專利名稱：改善胃腸道功能的制劑的制作方法
改善胃腸道功能的制劑相關(guān)申請的交叉參考本申請要求于2007年10月14日申請的美國臨時申請序列號60/979，845的權(quán)益， 其全部內(nèi)容、包括任何數(shù)字、表或圖由此通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
腸起屏障功能的作用，它是先天性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組分。只有單層的上皮細(xì)胞將 內(nèi)腔內(nèi)容物與身體粘膜固有層和機體內(nèi)環(huán)境的效應(yīng)子免疫細(xì)胞分離。破壞該單層上皮可導(dǎo) 致高免疫活性上皮下細(xì)胞(subepithelium)病理性暴露于腔內(nèi)的大量微生物和抗原。屏障 的破壞牽涉于急性疾病如多器官系統(tǒng)衰和引起敗血癥的細(xì)菌移位的發(fā)病機制。腸作為抗感染屏障的功能缺陷可以在所有年齡段的個體中發(fā)生。但是，年老和年 幼的人特別易感。例如，由于喂養(yǎng)不耐受性以及對壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)的恐懼，很多早 產(chǎn)兒遭受一段“內(nèi)腔饑餓(luminal starvation) ”的時期，這段時期內(nèi)，這些嬰兒通過胃腸 道接受(如果有的話)極少的食物，主要通過靜脈內(nèi)途徑、利用總胃腸外營養(yǎng)(TPN)來給 以營養(yǎng)。具有TPN的腸內(nèi)營養(yǎng)物的缺乏促使粘膜破壞、細(xì)菌移位以及全身性炎癥傾向增加 (Huang Y，Li N, Liboni K，Neu J “谷氨酰胺通過非-NF κ-B途徑使Caco_2細(xì)胞中內(nèi)毒 素誘導(dǎo)的 IL-8 生成減少”，Cytokine. 2003 年 5 月；22 (3-4) :77_88)。早產(chǎn)兒、尤其是極低出生體重的早產(chǎn)嬰兒因為呼吸功能不全、溫度調(diào)節(jié)和其它挑 戰(zhàn)通常也高度應(yīng)激。最近十年的趨勢是在出生后最初幾周的疾病急性期通過胃腸外途徑提 供更多的氨基酸(Liboni K，Li N, Neu J. “谷氨酰胺介導(dǎo)的改善Caco-2細(xì)胞中脂多糖誘 發(fā)的 IL-8 生成的機理，，，Cytokine. 2004 年 4 月 21 日；26 (2) :57_65 ；Beierle EA, Chen MK, HartwichJE, Iyengar Μ, Dai W, Li N, Demarco V, Neu J. “人工飼養(yǎng)小鼠仔鼠杯子模型中 小鼠仔鼠的發(fā)育”，Pediatr Res. 2004年8月；56 (2) 250-5.)，然后通過腸內(nèi)途徑向人奶或 配方轉(zhuǎn)換。這是不夠的，因為在生命最初幾周所提供的任何腸內(nèi)營養(yǎng)通常是“最低腸內(nèi)營 養(yǎng)”(大致定義為不滿足生長的營養(yǎng)需求但給予某些益處的營養(yǎng)量，且通常少于總營養(yǎng)需 求的20%)的形式(Liboni，K，Li N, Scumpia P0, Neu J. “谷氨酰胺在人胎兒和成人腸上 皮中通過 I κ B/NF- κ B 調(diào)節(jié) LPS 誘導(dǎo)的 IL-8 生成”，Journal of Nutrition2005 年 2 月； 135(2) 245-51 ；Liu Z，Li N,Neu J. “緊密連接、滲漏性腸和兒科疾病”，Acta Paediatrica 2005 ；94 386-393 ；Zhang L, Li N, CaicedoR, Neu J. “死亡或存活鼠李糖乳桿菌 GG 減少 Caco-2細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的IL-8生成”，Journal of Nutrition 2005年7月； 135(7) 1752-6)。盡管通常被稱為“營養(yǎng)性營養(yǎng)(trophic nutrition)”，但是最低腸內(nèi)營養(yǎng)與胃 腸外營養(yǎng)(PN) —起既不會提供對腸明顯的營養(yǎng)作用，也不會增強屏障功能(Zhang L，Li N, desRobert C, Fang Μ, Liboni K, McMahon R, Caicedo R, Neu J. “ 鼠李糖乳桿菌 GG 減 少胃造口術(shù)喂養(yǎng)的嬰兒大鼠模型中脂多糖誘導(dǎo)的全身性炎癥”，Journal of Pediatric Gastroenterology andNutrition，2006 年 5 月，42 :545_552 ；Neu, J. “室息禾口缺氧一缺血 作為壞死性小腸結(jié)腸炎的首要原因的‘猜想，”，Biol Neonate. 2005 ；87 (2) 97-8 ；Neu J， Chen M, Beierle E “腸先天性免疫它如何與壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)病機制有關(guān)？ ”，Semin
3Pediatr Surg. 2005年8月；14(3) 137-44) 0而且，清楚的是，TPN的使用與醫(yī)院獲得性敗 血癥顯著相關(guān)(Caicedo RA, Schanler RJ, Li N, Neu J. “發(fā)育中的腸生態(tài)系統(tǒng)對于新生 兒的含意”，Pediatr Res. 2005年10月；58 (4) :625_8)，醫(yī)院獲得性敗血癥部分是由腸細(xì)菌 移位引起的(Li N，Lassman BJ, Liu Z.，Liboni，K.，Neu，J. “在胃造口術(shù)喂養(yǎng)的大鼠仔鼠 中蛋白質(zhì)剝奪對生長和小腸形態(tài)學(xué)的作用并不被谷氨酰胺或谷氨酸鹽改善”，J. Pediatric Gastroenterology and Nutrition 2004 ￥ 7 月；39(1) 28-33 ；Neu J, Zhang L. “豐及 低出生體重嬰兒的喂養(yǎng)不耐受性它是什么和我們對此能做些什么？ ”，Acta Paediatr Supp 1. 2005 年 10 月；94 (449) 93~9)。盡管最近早期增加靜脈內(nèi)蛋白質(zhì)攝取的趨勢可以在蛋白質(zhì)合成、減少分解代謝以 及可能的甚至身體生長方面提供益處(Beierle EA,Chen MK,Hartwich JE，Iyengar Μ, Dai W, Li N, Demarco V, Neu J. “人工飼養(yǎng)小鼠仔鼠杯子模型中的小鼠仔鼠的發(fā)育”，Pediatr Res. 2004 年 8 月；56 (2) 250~5 ；Neu J. “胃腸道成熟和喂養(yǎng)”，Semin Perinatol. 2006 年 4月；30(2) :77-80)，但是這種實踐不會提高或維持胃腸道屏障功能或胃腸道的優(yōu)化生長， 它是調(diào)節(jié)其中腸介導(dǎo)的破壞和全身性炎癥起作用的若干疾病過程的先決條件。這些包括 NEC、肝炎、慢性肺疾病以及腦室周圍白質(zhì)軟化病的進展。因此，非常需要出生后立刻服用的腸內(nèi)輔助物(adjunct)，其將減少對胃腸外營養(yǎng) 的需求。增強腸生長且改善屏障功能的安全有效的“起動劑配方(starter formula) ”對患 病低出生體重嬰兒是需要的。這種制劑可用作早期積極性胃腸外營養(yǎng)和其它腸內(nèi)營養(yǎng)物如 人奶的輔助物。簡述本發(fā)明提供改善胃腸道功能的組合物及其用途。本發(fā)明的組合物和方法特別有益 地適用于新生兒，因為它們可用于刺激未成熟腸的發(fā)育，以便提供增強吸收營養(yǎng)物的能力 并且達到更強的屏障功能。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供添加有谷氨酰胺(GLN)、二十二碳六烯酸 (DHA)和丁酸(butyrate)的低滲性、富含蛋白質(zhì)的最低腸內(nèi)營養(yǎng)配方。本發(fā)明的組合物尤 其設(shè)計用于刺激更好的腸生長、增強腸屏障和控制腸源性炎癥。依照本發(fā)明，蛋白質(zhì)通過促進腸蛋白質(zhì)生長和防止分解代謝起作用；GLN促進上皮 內(nèi)連接(inter印ithelial junction)完整性，將粘膜應(yīng)激反應(yīng)減至最小且減少炎癥；丁酸 加強增殖、增強屏障功能并增加類高血糖素肽2 (GLP-2，高度腸營養(yǎng)(intestinotrophic) 肽)的腸分泌，且DHA通過減少炎癥應(yīng)答起作用。當(dāng)患者遭受炎癥應(yīng)激時，含有高水平蛋白質(zhì)、DHA、谷氨酰胺和丁酸但具有相對低 的碳水化合物和脂肪濃度的本發(fā)明制劑可用于安全地防止腸屏障破壞、防止腸萎縮以及遠(yuǎn) 端器官例如肝和腦的損傷。附圖簡述

圖1顯示治療24小時后由丁酸介導(dǎo)的早期融合Caco-2細(xì)胞跨上皮電阻抗的增 加。圖2A-B顯示不同劑量的脂肪酸對TNF α誘發(fā)的IL_8生成的影響。發(fā)明詳述本發(fā)明提供促進腸生長并且改善屏障功能、用于低出生體重嬰兒以及其他的安全有效的組合物和方法。早產(chǎn)兒或危重病嬰兒由于他們未成熟的胃腸道的易損性，經(jīng)常通過靜脈內(nèi)途徑施 用延長的胃腸外營養(yǎng)(總胃腸外營養(yǎng)；TPN)。遺憾的是，延長的胃腸外營養(yǎng)與腸萎縮、細(xì)菌 移位增加、敗血癥和全身性炎癥有關(guān)，其可加重肝、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致終生殘疾。用于解決這個問題的現(xiàn)有方法包括在出生后最初幾周的疾病急性期通過胃腸外 途徑提供氨基酸、然后通過腸內(nèi)途徑向人奶或配方轉(zhuǎn)換。這種方法是不夠的，因為在生命最 初幾周所提供的任何腸內(nèi)營養(yǎng)通常是最低腸內(nèi)營養(yǎng)形式，其既不會對腸提供顯著的營養(yǎng)效 應(yīng)也不會增強屏障功能。而且，TPN的使用與醫(yī)院獲得性敗血癥顯著相關(guān)。除了 Arg和/或Gin或Glu之外，優(yōu)選本發(fā)明的組合物具有少于20%重量的游離 氨基酸，更優(yōu)選該組合物具有少于20%的游離氨基酸，甚至更優(yōu)選組合物具有少于15%的 游離氨基酸，且該組合物還可以具有少于10%、5%或游離氨基酸。腸粘膜完整性與數(shù)種功能能力有關(guān)，包括消化、吸收、細(xì)菌或抗原移位，以及內(nèi)腔 微生物和/或毒素激勵炎癥應(yīng)答、引起病理學(xué)如壞死性小腸結(jié)腸炎或全身性炎癥的能力。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于極低出生體重嬰兒的“起動劑”腸內(nèi)營養(yǎng)配 方，其在出生后即刻利用。有利地，該配方支持腸發(fā)育并減少對胃腸外營養(yǎng)的需要，后者是 高發(fā)病率以及新生兒重癥特別護理的昂貴成本的原因。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可用作早期攻擊性胃腸外營養(yǎng)和其它腸內(nèi)營 養(yǎng)物如人奶的輔助物。本發(fā)明解決了面對危重和/或過早出生嬰兒的最重要問題之一。他們未成熟的胃 腸道的易損性需要延長的胃腸外營養(yǎng)，其與腸萎縮、細(xì)菌移位增加、敗血癥和全身性炎癥有 關(guān)。反過來，這些條件可以加重肝、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致終生殘疾。有利地，本發(fā)明 可經(jīng)由胃腸道利用。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的制劑利用輔助性營養(yǎng)劑，增強腸生長、 屏障功能并調(diào)節(jié)腸源性炎癥和應(yīng)激反應(yīng)。本文所述的方法和組合物特別可用于稱重少于1250克的新生兒。這些新生兒具 有很不成熟的胃腸道。新生兒專家不情愿利用他們的胃腸道來養(yǎng)育這些嬰兒，相反，主要通 過靜脈內(nèi)途徑給予他們營養(yǎng)，而靜脈內(nèi)途徑與重要的問題有關(guān)，如醫(yī)院獲得性敗血癥。這些 嬰兒的胃腸道可利用得越早，醫(yī)院獲得性敗血癥的風(fēng)險就越低，其在他們住院期間影響這 些嬰兒的約30-40%，引起很高的發(fā)病率且顯著增加住院成本。本發(fā)明的材料和方法具有其它用途，包括例如幫助所有年齡段的患者從腸道手術(shù) 中恢復(fù)。本文特別示例的是添加有谷氨酰胺(GLN)、二十二碳六烯酸(DHA)和丁酸的低滲 性、富含蛋白質(zhì)的最低腸內(nèi)營養(yǎng)配方，其尤其設(shè)計用于刺激更好的腸生長、增強腸屏障和控 制腸源性炎癥。含有高水平的蛋白質(zhì)、DHA, GLN和丁酸但具有相對低的碳水化合物和脂肪 含量的低滲性制劑，與含有通常大量營養(yǎng)物混合物的最低腸內(nèi)營養(yǎng)制劑相比，可用于防止 腸屏障破壞并防止腸萎縮。優(yōu)選地，組合物的蛋白含量多于2%重量、多于3%重量、多于5%重量、多于7. 5% 重量和/或多于10%重量。優(yōu)選地，碳水化合物含量少于10%重量、少于7. 5%重量和/或少于5%重量。優(yōu)選地，脂肪含量少于10%重量、少于7. 5%重量和/或少于5%重量。
高蛋白質(zhì)、低脂肪和碳水化合物、低滲性配方中GLN、DHA和丁酸的組合，協(xié)同地用 于增加粘膜量，且減少腸滲透性過高以及由于腸源性炎癥引起的損傷。這些益處通過穩(wěn)定 粘膜屏障和減少腸源性炎癥的組合來實現(xiàn)。本發(fā)明的組合配方是安全的，并且提供比用任何單個營養(yǎng)補充劑所觀察到的更好 的效果。本發(fā)明的制劑可用于提供以下優(yōu)點1.高蛋白質(zhì)，以提高腸營養(yǎng)性和屏障功能。2.谷氨酰胺，以預(yù)防腸源性炎癥且調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡。3. ω 3脂肪酸，例如DHA，以防止腸源性炎癥的傳播。4.短鏈脂肪酸，例如丁酸，以提高屏障功能。經(jīng)由胃腸(GI)道的蛋白質(zhì)攝取是腸粘膜生長的主要決定因素。在某些個體、包括 早產(chǎn)兒和/或低出生體重嬰兒中，膳食蛋白必須以充分的量通過腸內(nèi)途徑供應(yīng)，以防止粘 膜破壞和提高屏障功能。此外，谷氨酰胺(GLN)、丁酸和DHA作為補充劑有益于增強腸屏障 功能和預(yù)防腸源性炎癥反應(yīng)的傳播，以及預(yù)防應(yīng)激相關(guān)性遠(yuǎn)端器官細(xì)胞凋亡。本發(fā)明的蛋白質(zhì)組分可以是例如乳清或酪蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，主要蛋白 質(zhì)組分為乳清。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)以約0. 5至lg/Kg/天提供。本發(fā)明制劑的谷氨酰胺組分可以作為單個氨基酸或作為例如二肽的一部分提供。 在優(yōu)選的實施方案中，谷氨酰胺在配方中作為單個氨基酸提供。在一個實施方案中，精氨酸 也包括于制劑中。一個實施方案包括使用精氨酰-谷氨酰胺二肽。精氨酸和谷氨酰胺也可 在配方中單獨供應(yīng)。谷氨酰胺的劑量可以是例如0. 3至0. 7g/Kg/天。在一個實施方案中，本發(fā)明包括施用ω3脂肪酸、尤其是長鏈多不飽和脂肪酸 (PUFA)例如DHA，以便通過下調(diào)促炎介質(zhì)向嬰兒小腸提供有益的作用。DHA的劑量可以是例 如0. 1至lg/Kg/天?；ㄉ南┧?AA)和/或二十碳五烯酸(EA)也可以依照本發(fā)明施用。 DHA與AA或EA的比率通常在5 1至1 1的范圍內(nèi)。短鏈脂肪酸(SCFA)可以在維持腸粘膜屏障中起作用。這些SCFA是碳水化合物的 細(xì)菌代謝產(chǎn)物，并且可能是共生細(xì)菌或益生菌(probiotics)有益效應(yīng)的部分原因。因此， SCFA可以被看作是“益生菌”。目前的關(guān)注涉及將益生菌用于早產(chǎn)兒，部分基于向免疫缺損 宿主提供活細(xì)菌的安全考慮。依據(jù)本發(fā)明，丁酸可用于提供益生細(xì)菌的益處而沒有有害的 副作用。丁酸的劑量可以是例如100-800mg/Kg/天。依照本發(fā)明，較高的丁酸攝取可用于增加緊密連接蛋白質(zhì)(閉合蛋白(claudin) 和閉鎖蛋白(occludin))表達以及減少對細(xì)胞旁(paracellular)標(biāo)記物的離體滲透性。使 用丁酸還下調(diào)小腸中的炎癥應(yīng)答，并且防止其傳播至遠(yuǎn)端器官，以及某些由于炎癥可在肝、 肺和腦中觀察到的病理學(xué)。本發(fā)明的制劑可用作早期攻擊性胃腸外營養(yǎng)和其它腸內(nèi)營養(yǎng)物如人奶的輔助物， 其改善新生兒健康并且減少發(fā)病率以及與缺少腸內(nèi)營養(yǎng)和長期胃腸外營養(yǎng)有關(guān)的成本。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的制劑可用于改善腸道手術(shù)的創(chuàng)傷愈合以及減輕 炎性腸疾病的癥狀。如下文詳細(xì)描述，本發(fā)明制劑的功效已經(jīng)在杯子胃造口術(shù)喂食模型的大鼠仔鼠中 評價，以分步驟方式評價補充具有以下的“起動劑配方”的作用1)高蛋白質(zhì)；2)GLN;3)DHA;和4) 丁酸。已經(jīng)在非炎性狀態(tài)和炎性狀態(tài)下就腸屏障功能、腸源性炎癥、炎癥傳播和 遠(yuǎn)端器官病理學(xué)方面評價了該制劑。關(guān)于本發(fā)明的大鼠研究證明了 1.蛋白質(zhì)剝奪(25%正常攝取)與腸絨毛萎縮有關(guān)。2. GLN和GLU都不能恢復(fù)這種作用，但是更多的蛋白質(zhì)攝取與增加的腸閉合蛋白 水平有關(guān)。3.正常蛋白質(zhì)配方(其等同于當(dāng)大鼠仔鼠由母鼠養(yǎng)育時所得的攝取量)不防止 LPS引發(fā)的腸CINC或TNF α生成。4.但是，在蛋白質(zhì)剝奪、用LPS治療的大鼠中的GLN補充，減少了腸的CINC(IL-8 的嚙齒動物類形式_強效的嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)引誘物)生成。5. GLN補充所導(dǎo)致的腸CINC生成減少與腸髓過氧化物酶和炎癥形態(tài)學(xué)標(biāo)記物的 減少有關(guān)。6. GLN誘發(fā)的腸CINC減少與較低的血漿CINC和TNF- α水平有關(guān)，表明這種作用 可解釋成炎癥及對腸外器官的損害減少。7.向BBDP大鼠-已知具有高滲透性腸、繼而發(fā)展成糖尿病的品種-施用NaB，可 經(jīng)由下調(diào)炎癥應(yīng)答而減少由糖尿病引起的死亡率，推定繼發(fā)于維持改善的腸粘膜完整性。細(xì)胞培養(yǎng)研究支持GLN剝奪1.減少跨上皮電阻抗，增加滲透性并減少閉合蛋白蛋白表達。2.加重源于人類成人與胎兒細(xì)胞的LPS和TNF α弓丨發(fā)的IL-8生成。源于人類胎 兒的細(xì)胞(Η4)比成人(Caco-2)源性細(xì)胞對LPS和GLN剝奪更敏銳。3.在成人源性細(xì)胞中通過增加I κ B的蛋白分解起作用，允許更多NFk B釋放、核 轉(zhuǎn)運和DNA結(jié)合，但是在胎兒源性細(xì)胞中通過減少翻譯激活(減少eIF-α)起作用，因此減 少I κ B，允許更多的NF κ B釋放、核轉(zhuǎn)運和DNA結(jié)合。η-6和n-3LCPUFA和丁酸的細(xì)胞培養(yǎng)研究1.顯示DHA可以下調(diào)TNFa誘發(fā)的炎癥。2.顯示DHA可以下調(diào)由Toll樣受體配體poly I :C誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答。3.顯示丁酸明顯增加Caco-2細(xì)胞的跨上皮電阻抗-細(xì)胞旁完整性的主要標(biāo)記物。腸上皮細(xì)胞GLN剝奪研究，通過蛋白質(zhì)印跡顯示閉合蛋白-1、閉鎖蛋白和ZO-I蛋 白表達減少，通過免疫熒光顯微鏡檢查顯示周圍(periiimctional)閉合蛋白_1消失以及 閉鎖蛋白減少。透射電子顯微鏡檢查揭示GLN剝奪細(xì)胞在鄰接細(xì)胞的頂端與側(cè)緣(apical lateral margin)之間形成不規(guī)則的連接復(fù)合體。 以下是例證用于實施本發(fā)明的規(guī)程的實施例。這些實施例不應(yīng)被解釋為限制。所 有百分比以重量計，且所有溶劑混合物比例以體積計，除非另有說明。實施例1GLN的營養(yǎng)價值可受粘膜上皮高極化性質(zhì)的影響，從而當(dāng)通過頂端(apically)或 基底(basally)提供相同的濃度時GLN提供營養(yǎng)優(yōu)勢。比較了頂端對基底的GLN攝取動力 學(xué)，發(fā)現(xiàn)沒有顯著不同或者沒有導(dǎo)致顯著分化差異。發(fā)現(xiàn)缺乏GLN(介質(zhì)不添加GLN和GLN 合成酶抑制)引起跨上皮電阻抗(TER)顯著降低，滲透性增加。在體內(nèi)觀察到類似的作用。在Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)物中，GLN剝奪的作用當(dāng)GLN合成酶(GS)也被抑制時是最顯著的，但是當(dāng)用介質(zhì)變化應(yīng)激細(xì)胞培養(yǎng)物時，即使沒有GS抑制也 可以被誘導(dǎo)。如用堿性磷酸酶活性評價的Caco-2細(xì)胞的分化也明顯依賴于GLN。當(dāng)GLN合成酶 活性被MS抑制時，谷氨酸鹽不會“援救(rescue)”堿性磷酸酶的恢復(fù)；然而施用于細(xì)胞培 養(yǎng)介質(zhì)的GLN完全恢復(fù)了堿性磷酸酶活性。進行研究來評價在缺乏GLN時，谷氨酸鹽、核苷酸單磷酸混合物、精氨酸或葡糖胺 是否可以支持大鼠腸隱窩細(xì)胞(IEC-6)的增殖。結(jié)果顯示，在缺乏外源性GLN時，谷氨酸鹽、 葡糖胺、精氨酸或核苷酸單磷酸獲得與GLN相似的增殖。用谷氨酸鹽、葡糖胺、精氨酸或核 苷酸混合物處理的GLN合成酶抑制的細(xì)胞顯示，在所有處理劑量下與用GLN處理的細(xì)胞相 比增殖減少。這表明用于使這些前體轉(zhuǎn)化成GLN的活性GLN合成酶或?qū)?xì)胞增殖顯示與 GLN相同作用的化合物的必要性。實施例2-GLN和谷氨酸鹽對Caco-2細(xì)胞細(xì)胞間連接形態(tài)學(xué)和緊密連接蛋白的作 用利用“杯子中的仔鼠(pup-in-a-cup) ”大鼠模型，檢查發(fā)育大鼠小腸中的蛋白質(zhì)剝 奪和GLN或GLU補充。四組6-7天齡的仔鼠通過胃造口術(shù)管喂養(yǎng)有或沒有另外的GLN或谷 氨酸鹽(GLU)的100%或25%蛋白質(zhì)(相對于母鼠喂養(yǎng)的大鼠)大鼠奶替代品(RMS)，喂養(yǎng) 6天。接受100%蛋白質(zhì)RMS的仔鼠比接受25%蛋白質(zhì)RMS+GLN/GLU補充的3組仔鼠經(jīng)歷 更好的生長。因此，更好的生長可以用腸內(nèi)蛋白質(zhì)補充來實現(xiàn)，單獨的GLN或GLU都不能挽 救蛋白質(zhì)剝奪的作用。絨毛大小是吸收能力的主要組分。接受100%蛋白質(zhì)RMS的仔鼠中的絨毛高度和 面積與給予其它RMS配方的3組仔鼠相比更大，然而絨毛高度和面積在接受有或沒有GLN 或GLU下25%蛋白質(zhì)的各組之間沒有差異。因此，蛋白質(zhì)攝取對維持絨毛尺寸很關(guān)鍵。實施例3-高蛋白膳食對緊密連接蛋白質(zhì)的作用緊密連接蛋白質(zhì)在腸屏障的細(xì)胞旁滲透性中起不可缺少的作用，這些蛋白中的兩 種-閉合蛋白(claudin)和閉鎖蛋白(occludin)使用蛋白質(zhì)印跡法評價。緊密連接蛋白 質(zhì)閉合蛋白-1在喂養(yǎng)100%蛋白膳食的組中顯著更高，而閉鎖蛋白在4組中沒有差異。實施例4-CINC mRNA細(xì)胞因子誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)引誘物(CINC)是嚙齒動物趨化因子，其執(zhí)行 嗜中性粒細(xì)胞化學(xué)引誘物功能，類似于人類中的IL-8。大量的這種促炎介質(zhì)可以是有害的。 腸內(nèi)施用LPS顯著增加腸CINC。為了闡明膳食對小腸CINC mRNA的作用，進行了 RT-PCR。蛋白質(zhì)剝奪和LPS(僅僅 25%蛋白質(zhì)的組)增加了 CINC mRNA表達。GLN補充使CINC mRNA減至與母鼠喂養(yǎng)的仔鼠 類似的水平。密度測定法顯示25%蛋白質(zhì)喂養(yǎng)的大鼠腸與母鼠喂養(yǎng)的仔鼠相比具有顯著更 高的CINC mRNA水平，而GLN逆轉(zhuǎn)了這種作用。但是，Glu沒有顯示與GLN相同的作用。實施例5-CINC肽與母鼠喂養(yǎng)的仔鼠相比，被提供100%和25%蛋白質(zhì)的LPS處理的仔鼠的腸CINC 肽升高約13倍。GLN和GlU分別使腸CINC肽減少73%和80%。胃造口術(shù)喂養(yǎng)的、LPS處 理的仔鼠也具有更高水平的血漿CINC肽。GLN而不是Glu減少了血漿CINC肽。實施例6-髓過氧化物酶反映在炎癥位點嗜中性粒細(xì)胞滲入和活性
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胃造口術(shù)喂養(yǎng)的、LPS處理的大鼠的腸髓過氧化物酶(MPO)活性的約6倍升高分 別被GLN和Glu減少92%和54%。大鼠仔鼠的研究證明了蛋白質(zhì)消耗導(dǎo)致明顯的腸萎縮，其不能用GLN或GLU挽救。 但是，在第二組研究(炎性病癥)中，蛋白質(zhì)沒有減少LPS誘導(dǎo)的腸CINC生成，但GLN減 少LPS誘導(dǎo)的腸CINC生成。這表明營養(yǎng)物的聯(lián)合(腸內(nèi)蛋白和添加的GLN)在防止腸萎縮 (蛋白質(zhì)作用)和減少炎癥(GLN作用)中可能具有協(xié)同作用。這些研究還支持腸內(nèi)GLN的 操作可以改變腸連接完整性，且這可能與腸炎癥的引發(fā)和傳播有關(guān)。實施例7- 丁酸對腸上皮內(nèi)連接的作用Caeo-2細(xì)胞的研究顯示丁酸對腸上皮內(nèi)連接具有顯著的作用。圖1顯示在治療 24小時后由丁酸介導(dǎo)的早期融合Caco-2細(xì)胞跨上皮電阻抗的顯著增加。實施例8-ω 3脂肪酸在于杯子模型的仔鼠中體內(nèi)評價之前，在作為初始模型的腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)中評價 ω3脂肪酸的作用。數(shù)據(jù)顯示在腸上皮細(xì)胞中具有顯著的抗炎作用。兩種主要膳食η-3長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)、二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20 :5η_3) 和二十二碳六烯酸(DHA，22 :6η-3)的抗炎性質(zhì)已經(jīng)在臨床上用于治療炎癥性疾病的癥狀 (Calder, P. C. “多不飽和脂肪酸和炎癥”，Biochem. Soc. Trans.，2005. 33 :423_427)。EPA 和 DHA 用作 n_3PUFA，且亞油酸(LA，18 :2n_6)用作 n_6PUFA。H4 和 Caco-2 細(xì) 胞分別用不同劑量的EPA、DHA和LA以及不同的組合預(yù)處理24小時。然后將TNF-α (對于 朋，11^/1;對于0^0-2細(xì)胞，501^/1)加至細(xì)胞培養(yǎng)基中，將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時。用于 Η4細(xì)胞系的較低劑量反映它們對炎性刺激物敏銳的靈敏度。評價了不同劑量的脂肪酸對TNF α誘發(fā)的IL-8生成的作用，見于圖6Α_Β。LCPUFA研究的總結(jié)1. Η4 (胎兒)細(xì)胞較Caco-2 (成人)細(xì)胞對TNF- α和PUFA刺激敏感得多。2. LA和EPA顯示在有和沒有TNF- α刺激下在Η4中較Caco_2細(xì)胞中對IL-8生成 具有更大的抗炎作用。3. DHA顯示對Caco_2的抗炎作用，并沒有加重H4細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的IL-8生 成。這些研究表明輔助性DHA補充而不是LA或EPA的價值。實施例9-PUFA對腸上皮中Poly IC誘導(dǎo)的IL_8生成的作用為了測定DHA是否對非TNF α的炎癥誘導(dǎo)物具有作用，對另一種Toll樣受體的刺 激進行評價。聚核糖肌苷酸_聚核糖胞苷酸[poly(I:C)]是實驗上用于模仿病毒感染的合 成雙鏈RNA。最近它已經(jīng)被確定是toll樣受體3 (TLR3)的關(guān)鍵性刺激物之一。還未報道 n-3PUFA對腸上皮中病毒誘導(dǎo)的炎癥的作用。二十二碳六烯酸(DHA、22 :6n_3)用作n_3PUFA，并且亞油酸(LA，18 :2n_6)用作 n-6PUFA。分化的Caco-2細(xì)胞用不同劑量的DHA或LA預(yù)處理24小時。然后該細(xì)胞用50ug/ ml poly (I: C)處理另外的24小時。收集培養(yǎng)介質(zhì)，通過ELISA測量IL-8生成。第一實驗 確定Poly(I = C)對一種主要的促炎趨化因子IL-8刺激的作用。Poly(I = C)使IL-8生成增 加10倍。評價了 DHA和LA對poly (I C)誘導(dǎo)的IL-8生成的作用。DHA (100 μ Μ)使 poly (I C)誘發(fā)的IL-8生成減少75 %。但是，劑量為50 μ M和100 μ M的LA沒有顯著減少由Poly IC誘導(dǎo)的IL-8生成。這些結(jié)果顯示多不飽和脂肪酸、尤其是DHA、n-3PUFA抑制Caco-2腸細(xì)胞中 poly (I:C)誘導(dǎo)的IL-8生成，表明DHA可在由腸上皮病毒感染引起的抗炎癥應(yīng)答中發(fā)揮重 要作用。實施例10-用于腸內(nèi)施用的營養(yǎng)組合物本發(fā)明組合物優(yōu)選為用于腸內(nèi)施用的營養(yǎng)組合物。即，它設(shè)計用于口服、胃內(nèi)或經(jīng) 幽門使用。本發(fā)明組合物可以是嬰兒配方或成人營養(yǎng)組合物，其可以是基于奶、基于大豆或 基于其它食物來源。該組合物可以配制成粉末或液體營養(yǎng)組合物，用于為嬰兒、兒科和成人 群體制備的配方。本發(fā)明組合物可通過包括可接受水平的維生素和礦物質(zhì)配制成全營養(yǎng)膳 食形式。該組合物可以是膳食產(chǎn)品形式，例如嬰兒配方、代乳品和膳食替代品或膳食補充 物。在一個實施方案中，新的嬰兒配方為營養(yǎng)全面的。所謂術(shù)語“營養(yǎng)全面的”是指該 組合物包含足夠的營養(yǎng)物以在延長期內(nèi)維持健康的人類生活。本發(fā)明的嬰兒配方包含用于 滿足人類嬰兒的營養(yǎng)需要即蛋白質(zhì)和其它營養(yǎng)物例如維生素和礦物質(zhì)的成分。本發(fā)明組合物可以包含氮源(即氨基酸和/或蛋白質(zhì))，該氮源的量通常為約Ig 至約IOg每IOOkcal總組合物，優(yōu)選為約2g至約6g每IOOkcal。維生素和礦物質(zhì)在全營養(yǎng) 組合物中的量通常足以滿足100 %的美國推薦的日攝取量(RDI)，為約500至約3，OOOkcal、 優(yōu)選為約1，000至約3，OOOkcal。在本發(fā)明營養(yǎng)組合物的一個實施方案中，維生素和礦物質(zhì)的量足以滿足100%的 RDI，為約500至約3，OOOkcal、優(yōu)選為約1，000至約3，OOOkcal。如本文所用的RDI是指在 ((Federal Register》，Vol. 58，No. 3，星期三，1993年1月6日，第2227頁中公開的那些，如 下維生素A :5，000國際單位；維生素C :60毫克；硫胺1. 5毫克；核黃素1. 7毫克；煙酸 20毫克；鈣1. Og ；鐵18毫克；維生素D :400國際單位；維生素E 30國際單位；維生素B6 2. 0毫克；葉酸0. 4毫克；維生素B12 6微克；磷1. Og ；碘150微克；鎂400毫克；鋅15 毫克；銅2毫克；生物素0. 3毫克；泛酸10毫克。在一個實施方案中，新的嬰兒配方包含谷氨酰胺，其量少于配方重量的0. 1%。 優(yōu)選，配方中谷氨酰胺的量為配方重量的約0. 001 %至0. 098%，更優(yōu)選為約0. 01 %至 0. 098%重量。在本發(fā)明方法中，該嬰兒配方或膳食補充劑以足以提高胃腸道健康的量施用于嬰 兒。在優(yōu)選的實施方案中，所述量為約0. 001至約10，000mg/kg對象體重/天，更優(yōu)選為約 0. 01至約1000mg/kg/天，進一步更優(yōu)選為約0. 01至約50mg/kg/天，甚至更優(yōu)選為約0. 1 至約10mg/kg/天?；蛘?，施用于嬰兒的量為約Img至約10，OOOmg/天，優(yōu)選約IOmg至約 lOOOmg，更優(yōu)選為約IOmg至約500mg。除二肽之外存在的蛋白質(zhì)來源可以是脫脂乳固體、脫脂乳固體和乳清蛋白質(zhì)的組 合、脫脂乳和/或乳清固體的部分水解物、大豆蛋白分離物或部分水解的大豆蛋白分離物。 嬰兒配方可以是以酪蛋白為主或以乳清為主。全營養(yǎng)組合物包含所有被認(rèn)為在日常飲食中必不可少的維生素和礦物質(zhì)，且這些 物質(zhì)應(yīng)以營養(yǎng)上有效的量存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，已經(jīng)確定某些已知對正常生理功能 來說必需的維生素和礦物質(zhì)的最低需要量。從業(yè)者也理解，需要提供適宜的額外量(超量)的微生物和礦物質(zhì)成分，以補償在加工和貯藏此類組合物期間的部分損耗。選擇用于本發(fā)明的嬰兒配方的具體的維生素或礦物質(zhì)化合物，需要考慮該化合物 與所用的具體加工條件和儲存期(Shelf storage)相容性相關(guān)的化學(xué)性質(zhì)。礦物質(zhì)、維生素和其它任選存在于本發(fā)明組合物中的營養(yǎng)物的實例包括維生素A、 維生素B6、維生素B12、維生素E、維生素K、維生素C、葉酸、硫胺、肌醇、核黃素、煙酸、生物素、 泛酸、膽堿、鈣、磷、碘、鐵、鎂、銅、鋅、錳、氯化物、鉀、鈉、硒、鉻、鉬、?；撬岷蚅-肉堿。礦物 質(zhì)通常以鹽形式添加。除了相容性和穩(wěn)定性考慮之外，特定的礦物質(zhì)與其它維生素的存在 和量將隨預(yù)期的嬰兒群體而略有改變。本發(fā)明的嬰兒配方通常也包含乳化劑和穩(wěn)定劑，如大豆卵磷脂、角叉菜膠等。本發(fā)明的嬰兒配方可以任選地包含可具有有益作用的其它物質(zhì)，例如乳鐵蛋白、 核苷酸類、核苷類、免疫球蛋白類等。本發(fā)明的嬰兒配方是濃縮液體形式、液態(tài)即時消耗形式或粉末形式。當(dāng)然，如果是 粉末形式，則配方用水稀釋成正常強度以形成即時消耗形式。本發(fā)明的液態(tài)嬰兒配方的重量克分子滲透壓濃度(當(dāng)即時消耗時)可以是約100 至 300m0sm/kg H2O,更通常為約 200 至 300m0sm/kg H20。本發(fā)明的嬰兒配方如有需要，可以通過本領(lǐng)域已知技術(shù)滅菌，例如熱處理，如高壓 滅菌或干餾(retorting)等。本發(fā)明的嬰兒配方可以以本領(lǐng)域已知的用于貯存營養(yǎng)產(chǎn)品的任何類型容器包裝， 例如玻璃、線條紙板、塑料、包層的金屬罐等。本發(fā)明的嬰兒配方在重建后是貯存穩(wěn)定的。所謂“貯存穩(wěn)定”是指即時消耗形式 的配方保持在單一均相中(即經(jīng)目測不會分成多于一個相)或增稠劑在冰箱貯存過夜后經(jīng) 目測不會以沉淀析出。由于該產(chǎn)品增稠的性質(zhì)，本發(fā)明的配方也具有保持液態(tài)的優(yōu)點(即 當(dāng)在冰箱貯存過夜時不會膠化成實體團塊)。本發(fā)明在期望的穩(wěn)定性和物理特性方面提供商業(yè)上可接受的產(chǎn)物，該產(chǎn)物證明很 少或沒有可觀察到的與美拉德反應(yīng)有關(guān)的褐變效應(yīng)副產(chǎn)物。此外，本發(fā)明組合物在重建后 的可接受期間內(nèi)(或如果以液體形式制備在貯存期限內(nèi))基本上是均質(zhì)的。本發(fā)明特別可 用于預(yù)防并治療早產(chǎn)視網(wǎng)膜病變的嬰兒配方制劑，盡管它可等同地適用于對以下選擇群體 特有的其它要素膳食處于糖尿病視網(wǎng)膜病變、血管增殖性視網(wǎng)膜病變或異常血管化增殖 等的風(fēng)險或者疑似患有糖尿病視網(wǎng)膜病變、血管增殖性視網(wǎng)膜病變或異常血管化增殖等的 選擇群體。實施例11 一具體組合物對于5盎司的食用份量，從營養(yǎng)的觀點，本發(fā)明的組合物可包括例如2. 5-10克蛋 白質(zhì)、少于5克脂肪、少于10克碳水化合物和130-135克(通常134克)水以及GLN、DHA 和丁酸。在一個實施方案中，該組合物的組成如下上述量的上述成分和任選的維生素、礦 物質(zhì)和營養(yǎng)素。在另一個實施方案中，該組合物可進一步包括適當(dāng)?shù)妮d體、防腐劑以及不 會降低將組合物安全地施用于嬰兒的能力的物質(zhì)。因此，除GLN、丁酸和DHA之外，該組合 物可包括例如任何或所有下述物質(zhì)(其中百分比是示例性的)脫脂乳、乳清蛋白濃縮物、 高山被孢霉(mortierella alpina)油-花生四烯酸ARA的來源-少于1 %、寇氏隱甲藻 (crypthecodinium cohnii)油-二十二碳六烯酸DHA的來源-少于1%、維生素A棕櫚酸酯-少于1 %、維生素D3-少于1 %、維生素E醋酸酯-少于1 %、維生素Kl-少于1 %、鹽酸 硫胺-少于1%、核黃素-少于1%、鹽酸維生素B6-少于1%、維生素B12-少于1%、煙酰 胺-少于1%、葉酸-少于1%、泛酸鈣-少于1%、生物素-少于1%、抗壞血酸-少于1%、 氯化膽堿_少于1 %、肌醇_少于1 %、碳酸鈣_少于1 %、氧化鎂-少于1 %、硫酸亞鐵-少 于1 %、硫酸鋅-少于1 %、硫酸錳-少于1 %、硫酸銅_少于1 %、氯化鉀_少于1 %、檸檬酸 鉀-少于1%、氫氧化鉀-少于1%、亞硒酸鈉-少于1%、?；撬?少于1%、L-肉堿-少 于1%、核苷酸類-少于1%、腺苷5'-單磷酸-少于1%、胞苷5' _單磷酸-少于1%、 鳥苷5 ‘-單磷酸二鈉-少于1 %、尿苷5 ‘-單磷酸二鈉-少于1 %。此外，在示例性的實 施方案中，每份各種成分的量可以如下(其中應(yīng)理解，所列出的量可以變化50%或更多)。亞油酸 860. Omg維生素A300. OIU維生素D 60. OIU維生素E 2. OIU維生素 K 8. Omcg硫胺(維生素Bi) 80. Omcg核黃素(維生素B2) 140. Omcg維生素 B660. Omcg維生素B120. 3mcg煙酸1000. Omcg葉酸(Folacin) 16. Omcg泛酸 500. Omcg生物素3. Omcg維生素C (抗壞血酸)12. Omg膽堿24. Omg肌醇6. Omg鈣 78. Omg磷 43. Omg鎂 8. Omg鐵 1.8mg鋅 l.Omg錳 15. Omcg銅 75. Omcg碘10. Omcg硒 2.8mcg鈉 27. Omg鉀 108. Omg氯化物63. Omg所有專利、專利申請、臨時申請以及本文所提及或引用的出版物的全部內(nèi)容、包括 所有圖和表通過引用并入本文，達到它們與本說明書明確的教義一致的程度。
應(yīng)理解，本文所述的實施例和實施方案僅用于例證性目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想 到根據(jù)這些實施例和實施方案進行各種變更或改變，而且這些變更或改變包括在本申請的 精神和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
用于腸內(nèi)施用的制劑，其中所述制劑包括蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、短鏈脂肪酸和谷氨酰胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中所述長鏈多不飽和脂肪酸為DHA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中所述短鏈脂肪酸為丁酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其進一步包括精氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其包括蛋白質(zhì)、DHA、丁酸和谷氨酰胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中所述蛋白質(zhì)為乳清。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其為低滲性的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為最低腸內(nèi)營養(yǎng)配方。
9.用于促進胃腸道健康的方法，其中所述方法包括向患者施用用于腸內(nèi)施用的制劑， 其中所述制劑包括蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、短鏈脂肪酸和谷氨酰胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述長鏈多不飽和脂肪酸為DHA。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述短鏈脂肪酸為丁酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述制劑進一步包括精氨酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述制劑包括蛋白質(zhì)、DHA、丁酸和谷氨酰胺。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述蛋白質(zhì)為乳清。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述制劑為低滲性的。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述組合物為最低腸內(nèi)營養(yǎng)配方。
17.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述患者為新生兒。
18.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述患者重量低于1250克。
全文摘要
本發(fā)明提供改善胃腸道功能的組合物及其用途。本發(fā)明的組合物和方法特別有益地適用于新生兒，因為它們可用于刺激未成熟腸的發(fā)育，以便提供增強吸收營養(yǎng)物的能力并且達到更強的屏障功能。
文檔編號A61K31/22GK101896176SQ200880120656
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月14日
發(fā)明者J·諾伊 申請人:佛羅里達大學(xué)研究基金公司