專利名稱：經(jīng)熱處理的菌苗,及由這些經(jīng)熱處理的菌苗制備的乳劑疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及疫苗領(lǐng)域，且涉及穩(wěn)定乳劑疫苗的方法。具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng) 熱處理的菌苗，生產(chǎn)經(jīng)熱處理的菌苗的方法及由這些經(jīng)熱處理的菌苗制備的豬乳劑疫苗。
背景技術(shù)：
疫苗接種越來越多地用于控制動(dòng)物中的傳染性疾病。佐劑常常用在疫苗里，因?yàn)?其能增加對抗原的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。疫苗經(jīng)常配制為乳劑，因?yàn)槿閯┠芷鸬阶魟?的作用且具有將抗原作為儲(chǔ)庫(Cbpot)保留于注射位點(diǎn)的屬性。乳化劑通常用于乳劑疫苗 中。除了使用乳化劑之外，乳劑疫苗的穩(wěn)定性還能通過使用機(jī)械方式減少乳劑微滴大小而 達(dá)到。美國專利號5，084，269涉及佐劑制劑，其含有與礦物油組合的卵磷脂，其在宿主 動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生較少刺激，同時(shí)誘導(dǎo)增加的系統(tǒng)性免疫。根據(jù)美國專利5，084，269的組合物以 商標(biāo)名AMPHIGEN (輝瑞公司的商標(biāo))商用。通常地，細(xì)菌抗原在加熱時(shí)不穩(wěn)定，甚至短時(shí)暴露于升高的溫度能減少抗原的活 性。例如目前的炭疽疫苗在37°C下48小時(shí)會(huì)喪失所有生物學(xué)活性(S. Sing，N. Ahuja, V. Chauhan, Ε. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat,禾口 R. Bhatnagar ；Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6 ；295 (5) 1058-62)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)熱處理的菌苗，生產(chǎn)經(jīng)熱處理的菌苗的方法及由這些經(jīng)熱處理的菌 苗制備的豬乳劑疫苗。該方法包括加熱菌苗至大約35-大約80°C的溫度以形成經(jīng)熱處理的 菌素。發(fā)明詳述定義可接受抗原性活性_術(shù)語“可接受抗原性活性”指的是受到攻擊之后或由通過使 用同源的活生物體的編碼效力測試(codifiedpotency test)在疫苗接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)保 護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。菌苗-術(shù)語“菌苗”指的是可用作疫苗組分的滅活的細(xì)菌懸液。乳化劑-術(shù)語“乳化劑”指的是用于制造更穩(wěn)定的乳劑的物質(zhì)。乳劑-術(shù)語“乳劑”指的是兩種不相混液體的組合物，其中一種液體的小滴懸于另 一種液體的連續(xù)相中。經(jīng)熱處理的菌苗_術(shù)語“經(jīng)熱處理的菌苗”指的是經(jīng)過經(jīng)經(jīng)熱處理的菌苗，其具有 的脂酶活性是熱處理之前脂酶活性的50%或更低，且具有可接受抗原性活性。反相乳劑_術(shù)語“反相乳劑”指的是油包水乳劑。脂酶-術(shù)語“脂酶”指的是能引起乳化劑在乳劑疫苗中分解的酶、酯酶、脂酶和磷 脂酶。正常乳劑_術(shù)語“正常乳劑”指的是水包油乳劑。
水包油乳劑_術(shù)語“水包油乳劑”指的是其中小油滴懸于連續(xù)水相中的乳劑。室溫-術(shù)語“室溫”指的是從18-25°C的溫度。油包水乳劑_術(shù)語“油包水乳劑”指的是其中小水滴懸于連續(xù)油相中的乳劑。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有減少的脂酶活性的菌苗、由這些菌苗制備的豬乳劑疫苗、及減少 菌苗的脂酶活性的方法。除了抗原性組分，一些菌苗具有脂酶活性。當(dāng)具有脂酶活性的 菌苗并入乳劑中時(shí)，脂酶可分解用于制造乳劑的乳化劑。包含具有高脂酶活性的菌苗的 乳劑疫苗常常是不穩(wěn)定的乳劑，包含具有低水平脂酶的菌苗的乳劑疫苗常常是穩(wěn)定的。 在滅活后產(chǎn)生具有脂酶活性的菌苗的細(xì)菌的實(shí)例包括豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathieae)，單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌(Listeria monocytogenes)，大腸埃希 氏菌(Escherichia coli),豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae),及鉤端螺方寵 體(Leptospira)種屬，如已知的病原體犬鉤端螺旋體(L印tospiracanicola)、感冒傷寒 型鉤端 il 旋體(Leptospira grippotyposa)、哈德焦鉤端 il 旋體(Leptospira hard jo) > 出血黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagiae)、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體 (Leptospira bratislava)和波摩那鉤端螺旋體(L印tospirapomona)。這些細(xì)菌能引起豬 的疾病，并且需要針對這些疾病進(jìn)行疫苗接種。鉤端螺旋體菌苗更可能具有高脂酶活性，而 豬紅斑丹毒絲菌可能具有較低的、更易控制的脂酶活性。脂酶，其能分解用于制造乳劑的乳化劑，并因此引起乳劑的不穩(wěn)定及分解，可能 包括一種或多種乳劑分解酶如酯酶、脂酶和磷脂酶?？傮w上這些酶，酯酶、脂酶和磷脂 酶被稱為脂酶。菌苗的脂酶活性可使用叫做0-匹伐酸傘形酮(0-pivaloyloxymethyl umbelliferone) (C-POM)的合成底物進(jìn)行測量。由脂酶引起的水解速率是對脂酶活性的測 量。該反應(yīng)中由脂酶引起的水解反應(yīng)速率通過脂酶活性的產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度的增加而進(jìn)行 監(jiān)視。反應(yīng)速率取決于所選擇的確切水解測試條件，這樣應(yīng)當(dāng)用相同測試條件產(chǎn)生的數(shù)據(jù) 比較由水解速率測量所得的脂酶活性水平。在幾篇文章中公開了文獻(xiàn)方法，包括Kurioka S.和 Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75 :281_289，De Silva N. S.和 Quinn P. A. (1987) J. Clin. Microbiol. 25 :729-731，及 Grau A.和 Ortiz A. (1998)Chem. Phys. of Lipids. 91 109-118)。在乳劑疫苗中，乳劑的分解引起組分的相分離。這是不需要的，因?yàn)楫?dāng)有相分離 時(shí)，從容器中取出的各自的劑量可能不會(huì)含有相同水平的疫苗組分。此外，乳劑的喪失能導(dǎo) 致乳化劑佐劑活性的喪失且導(dǎo)致疫苗抗原性效應(yīng)的減少。減毒活病毒常常與菌苗一并包括在疫苗中。這些疫苗是有用的，因?yàn)閱蝹€(gè)疫苗能 用于制造使用一種疫苗針對不同疾病的免疫性。如果脂酶活性存在于菌苗中，其會(huì)引起乳 化劑從乳劑中的釋放。該游離乳化劑能破壞并使活的疫苗病毒失活，這樣導(dǎo)致病毒傳染性 的喪失。用于疫苗的菌苗可通過培養(yǎng)目的細(xì)菌，以及之后滅活細(xì)菌以產(chǎn)生含有多種細(xì)菌組 分(包括細(xì)胞壁組分)的菌苗而形成。細(xì)菌可通過多種方法滅活，包括將其暴露于化合物 如硫柳汞、福爾馬林、甲醛、二乙胺、二乙烯亞胺(binary ethylenamine，BEI)、β丙內(nèi)酯 (BPL)和戊二醛。這些化合物的組合可以使用。此外，有可能用滅菌輻射以滅活細(xì)菌。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有這種脂酶活性的菌苗的脂酶活性可通過熱處理而被減少。具體地，菌苗的脂酶活性可通過將菌苗加熱至大約35-大約80°C的溫度以形成經(jīng)經(jīng)熱處理的菌 苗而被減少，所述經(jīng)經(jīng)熱處理的菌苗具有可接受抗原性活性。熱處理進(jìn)行一段足夠的時(shí)間， 以使經(jīng)經(jīng)熱處理的菌苗的脂酶活性是熱處理之前菌苗中所發(fā)現(xiàn)的50%或更低。對于優(yōu)良的 乳劑疫苗穩(wěn)定性，脂酶活性不必減少到零。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良保質(zhì)期的疫苗可由具有 熱處理前脂酶活性水平的50 %或更低的脂酶活性水平的經(jīng)熱處理的菌苗制備。當(dāng)測試底物的水解速率被用作對菌苗脂酶活性的測量時(shí)，比較測試底物在熱處理 之前的水解速率與熱處理之后的水解速率。進(jìn)行熱處理以將水解速率減少到新鮮菌苗觀察 到的水解速率的50%或更低。如果相同方法被用于測量熱處理之前的活性及熱處理之后的活性，則測量脂酶活 性水平的確切方法不是關(guān)鍵的。例如，如果測試底物的水解速率使用一種底物進(jìn)行測量時(shí)， 不同底物可以產(chǎn)生不同的速率。然而，如果相同底物用于起始活性確定及處理后的活性確 定，相對速率仍會(huì)顯示熱處理的效應(yīng)。有用于波摩那鉤端螺旋體菌苗(9CFR§ 113. 101)、出血黃疸鉤端螺旋體菌苗 (9CFR§ 113. 102)、犬鉤端螺旋體菌苗(9CFR§ 113. 103)、感冒傷寒型鉤端螺旋體菌苗 (9CFR§ 113. 104)及哈德焦鉤端螺旋體菌苗(9CFR§ 113. 105)抗原性活性的編碼測試 (9CFR§ 113. 101，§113.102，§113.103，§113. 104，及 §113.105)。對于這些種屬，可接 受抗原性活性可定義為在疫苗接種的倉鼠中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力，使得當(dāng)倉鼠用同 源活細(xì)菌進(jìn)行攻擊時(shí)，至少75 %的免疫接種的倉鼠在模式中存活，而至少80 %的未免疫接 種的倉鼠不能存活。就抗原而言，哈德焦鉤端螺旋體，可接受抗原性活性可定義為在已經(jīng)用 包含細(xì)菌抗原哈德焦鉤端螺旋體免疫接種的牛中疫苗誘導(dǎo)針對哈德焦鉤端螺旋體的血清 學(xué)凝集的幾何平均滴度> 40的能力。對于其他菌苗，可接受抗原性活性定義為受到攻擊之 后或由通過使用同源活的生物體的效力測試在疫苗接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的 能力。熱處理可在一定的溫度范圍上進(jìn)行，可進(jìn)行一段不同長度的時(shí)間。一般地，加熱在 大約35-大約80°C進(jìn)行大約20分鐘-大約24小時(shí)而完成。當(dāng)菌苗加熱到更高溫度時(shí)，如 大約75-大約80°C，加熱時(shí)間為時(shí)間范圍的短的情況。當(dāng)加熱在更低溫度下完成時(shí)，加熱 進(jìn)行一段更長的時(shí)間。另一種溫度和時(shí)間的組合是在大約60-大約70°C的溫度下加熱大 約9-大約10小時(shí)。另一種溫度和時(shí)間的組合是在大約65-大約70°C的溫度下加熱大約 5-大約8小時(shí)。另一種溫度和時(shí)間的組合是在大約65-大約70°C的溫度下加熱大約1小 時(shí)。另一種溫度和時(shí)間的組合是在大約55-大約65°C的溫度下加熱大約5-大約8小時(shí)。熱處理后，菌苗具有比新鮮制備菌苗低的脂酶活性，但還可以以相同的方式配制 成新鮮制備的菌苗。這樣，經(jīng)熱處理的菌苗可以通過生產(chǎn)疫苗的普通方法并入疫苗。可通過組合所需的菌苗和油相以及乳化劑或多種乳化劑而形成乳劑疫苗。然后對 此組合進(jìn)行劇烈攪拌以形成乳劑。合適的攪拌方法包括均質(zhì)化及隨后的微流體化。防腐劑 和賦形劑還可于乳化作用前包括在組合之內(nèi)。疫苗可包括菌苗和病毒抗原二者。在制備包括菌苗和病毒抗原的疫苗時(shí)，將菌苗、 任何要包括的病毒抗原、乳化劑或多種乳化劑、以及可選地防腐劑和佐劑與油相組合，并進(jìn) 行乳化。在乳劑形成后，制劑的PH可使用NaOH或HCl溶液調(diào)整到合適的pH。用于疫苗用 途，通?？扇〉氖荘H接近中性以避免注射位點(diǎn)的刺激。通常pH為大約7. 0-大約7. 3。
合適的用于乳劑疫苗形成的油相包括不可代謝油以及可代謝油。不可代謝油包括 礦物油，如白色礦物油及輕礦物油?？纱x油包括蔬菜油、魚油和合成的脂肪酸甘油酯。可用于制備本發(fā)明的乳劑疫苗的乳化劑的實(shí)例為磷脂、山梨坦酯、聚乙氧山梨坦 酯以及甘露醇衍生物，其為常見的疫苗乳化劑。磷脂乳化劑包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷 脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸及卵磷脂(例如AMPHIGEN )。山梨坦酯乳化劑包括脫水山梨醇 單月桂酸酯(例如Span 20和Arlacel 20)，脫水山梨醇單油酸酯(例如Span 80 ^P Arlacel 80)，脫水山梨醇單棕櫚酸酯(例如Span 40和Arlacel 40)，及脫水山梨醇單 硬脂酸酯(例如Span 60和Arlacel 60)。聚乙氧山梨坦酯包括聚乙氧脫水山梨醇單月 桂酸酯(例如Tween 20andTween 21)，聚乙氧脫水山梨醇單油酸酯(例如Tween 80)， 聚乙氧脫水山梨醇單棕櫚酸酯(例如Tween 40)，及聚乙氧脫水山梨醇單硬脂酸酯(例如 Tween 60)。甘露醇衍生物乳化劑包括甘露醇十八酸酯。Span 、Arlacel 和Tween 為 ICI Americas的商標(biāo)。AMPHIGEN 為輝瑞公司的商標(biāo)。通常，疫苗配制為正常的水包油乳 劑，但也可能制備反相油包水乳劑。多種佐劑如Quil A、膽固醇、磷酸鋁和氫氧化鋁及防腐劑如硫柳汞可用于疫苗中。 Quil A為提取自南美洲皂樹(Quillaja SaponariaMolina)樹皮的皂角苷的經(jīng)純化混合物。 Quil A直接作用于免疫系統(tǒng)以激活敏感性的一般狀態(tài)。這樣，其誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答。 親脂鏈?zhǔn)沟每乖妥魟┑南嗷プ饔脗鬟f至細(xì)胞溶膠而以內(nèi)源途徑進(jìn)行加工。Quil A常常 與膽固醇一同使用，因?yàn)楫?dāng)以合適比例添加時(shí)膽固醇消除了不那么需要的副作用。膽固醇 與Quil A形成不可溶復(fù)合體，當(dāng)膽固醇結(jié)合于Quil A時(shí)，其形成螺旋樣結(jié)構(gòu)，這樣暴露了 分子的糖單元，有助于刺激免疫應(yīng)答。常常將豬病毒抗原添加至含有菌苗的疫苗。這種手段的一個(gè)優(yōu)勢是一種疫苗可用 于產(chǎn)生對幾種疾病的免疫性，而無需幾種不同疫苗的劑量達(dá)到相同結(jié)果。滅活病毒和減毒 活病毒都可用于疫苗中。在引起豬疾病的病毒中可用的是豬腺病毒、豬環(huán)狀病毒、豬皰疹病 毒、假狂犬病病毒、傳統(tǒng)豬瘟熱病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、豬細(xì)小病 毒、豬呼吸性冠狀病毒、豬生殖和呼吸道病毒、豬流感、傳染性腸胃炎病毒及水皰性口炎病
ο如果脂酶活性存在于菌苗中，其可引起乳化劑從乳劑中釋放。此游離的乳化劑可 破壞活病毒的被膜，并使活疫苗病毒失活，因此導(dǎo)致病毒傳染性的喪失。這樣，對菌苗的熱 處理幫助穩(wěn)定乳液，并保持其佐劑作用，還保持病毒的病毒傳染性。提供以下實(shí)施例以用于進(jìn)一步闡明，但無意限制所要求保護(hù)的發(fā)明的范圍。步驟步驟1濁度的測定濁度通過光散射法以濁度單位(N印helometric Units, NU)進(jìn)行測定。由規(guī)定條 件下樣品散射的光的強(qiáng)度與由標(biāo)準(zhǔn)參照懸液散射的光強(qiáng)度比較。散射的光的強(qiáng)度越高，樣 品的濁度越高。光源射向樣品，在光源方向90°處測量光散射。通過測量福爾馬胼懸液的 光散射而校準(zhǔn)設(shè)備。濁度計(jì)設(shè)備的校準(zhǔn)將蒸餾水通過具有0. 2 μ m孔徑的膜濾器進(jìn)行過濾制備超濾水。通過在容量瓶中， 將1. OOg硫酸胼(NH2) H2SO4溶解于超濾水并以超濾水稀釋至IOOml而制備第一種溶液。通過在容量瓶中，將10. OOg六亞甲基四胺(hexamethylenetetramine)溶解于超濾水并以超 濾水稀釋至IOOml而制備第二種溶液。通過將5. Oml第一種溶液和5. Oml第二種溶液混合 來制備福爾馬胼懸液。讓混合物在大約24°C下靜置24小時(shí)?；旌衔镉贸瑸V水稀釋至IOOml 以形成具有400NU濁度的儲(chǔ)備濁度懸液。通過將10. OOml儲(chǔ)備濁度懸液用超濾水稀釋到 IOOml而制備40NU的福爾馬胼濁度懸液。進(jìn)一步的校準(zhǔn)溶液是通過稀釋儲(chǔ)備溶液來制備 的。濁度的測量要測量的樣品用超濾水稀釋，以使?jié)岫认陆档綕岫扔?jì)的校準(zhǔn)范圍內(nèi)。測量濁度并 以下面等式計(jì)算原始濁度 其中M為以NU計(jì)的經(jīng)稀釋樣品的濁度D為稀釋水的體積，以mL計(jì)
0為原始樣品體積，以mL計(jì)步驟2脂酶分析脂酶活性使用0-匹伐酸傘形酮作為熒光發(fā)生底物進(jìn)行測定。脂酶催化此非熒光 底物的水解產(chǎn)生羥基甲醚(它在水溶液條件下不穩(wěn)定)。不穩(wěn)定羥基甲醚的分解產(chǎn)生乙醛 和熒光產(chǎn)物傘形酮。監(jiān)視所產(chǎn)生傘形酮的熒光強(qiáng)度，作為時(shí)間的函數(shù)，提供脂酶酶活性的敏 感的動(dòng)態(tài)測量。0-匹伐酸傘形酮(Molecular Probes產(chǎn)品號P35901)溶液在純DMSO中制備， 儲(chǔ)備液濃度為5mM ；未使用的溶液于_20°C，避光儲(chǔ)存。5mM 0-匹伐酸傘形酮溶液用58mM TRIS-HCl緩沖液(pH 8.0)稀釋到750 μ m，將所得的溶液預(yù)熱至37°C。菌苗樣品或?qū)φ站?沖液/基質(zhì)在室溫下以6500X重力離心10分鐘以形成沉淀和上清。通過將15 μ LlOOmM TRIS-HCl緩沖液(pH 8.0)與15 μ L來自菌苗樣品或?qū)φ站彌_液/基質(zhì)的上清在室溫下混 合在小體積96孔板(Corning 3393，黑色聚苯乙烯非結(jié)合表面，半面積)的測定孔中進(jìn)行反 應(yīng)；在37°C下預(yù)孵育10分鐘；然后通過加入20 μ L的750 μ m 0-匹伐酸傘形酮或?qū)φ站彌_ 液/基質(zhì)起始反應(yīng)。所得反應(yīng)混合物含有53mM TRIS-HCl緩沖液(pH8. 0)和0或300 μ m 0-匹伐酸傘形酮。在一小時(shí)時(shí)間段內(nèi)間隔30-45秒測量熒光強(qiáng)度(Spectramax Gemini XS, 37°C，λ ex = 360nm, Aem = 460nm, PMT敏感性裝置‘基質(zhì)，，每孔讀數(shù)6次)。反應(yīng)速率由所 得過程曲線的斜率確定。步驟3豬紅斑丹毒絲菌制備物的濁度測量豬紅斑丹毒絲菌制備物的濁度用分光光度計(jì)在600nm波長處測量。結(jié)果以光學(xué)單 位(optical units, 0U) 艮告。
實(shí)施例實(shí)施例1通過熱處理減少脂酶活性制備硫柳汞滅活的鉤端螺旋體集合，其包括以下種屬犬鉤端螺旋體、出血黃疸鉤 端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體和波摩那鉤端螺旋體，來自各自的菌苗。將組合的菌苗的六份樣品在4°C、37°C、45°C、56°C、65°C和80°C儲(chǔ)存過夜(大約12小 時(shí))。儲(chǔ)存于4°C的樣品用作未處理對照。在37°C、45°C、56°C、65°C和80°C儲(chǔ)存12小時(shí)的 樣品為經(jīng)熱處理的樣品。儲(chǔ)存之后，根據(jù)步驟2的方法測量測試底物在各菌苗存在下水解 的速率。樣品的水解速率除儲(chǔ)存于4°C的樣品的水解速率乘以100為儲(chǔ)存后殘余的各菌苗 的原始脂酶活性。以下圖表顯示儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存后殘余的原始脂酶活性百分比。 制備了兩個(gè)布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體系列。這些系列使用硫柳汞進(jìn)行失活，然后 進(jìn)行熱處理在65°C下8小時(shí)。在處理前以及處理中每兩個(gè)小時(shí)取出樣品。脂酶活性在每個(gè) 時(shí)間點(diǎn)根據(jù)步驟2的方法確定。取出樣品時(shí)，測量測試底物在每個(gè)樣品存在下的水解速率。 樣品水解速率除以起始水解速率乘以100為熱處理后殘余的各菌苗的原始脂酶活性。以下 圖表顯示取樣時(shí)間和那時(shí)殘余的原始脂酶活性百分比。 實(shí)施例2制備實(shí)驗(yàn)疫苗制劑培養(yǎng)犬鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺 旋體、波摩那鉤端螺旋體、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、豬紅斑丹毒絲菌和豬細(xì)小病毒的培養(yǎng) 物。每種鉤端螺旋體培養(yǎng)物的濁度以濁度單位(NU)進(jìn)行測量。紅斑丹毒絲菌培養(yǎng)物的濁 度以光學(xué)單位(OU)進(jìn)行測量。細(xì)菌用硫柳汞進(jìn)行滅活以形成菌苗。每種鉤端螺旋體菌苗 在65°C下熱處理8小時(shí)以減少脂酶活性。豬紅斑丹毒絲菌菌苗不進(jìn)行熱處理。鉤端螺旋體 菌苗與滅活的豬細(xì)小病毒及滅活的豬紅斑丹毒絲菌相組合，然后與AMPHIGEN 、佐劑、防腐 劑、稀釋緩沖液混合，使得每2ml劑量的疫苗含有下表所示的組分。抗原濃度 實(shí)施例3倉鼠和豬中的效力測試將實(shí)施例2的疫苗施用于倉鼠和兔以使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型測試效力。測試倉 鼠然后用一定劑量的犬鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、布拉迪 斯拉發(fā)鉤端螺旋體或波摩那鉤端螺旋體進(jìn)行攻擊以測試疫苗的效力。測量存活者的數(shù)量作 為功效的表現(xiàn)。測量針對哈德焦鉤端螺旋體的兔顯微凝集滴度以顯示疫苗的部分的效力。 下表顯示由經(jīng)熱處理的鉤端螺旋體菌苗制備的疫苗能夠產(chǎn)生通過功效標(biāo)準(zhǔn)的抗原性應(yīng)答。 通過比較疫苗血清學(xué)滴度與參考疫苗的滴度在兔中測試豬紅斑丹毒絲菌。疫苗具 有3. 0的RP (相對效力)。PPV在血凝測定中進(jìn)行測試，具有HA滴度為1024HA/. 05ml。對 于疫苗320HA/. 05ml的滴度是可接受值。實(shí)施例4疫苗的生化測試根據(jù)實(shí)施例2中列出的制劑制備具有經(jīng)熱處理的鉤端螺旋體菌苗和其他組分的 疫苗。根據(jù)實(shí)施例2的方法從非熱處理的鉤端螺旋體菌苗制備類似的疫苗。兩種疫苗制劑 于4°C儲(chǔ)存0、6、12、15和18個(gè)月的時(shí)間。使用激光衍射計(jì)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對每種疫苗進(jìn)行 顆粒大小分析。以下顯示的圖表顯示了每種疫苗在數(shù)月的監(jiān)視時(shí)間(0、6、12、15和18個(gè)月)內(nèi)的
顆粒大小分布。在第0天對新鮮制備的含有經(jīng)熱處理的鉤端螺旋體菌苗的疫苗進(jìn)行顆粒大小分 析 從非熱處理的鉤端螺旋體菌苗制備的疫苗(上部的圖)顯示了顆粒大小的增加， 表示乳劑分解。從經(jīng)熱處理的鉤端螺旋體菌苗制備的疫苗(下部的圖)顯示了整個(gè)18個(gè) 月中顆粒大小的保持，表示乳劑穩(wěn)定。實(shí)施例5PPV 血凝測定(Hemaglutination Assay, HA)—開始就HA滴度和溶血滴度測試實(shí)施例2中所列的由非熱處理的鉤端螺旋體菌 苗和經(jīng)熱處理的鉤端螺旋體菌苗制備的疫苗制劑(實(shí)施例2列表中的疫苗含有所有列出的 抗原——用于所有工作的相同疫苗)。不同時(shí)間點(diǎn)HA滴度的穩(wěn)定性。HA測定通過調(diào)整樣 品pH至11-11. 2以從氫氧化鋁膠中提取PPV(豬細(xì)小病毒)病毒而進(jìn)行。然后離心樣品并 收集上清用于測定。將豚鼠紅細(xì)胞加入96孔板中用作凝集指示物。樣品上清在相同的兩 行間依次稀釋2倍，起始稀釋為1 5。平板在5士3C下孵育16-24小時(shí)。每孔血凝的程度 以0-4計(jì)分。在最后的稀釋含有2分或以上時(shí)記錄滴度。在測試未熱處理的疫苗時(shí)，發(fā)現(xiàn) 此疫苗引起溶血。溶血滴度是觀察到溶血的最高稀釋。經(jīng)熱處理的疫苗不產(chǎn)生溶血。以下圖表顯示隨時(shí)間的平均HA滴度和溶血滴度。CTC為具有經(jīng)熱處理的鉤端螺旋 體菌苗的疫苗。OOP為不具有經(jīng)熱處理的鉤端螺旋體菌苗的疫苗。圖表1 隨時(shí)間的PPV HA滴度隨時(shí)間對OOP和CTC PPV HA的跟蹤起始Imo 2mos. 3mos. 4mos. 5mos. 7mos. IOmos.
1280 640 80 0
OOP 160 1280 CTC 1280 1280
OOP 80 160 CTC O O
23
1280 1280 1280 1280
1280 1280 1280 1280
80
溶血滴度 80 160
0 0
160 0
1280 640
160 0
640 640
160 0
1280 640
160 0
權(quán)利要求
包括乳劑、經(jīng)熱處理菌苗的疫苗，所述經(jīng)熱處理菌苗包括滅活細(xì)菌的懸液，其中所述滅活細(xì)菌為布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體種屬和1 13種選自如下的引起豬疾病的病毒豬腺病毒、豬環(huán)狀病毒、豬皰疹病毒、假狂犬病病毒、傳統(tǒng)豬瘟熱病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬呼吸性冠狀病毒、豬生殖和呼吸道病毒、豬流感、傳染性腸胃炎病毒及水皰性口炎病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其進(jìn)一步包括卵磷脂制備物和基于鋁佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的疫苗，其進(jìn)一步包括油包卵磷脂制備物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其進(jìn)一步包括經(jīng)熱處理菌苗，其包括滅活細(xì)菌懸液，其中所 述滅活細(xì)菌為1-6種選自如下的細(xì)菌種屬犬鉤端螺旋體、出血黃疸鉤端螺旋體、感冒傷寒 型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體和豬紅斑丹毒絲菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗，其進(jìn)一步包含卵磷脂制備物和基于鋁佐劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗，其進(jìn)一步包含油包卵磷脂制備物。
全文摘要
公開了經(jīng)熱處理的菌苗、生產(chǎn)經(jīng)熱處理的菌苗的方法以及從這些經(jīng)熱處理的菌苗制備的豬乳劑疫苗。
文檔編號A61K39/02GK101903041SQ200880121714
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者M·D·古德伊爾, M·J·休特, N·L·歐伊恩, R·L·克萊布斯 申請人:輝瑞大藥廠