的總和MRA前的量(％ ) = (MRA前的峰面積的合計(jì)/各峰的合計(jì)面積)X 100典型的層析圖如圖4所示。MRA前是指MRA主之前出來的全部峰的總和。本實(shí)施例中得到的離子交換層析法(IEC)評價(jià)結(jié)果如表2及圖5、6所示。從中可 以看到，添加了精氨酸的樣品(樣品No. All A15)在40°C 3個(gè)月及25°C 6個(gè)月的加速試 驗(yàn)中，前峰的量比沒有添加精氨酸的樣品(樣品No. A10)低，由此可以判斷，精氨酸具有抑 制前峰生成的作用。并且，可以看到前峰的量的降低與精氨酸添加量成比例關(guān)系。另一方 面，添加了甲硫氨酸的樣品(樣品No. A16 A18)，經(jīng)過40°C 3個(gè)月及25°C 6個(gè)月的加速試 驗(yàn)，前峰的量與沒有添加精氨酸的樣品(樣品No. A10)相等，因此，未檢測到添加甲硫氨酸 的影響。表2-3表2 實(shí)施例3 __禾口☆戸斤致漏嫌效果(2)
同實(shí)施例1 一樣，評價(jià)精氨酸與甲硫氨酸的組合對含有抗IL-6受體人源化抗體的 溶液制劑的穩(wěn)定化的影響。本研究中為了評價(jià)精氨酸與甲硫氨酸的組合的效果，配制了樣品No. A19 A27的 評價(jià)樣品。各評價(jià)樣品的配方如下所述。表3-1配方
為評價(jià)溶液制劑的穩(wěn)定性，對各樣品進(jìn)行光加速試驗(yàn)(總照度120萬Iux及總近 紫外照射能量200W -h/m2)。與實(shí)施例1、2 —樣，采用凝膠過濾層析法(SEC)及離子交換層 析法(IEC)對光加速前后抗體的純度進(jìn)行評價(jià)。本實(shí)施例中得到的凝膠過濾層析法(SEC)評價(jià)結(jié)果如表3及圖7所示。從中可以 看到，添加了精氨酸的樣品(樣品NO.A20 A24)在光加速試驗(yàn)中，二聚體的量比沒有添加 精氨酸的樣品(樣品NO.A19)低，由此可以判斷，精氨酸具有抑制二聚體生成的作用。并且， 可以看到二聚體量的降低與精氨酸添加量成比例關(guān)系。另一方面，向精氨酸(IOOmM)中添 加甲硫氨酸的樣品(樣品No.A25 A27)經(jīng)過光加速試驗(yàn)，其二聚體的生成量比作為全穩(wěn) 定化劑濃度幾乎相同的精氨酸濃度為150mM的樣品(樣品No.A22)低，而且也比精氨酸濃 度為200mM及300mM的樣品(樣品No. A23、A24)低。該結(jié)果表明通過精氨酸與甲硫氨酸的 組合產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)，可以起到抑制二聚體生成的效果。未檢測到精氨酸及甲硫氨酸對低分子量分解物的量的影響。表3-2表3
其次，離子交換層析法(IEC)的評價(jià)結(jié)果如表4及圖8所示。從中可以看到，添加了精氨酸的樣品(樣品No.A20 A24)在光加速試驗(yàn)中，前峰 的量比沒有添加精氨酸的樣品(樣品NO.A19)低，由此可以判斷，精氨酸具有抑制前峰生成 的作用。并且，可以看到前峰的量的降低與精氨酸添加量成比例關(guān)系。另一方面，向精氨酸 (IOOmM)中添加甲硫氨酸的樣品(樣品No.A25 A27)經(jīng)過光加速試驗(yàn)，其二聚體的生成量 比作為全穩(wěn)定化劑濃度幾乎相同的精氨酸濃度為150mM的樣品(樣品No.A22)低，而且也 比精氨酸濃度為200mM及300mM的樣品(樣品No. A23、A24)低。該結(jié)果表明通過精氨酸與 甲硫氨酸的組合產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)，可以起到抑制前峰生成的效果。表4
權(quán)利要求
穩(wěn)定的含抗體的溶液制劑，其特征在于，含有精氨酸和甲硫氨酸。
2.權(quán)利要求1的溶液制劑，其還含有組氨酸緩沖劑。
3.權(quán)利要求1或2的溶液制劑，其還含有表面活性劑。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的溶液制劑，其中所述抗體濃度為50mg/mL以上。
5.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的溶液制劑，其中所述抗體濃度為lOOmg/mL以上。
6.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)的溶液制劑，其中所述抗體濃度為120mg/mL以上。
7.權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)的溶液制劑，其中所述抗體為抗白細(xì)胞介素_6受體抗體。
8.穩(wěn)定的含抗白細(xì)胞介素_6受體抗體的溶液制劑，其特征在于，含有精氨酸或甲硫氨
9.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)的溶液制劑，其中所述抗體為人源化抗體或人抗體。
10.權(quán)利要求ι --9中任一-項(xiàng)的浮 液制劑，其還含有色氨酸。
11.權(quán)利要求ι --10中任-一項(xiàng)的3容液制劑，其中所述溶液制劑的PH為4 8。
12.權(quán)利要求ι --11中任-一項(xiàng)的3容液制劑，其中所述精氨酸的含量為50 1500mM。
13.權(quán)利要求ι --12中任-一項(xiàng)的3容液制劑，其粘度為2 15mPa · s。
14.權(quán)利要求ι --13中任-一項(xiàng)的溶液制劑，其中所述溶液制劑于22 28°C至少6個(gè)月穩(wěn)定,
15.權(quán)利要求1 --13中任-一項(xiàng)的3容液制劑，其特征在于，抗體二聚體的生成被抑制。
16.權(quán)利要求1 --13中任-一項(xiàng)的i容液制劑，其特征在于，抗體分子的脫酰胺化被抑制。
17.權(quán)利要求1 --13中任-一項(xiàng)的i容液制劑，其被皮下施用。
18.權(quán)利要求1 --13中任--項(xiàng)的i容液制劑，其中所述溶液制劑的制備過程中不包括凍干工序而被制備出。
19.抑制含抗體的溶液制劑的抗體分子的脫酰胺化的方法，包括向所述溶液中添加精氨酸。
20.抑制含抗體的溶液制劑的抗體二聚體生成的方法，包括向所述溶液中添加精氨 酸和甲硫氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的含抗體的溶液制劑，其特征在于含有精氨酸和甲硫氨酸，所述制劑是長期保存時(shí)二聚體的生成及脫酰胺化被抑制的、穩(wěn)定的、適于皮下施用的含抗體的制劑。
文檔編號(hào)A61K9/08GK101883588SQ20088011906
公開日2010年11月10日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者O·B·施陶赫, 今枝好美, 前田照利, 森近俊行, 龜岡大介 申請人:中外制藥株式會(huì)社;弗·哈夫曼-拉羅切有限公司