專利名稱：增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及類胡蘿卜素氧化產(chǎn)物用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途。
背景技術(shù)：
多細(xì)胞生物已經(jīng)發(fā)育成兩種對(duì)感染因素的一般性免疫系統(tǒng)。這兩種系統(tǒng)是先天免 疫或天然免疫(也被稱為“先天免疫”)和適應(yīng)性(后天或獲得性)免疫或特異性免疫。這 兩種系統(tǒng)之間的主要差異是它們識(shí)別感染因素的機(jī)制不同。先天免疫系統(tǒng)采用一套用于識(shí)別微生物中存在的保守分子模式的生殖系(或種 系)編碼的受體。在微生物的某些組分中出現(xiàn)的這些分子模式包括脂多糖類、肽聚糖類、 脂磷壁酸、卵磷脂、細(xì)菌特異性蛋白(包括脂蛋白)、細(xì)菌性DNA、病毒單鏈和雙鏈RNA、未甲 基化的CpG-DNA、甘露聚糖和各種其他細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁組件。這種分子模式也能夠出現(xiàn) 在其他分子(如植物生物堿)中。先天免疫識(shí)別的這些靶標(biāo)被稱為病原體相關(guān)的分子模式 (PAMP)，因?yàn)樗鼈兪怯晌⑸锂a(chǎn)生而不是通過感染的宿主生物產(chǎn)生。識(shí)別PAMP的先天免疫 系統(tǒng)的受體被稱為模式識(shí)別受體(PRR)(參見，Janeway et al.，Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54 1(1989) ；Medzhitov et al.，Curr. Opin. Immunol. 94 :4 (1997))。這些受 體的結(jié)構(gòu)不同而屬于幾個(gè)不同的蛋白家族。這些受體中的一些直接識(shí)別PAMP (例如，CD14、 DEC205、膠原凝集素)，而其他受體(例如，補(bǔ)體受體)識(shí)別通過PAMP識(shí)別產(chǎn)生的產(chǎn)物。一 般將這些受體家族的成員分成三種類型(1)在血漿中循環(huán)的體液受體；(2)在免疫細(xì)胞表 面上表達(dá)的胞吞受體(endocytic rec印tor)，和(3)能夠在細(xì)胞表面上或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的信 號(hào)受體° (Medzhitov et al. , Curr. Opin. Immunol. 94 4 (1997) ；Fearon et al. , Science 272 :50(1996))。細(xì)胞PRR在先天免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)，包括在適應(yīng)性免疫中起到專職抗原 呈遞細(xì)胞(APC)作用的細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和表面上皮細(xì)胞。這種表 達(dá)分布使得PRR能夠直接誘導(dǎo)先天效應(yīng)子機(jī)制，而且也能夠通過誘導(dǎo)一組內(nèi)源性信號(hào)的表 達(dá)(如下文中討論的炎性細(xì)胞因子和趨化因子)來警告宿主生物存在感染因素。后一種功 能使得效應(yīng)子力量被有效動(dòng)員起來與入侵者進(jìn)行戰(zhàn)斗。相對(duì)而言，僅在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)利用兩種類型的抗原受體，這 樣的受體是通過體細(xì)胞機(jī)制在每一個(gè)體生物的發(fā)育期間產(chǎn)生的。兩種類型的抗原受體是 T-細(xì)胞受體(TCR)和免疫球蛋白受體(IgR)，它們分別在兩種特異性的細(xì)胞類型(τ-淋巴 細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞)上表達(dá)。這些抗原受體的特異性在淋巴細(xì)胞成熟期間通過體細(xì)胞基 因重組、受體子單元的隨機(jī)配對(duì)的過程、以及通過在重組期間將核苷酸非模板依賴性地加 入到編碼區(qū)而隨機(jī)產(chǎn)生。先天免疫系統(tǒng)在控制適應(yīng)性免疫應(yīng)答開始和誘導(dǎo)合適的細(xì)胞效應(yīng)子應(yīng)答方面起 到關(guān)鍵作用(Fearon et al.，Science 272:50(1996))。現(xiàn)在已經(jīng)良好地確立天然Τ-淋 巴細(xì)胞的活化需要兩個(gè)不同的信號(hào)一個(gè)是通過TCR識(shí)別的特異性抗原肽，而另一個(gè)是所 謂的共刺激信號(hào)，Β7，其在APC上表達(dá)并通過在T-細(xì)胞上表達(dá)的⑶28分子識(shí)別(Lenschow
5et al.，Anna. Rev. Immunol. 14 :233(1996))。天然CD4+T-淋巴細(xì)胞的激活需要兩個(gè)信號(hào)， 特異性抗原和B7分子，都在相同的APC上表達(dá)。如果天然CD4T-細(xì)胞在不存在B7信號(hào)時(shí) 識(shí)別該抗原，則T-細(xì)胞會(huì)通過細(xì)胞凋亡而死亡。因此，B7分子在APC上的表達(dá)控制了天然 CD4T-淋巴細(xì)胞是否會(huì)被激活。因?yàn)镃D4T-細(xì)胞控制CD8T-細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞毒性功能的激活， 以及B-細(xì)胞對(duì)于抗體產(chǎn)生的激活，因此B7分子的表達(dá)決定了適應(yīng)性免疫應(yīng)答是否會(huì)被激 活。先天免疫系統(tǒng)在B7表達(dá)的控制中起到了關(guān)鍵作用(Fearon etal. ,Science 272 50(1996) ；Medzhitov et al. ,Cell 91:295(1997))。正如先前的所提及的，先天免疫識(shí)別 時(shí)由識(shí)別PAMP的PRR介導(dǎo)的。PAMP被PRR識(shí)別導(dǎo)致控制各種可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的基因(包括 編碼淋巴細(xì)胞如B7、細(xì)胞因子和趨化因子的激活所必需信號(hào)的基因)表達(dá)的信號(hào)通路的激 活(Medzhitov et al. ,Cell 91 295(1997) ；Medzhitov et al. ,Nature 388:394(1997))。 因此，在識(shí)別PAMP后，由PRR誘導(dǎo)的B7表達(dá)解釋說明了自我/非自我辨別并確保僅僅特異 于微生物衍生抗原的T-細(xì)胞被正常活化。這種機(jī)制通常阻止了特異于自體抗原的自動(dòng)反 應(yīng)淋巴細(xì)胞的活化。近來已經(jīng)確定了控制B7分子和細(xì)胞因子表達(dá)的先天免疫系統(tǒng)的受體。(Medzhitov et al. ,Nature 388:394(1997) ；Rock et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci USA,95 :588 (1998))。 這些受體屬于Toll-樣受體(TLRs)家族，如此稱謂是因?yàn)樗鼈兺从趨⑴c果蠅胚胎 的背腹圖案形成和成體蠅的免疫應(yīng)答的果蠅Toll蛋白(Lemaitre et al. , Cell86 973 (1996))。在哺乳動(dòng)物生物體中，已經(jīng)證明這樣的TLR識(shí)別PAMP，例如細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)PS、肽 聚糖和脂蛋白(Schwandner et al.，J. Biol. Chem. 274 17406 (1999) ；Yoshimura et al.， J. Immunol. 163 1(1999) ；Aliprantis et al.，Science 285:736(1999))。傳統(tǒng)上，疫苗已經(jīng)被用作一種保護(hù)機(jī)體以防止由于感染病原產(chǎn)生疾病的方式，并 且隨著疫苗技術(shù)的進(jìn)步，疫苗已經(jīng)用于其他應(yīng)用中，包括但不限于，控制哺乳動(dòng)物生育率、 調(diào)節(jié)激素作用、以及預(yù)防或治療腫瘤。用于保護(hù)機(jī)體對(duì)抗疾病的疫苗主要目的是誘導(dǎo)對(duì)特 定微生物的免疫記憶。更一般而言，需要疫苗來誘導(dǎo)對(duì)特異性抗原的免疫應(yīng)答，無論它們是 否屬于微生物或通過腫瘤細(xì)胞或其他患病的或異常細(xì)胞表達(dá)。具有特異于抗原的表面受體 的B-淋巴細(xì)胞和T-淋巴細(xì)胞的分裂和分化產(chǎn)生特異性和記憶。為了利用疫苗來誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，其必須滿足以下要求1)必須包括將會(huì)成 為接種疫苗后保護(hù)性免疫的靶標(biāo)的特異性抗原或其片段；2)必須以能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別 的形式，例如在免疫識(shí)別之前抵抗降解的形式呈遞這樣的抗原；和3)必須活化APC從而向 CD4+T-細(xì)胞呈遞抗原，而CD4+T-細(xì)胞又誘導(dǎo)B-細(xì)胞分化和其他免疫效應(yīng)子功能。傳統(tǒng)的疫苗含有減毒的或滅活的微生物(如病毒或細(xì)菌)而自身不能導(dǎo)致嚴(yán)重感 染但是當(dāng)接種至宿主中時(shí)能夠抵抗未經(jīng)修飾的(或有毒力的)物質(zhì)的懸浮液。該術(shù)語的用 法現(xiàn)在已經(jīng)延伸到包括基本上任何傾向于用于活性免疫預(yù)防(例如，有毒力的菌株的滅活 微生物或減毒(變異體或突變)菌株的活體微生物；微生物的、真菌的、植物的、原生動(dòng)物的 或多細(xì)胞動(dòng)物衍生物或產(chǎn)物；以及合成疫苗的制劑)的制劑。疫苗的實(shí)例包括但不限于，接 種用于抗天花的牛痘病毒、預(yù)防破傷風(fēng)的破傷風(fēng)類毒素、預(yù)防百日咳(百日咳)的完全滅活 的細(xì)菌、預(yù)防鏈球菌肺炎的多糖亞單元、和預(yù)防乙型肝炎的重組蛋白。盡管減毒疫苗通常是免疫原性的，但是因?yàn)槠湫芤话阈枰唧w詳細(xì)地了解毒力
6的分子決定子而其使其應(yīng)用受到限制。而且，在疫苗中使用減毒病原與各種風(fēng)險(xiǎn)因素有關(guān)， 這些風(fēng)險(xiǎn)因素在大多數(shù)情況下阻礙了其在人體中的安全使用。另一方面，合成疫苗的問題在于它們經(jīng)常是非免疫原性的或非保護(hù)性的。由于佐 劑自身產(chǎn)生的不可接受的副作用，通常不能使用可用的佐劑來提高合成疫苗的免疫原性。佐劑是提高抗原免疫原性的任何物質(zhì)。盡管如明礬之類的化學(xué)品經(jīng)常被用做佐 劑，但是它們的效果類似于載體，并且易于通過使抗原穩(wěn)定化和/或促進(jìn)它們與抗原呈遞 細(xì)胞的相互作用而發(fā)揮作用。最佳的佐劑是那些模擬微生物激活先天免疫系統(tǒng)的能力的 佐劑。純抗原并不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因?yàn)樗鼈儾荒苷T導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化所必需的共刺激信 號(hào)(例如，B7.1或B7.2)。因此，佐劑活性的關(guān)鍵機(jī)制歸因于通過承載屬于佐劑常規(guī)組分 的PAMP的微生物或類微生物組分誘導(dǎo)的共刺激信號(hào)(參見Janeway et al. ,Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54 :1 (1989))。如上文中討論的，PRR對(duì)這些PAMP的識(shí)別誘導(dǎo)了淋 巴細(xì)胞活化(如B7)和分化(效應(yīng)細(xì)胞因子)所必需的信號(hào)。向疫苗制劑中引入佐劑來增強(qiáng)免疫原性的益處必需針對(duì)這些藥劑將會(huì)誘導(dǎo)不良 的局部和/或系統(tǒng)反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)來衡量。局部不良反應(yīng)包括在注射部位發(fā)生局部發(fā)炎，以及 偶見的誘導(dǎo)產(chǎn)生肉芽腫或無菌膿腫的形成。在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中所觀察到佐劑的系統(tǒng)反應(yīng)包 括不適、發(fā)熱、佐劑關(guān)節(jié)炎和前葡萄膜炎(Allison et al.，Mol. Immunol. 28 =279(1991)； Waters et al.，Infect. Immun. ,51 =816(1986)) 這種反應(yīng)經(jīng)常可以是由于佐劑誘導(dǎo)的細(xì) 胞因子分布(profile)所致。因此，許多強(qiáng)效佐劑，如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，都 是有毒的，因而僅用于動(dòng)物研究目的，而不用于人類接種。目前，明礬已經(jīng)被批準(zhǔn)用作臨床佐劑，即使其具有相對(duì)有限的效能，因?yàn)槠洳皇窍?天免疫刺激劑并因此不會(huì)導(dǎo)致過度發(fā)炎。因此，仍然需要能夠提高抗原免疫原性而不會(huì)產(chǎn)生促炎性反應(yīng)的佐劑。而且也需 要能夠致敏或啟動(dòng)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，從而對(duì)宿主產(chǎn)生的感染產(chǎn)生更迅速和有效的 應(yīng)答，或增強(qiáng)抗生素效能的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素及其組分的組合物、方法和試劑盒。該 組合物能夠用于致敏受治療者的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)而由此能夠用于治療感染或在免 疫作用中作為佐劑。在第一方面，本發(fā)明的特征在于一種通過向受治療者以足以治療感染的量給予氧 化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分類似治療患有該感染的受治療者的方法。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于一種通過向受治療者以足以治療感染的量給 予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分來治療患有該感染或具有患上該感染的風(fēng)險(xiǎn)的人類受 治療者的方法。在另一相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于一種通過向受治療者以足以治療該感染的 量給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分來治療患有該感染或具有患上該感染的風(fēng)險(xiǎn)的受 治療者的方法，其中氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分經(jīng)由靜脈內(nèi)、眼部、肌肉內(nèi)、局部地、皮 下、或鼻內(nèi)進(jìn)行給藥。本發(fā)明的特征在于一種通過向受治療者以有效量給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或
7其組分而增強(qiáng)患有感染的受治療者體內(nèi)的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明的其他特征在于一種通過向人類受治療者以有效量給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡 蘿卜素或其組分而增強(qiáng)患有感染或具有患有感染危險(xiǎn)的人類受治療者體內(nèi)的免疫應(yīng)答的 方法。本發(fā)明進(jìn)一步的特征在于一種通過向人類受治療者以有效量給予氧化轉(zhuǎn)化的類 胡蘿卜素或其組分而增強(qiáng)患有感染或具有患有感染危險(xiǎn)的人類受治療者體內(nèi)的免疫應(yīng)答 的方法，其中氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分經(jīng)由靜脈內(nèi)、眼部、肌肉內(nèi)、局部地、皮下或鼻 內(nèi)進(jìn)行給藥。在以上方法的某些實(shí)施方式中，感染是由細(xì)菌、病毒、真菌、或寄生蟲引起的。例 如，該感染能夠是社區(qū)獲得性肺炎、上呼吸道和下呼吸道感染、皮膚和軟組織感染、急性細(xì) 菌性中耳炎、細(xì)菌性肺炎、并發(fā)感染、腎盂腎炎、腹腔內(nèi)感染、細(xì)菌性敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng) 感染、菌血癥、外傷感染、腹膜炎、腦膜炎、燒傷后感染、泌尿生殖道感染、盆腔炎、心內(nèi)膜炎 或血管內(nèi)感染。該氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分能夠眼部給藥而用于治療眼睛感染。在 另一實(shí)施方式中，該氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分經(jīng)由局部給予至受治療者的口腔以用 于治療口腔感染。在以上方法的其他實(shí)施方式中，受治療者還沒有診斷出患有感染，但是具有患上 感染的風(fēng)險(xiǎn)?？商娲?，該方法用于治療患有感染的受治療者。在任何以上方面的某些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括向受治療者給予抗生素， 其中該氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分與抗生素同時(shí)給予或在給予的14天、10天、7天或 3天內(nèi)分別給予。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明的特征在于一種增強(qiáng)經(jīng)免疫的受治療者對(duì)抗原的適應(yīng) 性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括(i)向受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其 組分，和(ii)向受治療者給予抗原，其中在抗原給予之前給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其 組分。本發(fā)明的其他特征在于一種增強(qiáng)經(jīng)免疫的人類受治療者對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng) 答的方法，該方法包括向受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。本發(fā)明進(jìn)一步的特征在于一種增強(qiáng)經(jīng)免疫的受治療者對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答 的方法，該方法包括向受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，其中該氧 化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分經(jīng)由靜脈內(nèi)、眼部、肌肉內(nèi)、局部地、皮下或鼻內(nèi)給予。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于一種用于增強(qiáng)經(jīng)免疫的受治療者對(duì)抗原的 適應(yīng)性免疫應(yīng)答的試劑盒，包括(i)包括氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的藥物組合物； (ii)包括抗原的藥物組合物；和(iii)給予所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分、以及抗 原從而使受治療者被免疫的說明。在涉及增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的任何以上方法或試劑盒中，抗原能夠來自于，例如 病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲。在某些實(shí)施方式中，抗原是糖類(或碳?xì)浠衔?、糖 脂、糖蛋白、脂質(zhì)、蛋白、脂蛋白、磷脂、或多肽。病原能夠是，例如，活病毒或減毒的活病毒。 在一些實(shí)施方式中，病原體是炭疽、流行性感冒、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、狂犬病或本文中描述的 任何病原體。在涉及增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的任何以上方法或試劑盒中，能夠在給予抗原的14天、10天、8天，6天、4天、3天、2天或甚至1天內(nèi)給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。在 某些實(shí)施方式中，在給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分之前給予抗原。在其他實(shí)施方式 中，在給予抗原之前給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。在還有的另一實(shí)施方式中，氧化 轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分與抗原同時(shí)給藥。在相關(guān)的方面，本發(fā)明的特征在于一種包括氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分和抗 原的藥物組合物。該藥物組合物能夠配制成，例如，用于口服、經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼部、局部 地、皮下或鼻內(nèi)給藥。在某些實(shí)施方式中，抗原能夠來自于，例如病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌 或寄生蟲。在某些實(shí)施方式中，抗原是糖類(或碳?xì)浠衔?、糖脂、糖蛋白、脂質(zhì)、蛋白、脂 蛋白、磷脂、或多肽。病原體能夠是，例如，活病毒或減毒的活病毒。在一些實(shí)施方式中，病 原體是炭疽、流行性感冒、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、狂犬病或本文中描述的任何病原體。在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種試劑盒，包括(i)包括氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜 素或其組分的藥物組合物；和(ii)給予該組合物來治療患有感染或具有患上感染風(fēng)險(xiǎn)的 受治療者的說明。在某些實(shí)施方式中，感染是由細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲引起的。例如，感 染能夠是社區(qū)獲得性肺炎、上呼吸道和下呼吸道感染、皮膚和軟組織感染、急性細(xì)菌性中耳 炎、細(xì)菌性肺炎、并發(fā)感染、腎盂腎炎、腹腔內(nèi)感染、細(xì)菌性敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、菌血 癥、外傷感染、腹膜炎、腦膜炎、燒傷后感染、泌尿生殖道感染、盆腔炎、心內(nèi)膜炎或血管內(nèi)感 染。在其他實(shí)施方式中，該試劑盒還包括向受治療者給予抗生素的說明。本發(fā)明的其他特征在于一種包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的牙膏。這種牙 膏能夠與任何適用于制作牙膏的輔料進(jìn)行配制，如本文中所描述的那些。本發(fā)明的特征還在于一種包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的漱口水。這種漱 口水能夠與任何適用于制作漱口水的輔料進(jìn)行配制，如本文中所描述的那些。本發(fā)明的特征還在于一種包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的藥物組合物，并 配制成用于向眼睛給藥。該藥物組合物能夠是，例如，滴眼液、眼藥膏、眼用軟膏、眼用噴霧 劑、結(jié)膜下注射劑、或玻璃體內(nèi)注射劑、隱形眼鏡、結(jié)膜插入物、或眼內(nèi)插入物。該藥物組合 物能夠與已知適用于制備向眼睛遞送的制劑的任何賦形劑進(jìn)行配制，如本文中所描述的那 些賦形劑。在任何以上的方法、組合物和試劑盒中，氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，能夠包 括氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的聚合組分。在其他實(shí)施方式中，該氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或 其組分包括的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素組分，包括2-甲基-6-氧代-2，4-庚二烯醛、二氫 獼猴桃醇內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮5，6_環(huán)氧化物(i3-ionone5， 6-印oxide)、4_ 氧代-β -紫羅蘭酮、β -紫羅蘭亞基乙醛(β -ionylideneacetaldehyde)、 β-紫羅蘭亞基乙醛 5，6-環(huán)氧化物(β-ionylideneacetaldehyde 5，6-印 oxide)、4_ 氧 代-β -紫羅蘭亞基乙醛、β _脫-13-類胡羅卜酮(β -apo-13-carotenone)、β -脫-13-類 胡羅卜酮 5，6-環(huán)氧化物(β -apo-13-carotenone 5，6_印oxide)、4-氧代-β -脫-13-類 胡羅卜酮(4-οχο-β -apo-13-carotenone)、視黃醛、視黃醛5，6_環(huán)氧化物、或它們的混合 物。在還有的其他實(shí)施方式中，氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，包括2-甲基-6-氧代-2， 4_庚二烯醛。理想地，這種氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分是氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素。在 某些實(shí)施方式中，這種氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素是胡羅卜素、番茄紅素、視黃酸、或角黃 素的氧化產(chǎn)物。
在任何以上的方法、組合物和試劑盒中，氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分能夠通 過口服、經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼部、局部地、皮下、鼻內(nèi)或通過本文中描述的任何其他給藥途 徑進(jìn)行給藥。在任何以上的方法、組合物和試劑盒中，受治療者能夠是人、馴養(yǎng)寵物(例如，狗、 貓、馬、或鳥)或農(nóng)用牲畜，包括例如，羊、豬，牛(例如，奶牛或菜牛)、家禽(例如，火雞或雛 雞)或魚(例如，羅非魚、鯰魚、鱒魚或鮭魚)。如本文中所使用的，“有效量”是指致敏受治療者的先天或適應(yīng)性免疫系統(tǒng)從而增 強(qiáng)對(duì)感染的免疫應(yīng)答的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的量。“足量”是指用于治療或預(yù)防感染或與感染有關(guān)的疾病的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素 或其組分所需的量。用于實(shí)施本發(fā)明以治療性或預(yù)防性治療由感染或由感染所致疾病的本 發(fā)明的藥物組合物的有效量根據(jù)給藥的方式、受治療者的年齡、體重和總體健康狀況而有 所不同。最后，主治醫(yī)師或獸醫(yī)將會(huì)決定合適的用量和劑量方案。這樣的量被稱為“足量”。如本文中所使用的，“類胡羅卜素”是指那些能夠在植物、藻類、細(xì)菌和某些動(dòng) 物(如鳥類和甲殼類動(dòng)物)中發(fā)現(xiàn)的萜類化合物組的天然顏料。類胡蘿卜素包括屬于烴 類物質(zhì)(即，無氧)的胡羅卜素、和其氧化的衍生物(即，葉黃素)。類胡蘿卜素的實(shí)例 包括番茄紅素；β _胡羅卜素；玉米黃素；海膽酮；異玉米黃素；奸青素；角黃素；葉黃素； 桔黃素(citranaxanthin) ； β -脫_8 ‘-胡羅卜素酸乙酯；羥基類胡蘿卜素，如異黃素 (alloxanthin)、阿撲胡蘿卜醇(apocaroteno)、蝦紅素、蝦青素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、胡 羅卜素二醇、胡羅卜素三醇、胡蘿卜醇、隱黃素、癸異戊二烯黃素(decaprenoxanthin)、副 葉黃素、藻褐素、羥基胡羅卜素酮、羥基海膽酮、羥基番茄紅素、葉黃素、番茄黃素、鏈孢紅素 (neurosporine)、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、紫菌紅素乙、球形紅極毛桿菌烯、圓酵母素 (torulene)、堇黃素、和玉米黃素；和羧基類胡蘿卜素，如阿撲胡羅卜素酸、β _脫_8'-胡 羅卜素酸、杜鵑紅素、紅木素、羧基胡羅卜素、藏花酸、二阿撲胡羅卜素酸、鏈孢霉黃素、降胭 脂樹素、和番茄紅素酸。如本文中所使用的，“組分”是指氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素混合物的活性氧化的組 分，包括選自2-甲基-6-氧-2，4-庚二烯醛、二氫獼猴桃醇內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅 蘭酮、β-紫羅蘭酮5，6_環(huán)氧化物、4-氧代-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭亞基乙醛、β-紫 羅蘭亞基乙醛5，6_環(huán)氧化物、4-氧代-β-紫羅蘭亞基乙醛、β-脫-13-類胡羅卜酮、 β-脫-13-類胡羅卜酮5，6_環(huán)氧化物、4-氧代-β-脫-13-類胡羅卜酮、視黃醛和視黃 醛5，6_環(huán)氧化物；及它們的混合物的聚合物物質(zhì)或化合物。氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的 組分是活性的，因?yàn)樗鼈兡軌蛑委焺?dòng)物中的感染或增強(qiáng)其免疫應(yīng)答。實(shí)施例中提供了評(píng) 價(jià)氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的特定部分是否能夠治療感染和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。將 氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素混合物分餾成各個(gè)組分的方法描述于美國專利第5，475，006號(hào)和 U. S. S. N. 08/527, 039中，它們均結(jié)合于本文中作為參考。如本文中所使用的，“增強(qiáng)免疫應(yīng)答”是指如本文中所描述的，與治療之前的同 一受治療者相比，用氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分治療的受治療者中CD14表達(dá)增加或 THP-I細(xì)胞中的吞噬活性增加?！案腥尽笔侵肝⑸?例如，細(xì)菌、真菌或病毒)對(duì)宿主的侵襲。例如，感染可以包 括正常存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)或體表的微生物的過度生長或非正常存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)或體表的微生物的生長。更一般而言，感染能夠是微生物群落的存在對(duì)于宿主身體損傷的任 何狀況。在一些情況下，微生物生長可以是適度的，但是損傷由微生物產(chǎn)生的各種毒性成分 引起。在很少見的情況下，微生物在宿主外生長，產(chǎn)生的毒素被吸收并且損傷完全是由于這 種微生物毒素的活性所導(dǎo)致的。因此，當(dāng)微生物群落過量存在于受治療者體內(nèi)或體表時(shí)，或 當(dāng)微生物群落的存在破壞了受治療者的細(xì)胞或其他組織時(shí)，受治療者就“患有”感染。如本文中所使用的，“氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素”是指已經(jīng)與高達(dá)6 Smol當(dāng)量的 氧或來自另一種氧化劑的等量氧反應(yīng)，而得到非常低分子量的氧化性分裂產(chǎn)物(oxidative cleavage product)和較大比例的聚合物物質(zhì)(或大分子物質(zhì))(即，分子量超過1，000道 爾頓的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的組分)的混合物的類胡蘿卜素。所產(chǎn)生的反應(yīng)生成了包含 分子量范圍為約100 8，000道爾頓的分子物質(zhì)的混合物。該聚合物物質(zhì)被認(rèn)為是由所 生成的各種氧化的碎片發(fā)生許多可能的化學(xué)重組而生成的。美國專利第5，475，006號(hào)和 U. S. S. N. 08/527，039中描述了制備氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的方法，它們均結(jié)合于本文中作 為參考。如本文中所使用的，術(shù)語“OxBC”尤其是指衍生自胡羅卜素的氧化轉(zhuǎn)化的類胡 蘿卜素?！八幬锝M合物”是指含有氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，并以符合政府機(jī)構(gòu)規(guī)定 的藥物作為治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物疾病的治療方案的部分進(jìn)行生產(chǎn)和銷售的要求(例如，根 據(jù)GMP法規(guī)進(jìn)行生產(chǎn)并適用于向人類給藥)的方式與一種或多種藥物級(jí)賦形劑進(jìn)行配制的 組合物。藥物組合物能夠配制成，例如，以單位劑量形式口服給藥(例如，片劑、膠囊劑、囊片、 軟膠囊或糖漿劑)；局部給藥(例如，作為乳膏劑、凝膠劑、洗劑或軟膏劑)；經(jīng)靜脈給藥(例如， 無顆粒栓塞的無菌溶液和適用于靜脈使用的溶劑體系)；或本文中描述的任何其他制劑?！笆苤委熣摺笔侵溉魏渭棺祫?dòng)物，包括但不限于，人、狗、貓、馬、羊、豬、牛、家禽、和 佳.ο如本文中所使用的，術(shù)語“治療”是指出于預(yù)防和/或治療目的而給予藥物組合 物?！邦A(yù)防疾病”是指對(duì)還沒有患病但易于患病或具有患某種具體疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受治療者的 預(yù)防性治療?！爸委熂膊　被颉爸委熜蕴幚怼钡膽?yīng)用是指對(duì)已經(jīng)患有疾病的受治療者進(jìn)行治 療以改善或穩(wěn)定受治療者的病況。因此，在權(quán)利要求和實(shí)施方式中，治療是出于治療或預(yù)防 目的向受治療者給藥。如本文中所使用的，“具有...的風(fēng)險(xiǎn)”是指受治療者有受感染的傾 向。受治療者能夠有受感染的傾向是由于例如(i)免疫系統(tǒng)較弱(即，免疫妥協(xié)的受治療 者)或(ii)暴露于微生物(即，由于手術(shù)過程、與公眾的日常接觸如與學(xué)校的教師或健康 工人接觸、或暴露于致病/感染環(huán)境)。U. S. S. N. 08/527，039中已經(jīng)報(bào)道了 2_甲基_6_氧代_2，4_庚二烯醛的合成和純 化。2003年5月22日公開的U. S. S. N. 10/196，695中提供了用于制備2-甲基-6-氧代-2， 4-庚二烯醛的更為方便的五步合成方案。本發(fā)明的組合物和方法能夠用于致敏受治療者對(duì)感染的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。本發(fā)明其他特征和優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)以下的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求而變得顯而易 見。


圖1是描述在用OxBC處理之前，用LPS培養(yǎng)的原發(fā)性外周血單核細(xì)胞(PBM)中的
11TNF(A)、IL-I β (B)和IL-6(C)水平的圖表。在用所指示濃度的OxBC處理之前用LPS(15ng/ ml)培養(yǎng)原發(fā)性PBM 24h。24h之后，收獲CM并通過ELISA(*p < 0. 05，**p < 0. 02，學(xué)生t_檢 驗(yàn))檢測(cè)TNF(A)、IL-I β (B)和IL-6(C)的水平。暴露于LPS的純化的人單核細(xì)胞通過炎 性細(xì)胞因子IL-I β的表達(dá)增加而響應(yīng)于用OxBC的處理，這間接表明OxBC能夠增強(qiáng)對(duì)于微 生物感染的應(yīng)答。圖2是描述在用OxBC處理之前用LPS培養(yǎng)的原發(fā)性PBM中的IL_8 (A)和IL-12 (B) 水平的圖表。在用所指示濃度的OxBC處理之前用LPS(15ng/ml)培養(yǎng)原發(fā)性PBM 24h。24h 之后，收獲CM并通過ELISA (*p < 0. 05廣ρ < 0. 01，學(xué)生t_檢驗(yàn))檢測(cè)IL_8 (A)和IL-12 (B) 的水平。調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(regulatory cytokine) IL-8的表達(dá)在用LPL激發(fā)后暴露于OxBC 的人單核細(xì)胞中上升，這間接表明OxBC能夠使抗微生物活性增加。圖3是描述在OxBC-處理的THP-I細(xì)胞中⑶14表達(dá)的圖表。THP-1單核細(xì)胞用 所指示濃度的OxBC或DMSO對(duì)照培養(yǎng)。在24h后處理時(shí)進(jìn)行FACS分析。數(shù)值表示相對(duì)于 DMSO對(duì)照的倍數(shù)變化。佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)以25ng/ml使用Γρ < 0. 001，學(xué)生t 檢驗(yàn)vs. DMSO對(duì)照)。OxBC促進(jìn)⑶14(其是一種結(jié)合于微生物組件的受體)的表達(dá)，并引 發(fā)對(duì)感染的先天免疫應(yīng)答。圖4是描述OxBC-處理的THP-I細(xì)胞中⑶40L和⑶86的表達(dá)的圖表。THP-I單核 細(xì)胞用所指示濃度的OxBC或DMSO對(duì)照培養(yǎng)。在24h后處理時(shí)進(jìn)行FACS分析。數(shù)值表示相 對(duì)于DMSO對(duì)照的倍數(shù)變化。佛波醇肉豆蔻酸酸乙酸酯(PMA)以25ng/ml使用Γρ < 0. 005， **Ρ < 0. 001，學(xué)生t檢驗(yàn)vs. DMSO對(duì)照)。OxBC使與抗原呈遞和淋巴細(xì)胞應(yīng)答的刺激有關(guān) 的表面受體表達(dá)增加，因此提高了響應(yīng)于免疫激發(fā)的單核細(xì)胞活性。圖5是描述在OxBC處理和LPS激發(fā)之后在THP-I細(xì)胞中分化抗原表達(dá)的圖表。 THP-I單核細(xì)胞用所指示濃度的OxBC或DMSO對(duì)照培養(yǎng)24h，然后在5天后用15ng/ml的LPS 激發(fā)。數(shù)值表示相對(duì)于未用OxBC處理的對(duì)照的倍數(shù)變化Cp < 0. 02，學(xué)生t檢驗(yàn)vs.未處 理的對(duì)照)。在用LPS激發(fā)之前用低濃度OxBC處理單核細(xì)胞對(duì)涉及先天免疫的受體表達(dá)沒 有顯著影響。圖6是描述在OxBC處理和LPS激發(fā)之后在THP-I細(xì)胞中共刺激分子表達(dá)的圖 表。THP-I單核細(xì)胞用所指示濃度的OxBC或DMSO對(duì)照培養(yǎng)24h，然后在5天后用15ng/mL LPS激發(fā)。數(shù)值表示相對(duì)于未用OxBC處理的對(duì)照的倍數(shù)變化Γρ < 0. 05廣ρ < 0. 005,***ρ <0.001，學(xué)生t檢驗(yàn)vs.未處理對(duì)照)。采用低濃度OxBC處理傾向于增強(qiáng)單核細(xì)胞參與 誘導(dǎo)對(duì)微生物的適應(yīng)性應(yīng)答的能力。圖7是描述OxBC處理的THP-I細(xì)胞中的吞噬作用的圖表。THP-I單核細(xì)胞用所指 示濃度的OxBC或DMSO對(duì)照培養(yǎng)24h，并隨后僅在培養(yǎng)基中恢復(fù)24h。在恢復(fù)期之后評(píng)價(jià)吞 噬作用。數(shù)值表示相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)變化。以25ng/ml使用PMA。< 0. 05，**p < 0. 02，
< 0.002，學(xué)生t檢驗(yàn)vs.對(duì)照。OxBC使THP-I細(xì)胞中的吞噬活性明顯提高，這間接表 明抗微生物活性提高。圖8是描述OxBC處理和LPS刺激的THP-I細(xì)胞中的吞噬作用的圖表。在用 LPS (15ng/ml)處理之前，用所指示濃度的OxBC或DMSO對(duì)照培養(yǎng)THP-I單核細(xì)胞24h。在 LPS刺激之后24h評(píng)價(jià)吞噬作用。數(shù)值表示相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)變化。以25ng/mL使用PMA。 *p < 0. 05，**p < 0. 02，***p < 0. 002，學(xué)生 t 檢驗(yàn) vs.對(duì)照。用 OxBC 處理的 THP-I 細(xì)胞在用LPS激發(fā)后比未處理的對(duì)照表現(xiàn)出更大的吞噬活性。圖9是描述OxBC-處理和LPS刺激的原發(fā)性PBM中吞噬作用的圖表。在用 LPS(15ng/ml)處理之前，用所指示濃度的OxBC或DMSO對(duì)照培養(yǎng)原發(fā)性PBM 24h。在LPS 刺激之后24h評(píng)價(jià)吞噬作用。數(shù)值表示相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)變化。以25ng/ml使用PMA。
< 0. 05，***p < 0. 002，學(xué)生t檢驗(yàn)vs.對(duì)照。原發(fā)性人單核細(xì)胞通過響應(yīng)LPS刺激提高其 吞噬活性而響應(yīng)于OxBC處理。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了用于給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素及其組分的組合物、方法和試劑 盒。該組合物能夠適用于致敏受治療者對(duì)感染的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。療法本發(fā)明的特征在于致敏受治療者對(duì)感染的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的方法。根據(jù)本發(fā)明的療法可以單獨(dú)實(shí)施或與另一療法結(jié)合實(shí)施(即，與抗生素治療組 合)并可以在家庭、醫(yī)生辦公室、臨床診室、醫(yī)院門診或醫(yī)院提供。該療法的持續(xù)時(shí)間取決 于所治療的疾病或障礙的類型、患者的年齡和病況、患者的疾病的階段和類型、以及患者對(duì) 治療的響應(yīng)程度。治療微生物感染本發(fā)明的方法和組合物能夠用于治療，例如，呼吸道感染、急性細(xì)菌性中耳炎、細(xì) 菌性肺炎、尿路感染、并發(fā)感染、腎盂腎炎、腹腔內(nèi)感染、細(xì)菌性敗血癥、皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感 染、軟組織感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、菌血癥、外傷感染、腹膜炎、腦膜炎、燒傷后感染、泌尿 生殖道感染、盆腔炎、心內(nèi)膜炎、血管內(nèi)感染、以及本文中描述的任何其他感染。提高抗原的免疫原性本發(fā)明的方法和組合物能夠用于提高抗原的免疫原性(即，在免疫接種中用作佐 劑)。受治療者可以對(duì)其免疫的疾病包括所有能夠通過免疫化得到治療或預(yù)防的疾病，如病 毒性疾病、過敏癥狀、由細(xì)菌或進(jìn)入通過粘膜表面進(jìn)入或移植粘膜表面上的其他病原體所 致的疾病、AIDS、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、以及癌癥。可以采用本發(fā)明治療或預(yù) 防的病毒感染的實(shí)例包括DNA病毒(如EBV和VZV)的感染，尤其是皰疹病毒(例如HSV和 HCMV)、腺病毒、乳多空病毒(如HPV)、乙型肝炎病毒(如HBV)的感染；RNA病毒(如微小核 糖核酸病毒)的感染，尤其是小兒麻痹病毒(polivirus)和HAV、鼻病毒和FMDV、披膜病毒、 黃病毒、冠狀病毒、副粘病毒(如RSV)、正粘病毒(如流行性感冒病毒)、和逆轉(zhuǎn)錄病毒，尤 其是HIV。組合療法本發(fā)明的方法、試劑盒和組合物也可以包括抗生素。例如，氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜 素或其組分可以與選自但不限于以下的抗生素一起給予胺基糖苷類，如阿米卡星、安普霉 素、阿貝卡星、班貝霉素、布替羅星、地貝卡星、雙氫鏈霉索、阿司霉素(類)、硫酸新霉素、 慶大霉素、異帕米星(ispamicin)、卡那霉素、小諾霉素、新霉素、新霉素十一烯酸酯、奈替 米星、巴龍霉素、核糖霉素、西索米星、大觀霉素、鏈霉素、鏈霉素異煙胼、和妥布霉素；氯霉 素類(amphenicols)，如疊氮氯霉素、氯霉素、氯霉素棕櫚酸酯、氯霉素泛酸酯、氟苯尼考、 和甲砜霉素；安沙霉素類，如利福平、利福布丁、利福噴丁、和利福昔明；β -內(nèi)酰胺類，如美西林、氮卓西林、頭孢特侖(Pivoxil)、阿莫西林、氨芐西林、阿撲西林、疊氮西林、阿洛西 林、巴氨西林、芐青霉素酸、青霉素、羧芐西林、卡非西林、卡茚西林、氯甲西林、氯唑西林、環(huán) 西林、雙氯己西林、聯(lián)苯青霉素(diphenicillin)、依匹西林、芬貝西林、floxicillin、海他 西林、侖氨西林、美坦西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、培那西林、氫碘酸噴 沙西林(penethamate hydriodide)、苯乙芐胺青霉素G、芐星青霉素G、二苯甲胺青霉素G、 青霉素G鈣、海巴明青霉素G(peniCillin G hydragamine)、青霉素G鉀、青霉素G、普魯卡 因、青霉素N、青霉素0、青霉素V、芐星青霉素V、海巴明青霉素V、青哌環(huán)素、苯氧乙基青霉 素、哌拉西林、匹凡西林(pivapicillin)、丙匹西林、喹那西林、磺芐西林、酞氨西林、替莫 西林和替卡西林；碳青霉烯類、如亞胺培南；頭孢菌素類、如1-碳代(去硫雜)頭孢菌素、 頭孢克羅(cefactor)、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢曲嗪、頭孢西酮、頭孢唑啉、頭孢克肟、 頭孢甲肟、頭孢地嗪、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢替安、頭孢咪唑、頭孢 匹胺(cefpirimide)、頭孢泊肟酯、頭孢沙定、頭孢磺啶、頭孢他啶、頭孢特侖、頭孢替唑、頭 孢布坦、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢唑南、頭孢乙腈鈉、頭孢氨芐、頭孢來星、頭孢 噻啶、頭孢菌素、頭孢噻吩、頭孢匹林鈉、頭孢霉定、pivcefalexin、頭孢噻吩、頭孢克洛、頭 孢替坦、頭孢丙烯、氯碳頭孢、頭孢米諾和頭孢吡肟；頭霉素類、如頭孢拉宗、頭孢美唑、頭孢 米諾、頭孢替坦(cefetan)、和頭孢西丁 ；單環(huán)β -內(nèi)酰胺類、如氨曲南、卡魯莫南和替格莫 南；氧頭孢烯類、如氟氧頭孢和拉氧頭孢；林可胺類、如克林霉素和林可霉素；大環(huán)內(nèi)酯類、 如阿奇霉素、卡波霉素、甲紅霉素、紅霉素及衍生物、交沙霉素、北里霉素、麥迪霉素、米歐卡 霉素、竹桃霉素、普利霉素、羅他霉素、羅沙米星、羅紅霉素、乙酰螺旋霉素和醋竹桃霉素；多 肽類、如安福霉素、桿菌肽、卷曲霉素、多粘霉素、恩拉霉素、恩洛霉素(enylomycin)、夫莎芬 凈、短桿菌肽、短桿菌肽S、米加霉素、多粘菌素、多粘菌素β -甲磺酸、普那霉素、瑞斯托菌 素、太古霉素、硫鏈絲菌素、結(jié)核放線菌素、短桿菌酪肽、酪毛霉素、萬古霉素、紫霉素、維吉 尼霉素和桿菌肽鋅；四環(huán)素類、如斯匹環(huán)素(spicycline)、氯四環(huán)素、氯摩四環(huán)素、地美環(huán) 素、多西環(huán)素、胍甲環(huán)素、賴氨四環(huán)素、甲氯環(huán)素、甲烯土霉素、米諾環(huán)素、氧四環(huán)素、青哌環(huán) 素、匹哌環(huán)素、羅利環(huán)素、山環(huán)素、琥珀酸氯霉素吡甲四環(huán)素和四環(huán)素；和2，4_ 二氨基嘧啶 類、如溴莫普林、四氧普林和甲氧芐啶；硝基呋喃類、如呋喃他酮、呋唑銨鹽、硝呋拉定、硝呋 特爾、硝呋復(fù)林、呋喃那斯、硝呋拉嗪、硝呋妥因醇和呋喃坦??；喹諾酮類、如氫氟沙星、西諾 沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星、依諾沙星、多氟沙星、氟甲喹、洛美沙星、米洛沙星、萘啶酸、諾氟 沙星、氧氟沙星、噁喹酸、培氟沙星、吡哌酸、吡咯米酸、羅索沙星、替馬沙星和妥舒沙星；磺 胺類藥、如乙?；前芳籽踹拎骸⒁阴；前樊悋f唑、偶氮磺酰胺、芐磺酰胺、氯胺-β、氯胺-τ、 二氯胺-Τ、甲醛磺噻唑、Ν2-甲酸基-磺胺索嘧啶、Ν4-β-D-葡糖基磺胺、磺胺米隆、烏利龍、 對(duì)硝基磺胺噻唑、諾丙磺胺、酞磺醋胺、酞磺胺噻唑、柳氮磺胺嘧啶、琥磺噻唑、苯?；前?、乙 酰磺胺、磺胺氯達(dá)嗪、磺胺柯衣酸、磺酰乙胞嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺戊烯、碘胺二甲氧噠嗪、磺 胺多辛、磺胺乙二唑、磺胺脒、磺胺二甲 唑脒、磺胺林、磺胺洛西酸、磺胺二甲基嘧啶、磺胺 對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧甲嘧啶、新諾明、磺胺甲氧[達(dá)]嗪、磺胺 曲羅、磺胺柯衣定、磺胺噁唑、磺胺、磺胺甲磺酸三乙醇胺鹽、4-磺胺水楊酸、Ν4-磺胺酰磺 胺、磺酰脲、N-磺胺酰-3，4-丙谷胺、磺胺硝苯、磺胺-5-甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺普羅林、 磺胺吡嗪、磺胺吡啶、磺胺異噻唑、磺胺均三嗪、磺胺噻唑、磺胺硫脲、硫胺托拉米、磺胺索嘧 啶和硫代異噁唑；砜類、如醋氨苯砜、醋地砜、磺胺苯砜、氨苯砜、地百里砜、葡胺苯砜、苯丙
14砜、琥珀氨苯砜、磺胺酸、對(duì)磺酰胺芐胺、P，P'-磺酰二苯胺-N，N' _氨苯砜雙半乳糖苷、 阿地砜和噻唑砜；脂肽類、如達(dá)托霉素；呃唑烷酮類、如采福適；酮內(nèi)酯類、如泰利霉素；和 各種抗生素、如氯?？朔?、海克西定、蛙皮素、六亞甲四胺、六亞甲四胺無水甲叉檸檬酸酯、 馬尿酸烏洛托品、扁桃酸烏洛托品、烏洛托品堿式水楊酸鹽、硝羥喹啉、角鯊多胺、希波酚、 環(huán)絲氨酸、莫匹羅星和馬鈴薯球蛋白。對(duì)于增強(qiáng)抗生素對(duì)微生物耐藥性菌株的效能、經(jīng)過抗 生素處理時(shí)降低形成微生物耐藥性菌株的可能性、和/或降低抗生素的載荷而言，氧化轉(zhuǎn) 化的類胡蘿卜素或其組分與抗生素的療法的組合使用能夠是合乎需要的。這能夠通過用氧 化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分來增強(qiáng)宿主對(duì)微生物的免疫應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)。給藥和制劑本發(fā)明的特征在于致敏受治療者對(duì)感染的先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組合物、試劑 盒和方法。對(duì)于氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素，典型的劑量范圍是約5yg/kg體重/天 約50mg/ kg體重/天。理想地，給藥的劑量為5 μ g/kg體重/天 5mg/kg體重/天，或5 μ g/kg體 重/天 0.5mg/kg體重/天。對(duì)于氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的組分，典型的劑量范圍是約 0. 05 μ g/kg體重/天 約500 μ g/kg體重/天。理想地，給藥劑量為0. 05 μ g/kg體重/ 天 50 μ g/kg體重/天或0. 05 μ g/kg體重/天 5 μ g/kg體重/天。給予氧化轉(zhuǎn)化的類 胡蘿卜素或其組分的劑量可能取決于諸如動(dòng)物的物種、飲食、和年齡這些變量。標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn) 方法，如實(shí)施例1中描述的那些，可以用于優(yōu)化氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的劑量和 劑量頻率。氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分可以與藥用稀釋劑、載體或賦形劑一起向人類、 家養(yǎng)寵物、家畜、或其他動(dòng)物給藥。給藥可以是局部施用、非腸道、經(jīng)靜脈、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌 肉內(nèi)、顱內(nèi)、眼眶內(nèi)、眼部、心室內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣溶膠、通過栓劑或 口服給藥。在某些制劑中，以單位劑量形式提供該氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。治療制劑可以是液體溶液或懸浮液形式；對(duì)于口服給藥，制劑可以是片劑或膠囊 劑的形式；而對(duì)于鼻內(nèi)制劑，可以是粉末、鼻滴液、耳滴液或氣溶膠的形式。本領(lǐng)域內(nèi)配制制劑的眾所周知的方法可以在文獻(xiàn)，例如，“Remington :The Science and Practice of Pharmacy " (20th ed. , ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins)中找到。非腸道給藥的制劑可以，例如，含有賦形劑、無菌水或鹽水、 聚烷二醇如聚乙二醇，植物源性的油、或氫化萘類。生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合 物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的釋放。納 米顆粒制劑(例如，可生物降解的納米粒子、固體脂質(zhì)納米顆粒、脂質(zhì)體)可以用于控制化 合物的生物分布。其他潛在有用的非腸道遞送體系包括乙烯_醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲 透泵、可植入輸注系統(tǒng)、和脂質(zhì)體。對(duì)于吸入劑可以含有賦形劑(例如乳糖)，或可以是含有 例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、乙醇酸酯(鹽)和脫氧膽酸酯(鹽)的水性溶液，或可以是以 鼻滴液形式給予的油性溶液，或作為凝膠。制劑中化合物的濃度根據(jù)許多因素而有所不同， 這些因素包括所給予藥物的劑量，以及給藥途徑。在式I的化合物具有(i)較窄的治療指數(shù)(例如，導(dǎo)致有害副作用或毒性反應(yīng)的 血漿濃度與產(chǎn)生療效的血漿濃度之間的差較?。灰话愣?，治療指數(shù)，Tl，定義為半致死劑 量(LD50)與半有效劑量(ED50)之比)；(ii)在消化道中較窄的吸收窗口 ；或(iii)短生物 半衰期，而使得需要一天之內(nèi)頻繁劑量才能維持治療水平的血漿濃度的情況下，以控釋制劑形式給予化合物是有利的。能夠采取許多種策略以獲得釋放速率超過治療化合物的代謝速率的控釋效果。例 如，能夠通過合當(dāng)?shù)剡x擇制劑參數(shù)和成分，包括例如適當(dāng)?shù)目蒯尳M合物和涂層而獲得控釋。 實(shí)例包括單或多單位片劑或膠囊組合物、油性溶液、懸浮液、乳液、微膠囊、微球、納米顆粒、 貼劑、和脂質(zhì)體?？诜猛镜闹苿┌ê信c無毒藥用賦形劑的混合物中的(一種或多種)活性成 分的片劑。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填料(例如，蔗糖和山梨醇)、潤滑劑、助 流劑、和防結(jié)合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、氧化硅、氫化植物油或滑石)?？诜猛镜闹苿┮部梢砸詥挝粍┝啃问教峁?，作為可咀嚼片劑、片劑、囊片、或膠 囊劑(即，作為其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合的硬凝膠膠囊，或作為其中活性成分 與水或油介質(zhì)混合的軟凝膠膠囊)。氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分可以與例如2003年5月22日公開的 U. S. S. N. 10/196，695中描述的藥用稀釋劑、載體或賦形劑一起進(jìn)行配制?？谇恍l(wèi)生制劑氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，能夠作為適用于一般口腔衛(wèi)生，尤其是殺死導(dǎo) 致牙菌斑、牙齦炎和難聞氣味的微生物的漱口水或牙膏來配制。氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或 其組分的濃度能夠?yàn)?. 0001w/w% lw/w%，更優(yōu)選為0. 001w/w% 0. lw/w%。本發(fā)明的漱口水能夠通過將氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分與現(xiàn)有的漱口 水簡(jiǎn)單混合而進(jìn)行制備?？蛇x地，本發(fā)明的漱口水進(jìn)一步包含水、氟化物、香味劑、 醇、過氧化氫、麝香草酚、胺葉素、?？颂驵?、水楊酸甲酯、薄荷醇、氯己定葡糖酸酯 (chlorhexidinegluconate)、苯扎氯銨、氯化十六烷基吡啶鐺、尼泊金甲酯、過氧化氫、溴化 度米芬、酶類、鈣、鋅和/或甜味劑(即，山梨醇、半乳蔗糖或糖精鈉)。本發(fā)明的牙膏能夠通過將氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分與現(xiàn)有的牙膏簡(jiǎn)單混 合而進(jìn)行制備。可選地，本發(fā)明的牙膏進(jìn)一步包含氟化物(即，氟化鈉或單氟磷酸鈉)、再礦 化劑(即，羥基磷灰石、無定形磷酸鈣、碳酸鈣)、發(fā)泡劑(即，十二烷基硫酸鈉)、碳酸鈉、酶 類、維生素、草藥成分、鈣、磷硅酸鈣鈉、過氧化氫、抗細(xì)菌劑(三氯生、氯化鋅)、增稠劑(即， 甘油)、和/或香味劑(即，留蘭香、洋薄荷、普通薄荷等)。眼科制劑本發(fā)明的眼科藥物組合物能夠通過向現(xiàn)有的眼科制劑中加入氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿 卜素或其組分而進(jìn)行制備?？蛇x地，眼科藥物組合物包含緩沖劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、防腐
齊U、眼用潤濕劑、和/或眼用稀釋劑。通常用于眼科溶液的潤濕劑包括羧甲基纖維素、羥丙 基甲基纖維素、甘油、甘露醇、聚乙烯醇或羥乙基纖維素，而稀釋劑可以是水、蒸餾水、無菌 水、或人造淚液，其中潤濕劑的存在量為約0. 001% 約10%。氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其 組分的濃度能夠?yàn)?. 0001w/w% lw/w%，更優(yōu)選為0. 001w/w% 0. lw/w%。眼科組合物 能夠用于治療導(dǎo)致例如結(jié)膜炎、角膜擦傷、潰瘍性傳染性角膜炎、上皮角膜炎、間質(zhì)狀角膜 炎、或與皰疹病毒相關(guān)的角膜炎的眼睛感染(即，細(xì)菌、病毒、真菌、或變形蟲、或寄生蟲)。眼科溶液和眼科軟膏的實(shí)例能夠采用本領(lǐng)域內(nèi)那些普通技術(shù)人員公知的許多廣 泛使用的方法配制成這種制劑。在制備眼科溶液的情況下，例如，如果必要的話，它們能夠 利用以下物質(zhì)來制備蒸餾水、水溶性堿或任何其他可接受的堿；張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉和
16濃縮甘油；緩沖劑如磷酸鈉和乙酸鈉；表面活性劑如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯、硬 脂酸聚氧烴酯40 (stearic polyoxyl 40)、和聚氧乙烯氫化蓖麻油；穩(wěn)定劑如檸檬酸鈉和乙 二胺四乙酸鈉；防腐劑如苯扎氯銨、硫柳汞、氯丁醇、氯化鈉、硼酸、對(duì)羥基苯甲酸酯(山梨 酸酯、苯甲酸酯、丙酸酯)、氯丁醇、芐氯、汞制劑、尼泊金等，和它們的混合物。苯扎氯銨和 硫柳汞是優(yōu)選的防腐劑。眼科制劑可以進(jìn)行變化以包括酸和堿來調(diào)節(jié)PH值；張力產(chǎn)生劑 (tonicityimparting agent)如山梨醇、甘油和右旋糖；其他生粘劑如羧甲基纖維素鈉、微 晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其他樹膠；合適的吸收增強(qiáng)劑，如表面活性劑、膽汁 酸；穩(wěn)定劑例如抗氧化劑，如亞硫酸鹽和抗壞血酸鹽；金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸鈉；以 及藥物溶解度增強(qiáng)劑，如聚乙二醇。這些額外的成分有助于使商品化溶液具有足夠的穩(wěn)定 性而使其不需要按需進(jìn)行混合(compound)。本發(fā)明的眼科制劑能夠是無菌含水載體、油膏或軟膏。油膏和軟膏典型地包括氧 化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，溶解或懸浮于無菌藥用油膏基或軟膏基，如礦物油-白礦 脂基中。在油膏或軟膏組合物中，制劑中也可以包含無水羊毛脂。硫柳汞或氯丁醇能夠作 為抗微生物劑而加入制劑中。以下的實(shí)施例是為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供本文中要求授權(quán)的方法和組合物如 何實(shí)施、制備和評(píng)價(jià)的全部公開內(nèi)容和描述，并且預(yù)想這些都僅僅是本發(fā)明的示例，而不是 意在限制本發(fā)明人認(rèn)定的其發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1.補(bǔ)充氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素(OxBC)后單核細(xì)胞細(xì)胞因子分布的評(píng)價(jià)。以下結(jié)果證實(shí)了在單核吞噬細(xì)胞中OxBC激活細(xì)胞因子響應(yīng)。氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿 卜素能夠引發(fā)細(xì)胞響應(yīng)于激發(fā)，例如侵入性病原體，并增強(qiáng)激發(fā)細(xì)胞中的抗微生物活性。發(fā)炎是一種非特異性免疫的關(guān)鍵組件，其是形成主要生理過程的一個(gè)復(fù)雜序列事 件，身體由此修復(fù)組織損傷并防御感染、毒性物質(zhì)或過敏原性物質(zhì)。盡管控制促炎性響應(yīng)的 誘導(dǎo)和傳播的精確機(jī)制在很大程度仍然是不清楚的，但是由常駐免疫細(xì)胞釋放的趨化因子 和可溶性調(diào)節(jié)劑代表了這種主要調(diào)節(jié)因子(或初級(jí)調(diào)節(jié)因子，primary mediator)。許多研 究已經(jīng)證明，微量營養(yǎng)物質(zhì)(如胡羅卜素)能夠通過活化細(xì)胞因子和其他促炎性調(diào)節(jié) 因子的產(chǎn)生而顯著地影響不同的吞噬細(xì)胞功能，包括其對(duì)明顯炎性應(yīng)答的貢獻(xiàn)。因此，我們 評(píng)價(jià)了 OxBC通過人單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對(duì)產(chǎn)生促炎性反應(yīng)(腫瘤壞死因子(TNF)-Ci、白細(xì) 胞介素(lU-Ιβ、IL-6和干擾素(IFN)-Y)和免疫調(diào)節(jié)(IL-12、IL-8和單核細(xì)胞化學(xué)引誘 物蛋白(MCP)-I)細(xì)胞因子的影響。方法化合物的制備OxBC由β-胡羅卜素進(jìn)行制備(參見美國專利第5，475，006號(hào))并在使用前 于-20°C下儲(chǔ)存。通過溶解26.85mg 0xBC/mL DMSO來制備儲(chǔ)備溶液(50mM胡羅卜素等價(jià)物) 并作為500 μ L等分試樣于-80°C下儲(chǔ)存。通過在合適的培養(yǎng)基介質(zhì)中稀釋而制備200 μ M 的OxBC工作溶液并通過過濾(0. 22 μ m孔徑)滅菌。測(cè)定OxBC的當(dāng)量值并在表1中示出 了測(cè)試樣品和對(duì)照樣品中DMSO的有關(guān)含量。DMSO載體的當(dāng)量含量用作對(duì)照。表1 OxBC的濃度和相關(guān)的DMSO值OxBC ( μ Μ)OxBC ( μ g/mL) DMSO (%，ν/ν)0.0 0.00 0.000
0.10.050.0010.50.270.0051.00.540.0102.51.340.0255.02.670.050105. 380.100158.010.1502513.40.2505026. 90.500細(xì)胞系人THP-I單核細(xì)胞樣細(xì)胞(急性單核細(xì)胞性白血病)由美國典型組織培養(yǎng)物保藏 中心(American Type Tissue Collection) (#TIB-202)獲得。細(xì)胞在補(bǔ)充有 2mM L-谷氨酰 胺、10mMHEPES、1.0mM丙酮酸鈉、10%胎牛血清和抗生素的RPMI-1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。外 周血單核細(xì)胞(PBM)和淋巴細(xì)胞(PBL)采用Miltenyi Biotec MACs磁分離系統(tǒng)分別通過 陽性和陰性選擇從PBMC中分離出來。PBM在補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺、IOmMHEPES、1. OmM丙 酮酸鈉、20%胎牛血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將PBL接種在除了使用10% FBS的相同介質(zhì)中。具體細(xì)胞密度和實(shí)驗(yàn)條件如下進(jìn)行描述。實(shí)驗(yàn)條件在天然激發(fā)和LPS激發(fā)這兩個(gè)模型中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于天然研究，將細(xì)胞直 接暴露于改變時(shí)間框的OxBC，并通過ELISA在條件培養(yǎng)基(CM)中評(píng)價(jià)細(xì)胞因子表達(dá)。對(duì)于 LPS激發(fā)，首先用OxBC將細(xì)胞培養(yǎng)指定的時(shí)間，在該時(shí)間點(diǎn)時(shí)除去OxBC并用新鮮的無OxBC 培養(yǎng)基替換。在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后處理，隨后在通過ELISA評(píng)價(jià)CM中的細(xì)胞因子水平之前， 用LPS(15ng/ml)激發(fā)細(xì)胞24h。在LPS激發(fā)的方案中，主要PBM首先用LPS激發(fā)24h。在 該初始刺激之后，將LPS處理的細(xì)胞暴露于OxBC 24h，隨后收獲CM以進(jìn)行ELISA分析。酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)采用Endogen Human ELISA試劑盒(Pierce)根據(jù)廠商說明書來實(shí)施CM中細(xì)胞因 子水平的分析。CM是通過離心除去細(xì)胞碎片來制備的，并且其可以純凈的形式使用，用完全 培養(yǎng)基稀釋或采用Nanos印3K離心濃縮機(jī)(Pall)濃縮以確保細(xì)胞因子水平處于每次分析 的線性范圍內(nèi)。在適當(dāng)?shù)那闆r下，樣品在-80°C下儲(chǔ)存并在使用之前通過室溫下的漸變平衡 (gradual equilibration)而解凍。簡(jiǎn)言之，向微孔板的每孔中加入50 μ L樣品，其中已經(jīng) 吸附了特異于所關(guān)心的細(xì)胞因子的抗體并在室溫下孵育1 3h。將孔板沖洗3次以除去非 特異性的結(jié)合物質(zhì)并用特異于所關(guān)心細(xì)胞因子的生物素標(biāo)記的抗體再培養(yǎng)1 3h。沖洗之 后，用鏈霉親合素_辣根過氧化物酶試劑培養(yǎng)孔板30min，接著再進(jìn)行沖洗循環(huán)。將沖洗過 的孔板用3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物培養(yǎng)30min，反應(yīng)停止并在450nm(550nm 參比)處測(cè)定吸光度。采用供給的重組標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于每一細(xì)胞因子生成參比曲線。結(jié)果與討論初級(jí)原理論證研究(primary proof-of-principle study)在未經(jīng)處理(模擬試 驗(yàn))或用OxBC、PMA(25ng/ml)和載體(DMSO)處理24h的THP-I細(xì)胞中進(jìn)行。用OxBC直 接刺激對(duì)炎性細(xì)胞因子水平?jīng)]有顯著的影響(參見表2)，但是可以檢測(cè)到調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子MCP-I和IL-8的中度升高。將這些研究擴(kuò)展到包括OxBC的濃度范圍(2. 5,7. 5和12. 5 μ Μ) 和樣品的濃度范圍，以試圖提高對(duì)豐度較小的細(xì)胞因子的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)12. 5 μ M的OxBC誘導(dǎo) MCP-I (58. 1 士8. 8%)和IL-8(42. 1 士 1.0%)的表達(dá)增加，但是對(duì)其他細(xì)胞因子的水平不產(chǎn) 生此效應(yīng)(參見表3)。而且，在MCP-I和IL-8表達(dá)中在該化合物的濃度較低的情況下沒 有檢測(cè)到變化。MCP-I和IL-8都起到將免疫細(xì)胞募集至感染或受傷部位的細(xì)胞因子作用。 例如，IL-8在炎性響應(yīng)中主要募集嗜中性粒細(xì)胞，也稱之為嗜中性粒細(xì)胞募集因子(NRF)， 而MCP-I的主要功能是募集其他單核細(xì)胞。通過單核細(xì)胞/吞噬細(xì)胞來表達(dá)細(xì)胞因子被誘 導(dǎo)響應(yīng)于抗原檢測(cè)或者侵入性病原體的吞噬作用。表2.原理論證細(xì)胞因子釋放分析 1.按照在每一分析中所包含的參比標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的值，表示為pg/ml2.冊(cè)，未檢出；值低于5.0 8/1111表3. OxBC處理后細(xì)胞因子的分布情況 1.按照在每--分析中所包含的參比標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的值，表示為Pg//ml2. ND,未檢出；值低于 5. Opg/ml3. DMSO值表示對(duì)于所示OxBC對(duì)應(yīng)濃度的載體的含量假設(shè)當(dāng)天然單核細(xì)胞樣細(xì)胞被激發(fā)時(shí)OxBC對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)影響有限，我們 下一步就對(duì)此化合物改變單核細(xì)胞對(duì)促炎性刺激，即脂多糖(LPS)的響應(yīng)可能性進(jìn)行評(píng) 價(jià)。為了評(píng)價(jià)這種潛力，實(shí)施了次級(jí)原理論證研究，其中在通過ELISA測(cè)定TNF表達(dá)之前用 OxBC (0. 1,0. 5,1. O μ M)預(yù)處理ΤΗΡ-1細(xì)胞24h，培養(yǎng)5天并隨后用LPS再刺激24h。選擇 較低濃度的OxBC更接近于宿主中的模型利用度，而選擇TNF作為原型促炎性細(xì)胞因子。如 下表4中所示，通過在所評(píng)價(jià)的所有濃度中的大約25% LPS激發(fā)之后，用OxBC進(jìn)行的預(yù)處
19理使得TNF表達(dá)上調(diào)。隨后采用類似的引物和激發(fā)模型將這些研究擴(kuò)展到其他炎性細(xì)胞因 子。當(dāng)用0. 1或0.5 μ MOxBC處理(prime)細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)到IL-6和IL-I β表達(dá)的增加，但是 沒有檢測(cè)到IFN γ表達(dá)增加(參見表5)。有意思的是，當(dāng)用1.0 μ M的該化合物處理細(xì)胞時(shí)， 沒有觀察到細(xì)胞因子表達(dá)的變化。IL-6是發(fā)熱的急性時(shí)相反應(yīng)(acute phase response) 的最重要的調(diào)節(jié)因子之一；然而，該細(xì)胞因子也需要用于維持微生物抗性。TNF和IL-I β 在先天免疫和炎性響應(yīng)中是都是關(guān)鍵的多效性細(xì)胞因子，其調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功 能。類似地，還發(fā)現(xiàn)OxBC預(yù)處理在LPS激發(fā)之后能夠使調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)上調(diào)。具 體而言，與僅用LPS刺激的細(xì)胞相比，在用0. 1和0. 5 μ M OxBC預(yù)處理之后，IL-8表達(dá)分別 提高了 33 士 4%和49 士 5%。然而，在用ΙμΜ的該化合物預(yù)處理的培養(yǎng)物中沒有觀察到差
已 升。表4.在OxBC處理和LPS激發(fā)之后的TNF表達(dá)(原理論證) 1.按照在每一分析中所包含的參比標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的值，表示為pg/ml2.相對(duì)于僅用LPS處理的細(xì)胞的倍數(shù)變化。表5 用OxBC處理和LPS激發(fā)后促炎性細(xì)胞因子的表達(dá) 1.相對(duì)于僅用LPS處理的細(xì)胞的倍數(shù)變化。因?yàn)閱魏思?xì)胞是最感興趣的先天免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞，因此我們接下來評(píng)價(jià)OxBC 是否能夠影響先前已經(jīng)暴露于LPS激發(fā)的主要PBM中的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。PBM最初用 LPS(15ng/ml)處理24h，并隨后用不同濃度的OxBC再刺激24h，之后收集CM用于ELISA分 析。在OxBC處理之后沒有檢測(cè)到LI-6表達(dá)的變化，而TNF水平僅在該化合物的濃度較低 時(shí)升高(約25% )(參見圖1)。然而，IL-I β表達(dá)在OxBC濃度超過5 μ M的情況下一直升 高，并檢測(cè)到約50%的最大增加(圖1)。調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-8和IL-12的評(píng)價(jià)表明，盡管 在用OxBC預(yù)處理的細(xì)胞中沒有觀察到IL-12表達(dá)的變化，但是相對(duì)于未處理的單核細(xì)胞，IL-8的表達(dá)在OxBC濃度超過2. 5 μ M時(shí)顯著升高(圖2)。實(shí)施例2.用氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素(OxBC)處理之后單核細(xì)胞上的免疫相關(guān)的表 面受體的評(píng)價(jià)以下結(jié)果證實(shí)了 OxBC處理與⑶14、⑶51、⑶16和⑶36表達(dá)的增加相關(guān)，所有分 化標(biāo)記都涉及到單核細(xì)胞的活化。而且，也觀察到淋巴細(xì)胞共刺激分子⑶86(即，Β7)和 ⑶40L的表達(dá)增加，這間接表明了激活免疫系統(tǒng)的先天和適應(yīng)性分支的能力。在LPS激發(fā)模 型中，當(dāng)用較低濃度的OxBC處理單核細(xì)胞時(shí)，在分化標(biāo)記水平中幾乎沒有檢測(cè)到變化。然 而，OxBC處理與響應(yīng)于LPS激發(fā)的共刺激表面受體的表達(dá)增加相關(guān)。未分化單核細(xì)胞隨著其分化成巨噬細(xì)胞而喪失了其小的、圓形形態(tài)并表現(xiàn)出尺 寸、細(xì)胞擴(kuò)散和間隔尺寸(granularity)增加。在單核細(xì)胞中也鑒別出了幾種分化的抗原 并與各種有關(guān)先天和特異性免疫的生物學(xué)功能相關(guān)。這些表面抗原的表達(dá)分布隨著單核 細(xì)胞分化而變化，這提供了通過流式細(xì)胞儀在混合的群中成熟巨噬細(xì)胞數(shù)目實(shí)施量化的方 式。對(duì)于這些研究，通過評(píng)估在這種過程中起到細(xì)胞粘附(整聯(lián)蛋白⑶lib/⑶18和⑶51)、 微生物組件(⑶14，LPS受體)的結(jié)合、清除和吞噬作用(⑶36)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答 (CD16，抗體依賴性細(xì)胞殺傷所需的低親合性IgG受體)作用的代表性表面部分的水平來評(píng) 價(jià)分化和先天功能。典型地，這些受體在天然單核細(xì)胞上以較低水平表達(dá)并且在受到刺激 后會(huì)發(fā)生上調(diào)。為了評(píng)價(jià)OxBC對(duì)單核細(xì)胞的適應(yīng)性免疫功能的影響，評(píng)價(jià)了第II類MHC分 子，HLA-DR和HLA-DP的表面表達(dá)。這些分子是涉及到抗原呈遞的特征單核細(xì)胞表面標(biāo)記。 類似地，還確定了在T-細(xì)胞的抗原呈遞中起作用的其他細(xì)胞表面分子，包括共刺激白細(xì)胞 抗原 B7-2 (CD86)、CD40 和 CD40L 的表達(dá)。方法化合物制備OxBC儲(chǔ)備溶液按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行制備細(xì)胞系和條件人THP-I單核細(xì)胞樣細(xì)胞(急性單核細(xì)胞性白血病)獲自美國典型組織培養(yǎng)物保 藏中心(American Type Tissue Collection (#TIB_202)。細(xì)胞在補(bǔ)充有用 2mM L-谷氨酰 胺、IOmM HEPES，1.0mM丙酮酸鈉、10%胎牛血清和抗生素補(bǔ)充的RPMI-1640的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。在用OxBC處理之前進(jìn)行細(xì)胞接種(5X105細(xì)胞/孔，6-孔培養(yǎng)孔板)24h并收獲以根 據(jù)三種試驗(yàn)方案進(jìn)行分析1)細(xì)胞用0勸((2.5、7.5或12.5 4 10處理24h并隨后對(duì)表面受 體表達(dá)進(jìn)行評(píng)價(jià)；2)細(xì)胞用0xBC(0. 1,0. 5或1. 0 μ Μ)處理24h，在此時(shí)間點(diǎn)上在分析前供 給持續(xù)無OxBC的新鮮培養(yǎng)基48h，和3)細(xì)胞用OxBC (0. 1、0. 5或1. 0 μ M)處理24h，在此時(shí) 間點(diǎn)上持續(xù)供給無OxBC的新鮮培養(yǎng)基5天。隨后，在分析前用LPS(15ng/ml)刺激所處理 的細(xì)胞24h。單獨(dú)在當(dāng)量百分?jǐn)?shù)(ν/ν)的DMSO中培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照。對(duì)于這些沒有采用 LPS刺激的研究，PMA(25ng/ml)用作單核細(xì)胞分化的陽性刺激物。FACS 分析抗人CDllb、CD14、CD16、CD36、CD51/CD61、HLA (廣泛的同種型)、HLA-B7、CD86、 ⑶40、⑶40L和⑶3的藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記的一抗獲自AbCam。采用直接免疫熒光標(biāo)記和流 式細(xì)胞分析分析來評(píng)價(jià)受體表達(dá)。簡(jiǎn)言之，將冷的緩沖液(含有10% FBS和疊氮化鈉 的PBS)中的三份細(xì)胞等分試樣與一抗(10 20 μ L)在室溫下于低光照條件下孵育45分
21鐘。將細(xì)胞沖洗3次并再懸浮于500 μ 1緩沖劑中，采用FacsAria細(xì)胞分類器進(jìn)行分析。未 標(biāo)記的細(xì)胞和用抗體標(biāo)記的細(xì)胞單獨(dú)用作對(duì)照。結(jié)果與討論THP-I細(xì)胞用OxBC處理24h并通過直接標(biāo)記流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)分化抗原的表達(dá)。如 表6和圖3中所示，OxBC處理的最顯著的特點(diǎn)是在整個(gè)評(píng)價(jià)濃度范圍內(nèi)使原型單核細(xì)胞分 化抗原⑶14的表達(dá)上調(diào)。這種效果是劑量依賴性的并在使用12. 5 μ M OxBC時(shí)于2-倍增長 處出現(xiàn)峰值，其結(jié)果堪比PMA的效果。CD14是一種與膜有關(guān)的糖蛋白，其作為與Toll樣受 體(TLR)-4的的共受體來檢測(cè)細(xì)菌性LPS。在該檢測(cè)中，其在介導(dǎo)先天免疫應(yīng)答的細(xì)菌感染 中，包括細(xì)胞因子分泌和炎性響應(yīng)，起到關(guān)鍵作用。因此，其通過OxBC的上調(diào)作用表明，該 化合物具有激活基本先天免疫途徑的能力。除了 CD14之外，在OxBC的濃度為12. 5 μ M時(shí) 檢測(cè)到⑶51的上調(diào)表達(dá)(37% )，其是一種在活化之后參與單核細(xì)胞粘附至內(nèi)皮細(xì)胞的整 聯(lián)蛋白，以及CD16的上調(diào)表達(dá)(39% )，其是一種識(shí)別支撐抗體-引導(dǎo)的細(xì)胞殺傷的抗體的 Fc受體。將這些結(jié)果結(jié)合到一起，這些結(jié)論提供了 OxBC能夠在單核細(xì)胞樣細(xì)胞中起到分化 刺激作用的證據(jù)。應(yīng)該注意到，用CD3(其是一種年淋巴細(xì)胞標(biāo)記)染色作為指示THP-I細(xì) 胞的對(duì)照并未表達(dá)受體(未示出數(shù)據(jù))。表6 =THP-I細(xì)胞中的分化抗原表達(dá) 1.這些值代表關(guān)于載體對(duì)照的倍數(shù)變化(士SD)。黑體表示統(tǒng)計(jì)顯著性。2. PMA作為陽性刺激物的對(duì)照以25ng/ml使用。CDllb是一種在其銜接產(chǎn)生導(dǎo)致單核細(xì)胞活化和促炎性細(xì)胞因子釋放的信號(hào)的骨 髓細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的整聯(lián)蛋白，而CD36是一種與引發(fā)吞噬作用有關(guān)的表面部分，它們?cè)趩?核細(xì)胞樣細(xì)胞上以接近一致性的水平進(jìn)行表達(dá)。因此，我們也在對(duì)這些分子進(jìn)行染色后評(píng) 價(jià)了熒光強(qiáng)度以作為受體密度的測(cè)量值。這樣做避免了錯(cuò)失潛在效應(yīng)，否則這種潛在效應(yīng) 會(huì)被充足的陽性標(biāo)記的細(xì)胞抑制。如表7中所示，⑶36表達(dá)在用12. 5 μ M OxBC處理后增 加約27%，而CDllb水平以較小程度增加。相比而言，PMA使兩種受體的密度提高一個(gè)更大 的范圍，為2 4倍。表7:受體密度
22 1.這些值代表關(guān)于載體對(duì)照的倍數(shù)變化(士SD)。黑體表示統(tǒng)計(jì)顯著性。2. PMA作為陽性刺激物的對(duì)照以25ng/ml使用。參與抗原呈遞和淋巴細(xì)胞響應(yīng)的刺激的表面受體的表達(dá)也通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行 評(píng)價(jià)。通過用7. 5和12. 5 μ M OxBC處理使HLAB7-2 (aka⑶86)和⑶40L的表達(dá)上調(diào)(表 8，圖4)。⑶86通過與⑶28相互作用的巨噬細(xì)胞而提供T-細(xì)胞活化所需的共刺激信號(hào)。這 種相互作用引發(fā)效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)由活化的巨噬細(xì)胞呈遞的抗原產(chǎn)生響應(yīng)。⑶40L或⑶154是 TNF超家族的成員，該TNF超家族結(jié)合于抗原呈遞細(xì)胞上的CD40并起到共刺激分子的作用。 ⑶40L在⑶4+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)最為充分；然而，近來的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，⑶40L也在其他免 疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)，包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，其中其作用是提高巨噬細(xì)胞活化的水平并 增強(qiáng)吞噬作用和產(chǎn)生活性的細(xì)胞因子。因此，與⑶14 一樣，這兩種分子的作用是提高活化 的單核細(xì)胞響應(yīng)免疫激發(fā)的能力。表8 共刺激分子在THP-I單核細(xì)胞上的表達(dá) 1.這些值代表關(guān)于載體對(duì)照的倍數(shù)變化(士SD)。黑體表示統(tǒng)計(jì)顯著性。2. PMA作為陽性刺激物的對(duì)照以25ng/ml使用。我們接下來評(píng)價(jià)采用較低濃度的OxBC ( < 1 μ M)處理24h和LPS激發(fā)大約5天后 的受體表達(dá)。應(yīng)該注意到，在無LPS激發(fā)時(shí)，用這些濃度的OxBC處理細(xì)胞并不影響以較高 濃度的上述化合物處理時(shí)評(píng)價(jià)的任何受體的表達(dá)(數(shù)據(jù)未示出)。類似地，在用0. ΙμΜ處 理的情況下，沒有觀察到⑶lib的表達(dá)與在LPS刺激之后用OxBC處理和未處理的細(xì)胞之間 分化抗原的表達(dá)有顯著差異(圖5)。相對(duì)而言，與LPS激發(fā)后未處理的對(duì)照相比，參與抗原 呈遞的共刺激分子(即HLA(DP/DR/DP)和CD86)的表達(dá)在OxBC處理的培養(yǎng)物中顯著升高 (圖6)。類似地，盡管CD40表達(dá)的優(yōu)勢(shì)在整個(gè)通過OxBC處理的細(xì)胞群中并未上調(diào)，但與未 處理的對(duì)照相比，⑶40在OxBC處理細(xì)胞的一些亞群中的表達(dá)更加充分。因此，用較低濃度 的OxBC處理表現(xiàn)出增強(qiáng)了單核細(xì)胞參與誘導(dǎo)對(duì)微生物的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力。實(shí)施例3.對(duì)用氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素(OxBC)處理的人單核細(xì)胞表現(xiàn)出的吞噬作用活性的評(píng)價(jià)以下結(jié)果證實(shí)，OxBC處理與吞噬作用增加有關(guān)。本研究被設(shè)計(jì)為確定OxBC是否 能夠影響主要人單核細(xì)胞和所構(gòu)建的THP-I單核細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)物中的吞噬作用活性。在 用OxBC單獨(dú)處理的天然單核細(xì)胞培養(yǎng)物中吞噬作用的增加是明顯的。然而，OxBC的影響 在用OxBC預(yù)處理并隨后用LPS激發(fā)的培養(yǎng)物中是最大的。這些結(jié)果間接表明，OxBC具有 引發(fā)單核細(xì)胞響應(yīng)于提高吞噬作用活性的LPS激發(fā)的能力。吞噬作用是一種起到微生物_先天免疫相互作用經(jīng)典模型的先天免疫防御的基 本機(jī)制。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)功能，吞噬細(xì)胞表達(dá)參與微粒識(shí)別和內(nèi)化的廣譜受體。這些受體中 的一些能夠傳輸啟動(dòng)吞噬作用的胞內(nèi)信號(hào)。然而，其他受體如清除劑受體(例如，CD36)參 與結(jié)合至靶標(biāo)或起到增加內(nèi)化作用的效力的作用。吞噬細(xì)胞-微生物接觸需要啟動(dòng)與細(xì)胞 骨架重排，膜運(yùn)輸中的改造，微生物殺滅機(jī)制的活化，促炎性和抗炎細(xì)胞因子和趨化因子的 產(chǎn)生，細(xì)胞凋亡的活化，以及產(chǎn)生對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的有效抗原呈遞所需的分子的各種不 同的細(xì)胞過程的胞內(nèi)信號(hào)陣列，這是一個(gè)看似復(fù)雜的過程。因此，吞噬作用是一個(gè)對(duì)單核細(xì) 胞功能和先天抗微生物防御調(diào)節(jié)而言至關(guān)重要的過程。實(shí)施例1和2的研究證實(shí)了 OxBC 具有活化單核細(xì)胞培養(yǎng)物中的各種先天響應(yīng)的能力。假設(shè)許多這些響應(yīng)能夠通過吞噬作用 啟動(dòng)，我們接下來評(píng)價(jià)OxBC影響單核細(xì)胞中吞噬活性的能力。方法化合物的制備OxBC儲(chǔ)備溶液按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行制備。細(xì)胞系和條件人THP-I單核細(xì)胞樣細(xì)胞(急性單核細(xì)胞性白血病)獲自美國典型組織培養(yǎng)物保 藏中心(American Type Tissue Collection) (#TIB_202)。細(xì)胞在補(bǔ)充有用 2mM L-谷氨酰 胺，IOmM HEPES，1.0mM丙酮酸鈉，10%胎牛血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采 用Miltenyi Biotec MACs磁分離系統(tǒng)將初級(jí)外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBM)從混合的外周血單 核細(xì)胞制劑中分離出來。PBM在與THP-I細(xì)胞相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，除了采用20%的胎牛 血清之外。在用0xBC、PMA(25ng/ml)和/或LPS(15ng/m 了 )處理24h前接種細(xì)胞(IX IO5 細(xì)胞/孔，96-孔培養(yǎng)板)，如下文中的描述。單獨(dú)在當(dāng)量百分?jǐn)?shù)(ν/ν)的DMSO中培養(yǎng)的細(xì) 胞作為對(duì)照。吞噬作用分析采用Vybrant吞噬作用分析試劑盒(Invitrogen，#V6694)基于熒光素-標(biāo)記的大 腸桿菌(菌株K12)細(xì)菌顆粒的攝取來評(píng)價(jià)在單核細(xì)胞培養(yǎng)物中的吞噬作用。簡(jiǎn)言之，所處 理細(xì)胞在37°C下用100 μ LHank氏緩沖的鹽溶液中的熒光生物顆粒懸浮液中培養(yǎng)5h。培養(yǎng) 之后，除去懸浮液并用IOOyL的2%臺(tái)盼藍(lán)溶液代替培養(yǎng)1分鐘。除去臺(tái)盼藍(lán)溶液并采用 熒光微孔讀板器(480nm激發(fā)，520nm發(fā)射)來確定所攝取的顆粒數(shù)。僅含有培養(yǎng)基(無細(xì) 胞)的孔作為陰性反應(yīng)對(duì)照，使針對(duì)每一次試驗(yàn)重復(fù)的陰性對(duì)照相等。在確定吞噬細(xì)胞活 性之前，研究了對(duì)THP-I細(xì)胞和PBM的三種處理方案(1)細(xì)胞僅用OxBC或PMA處理24h ； (2)細(xì)胞用OxBC或PMA處理24h，在此時(shí)間點(diǎn)時(shí)除去該化合物并在完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)細(xì) 胞24h ；和(3)用OxBC或PMA處理細(xì)胞24h，在此時(shí)間點(diǎn)上除去該化合物并在含LPS的完全 培養(yǎng)基中再培養(yǎng)細(xì)胞24h。對(duì)于THP-I細(xì)胞，研究了另外的情況，其中用OxBC或PMA處理細(xì)胞24h，在此時(shí)間點(diǎn)上除去該化合物并使細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中恢復(fù)72h?；謴?fù)之后，在測(cè)量 吞噬作用之前用LPS處理細(xì)胞24h。結(jié)果與討論首先采用先前證實(shí)不產(chǎn)生顯著毒性的濃度和時(shí)間進(jìn)程在人THP-I細(xì)胞、已構(gòu)建的 單核細(xì)胞樣細(xì)胞系中評(píng)價(jià)OxBC對(duì)單核細(xì)胞中吞噬作用的影響。用OxBC處理天然THP-I 細(xì)胞24h，在所評(píng)價(jià)的任何濃度下均不顯著改變吞噬活性。相對(duì)而言，PMA處理與相對(duì)于 對(duì)照培養(yǎng)物的吞噬活性的12. 94士2. 05倍增加相關(guān)。然而，當(dāng)容許THP-I細(xì)胞在評(píng)價(jià)吞噬 作用之前恢復(fù)24h時(shí)，發(fā)現(xiàn)OxBC處理會(huì)影響吞噬活性。與對(duì)照相比，在用2. 5 μ Μ、5 μ M或 7. 5 μ Μ(1· 34 μ g/mL、2. 67 μ g/mL 或 4. 02 μ g/mL)的 OxBC 處理的 THP-I 培養(yǎng)物中觀察到吞 噬活性的顯著升高，但這種效應(yīng)約為采用PMA所觀察到的一半(參見圖7)。值得注意的是， 10μΜ(5. 38 μ g/mL)的OxBC使所處理的培養(yǎng)物中吞噬作用的程度降低，這可能是由于毒性 作用所致。實(shí)施例1和實(shí)施例2證實(shí)了 OXBC處理能夠引發(fā)單核細(xì)胞對(duì)次級(jí)刺激物如LPS的 響應(yīng)增強(qiáng)。與這些觀察結(jié)果一致，用OxBC處理的THP-I細(xì)胞在LPS激發(fā)之后比未處理的對(duì) 照表現(xiàn)出更大的吞噬活性(圖8)。用濃度超過2. 5 μ M(l. 34 μ g/mL)的OxBC預(yù)處理使吞噬 作用增加至在用PMA處理的單核細(xì)胞中觀察到的類似水平。在評(píng)價(jià)主要PBM時(shí)觀察到類似的結(jié)果。當(dāng)采用用OxBC處理24h接著恢復(fù)24h的 試驗(yàn)方案時(shí)，與對(duì)照相比，在OxBC處理的細(xì)胞中檢測(cè)到約35%的吞噬活性的普遍增加。盡 管觀察到了增加，但這些結(jié)果由于重復(fù)試驗(yàn)之間的可變性而不能到達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。盡管 增加重復(fù)試驗(yàn)的次數(shù)能夠通過降低可變性而使這些響應(yīng)提高至更顯著的水平，但這一選擇 由于將會(huì)需要大量的原代細(xì)胞(primarycell)而并不可行。然而，與THP-I細(xì)胞一樣，發(fā)現(xiàn) OxBC能夠引發(fā)PBM對(duì)LPS激發(fā)的響應(yīng)。如圖9所示，用OxBC預(yù)處理與對(duì)相當(dāng)于采用最大水 平PMA獲得的LPS刺激的吞噬響應(yīng)增加有關(guān)。還在容許在OxBC處理之后恢復(fù)72h的THP-I細(xì)胞中評(píng)價(jià)了吞噬活性。在單獨(dú)用 OxBC處理的細(xì)胞中觀察到吞噬作用的適度增加，但是這些響應(yīng)被PMA-處理的培養(yǎng)物中吞 噬活性的巨大增加所掩蔽。相比較而言，再次發(fā)現(xiàn)OxBC預(yù)處理引發(fā)THP-I細(xì)胞對(duì)遞送72h 后的LPS刺激產(chǎn)生響應(yīng)。在用濃度超過5 μ M(2. 67 μ g/mL)的OxBC預(yù)處理的單核細(xì)胞中檢 測(cè)到吞噬活性的顯著增加，這間接表明OxBC處理的效果在單核細(xì)胞首次暴露于OxBC之后 維持了幾天。OxBC表現(xiàn)出直接提高原發(fā)性的(或原代的，primary)和所構(gòu)建的單核細(xì)胞的吞噬 活性的能力。然而，OxBC對(duì)免疫系統(tǒng)的最大影響表現(xiàn)在其能夠引發(fā)單核細(xì)胞響應(yīng)于隨后的 LPS激發(fā)而產(chǎn)生更強(qiáng)烈的吞噬響應(yīng)的能力。其他實(shí)施方式本說明書中提及所有出版物和專利申請(qǐng)、以及專利都結(jié)合于本文中作為參考。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)行了描述，但是應(yīng)該理解，能夠?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn) 行進(jìn)一步修改。因此，本申請(qǐng)傾向于涵蓋一般遵循本發(fā)明原理的本發(fā)明任何修改、應(yīng)用或改 變，包括屬于本領(lǐng)域已知的或常規(guī)實(shí)踐的本發(fā)明公開內(nèi)容偏離的內(nèi)容。其他實(shí)施方式都在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種治療患有感染的受治療者的方法，所述方法包括以足以治療所述感染的量向所述受治療者給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
2.一種治療患有感染、或具有患感染風(fēng)險(xiǎn)的人類受治療者的方法，所述方法包括以足 以治療所述感染的量向所述受治療者給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
3.一種治療患有感染、或具有患感染風(fēng)險(xiǎn)的受治療者的方法，所述方法包括以足以治 療所述感染的量向所述受治療者給予氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，其中，所述氧化轉(zhuǎn) 化的類胡蘿卜素或其組分經(jīng)由靜脈內(nèi)、眼部、肌肉內(nèi)、局部地、皮下、或鼻內(nèi)給予。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述感染是由細(xì)菌、病毒、真菌、或寄 生蟲引起的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述感染選自社區(qū)獲得性肺炎、上呼 吸道和下呼吸道感染、皮膚和軟組織感染、急性細(xì)菌性中耳炎、細(xì)菌性肺炎、并發(fā)感染、腎盂 腎炎、腹腔內(nèi)感染、細(xì)菌性敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、菌血癥、外傷感染、腹膜炎、腦膜炎、 燒傷后感染、泌尿生殖道感染、盆腔炎、心內(nèi)膜炎、和血管內(nèi)感染。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組 分經(jīng)由眼部給予以治療眼睛感染。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組 分向所述受治療者的口腔局部給予以治療口腔感染。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分經(jīng)由口 腔、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼部、局部地、皮下、或鼻內(nèi)給予。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述受治療者還未診斷出患有感染，但是具 有患感染的風(fēng)險(xiǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述受治療者患有感染。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括向所述受治療者給予抗生素， 其中所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分與所述抗生素同時(shí)給藥，或在14天內(nèi)分別給藥。
12.一種使接受免疫的受治療者對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答增強(qiáng)的方法，所述方法包括 (i)向所述受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，和(ii)向所述受治療 者給予抗原，其中，在給予所述抗原之前給予所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
13.一種使接受免疫的人類受治療者對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答增強(qiáng)的方法，所述方法 包括向所述受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
14.一種使接受免疫的受治療者對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答增強(qiáng)的方法，所述方法包括 向所述受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類 胡蘿卜素或其組分經(jīng)由靜脈內(nèi)、眼部、肌肉內(nèi)、局部地、皮下、或鼻內(nèi)給予。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原來源于病原體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述病原體選自細(xì)菌、病毒、真菌、或寄生蟲。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述抗原是糖類、糖脂、糖蛋白、脂質(zhì)、蛋白、脂 蛋白、磷脂、或多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述病原體是活病毒或減毒的活病毒。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述病原體是炭疽、流行性感冒、脊髓灰質(zhì)炎、 麻疹、或狂犬病。
20.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其 組分在給予所述抗原14天內(nèi)給予。
21.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分與 所述抗原一起給予。
22.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、12、13或14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡 蘿卜素或其組分包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的聚合物組分。
23.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、12、13或14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類 胡蘿卜素或其組分包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的組分，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的組分 包括2-甲基-6-氧代-2，4-庚二烯醛、二氫獼猴桃醇內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛、紫羅蘭酮、 β -紫羅蘭酮5，6-環(huán)氧化物、4-氧代-β -紫羅蘭酮、β -紫羅蘭亞基乙醛、β -紫羅蘭亞基 乙醛5，6_環(huán)氧化物、4-氧代-β-紫羅蘭亞基乙醛、β-脫-13-類胡羅卜酮、β-脫-13-類 胡羅卜酮-5，6-環(huán)氧化物、4-氧代-β-脫-13-類胡羅卜酮、視黃醛、視黃醛5，6_環(huán)氧化 物、或它們的混合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分包含 2-甲基-6-氧代_2，4-庚二烯醛。
25.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、12、13或14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡 蘿卜素或其組分是氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素。
26.—種藥物組合物，包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，以及抗原。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中，所述組合物被配制成用于經(jīng)口服、靜脈 內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼部、局部地、皮下、或鼻內(nèi)給藥。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中，所述抗原來源于病原體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中，所述病原體選自細(xì)菌、病毒、真菌、或寄 生蟲。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中，所述抗原是糖類，糖脂、糖蛋白、脂質(zhì)、 蛋白、脂蛋白、磷脂、或多肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中，所述病原體是活病毒或減毒的活病毒。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中，所述病原體是炭疽、流行性感冒、脊髓 灰質(zhì)炎、麻疹、或狂犬病。
33.一種試劑盒，包括(i) 一種包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的藥物組合物；和( )給予所述組合物以用于治療患有感染或具有患感染風(fēng)險(xiǎn)的受治療者的說明。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中，所述感染是由細(xì)菌、病毒、真菌、或寄生蟲引 起的。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中，所述感染選自社區(qū)獲得性肺炎、上呼吸道和 下呼吸道感染、皮膚和軟組織感染、急性細(xì)菌性中耳炎、細(xì)菌性肺炎、并發(fā)感染、腎盂腎炎、 腹腔感染、細(xì)菌性敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、菌血癥、外傷感染、腹膜炎、腦膜炎、燒傷后感 染、泌尿生殖道感染、盆腔炎、心內(nèi)膜炎、和血管內(nèi)感染。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，進(jìn)一步包括用于向所述受治療者給予抗生素的說明。
37.一種試劑盒，包括(i)包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分的藥物組合物； ( )包含抗原的藥物組合物；和(iii)給予所述氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分、以及所述抗原以用于對(duì)受治療者進(jìn) 行免疫的說明。
38.一種牙膏，包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
39.一種漱口水，包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
40.一種藥物組合物，包含氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，并且被配制成用于向眼睛給藥。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物是滴眼液、眼藥膏、眼 用軟膏、眼用噴霧劑、結(jié)膜下注射劑、或玻璃體內(nèi)注射劑、隱形眼鏡、結(jié)膜插入物、或眼內(nèi)插 入物。
42.一種增強(qiáng)患有感染的受治療者體內(nèi)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受治 療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
43.一種增強(qiáng)患有感染或具有患感染風(fēng)險(xiǎn)的人類受治療者體內(nèi)的免疫應(yīng)答的方法，所 述方法包括向所述受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分。
44.一種增強(qiáng)患有感染或具有患感染風(fēng)險(xiǎn)的人類受治療者體內(nèi)的免疫應(yīng)答的方法，所 述方法包括向所述受治療者給予有效量的氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分，其中，所述氧 化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分經(jīng)由靜脈內(nèi)、眼部、肌肉內(nèi)、局部地、皮下或鼻內(nèi)給予。
全文摘要
本發(fā)明披露了氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素或其組分用于增強(qiáng)受治療者體內(nèi)的免疫應(yīng)答以用于治療感染，或使接受免疫的受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答增強(qiáng)的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了含有這種氧化轉(zhuǎn)化的類胡蘿卜素的藥物組合物和試劑盒。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101909611SQ200880122743
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者博任娜·科爾恰克, 格雷厄姆·伯頓, 詹姆斯·約翰斯頓 申請(qǐng)人:凱馬福爾公司;加拿大國家研究會(huì)