專利名稱：抗體制劑的制作方法
抗體制劑本發(fā)明涉及抗CD20單克隆抗體制劑，制備所述制劑的方法和所述制劑的用途。
背景技術(shù)：
⑶20分子(也被稱為B-淋巴細(xì)胞-限制性分化抗原或Bp35)是位于前B及成 熟B淋巴細(xì)胞上的分子量大約為35kD的疏水性跨膜蛋白(Valentine等人(1989) J. Biol. Chem. 264(19) :11282_11287 和 Einfield 等人(1988)EMBO J. 7 (3) :711_717)。在超過(guò) 90% 的來(lái)自外周血或淋巴樣器官的B細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)了 CD20，其在早期前B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中 被表達(dá)并且一直存在到漿細(xì)胞分化。⑶20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞上。特別地， ⑶20表達(dá)于超過(guò)90%的B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上(Anderson等人(1984)Blood 63 (6) 1424-1433)，但是在造血干細(xì)胞、原-B細(xì)胞、正常漿細(xì)胞或其它正常組織上沒(méi)有被 發(fā)現(xiàn)(Tedder 等人(1985) J，Immunol. 135(2) :973_979)。CD20蛋白質(zhì)的85個(gè)氨基酸羧基末端區(qū)域位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。該區(qū)域的長(zhǎng)度與其它B 細(xì)胞_特異性表面結(jié)構(gòu)(如IgM、IgD和IgG重鏈)或者組織相容性Il類抗原α或β鏈 形成對(duì)比，其分別具有3、3、28、15和16個(gè)氨基酸的相對(duì)短的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(Komaromy等人 (1983) NARll :6775_6785)。在最后61個(gè)羧基末端氨基酸中，21個(gè)是酸性殘基，而只有2個(gè) 是堿性的，表明該區(qū)域具有強(qiáng)的凈負(fù)電荷。GenBank登記號(hào)是ΝΡ-690605。認(rèn)為⑶20可能 參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞激活和分化過(guò)程中的早期階段(Tedder等人(1986) Eur. J. Immunol. 2516 881-887)并能起到鈣離子通道的作用(Tedder 等人(1990) J. Cell. Biochem. 14D 195)。存在兩種不同類型的抗CD20抗體，它們的CD20結(jié)合模式和生物活性明顯 不同(Cragg, M. S.，等人，Blood, 103 (2004) 2738-2743 和 Cragg, M. S.，等人，Blood, 101 (2003) 1045-1051) ο I型抗體，如利妥昔單抗(Rituximab)，在補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性方面 是有效的，而II型抗體，如托西莫單抗(Tositumomab) ( Bexxar , Bi)、11B8和AT80，通 過(guò)具有伴隨的磷脂酰絲氨酸外露的胱天蛋白酶_非依賴性細(xì)胞凋亡促使靶細(xì)胞死亡。I型和II型抗⑶20抗體的共享的共同特征總結(jié)于表1中。
表1 :1型和II型抗⑶20抗體的特性發(fā)明概述一個(gè)方面，本發(fā)明涉及藥物制劑，其包含1 至 150mg/mL 的抗 CD20 抗體；1至IOOmM的緩沖液；任選地0. 001至1 %的表面活性劑；和任選地1至800mM的張度劑；pH在4. 5至7. 0的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述抗⑶20抗體是II型抗體。更優(yōu)選地，所述抗⑶20抗體是人源化 B-Lyl抗體。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)“抗體”包括各種不同形式的抗體，包括但不限于全抗體、人抗體、人源化抗體 和遺傳基因工程抗體(如單克隆抗體、嵌合抗體或重組抗體)以及此類抗體的片段，只要保 留本發(fā)明的特有的特性。“抗體片段”包括全長(zhǎng)抗體的一部分，通常至少包括其抗原結(jié)合部分或可變區(qū)。抗 體片段的實(shí)例包括雙抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素和由抗體片段形成的多特異性抗體。此 外，抗體片段包括具有VH鏈的特征的單鏈多肽，即能與VL鏈裝配在一起或者具有與CD20 抗原結(jié)合的VL鏈的特征，即能與VH鏈裝配成功能性抗原結(jié)合口袋。“抗體片段”還包括這樣的片段，其本身不能提供效應(yīng)子功能(ADCC/⑶C)，但是能 在與適當(dāng)?shù)目贵w恒定區(qū)結(jié)合后以根據(jù)本發(fā)明的方式提供此種功能。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一氨基酸組成的抗體 分子的制劑。因此，術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”指顯示出單一結(jié)合特異性的抗體，其具有來(lái)源于 人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由包括從轉(zhuǎn)基 因非人動(dòng)物(如轉(zhuǎn)基因小鼠)獲得的B細(xì)胞的雜交瘤制備，所述雜交瘤具有與無(wú)限增殖化 細(xì)胞融合的包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指包含由一個(gè)來(lái)源或物種得到可變區(qū)(即結(jié)合區(qū))和從不同來(lái)源 或物種得到的至少部分恒定區(qū)的單克隆抗體，通常通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。尤其優(yōu)選包含 鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。此種鼠/人嵌合抗體是免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物，所 述免疫球蛋白基因包含編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼人免疫球蛋白恒定區(qū) 的DNA區(qū)段。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它形式是原始抗體的類或亞類經(jīng)修飾或改變 的形式。此種“嵌合”抗體也稱為“類轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體的制備方法涉及本領(lǐng)域已知的 常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參加例如Morrison，S. L.等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984)6851-6855 ；US 5，202，238 和 US 5,204,244。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指這樣的抗體，其中構(gòu)架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(OTR)經(jīng)修飾而包 含特異性不同于親代免疫球蛋白的免疫球蛋白CDR。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將鼠CDR 嫁接到人抗體的構(gòu)架區(qū)內(nèi)以制備“人源化抗體”。參加例如Riechmarm，L.等人，Nature332(1988)323-327 和 Neuberger，Μ· S.等人，Nature 314(1985)268-270。對(duì)于嵌合和雙功 能抗體，特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于那些識(shí)別上述抗原的代表性序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變 區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk, Μ. Α.和van de Winkel, J. G.，Curr· Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374)?；诖朔N技術(shù)，能制備對(duì)抗各種各 樣的靶點(diǎn)的人抗體。人抗體的實(shí)例例如描述于Kellermarm，S. Α.等人，Curr Opin Biotechnol. 13(2002)593-597 中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”意欲包括所有通過(guò)重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分 離的人抗體，例如從宿主細(xì)胞(例如NSO或CHO細(xì)胞)或從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物(例如小鼠)分離的抗體，或采用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。此種 重組人抗體具有重排形式的源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。本發(fā)明的重組 人抗體已經(jīng)過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列雖然源自人種 系VH和VL序列并與其相關(guān)，卻可以不天然存在于體內(nèi)人抗體種系庫(kù)內(nèi)。本文所用的“特異性結(jié)合”指抗體特異性地與CD20抗原結(jié)合。優(yōu)選地，結(jié)合親和 力是 10_9mOl/l 或 10_9mOl/l 以下(例如 lO.mol/l)的 KD 值，優(yōu)選 ΙΟ,πιοΙ/Ι 或 lO.mol/ 1以下(例如10_12mOl/l)的KD值。用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定法測(cè)定結(jié)合親和力，例如表面等離振子 共振技術(shù)(Biacore )。本文所用的“核酸分子“意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或 雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA?！昂愣▍^(qū)”不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但參與效應(yīng)功能(ADCC、補(bǔ)體結(jié)合和 CDC)。本文所用的“可變區(qū)”(輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH))指直接參與抗體抗原 結(jié)合的每一對(duì)輕鏈和重鏈。人輕鏈和重鏈的可變區(qū)具有相同的一般結(jié)構(gòu)，每個(gè)區(qū)域包含四 個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，其序列廣泛保守，由三個(gè)“超變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)連接。構(gòu)架區(qū)采 取b-片層構(gòu)象，⑶R可形成連接b-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的⑶R通過(guò)構(gòu)架區(qū)保持其三 維結(jié)構(gòu)并與另一條鏈的CDR —起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā) 明的抗體結(jié)合特異性/親和力中發(fā)揮重要的作用，因而提供了本發(fā)明的另一個(gè)目的。當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語(yǔ)“超變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的 氨基酸殘基。超變區(qū)包含“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”區(qū)或“FR”區(qū)是除了 本文所定義的超變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)區(qū)域。因此，抗體的重鏈和輕鏈從N-端到C-端 包含區(qū)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。尤其是，重鏈的CDR3是對(duì)抗原結(jié)合作出最 大貢獻(xiàn)的區(qū)域° 根據(jù) Kabat 等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (免 疫學(xué)重要的蛋白質(zhì)序列)，第五版.公共衛(wèi)生服務(wù)處，國(guó)家衛(wèi)生部，貝塞斯達(dá)，馬里蘭 州.(1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或那些來(lái)自“超變環(huán)”的殘基確定CDR區(qū)和FR區(qū)。本文可互換使用術(shù)語(yǔ)“⑶20”和“⑶20抗原”，并且其包括人⑶20的任何變體、同 種型和種同源物，其由細(xì)胞天然表達(dá)或表達(dá)于用CD20基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上。本發(fā)明的抗體和 ⑶20抗原的結(jié)合通過(guò)失活⑶20來(lái)介導(dǎo)殺死表達(dá)⑶20的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)。殺死表達(dá) ⑶20的細(xì)胞可通過(guò)以下一種或多種機(jī)理發(fā)生現(xiàn)有技術(shù)已確認(rèn)的⑶20的同義詞包括B-淋巴細(xì)胞抗原⑶20、B_淋巴細(xì)胞表面抗原 Bi、Leu-16、Bp35、BM5 和 LF5。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“抗CD20抗體”是特異性結(jié)合CD20抗原的抗體。取決 于抗⑶20抗體對(duì)⑶20抗原的結(jié)合特性和生物活性，根據(jù)Cragg，Μ. S.等人，Blood 103 (2004) 2738-2743 和 Cragg，M. S.等人，Blood 101(2003) 1045-1051 能將抗 CD20 抗體區(qū) 分為兩種類型，見(jiàn)表2。 表2 :1型和II型抗⑶20抗體的特性I型和II型抗⑶20抗體的一個(gè)重要特性是它們的結(jié)合模式。因此可通過(guò)所述抗 ⑶20抗體相對(duì)于利妥昔單抗對(duì)Raji細(xì)胞(ATCC-No. CCL-86)上的⑶20的結(jié)合能力的比率 對(duì)I型和II型抗⑶20抗體進(jìn)行分類。如本文所用的，“抗⑶20抗體”可以是I型或II型抗體。優(yōu)選地，它是II型抗體。所述I型抗⑶20抗體相對(duì)于利妥昔單抗對(duì)Raj i細(xì)胞(ATCC_No. CCL-86)上的 ⑶20的結(jié)合能力的比率為0. 8至1. 2、優(yōu)選0. 9至1. 1。此種I型抗⑶20抗體的實(shí)例包 括例如利妥昔單抗、(W094/11026) UF5IgG2a(ECACC,雜交瘤；Press 等人，Blood 69/2 584-591 (1987))，H147IgG3 (ECACC,雜交瘤)，2C6IgGl (如 W02005/103081 中公開(kāi)的)， 2F2IgGl (如公開(kāi)的及 WO 2004/035607 和 W02005/103081)和 2H7 IgGl (如 WO 2004/056312 中公開(kāi)的)。優(yōu)選地所述I型抗CD20抗體是與利妥昔單抗結(jié)合相同的表位的單克隆抗體。 所述II型抗CD20抗體相對(duì)于利妥昔單抗對(duì)Raji細(xì)胞(ATCC-No. CCL-86)上的CD20的結(jié) 合能力的比率為0. 3至0. 6，優(yōu)選0. 35至0. 55，更優(yōu)選0. 4至0. 5。此種II型抗⑶20抗 體的實(shí)例包括例如托西莫單抗(Bi IgG2a)、人源化B-Lyl抗體IgGl (如W02005/044859中 公開(kāi)的嵌合人源化IgGl抗體)、11B8 IgGl (如W02004/035607中公開(kāi)的)和AT80IgGl。 優(yōu)選地所述II型抗CD20抗體是與人源化B-Lyl抗體結(jié)合相同的表位的單克隆抗體(如 W02005/044859 中公開(kāi)的)。使用所述綴合Cy5的抗⑶20抗體和綴合Cy5的利妥昔單抗在FACSArray (BectonDickinson)中用Raji細(xì)胞(ATCC-No. CCL-86)通過(guò)直接免疫熒光測(cè)定(測(cè)定平均熒光強(qiáng)度 (MFI))確定“抗⑶20抗體相對(duì)于利妥昔單抗對(duì)Raji細(xì)胞(ATCC-No. CCL-86)上的⑶20的 結(jié)合能力的比率”，如實(shí)施例2中所述，并且如下計(jì)算
對(duì)Raji細(xì)胞(ATCC-No. CCL-86 )上的CD20的結(jié)合能力的比率= MFI是平均熒光強(qiáng)度。如本文所用的“Cy5標(biāo)記比率”意指每分子抗體Cy5標(biāo)記分
子的數(shù)量。所述第一抗⑶20抗體相對(duì)于利妥昔單抗對(duì)Raj i細(xì)胞(ATCC_No. CCL-86)上的 ⑶20的結(jié)合能力的比率，典型地所述I型抗⑶20抗體為0.8至1.2，優(yōu)選0.9至1. 1。所述第二抗⑶20抗體相對(duì)于利妥昔單抗對(duì)Raj i細(xì)胞(ATCC_No. CCL-86)上的 ⑶20的結(jié)合能力的比率，典型地所述II型抗⑶20抗體為0. 3至0. 6，優(yōu)選0. 35至0. 55，更 優(yōu)選0.4至0.5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述II型抗CD20抗體(優(yōu)選人源化B-Lyl抗體)具有增 加的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)?！熬哂性黾拥目贵w依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的抗體”意指如本文所定義的術(shù)語(yǔ)抗體， 其具有如通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適宜的方法確定的增加的ADCC。體外ADCC 測(cè)定法中接受的一種方法如下1)所述測(cè)定法使用已知表達(dá)抗體的抗原_結(jié)合區(qū)能識(shí)別的靶抗原的靶細(xì)胞；2)所述測(cè)定法使用由隨機(jī)選擇的健康供者的血液分離的人外周血單核細(xì)胞 (PBMC)作為效應(yīng)細(xì)胞；3)根據(jù)以下方案進(jìn)行所述測(cè)定法i)使用標(biāo)準(zhǔn)密度離心程序分離PBMC并將其以5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml懸浮于RPMI細(xì)
胞培養(yǎng)基中；ii)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法使靶細(xì)胞生長(zhǎng)，從具有大于90%的生活力的指數(shù)生長(zhǎng) 期收集，在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基中洗滌，用100微居里"CI-標(biāo)記，用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌兩次，然 后以10'個(gè)細(xì)胞/ml的密度再懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中；iii)將上面的100微升最終的靶細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移到96-孔微量滴定板的各個(gè)孔 中；iv)在細(xì)胞培養(yǎng)基中將抗體從4000ng/ml連續(xù)稀釋至0. 04ng/ml，然后將50微升 得到的抗體溶液加入到96-孔微量滴定板的靶細(xì)胞中，一式三份測(cè)試包括上面整個(gè)濃度范 圍的不同的抗體濃度；ν)對(duì)于最大釋放(MR)對(duì)照，將50微升2% (VN)的非離子型去污劑(Nonidet， Sigma，圣路易斯)水溶液代替抗體溶液(上面要點(diǎn)iv)添加到板中含有標(biāo)記的靶細(xì)胞的3 個(gè)另外的孔；vi)對(duì)于自發(fā)釋放(SR)對(duì)照，將50微升的RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基代替抗體溶液(上面 要點(diǎn)iv)添加到板中含有標(biāo)記靶細(xì)胞的3個(gè)另外的孔；
vii)然后將96-孔微量滴定板以50x g離心1分鐘并在4°C下溫育1小時(shí)；viii)將50微升的PBMC混懸液(上面的i點(diǎn))添加到各個(gè)孔中以得到25 1的 效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比率，然后將板置于37°C、5% C02氣氛下的培養(yǎng)箱中4小時(shí)；ix)從各個(gè)孔中收集不含細(xì)胞的上清液，使用Y計(jì)數(shù)器對(duì)實(shí)驗(yàn)釋放(ER)的放射性
進(jìn)行定量；χ)根據(jù)公式(ER-MR) / (MR-SR) χ 100計(jì)算各個(gè)抗體濃度的特異性溶解百分率，其 中ER是對(duì)于該抗體濃度量化的平均放射性(見(jiàn)上面要點(diǎn)ix)，MR是對(duì)于MR對(duì)照(見(jiàn)上面 要點(diǎn)V)量化的平均放射性(見(jiàn)上面要點(diǎn)ix)，SR是對(duì)于SR對(duì)照(見(jiàn)上面要點(diǎn)vi)量化的 平均放射性(見(jiàn)上面要點(diǎn)ix)；4) “增加的ADCC”定義為上面所測(cè)試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的最大特異性溶解 百分率增加，和/或達(dá)到上面所測(cè)試的抗體濃度范圍內(nèi)觀察到的最大特異性溶解百分率的 一半需要的抗體濃度減小。ADCC增加是相對(duì)于ADCC，用上面測(cè)定法測(cè)定，由相同的抗體介 導(dǎo)，由相同類型的宿主細(xì)胞產(chǎn)生，使用相同標(biāo)準(zhǔn)的制備、純化、配制和儲(chǔ)存方法，這些對(duì)于本 領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，但是其還沒(méi)有被工程化以過(guò)表達(dá)GnTIII的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。能通過(guò)對(duì)所述抗體進(jìn)行糖工程化獲得所述“增加的ADCC”，這意味著如Umana， P.等人，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999)和美國(guó)專利號(hào) 6，602，684 中所述的，通過(guò) 對(duì)它們的寡糖成分進(jìn)行工程化增強(qiáng)所述單克隆抗體的天然、細(xì)胞_介導(dǎo)的效應(yīng)功能。術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)體_依賴性細(xì)胞毒性(CDC) ”指在補(bǔ)體存在下人腫瘤靶細(xì)胞被根據(jù)本發(fā)明 的抗體溶解。優(yōu)選通過(guò)在補(bǔ)體存在下用根據(jù)本發(fā)明的抗CD20抗體處理CD20表達(dá)細(xì)胞的制 劑測(cè)定CDC。如果IOOnM濃度的抗體在4小時(shí)后誘導(dǎo)20%或20%以上的腫瘤細(xì)胞溶解(細(xì) 胞死亡)，則發(fā)現(xiàn)CDC。優(yōu)選用51Cr或Eu標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞并測(cè)定釋放的51Cr或Eu進(jìn)行測(cè)定 法。對(duì)照包括用補(bǔ)體但不用抗體溫育腫瘤靶細(xì)胞。典型地，IgGl同種型的I型和II型抗⑶20抗體顯示出特征性⑶C特性。相對(duì)于 彼此，I型抗CD20抗體具有增加的CDC(如果是IgGl同種型)，II型抗CD20抗體具有減少 的⑶C(如果是IgGl同種型)。優(yōu)選I型和II型抗⑶20抗體均為IgGl同種型抗體。“利妥昔單抗”抗體是針對(duì)人CD20抗原的含有遺傳工程化的嵌合人Y 1鼠恒定區(qū) 的單克隆抗體。這種嵌合抗體含有人Yl恒定區(qū)并由W094/11026 (Anderson等人)中的名 稱“C2B8”確定。利妥昔單抗獲得批準(zhǔn)用于治療患有復(fù)發(fā)性或折射低度惡性或?yàn)V泡型、CD20 陽(yáng)性的B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。體外作用機(jī)理研究表明利妥昔單抗表現(xiàn)出人補(bǔ) 體-依賴性細(xì)胞毒性(CDC) (Reff等人，Blood 83(2) :435_445 (1994))。此外，利妥昔單抗 在測(cè)定抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的測(cè)試中表現(xiàn)出顯著活性。術(shù)語(yǔ)“人源化B-Lyl抗體”指如W02005/044859中公開(kāi)的人源化B-Lyl抗體，其 是由鼠單克隆抗⑶20抗體B-Lyl (鼠重鏈可變區(qū)(VH) =SEQID NO 1 ；鼠輕鏈可變區(qū)(VL) SEQ ID NO 2-B Poppema, S. and Visser, L. ,Biotest Bulletin 3 131-139 (1987))通過(guò) 與IgGl的人恒定區(qū)嵌合然后人源化獲得的(見(jiàn)W02005/044859)。W02005/044859中詳細(xì) 地公開(kāi)了這些“人源化B-Lyl抗體”。優(yōu)選地，“人源化B-Lyl抗體”具有選自SEQ ID No. 3至SEQ ID No. 20的重鏈可變 區(qū)(VH) (W02005/044859 中的 B-HH2 至 B-HH9 和 B-HL8 至 B-HL17)。尤其優(yōu)選的是 Seq. ID No. 3、4、7、9、11、13 和 15 (W02005/044859 中的 B—HH2、BHH—3、B—HH6、B—HH8、B—HL8、B-HL11 和B-HL13)。最優(yōu)選地，所述VH是BHH6。優(yōu)選地，“人源化B-Lyl抗體”具有W02005/044859中 的SEQ ID No. 20 (B-KVl)的輕鏈可變區(qū)(VL)。而且，人源化B-Lyl抗體優(yōu)選為IgGl抗體。優(yōu) 選地,此種人源化B-Lyl抗體的Fc區(qū)被根據(jù)W02005/044859、W0 2004/065540,Umana, P.等 人，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999)和 WO 99/154342 中描述的方法糖工程化(GE)。 多少糖工程化的人源化B-Lyl抗體的Fc區(qū)具有改變的糖基化模式，優(yōu)選具有減小的巖藻糖 殘基水平。優(yōu)選地，F(xiàn)c區(qū)中至少40%或40%以上(一個(gè)實(shí)施方案中在40%和60%之間， 另一實(shí)施方案中至少50%，又一實(shí)施方案中至少70%或70%以上)的寡糖是非巖藻糖基化 的。而且，F(xiàn)c區(qū)中的寡糖優(yōu)選是對(duì)分的。最優(yōu)選地，“人源化B-Lyl抗體”包含W02005/044859 中的VH B-HH6和VL B-KVl。本文所用的，所述抗體也被稱為“HuMab〈⑶20>”。在另一最優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述抗體具有如上定義的減小的巖藻糖殘基水平和/或Fc區(qū)中的寡糖最 優(yōu)選是對(duì)分的。在又一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體表現(xiàn)出如本文定義的增加的ADCC。寡糖成分能明顯影響與治療性糖蛋白的效力相關(guān)的性質(zhì)，包括物理穩(wěn)定性、對(duì)蛋 白酶攻擊的抗性、與免疫系統(tǒng)的相互作用、藥代動(dòng)力學(xué)和特定的生物活性。此種性質(zhì)可能 不僅取決于寡糖的存在或缺失，而且取決于寡糖特定的結(jié)構(gòu)?？梢詫?duì)寡糖結(jié)構(gòu)和糖蛋白功 能之間進(jìn)行一些概括。例如，某些寡糖結(jié)構(gòu)通過(guò)與特定的糖結(jié)合蛋白相互作用介導(dǎo)糖蛋白 從血流中快速清除，而其它寡糖能被抗體結(jié)合并啟動(dòng)不期望的免疫反應(yīng)(Jenkins等人， Nature Biotechnol. 14 :975_81(1996))。由于它們對(duì)人類應(yīng)用以最相容的形式糖基化蛋白的能力，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用于制 備治療性糖蛋白的優(yōu)選宿主。(Cumming等人，Glycobiologyl 115-30 (1991) Jenkins等 人，Nature Biotechnol. 14 :975_81 (1996))。細(xì)菌極少使蛋白質(zhì)糖基化，并且象其它類型的 常見(jiàn)宿主，如酵母、絲狀真菌、昆蟲和植物細(xì)胞，產(chǎn)生伴隨從血流中快速清除、不期望的免疫 相互作用、和在一些特殊的情況中降低的生物活性的糖基化模式。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在最 近的二十年中最常使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。除了提供適宜的糖基化模式之外，這些 細(xì)胞允許遺傳上穩(wěn)定的、高產(chǎn)克隆細(xì)胞系的一致產(chǎn)生。它們能在簡(jiǎn)易的生物反應(yīng)器中使用 不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)至高密度，并且允許開(kāi)發(fā)安全和可重現(xiàn)的生物工藝。其它通常使用 的動(dòng)物細(xì)胞包括幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤細(xì)胞。最近，也對(duì)由轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物生產(chǎn)進(jìn)行了試驗(yàn)。(Jenkins 等人，Nature Biotechnol. 14 :975_981 (1996))。所有的抗體在重鏈恒定區(qū)的保守位置含有糖結(jié)構(gòu)，每個(gè)同種型具有不同排列的 N-連接糖結(jié)構(gòu)，其易變地影響蛋白質(zhì)組裝、分泌或功能活性。(Wright，A.和MoniSon，S.L.， Trends Biotech. 15 :26_32 (1997))。附著的N-連接糖的結(jié)構(gòu)變化相當(dāng)大，這取決于加工 程度，并且可以包括高甘露糖、多分枝以及雙天線復(fù)雜型寡糖。(Wright，A.和Morrison， S. L. ,Trends Biotech. 15 :26_32 (1997))。典型地，在特定的糖基化位點(diǎn)處連接的核心寡糖 結(jié)構(gòu)存在異質(zhì)加工，從而使單克隆抗體甚至以多糖形存在。同樣，已經(jīng)表明抗體糖基化中的 主要差別出現(xiàn)在細(xì)胞系之間，甚至對(duì)于在不同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的給定細(xì)胞系也看到較小 的差別。(Lifely, M. R.等人，Glycobiology 5(8) :813_22 (1995))?！獋€(gè)獲得大的效力增加同時(shí)保持簡(jiǎn)單的生產(chǎn)工藝并潛在地避免明顯的、不期望的 副作用的方法是如Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999)和美國(guó)專利 6，602，684號(hào)中所述的通過(guò)對(duì)它們的寡糖成分進(jìn)行工程化而增強(qiáng)單克隆抗體的天然的、細(xì) 胞-介導(dǎo)的效應(yīng)功能。IgGl型抗體(癌癥免疫治療中最常使用的抗體)是在各個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域
11中的Asn297處具有保守的N-連接糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。兩個(gè)與Asn297連接的雙天線復(fù)雜 型寡糖埋入CH2結(jié)構(gòu)域之間，與多肽主鏈形成廣泛的接觸，并且它們的存在對(duì)于抗體介導(dǎo) 效應(yīng)功能如抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)是必不可少的(Lifely，M.R.，等人，Glycobiology 5 813-822(1995) Jefferis, R.，等人，Immunol. Rev. 163 :59_76(1998) ；Wright, Α.和 Morrison, S. L.，Trends Biotechnol. 15 :26_32(1997))。先前證實(shí)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞過(guò)表達(dá)β (1，4)-Ν-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶 IlK" GnTII17y)(催化形成截開(kāi)的寡糖的糖基轉(zhuǎn)移酶)顯著增加了由工程化CHO細(xì)胞 產(chǎn)生的抗神經(jīng)母細(xì)胞瘤嵌合單克隆抗體(chCE7)的體外ADCC活性。(見(jiàn)Umana，P.等人， Nature Biotechnol. 17 :176_180 (1999)和 WO 99/154342，其全部?jī)?nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并 入)?？贵wchCE7屬于未綴合的單克隆抗體的大類，其具有高度腫瘤親和性和特異性，但是 當(dāng)在缺乏GnTIII酶的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)細(xì)胞系中制備時(shí)具有太小潛能而在臨床是無(wú)用的(Umana， P.，等人，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999))。該研究是第一個(gè)證實(shí)大的 ADCC 活性 增加能通過(guò)對(duì)抗體生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行工程化以過(guò)表達(dá)GnTIII獲得，其也導(dǎo)致恒定區(qū)(Fe)-結(jié)合 的、截開(kāi)型寡糖(包括截開(kāi)型非巖藻糖基化寡糖)的比例增加超過(guò)天然存在的抗體中發(fā)現(xiàn) 的水平。術(shù)語(yǔ)“CD20抗原的表達(dá)”用于表明CD20抗原在分別來(lái)自于腫瘤或癌癥(優(yōu)選非實(shí) 體瘤)的細(xì)胞中、優(yōu)選在T-或B-細(xì)胞的細(xì)胞表面上、更優(yōu)選B-細(xì)胞的細(xì)胞表面上顯著表 達(dá)水平?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法確定患有“⑶20表達(dá)癌癥”的患者?！阿?0抗 原的表達(dá)”也優(yōu)選用于表明CD20抗原在自身免疫性疾病的細(xì)胞中、優(yōu)選在T-或B-細(xì)胞的 細(xì)胞表面上、更優(yōu)選B-細(xì)胞的細(xì)胞表面上顯著水平的表達(dá)。例如使用免疫組織化學(xué)(IHC) 檢測(cè)、FACS或基于PCR的檢測(cè)相應(yīng)的mRNA來(lái)測(cè)定⑶20抗原表達(dá)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“⑶20表達(dá)癌癥”優(yōu)選指淋巴瘤(優(yōu)選B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)和淋巴細(xì)胞性白血病。此種淋巴瘤和淋巴細(xì)胞性白血病包括例如a)濾泡型淋巴瘤， b)小無(wú)核裂細(xì)胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤、散發(fā)性伯基特淋巴瘤 和非伯基特淋巴瘤)，c)邊緣區(qū)淋巴瘤(包括結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(粘膜相關(guān)淋巴樣組 織淋巴瘤，MALT)、結(jié)節(jié)邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤和脾邊緣區(qū)淋巴瘤)，d)外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)， e)大細(xì)胞淋巴瘤(包括B細(xì)胞彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤(DLCL)、彌漫性混合型細(xì)胞淋巴瘤、免 疫母細(xì)胞性淋巴瘤、原發(fā)縱隔B細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B細(xì)胞淋巴瘤)，f)毛 細(xì)胞性白血病，g)淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，h)急性淋巴細(xì)胞性白 血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞性白血病(SLL)、B細(xì)胞前淋巴細(xì)胞 性白血病，i)漿細(xì)胞贅生物、漿細(xì)胞性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤，j)何杰金氏病。優(yōu)選地，⑶20表達(dá)癌癥是B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。⑶20表達(dá)癌癥尤其是 外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、B細(xì) 胞彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤、毛細(xì)胞性白血病、濾泡型淋巴瘤、多發(fā)性骨 髓瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、移植后淋巴增生性障礙(PTLD)、HIV相關(guān)淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球 蛋白血癥或原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。本文所用的，“自身免疫性疾病”涉及由患者自身組織產(chǎn)生并且針對(duì)患者自身組 織的疾病或障礙。自身免疫性疾病或障礙的實(shí)例包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎)、銀屑病、皮炎、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死溶解、系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥、與15炎性腸病相關(guān)的反應(yīng)、克隆病、潰瘍性結(jié)腸 炎、呼吸窘迫綜合征、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、結(jié)腸炎、血管 球性腎炎、過(guò)敏狀況、濕疹、哮喘、涉及T細(xì)胞滲出和慢性炎癥應(yīng)答的狀況、動(dòng)脈粥樣硬化、 自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、青少年型糖尿病、多發(fā)性硬 化、變應(yīng)性腦脊髓炎、與由細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)有關(guān)的免 疫反應(yīng)、結(jié)核病、肉樣瘤病、肉芽腫病(包括韋格納肉芽腫病)、粒細(xì)胞缺乏癥、血管炎(包 括ANCA)、再生障礙性貧血、戴-布二氏貧血、免疫性溶血性貧血，包括自身免疫性溶血性 貧血(AIHA)、惡性貧血、單純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、第VIII因子缺乏癥、血友病A、自身 免疫性嗜中性白血球減少癥、全血細(xì)胞減少癥、白血球減少癥、涉及白血球滲出的疾病、中 樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性障礙、多器官損傷綜合征、重癥肌無(wú)力、抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾 病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體綜合征、過(guò)敏性神經(jīng)炎、白塞病、巨淋巴結(jié)增生綜合征 (Castleman' s syndrome)、古德帕斯丘綜合征、Lambert-Eaton肌無(wú)力綜合征、雷諾綜合 征、舍格倫綜合征(Sjorgen' s syndrome)、其Jf -約綜合征(Stevens Johnson syndrome) > 大皰性類天皰瘡、天皰瘡、自身免疫性多內(nèi)分泌病、腎病、IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神 經(jīng)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血 小板減少癥、睪丸和卵巢的自身免疫性疾病(包括睪丸炎和卵巢炎)、原發(fā)性甲狀腺機(jī)能 減退、自身免疫性內(nèi)分泌障礙性疾病(包括自身免疫性甲狀腺炎)、慢性甲狀腺炎(橋本 甲狀腺炎)、亞急性甲狀腺炎、特發(fā)性甲狀腺機(jī)能減退、艾迪生病、格雷夫斯病(Grave' s disease)、自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體I內(nèi)分泌病綜合征)、I型糖尿病也稱為胰 島素依賴性糖尿病(IDDM)和希恩綜合征、自身免疫性肝炎、淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎(HIV)、 梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植)相對(duì)于NSIP、吉-巴綜合征、大血管性血管炎(包括風(fēng)濕性多 肌痛和巨細(xì)胞性(高安)動(dòng)脈炎)、中血管性血管炎(包括川畸病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、強(qiáng) 直性脊柱炎、伯格氏病(IgA腎病)、急進(jìn)性腎小球性腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、口炎性腹 瀉(非熱帶性口炎性腹瀉)、冷球蛋白血癥、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、冠心病等。通過(guò)將具有所需純度的抗體與任選的可藥用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑 (Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 I6 版，0sol，A.編輯(1980))混合以凍干制 劑或水溶液的形式制備根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的治療制劑用于儲(chǔ)存?？山邮艿妮d體、賦形 劑或穩(wěn)定劑在采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”指可藥用的表面活性劑。在本發(fā)明的制劑中，表面 活性劑的量以重量/體積百分比表達(dá)。最常使用的重量/體積單位是mg/ml。適宜的可藥用 的表面活性劑包括但不限于非離子表面活性劑，如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。 而且，所述表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨醇醚脂肪酸酯、聚氧乙烯化聚丙二 醇、聚氧乙烯硬脂酸酯和十二烷基硫酸鈉。優(yōu)選的聚氧乙烯失水山梨醇是聚氧乙烯(20)失 水山梨醇酯(別名為聚山梨酯20，以商標(biāo)吐溫(Tween) 20 銷售)和聚氧乙烯(20)失水山 梨醇醚單油酸酯(別名為聚山梨酯80，以商標(biāo)吐溫80 銷售)。優(yōu)選的聚氧乙烯化聚丙二 醇是以普朗尼克(Pluronic) F68或泊洛沙姆(Poloxamer) 188 銷售的那些物質(zhì)。最優(yōu)選 的是泊洛沙姆188 。優(yōu)選的聚氧乙烯硬脂酸酯是以商標(biāo)Myr j 銷售的那些物質(zhì)。優(yōu)選的 聚氧乙烯單月桂醚是以商標(biāo)Bri j 銷售的那些物質(zhì)。當(dāng)使用聚氧乙烯失水山梨醇-聚氧乙 烯(20)失水山梨醇酯(吐溫20 )和聚氧乙烯(20)失水山梨醇單油酸酯(吐溫80 )時(shí)，它們通常的用量是大約0. 001至大約1%，優(yōu)選大約0. 005至大約0. 并且更優(yōu)選大約 0. 01% 至大約 0. 04% w/vo本文所用的術(shù)語(yǔ)“緩沖液”指可藥用的緩沖液。適宜的可藥用的緩沖液包括但不限 于組氨酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選 的緩沖液包括L-組氨酸或L-組氨酸與L-組氨酸鹽酸鹽和等張劑，并且可能用本領(lǐng)域已知 的酸或堿調(diào)節(jié)PH。最優(yōu)選的是L-組氨酸。上述的組氨酸-緩沖液通常以大約ImM至大約 100mM、優(yōu)選大約5mM至大約50mM并且還更優(yōu)選大約20mM的量使用。不依賴所使用的緩沖 液，通過(guò)用本領(lǐng)域已知的酸或堿調(diào)節(jié)或者通過(guò)使用適當(dāng)?shù)木彌_成分的混合物或者二者將PH 調(diào)節(jié)至包括大約4. 5至大約7. 0、優(yōu)選大約5. 5至大約6. 5并且更優(yōu)選大約6. 0的值。本文所用的術(shù)語(yǔ)“等張劑”指可藥用的等張劑。使用等張劑以提供等張制劑。等 張制劑是液體或由固體形式(例如凍干形式)重構(gòu)的液體，并且指具有與同它相比的其它 一些溶液(如生理鹽水溶液和血清)相同的張度的溶液。適宜的等張劑包括但不限于鹽， 包括但不限于氯化鈉(NaCl)或氯化鉀；糖，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘油和來(lái) 自氨基酸、糖、鹽及其組合的任何成分。等張劑通常以大約5mM至大約350mM的總量使用。本文所用的與根據(jù)本發(fā)明的制劑有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“液體”指一種制劑，其在至少大約2 至大約8°C的溫度下為液體。本文所用的與根據(jù)本發(fā)明的制劑有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“凍干的”指一種制劑，其用本領(lǐng)域已 知的任何冷凍干燥方法(例如市售的冷凍干燥裝置)通過(guò)將制劑冷凍然后使冰從冷凍的內(nèi) 容物中升華來(lái)干燥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹽”指大約ImM至大約500mM量的鹽。所述鹽的非限制性實(shí)例 包括陽(yáng)離子鈉、鉀、鈣或鎂與陰離子氯、磷酸根、檸檬酸根、琥珀酸根、硫酸根的任何組合的 鹽或者其混合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指大約1至大約lOOmg/mL量的氨基酸，其包括但不限 于精氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、脯氨酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“糖”指大約25mM至大約500mM量的可藥用的糖。優(yōu)選的是100 至300mM。更優(yōu)選的是220至260mM。最優(yōu)選的是240mM。適宜的糖包括但不限于單糖和二 糖。根據(jù)本發(fā)明的糖的非限制性實(shí)例包括海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、甘露 糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(通常所說(shuō)的“葡甲胺”)、 半乳糖胺和神經(jīng)氨酸及其組合。最優(yōu)選的是海藻糖。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”指可藥用的穩(wěn)定劑，像例如但不限于如上面部分描述的氨基酸和糖 以及本領(lǐng)域已知的任何種類和分子量的市售的葡聚糖。術(shù)語(yǔ)“抗氧化劑”指可藥用的抗氧化劑。這可以包括如甲硫氨酸、芐醇的賦形劑或 者用來(lái)使氧化降到最低的其它賦形劑。術(shù)語(yǔ)“治療方法”或它的同等表達(dá)當(dāng)用于例如癌癥時(shí)，指用來(lái)減少或消除患者體內(nèi) 癌細(xì)胞數(shù)目或減輕癌癥的癥狀的程序或過(guò)程。癌癥或另外的增生性障礙的“治療方法”不一 定指癌癥細(xì)胞或其它障礙會(huì)實(shí)際上被消除，細(xì)胞或障礙的數(shù)目會(huì)實(shí)際上被減少或者癌癥或 其它障礙的癥狀會(huì)實(shí)際上被減輕。通常，即使只具有低的成功可能性也會(huì)進(jìn)行治療癌癥的 方法，但是考慮到患者的病史和估計(jì)的生存預(yù)期，其仍然被認(rèn)為誘導(dǎo)總體有益的作用過(guò)程。
在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及抗⑶20抗體制劑，其包含-大約1至大約150mg/mL的抗CD20抗體，-大約0.001至大約10A的至少一種表面活性劑，和-大約1至大約IOOmM的緩沖液，-pH為大約4. 5至大約7. 0。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制劑包含-大約1至大約150mg/mL的抗CD20抗體，-大約0.005至大約0. 05%的至少一種表面活性劑，和-大約1至大約IOOmM的緩沖液，-pH為大約4. 5至大約7. 0。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制劑包含-大約10至大約30mg/mL的II型抗CD20抗體，-20mM 的 L-組氨酸，_240mM的海藻糖，和-0. 02% w/v 的聚山梨酯 20，-pH 為大約 6。在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制劑包含-大約10至大約30mg/mL的II型抗CD20抗體，-0. 02% w/v 的泊洛沙姆 188 ，-20mM的L-組氨酸，禾口_240mM 的海藻糖，-pH 為大約 6。優(yōu)選地，抗⑶20抗體是I型抗體。更優(yōu)選地，抗⑶20抗體是II型抗體。甚至更優(yōu) 選地，抗CD20抗體是如W02005/044859中詳細(xì)地公開(kāi)的“人源化B-Lyl抗體”。更優(yōu)選地， 所述抗體是HuMab〈⑶20>。所述制劑包含1至大約150mg/ml的所述抗體，更優(yōu)選大約5至 大約100mg/ml的所述抗體，甚至更優(yōu)選大約10至大約30mg/ml的所述抗體，或者選自大約 5、10、15、20、25或30mg/ml的所述抗體，并且最優(yōu)選25mg/ml的所述抗體。根據(jù)本發(fā)明的制劑可以是液體形式、凍干形式或由凍干形式重構(gòu)的液體形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制劑是凍干制劑。根據(jù)本發(fā)明的凍干制劑對(duì)于 更高分子量的顆粒和聚集物的形成具有改善的穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，這用相同濃度的所述抗CD20 抗體的液體制劑通常是難以達(dá)到的?？赏ㄟ^(guò)靜脈注射(i. v.)、皮下注射(s. C.)或任何其它非腸道給藥方式(如藥學(xué)領(lǐng) 域中已知的那些)施用根據(jù)本發(fā)明的制劑。而且，根據(jù)本發(fā)明的制劑可以包含防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲 氯銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；尼泊金烷基酯類，如尼泊金甲酯或尼泊金丙 酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(小于大約10個(gè)殘基)多肽； 蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；螯合劑，如EDTA ；鹽形成抗衡離子，如鈉；金屬 絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)。也可以將活性成分分別包封于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微囊
15(例如羥甲基纖維素或明膠微囊和聚甲基丙烯酸甲酯微囊)、膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂 質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米囊)或微乳中。此種技術(shù)公開(kāi)于Remington' s Pharmaceutical Sciences % 16 版，0sol，A.編輯(1980)中。可以制備緩釋制劑。適宜的緩釋制劑的實(shí)例包括含有抗體的固體疏水性聚合物的 半滲透性基質(zhì)，該基質(zhì)是成形制品的形式(例如薄膜或微囊)。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、 水凝膠(例如聚甲基丙烯酸2-羥乙酯、或聚乙烯醇)、聚丙交酯(US 3，773，919)、L-谷氨 酸和Y -乙基-L谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸 共聚物如LUPR0NDEP0T (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射的微球)和 聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾容易實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，如上文確定的，本發(fā)明的制劑包含大約5mM至大約350mM量的一種或多種 等張劑。優(yōu)選地，如上文確定的，本發(fā)明的制劑包含大約25mM至大約500mM量的糖。還優(yōu)選地，本發(fā)明的制劑進(jìn)一步包含一種或多種以下成分抗氧化劑、抗壞血酸、 谷胱甘肽、防腐劑，例如間甲酚、苯酚、芐醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯代丁醇、硫柳汞、苯 扎氯銨、聚乙二醇，例如PEG 3000、3350、4000、6000、人血白蛋白、人血清白蛋白(HSA)、牛 血清白蛋白(BSA)、多元醇、甘油、乙醇、甘露醇、鹽、乙酸鹽(例如乙酸鈉)、氯化鎂、氯化鈣、 氨基丁三醇、EDTA (例如Na-EDTA)。還優(yōu)選地，本發(fā)明的制劑進(jìn)一步包含一種或多種如上文定義的穩(wěn)定劑和本領(lǐng)域也 被稱為“凍干保護(hù)劑”的成分(如本領(lǐng)域中已知的糖、糖醇、氨基酸和葡聚糖)。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑包含以下的液體、凍干或由凍干形式重構(gòu)的液 體制劑15mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>，0. 01 % w/v 的聚山梨酯 20，20mM的L-組氨酸，和140mM的氯化鈉，pH 6. 0 ；或者10mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>，0. 01 % w/v 的聚山梨酯 20，20mM的L-組氨酸，和140mM的氯化鈉，pH 6. 0 ；或者15mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>，任選地0. 001至1 % w/v的表面活性劑，20mM 的 L-組氨酸，pH 6. 0 ；或者
1610mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>， 0. 02% w/ν的聚山梨酯20， 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. O ； 或者
25mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>， 0. 02% w/ν的聚山梨酯20， 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. O ； 或者
25mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>， 0. 02% w/v的泊洛沙姆188 , 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. O ； 或者
25mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>， 0. 01% w/v的泊洛沙姆188 , 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. O ； 或者
25mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>， 0. 1% w/v的泊洛沙姆188 , 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. O ； 或者
25mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>， 0. 02% w/v的聚山梨酯80， 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. O ； 或者
25mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>， 0. 1% w/v的聚山梨酯80， 20mM的乙酸鹽，和
240mM的海藻糖，pH 5. 5 ；或者25mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>，0. w/v 的聚山梨酯 80，20mM的乙酸鹽，和140mM的氯化鈉，pH 5. 5 ；或者30mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>，0. 01% w/v 的泊洛沙姆 188 ,20mM的L-組氨酸，和200mM的海藻糖，pH 6. 5 ；在根據(jù)本發(fā)明的制劑的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑是凍干形式并且用適量的注 射用水重構(gòu)后包含10mg/mL的II型抗⑶20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab〈⑶20>，0. 02 % w/v 的聚山梨酯 20，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6. O ；這種制劑在儲(chǔ)存于2_8°C和25°C時(shí)表現(xiàn)出對(duì)于物理終點(diǎn)(如聚集)和化學(xué)終點(diǎn) (例如斷裂)具有足夠穩(wěn)定性的良好的穩(wěn)定性。在根據(jù)本發(fā)明的制劑的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑是液體形式25mg/mL的II型抗CD20抗體、優(yōu)選人源化B-Lyl抗體、最優(yōu)選HuMab<CD20>，0. 2% w/v 的泊洛沙姆 188 ，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6. O ；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑用于預(yù)防或減少患有⑶20表達(dá)癌癥的患者體內(nèi) 轉(zhuǎn)移或進(jìn)一步的擴(kuò)散。所述制劑用于增加此類患者的生存期、增加此類患者的無(wú)進(jìn)展生 存期、增加反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，引起被治療患者統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著和臨床上有意義的改善，如通過(guò)生存 期、無(wú)進(jìn)展生存期、應(yīng)答率或反應(yīng)持續(xù)時(shí)間測(cè)定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑用于增加 一組患者的應(yīng)答率。在本發(fā)明的上下文中，可以將其它另外的細(xì)胞毒性劑、化學(xué)治療劑或抗癌劑，或者 增強(qiáng)此種治療劑的效應(yīng)的化合物與根據(jù)本發(fā)明的抗CD20抗體制劑組合使用。此種治療劑包括，例如烷化劑或具有烷化作用的藥物，如環(huán)磷酰胺(CTX ；例如 Cytoxan )、苯丁酸氮芥(chl ；例如leukeran )、順鉬(CisP ；例如platinol )、白消
安(例如myleran )、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(bcnu)、鏈脲霉素、曲他胺(tem)、絲裂霉
18素c等；抗代謝藥，例如甲氨蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP16 ；例如vepesid )、6-巰基嘌呤 (6MP)、6-硫胍(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(例如Xeloda )、達(dá)卡巴嗪(DTic)等；抗生素，例如放線菌素D、多柔比星(dxr;例如adriamycin )、 柔紅霉素(道諾霉素)、博來(lái)霉素、道諾霉素等；生物堿，例如長(zhǎng)春花生物堿，如長(zhǎng)春新堿 (VCR)、長(zhǎng)春堿等；和其它抗腫瘤劑，例如紫杉醇(例如taxol )和紫杉醇衍生物、細(xì)胞生 長(zhǎng)抑制劑、如地塞米松(dex;例如decadron )的糖皮質(zhì)激素和如潑尼松的皮質(zhì)激素、核 苷酶抑制劑如羥基脲、氨基酸消耗酶如天冬酰胺酶、亞葉酸和其它葉酸衍生物以及相似的、 多種多樣的抗腫瘤劑。以下藥物也可用作另外的藥物氨磷汀(例如ethyol )、更生霉素、 氮芥、鏈脲霉素、環(huán)磷酰胺、羅氮芥(CCNU)、多柔比星脂質(zhì)體(例如doxil )、吉西他濱(例 如gemzar )、柔紅霉素脂質(zhì)體(例如daunoxome )、丙卡巴胼、絲裂霉素、多西他賽 (例如taxotere )、阿地白介素、卡鉬、奧沙利鉬、克拉屈濱、喜樹堿、CPT ιι(伊立替康)、 10-羥基-7-乙基喜樹堿(SN38)、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、異環(huán)磷酰胺、伊達(dá)比星、美司鈉、干擾素 β、干擾素α、米托蒽醌、拓?fù)涮婵?、醋酸亮丙瑞林、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巰嘌呤、普卡 霉素、米托坦、天門冬酰胺酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睪內(nèi)酪、 硫鳥嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、長(zhǎng)春烯堿、苯丁酸氮芥。優(yōu)選地，采用沒(méi)有此種另外的藥物 的抗⑶20抗體組合治療。上述細(xì)胞毒性劑和抗癌劑以及抗增殖靶_特異性抗癌藥(如蛋白激酶抑制劑)在 化學(xué)治療方案中的用途在癌癥治療領(lǐng)域中被很好地表征，并且本文它們的使用受到同樣的 考慮以監(jiān)控耐受性和有效性以及控制施用途徑和劑量，進(jìn)行一些調(diào)整。例如，細(xì)胞毒性劑的 實(shí)際劑量可根據(jù)通過(guò)使用組織培養(yǎng)方法確定的患者的培養(yǎng)細(xì)胞響應(yīng)而變化。通常地，相對(duì) 于不存在其它另外的藥物時(shí)所使用的量會(huì)減小劑量。有效的細(xì)胞毒性劑的典型劑量可以在廠商推薦的范圍內(nèi)，并且在由體外反應(yīng)或動(dòng) 物模型中的反應(yīng)指明的情況中，能被減小高達(dá)約一個(gè)數(shù)量級(jí)濃度或量。因此，實(shí)際劑量將取 決于醫(yī)師的判斷、患者的狀況和治療方法的有效性(基于原代培養(yǎng)的惡性細(xì)胞或組織培養(yǎng) 的組織樣品的體外反應(yīng)性、或者在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中觀察到的反應(yīng))。在本發(fā)明的上下文中，除了根據(jù)本發(fā)明的抗CD20抗體制劑之外，可以進(jìn)行有效量 的電離放射和/或可以使用放射藥物。放射源對(duì)于治療中的患者可以是外部的或內(nèi)部的。 當(dāng)放射源對(duì)于患者是外部的時(shí)，治療稱為外線束放射療法(EBRT)。當(dāng)放射源對(duì)于患者是內(nèi) 部的時(shí)，治療稱為近距離放射療法(ΒΤ)。用于本發(fā)明的上下文中的放射性原子可以選自， 但不限于鐳、銫-137、銥-192、镅-241、金-198、鈷-57、銅-67、锝-99、碘-123、碘-131和 銦-111。也可能用此種放射性同位素標(biāo)記抗體。優(yōu)選地，在沒(méi)有此種電離放射的情況下使 用根據(jù)本發(fā)明的抗CD20抗體制劑。放射治療是用于控制不能切除的或不能手術(shù)治療的腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn) 治療。當(dāng)放射治療與化學(xué)治療結(jié)合時(shí)已經(jīng)看到改善的結(jié)果。放射治療基于遞送到靶區(qū)的高 劑量放射會(huì)導(dǎo)致腫瘤和正常組織中的增殖細(xì)胞死亡的原理。放射劑量方案通常根據(jù)輻射吸 收的劑量(Gy)、時(shí)間和分級(jí)確定，并且必須由腫瘤學(xué)專家認(rèn)真確定。患者接受的放射量將取 決于各種不同的考慮，但最重要的兩點(diǎn)是腫瘤相對(duì)于身體其它重要結(jié)構(gòu)或器官的位置和腫 瘤擴(kuò)散的程度。經(jīng)受放射治療的患者的典型療程是1至6周周期，一周5天以大約1. 8至 2. OGy的單日分劑量施用給患者，總劑量為10至SOGy之間。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)用根據(jù)本發(fā)明的制劑和放射治療人患者體內(nèi)的腫瘤時(shí)存在協(xié)同作用。換言之，當(dāng)與放射、 任選與另外的化學(xué)治療劑或抗癌劑結(jié)合時(shí)，增強(qiáng)了包含本發(fā)明的組合的藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的 抑制。輔助放射治療的參數(shù)例如包含于WO 99/60023中。通過(guò)作為推注的靜脈注射或通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)或 鞘內(nèi)途徑的一段時(shí)間的連續(xù)輸注，根據(jù)已知方法將抗體制劑施用給患者。優(yōu)選靜脈或皮下 施用抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包含藥盒，其特征在于包含容器、容器內(nèi)包含所述抗⑶20抗體制劑 的組合物和指導(dǎo)制劑的使用者將所述抗⑶20抗體制劑施用給患有⑶20表達(dá)癌癥的患者的 包裝說(shuō)明書。術(shù)語(yǔ)“包裝說(shuō)明書”指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說(shuō)明書，其可包括關(guān)于 此種治療產(chǎn)品使用的有關(guān)適應(yīng)癥、用法、劑量、給藥、禁忌證和/或注意事項(xiàng)的信息。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，成品容器可進(jìn)一步包括可藥用的載體。成品可進(jìn)一步包括 無(wú)菌稀釋劑，其優(yōu)選儲(chǔ)存于另外的單獨(dú)容器中。如本文所用的，“可藥用的載體”用來(lái)包括與藥物施用相容的任何和所有的材料， 包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑和其它與藥物施用 相容的材料和化合物。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容外，其在本發(fā)明的組 合物中的使用被考慮。輔助的活性化合物也可摻入組合物。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制劑包含I型抗CD20抗體，其與根據(jù) 本發(fā)明的II型抗CD20抗體共同施用。根據(jù)本發(fā)明的制劑對(duì)于每個(gè)抗CD20抗體可以是兩 個(gè)獨(dú)立的制劑。備選地，本文的制劑也可以在一種制劑中含有兩種抗體。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制劑包含抗CD20抗體，因?yàn)樗隹?CD20抗體與抗Bcl-2活性劑共同施用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Bcl-2”指Bcl-2蛋白質(zhì)(Swiss Prot ID No.P10415)，是Bcl-2蛋白質(zhì)家族的成員。術(shù)語(yǔ)“抗Bcl_2活性劑”包含“抗Bcl_2 反義核苷酸”和“Bcl-2抑制劑”?！翱笲cl-2反義核苷酸”下調(diào)Bcl-2mRNA水平并減少Bcl_2 蛋白質(zhì)表達(dá)。此種抗Bcl-2反義核苷酸的實(shí)例包括Oblimersen和SPC-2996。本文所用 的ABT-737意指N-[4-[4-(4'-氯聯(lián)苯_2_基甲基)哌嗪基]苯甲酰基]_3_[3_( 二 甲氨基)_1 (R)-(苯硫烷基甲基)丙氨基]-4-硝基苯磺酰胺；4-[4-(4‘-氯聯(lián)苯-2-基 甲基)哌嗪-1-基]-N-[3-[3-( 二甲氨基)-l(R)_(苯硫烷基甲基)丙氨基]-4-硝基苯 磺?；鵠苯甲酰胺(Bcl-2抑制劑)，其描述于WO 2006/099667或Corey，S.，等人，Cancer Cell (2005) 5-6中。本文所用的BT-263意指Bcl_2抑制劑，其描述于US 2007027135中。 優(yōu)選地，抗 Bcl-2 活性劑選自 Oblimersen、SPC-2996, TA-402、棉酚、AT-10U Obatoclax 甲 磺酸鹽、A-371191、A-385358、A-438744、ABT-737、AT-101、BL-ll、BL-193、GX-15-003、2-甲 氧基抗霉素 A3、HA-14-l、KF-67544、紅紫掊精、TP-TW-37、YC-137 和 Z-24。優(yōu)選地，抗 Bcl_2 活性劑是Bcl-2蛋白結(jié)合抑制劑，其抗Bcl-2抑制活性的IC50為5 μ M或5 μ M以下。此種 Bcl-2蛋白結(jié)合抑制劑優(yōu)選選自棉酚、AT-101、Obatoclax甲磺酸鹽、ABT-263和ABT-737， 更優(yōu)選選自ABT-263或ABT-737。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的制劑包含抗CD20抗體，因?yàn)樗隹?CD20抗體與蛋白酶體抑制劑共同施用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白酶體抑制劑”指抑制26S蛋 白酶體活性的藥物。此種蛋白酶體抑制劑包括尤其是例如肽衍生物，如肽醛(例如MG132、
20MG115、CEP-1615、PSI或免疫蛋白酶體特異性抑制劑IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-芐氧羰 基_亮氨?；鵢正亮氨酸，見(jiàn)US 20060241056)、肽硼酸鹽(例如硼替佐米(bortezomib， PS-341)或 DFLB)、肽環(huán)氧酮(例如 epoxomicin、dihydroeponemycin 或 epoxomicin 衍生物 carfilzomib(PR-171))或肽乙烯基砜(例如NLVS)和非肽衍生物(例如salinosporamide A(NPI-0052)、salinosporamide A衍生物、乳胞素或乳胞素衍生物(例如clasto-乳胞 素-L-內(nèi)酯(omuralide)或PS-519)。所述蛋白酶體抑制劑的不同類型和結(jié)構(gòu)描述于例 如 Kisselev, A. L.，等人，Chem Biol(2001)739-758 ；WO 2004/004749 和 Joazeiro, C.， 等人，Res 66(16) (2006)7840-7842 ;Kanagasabaphy，等人，Curr Opin Investig Drugs 8(2007)447-51 ；Adams, J. , Nat Rev Cancer 4 (2004) 349-360 及 US 20060241056 中。優(yōu)選地，此種蛋白酶體抑制劑選自肽醛(優(yōu)選N-芐氧羰基_亮氨?；鵢正亮氨 酸(IPSI-001))、肽硼酸鹽(優(yōu)選硼替佐米(PS-341))、肽環(huán)氧酮(優(yōu)選epoxomicin衍生物 carfilzomib(PR-171))或 salinosporamideA(NPI-0052)。更優(yōu)選地，此種蛋白酶體抑制劑 選自硼替佐米(PS-341) ,carfilzomib(PR-171) ,salinosporamide A(NPI_0052)或選N-芐 氧羰基_亮氨?；鵢正亮氨酸(IPSI-001)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑是選自肽醛(優(yōu)選N-芐氧羰基-亮氨酰 基-正亮氨酸(IPSI-001))、肽硼酸鹽(優(yōu)選硼替佐米(PS-341))或肽環(huán)氧酮的肽衍生物。 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑是肽硼酸鹽(優(yōu)選硼替佐米(PS-341)；見(jiàn)例如 Adams, Cur. Opin. Chem Biol. 6 (2002)493-500 和 US 5，780，454)。優(yōu)選地，蛋白酶體抑制劑的抗蛋白酶體抑制活性的IC50是5μΜ或5μΜ以下， 更優(yōu)選IyM或 μΜ以下。用于鑒定此種蛋白酶體抑制劑和用于確定抗蛋白酶體抑制活 性的IC50的基于細(xì)胞的測(cè)定法(通過(guò)系列稀釋和使用非線性曲線擬合計(jì)算(XLfit軟件 (ID Business Solution Ltd. , Guilford, Surrey, UK))描述于 Moravec,等人，Cell Notes 15 (2006) 4-7中，其使用來(lái)自Promega的Proteasome-GloTM基于細(xì)胞的測(cè)定法試劑與U266 細(xì)胞(人血漿骨髓瘤)。這種“添加_混合_測(cè)定”方法測(cè)定培養(yǎng)的細(xì)胞中與蛋白酶體相關(guān) 的糜蛋白酶樣蛋白酶活性。除了 IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-芐氧羰基-亮氨?；鵢正亮氨酸)之外，US 20060241056中的以下肽衍生物也是優(yōu)選的蛋白酶體抑制劑N_芐氧羰基-高苯丙氨酰
基_苯丙氨酸、N-芐氧羰基-亮氨?；鵢苯丙氨酸、N-芐氧羰基-丙氨?；鵢苯丙氨酸、 N-芐氧羰基_甘氨?；鵢脯氨酰基_丙氨?；鵢苯丙氨酸、N-芐氧羰基-甘氨?；鵢脯氨 酰基-苯丙氨?；?苯丙氨酸、N-芐氧羰基-甘氨?；鵢苯丙氨酰基_苯丙氨酸、N-芐氧羰 基_亮氨酰基_正亮氨酸硼酸、N-芐氧羰基-苯丙氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-芐氧羰基-高 苯丙氨?；鵢苯丙氨酸硼酸、N-芐氧羰基-亮氨酰基-苯丙氨酸硼酸、N-芐氧羰基-甘氨酰 基_脯氨?；鵢丙氨?；鵢苯丙氨酸硼酸、N-芐氧羰基-甘氨酰基_脯氨?；鵢苯丙氨酰 基_苯丙氨酸硼酸、N-芐氧羰基-亮氨酰基-亮氨?；?苯丙氨酸硼酸、N-芐氧羰基-甘 氨?；鵢苯丙氨?；鵢苯丙氨酸硼酸、N-芐氧羰基-亮氨酰基-正亮氨酸甲基乙烯基砜、 N-芐氧羰基_苯丙氨?；鵢苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-芐氧羰基-高苯丙氨?；鵢苯丙氨 酸甲基乙烯基砜、N-芐氧羰基-亮氨?；?苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-芐氧羰基-丙氨酰 基_苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-芐氧羰基-甘氨?；鵢脯氨?；鵢丙氨酰基_苯丙氨酸甲 基乙烯基砜、N-芐氧羰基-甘氨酰基_脯氨?；鵢苯丙氨?；鵢苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-芐氧羰基_亮氨酰基_亮氨?；鵢苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-芐氧羰基-甘氨酰基_苯 丙氨?；鵢苯丙氨酸甲基乙烯基砜、N-芐氧羰基-亮氨?；?正亮氨酸環(huán)氧酮、N-芐氧羰 基_苯丙氨?；鵢苯丙氨酸環(huán)氧酮、N-芐氧羰基-高苯丙氨?；?苯丙氨酸環(huán)氧酮、N-芐 氧羰基_亮氨?；鵢苯丙氨酸環(huán)氧酮、N-芐氧羰基-丙氨?；?苯丙氨酸環(huán)氧酮、N-芐氧 羰基_甘氨?；鵢脯氨酰基_丙氨?；鵢苯丙氨酸環(huán)氧酮、N-芐氧羰基-甘氨?；鵢脯氨 酰基-苯丙氨?；?苯丙氨酸環(huán)氧酮、N-芐氧羰基-亮氨?；?亮氨酰基-苯丙氨酸環(huán)氧 酮和N-芐氧羰基-甘氨?；鵢苯丙氨?；鵢苯丙氨酸環(huán)氧酮。 提供以下實(shí)施例和附圖
來(lái)幫助理解本發(fā)明，其真正的范圍闡述于所附的權(quán)利要求 中。應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明的精神的情況下可以在所給出的步驟中進(jìn)行修改。
實(shí)施例實(shí)施例1制備以下液體、凍干或由凍干形式重構(gòu)的液體制劑15mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. 01 % w/v 的聚山梨酯 20，20mM的L-組氨酸，和140mM的氯化鈉，pH 6. 0 ；10mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. 01 % w/v 的聚山梨酯 20，20mM的L-組氨酸，和140mM的氯化鈉，pH 6. O ；15mg/mL 的 HuMab<CD20>，20mM 的 L-組氨酸，pH 6. O ；10mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. 02 % w/v 的聚山梨酯 20，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6. O ；25mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. 02 % w/v 的聚山梨酯 20，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，ρΗ6·0。還制備了凍干形式，其用適量的注射用水重構(gòu)后包含10mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. 02 % w/v 的聚山梨酯 20，
20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6.0 ；該制劑在儲(chǔ)存于2_8°C和25°C時(shí)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，對(duì)于物理終點(diǎn)(如聚集) 和化學(xué)終點(diǎn)(例如斷裂)具有足夠的穩(wěn)定性。如下開(kāi)發(fā)根據(jù)本發(fā)明用于腸胃外施用的液體和凍干藥物產(chǎn)品制劑液體制劑的制備通過(guò)將HuMab〈⑶20>在制備緩沖液(例如pH大約為6. 0的20mM組氨酸緩沖液或 含有140mM氯化鈉和0. 01 % (w/v)聚山梨酯20的pH大約為6. 0的20mM組氨酸緩沖液) 中的溶液勻化制備HuMab<CD20>的制劑。還可以通過(guò)用緩沖液稀釋將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至所 需濃度制備HuMab<CD20>的制劑。按照需要添加用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和用于張度調(diào)節(jié)的賦形劑 并且可以以溶解形式或者備選地以固體添加。按照需要將表面活性劑添加到制劑中作為貯 備液。將全部的制劑通過(guò)0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾除菌，然后無(wú)菌等分至無(wú)菌玻璃瓶并用橡皮 塞和鋁質(zhì)鉗口蓋(alucrimp cap)密封。將這些制劑儲(chǔ)存在不同的溫度不同的時(shí)程，在單個(gè) 段落中標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)取出用于分析。對(duì)制劑進(jìn)行如下分析1)通過(guò)UV分光光度法，2)通過(guò) 大小排阻層析(SEC)，3)通過(guò)可見(jiàn)和亞可見(jiàn)的顆粒，4)通過(guò)離子交換層析法(IEC)和5)通 過(guò)溶液的濁度。凍干制劑的制備如上文對(duì)液體制劑所述制備HuMab〈⑶20>的溶液，或通過(guò)將HuMab〈⑶20>在pH大 約為6. 0的20mM組氨酸的HuMab〈⑶20>溶液勻化制備，其含有糖和表面活性劑。將全部的 制劑通過(guò)0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾除菌，然后無(wú)菌等分至無(wú)菌玻璃瓶。用適用于凍干過(guò)程的橡 皮塞部分密封玻璃瓶，然后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥器的干燥室中。本領(lǐng)域中已知的任何凍干方法 都意欲包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，本研究中采用的凍干過(guò)程包括將制劑從室溫冷卻至 約5°C (預(yù)冷卻)，然后以約1°C/分鐘至5°C/分鐘的降溫速率在_40°C下冷凍(冷凍I)。 第一干燥步驟可以以0. 3至0. 5°C /分鐘的升溫速率從-40°C至-30°C進(jìn)行，然后在約75至 80毫托的室壓力下-30°C保持至少50小時(shí)。第二干燥步驟可以以0. 1至0. 3°C /分鐘的升 溫速率從_30°C至25°C進(jìn)行，然后在約50至80毫托的室壓力下25°C保持至少5小時(shí)(采 用的干燥方案示于表1中)。發(fā)現(xiàn)使用描述的凍干過(guò)程干燥的HuMab<CD20>制劑方便地具 有大約2-3分鐘的快速重構(gòu)時(shí)間。根據(jù)卡爾-費(fèi)歇爾法(Karl-Fischer method)，本研究中 所有的凍干餅的殘余含水量為約0. 1至1. 0%。將凍干小瓶?jī)?chǔ)存于不同溫度不同的時(shí)間間 隔。用各自體積的注射用水(WFI)重構(gòu)凍干制劑，然后1)通過(guò)UV分光光度法分析，2)確定 重構(gòu)時(shí)間，3)通過(guò)大小排阻層析法(SEC)分析，4)通過(guò)離子交換層析法(IEC)，5)測(cè)定亞可 見(jiàn)和可見(jiàn)的顆粒和6)通過(guò)溶液的濁度。進(jìn)行大小排阻層析(SEC)來(lái)檢測(cè)制劑中高分子量物質(zhì)(聚集體)和低分子量水 解產(chǎn)物。該方法使用適宜的裝配有UV檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)280nm)和Zorbax GF-250柱 (9. 4x250mm，安捷倫)的HPLC儀；該方法采用200mM pH 7. 0的磷酸鈉作為流動(dòng)相。進(jìn)行離子交換層析(IEC)來(lái)檢測(cè)改變制劑中HuMab<CD20>的凈電荷的化學(xué)降解 產(chǎn)物。該方法使用適宜的裝配有UV檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為220和280nm)和Dionex ProPac WCX-10柱(4mmx250mm)的HPLC儀。分別采用IOmM pH 6. 0的磷酸鈉在水中的緩沖液和
23IOmM pH 6. 0的磷酸鈉緩沖液+0. 75M NaCl作為流動(dòng)相A和B，流速為1. OmL/分鐘。在arian Cary Bio UV分光光度計(jì)上于280nm進(jìn)行用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的UV分
光光度法。為了測(cè)定濁度，使用HACH 2100AN濁度計(jì)在室溫下以FTU(濁度單位)測(cè)量乳光。通過(guò)使用HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150)分析樣品的亞可見(jiàn)顆粒，使用 Seidenader V90-T視覺(jué)檢測(cè)儀分析樣品的可見(jiàn)顆粒。表1冷凍-干燥循環(huán) 根據(jù)本發(fā)明的液體HuMab<CD20>藥物產(chǎn)品制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)制劑15mg/mL HuMab<CD20>, 20mM L-組氨酸，pH 6. 0， n/d 未測(cè)定合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> IOnm/容器，最多600個(gè)顆粒 彡25 μ m/容器制劑10mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨酸、240mM 海藻糖、0· 02% w/v 聚山梨酯 20、pH 6. 0， n/d 未測(cè)定合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> IOym/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器籠H日■奸HuMab<CD20> 輸一口口口吿__對(duì)牛誦制劑10mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨酸、240mM 海藻糖、0. 02% w/v 聚山梨酯 20、pH6.0， n/d 未測(cè)定合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> 10 μ m/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器實(shí)施例2制備以下液體、凍干或由凍干形式重構(gòu)的液體的制劑15mg/mL 的 HuMab<CD20>，
0. 02% w/v 的泊洛沙姆 188TM，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6. 0 ；或者25mg/mL 的 HuMab<CD20>,0. 01% w/v 的泊洛沙姆 188 ，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6. 0 ；或者25mg/mL 的 HuMab<CD20>,
0. 1% w/v 的泊洛沙姆 188 ，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6. 0 ；或者25mg/mL 的 HuMab<CD20>,0. 02 % w/v 的聚山梨酯 80，20mM的L-組氨酸，和240mM的海藻糖，pH 6. 0 ；或者25mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. w/v 的聚山梨酯 80，20mM的乙酸鹽，和240mM的海藻糖，pH 5. 5 ；或者25mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. w/v 的聚山梨酯 80，20mM的乙酸鹽，和140mM的氯化鈉，pH 5. 5 ；或者30mg/mL 的 HuMab<CD20>，0. 01% w/v 的泊洛沙姆 188 ，20mM的L-組氨酸，和200mM的海藻糖，
pH 6. 5 ；如下制備用于腸胃外施用的液體和凍干藥物產(chǎn)品制劑液體制劑的制備通過(guò)將HuMab〈⑶20>在制備緩沖液(例如含有240mM海藻糖和0. 02% (w/v)泊 洛沙姆188 的pH大約為6. 0的20mM組氨酸緩沖液)中的溶液勻化制備HuMab〈⑶20>的 制劑。還可以通過(guò)切向流過(guò)濾對(duì)約10-40mg/ml HuMab〈⑶20>在制備緩沖液(例如pH大約 為6. 0的20mM組氨酸緩沖液)中的溶液進(jìn)行滲濾以使蛋白濃度增加至超過(guò)靶蛋白濃度并 交換緩沖液來(lái)制備HuMab<CD20>的制劑。還可以通過(guò)用緩沖液稀釋將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至所 希望的濃度制備HuMab<CD20>的制劑?？梢砸匀芙庑问交蛘邆溥x地以固體添加用于穩(wěn)定蛋 白質(zhì)和用于張度調(diào)節(jié)的賦形劑。按照需要將表面活性劑添加到作為貯備液的制劑中。將全 部的制劑通過(guò)0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾除菌，然后無(wú)菌等分至無(wú)菌玻璃瓶并用橡皮塞和鋁質(zhì)鉗 口蓋密封。將這些制劑儲(chǔ)存在不同的溫度不同的時(shí)程，在單個(gè)段落中標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)取出用 于分析。對(duì)制劑進(jìn)行如下分析1)通過(guò)UV分光光度法，2)通過(guò)大小排阻層析(SEC)，3)可見(jiàn) 和亞可見(jiàn)的顆粒，4)通過(guò)離子交換層析(IEC)和5)通過(guò)溶液的濁度。凍干制劑的制備如上文對(duì)液體制劑所述制備〈⑶20>的溶液。將全部的制劑通過(guò)0. 22 μ m過(guò)濾器 過(guò)濾除菌，然后無(wú)菌等分至無(wú)菌玻璃瓶。用適用于凍干過(guò)程的橡皮塞部分密封玻璃瓶，然后 轉(zhuǎn)移至冷凍干燥器的干燥室中。本領(lǐng)域中已知的任何凍干方法都意欲包括在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。例如，本研究中采用的凍干過(guò)程包括將制劑從室溫冷卻至約5°C (預(yù)冷卻)，然后以約 1°C/分鐘至5°C/分鐘的降溫速率在-40°C下冷凍(冷凍I)。第一干燥步驟可以以0.3至 0. 50C /分鐘的升溫速率從-40°C至-30°C進(jìn)行，然后在約75至80毫托的室壓力下-30°C 保持至少50小時(shí)。第二干燥步驟可以以0. 1至0. 30C /分鐘的升溫速率從-30°C至25°C 進(jìn)行，然后在約50至80毫托的室壓力下25°C保持至少5小時(shí)(采用的干燥方案示于表1 中)。根據(jù)卡爾_費(fèi)歇爾法，發(fā)現(xiàn)使用描述的凍干過(guò)程干燥的HuMab<CD20>制劑的殘余含水 量為約0. 1至1. 0%。將凍干小瓶?jī)?chǔ)存于不同溫度下不同的時(shí)間間隔。用相應(yīng)體積的注射 用水(WFI)重構(gòu)凍干制劑，然后1)通過(guò)UV分光光度法分析，2)通過(guò)大小排阻層析(SEC)分 析，3)通過(guò)離子交換層析(IEC)，4)測(cè)定亞可見(jiàn)和可見(jiàn)的顆粒和5)通過(guò)溶液的濁度分析。進(jìn)行大小排阻層析(SEC)來(lái)檢測(cè)制劑中高分子量物質(zhì)(聚集體)和低分子量水 解產(chǎn)物。該方法使用適宜的裝配有UV檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)280nm)和Zorbax GF-250柱 (9. 4x250mm,安捷倫)或 TSKgel G3000SWXL(7. 8x300mm)的 HPLC 儀；該方法采用 200mM pH 7. 0的磷酸鈉或pH 7. 0的200mM磷酸鉀中的250mM氯化鉀作為流動(dòng)相。進(jìn)行離子交換層析(IEC)來(lái)檢測(cè)改變制劑中HuMab<CD20>的凈電荷的化學(xué)降解 產(chǎn)物。該方法使用適宜的裝配有UV檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)為220和280nm)和Dionex ProPac WCX-10柱(4mmx250mm)的HPLC儀。分別采用IOmM pH 6. 0的磷酸鈉在水中的緩沖液和 IOmM pH 6. 0的磷酸鈉緩沖液+0. 75M NaCl作為流動(dòng)相A和B，流速為1. OmL/分鐘。在arian Cary Bio或Perkin Elmer UV分光光度計(jì)上于280nm進(jìn)行用于測(cè)定蛋 白質(zhì)濃度的UV分光光度法。為了測(cè)定濁度，使用HACH 2100AN濁度計(jì)在室溫下以FTU(濁度單位)測(cè)量乳光。通過(guò)使用HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150)分析樣品的亞可見(jiàn)顆粒，通過(guò)使用Seidenader V90-T視覺(jué)檢測(cè)儀分析樣品的可見(jiàn)顆粒。表1冷凍-干燥循環(huán) 液體HuMab<CD20>藥物產(chǎn)品制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)制劑25mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨酸、240mM 海藻糖、0. 02% w/v 泊洛沙姆 188 、pH 6. 0， 合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> IOym/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器制劑25mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨酸、240mM 海藻糖、0. 01% w/v 泊洛沙姆 n/a 未分析合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> IOym/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器制劑25mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨酸、240mM 海藻糖、0. 1 % w/v 泊洛沙姆 188 、pH 6. 0， n/a 未分析合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> 10 μ m/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器制劑25mg/mL HuMab<CD20>、20mM 乙酸鹽、240mM 海藻糖、0. 1% w/v 聚山梨酯 80、 pH 5. 5， n/a 未分析合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> 10 μ m/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器制劑25mg/mL HuMab<CD20>、20mM 乙酸鹽、140mM 氯化鈉、0. 1% w/v 聚山梨酯 80、 pH 5. 5， n/a:未分析合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> 10 μ m/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器制劑30mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨酸、240mM 海藻糖、0. 01% w/v 泊洛沙姆 188 、pH 6. 5，
合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> IOym/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器
凍干HuMab<CD20>藥物產(chǎn)品制劑的穩(wěn)定件數(shù)據(jù)
制劑25mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨 188 ,
酸、240mM海 合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> IOym/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器制劑25mg/mL HuMab<CD20>、20mM L-組氨酸、240mM 海藻糖、0. 02% w/v 聚山梨酯 80、pH 6. 0， n/a 未分析合格基本上不含可見(jiàn)顆粒，最多6000個(gè)顆粒> 10 μ m/容器，最多600個(gè)顆粒 ^ 25 μ m/容器
權(quán)利要求
一種制劑，其包含 大約1至大約150mg/mL的II型抗CD20抗體， 任選地大約0.001至大約1％w/v的至少一種表面活性劑，和 大約1至大約100mM的緩沖液， pH為大約4.5至大約7.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其包含-大約1至大約150mg/mL的II型抗⑶20抗體， -大約0. 005至大約0. 05% w/v的至少一種表面活性劑，和 -大約1至大約IOOmM的緩沖液， -PH為大約4. 5至大約7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制劑，其包含-大約10至大約30mg/mL的II型抗⑶20抗體，-20mM的L-組氨酸，-240mM的海藻糖，和-0. 02% w/v的聚山梨酯20，-PH為大約6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制劑，其包含-大約10至大約30mg/mL的II型抗⑶20抗體，-0. 02% w/v的泊洛沙姆188，-20mM的L-組氨酸，和-240mM的海藻糖，-PH為大約6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的制劑，其為液體形式、凍干形式或由凍干形式重構(gòu)的液體形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的制劑，其可以通過(guò)靜脈內(nèi)(i.v.)或皮下(s.c.) 或任何其它腸胃外給藥施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的制劑，其進(jìn)一步包含大約5mM至大約350mM量 的一種或多種等張劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述等張劑選自氯化鈉(NaCl)、氯 化鉀、包括葡萄糖的糖、甘油、氨基酸及其組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的制劑，其進(jìn)一步包含大約25mM至大約500mM量 的糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡 萄糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺(“葡甲胺”)、 半乳糖胺、神經(jīng)氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的制劑，其進(jìn)一步包含選自以下可藥用的一 種或多種成分抗氧化劑，抗壞血酸、谷胱甘肽、防腐劑，特別是間甲酚、苯酚、芐醇、尼泊金 甲酯、尼泊金丙酯、氯代丁醇、硫柳汞、苯扎氯銨、聚乙二醇，特別是PEG 3000、3350、4000或 6000、人血白蛋白、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、多元醇、甘油、乙醇、甘露醇、鹽、乙酸鹽，特別是乙酸鈉，氯化鎂、氯化鈣、氨基丁三醇、EDTA，特別是Na-EDTA。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述制劑包含 15mg/mL 的 HuMab < CD20 >，20mM的L-組氨酸，任選地0. 001至w/v的表面活性劑， pH 6. 0 ；或者10mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 02% w/v的聚山梨酯20， 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. 0 ； 或者25mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 02% w/v的聚山梨酯20， 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. O。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述制劑為凍干形式并且包含 10mg/mL 的 HuMab < CD20 >，0. 02% w/v的聚山梨酯20， 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. 0。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述制劑包含 25mg/mL 的 HuMab < CD20 >，[0. 02% w/v的泊洛沙姆188 , 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. 0 ； 或者25mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 01% w/v的泊洛沙姆188 , 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. 0 ； 或者25mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 1% w/v的泊洛沙姆188 ，20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. 0 ；或者25mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 02% w/v的聚山梨酯80， 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. 0 ； 或者25mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 1% w/v的聚山梨酯80， 20mM的乙酸鹽，和 240mM的海藻糖， pH 5. 5 ； 或者25mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 1% w/v的聚山梨酯80， 20mM的乙酸鹽，和 140mM的氯化鈉， pH 5. 5 ； 或者30mg/mL 的 HuMab < CD20 >， 0. 01% w/v的泊洛沙姆188 , 20mM的L-組氨酸，和 200mM的海藻糖， pH 6. 5。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的制劑，其中所述制劑為液體形式并且包含 25mg/mL 的 HuMab < CD20 >，`0. 02% w/v的泊洛沙姆188 , 20mM的L-組氨酸，和 240mM的海藻糖， pH 6. 0。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的制劑用于制備可用于治療CD20-相關(guān)疾病的 藥物的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的制劑，其中所述疾病選自乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)和前列腺癌。
18.如上文描述的發(fā)明。全文摘要
本發(fā)明涉及抗CD20人單克隆抗體制劑，制備所述制劑的方法和其用途。
文檔編號(hào)A61K47/18GK101896163SQ200880120604
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者C·沃思, H-C·馬勒, M·阿德勒 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司