專利名稱：Gdnf剪接變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor, GDNF)蛋白及其cDNA，更具體來說，涉及被稱為(Y)pro-GDNF的 ⑶NF蛋白的新剪接變體，該變體由新的mRNA剪接變體pre- ( y ) pro-GDNF編碼，并以神經(jīng)元活性依賴性的方式分泌。本發(fā)明涉及(Y)pro-GDNF蛋白、其cDNA和它的部分的用途。
背景技術(shù)：
⑶NF是支持周圍交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)、腸神經(jīng)和感覺神經(jīng)的神經(jīng)元以及中腦多巴胺神經(jīng)元和運動神經(jīng)元的發(fā)育和存活的神經(jīng)營養(yǎng)因子。在帕金森氏癥(PD)的多種動物模型中，GDNF可以預(yù)防神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元的死亡，并且促進軸突出芽最終導(dǎo)致功能的恢復(fù)。被稱為pre_(a )pro_GDNF(先前稱為⑶NF a )和pre-( β )pro-GDNF(先前稱為GDNF0)的兩種GDNF剪接變體已有描述(Suter-Crazzolara and Unsicker, Neuroreport,5 :2486-2488 (1994)) 這些剪接變體是通過GDNF mRNA的不同剪接產(chǎn)生的。多種分泌蛋白包括神經(jīng)營養(yǎng)因子都是以前體、前-原-成熟蛋白的形式合成的。 由ER信號肽構(gòu)成的前區(qū)(pre region)在翻譯過程中被信號肽酶剪掉，原_成熟蛋白在合成后立即被釋放到ER腔中。成熟蛋白的蛋白水解切割可以發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)或胞外基質(zhì)或者這兩種情況都有。原-成熟蛋白還可以保持不被切割的狀態(tài)，具有不同于切割好的成熟蛋白的功能。例如，神經(jīng)細(xì)胞既分泌成熟的腦來源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，也分泌原-BDNF。 成熟BDNF與TrkB受體結(jié)合，誘導(dǎo)神經(jīng)元存活、分化和突觸調(diào)制，而原-BDNF與p75NTK和分揀蛋白(sortilin)受體結(jié)合，誘發(fā)細(xì)胞凋亡(參見Thomas and Davies, Curr. Biol, 15 262-264(2005) ；Teng et al，J. Neurosci.，25 :5455-5463 (2005)等綜述)。GDNF剪接變體含有氨基端信號序列(前區(qū))和會被從成熟結(jié)構(gòu)域切下的原序列(Lin et al.，Science，260 1130-1132 (1993))(圖 1)。(3)pro-⑶ NF 的原區(qū) (pro-region)比(α )pro-⑶NF 的原區(qū)少 26 個氨基酸(aa) (Trupp et al.，J. Cell Biol, 130 :137-148(1995)).這兩種剪接變體產(chǎn)生的成熟⑶NF蛋白非?？赡苁且粯拥摹３墒?⑶NF由134個氨基酸(aa)組成，含有兩個推測的N-糖基化位點和7個保守半胱氨酸，這些半胱氨酸與TGF-β蛋白家族的其他成員處于同樣的相對間距(Lin et al. ,Science, 260 1130-1132(1993) ；Eigenbrot and Gerber，Nat. Struct. Biol，4 :435-438(1997) ；Chang et al.，Endocri. Rev. ,23 :787-823(2002))(圖 1)。生物活性的成熟 GDNF 二聚體是通過單體中未配對的半胱氨酸之間的共價二硫鍵形成的(Eigenbrot and Gerber, Nat. Struct. Biol. 4 :435-438(1997))。在科學(xué)文獻中，⑶NF mRNA和⑶NF蛋白這兩個名稱已被用于全長pre_((a) pro-GDNF mRNA和(a ) pro-GDNF蛋白被蛋白水解切割產(chǎn)生的成熟⑶NF蛋白。對于成熟 ⑶NF蛋白已有廣泛深入的研究，在PubMed中⑶NF有2500個以上的引用。⑶NF的鑒定基于其提高神經(jīng)突長度、細(xì)胞大小和多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的能力，以及它們攝入培養(yǎng)基中多巴胺的高親和力(Linet al.，Science，260 1130-1132 (1993))。GDNF 在 PD 動物模型中以及PD患者的治療中，是保護黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元抗毒素誘導(dǎo)的降解的有力因子(綜述見 Airaksinen and Saarma, Nat. Rev. Neurosci. 3 :383-394(2002),禾口 Bespalov and Saarma, Trends Pharmacol. Sci. 28 :68-74(2007)) 此外，GDNF 在治療肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis) (ALS)、成癮癥、酗酒和抑郁癥的動物模型中具有醫(yī)療作用(綜述見 Bohn，Exp. Neurol, 190 :263-275(2004) ；Messer et al.，Neuron, 26 247-257(2000) ；He et al. , J. Neurosci. ,25 :619-628(2005) ；Angelucci et al. , Int. J. Neuropsycho-pharmacol.，6 =225-231 (2003)) GDNF 在神經(jīng)系統(tǒng)之外也有重要作用。 它是腎發(fā)育過程中的形態(tài)發(fā)生素，并且能夠調(diào)節(jié)精原細(xì)胞的分化(綜述見Sariola and Saarma, J. Cell Sci. 116 :3855-3862(2003))。在例如美國專利6，362，319和歐洲專利06102M中公開了( α )pro_GDNF蛋白，截短形式的⑶NF在美國專利6，184，200和歐洲專利0920448中有公開。已經(jīng)利用成熟⑶NF蛋白進行了治療帕金森氏癥的臨床試驗。臨床前試驗中得到的結(jié)果很有希望(Gill et al., Nat. Med. ,9 :589-595(2003) ；Slevin et al，J. Neurosurg.，102 :401 Q005))，但是 I/II 期臨床試驗的結(jié)果不令人滿意。據(jù)報道帕金森氏癥的癥狀沒有統(tǒng)計學(xué)上顯著的改善，并且存在著潛在的安全風(fēng)險。因此，成熟⑶NF蛋白的臨床試驗被全部終止(Lang et al. , Ann. Neurol,59 :459-466(2006))。pre-( β )pro-GDNF mRNA 剪接變體由 Suter-Crazzolara 禾口 Unsicker (Neuroreport, 5 =2486-2488)在1994年首次描述了存在于大鼠組織，由Matsushita等 (Gene, 203 :149-157(1997))在 1997 年描述存在于小鼠組織，Grimm 等(Hum. MoI. Genet.， 12 :1873-1886 (1998) )1998年報道存在于人組織。除了 mRNA的表達數(shù)據(jù)，Trupp等(J. Cell Biol, 130 :137-148(1995))顯示，pre-( β ) pro_GDNF cDNA所編碼的分泌的 GDNF 蛋白在 ElO 雞椎旁交感神經(jīng)元中促進了強健存活、廣泛的神經(jīng)突生長并提高了細(xì)胞體的大小。發(fā)明概述本申請中描述的發(fā)明顯示，除了以前知道的被稱為pre-(a)pro-GDNF和 pre- ( β ) pro-GDNF的⑶NF mRNA剪接變體，還存在著第三個不同的剪接變體，稱為 pre- ( y ) pro-⑶NF (圖 3 和 4)。人 pre- ( a ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF 的開放讀碼框 (ORFs)從外顯子2開始，而pre-( γ )pro-GDNF剪接變體缺少整個外顯子2的序列，而是在外顯子1中含有替代的蛋白翻譯起始密碼子CTG(圖2)。pre-(y)pro-GDNF mRNA所編碼的(γ )pro_GDNF蛋白的前原區(qū)長度為47個氨基酸(aa)，比(a) pro-GDNF的前原區(qū)短30個aa (

圖1)。pre-( y ) pro-GDNF的前原區(qū)的26 個C末端aa由外顯子3編碼，因此與pre- ( α ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF中的相應(yīng)區(qū)域相同。(Y)Pro-GDNF的前21個aa由外顯子1編碼，是該剪接變體特有的(圖2)。由這三種GDNF剪接變體產(chǎn)生的成熟GDNF蛋白非常可能是一樣的(圖1)。我們的結(jié)果顯示(α ) pro-GDNF、( β ) pro-GDNF 和(Y ) pro-GDNF 以原-GDNF 蛋白和成熟蛋白的形式分泌，其中成熟蛋白是原-GDNF被蛋白水解切割產(chǎn)生的。(cOpro-GDNF 和成熟⑶NF的分泌是組成性的，而(β ) pro-GDNF和(γ ) pro-GDNF的分泌是神經(jīng)元活性依賴性的，即受到神經(jīng)元和神經(jīng)生理刺激的調(diào)節(jié)。這使得(i3)pro-GDNF和(Y)pro-GDNF以及它們的編碼cDNAs比(α ) pro-GDNF及其cDNA更有可能成為基因療法治療PD的治療分子。
因此，本發(fā)明的主要對象是由人pre-(Y)pro-GDNF剪接變體編碼的，包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的純化和分離的人(Y)pro-GDNF蛋白剪接變體。作為對比，我們也純化和分離了由小鼠pre-(Y)pro-GDNF剪接變體編碼的，包含SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的小鼠(Y ) pro-GDNF蛋白剪接變體。發(fā)明的另一個對象是人(Y)pro-GDNF蛋白剪接變體的修飾，其中氨基端亮氨酸殘基被甲硫氨酸殘基代替。所述修飾的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。發(fā)明的再一個對象是人pre-( γ )pro-GDNF的成熟多肽部分，包含SEQ IDNO 2中的氨基酸1到134，以及(γ )pro-序列，即SEQ ID NO 2中氨基酸-47到-1的序列部分， 這部分具有調(diào)控功能但不含信號序列。發(fā)明的一個對象是人(Y)ro-GDNF蛋白剪接變體的前原氨基酸序列，以及修飾的前-原序列，這兩個氨基酸序列分別如SEQ ID N0:19和SEQ IDNO :21所示。SEQ ID NO: 21中顯示的具有調(diào)控功能的前-原序列的(Y)pro部分也包含在本發(fā)明中。人(Y )pro_GDNF蛋白剪接變體的截短形式，即缺少成熟多肽部分中N末端的38 個氨基酸(SEQ ID NO :24)，及其如上所述的Leu-Met修飾(SEQ IDNO 26)也是發(fā)明的對象。人(γ ) pro-GDNF剪接變體的V34M突變體(SEQ ID NO 27)及其如上所述的 Leu-Met修飾(SEQ ID NO 29)也是發(fā)明的對象。本發(fā)明的再一方面是純化的、分離的和V38M突變的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白剪接變體(pre-(i3)pro-GDNF)，以及所述pre-(i3)pro-GDNF的截短形式，該截短形式缺少成熟多肽部分N末端的38個氨基酸。這些蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID N0:31和SEQ ID NO :35所示。另外，pre-( β ) pro-GDNF剪接變體及編碼該變體的多核苷酸(如SEQ IDNO 51所示)在特別是利用基因療法治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病 (neurological disorder)或神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative disease)中的用途，也是發(fā)明的一個具體方面。發(fā)明還涉及純化的、分離的和V64M突變的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白剪接變體(pre-(a)pro-GDNF)。其氨基酸序列如SEQ ID NO 33所示。發(fā)明的另一些對象是編碼以上指定形式的GDNF蛋白剪接變體的分離的多核苷酸。特異結(jié)合(Y)pro-GDNF蛋白剪接變體的抗體構(gòu)成本發(fā)明的再一對象。還提供了與(a ) pro-GDNF、( β ) pro-GDNF和/或(Y ) pro-GDNF蛋白剪接變體的原部分特異結(jié)合的抗體。此外,還考慮了與 pre- ( a ) pro-GDNF、pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF 蛋白剪接變體的前原區(qū)特異結(jié)合的抗體。本發(fā)明的一個優(yōu)選項提供了重組形式的人pre-( γ )pro-GDNF剪接變體編碼的蛋白。應(yīng)當(dāng)理解，可以從其他哺乳動物中獲得同源pre-(Y)pr0-GDNF分子及其編碼序列。作為一個實例，提供了包含如SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的小鼠(Y)pro-GDNF蛋白剪接變體。附圖簡述圖 1 是 pre- ( a ) pro-⑶NF、pre_ ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF mRNA 編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。為了清楚起見，包含了氨基端的信號序列(前區(qū))，雖然它們在蛋白翻
7譯過程中已被切除。圖中顯示了成熟分子中的氨基酸(以織表示)，原區(qū)中的氨基酸(以表示)、前區(qū)中的氨基酸(以■表示)的數(shù)量。在Pre-(Y)pro-GDNF中，前原區(qū)以霧示。7個保守半胱氨酸的相對位置以黑色條帶指示。GDNF中兩個推測的N-糖基化位點標(biāo)有箭頭。圖 2 顯示了 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF 剪接變體的特點。在⑶NF cDNA中，剪接變體的ORFs顯示為■,未翻譯的(UTR)區(qū)域顯示為； pre- ( α ) pro-GDNF 和 pre- ( β ) pro-GDNF 的 ORFs 被分為外顯子 2 和 3，pre- ( y ) pro-⑶NF 的分為外顯子1和3。pre-(3 )pro-GDNF剪接變體的外顯子2的3’區(qū)缺少78bp0 pre-(y) pro-GDNF剪接變體的外顯子1中含有替代的蛋白翻譯起始密碼子CTG，和一個獨特的61bp 的序列。成熟⑶NF由外顯子3編碼，在全部三種剪接變體中很可能一樣。圖3。通過RT-PCR分析的小鼠⑶NF mRNA在腎組織中的表達。泳道1 胚胎第13 天(E 13)腎組織；泳道2 :E15腎組織；泳道3 :E17腎組織；泳道4 產(chǎn)后第1天(Pl)腎組織；泳道5 :P5腎組織；泳道6 :P6腎組織；泳道7 空泳道；泳道8 =PCR陰性對照。pre_( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF和pre- ( γ ) pro-⑶NF變體標(biāo)有箭頭。在樣品El3-Pl中檢測 IlJ pre- ( α ) pro-GDNF 和 pre- ( β ) pro-GDNF 變體。樣品 E13、E15 和 P1 中檢測 pre- ( γ ) pro-⑶NF變體。圖4。通過RT-PCR分析的⑶NF mRNA在成人腦組織中的表達。泳道1和2 成人腦組織；泳道 3 =PCR 陽性對照；泳道 4 陰性 PCR 對照。pre- ( α ) pro-GDNF,pre- ( β ) pro-GDNF 和pre- ( γ ) pro-GDNF變體標(biāo)有箭頭。圖5。小鼠(a)pro-GDNF和(β )pro_⑶NF蛋白在CHO細(xì)胞中表達的分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的 cDNAs克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4 μ g質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基替換為OptiMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基(上清)， 用小鼠抗GDNF抗體(3. 3 μ g/樣品)將GDNF免疫沉淀，利用15 %變性SDS-PAGE凝膠分離， 隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween (0. )的5%牛奶封閉。通過ECL方法，用兔抗 ⑶NF抗體(Santa Cruz，l 500稀釋)和偶聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀釋)檢測⑶NF。泳道1 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-( α )pro-GDNF的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物；泳道2 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-(i3)pr0-GDNF的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物；泳道3 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(陰性對照)、細(xì)胞裂解物；泳道4 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-(a)pr0-GDNF的細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道5 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-( β ) pro-GDNF的細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道6 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(陰性對照)、培養(yǎng)基。圖6。人(a)pro-GDNF和(β )pro_⑶NF蛋白在CHO細(xì)胞中表達的分析。含有人 pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNAs 克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。將生長在含有10% FCS和抗生素的 DMEM中的CHO細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4 μ g質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后 4小時，將培養(yǎng)基替換為OptiMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基(上清)，利用15%變性SDS-PAGE凝膠分離，隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween (0. 1%)中的5% 牛奶封閉。通過ECL方法，用兔抗⑶NF抗體(Santa Cruz, 1 500稀釋)和偶聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀釋)檢測⑶NF。泳道1 轉(zhuǎn)染了人pre-(a)pro-GDNF的細(xì)胞，細(xì)胞裂解物；泳道2 轉(zhuǎn)染了人pre-(i3)pro-GDNF的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物；泳道3 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(陰性對照)、細(xì)胞裂解物；泳道4 轉(zhuǎn)染了人pre-( α )pro-GDNF的細(xì)胞、培養(yǎng)基； 泳道5 轉(zhuǎn)染了人pre-(i3 )pro-GDNF的細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道6 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(陰性對照)、
培養(yǎng)基。圖7。小鼠(Y)pro-GDNF蛋白在BHK細(xì)胞中表達的分析。含有小鼠pre_(i3) pro-GDNF或pre- ( γ ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的pre- ( y ) pro-⑶NF cDNAs克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的BHK細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4 μ 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基替換為OptiMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基 (上清)，用小鼠抗⑶NF抗體(3. 3 μ g/樣品)將⑶NF免疫沉淀，利用15 %變性SDS-PAGE 膠分離，隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween(0. )的5%牛奶封閉。通過ECL方法，用兔抗⑶NF抗體(Santa Cruz,l 500稀釋)和偶聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白二抗 (1 2000稀釋)檢測⑶NF。泳道1 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物； 泳道2 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-(Y)pro-GDNF的細(xì)胞、細(xì)胞裂解物；泳道3 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(陰性對照)、細(xì)胞裂解物。圖8A和8B。人(Y ) pro-GDNF蛋白在BHK和C0S-7細(xì)胞中表達的分析。含有人pre- ( y ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNAs (含有ATG或 CTG作為蛋白翻譯的起始密碼子)克隆到PAAV-MCS(Stratagene)或pEGFP-Nl表達載體 (Invitrogen)中制備的。將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的BHK細(xì)胞接種至 6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4μ g質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基替換為 OptiMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集培養(yǎng)基(上清)，利用15%變性SDS-PAGE凝膠分離， 隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween(0. )的5%牛奶封閉。通過ECL方法，用兔抗 ⑶NF抗體(Santa Cruz，l 500稀釋)和偶聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀釋)檢測⑶NF。圖8A 泳道1 轉(zhuǎn)染了含有人pre-( y )pro-GDNF(翻譯起始密碼子為ATG) 的pAAV-MCS的BHK細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道2 轉(zhuǎn)染了含有人pre- ( y ) pro-GDNF (帶有翻譯起始密碼子CTG和終止密碼子)的pEGFP-Nl的BHK細(xì)胞、培養(yǎng)基。圖8B 泳道1 轉(zhuǎn)染了含有人 pre- ( y ) pro-GDNF (翻譯起始密碼子為ATG)的pAAV-MCS的C0S-7細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道2 未轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞(陰性對照)、培養(yǎng)基。圖9A和9B。⑶NF在分化PC-6. 3細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的免疫熒光分析。含有人 pre- ( α ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNAs 克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。PC-6. 3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前，在含有達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' smodified Eagle' s medium) (DMEM)、5% HS(Gibco)、 2. 5% FCS和50ng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)的分化培養(yǎng)基中分化3天。轉(zhuǎn)染后M小時，將細(xì)胞用4% PFA固定，或者先用50mM KCl和50 μ g/ml環(huán)己亞胺刺激2小時，使蛋白合成停止， 然后用 4% PFA 固定。所有細(xì)胞用 0. 5% BSA (Sigma)封閉，并用 0. 1% Triton X-IOO(Sigma) 使通透性增加。將細(xì)胞與溶于0.5% BSA中的一抗，即多克隆抗⑶NF(Gene Way Biotech Inc. ；1 750稀釋)和成熟高爾基體的單克隆抗GM130 (Abeam ;1 100稀釋)在室溫下溫育1小時，清洗，然后用二抗重復(fù)上述過程。通過顯微鏡(AX70ft~OVis ；Olympus)上的電荷耦合照相機(DP70 ；Olympus)獲取圖像。圖 9A pre-( α )pro-GDNF(白色)或 pre_(i3) pro-GDNF(灰色)編碼的蛋白在未被刺激的PC_6. 3細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的定量。顯示了蛋
9白在單獨高爾基體中或者在囊泡+/_高爾基體中的百分比(n = 3)。= 0. 0023.誤差條顯示 SD。圖 9B:Q pre-(a)pro-GDNF 和 pre-(0)pro_GDNF 編碼的蛋白在分化 PC-6. 3 細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的定量。顯示了蛋白在單獨高爾基體中、在囊泡+/_高爾基體中或者在單獨囊泡中的百分比(n = 3)。細(xì)胞沒有處理(oh)或者用50mM KCl和50 μ g/ml環(huán)己亞胺處理2小時(2h)。圖10。收集自分化PC-6. 3細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中的小鼠⑶NF Western印跡分析。 含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNAs克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。將生長在含有10%馬血清 (HS)、5%胎牛血清(FCS)和抗生素的DMEM中的PC-6. 3細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約 80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4yg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基替換為含有5% HS和2. 5% FCS、 50mg/ml神經(jīng)生長因子(NGF)和抗生素的DMEM分化培養(yǎng)基。72小時后，用溶于DMEM的25mM KCl將PC-6. 3細(xì)胞去極化5小時。對照(未去極化的)細(xì)胞用DMEM處理。收集培養(yǎng)基(上清)，利用15%變性SDS-PAGE凝膠分離，隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween (0.1%) 的5%牛奶封閉。通過ECL方法，用兔抗⑶NF抗體(Santa Cruz，l 500稀釋)和偶聯(lián)HRP 的驢抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀釋)檢測⑶NF。在細(xì)胞培養(yǎng)基中，pro-GDNF、加工過的中間體pro-GDNF和成熟⑶NF條帶標(biāo)有箭頭。泳道1 轉(zhuǎn)染了小鼠pre- ( α ) pro-GDNF的未去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道2 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的去極化的PC-6. 3 細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道3 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的未去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基； 泳道4 轉(zhuǎn)染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基。圖11。收集自分化PC-6. 3細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中的人⑶NF Western印跡分析。含有人pre-( α )pro-GDNF或pre-( β )pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的 cDNAs克隆到pAAV-MCS表達載體(Stratagene)中制備的。將生長在含有10% HS、5% FCS 和抗生素的DMEM中的PC-6. 3細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4 μ g 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基替換為含有5% HS和2. 5% FCS、50mg/ml NGF和抗生素的 DMEM分化培養(yǎng)基。72小時后，用溶于DMEM的50mM KCl將PC-6. 3細(xì)胞去極化5小時。對照(未去極化的)細(xì)胞用DMEM處理。收集培養(yǎng)基(上清)，利用15%變性SDS-PAGE凝膠分離，隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween(0. )的5%牛奶封閉。通過ECL方法，用兔抗⑶NF抗體(SantaCruz，1 500稀釋)和偶聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000 稀釋)檢測⑶NF。泳道1 轉(zhuǎn)染了人pre-(a)pro-GDNF的未去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道2 轉(zhuǎn)染了人pre-(a )pro-GDNF的去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道3 轉(zhuǎn)染了人pre- ( β ) pro-GDNF的未去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道4:轉(zhuǎn)染了人pre_(i3) pro-GDNF的去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基。圖12A和12B。通過ELISA分析確定PC-6. 3細(xì)胞中的⑶NF濃度。含有小鼠 pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNAs 克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。在pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen) 中含有不帶終止密碼子的大鼠前-原-BDNF的表達構(gòu)建體作為對照。將生長在含有10% HS,5% FCS和抗生素的DMEM中的PC-6. 3細(xì)胞接種至M孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時， 每孔轉(zhuǎn)染0. 8 μ g質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成含有5 % HS和2. 5% FCS、50mg/ml NGF和抗生素的DMEM分化培養(yǎng)基。72小時后，用溶于DMEM的50mM KCl將PC-6. 3細(xì)胞去
10極化2小時。對照(未去極化的)細(xì)胞用DMEM處理。收集培養(yǎng)基(上清)，利用⑶NF Efflax ImmunoAssay System (Promega)分析 GDNF,利用 BDNF Emax ImmunoAssay System (Promega) 分析BDNF。圖12A:第1欄轉(zhuǎn)染了人pre-(a)pro-GDNF的去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；第2欄轉(zhuǎn)染了人pre-( a )pro-GDNF的未去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；第3欄轉(zhuǎn)染了人pre-( β )pro-GDNF的去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；第4欄轉(zhuǎn)染了人pre-( β ) pro-⑶NF的未去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基，(n = 3) · *，P = 0. 092227。誤差條表示SD0 圖12Β 第1欄轉(zhuǎn)染了大鼠前-原-BDNF的去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基；第2欄轉(zhuǎn)染了大鼠前-原-BDNF的未去極化的PC-6. 3細(xì)胞、培養(yǎng)基，(n = 3).*,P = 0. 00307。誤差條表示 SD。圖 13Α 和 i;3B。321/pro-⑶NF 抗體識別 CHO 細(xì)胞中 pre- ( a ) pro-⑶NF、pre_ ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF的原-結(jié)構(gòu)域特異性的免疫熒光分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表達載體 (Invitrogen)中制備的。含有人 pre_( β )pro_GDNF、人 pre_( γ )pro_GDNF 的表達構(gòu)建體 (含有ATG作為蛋白編碼起始密碼子和人pre-⑶NF)是通過將帶有終止密碼子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表達載體(Stratagene)中制備的。由空的pEGFP-Nl載體表達綠色熒光蛋白(GFP)。將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至4孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染0. 8 μ g質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成含有10% FCS和抗生素的新鮮DMEM。轉(zhuǎn)染后M小時，用4%仲甲醛(Sigma)將細(xì)胞固定，并用0. 1 % "Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。將細(xì)胞與溶于0. 5% BSA中的一抗，即抗⑶NF原-結(jié)構(gòu)域的多克隆321/pro-GDNF(l 200稀釋)和抗成熟⑶NF的單克隆小鼠抗⑶NF(1 100稀釋)在室溫下溫育1小時，清洗，然后用二抗重復(fù)上述過程。細(xì)胞核用Hoechst染色。通過顯微鏡(AX70Provis ；Olympus)上的電荷耦合照相機(DP70 ；Olympus)獲取圖像。圖13A 在CHO細(xì)胞中過表達小鼠(a)pro-GDNF、人(β ) pro-GDNF、人(Y )pro_GDNF和沒有原區(qū)的人成熟⑶NF，用321/pro-GDNF (紅色)和抗⑶NF (綠色)雙重免疫熒光染色。將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色作為對照。細(xì)胞核以藍色顯示。圖13B:在CHO細(xì)胞中表達GFP蛋白(綠色)，細(xì)胞用321/pro-GDNF抗體(紅色)免疫熒光染色。細(xì)胞核以藍色顯示。圖 14A 和 14B。320/ ( a ) pro-⑶NF 抗體識別 CHO 細(xì)胞中 pre- ( a ) pro-⑶NF 的原-結(jié)構(gòu)域特異性的免疫熒光分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。含有人pre-( γ )pro-GDNF的表達構(gòu)建體(含有ATG作為蛋白編碼起始密碼子和人pre-GDNF)是通過將帶有終止密碼子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表達載體(Stratagene) 中制備的。由空的pEGFP-Nl載體表達綠色熒光蛋白(GFP)。將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至帶有蓋片的4孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染0. Syg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成含有10% FCS和抗生素的新鮮DMEM。轉(zhuǎn)染后M小時，用4%仲甲醛(Sigma)將細(xì)胞固定，并用0. 1% Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。將細(xì)胞與溶于0.5% BSA中的一抗，即抗(a)pro-GDNF原-結(jié)構(gòu)域的多克隆320/ (a)pro-GDNF(l 200稀釋)和抗成熟GDNF的單克隆小鼠抗GDNF(1 100稀釋)在室溫下溫育1小時，清洗，然后用二抗重復(fù)上述過程。細(xì)胞核用Hoechst染色。通過顯微鏡 (AX70Provis ；Olympus)上的電荷耦合照相機(DP70 ；Olympus)獲取圖像。圖14A 在CHO細(xì)胞中過表達小鼠(a)pro-GDNF、小鼠(β )pro-GDNF、人(Y )pro-GDNF和沒有原區(qū)的人成熟⑶NF，用320/( a )pro-GDNF(紅色)和抗⑶NF(綠色)雙重免疫熒光染色。細(xì)胞核以藍色顯示。圖14B 在CHO細(xì)胞中表達GFP蛋白(綠色)，細(xì)胞用320/( a ) pro-GDNF抗體(紅色)免疫熒光染色。細(xì)胞核以藍色顯示。圖 15A 和 15B。322/ ( β ) pro-⑶NF 抗體識別 CHO 細(xì)胞中 pre- ( β ) pro-⑶NF 的原-結(jié)構(gòu)域特異性的免疫熒光分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF的表達構(gòu)建體是通過將帶有終止密碼子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中制備的。含有人pre-( γ )pro-GDNF的表達構(gòu)建體(含有ATG作為蛋白編碼起始密碼子和人pre-GDNF)是通過將帶有終止密碼子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表達載體(Stratagene) 中制備的。由空的PEGFP-Nl載體表達綠色熒光蛋白(GFP)。將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至帶有蓋片的4孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染0. Syg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成含有10% FCS和抗生素的新鮮DMEM。轉(zhuǎn)染后M小時，用4%仲甲醛(Sigma)將細(xì)胞固定，并用0. 1% Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。將細(xì)胞與溶于0.5% BSA中的一抗，即抗(i3)pro-GDNF原-結(jié)構(gòu)域的多克隆322/ (^)pro-GDNF(l 200稀釋)和抗成熟GDNF的單克隆小鼠抗GDNF(1 100稀釋)在室溫下溫育1小時，清洗，然后用二抗重復(fù)上述過程。細(xì)胞核用Hoechst染色。通過顯微鏡 (AX70Provis ；Olympus)上的電荷耦合照相機(DP70 ；Olympus)獲取圖像。圖15A 在CHO 細(xì)胞中過表達小鼠(a)pro-GDNF、小鼠(β )pro-GDNF、人(Y )pro-GDNF和沒有原區(qū)的人成熟⑶NF，用322/(β )pro-GDNF(紅色)和抗⑶NF(綠色)雙重免疫熒光染色。細(xì)胞核以藍色顯示。圖15B 在CHO細(xì)胞中表達GFP蛋白(綠色)，細(xì)胞用322/( β ) pro-GDNF抗體(紅色)免疫熒光染色。細(xì)胞核以藍色顯示。圖 16A、16B 禾Π 16C。321/pro-⑶NF 抗體識別 CHO 細(xì)胞中 pre-( a ) pro-GDNF、 pre-( β ) pro-⑶NF和pre- ( γ ) pro-GDNF的原-結(jié)構(gòu)域特異性的Western印跡分析。將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4yg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成aiil OptiMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基(上清)，將培養(yǎng)基濃縮，樣品利用15% 變性SDS-PAGE膠分離，隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween(0. 1 % )的5 % 牛奶封閉。通過ECL方法，用多克隆321/pro-GDNF抗體(1 500稀釋)或抗成熟⑶NF的多克隆D20抗體(Santa Cruz, 1 500稀釋)以及偶聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀釋)檢測⑶NF。泳道1 轉(zhuǎn)染了人pAAV-MCS-pre-( α ) pro-⑶NF 的 CHO 細(xì)胞、細(xì)胞；泳道 2 轉(zhuǎn)染了人 pAAV-IRES-hrGFP-pre-( α ) pro-⑶NF 的CHO細(xì)胞、細(xì)胞；泳道3 轉(zhuǎn)染了人pAAV-MCS-pre-( α )pro-GDNF的CHO細(xì)胞、 培養(yǎng)基；泳道 4 轉(zhuǎn)染了人 pAAV-IRES-hrGFP-pre-(a )pro-GDNF 的 CHO 細(xì)胞、 培養(yǎng)基；泳道5 轉(zhuǎn)染了人pAAV-MCS-pre-( β )pro-GDNF的CHO細(xì)胞、細(xì)胞；泳道 6 轉(zhuǎn)染了人 pAAV-IRES_hrGFP-pre-(0 )pro-GDNF 的 CHO 細(xì)胞、細(xì)胞；泳道 7 轉(zhuǎn)染了人pAAV-MCS-pre-(i3 )pro-⑶NF的CHO細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道8 :轉(zhuǎn)染了人 pAAV-IRES-hrGFP-pre-( β )pro-GDNF的CHO細(xì)胞、培養(yǎng)基；泳道9 轉(zhuǎn)染了表達GFP的空 pEGFP-Nl載體的CHO細(xì)胞，細(xì)胞；泳道10 轉(zhuǎn)染了人pAAV-MCS-pre_GDNF的CHO細(xì)胞，細(xì)胞；泳道11 轉(zhuǎn)染了表達GFP的空pEGFP-Nl載體的CHO細(xì)胞，培養(yǎng)基；泳道12 轉(zhuǎn)染了人
12pAAV-MCS-pre-GDNF的CHO細(xì)胞，培養(yǎng)基。圖16A 用321/pro_GDNF抗體檢測的樣品。圖16B 用D20抗體檢測的樣品。圖16C 用321/pro-GDNF抗體檢測(a) pro-GST和(β ) pro-GST 融合蛋白。圖 17A、17B、17C 禾Π 17D。320バ α )pro-GDNF 抗體識別 CHO 細(xì)胞中 pre-(a ) pro-GDNF的原-結(jié)構(gòu)域特異性的^iestern印跡分析。將生長在含有10 % FCS和抗生 素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿吋，每孔轉(zhuǎn)染4μ g質(zhì) 粒。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成aiil OptiMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞和 培養(yǎng)基(上清)，將培養(yǎng)基濃縮，樣品利用15%變性SDS-PAGE膠分離，隨后轉(zhuǎn)印到尼龍 膜上，用溶于TBS-Tween (0. 1 % )的5 %牛奶封閉。通過ECL方法，用多克隆320/ ( a ) pro-GDNF抗體(1 500稀釋)或多克隆D20抗體(Santa Cruz，l 500稀釋)以及偶 聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白ニ抗(1 2000稀釋)檢測GDNF。細(xì)胞轉(zhuǎn)染了以下構(gòu)建體 泳道 1 小鼠 pre-( α )pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 2 人 pre-( α )pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 3 人 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( α ) pro-⑶NF ；泳道 4 人 pAAV-MCS-pre- ( α ) pro-⑶NF ；泳道 5 小鼠 pre- ( β ) pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 6 人 pre- ( β ) pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 7 人 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( β ) pro-⑶NF ；泳道 8 人 pAAV-MCS-pre- ( β ) pro-⑶NF ；泳道 9 表 達 GFP 的空 pEGFP-Nl 載體；泳道 10 沒有原區(qū)的 pAAV-MCS-pre-GDNF。圖 17A 用 320/ ( α ) pro-GDNF抗體檢測的CHO細(xì)胞，細(xì)胞。圖17B 用320/ ( α ) pro-GDNF抗體檢測的CHO細(xì)胞， 培養(yǎng)基。圖17C 用D20抗體檢測的CHO細(xì)胞，細(xì)胞。圖17D 用D20抗體檢測的CHO細(xì)胞，
培養(yǎng)基。發(fā)明詳述縮略語aa氨基酸ALS肌萎縮側(cè)索硬化癥AtT-20細(xì)胞系小鼠垂體腫瘤細(xì)胞系BDNF腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子BHK-21幼倉鼠腎細(xì)胞系bp堿基對BSA牛血清清蛋白CDR補決定區(qū)CHO細(xì)胞系中國倉鼠卵巢細(xì)胞系C0S-7SV40 轉(zhuǎn)化的猴腎細(xì)胞系DMEM達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基ELISA酶聯(lián)熒光吸收法ER內(nèi)質(zhì)網(wǎng)FCA弗氏完全佐劑FCS胎牛血清FIA弗氏不完全佐劑⑶NF神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子GFP綠色熒光蛋白
“變體”是指與本發(fā)明的多核苷酸或多肽不同，但保持了關(guān)鍵特性的多核苷酸或多肽。通常，變體在整體上非常相似，許多區(qū)域中與本發(fā)明的多核苷酸或多肽是相同的?！凹艚幼凅w”是由一個基因轉(zhuǎn)錄得到的不同成熟mRNA分子。這樣的剪接過程稱為選擇性剪接，在真核細(xì)胞中可能發(fā)生。由一個基因轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生的不同剪接變體蛋白，它們的功能可能有明顯不同。“嚴(yán)緊”同源物(即來源于人以外物種的Pre-(Y)Pro-GDNF剪接變體分子的核酸) 或其他相關(guān)序列(例如旁系同源物)可以利用本領(lǐng)域公知的用于核酸雜交和克隆的方法， 通過與作為探針的特定人序列的全部或部分進行低、中等或高嚴(yán)緊雜交獲得。利用cDNA、mRNA或替代的基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增技術(shù)可以用于擴增pre-(Y)pro-GDNF剪接變體。可以將這類核酸克隆到合適的載體中，通過DNA序列分析進行表征。此外，可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如自動DNA 合成儀制備pre-( γ )pro-GDNF序列所對應(yīng)的寡核苷酸。“引物”是指能夠與指定的多核苷酸模板特異雜交并提供合成其互補多核苷酸的起點的多核苷酸。當(dāng)多核苷酸引物被置于能夠誘發(fā)合成的條件下，即在有核苷酸、互補多核苷酸模板和諸如DNA聚合酶的聚合劑的情況下，可發(fā)生這類合成。引物一般是單鏈的，但可以是雙鏈。引物一般是脫氧核糖核酸，但有許多合成的和天然的引物可以用于多種應(yīng)用。引物與它被設(shè)計成要與之雜交的模板互補，從而作為合成的起始位點，但不需要反映模板的確切序列。在這種情況中，引物與模板的特異雜交取決于雜交條件的嚴(yán)緊度。引物可以標(biāo)記上例如發(fā)光的、放射性的或者熒光部分，作為可檢測部分。術(shù)語“載體”用在本文中是指編碼外源核酸的任何質(zhì)粒或病毒。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)被理解為包括協(xié)助核酸轉(zhuǎn)移到毒?；蚣?xì)胞中的非質(zhì)粒和非病毒的化合物，比如例如多聚賴氨酸化合物等。載體可以是適合作為將編碼目標(biāo)蛋白或其突變體的核酸遞送到細(xì)胞的遞送媒介的病毒載體，或者載體可以是適用于相同目的的非病毒載體。用于將DNA遞送到細(xì)胞和組織的病毒和非病毒載體的實例是本領(lǐng)域已知的，在例如Ma et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94 :12744-12746(1997))中有描述。病毒載體的實例包括，但不限于重組痘苗病毒、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺相關(guān)病毒、重組禽痘病毒、重組桿狀病毒、重組乳頭瘤病毒、重組慢病毒等(Cranage et al,EMB0 J.，5 :3057-3063 (1986) ；PCT 申請WO 94/17810和 PCT申請WO 94/23744) 0非病毒載體的實例包括，但不限于細(xì)菌、真菌、哺乳動物、昆蟲、植物或酵母載體或者脂質(zhì)體、DNA的多胺衍生物等?！疤结槨笔遣煌L度的核酸序列，根據(jù)具體用途，優(yōu)選有至少約10個核苷酸(nt)、 IOOnt或許多(例如，6000nt)。探針用于檢測相同、相似或互補的核酸序列。更長的探針可以從天然或重組來源獲得，是高度特異的，比較短的寡聚探針雜交慢得多。探針可以是單鏈或雙鏈的，其設(shè)計保證它在PCR、基于膜的雜交技術(shù)或類似ELISA技術(shù)中具有特異性。探針也可以與生物樣品中的核酸分子雜交，由此能夠直接使用在染色體作圖、連鎖分析、組織鑒定和/或分類以及多種法醫(yī)學(xué)方法和本發(fā)明的診斷方法中。“同源物”是來源于不同物種的特定基因的核酸序列或氨基酸序列?！昂怂嵝蛄型恍园俜直?％)”定義為將序列對位排列并根據(jù)需要引入缺口以達到最大序列同一性百分比后，候選序列中與特定蛋白中相同的核苷酸的百分比。
ORF是帶有起始密碼子(ATG或CTG)并以三個“終止”密碼子(TAA、TAG或TGA)之一結(jié)束的核苷酸序列。術(shù)語“抗體”取其最廣泛的含義，特別涵蓋單克隆抗體、具有多表位特異性的抗體組合物、雙特異性抗體、二體和單鏈分子，以及抗體片段(例如Fab、F(ab')和Fv)，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性。該術(shù)語還涵蓋編碼上述抗體及其衍生物的DNA片段和cDNAs。術(shù)語“單克隆抗體”用于本文是指從基本同源的抗體群(即構(gòu)成群體的各個抗體是相同的，除了少量存在的可能天然發(fā)生的突變)中獲得的抗體。單克隆抗體是高特異性的，針對的是單個抗原位點。并且，與一般包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品不同，每個單克隆抗體針對的是抗原上的單個決定簇。除了其特異性，單克隆抗體的優(yōu)勢還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)合成的，不會污染其他免疫球蛋白。修飾詞“單克隆”表明抗體是由基本同源的抗體群中獲得的特點，不應(yīng)理解為必須通過任何特定方法來制備。例如，適合用于本發(fā)明的單克隆抗體可以通過K0hleretal，Nature，256 495(1975)首先描述的雜交瘤方法來制備，或者通過重組DNA方法(參見例如，美國專利 4,816, 567 (Cabilly et al)制備?！皢慰寺　笨贵w還可以利用例如 Clackson et al,Nature, 352 :624-628(1991)和 Marks et al, J. MoI. Biol，222 :581-597 (1991)中描述的方法從噬菌體抗體文庫中分離。文中的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，以及這些抗體的片段， 只要它們表現(xiàn)出需要的生物活性。所述嵌合抗體中，重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種的抗體或者屬于特定抗體類型或亞型的抗體中的相應(yīng)序列相同或者同源，而鏈的其他部分與來自另一物種的抗體或者屬于另一抗體類型或亞型的抗體中的相應(yīng)序列相同或者同源，(Cabilly et al, Proc. Natl. Acad. Sci.USA,81 :3273-3277(1984) ； Cabilly et al，Gene,40 :157-161(1985) ；Cabilly et al，Gene，85 :553-557(1989) ；Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))。本發(fā)明的抗體還可以包含多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢栽诓溉閯游镏信嘤嗫寺】贵w，例如通過將免疫劑，如果需要的話，和佐劑一起給予各種宿主動物來誘發(fā)產(chǎn)生含有抗原特異的多克隆抗體的血清，其中所述宿主動物包括，但不限于兔、小鼠、大鼠等。通常，免疫劑和/或佐劑可以通過多次皮下或腹腔內(nèi)注射給予哺乳動物。免疫劑可以包括前-原-GDNF多肽，多肽的合適的部分或融合蛋白。給蛋白質(zhì)偶聯(lián)上已知在被免疫動物中是免疫原性的試劑可能有用。這類免疫原性蛋白的實例包括， 但不限于匙孔嘁血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑?？梢圆捎玫淖魟┑膶嵗ǜナ贤耆魟┖蚆PL-TDM佐劑(單磷酰脂A-合成海藻糖二霉菌酸酯)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以無需過多試驗而選擇出免疫接種方案。然后給哺乳動物取血，分析血清的前-原-GDNF抗體滴度。如果需要，可以給予哺乳動物強化劑直至抗體滴度提高。非人(例如小鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)或其含有來源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段。很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自諸如小鼠、大鼠或兔的非人物種的CDR的殘基(供體抗體)所代替，后者具有所需的特異性、親和力和結(jié)合容量。在某些情況中，人免疫球蛋白 Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基代替。此外，人源化抗體可以包含受體抗體或者導(dǎo)
17入的CDR或框架序列中都沒有的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進和優(yōu)化抗體性能。 通常，人源化抗體包含基本上全部至少1個，一般是兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或基本全部 CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的CDR區(qū)對應(yīng)，全部或基本全部FR區(qū)是人免疫球蛋白序列。最優(yōu)地，人源化抗體還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，一般是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更詳細(xì)內(nèi)容參見 Jones et al, Nature, 321 :522-525 (1986)、Reichmann et al，Nature，332 323-329(1988)和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol, 2 :593-596 (1992)。人源化抗體包括靈長類化的抗體，其中所述抗體的抗原結(jié)合區(qū)來源于通過用目的抗原免疫獼猴產(chǎn)生的抗體。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是不使用活生物體的酶法DNA復(fù)制技術(shù)。這項技術(shù)利用溫度介導(dǎo)的酶-DNA聚合酶允許小量DNA被指數(shù)性地擴增。逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)是用于擴增一段確定的核糖核酸(RNA)分子的技術(shù)。RNA鏈?zhǔn)紫缺荒孓D(zhuǎn)錄為它的互補DNA(cDNA)，然后利用PCR進行擴增。DNA測序是確定給定DNA片段(稱為序列)中核苷酸順序的過程。表達載體是用于向靶細(xì)胞中弓丨入并表達特定DNA序列的環(huán)形DNA分子。表達質(zhì)粒的構(gòu)建是將例如含有所需基因的ORF的特定DNA片段克隆到表達載體的過程。轉(zhuǎn)染是將外來DNA導(dǎo)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染包括在細(xì)胞上瞬時打開小孔，允許表達質(zhì)粒進入。表達質(zhì)粒一旦進入了細(xì)胞，該DNA序列編碼的蛋白即通過細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機制產(chǎn)生。質(zhì)粒DNA沒有整合到細(xì)胞基因組中，而只是瞬時表達了。細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞系或從組織中分離的原代細(xì)胞在受控條件下生長的過程。細(xì)胞在合適的溫度和混合氣體中，生長和維持在細(xì)胞培養(yǎng)器里的培養(yǎng)基中。Western印跡分析是檢測給定樣品中的蛋白的方法。該方法利用凝膠電泳將變性蛋白按照質(zhì)量分開。分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，利用能夠識別蛋白的抗體在膜上進行檢測。酶聯(lián)免疫吸收法(ELISA)分析是一種利用兩種抗體檢測樣品中存在的抗體或抗原的技術(shù)。一種抗體是抗原特異性的，另一種與抗原-抗體復(fù)合體反應(yīng)，并偶聯(lián)了酶。該二抗可以導(dǎo)致發(fā)光的、放射性或熒光底物產(chǎn)生信號。在免疫熒光分析中，利用一抗來檢測特定蛋白表位。該一抗的檢測通過標(biāo)記了酶、 放射標(biāo)記或熒光團的二抗來實現(xiàn)。利用熒光或共聚焦顯微鏡來分析免疫熒光標(biāo)記的細(xì)胞和組織樣品。本發(fā)明基于新發(fā)現(xiàn)的⑶NF基因的新剪接變體-pre-(Y)pr0-GDNF。本文描述的實施例顯示，pre- ( y ) pro-GDNF mRNA在人腦中表達(圖4)，該剪接變體所編碼的蛋白的分泌受到嚴(yán)格的生物和生理調(diào)控，表明(Y )pro-GDNF蛋白是比(α )pro-GDNF有效地多的治療帕金森氏癥、ALS、成癮癥、酗酒、局部缺血、癲癇和抑郁癥的治療分子。此外，還在肺和子宮中研究了 pre-( γ )pro-GDNF mRNA的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。治療pre- ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF具有體內(nèi)基因治療用途，可用于給予哺乳動物，尤其是人來治療與GDNF活性有關(guān)的或者可以得益于GDNF-反應(yīng)性的疾病或病癥。 特別優(yōu)選的是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，優(yōu)選中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、ALS、 脊髓損傷、成癮癥和酗酒。發(fā)明特別考慮了通過基因操縱來調(diào)控蛋白表達或活性。可以使用任何合適的載體將目的轉(zhuǎn)基因?qū)雱游?。文獻中曾描述過的示范性的載體包括復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括但不限于慢病毒載體(Kim et al, J.Virol, 72 :811-816(1998) ；Kingsman & Johnson，Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46.)、腺病毒(參見例如，美國專利5，824，544、美國專利5，707，618、美國專利5，792，453、美國專利5，693，509、美國專利 5，670，488、美國專禾Ij 5，585，362、Quantin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 2581-2584(1992) > Stratford-Perricadet et al, J.Clin. Invest. , 90 :626-630(1992) 和Rosenfeld et al, Cell，68 :143-155 (1992))、逆轉(zhuǎn)錄病毒(參見例如，美國專利 5，888，502、美國專禾Ij 5，830，725、美國專利5，770，414、美國專利5，686，278、美國專利 4，861，719)、腺相關(guān)病毒(參見例如，美國專利5，474，935、美國專利5，139，941、美國專利5，622，856、美國專利5,658, 776、美國專利5，773，289、美國專利5，789，390、美國專利 5，834，441、美國專利 5，863，541、美國專利 5，851，521、美國專利 5，252，479、Gnatenko et al, J. Investig. Med. ,45 :87_98 (1997)、腺病毒-腺相關(guān)病毒雜交體(參見例如美國專利5，856，15 或者痘苗病毒或皰疹病毒(參見例如，美國專利5，879，934、美國專利5，849，571、美國專利5,830, 727、美國專利5，661，033、美國專利5，328，688)、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(BRL)、脂質(zhì)體載體(參見例如，美國專利5，631，237 (Liposomes comprising Sendai virus proteins)]，以及其基因表達可以體內(nèi)調(diào)控的病毒載體，和以上各種的組合。以上提到的全部文獻通過引用全文并入本文。復(fù)制缺陷型腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和慢病毒構(gòu)成本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。半透性的、可植入的膜裝置在某些情形中可以作為遞送藥物的手段。例如，可以將分泌可溶性(i3)pro-GDNF或(Y )pro_GDNF或嵌合體的細(xì)胞包埋起來，然后這類裝置可以植入患者。例如，植入患有帕金森氏癥的患者的腦。參見Aebischer等的美國專利 4，892，538、Aebischer 等的美國專利 5，011，472、Aebischer 等的美國專利 5，106，627、 PCT 申請 WO 91/10425、PCT 申請 WO 91/10470、Winn et al, Exper. Neurology, 113 322-329(1991)、Aebischer et al, Exper. Neurology, 111 :269-275(1991)禾口 Tresco et al, ASAI0，38 :17-23(1992)。相應(yīng)地，還包括預(yù)防或治療神經(jīng)損傷或其他(β )pro_GDNF或(γ )pro_GDNF反應(yīng)性細(xì)胞損傷的方法，所述方法包括將分泌(i3)pro-GDNF或(Y)pro-GDNF的細(xì)胞植入有需要的患者的體內(nèi)。最后，本發(fā)明包括通過植入患者來預(yù)防或治療神經(jīng)損傷或其他細(xì)胞損傷的裝置，所述裝置包含半透性膜，和包埋在所述膜內(nèi)分泌(β )pro-GDNF或(Y)pro-GDNF的細(xì)胞，其中所述膜對(i3)pro-GDNF或(Y)pro-GDNF是通透性的，而患者中對細(xì)胞有害的因子不能透過?；颊咦约旱谋浑x體轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生(0) 1~0-60順或(^) 1~0-60順的細(xì)胞可以直接植入患者，任選不進行包埋。用于活細(xì)胞膜包埋的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，制備包埋細(xì)胞及其向患者的植入無需過度試驗即可實現(xiàn)。因此，本發(fā)明包括通過將細(xì)胞植入有需要的患者體內(nèi)來預(yù)防或治療神經(jīng)損傷的方法；天然能夠產(chǎn)生或者經(jīng)工程化能夠分泌(i3)pro-GDNF或(Y)pro-GDNF的細(xì)胞。優(yōu)選地， 當(dāng)患者為人時，分泌的(β ) pro-GDNF或(γ ) pro-GDNF是可溶性的人(β ) pro-GDNF或(γ ) pro-GDNF。優(yōu)選植入物是非免疫原性的和/或防止免疫原性的植入細(xì)胞被免疫系統(tǒng)識別。 用于CNS遞送，優(yōu)選的植入部位是紋狀體。在采用病毒載體的實施方案中，優(yōu)選的多核苷酸包含合適的啟動子和多腺苷酸化序列以便促進在目標(biāo)組織中的表達。對于本發(fā)明，適用于哺乳動物細(xì)胞表達的啟動子 /增強子包括，例如巨細(xì)胞病毒啟動子/增強子(Lehner et al. , J. Clin. Microbiol, 29 2494-2502(1991) ；Boshart et al.，Cell，41 :521-530 (1985) )、Rous 肉瘤病毒啟動子 (Davis et al. ,Hum. Gene Ther.，4 :151 (199 )、猴病毒40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)(LTR)、角蛋白14啟動子和α肌球蛋白重鏈啟動子。在基因治療應(yīng)用中，基因被導(dǎo)入細(xì)胞以便實現(xiàn)體內(nèi)合成有療效的基因產(chǎn)物，用于例如取代缺陷基因?！盎蛑委煛卑ǔＲ?guī)的基因治療，這種情況通過一次治療達到持久的效果)；和給予基因治療劑，這種情況包括一次或者反復(fù)給予治療有效的DNA或mRNA。反義RNAs和DNAs可以用作治療劑來阻斷某些基因的體內(nèi)表達。研究顯示，雖然由于細(xì)胞膜限制了它們的攝取造成其在胞內(nèi)濃度低，短的反義寡核苷酸可以被輸入細(xì)胞作為抑制劑 (Zamecnik et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 :4143-4146 (1986)) 可以通過例如用不帶電荷的基團取代帶負(fù)電荷的磷酸二酯基使寡核苷酸改變以提高它們的攝入。有許多技術(shù)可以將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)核酸是被體外、離體還是體內(nèi)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)宿主的細(xì)胞中而不同。適合將核酸轉(zhuǎn)移到體內(nèi)哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)包括利用脂質(zhì)體(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721 :185-190(1982)； Fraley, et al, Proc.Natl. Acad. Sci. USA,76 :3348-3352 (1979) ；Feigner, Sci.Am, 276(6) :102-106(1997) ；Feigner, Hum. Gene Ther. ,7(15) :1791-1793, (1996))、電穿孑L (Tur-Kaspa, et al, MoI. Cell Biol,6 :716-718(1986) ；Potter, et al, Proc. Nat. Acad. ki. USA，81 :7161-7165(1984))、直接顯微注射(Harland and ffeintraub, J. Cell Biol.，101 :1094-1099(1985))、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖(Gopal，MoI. Cell Biol.，5 :1188-1190(198 )、磷酸鈣沉淀法(Graham and Van Der Eb, Virology, 52 456-467(1973) ；Chen and Okayama, MoI. Cell Biol,7 :2745-2752,(1987) ；Rippe，et al, MoI. Cell Biol. , 10 :689-695 (1990)、細(xì)胞超聲波處理(Fechheimer，et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84 :8463-8467(1987))、利用高速微粒子射擊的基因轟擊(Yang, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :9568-9572 (1990)。目前優(yōu)選的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒(一般是逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體進行的轉(zhuǎn)染和病毒外殼蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau et al, Trends in Biotechnology，11 :205-210 (1993))。某些情況中，給核酸源提供靶向到目標(biāo)細(xì)胞的試劑是可取的，比如靶細(xì)胞細(xì)胞表面上的膜蛋白的特異抗體、靶細(xì)胞上的受體的配體。采用脂質(zhì)體的情況中，可以利用蛋白質(zhì)進行導(dǎo)靶和/或協(xié)助攝取，所述蛋白質(zhì)能夠結(jié)合細(xì)胞表面上與胞吞相關(guān)的膜蛋白，這類蛋白包括例如對特定細(xì)胞類型嗜性的衣殼蛋白或其片段、內(nèi)化參與循環(huán)的蛋白的抗體以及能夠靶向到胞內(nèi)位置并提高胞內(nèi)半壽期的蛋白。 受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)在例如 Wu et al, J. Biol. Chem.，262 :4429-4432(1987)和 Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 :3410-3414(1990)中有描述。有關(guān)目前已知的基因標(biāo)記和基因治療試驗方案的綜述見Anderson et al，Science，256 :808-813 (1992)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，可以將表達構(gòu)建體包埋在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是囊狀結(jié)構(gòu)，其特征在于磷脂雙層膜和內(nèi)部的水性基質(zhì)。多室脂質(zhì)體具有通過水性基質(zhì)分開的多個脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮在過量的水溶液中可以自動形成所述脂質(zhì)體。脂類成分在形成閉合的結(jié)構(gòu)前進行自身重組，將水和溶解的溶質(zhì)包裹在脂雙層之間((^hosh and Bachhawat, “ In Liver Diseases，Targeted Diagnosis And Therapy UsingSpecific Receptors And Ligands, “ Wu, G. , Wu, C, ed. , New York :Marcel Dekker, PP. 87-104(1991))。向陽離子脂質(zhì)體中加入DNA導(dǎo)致脂質(zhì)體拓?fù)滢D(zhuǎn)換為光學(xué)雙折射液晶凝聚球(Radler，et al, Science，275 :810-814 (1997))。這些 DNA-脂質(zhì)復(fù)合體是可能用于基因治療和遞送的非病毒載體。本發(fā)明還考慮了涉及“脂轉(zhuǎn)染”技術(shù)的多種商業(yè)方法。發(fā)明的某些實施方案中，脂質(zhì)體可以與血凝病毒(HVJ)復(fù)合。已有研究顯示這有助與細(xì)胞膜的融合，促進脂質(zhì)體包埋的DNA進入細(xì)胞(Kaneda, et al.，Science，243 :375-378 (1989))。在其他實施方案中，脂質(zhì)體可以與非組蛋白性染色體蛋白質(zhì)復(fù)合或者與它一起使用(HMG-I) (Kato,et al. ,J.Biol. Chem.，266 :3361-3364 (1991))。再一些實施方案中，脂質(zhì)體可以與HVJ和HMG-I兩者復(fù)合或一起使用。因為這類表達構(gòu)建體已被成功地用于核酸的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達，它們可以用在本發(fā)明中?？梢杂糜趯⒕幋a治療基因的核酸遞送到細(xì)胞的其他載體遞送系統(tǒng)包括受體介導(dǎo)的遞送媒介。這類媒介利用了幾乎所有真核細(xì)胞中都存在的受體介導(dǎo)的胞吞對大分子的選擇性攝取。因為各種受體的細(xì)胞類型特異性分布，遞送可以是高度特異的(Wu and ffu,Adv. Drug Del. Rev.，12 :159-167(1993))。在發(fā)明的另一個實施方案中，表達構(gòu)建體可以僅由裸露的重組DNA或質(zhì)粒構(gòu)成。 這類構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移可以通過以上提到的任何可以物理地或化學(xué)地透過細(xì)胞膜的方法來實現(xiàn)。這特別適用于體外轉(zhuǎn)移，但也可以應(yīng)用在體內(nèi)使用。Dubensky等(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81 :7529-7533(1984))成功地將多瘤病毒DNA以CaPO4沉淀物的形式注射到成年和新生小鼠的肝和脾內(nèi)，表現(xiàn)出活躍的病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83 :9551-9555(1986))也展示直接腹膜內(nèi)注射CaPO4沉淀的質(zhì)粒造成了轉(zhuǎn)染基因的表達。本發(fā)明另一個向細(xì)胞轉(zhuǎn)移裸露DNA表達構(gòu)建體的實施方案可以包括粒子轟擊。這種方法依賴的是將包被DNA的微粒加快到高速，使它們能夠在不殺傷細(xì)胞的情況下穿透細(xì)胞膜并進入細(xì)胞(Klein，et ah, Nature, 327 :70-73(1987))的能力。已開發(fā)出給小粒子加速的幾種裝置。一種這類裝置依賴高壓放電產(chǎn)生電流，然后電流提供原動力(Yang，et ah, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87 :9568-9572 (1990))。使用的微粒由生物惰性物質(zhì)，比如鎢或金珠構(gòu)成。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白如何將基因遞送應(yīng)用于體內(nèi)(in vivo)和離體(exvivo)情形。對于病毒載體，通常要制備病毒載體儲液。根據(jù)病毒類型和可達到的滴度，可以給患者遞送 IxlO4, IxlO5, IxlO6, IxlO7, IxlO8、IxlO9, IxlO10, IxlO11 或 IxlO12 個感染性顆粒。通過比較相對的攝取效率，類似的數(shù)量可以推及脂質(zhì)體或其他非病毒制劑。藥物可接受組合物類的制劑在下文討論。給各種細(xì)胞類型考慮了多種途徑。對于幾乎任何細(xì)胞、組織或器官類型，考慮了系統(tǒng)遞送。其他實施方案中，可以采取各種直接的、局部和區(qū)域性的措施。例如，可以給細(xì)胞、 組織或器官直接注射表達載體或蛋白。在不同的實施方案中，還考慮了離體基因治療。在離體實施方案中，取出患者的細(xì)胞，保持在體外至少一段時間。在這個時間內(nèi)，遞送治療劑，之后將細(xì)胞重新導(dǎo)入患者。將基因轉(zhuǎn)移到體內(nèi)靶細(xì)胞的策略包括以下基本步驟(1)選擇其表達與CNS疾病或功能障礙相關(guān)的合適的轉(zhuǎn)基因；( 挑選和建立適宜有效的基因轉(zhuǎn)移載體；C3)證明靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因表達穩(wěn)定有效地進行；(4)證明體內(nèi)基因治療程序沒有引起嚴(yán)重的有害效應(yīng)；以及( 證明宿主動物中出現(xiàn)希望的表型效應(yīng)。雖然可以使用其他載體，用于發(fā)明所述方法的優(yōu)選載體是病毒和非病毒載體。選定的載體應(yīng)當(dāng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)1)載體必須能夠感染靶細(xì)胞，因此必須挑選有合適宿主范圍的病毒載體；幻被轉(zhuǎn)移的基因應(yīng)當(dāng)能夠在細(xì)胞中保留并表達較長的一段時間(而不引起細(xì)胞死亡)從而在細(xì)胞中穩(wěn)定地存在并表達；以及幻載體應(yīng)當(dāng)對靶細(xì)胞，如果有的話，只有很小的損傷。因為成年哺乳動物腦細(xì)胞不能分裂，選擇的重組表達載體必須能夠轉(zhuǎn)染不分裂的細(xì)胞并在其中表達。當(dāng)前已知具有這一能力的載體包括諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)的 DNA病毒，和某些RNA病毒，比如基于HIV的慢病毒、貓免疫缺陷病毒(FIV)和馬免疫缺陷病毒(EIV)。其他具有這一能力的載體包括單純皰疹病毒(HSV)。但是，這些病毒中的一些 (例如AAV和HSV)會產(chǎn)生毒性和/或有免疫原性。最近，建立了一個基于HIV的慢病毒載體系統(tǒng)，與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣，可以將轉(zhuǎn)基因插入宿主細(xì)胞的核內(nèi)(增加表達的穩(wěn)定性)， 但是與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，該系統(tǒng)可以將基因插入不分裂細(xì)胞的核內(nèi)。慢病毒載體曾被證實在直接注射后，能夠穩(wěn)定地感染腦細(xì)胞，并穩(wěn)定地表達外來轉(zhuǎn)基因而沒有可檢測到的來自病毒蛋白的致病性(參見，Naldini, et al.，Science, 272 J63167 (1996)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)。遵照最先構(gòu)建HIV-I逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的研究人員的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠構(gòu)建適用于發(fā)明所述方法的慢病毒載體(涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建的更一般性的參考文獻，參見例如 Kriegler, Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, W. Freeman Co. (NY 1990)禾口 Murray, E J, ed. , Methods inMolecular Biology, Vol. 7, Humana Press(NJ 1991))。重組AAV載體的作用很有效，感染相對長期，一般沒有毒性，除非載體中重組了有毒的轉(zhuǎn)基因。AAV是助手依賴型的細(xì)小病毒，由一個圍繞著簡單、沒有包被的二十面體蛋白外殼的4. 71Λ單鏈DNA基因組構(gòu)成。成年人群中大約85%是AAV血清陽性的。但是，沒有與AAV感染關(guān)聯(lián)的病理學(xué)。AAV依靠腺病毒或皰疹病毒作為助手來建立建立有成效的感染。 在沒有輔助病毒時，AAV基因組應(yīng)對毒性攻擊(UV輻射、羥基脲接觸)時也會擴增。如果沒有毒性攻擊或者輔助病毒，野生型AAV將位點特異地整合到人的第19號染色體。整合由 AAV Rep蛋白驅(qū)動，該蛋白介導(dǎo)在染色體整合位點形成AAV-染色體復(fù)合體。大部分病毒基因組(96% )將被去除，僅留下兩個145堿基對(bp)的反向末端重復(fù)(ITRs)用于病毒基因組的包裝和整合。本領(lǐng)域已建立了有效繁殖重組AAV、rAAV的技術(shù)利用迷你腺病毒基因組質(zhì)粒、在一個質(zhì)粒中編碼AAV包裝功能和腺病毒輔助功能的質(zhì)粒。而且，用于分離高度純化 WrAAV以及滴定rAAV儲液的方法比較直接和迅速。為了跟蹤rAAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達，經(jīng)常在rAAV中以雙順反子使用綠色熒光蛋白(GFP)，該蛋白是已被很好地研究過的238個氨基酸的熒光蛋白。借助不同啟動子選擇性和特異性地表達rAAV介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移也已鑒定。 我們使用可以購買到的AAV Helper-free system(Stratagene)來構(gòu)建我們的重組AAVs。 利用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可以將β )pro-GDNF和pre-( γ )pro_GDNF克隆到AAV系統(tǒng)載體/質(zhì)粒中。表達pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的病毒載體
用于本發(fā)明重組表達神經(jīng)系統(tǒng)生長因子的載體的構(gòu)建可以利用常規(guī)技術(shù)實現(xiàn)， 這些技術(shù)不需要對本領(lǐng)域技術(shù)人員詳細(xì)說明。文中列出了構(gòu)建AAV 載體的具體方面。 更詳細(xì)的參考，普通技術(shù)人員可能希望查閱Maniatis et al.，in Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)。簡單來說，重組表達載體的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)。為了分析證實構(gòu)建載體中的序列正確，可以用連接混合物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在合適的情況中，通過抗生素抗性選擇成功的轉(zhuǎn)化子。制備來自轉(zhuǎn)化子的載體，通過限制酶切進行分析和/或通過例如Messing等的方法(Nucleic Acids Res.，9 :309 (1981))、Maxam 等的方法(Methods in Enzymology， 65:499(1980))或者本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其他合適方法測序。利用例如Maniatis等 (Molecular Cloning, pp. 133-134 (1982))描述的常規(guī)的凝膠電泳將切割過的片段按照大小分離。在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后水平調(diào)控cDNA(pre_( β )pro_GDNF和pre_( γ ) pro-GDNF-ATG)的表達。轉(zhuǎn)錄起始是基因表達中的早期關(guān)鍵步驟。其取決于啟動子和增強子序列，受到與這些序列相互作用的特異細(xì)胞因子的影響。許多原核基因的轉(zhuǎn)錄單位由啟動子，在許多情況中還有增強子或調(diào)控元件組成(Banerji et al. , Cell 27 =299(1981)； Corden et al. , Science,209 1406 (1980)； 禾口 Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50 :349(1981))。對于逆轉(zhuǎn)錄病毒，參與逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組復(fù)制的調(diào)控元件位于長末端重復(fù)中(LTR) (Weiss et al, eds. , The molecular biology of tumor viruses RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982))。貞^“/S氏鼠白病毒(Moloney murine leukemia virus) (MLV)和 Rous 肉瘤病毒(RSV) LTRs 含有啟動子和 ±曾強子序列(Jolly et al.，Nucleic Acids Res. , 11 :1855(1983) ；Capecchi et al.，In Enhancer and eukaryotic gene expression,Gulzman and Shenk, eds. , pp.101-02,Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991))。其他強啟動子包括來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動子和其他野生型病毒啟動子。美國專利5，720，720,6, 027，931,6, 071，889 中，以及 WO 99/61066 中可以找到制備和使用rAAV的方法以及將rAAV體內(nèi)遞送給各種細(xì)胞的方法，上述文獻均通過引用并入本文。存在不同血清型的AAV，它們表現(xiàn)出組織嗜性。因此，正確使用血清型取決于要被轉(zhuǎn)導(dǎo)的組織。關(guān)于利用腺相關(guān)病毒(AAV)和選定啟動子在神經(jīng)系統(tǒng)中進行成功的、定位、長期和無毒的轉(zhuǎn)基因表達的方法，可以參考Klein et ah, Experimental Neurology, 150 183-194(1998), “ Neuron-Specific Transduction in the Rat Septohippocampal or Nigrostriatal Pathway by Recombinant Adeno-associated Virus Vectors"。關(guān)于利用重組AAV，通過穩(wěn)定表達神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、⑶NF、BDNF進行基因治療的方法，以及產(chǎn)生的可神經(jīng)化學(xué)定量的治療效果，可以參考Klein et al. ,Neuroscience,90 815-821(1999), “ Long-term Actions of Vector-deri ved Nerve Growth Factor or Brain-derived Neurotrophic Factor on Choline Acetyltransferase and Trk Receptor Levels in the Adult Rat Basal Forebrain〃 。另一個重要的參數(shù)是要遞送到靶組織中的pre- ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF的劑量。對于病毒載體，可以以每ml神經(jīng)營養(yǎng)組合物中病毒克隆的數(shù)量來界定pre- ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF的濃度。最佳情況，要利用病毒表達載體遞送 pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF，每單位劑量的 pre- ( γ ) pro-⑶NF 應(yīng)當(dāng)包含 2· 5 到25 μ 1 pre-(Y)pro-GDNF組合物，其中所述組合物包括存在于藥物可接受液體中的病毒表達載體，每ml pre-(0)pro_GDNF或pre-(Y)pro-GDNF組合物中提供101°到IO15的 pre-( β )pro-GDNF或pre-( γ )pro-GDNF表達病毒粒子。這樣高的滴度對AAV尤其有用。 對慢病毒來說，滴度通常更低，每mllO8到101°轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU/ml)。實驗實施例1通過RT-PCR克?、荖F剪接變體cDNAs和分析⑶NF剪接變體niRNA的表達我們通過RT-PCR從小鼠腎和腦細(xì)胞(利用第一對引物42和43，以及巢式引物46 和47)以及人腎、子宮和腦細(xì)胞(利用第一對引物53和49，以及巢式引物48和54)中克隆了 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF cDNAs (圖 3 和 4)。用 RNA 提取試劑盒(Ambion)分離小鼠總RNA，人RNA購自Clontech。將來自不同組織的總RNA (5 μ g) 作為模板，以寡聚(dT) (Promega)為引物，用逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript11，hvitrogen)合成第一鏈 cDNAs。用于克隆小鼠pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF 以及人 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 和 pre- ( γ ) pro-GDNF 的引物是小鼠Gdnf基因5，方向的第一引物(引物42)5-GCTCCTGCCCGAGGTC-3 ‘ (SEQ ID NO 7)小鼠Gdnf基因3’方向的第一引物(引物43)5-CCTTTCTTCGC ACTGT AGC AG-3' (SEQ ID NO 8)小鼠Gdnf基因5，方向的巢式引物(引物46)5-GTCCGGATGGGTCTCCTGG-3‘ (SEQ ID NO 9)小鼠Gdnf基因3’方向的巢式引物(引物47)5-CACAGCAGTCTCTGGAGCCG-3‘ (SEQ ID N0:10)人Gdnf基因5’方向的第一引物(引物53)5-GACCTGTTGGGCGGGGCTC-3‘ (SEQ ID NO 11)人Gdnf基因3，方向的第一引物T(引物49)5-CCTGGGAACCTTGGTCCCTTTC-3‘ (SEQ ID N0:12)人Gdnf基因5’方向的巢式引物(弓丨物48)5' -GCTCCAGCCATCAGCCCGG-S‘ (SEQ ID NO 13)人Gdnf基因3，方向的巢式引物(弓丨物54)5' -CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG-S‘ (SEQ ID NO 14)PCR反應(yīng)在50 μ 1或25 μ 1體積中進行，其中含有2/5或1/5RT反應(yīng)作為模板和 3. 75或1. 86單位的酶混合液，混合液中分別含有熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶和Tgo DNA聚合酶(Roche)，以及按照制造商的說明 Expand LongDistance Template PCR System 試劑盒 (Roche)。第一 PCR反應(yīng)后進行巢式PCR反應(yīng)，其中使用1-2 μ 1的第一 PCR反應(yīng)作為模板。 在第一和巢式PCR反應(yīng)中，采用以下條件擴增DNA :94°C (2分鐘)；94°C (10秒)、62°C (30 秒)、68°C (1 分鐘)，10 個循環(huán)；94°C (15 秒)、62°C (30 秒)、68°C (1 分 20 秒)，25 個循環(huán)；
2468 0C (7分鐘)、4°C (5分鐘)，1個循環(huán)。擴增的RT-PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上分離，然后直接將PCR片段測序，或者將片段克隆到pCR2. 1載體(Invitrogen)中，然后通過測序確認(rèn)。DNA片段的測序用Dye Terminator (v3. 1)試劑盒(Applied Biosystems)按照制造商的建議在ABI 3100Capillary測序儀上進行。用于凝膠提取的人PCR片段測序的引物是⑶NF基因5’方向 5' -GCTCCAGCCATCAGCCCGG-3 ‘ (SEQ ID NO 15)禾口 GDNF 基因 3'方向 5' -CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG-3‘ (SEQ ID NO :16)。用于小鼠PCR片段測序的引物是GDNF 基因 5，方向(SEQ ID NO 9)和 GDNF 基因 3，方向 5，-CACAGCAGTCTCTGGAGCCG-3 ‘ (SEQ ID NO 10)。為了分析各自mRNAs的表達，用限制酶xhol和HindIII從pCR2. 1載體中切割小鼠和人 pre-(a)pro-⑶NF、pre-(0)pro-⑶NF 和 pre-(Y)pro-⑶NF，連接到用相同限制酶切割好的PEGFP-Nl表達載體中。用于給插入的PCR片段測序的引物是 5，方向 5 ‘ -CAACGGGACTTTCCAAAATG-3 ‘ (SEQ IDNO :37)和 3 ‘方向 3，-GGACACGCTGAACTTGTGG-5，(SEQ ID NO :38)。為了進行進一步的表達分析，將人pre_(a )pro-GDNF和pre-( β )pro-GDNF克隆到 pAAV-MCS 和 pAAV-IRE S-hrGFP 表達載體(Stratagene)中，得到 pAAV-MCS-pre-( α ) pro-GDNF、pAAV-MCS-pre-( β )pro_GDNF、pAAV-IRES-hrGFP-pre-( α )pro_GDNF 禾口 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( β ) pro-GDNF構(gòu)建體?？寺∈褂玫囊镉?'方向的引物(89)5' -CAACAAGGATCCATGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3' (SEQ IDNO 39)3'方向的引物(90)3，-CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-5，(SEQ IDNO 40)為了表達分析的進行，將人pre- ( y ) pro-GDNF的翻譯起始密碼子CTG替換為常規(guī)的ATG翻譯起始密碼子，cDNA克隆到pAAV-MCS表達載體(Stratagene)中產(chǎn)生 pAAV-MCS-pre- ( y ) pro-GDNF-ATG構(gòu)建體?？寺∈褂玫囊镉?'方向的引物(91)5' -CAACAAGGATCCATGGGACTTGGGGCACCTGGAGTTAATG-S' (SEQ ID NO 17)3'方向的引物(92)5' -CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAGCGG-S' (SEQID NO 18)引物 89 和 90，或者 91 和 92 與 Dynazyme DNA 聚合酶(Finnzymes)和 Dynazyme IOx緩沖液用于PCR。PCR反應(yīng)總體積是50μ 1，其中含有40ng在pEGFP-Nl載體中的人 pre- ( α ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF作為模板。采用以下條件擴增DNA :95°C (5分鐘)； 950C (45 秒),560C (45 秒),72°C (1 分鐘)，25 個循環(huán)；72°C (7 分鐘)、4°C (7 分鐘)，1 個循環(huán)。擴增的PCR產(chǎn)物用限制酶BamRl和Biol切割，連接到經(jīng)相同限制酶切割的pAAV-MCS 載體(Stratagene)中，然后通過測序確認(rèn)。用于給插入的PCR片段測序的引物5’方向是5-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3‘ (SEQ ID NO :41)，3，方向是 3，-TA-GAAGGACACCTAGTCAGA-5‘ (SEQ ID NO 42).實施例2細(xì)胞培養(yǎng)
CHO、HEK-293, PC-6. 3 和 AtT-20 細(xì)胞系生長在含有抗生素，與 10% FCS (Gibco) (對于 CHO 和 HEK-293 細(xì)胞),10% HS(Gibco)和 5% FCS(PC-6. 3 細(xì)胞),10% FCS,4. 5g/ 1葡萄糖和1.5g/l碳酸鈉(AtT-20細(xì)胞)的達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中。 BHK-21細(xì)胞系生長在含有抗生素、7. 5% FCS、0. 04%胰蛋白胨磷酸鹽培養(yǎng)液(Difco)和
谷氨酸鹽(Gibco)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)中。用含有小鼠pre-(a)pro-GDNF、pre_(i3) pro-GDNF 或 pre-(Y)pro-GDNF,或者人 pre-( a )pro_GDNF、pre-( β )pro_GDNF 或 pre_( γ ) pro-GDNF cDNA 的 pEGFP-Nl (Invitrogen)表達載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。替代地,采用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染方案，用含有人 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG cDNA 的 pAAV-MCS 或 pAAV-IRES-hrGFP 載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在 Western 印跡分析中，將被轉(zhuǎn)染細(xì)胞在OptiMEM(Sigma)培養(yǎng)基中生長48小時，然后收集培養(yǎng)基，從細(xì)胞中制備蛋白提取物。用 Amicon Ultra_4Centrifugal Filter Units (Millipore)將分泌蛋白(培養(yǎng)基)濃縮，或者利用小鼠抗GDNF抗體免疫沉淀GDNF。蛋白提取物在15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，用D20抗體(Santa Cruz)通過flfestern印跡分析。在免疫熒光分析中，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞在正常的生長培養(yǎng)基中生長M小時，然后進行固定和通透化。用一抗和二抗將細(xì)胞染色，通過顯微鏡(AX70ft~OViS ；Olympus)上的電荷耦合照相機(DP70 ； Olympus)獲取圖像。結(jié)果結(jié)果顯示人和小鼠(α ) pro-GDNF和(β )pro_GDNF以及它們的成熟⑶NFs從CHO 細(xì)胞系中分泌出來(圖5和6)。此外，它們還被HEK493、PC-6. 3和AtT-20細(xì)胞系分泌。小鼠(y) pro-GDNF及其成熟GDNF可以從BHK-21 (圖7)、CH0和PC-6. 3細(xì)胞系分泌，Λ (υ) pro-GDNF-ATG (其中CTG翻譯起始密碼子被ATG代替)及其成熟⑶NF從BHK-21和C0S-7 細(xì)胞系分泌(圖8)實施例3人pre-( α ) pro-GDNF和pre-( β ) pro-GDNF從分化的PC_6. 3細(xì)胞和海馬原代細(xì)胞中的分泌PC-6. 3細(xì)胞的分化和刺激轉(zhuǎn)染后，PC-6.3細(xì)胞生長在含有達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、5% HS(Gibco)、2. 5% FCS和50ng/ml NGF的分化培養(yǎng)基中。72小時后，移走培養(yǎng)基，換成含有或不含有50mM KCl的無血清DMEM。轉(zhuǎn)染中使用的表達構(gòu)建體是pEGFP中的人和小鼠pre- ( α ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF。ELISA分析中，含有不帶終止密碼子的大鼠前 _ 原-BDNF (Volkmar Lessman 博士惠贈，University of ohannes-Gutenberg, Mainz, Germany)的pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)作為活性依賴性分泌的陽性對照(Haubensak et al.，J. Cell ScL，111 1483-93 (1998))。這個構(gòu)建體與其他使用的構(gòu)建體克隆過程類似。在Western印跡分析中，5小時后收集培養(yǎng)基(上清)，用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Units (Millipore)濃縮。蛋白提取物在 15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，用識別⑶NF的D20抗體(Santa Cruz)通過^festern印跡分析。在ELISA 分析中，2小時后收集培養(yǎng)基，用⑶NF Emax ImmunoAssay System(Promega)或者BDNF Emax ImmunoAssay System (Promega)分轉(zhuǎn)染分化PC-6. 3細(xì)胞的免疫熒光分析
通過將帶有終止密碼子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表達載體(Invitrogen)中產(chǎn)生含有人pre-(a)pro-GDNF或pre-(0)pro-GDNF的表達構(gòu)建體。轉(zhuǎn)染前，PC-6. 3細(xì)胞在含有達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、5% HS(Gibco)、2. 5% FCS和50ng/ml NGF 的分化培養(yǎng)基中分化3天。轉(zhuǎn)染使用的表達構(gòu)建體是pEGFP中的人和小鼠pre-(a) pro-GDNF和pre-( β ) pro-GDNF。轉(zhuǎn)染后24小時，細(xì)胞用4% PFA固定，或者先用50mM KCl和SOyg/ml環(huán)己亞胺(中止蛋白合成)刺激2小時，然后用4% PFA固定。用0.5% BSA(Sigma)封閉所有細(xì)胞，并用0. 1% Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。細(xì)胞與一抗， 即多克隆抗-GDNF(Gene Way Biotech Inc. ；1 :750dilution)和成熟高爾基體的單克隆抗 GMl 30 (Abeam5I =IOOdilution)在0.5% BSA中，室溫下溫育1小時，清洗，然后用二抗，即偶聯(lián) Cy2 的驢抗小鼠 IgGCJackson ImmunoResearch laboratories)和偶聯(lián) Cy3 的驢抗兔 IgG (Jackson ImmunoResearch laboratories)重復(fù)上述過禾呈。最后用 Immu_mount (Thermo electron corporation)蓋上蓋片。通過顯微鏡(AX70ftx)vis ;01ympus)上的電荷耦合照相機(DP70 ；Olympus)獲取圖像?；隈R酣懶、M胞』浦糖射·為了制備海馬神經(jīng)元，將來自El 8大鼠的海馬解剖。用溶于HBSS的0.25%胰蛋白酶在37°C將組織消化10-15分鐘。加入DNaseI (lmg/ml)，用硅化玻璃移液管磨碎樣品。細(xì)胞用含有IOmM葡萄糖(Sigma)的HBBS洗三次。在懸浮液中，利用Rat Neuron Nucleofector Kit(Amaxa biosys-tems)，按照制造商的建議用含有人或小鼠pre_(a ) pro-⑶ NF 或 pre- ( β ) pro-⑶ NFcDNA 的 pEGFP-Nl (Invitrogen)表達載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將細(xì)胞鋪在包被多聚D-賴氨酸氫溴酸鹽(Sigma)的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)物生長在補充了 L-谷氛酸鹽(Gibco Invitrogen)禾口 Ix B—27 (Gibco Invitrogen)的 Neurobasal 培養(yǎng)基 (GibcoInvitrogen)中。經(jīng)過4天培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)基，換成含有或不含有50mM KCl的 Neurobasal 培養(yǎng)基(Gibco Invitrogen)。15-30 分鐘后，收集培養(yǎng)基，通過GDNF Emax Immuno-Assay System (Promega)分析 GDNF 的濃度。MM免疫熒光分析的結(jié)果顯示，在分化的PC-6. 3細(xì)胞中，刺激前后，pre-(a) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF編碼的蛋白的位置有明顯不同。未刺激PC-6. 3細(xì)胞中， pre-(a)pro-GDNF編碼的⑶NF更經(jīng)常僅位于高爾基復(fù)合體上，而不是囊泡+/_高爾基體上(圖9)。相反，大部分pre-( β )pro-GDNF編碼的⑶NF位于囊泡+/-高爾基體上，小部分僅位于高爾基體。KCl刺激后，(i3)pro-GDNF及其成熟⑶NF形式比(a)pro-⑶NF及其成熟⑶NF形式更迅速地移動到囊泡腔內(nèi)(圖9)。Western印跡分析的結(jié)果顯示pre_( a ) pro-GDNF cDNA編碼的小鼠和人⑶NF均從分化的類神經(jīng)元PC_6. 3細(xì)胞中組成性地分泌，而 (β )pro-GDNF cDNA編碼的⑶NF的分泌是活性依賴性的(圖10和11)。這一結(jié)果進一步通過ELISA分析進行了證實，分析中大鼠BDNF的分泌作為陽性對照(圖12)。這些結(jié)果表明，(β ) pro-GDNF及其編碼cDNA可能是比(a ) pro-GDNF及其cDNA更有潛力的基因療法治療PD的治療分子。討論通過重組慢病毒載體遞送在完整黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)中長期體內(nèi)表達 pre-(a)pr0-GDNF導(dǎo)致多巴胺合成中的關(guān)鍵酶-酪氨酸羥化酶蛋白被選擇性地下ijf (Georgievska, et al. , J. Neuro-sci. ,24 :6437-6445(2004) ；Sajadi, et al., J. Neurochem. ,93 :1482-1486 (2005))。并且，通過重組慢病毒載體遞送，在6-羥基多巴胺損毀的帕金森氏癥模型大鼠的紋狀體中持續(xù)體內(nèi)表達pre-(a)pro-GDNF誘導(dǎo)了保存的紋狀體多巴胺終末中酪氨酸羥化酶的下調(diào)(Georgievska，et al.，Exp. Neurol, 177 461-474(2002))。這非?？赡苁怯捎谀撤N補償機制，該機制中多巴胺神經(jīng)元在持續(xù)的⑶NF 刺激下能夠通過降低酪氨酸羥化酶活性對增加的多巴胺合成和釋放進行補償。Perwphin 是神經(jīng)營養(yǎng)因子中⑶NF家族的成員。試驗非常清楚地顯示，高濃度的pers印hin是神經(jīng)毒性的(Tomac, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 99 :9521-9526 (2002)) 最近在非人靈長類中進行的試驗也表明，高濃度的GDNF誘發(fā)小腦毒性(Lang, et al, Ann. Neurol. ,59 459-466(2006))。因此，今后的治療應(yīng)當(dāng)避免高濃度的⑶NF，并且優(yōu)選在⑶NF水平可以生理地調(diào)節(jié)的系統(tǒng)中進行。我們的體外結(jié)果顯示，pre-(i3)pro-GDNF編碼的⑶NF的分泌受到生物刺激的調(diào)節(jié)，而pre-(a)pro-GDNF編碼的⑶NF的分泌是組成性的。這使得(β) pro-GDNF及其編碼cDNA是比(α )pro-GDNF及其cDNA潛力大得多的基因療法治療PD的治療分子。實施例4病毒載體構(gòu)建和病毒粒子制備為了構(gòu)建病毒載體，按照制造商的說明使用了 AAV Helper-Free System (Stratagene)。利用合適的限制酶，將人 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 和 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG的編碼序列插入pAAV-MCS的多克隆位點，或者替代的插入 pAAV-IRES-hrGFP 載體，分別得到載體 pAAV-MCS-pre- ( α ) pro-GDNF, pAAV-MCS-pre- ( β ) pro-⑶NF、pAAV-MCS-pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 或 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( α ) pro-GDNF, pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( β ) pro-⑶NF、pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( y ) pro-⑶NF-ATG。將以上提到的載體與pHelper和pAAV-RC載體一起共轉(zhuǎn)染到AAV-293細(xì)胞中，導(dǎo)致產(chǎn)生表達 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的重組 AAV 粒子。相應(yīng)地，使用載體pAAV-IRES-hrGFP產(chǎn)生表達GFP的對照病毒粒子。按照AAV Helper Free System(Stratagene)的制造商使用說明制備并純化重組病毒粒子。將分裝的重組病毒保存在_80°C。利用Southern斑點印跡確定病毒粒子數(shù)量。實施例5在帕金森氏癥神經(jīng)保護性動物模型中進行的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移動物。重250480g的雄性Wistar大鼠(Harlan)分成每組3到4只的組，喂養(yǎng)在 22°C的室溫，12:12小時的晝夜循環(huán)。自來水和鼠糧(Altromin 1324，Chr. Petersen A/S) 任取。病毒注射和6-0HDA損毀。所有立體定位注射參照I^axinos和Watson (The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego, 1997)的圖譜，利用相對前囟和硬腦脊膜的坐標(biāo)(A/P+1.0，L/M + 2.7，D/V-4)，在左紋狀體進行。異氟醚麻醉 (誘導(dǎo)階段是4. 5%，手術(shù)階段2. 5% )下的立體定向手術(shù)基本按照以前的描述分兩步進行 (Kearns et ah, J. Neurosci.，17 :7111-7118 (1997))。給動物注射攜帶 GFP 的 cDNA，或者 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的 cDNA 的重組 AAV 載體 (η = 5-7/組)。rAAV注射后14天，將動物再次麻醉，利用相對前囟和硬腦脊膜的坐標(biāo)(A/
28P+1. 0，L/M+2. 7，D/V-4)，向紋狀體中注射一個劑量的20 μ g6-0HDA (Sigma ；按游離基計算， 溶解在補充了 0. 02%抗壞血酸的3或4μ 1冰冷鹽水中)。注射速度是1 μ 1/分鐘，注射器在拔出前在原位再保留3分鐘。注射6-0HDA之前，給予地昔帕明(Desipramine) (Sigma ； 15mg/kg，i. p. , lml/kg)以防止6-0HDA攝入去甲腎上腺素能神經(jīng)末端，從而保護這些神經(jīng)末端不被破壞。行為測試。rAAV注射后第10天，和注射6-0HDA的四周后，給大鼠注射安非他明(amphetamineM2. 5mg/kg i. ρ·)，并監(jiān)測大鼠于120分鐘內(nèi)在自動轉(zhuǎn)盤(automated rotometer bowls, Colbourn Instruments, Inc. , Allentown, PA)上的轉(zhuǎn)體反應(yīng)(turning response)。旋轉(zhuǎn)試驗后，將腦灌流并收集進行免疫組織化學(xué)分析。酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)分析。6-0HDA注射觀天后，用戊巴比妥鈉將動物深度麻醉，經(jīng)心臟灌流PBS，然后灌流200ml冰冷的4%多聚甲醛(PFA)。將腦解剖，在相同的固定劑中固定3-4小時，轉(zhuǎn)移到25%蔗糖中48小時。在冰凍切片機上切成40 μ m的連續(xù)切片。按照以前的描述進行酪氨酸羥化酶(TH)的免疫組織化學(xué)(Kirik et al,Eur. J. Neu-rosci.， 13 :1589-1599(2001)) ο形態(tài)學(xué)分析SN細(xì)胞計數(shù)。利用光學(xué)分合法(West，et al, Anat. Rec, 231 482-497(1991))估計SNpc中TH陽性細(xì)胞的數(shù)量。按照以前的描述(Sauer，et al, Proc. Natl. Acad. Sci. ,92 :8935-8939 (1995)),用 Olympus BX51 顯微鏡上附帶的 Mereo Investigator platform(MicroBrightField)分析 SNpc。簡單來說，從每只動物中選擇 3個切片進行定量分析，這些切片來自有內(nèi)側(cè)尾核(medial terminal nucleus) (MTN)的 SNpc 中部(Paxinos 禾口 Watson 圖譜(paxinos, G. & Watson， C，1997， The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego)中的 A/P-5. 3mm)。在低倍(4x) 鏡下大概地找出每個參考空間，用高倍(60x，油浸)物鏡計數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量表達為平均數(shù)量/切片。細(xì)胞計數(shù)利用光學(xué)分合法聯(lián)合析象原則(dissector principle)和不偏計數(shù)規(guī)則。統(tǒng)計分析。利用單向ANOVA和之后的Tukey/Kramer' s事后(post-hoc)檢測，分析神經(jīng)保護研究中的所有同側(cè)旋轉(zhuǎn)數(shù)量和TH陽性細(xì)胞數(shù)量。實施例6帕金森氏癥神經(jīng)修復(fù)動物模型中的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移動物。重250480g的雄性 Wistar大鼠(Harlan)分成每組3到4只的組，喂養(yǎng)在室溫22°C，12:12小時的晝夜循環(huán)。 自來水和鼠糧(Altromin 1324, Chr. Petersen A/S )任取。病毒注射和6-0HDA損毀。所有立體定位注射參照Paxinos和Watson (The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego, 1997)的圖譜，利用相對前囟和硬腦脊膜的坐標(biāo)(A/P+l. 0，L/M+2. 7，D/V-4)，在左紋狀體進行。異氟醚麻醉(誘導(dǎo)階段是4. 5%，手術(shù)階段2. 5% )下的立體定向手術(shù)基本按照以前的描述分兩步進行(Kearns et ah, J. Neurosci. ,17 :7111-7118 (1997))。利用相對前囟和硬腦脊膜的坐標(biāo)(AfP+1. O, L/M+2. 7，D/V-4)，給每個動物向紋狀體中注射一個劑量的20 μ g 6-0HDA (Sigma ；按游離基計算，溶解在補充了 0. 02%抗壞血酸的3μ 1冰冷鹽水中)。注射速度是1 μ 1/分鐘，注射器在拔出前在原位再保留3分鐘。注射6-0HDA之前，給予地昔帕明(Desipramine) (Sigma ； 15mg/kg, i. p. , lml/kg)以防止6-0HDA攝入去甲腎上腺素能神經(jīng)末端，從而保護這些神經(jīng)
29末端不被破壞。6-0HDA注射后觀天，將動物再次麻醉，給動物注射攜帶GFP的cDNA，或者 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的 cDNA 的重組 AAV 載體 (η = 5-7/ 組)。注射 6-0HDA 21 天后，以及遞送 rAAV-pre- ( α ) pro_GDNF、rAAV-pre- ( β ) pro-GDNF 或 rAAV-pre-( γ )pro-GDNF-ATG 后 1、2、4 和 8 周，給大鼠注射安非他明(2. 5mg/ kg i.p.)，并監(jiān)測大鼠 120 分鐘內(nèi)在自動轉(zhuǎn)盤(Colbourn Instruments, Inc.，Allentown, PA)上的轉(zhuǎn)體反應(yīng)。旋轉(zhuǎn)試驗后，將腦灌流并收集進行免疫組織化學(xué)分析。行為測試、酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)分析、形態(tài)學(xué)分析和黑質(zhì)細(xì)胞計數(shù)如下進行酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)分析。AAV注射8周后，用戊巴比妥鈉將動物深度麻醉，經(jīng)心臟灌流PBS，然后灌流200ml冰冷的4% PFA。將腦解剖，在相同的固定劑中固定3-4 小時，轉(zhuǎn)移到25%蔗糖sucrose中48小時。在冰凍切片機上切成40 μ m的連續(xù)切片。按照以前的描述進行酪氨酸羥化酶(TH)的免疫組織化學(xué)分析(Kirik et al,Eur. J. Neu-rosci.， 13 :1589-1599(2001)) ο形態(tài)學(xué)分析SN細(xì)胞計數(shù)。利用光學(xué)分合法(West，et al, Anat. Rec, 231 482-497(1991))估計SNpc中TH陽性細(xì)胞的數(shù)量。按照以前的描述(Sauer，et al, Proc. Natl. Acad. Sci. ,92 :8935-8939 (1995)),用 Olympus BX51 顯微鏡上附帶的 Mereo Investigator platform(MicroBrightField)分析 SNpc。簡單來說，從每只動物中選擇 3 個切片進行定量分析，這些切片來自有內(nèi)側(cè)尾核(MTN)的SNpc中部(Paxinos和Watson圖譜(Paxinos,G. &ffatson,C,1997,The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego)中的A/P-5. 3mm)。在低倍Gx)鏡下大概地找出每個參考空間，用高倍 (60x，油浸)物鏡計數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量表達為平均數(shù)量/切片。細(xì)胞計數(shù)利用光學(xué)分合法聯(lián)合析象原則和不偏計數(shù)規(guī)則。實施例7病毒遞送 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 在癲癇動物模型中的用途電極埋植和病毒的腦室內(nèi)注射。雄性Sprague Dawley大鼠^)0_300g)用戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，放在立體定位儀上。用帶有特氟龍涂層的不銹鋼絲制成的雙極性電極埋植到右杏仁體基底外側(cè)核(離前囟-2. 8mm前后向；+4. 9mm橫向；和-8. 6mm背側(cè)) (Paxinos and Watson,The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. New York Academic Press, Paper Back, 1997)。對照大鼠給予4_8 μ 1對照病毒(AAV-GFP)，其他大鼠立體定位注射 4-8 μ 1 表達 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的 AAV,注射器尖位于右側(cè)腦室(-0. 8mm前后向；+1. 5mm橫向和-3. 6mm背側(cè))(Paxinos and Watson,The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. New York :Academic Press,Paper Back, 1997)。用牙科粘合劑和錨固螺絲將插管和電極緊緊固定在顱骨上，接地線連到一個錨固螺絲上(Binder et al. J. Neurosci.，19 1424-1436 (1999))。開始點燃刺激前，允許動物在術(shù)后恢復(fù)4天。點燃程序。每個點燃刺激的構(gòu)成是頻率為60Hz、1毫秒兩相矩形脈沖串共1秒，振幅在癲癇樣電圖閾值(EST)之上ΙΟΟμΑ。EST是通過在刺激第一天從100 μ A開始以每分鐘 100 μ A 的增幅確定的(Kokaia et al. Eur. J. Neurosci. , 11 1202-1216 (1999)) 動物每天刺激兩次，共11天(共22次刺激)。由一個對處理一無所知的觀察者記錄每次刺激的行為(癲癇類型)和電生理[癲癇樣電圖時程(ESD)]參數(shù)。癲癇行為類型按照Racine的分類法(Racine，1972)打分0型，沒有行為改變；1型，面部痙攣；2型，點頭；3型，單側(cè)前肢痙攣；4型，后肢直立，并雙側(cè)前肢痙攣；以及5型，后肢直立和跌倒(姿勢控制喪失)。動物分析。最后一次刺激后4或M小時或者1周，將動物斷頭。組織用氯化三苯四氮唑染色。利用原位標(biāo)記分析檢測皮層組織中的凋亡細(xì)胞。實施例8中風(fēng)動物模型中 rAAV-pre_(a )pro_⑶NF、rAAV-pre-(0 )pro_⑶NF 和 rAAV-pre-( γ )pro-⑶NF-ATG的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移rAAV-pre-( a ) pro-GDNF、rAAV-pre-( β ) pro-GDNF 或 rAAV-pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG 向皮層遞送。為了探討表達 pre- ( a ) pro-GDNF、pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG的重組rAAV載體作為中風(fēng)基因療法的潛能，將表達pre- ( a ) pro-⑶NF，pre- ( β ) pro-⑶NF or pre- ( y ) pro-⑶NF-ATG 的 rAAV 載體注射到大鼠的皮層中，所述大鼠正經(jīng)受暫時性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎30或90分鐘(Arvidsson et al., Neuro-biol. Dis.，14 :542-556 (2003))。如果 rAAV 注射動物皮層組織中的 pre- ( α ) pro-GDNF、pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG 水平明顯高于注射了表達 GFP 的rAAV(rAAV-GFP)的對照動物，表明rAAV可以被遞送到皮層組織中，并表達pre_( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 基因。前腦缺血的誘發(fā)。23只在缺血損傷時重280到^Og的雄性Wistar大鼠(Taconic M&B A/S)喂養(yǎng)在12小時/12小時明暗環(huán)境下，食物和水任取。禁食過夜后，通過吸入3. 5% 氟烷，然后人工通風(fēng)混在ROiO2中的1-2%氟烷(70 30)將動物麻醉。將尾動脈和靜脈分別插管取血、記錄血壓并輸注藥物。用放置到直腸的溫度計測量體溫，利用加熱墊將體溫保持在大約37°C。分離頸總動脈。然后給予50IU肝素，氟烷濃度降低到0.5%，靜脈內(nèi)輸注 2mg/h 維庫夕臭I安(vecuronium bromide) (Organon Tek-nika B. V.，Boxtel, The Netherlands)作為肌肉松弛劑。之后是30分鐘的穩(wěn)定狀態(tài)，在這個過程中監(jiān)測生理參數(shù)和腦電波(EEG)。通過雙側(cè)阻塞頸總動脈，并結(jié)合從頸靜脈放血達到的低血壓(動脈血壓 40-50mm Hg)來誘發(fā)缺血。10分鐘后通過再灌注血液和移去堵塞夾恢復(fù)血液循環(huán)。在剛開始重新循環(huán)時，給予碳酸氫鈉(靜脈內(nèi)給予0. 5ml,50mg/ml)來防止系統(tǒng)酸中毒(Arvidsson et al.，Neuroscience, 106 27-41(2001))。動物分析。再灌注后4和M小時以及1周，將動物(每組n = 6)斷頭。假手術(shù)組動物(η = 5)同樣處理，但沒有阻塞頸總動脈。用氯化三苯四氮唑?qū)⒔M織染色。利用原位標(biāo)記分析檢測皮層組織中的凋亡細(xì)胞。實施例9膽堿能細(xì)胞死亡動物模型中的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移給膽堿能細(xì)胞死亡大鼠模型注射病毒載體以確定利用體內(nèi)基因遞送，遞送 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG 載體防止神經(jīng)元變性的程度和參數(shù)。為了準(zhǔn)備動物模型，給成年雄性Wistar大鼠進行穹窿橫切以誘發(fā)基底前腦膽堿能神經(jīng)元死亡。將2. 5到10 μ 1范圍內(nèi)的Pre-(a )pro-GDNF, pre-( β )pro-GDNF或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 載體(pAAV-MCS-pre- ( a ) pro-⑶NF、pAAV-MCS-pre- ( β ) pro-⑶NF 或pAAV-MCS-pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG)或?qū)φ誆GFP載體儲液注射到膽堿能基底前腦，每
31ml (神經(jīng)營養(yǎng)組合物)含有IOici-IO12顆粒。顆粒在3-5分鐘內(nèi)于以下坐標(biāo)注射到右半球內(nèi) 離腦表面ΑΡ-0. 3 ；ML-0. 5 ；DV-6。將皮膚縫合，允許動物存活2_4周。實施例10肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALQ動物模型中的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移概論。肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALQ是一種涉及運動神經(jīng)元選擇性變性的不斷進行性發(fā)展的致命疾病。預(yù)期GDNF是很有希望的ALS和其他運動神經(jīng)元疾病的治療劑。 因為AAV已發(fā)展成安全性得到證實的基因遞送系統(tǒng)，我們探索了在ALS的G93A小鼠模型中通過AAV載體肌內(nèi)遞送⑶NFcDNAs的治療效果。家族性ALS的GlH轉(zhuǎn)基因小鼠模型攜帶帶有Gly93Ala突變的人超氧化物歧化酶(SODl) (Gurney et al. Science, 264 1772-1775(1994))。因為攜帶pre-( α ) pro-GDNF剪接異構(gòu)體的AAV也已發(fā)展成安全性得到證實的ALS基因遞送系統(tǒng)(Wang et al. Gene Ther.，9 :381-383 Q002))，我們探索了在 ALS 的 G93A 小鼠模型中通過 AAV 載體(rAAV-pre- ( α ) pro-GDNF, rAAV-pre- ( β ) pro-GDNF 和 rAAV-pre- ( γ ) pro-⑶NF)肌內(nèi)遞送 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-GDNF cDNA的治療效果。動物和病毒注射。帶有G93A人SODl突變(S0D1G93A)的雄性轉(zhuǎn)基因小鼠從The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)獲得。AAV載體質(zhì)粒在上文有詳細(xì)描述。在9-10周齡，將ALS小鼠隨機分配到四肢(腓腸肌和肱三頭肌)注射 rAAV-pre- ( α ) pro-⑶NF、rAAV-pre- ( β ) pro-⑶NF 或 rAAV-pre- ( γ ) pro-⑶NF 載體(η = 10)的三個處理組中，或者注射AAV-GFP載體(n = 5)和媒介(n = 5)的兩個對照組之一。 腓腸肌劑量是25 μ 1，肱三頭肌劑量為15 μ 1。行為測試。測試前，給小鼠三天來熟悉旋轉(zhuǎn)桿裝置(Rota-Rod/7650 ；或Rota-Rod Treadmill for Mice)。檢測時，將小鼠放在轉(zhuǎn)速為5、10和20rpm的旋轉(zhuǎn)桿上，自動記錄每只小鼠在桿上停留的時間。發(fā)病時間定義為如以前描述(Li et al. Science, 288 335-339 (2000)),小鼠不能在20rpm轉(zhuǎn)速下在桿上停留5分鐘的時候。如果小鼠在桿上保留 > 5分鐘，結(jié)束測試并評估為5分鐘。小鼠每兩天測試一次，直至它們不能執(zhí)行這項工作。 死亡記錄為當(dāng)小鼠被仰面朝上放置，不能在30秒內(nèi)翻身時的死亡年齡(Li et al. Science, 288 :335-339(2000)) ο形態(tài)學(xué)分析。肌肉切片(ΙΟμπι)在冷的丙酮中固定，然后與作為一抗的兔抗⑶NF D20多克隆抗體(1 500 ；Santa Cruz)和作為二抗的生物素化的抗兔抗體(1 400 ；Santa Cruz)溫育。用3，3-二氨基聯(lián)苯胺作為色原，通過鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合
} Ml^ (Vectastain ABC kits ；Vector Laboratories )。用于肌肉的雙重免疫熒光染色，切片依次與封閉液、多克隆兔抗GDNFD20抗體 (1 500 ；Santa Cruz)、偶聯(lián)FITC的羊抗兔IgG(1 200 ；Santa Cruz)和偶聯(lián)四甲基若丹明的α-金環(huán)蛇毒素(Molecular Probes)溫育。切片在共聚焦激光掃描顯微鏡(TCSNT ； Leica, Heidelberg, Germany)下檢驗禾口照相。為了脊髓的形態(tài)學(xué)分析，獲得Nissl、SMI-32或CTB免疫染色連續(xù)橫截面切片(30 μ m)。按照制造商的試驗方案，用 Mouse-on-Mouse kit (Μ. 0. Mkit) (Vector Laboratories)將懸浮切片對SMI-32免疫組織化學(xué)染色。經(jīng)處理用于分析CTB免疫反應(yīng)性的切片用5%兔血清封閉，然后與抗CTB抗體(1 10000，針對CTB的羊抗血清)溫育。通
32過標(biāo)準(zhǔn)ABC法將切片顯色。形態(tài)度量學(xué)分析(morphometric analysis)和細(xì)胞計數(shù)。用Olympus BX51顯微鏡和KS 400圖像分析軟件(Zeiss)，對用CXD相機捕獲的圖像進行形態(tài)學(xué)分析。在隨機挑選區(qū)域內(nèi)，由> 1000個纖維的計數(shù)計算肌肉纖維的平均面積。為了比較脊髓中運動神經(jīng)元的數(shù)量，我們按照以前的描述(Lewis etal. Nat. Genet. ,25 :402-405 (2000))，計數(shù)了每組中跨頸膨大和腰骶膨大的Nissl染色的切片以及SMI-32和CTB免疫染色的切片中的神經(jīng)元。 對于每只小鼠，每組第六連續(xù)切片中至少數(shù)20個切片。只有滿足以下標(biāo)準(zhǔn)的大的細(xì)胞特征被包括在內(nèi)位于中央管(central canal)的側(cè)線(lateral line)以下的前角(ventral horn)中；含有帶核仁的明顯的細(xì)胞核；以及具備至少一個厚(寬)thick process。實施例11脊椎損傷動物模型中的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移概論。已證實向受損脊髓遞送神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠刺激神經(jīng)元存活和再生。這表明缺少足夠的營養(yǎng)支持是導(dǎo)致哺乳動物脊髓沒有自發(fā)再生的一個因素。先前遞送pre-(a) pro-GDNF是通過重組腺病毒(AdCMVgdnf或AdCMVlacZ)介導(dǎo)的，并在脊髓受損的成年大鼠中測試了對功能恢復(fù)和中樞神經(jīng)元萎縮的作用。結(jié)果顯示腺病毒介導(dǎo)遞送的pre-(a) pro-GDNF在脊髓受損的大鼠中能夠防止皮質(zhì)脊髓運動神經(jīng)元的退化性萎縮，并提高運動功能(Tang et al.Neuroreport；15 :425-429(2004))。利用提供營養(yǎng)支持的基因遞送方法，我們將表達pre-(a)pr0-GDNF、pre-(i3) pro-⑶NF 或 pre-( γ ) pro-GDNF 的 AAV 載體(rAAV-pre-( α ) pro-GDNF、rAAV-pre-(b) pro-GDNF或rAAV-pre-( y )pro-GDNF)注射到脊髓損毀部位。我們從解剖學(xué)上分析了成年脊髓受損大鼠皮質(zhì)脊髓束(CST)再生情況，從行為學(xué)的角度分析了感覺-運動功能的改善。動物。所有試驗在赫爾辛基大學(xué)(University ofHelsinki)的試驗動物中心 (Laboratory Animal Center)進行，試驗動物研究和試驗方案遵循芬蘭國家立法、EU指令 (86/609) ,European Convention(ETS 123)和國家基因技術(shù)的規(guī)定。成年雌性Lewis大鼠 (160-190gm)4到6只一組養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)籠子里，12小時/12小時明暗循環(huán)，食物和水可任取。 動物皮下注射 Hypnorm (120 μ l/200g 體重 Janssen Pharmaceutics)和多美康(Dormicum) (每200g體重0. 75mg,溶于150 μ 1 ；Roche Pharmaceuticals)麻醉。在這個較長的過程中，施用含有維生素A的眼膏來防止眼睛脫水。按照Liebscher等的程序(Liebscher et al. Ann. Neurol，58 :706-719 (2005))，用虹膜切開剪和鋒利的尖刀在胸T8節(jié)段做一個T型損毀，包括脊髓背向部分，有主要的CST和CST的背外側(cè)和腹內(nèi)側(cè)部分。病毒的遞送。動物分成四批(rAAV-pre-(α )pro-GDNF、rAAV-pre-( β )pro-GDNF、 rAAV-pre-( Y)pro-GDNF和AAV-GFP)進行同樣的手術(shù)和行為測試。試驗以完全雙盲方式進行大鼠被隨機編號，各組在籠子里混合。所有的試驗人員對試驗各階段處理不知情，處理包括手術(shù)、保健、行為測試以及再生、出芽和損毀大小的評估。手術(shù)前，在取得基礎(chǔ)測量值之前，將所有動物為行為測試處理和訓(xùn)練4周。為了 AAV注射，將大鼠隨機分到試驗組中損毀+rAAV-pre-(a )pro-GDNF、損毀+rAAV-pre-(i3) pro-GDNF、損毀+rAAV-pre-( γ )pro-GDNF、損毀+對照AAV-GFP。損毀后立即用1 μ 1生理液沖洗傷口開始AAV注射。2周后，開始行為評估，并隔一周重復(fù)一次。5周后，單側(cè)跟蹤CST。 手術(shù)9周后，在行為測試的最后，進行形態(tài)學(xué)分析。
BBB運動(locomotor)評分。所有的測試由數(shù)碼攝像機監(jiān)測，并以雙盲方式分析。 手術(shù)前，在預(yù)訓(xùn)練4周后，獲取基礎(chǔ)測量值。手術(shù)后，以一周的間隔進行行為評估。允許大鼠自由運動，在4分鐘內(nèi)由兩名觀察者對其使用后肢的能力進行評分。根據(jù)21分BBB運動分級法(Basso et al. J. Neurotrauma，12 :1-12 (1995))，評判關(guān)節(jié)活動、足爪放置、體重支撐和前/后肢協(xié)調(diào)性。游泳試驗。游泳試驗的設(shè)置包括矩形有機玻璃盆(150x40x13cm)。水Q3_25°C ) 的深度足夠使大鼠不能碰到盆底。正常動物游泳是通過后肢和尾巴劃水，前肢舉在頌下不動(Stolz et al. Behav. Brain Res.，106 :127-132 (1999))。利用以 45 度放在池底的鏡子從側(cè)面和底部同時拍攝大鼠，每只大鼠監(jiān)測5輪游泳情況。通過按照以下標(biāo)準(zhǔn)給它們的動作打分來分析大鼠的游泳表現(xiàn)前肢使用2分=未使用(正常)，1分=整個距離使用一個手臂或者半程使用兩只手臂，0分=一直使用兩只手臂；后爪距離(支撐基礎(chǔ))2分=小距離，后腿在身體下方，1分=腿在身體外側(cè)，但爪子仍在身下，0分=距離大，腿和腳都在身體外側(cè)；后肢打水2分=打水有力，1分=打水力量中等，0分=虛弱或沒有打水動作；尾巴動作2分=整個尾巴運動規(guī)律有力，1分=部分運動，0分=沒有或者只有很弱的運動。 因此正常的游泳可以得到7到8分，訓(xùn)練良好的大鼠常規(guī)地達到這一數(shù)值。纖維計數(shù)和出芽評分在全部縱切連續(xù)切片中，以最終400x放大倍數(shù)在三個限定的區(qū)域(0. 25mm頭尾軸寬度，距損毀部位尾端0.5mm、2mm和5mm)內(nèi)計數(shù)從主要CST發(fā)出的再生纖維數(shù)量。由有經(jīng)驗的不了解情況的觀察者，根據(jù)緊靠損毀頭端的CST出芽的密度、異常途徑、朝向損毀和損毀周圍的彎曲、長度和分枝評分(0 =沒有出芽，3 =非常強的出芽)。實施例12培育抗⑶NF前原區(qū)的抗體320/ ( α ) pro-⑶NF、321/pro_⑶NF和322/ ( β ) pro-GDNF肽合成給每種待培育的抗體制備一種肽，共制備了三種。所述肽是肽A320 :CGKRLLEAPAEDHSLGHRRVP (SEQ ID NO :46)，用于 320/( α ) pro-⑶NF肽A321 CPEDYPDQFDDVMD (SEQ ID NO 47)，用于 321/pro-⑶NF 禾口肽A322 :CHTASAFPLPAA匪(SEQ ID NO 48)，用于 322/( β ) pro-GDNF。肽的制備基于利用Fmoc化學(xué)固相肽合成(SPPS)技術(shù)。Fmoc代表9_芴甲基氯甲酸酉旨(fluorenylmethyl chloroformate)(9H-(f)luoren-9-yl(m)eth (o)xy (c)arbonyl)， 描述的是給氨基酸的N添加的Fmoc保護基團以防止不需要的反應(yīng)，在酸性條件下穩(wěn)定。合成按照標(biāo)準(zhǔn)禾呈序(Benoiton，Chemistry of Peptide Synthesis,Taylor&Francis Group， 2005)，以0. Immol的規(guī)模從肽的C末端到N末端自動進行。合成過程中，氨基酸側(cè)鏈的功能基團用永久性保護基團保護，這些保護基團在合成完成后被切割，但它們在合成過程中對所有化學(xué)試劑是穩(wěn)定的。切割后，利用HPLC(高效液相色譜)技術(shù)控制肽純度(肽溶解于乙腈)，HPLC不同流份的質(zhì)量用MALDI TOF-MS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜) 控制，并在冷凍干燥設(shè)備中凍干。此外，在HPLC中純化2mg肽用于免疫(>95%純度)。 肽-樹脂保存在-20°C，肽粉末保存在+4°C。KLH 偶聯(lián)
將2mg純肽偶聯(lián)到載體蛋白KLH(匙孔嘁血藍蛋白)上以便在之后的免疫過程中刺激免疫反應(yīng)。KLH很合適，因為它的分子量大(MW 4.5xl05到1.3xl07)、免疫原性強并且?guī)в泻芏噘嚢彼峥梢杂糜谂悸?lián)。用于偶聯(lián)到肽上，使用的是馬來酰亞胺活化的KLH。馬來酰亞胺基團與添加到肽N末端的半胱氨酸(每個肽只有一個Cys，避免內(nèi)部Cys)的SH-基反應(yīng)，以便確保定點偶聯(lián)和未被遮蔽的肽用于免疫過程。反應(yīng)在中性條件下進行，之后利用透析純化。最終溶液是溶于PBS的偶聯(lián)劑濃度為0.5mg/ml。用偶聯(lián)前和后收集的樣品 (有和沒有KLH的肽)，以Ellman測試控制偶聯(lián)步驟。利用Ellman試劑(二硫雙(2-硝基苯甲酸))或DTNB)進行Ellman測試來估計含有巰基的肽與KLH偶聯(lián)的效率(Walker，The Protein Protocols Handbook,2nd edition, Humana Press inc. 2002, pp 595-596)。免疫免疫時間表第0天-免疫前血清和第一次(I)免疫；第14天-第二次(II)免疫；第35天-第三次(III)免疫；第45天-初步取血和ELISA檢測；第56天-第四次(IV) 免疫；第66天-最后的取血和ELISA檢測。第一次免疫使用了弗氏完全佐劑(FCA)，其他免疫使用弗氏不完全佐劑(FIA)。弗氏佐劑是油包水的乳劑，含有FCA，能夠殺死結(jié)核分支桿菌，被用于增強免疫反應(yīng)。將佐劑與KLH-肽偶聯(lián)溶液小心地1 1混合，皮下注射到兩個部位。一個課題中，使用了 2只兔子。從耳靜脈(air vain)取血，凝結(jié)并離心制備血清。 免疫前血清的量是 1ml，用于ELISA檢測的初期血清是 0. :3ml，最終血清 30ml。ELISA將適量的肽A320、A321或A322與牛血清清蛋白(BSA)偶聯(lián)(與KLH偶聯(lián)程序相同)。然后將該肽-BSA偶聯(lián)物包埋到高容量蛋白結(jié)合微量滴定板上(每個樣品一式兩份)。用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的抗兔IgG抗體作為二抗，3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為底物，通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測免疫前、初期和最終血清。用ELISA檢測儀測量 450nm的光密度。IgG-特異性純化IgG純化采用了MAbsorbent 技術(shù)。MAbsorbent 合成親和配體吸附劑被證實
可以用于從血清、血漿、腹水、哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物上清或轉(zhuǎn)基因來源提純抗體，它是替代蛋白A純化的一種創(chuàng)新技術(shù)。從血抗血清純化抗體是通過將它們與MAbsorbent A1P/A2P 結(jié)合進行的。Mabsorbent合成親和配體吸附劑“模擬”重組和天然蛋白A。但它們非常不同的是Mabsorbents能夠結(jié)合所有IgG亞型。它能有效結(jié)合多種人和哺乳動物多克隆抗體 (包括牛、小鼠、綿羊、山羊、馬和兔)以及完整單克隆抗體、人源化抗體嵌合分子和抗體片段。首先，按照隨空柱子和Mabsorbent提供的使用說明準(zhǔn)備柱子。簡單來說，將吸附劑漿溫和地混勻，加到柱子中，并用結(jié)合緩沖液平衡柱子。其次，將稀釋在結(jié)合緩沖液中的適量抗血清加入柱子，溫育并使其流過柱子。血清中的抗體與MAbsorbent A1P/A2P結(jié)合。然后將柱子清洗，從親和吸附劑上洗脫抗體并收集成2ml的流份。這之后，將柱子再次平衡用于新一輪純化?？梢苑磸?fù)進行這一步，直至所需量的抗血清被純化。平衡和結(jié)合在中性PH進行，洗脫在酸性條件下進行。收集后，將全部流份對PBS透析，利用BCATM蛋白檢測技術(shù)測量抗體濃度。最后，將抗體溶于磷酸鹽緩沖液 (PBS)中，保存在_20°C。
表位特異性純化表位特異性親和純化采用了 NHS-活化的Sepharose 介質(zhì)技術(shù)。NHS-活化的 kpharose可與抗原形成穩(wěn)定的酰胺鍵，這里是與肽形成酰胺鍵，之后肽會結(jié)合血清中的抗體?？贵w將被洗脫并收集。這個方法幫助純化血清中抗給定肽的抗體。首先，按照隨空柱子和NHS-活化的Sepharose 介質(zhì)提供的使用說明準(zhǔn)備柱子。 簡單來說，將NHS-活化的Sepharose 介質(zhì)加到空柱子中并清洗以除去儲存液。將抗原溶解在偶聯(lián)緩沖液中，加入柱的活性基團在溫育期間結(jié)合。然后將柱子立在 TRIS緩沖液中以封閉任何未發(fā)生反應(yīng)的活性基團。然后用pH值不同的兩種不同的緩沖液 (例如，第一種緩沖液PH8-9，第二種緩沖pH3-4)清洗柱子。其次，用結(jié)合緩沖液將準(zhǔn)備好的柱子平衡，并取稀釋在PBS中的適量血液抗血清裝柱。允許淤漿停留幾分鐘以便抗體與抗原結(jié)合。用不同pH(pH8_6.5)的結(jié)合緩沖液洗柱子，然后在酸性條件下洗脫抗體，收集每份Iml的流份。收集后，將全部流份對PBS透析， 利用BCA 蛋白檢測技術(shù)測量抗體濃度。最后，將抗體溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，保存在-200C。pro-GDNF抗體特異性的表征通過Wfestern印跡和免疫熒光分析驗證了 pro-GDNF抗體的特異性。在免疫熒光分析中，將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至帶有蓋片的4孔板， 當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染0. 8 μ g質(zhì)粒。用于轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體是包含在pEGFP載體(Invitrogen)中人和/或小鼠pre-( α )pro-⑶NF和pre-( β )pro-⑶NF，以及包含在 pAAV-MCS載體中蛋白編碼起始密碼子為ATG的人pre- ( γ ) pro-GDNF。包含在pAAV_MCS 載體中缺少原區(qū)的人pre-GDNF作為對照(Pia Runeberg-Roos博士惠贈，University of Helsinki，F(xiàn)inland)。該構(gòu)建體與其他所用構(gòu)建體克隆過程類似。從空pEGFP-Nl載體表達重組GFP蛋白作為模擬轉(zhuǎn)染對照。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成含有10% FCS和抗生素的新鮮DMEM。轉(zhuǎn)染后M小時，用4%仲甲醛(Sigma)將細(xì)胞固定，并用01 % "Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。將細(xì)胞與溶于0. 5% BSA中的一抗，即抗⑶NF pro-結(jié)構(gòu)域的多克隆 320/(a )pro-GDNF(l 200 稀釋)、321/pro_GDNF(1 200 稀釋)或 322/( β ) pro-GDNF(1 200稀釋)，和抗成熟⑶NF的單克隆小鼠抗⑶NF(1 100稀釋)在室溫下溫育1小時，清洗，然后用二抗即偶聯(lián)Cy2的驢抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch laboratories)禾口偶聯(lián) Cy3 的驢抗兔 IgG (JacKson ImmunoResearch laboratories)重復(fù)上述過禾呈。細(xì)胞核用 Hoechst 染色。最后用 Immu-mount (Thermo electron corporation) 蓋上蓋片。通過顯微鏡(AX70ft~OViS ；Olympus)上的電荷耦合照相機(DP70 ；Olympus)獲取圖像。在Wfestern印跡分析中，將生長在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)生長至大約80%鋪滿時，每孔轉(zhuǎn)染4μ g質(zhì)粒。用于轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體是包含在 pEGFP-NI 載體(Invitrogen)中人和 / 或小鼠 pre- ( α ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF，包含在 pAAV-IRES-hrGFP 載體(Stratagene)中的人 pre- ( α ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF 以及包含在 pAAV-MCS 載體(Stratagene)中的 pre- ( α ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF。包含在pAAV-MCS載體中缺少原區(qū)的人pre-GDNF作為對照。該構(gòu)建體與其他所用構(gòu)建體克隆過程類似。從空pEGFP-Nl載體表達重組GFP蛋白作為模擬轉(zhuǎn)染對照。轉(zhuǎn)染后4小時，將培養(yǎng)基換成aiil OptiMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基(上清)，將培養(yǎng)基濃縮，樣
36品利用15%變性SDS-PAGE凝膠分離，隨后轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用溶于TBS-Tween (0. )中的5%牛奶封閉。通過ECL方法，用抗⑶NF原-結(jié)構(gòu)域的多克隆320/(a)pro-GDNF(l 500 稀釋)或321/pro-GDNF(l 500稀釋)和抗成熟⑶NF的多克隆D20抗體(Santa Cruz, 1 500稀釋)，以及隨后的偶聯(lián)HRP的驢抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀釋)檢測⑶NF。MM免疫熒光分析結(jié)果顯示，321/pro-GDNF抗體能夠識別(α ) pro-GDNF、( β ) pro-GDNF和(γ ) pro-GDNF的⑶NF原-結(jié)構(gòu)域，但不能識別缺少原區(qū)的⑶NF蛋白或者重組GFP蛋白。此外，在未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未看到特異性染色。用識別GDNF成熟部分的小鼠抗⑶NF抗體也可以檢測(α ) pro-GDNF和(β ) pro-GDNF以及缺少原區(qū)的⑶NF蛋白(圖 13)。在免疫熒光分析中，320/ ( α ) pro-GDNF抗體能夠識別(α ) pro-GDNF的⑶NF原區(qū)，但不能識別(β ) pro-GDNF、( γ ) pro-GDNF、缺少原區(qū)的⑶NF或者重組GFP蛋白。用識別⑶NF 成熟部分的小鼠抗⑶NF抗體也可以檢測(a)pro-GDNF和(i3)pro_GDNF以及缺少原區(qū)的 ⑶NF蛋白。除了小鼠抗⑶NF染色，轉(zhuǎn)染了 pre-(i3)pro-GDNF cDNA的細(xì)胞中還看到某些 GFP信號(綠色)，很可能是從pEGFP-Nl載體泄露的(圖14)。在免疫熒光分析中，322/( β) pro-GDNF抗體能夠識別(β ) pro-GDNF的⑶NF原-結(jié)構(gòu)域，但不能識別(a ) pro-GDNF, ( γ ) pro-GDNF、缺少原區(qū)的⑶NF或重組GFP蛋白。用識別⑶NF成熟部分的小鼠抗⑶NF抗體也可以檢測(a ) pro-GDNF和(β ) pro-GDNF以及缺少原區(qū)的⑶NF蛋白。除了小鼠抗⑶NF 染色，轉(zhuǎn)染了 pre-(i3)pro-GDNF cDNA的細(xì)胞中還看到某些GFP信號(綠色)，很可能是從 PEGFP-Nl載體泄露的(圖15)。Western印跡分析結(jié)果顯示，321/pro-GDNF抗體能夠識別(a )pro_GDNF和(β ) pro-GDNF的⑶NF原-結(jié)構(gòu)域，但不能識別缺少原區(qū)的⑶NF蛋白或重組GFP蛋白。此夕卜， 321/pro-GDNF抗體能夠識別(a ) pro-GST和(β ) pro-GST融合蛋白?？耿荖F成熟部分的抗GDNF D20抗體能夠識別(a)pro-GDNF、(0)pro-GDNF和缺少原區(qū)的⑶NF蛋白(圖16)。 在Western印跡中，322/ ( a ) pro-GDNF抗體能夠識別(a ) pro-GDNF的⑶NF原-結(jié)構(gòu)域，但不能識別(β )pro-GDNF或缺少原區(qū)的⑶NF蛋白?？耿荖F成熟部分的抗⑶NFD20抗體能夠識別(a ) pro-GDNF, ( β) pro-GDNF和缺少原區(qū)的GDNF蛋白(圖17)。實施例13培育pre- ( y ) pro-GDNF的特異性抗體根據(jù)如實施例12中所用的已知技術(shù)，制備包含pre-(Y)pr0-GDNF肽特有的氨基酸序列的肽。偶聯(lián)將純肽偶聯(lián)到載體蛋白KLH(匙孔嘁血藍蛋白)上以便在之后的免疫過程中刺激免疫反應(yīng)。用于偶聯(lián)到肽上，使用的是馬來酰亞胺活化的KLH。馬來酰亞胺基團與添加到肽 N末端的半胱氨酸(每個肽只有一個Cys，避免內(nèi)部Cys)的SH-基反應(yīng)，以便確保定點偶聯(lián)和未被遮蔽的肽用于免疫過程。反應(yīng)在中性條件下進行，之后利用透析純化。最終溶液溶于PBS，偶聯(lián)劑濃度為0.5mg/ml。用偶聯(lián)前和后收集的樣品(有和沒有KLH的肽)，如實施例12所述通過Ellman測試控制偶聯(lián)步驟。利用Ellman試劑(二硫雙(2-硝基苯甲酸)) 或DTNB)進行Ellman測試來估計含有巰基的肽與KLH偶聯(lián)的效率(Walker，The Protein Protocols Handbook,2nd edition, Humana Press inc. 2002, pp 595—596)。
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免疫按照以下方案給兔免疫第0天-免疫前血清和第一次⑴免疫；第14天-第二次 (II)免疫；第35天-第三次(III)免疫；第45天-初步取血和ELISA檢測；第56天-第四次(IV)免疫；第66天-最后的取血和ELISA檢測。第一次免疫使用了弗氏完全佐劑(FCA)， 其他免疫使用弗氏不完全佐劑(FIA)。弗氏佐劑是油包水的乳劑，含有FCA，能夠殺死結(jié)核分支桿菌，被用于增強免疫反應(yīng)。將佐劑與KLH-肽偶聯(lián)溶液小心地1 1混合，皮下注射到兩個部位。從耳靜脈(air vain)取血，凝結(jié)并離心制備血清。免疫前血清的量是 1ml， 用于ELISA檢測的初期血清是 0. :3ml，最終血清 30ml。ELISA將適量的用于免疫的肽與牛血清清蛋白(BSA)偶聯(lián)(與KLH偶聯(lián)程序相同)。然后將該肽-BSA偶聯(lián)物包被到高容量蛋白結(jié)合微量滴定板上(每個樣品一式兩份)。然后， 用BSA將板上的所有空結(jié)合位點封閉。由免疫前、初期和最終血清制備稀釋液(在最后的 ELISA過程中)，并加入微孔中。用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的抗兔IgG抗體作為二抗檢測結(jié)合樣品，從而形成“三明治”結(jié)構(gòu)。在兩個孔中用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照， 每個步驟后將板溫育并清洗。最后，加入3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(Tiffi)后與!PR發(fā)生比色反應(yīng)，用ELISA檢測儀測量450nm的光密度?？贵w純化IgG純化采用了MAbsorbent 技術(shù)。從血液抗血清純化抗體是通過將它們與 MAbsorbent A1P/A2P結(jié)合進行的。Mabsorbent合成親和配體吸附劑“模擬”重組和天然蛋白A。首先，按照隨空柱子和Mabsorbent提供的使用說明準(zhǔn)備柱子。簡單來說，將吸附劑漿溫和地混勻，加到柱子中，并用結(jié)合緩沖液平衡柱子。然后，將稀釋在結(jié)合緩沖液中的適量抗血清加入柱子，溫育并使其流過柱子。血清中的抗體與MAbsorbent A1P/A2P結(jié)合。然后洗柱子，從親和吸附劑上洗脫抗體并收集成2ml的流份。這之后，將柱子再次平衡用于新一輪純化?？梢苑磸?fù)進行這一步，直至所需量的抗血清被純化。平衡和結(jié)合在中性PH進行，洗脫在酸性條件下進行。收集后，將全部流份對PBS透析，利用BCA 蛋白檢測技術(shù)測量抗體濃度。最后，將抗體溶于磷酸鹽緩沖液 (PBS)中，保存在_20°C。表位特異性親和純化采用了 NHS-活化的Sepharose 介質(zhì)技術(shù)。NHS-活化的 kpharose可與抗原形成穩(wěn)定的酰胺鍵，這里是與肽形成酰胺鍵，之后肽會結(jié)合血清中的抗體?？贵w將被洗脫并收集。這個方法幫助純化血清中抗給定肽的抗體。首先，按照隨空柱子和NHS-活化的Sepharose 介質(zhì)提供的使用說明準(zhǔn)備柱子。 簡單來說，將NHS-活化的Sepharose 介質(zhì)加到空柱子中并清洗以除去儲存液。將抗原溶解在偶聯(lián)緩沖液中，加入柱的活性基團在溫育期間結(jié)合。將柱子立在TRIS 緩沖液中以封閉任何未發(fā)生反應(yīng)的活性基團。然后用PH值不同的兩種不同的緩沖液(例如，第一種緩沖液PH8-9，第二種緩沖液PH3-4)洗柱子。隨后，用結(jié)合緩沖液將準(zhǔn)備好的柱子平衡，并取稀釋在PBS中的適量血液抗血清裝柱。允許淤漿停留幾分鐘以便抗體與抗原結(jié)合。用不同pH(pH8-6.5)的結(jié)合緩沖液洗柱子，然后在酸性條件下洗脫抗體，收集每份Iml的流份。收集后，將全部流份對PBS透析， 利用BCA 蛋白檢測技術(shù)測量抗體濃度。最后，將抗體溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，保存在-20 °CO
序列表自由格式(free text)
SEQIDNO1 [223]；天然人pre-gamma-pro-GDNF
SEQIDNO3[223]-'J、鼠 pre-gamma-pro-GDNF
SEQIDNO5[223]K pre-gamma-pro-GDNF,帶 ATG
SEQIDNO7[223]‘引物42
SEQIDNO8[223]‘引物43
SEQIDNO9[223]‘引物46
SEQIDNO10223]引物47
SEQIDNO11223]引物53
SEQIDNO12223]引物49
SEQIDNO13223]引物48
SEQIDNO14223]引物討
SEQIDNO15223]人⑶NF 5‘引物
SEQIDNO16223]人⑶NF 3‘引物
SEQIDNO17223]引物91
SEQIDNO18223]引物92
SEQIDNO19223]pre-gamma-pro aa Ιψβ}, ^ Leu
SEQIDNO20223]pre-gamma-pro nt 序列，帶 CTG
SEQIDNO21223]pre-gamma-pro aa 序列，帶 Met
SEQIDNO22223]pre-gamma-pro nt 序列，帶 ATG
SEQIDNO23223]截短的 pre-gamma-pro-GDNF nt,帶 CTG
SEQIDNO25223]截短的 pre-gamma-pro-⑶NF nt,帶 ATG
SEQIDNO27223]V34M pre-gamma-pro-GDNF aa, ^ Leu
SEQIDNO28223]V34M pre-gamma-pro-GDNF nt,帶 CTG
SEQIDNO29223]V34M pre-gamma-pro-GDNF aa，帶 Met
SEQIDNO30223]V34M pre-gamma-pro-GDNF nt，帶 ATG
SEQIDNO31223]V38M pre-beta-pro-GDNF aa
SEQIDNO32223]V38M pre-beta-pro-GDNF nt
SEQIDNO33223]V64M pre-alfa-pro-GDNF aa
SEQIDNO34223]V64M pre-alfa-pro-GDNF nt
SEQIDNO35223]截短的 pre-beta-pro-GDNF aa
SEQIDNO36223]截短的 pre-beta-pro-GDNF nt
SEQIDNO37223]pEGFP 5'引物
SEQIDNO38223]pEGFP 3'引物
SEQIDNO39223]引物89
SEQIDNO40223]引物90
SEQIDNO41223]pAAV-MCS5'引物
SEQIDNO42223]pAAV-MCS3'引物
39
SEQ ID NO 43[223]⑶NF蛋白剪接變體alfa，beta或gamma中任一種的前原序列的C末端沈個氨基酸的序列SEQIDNO44[223]人 pre-alfa-pro-GDNF 的原肽
SEQIDNO45[223]人pre-beta-pro-⑶NF的原肽
SEQIDNO46[223]抗體320的表位(基于小鼠alfa-原序列)
SEQIDNO47[223]抗體321的表位(基于pro-GDNF的C末端)
SEQIDNO48 [223]抗體322的表位(基于beta-原序列)
SEQIDNO49[223]pre-alfa-pro-⑶NF的前原區(qū)
SEQIDNO50[223]pre-beta-pro-GDNF 的前原區(qū)
SEQIDNO51[223]人 pre-beta-pro-GDNF
SEQIDNO51[223]原肽
權(quán)利要求
1.純化和分離的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白剪接變體 (pre- ( y ) pro-⑶NF)，其包含如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.修飾的人⑶NF蛋白剪接變體(pre-(Y)pro-GDNF)，其中SEQID NO 2的氨基末端亮氨酸替換為甲硫氨酸，如SEQ ID N0:6所示。
3.人pre-(Y)pro-GDNF的成熟多肽部分，其包含SEQID NO :2中的氨基酸1到134和 SEQ ID NO 2中的氨基酸-47到-1序列部分，所述-47到-1部分具有調(diào)控功能，但缺少信號序列。
4.權(quán)利要求1所述的人GDNF蛋白剪接變體的前原氨基酸序列，其包含如SEQID NO 19所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求2所述的人GDNF蛋白剪接變體的前原氨基酸序列，其包含如SEQID NO 21所示的氨基酸序列。
6.如SEQID NO 21中所示的具備調(diào)控功能的信號序列部分。
7.權(quán)利要求1所述的人GDNF蛋白剪接變體的截短形式，缺少成熟多肽部分中N末端的 38個氨基酸，所述形式如SEQ ID NO 24所示。
8.權(quán)利要求2所述的人GDNF蛋白剪接變體的截短形式，缺少成熟多肽部分中N末端的 38個氨基酸，所述形式如SEQ ID NO 所示。
9.人pre-(Y)pro-GDNF的截短的成熟多肽部分，包含SEQID NO :2中的氨基酸39到 134，以及具有調(diào)控功能的SEQ ID NO 2中氨基酸-47到-1的信號序列部分。
10.權(quán)利要求1所述人⑶NF蛋白剪接變體的V34M突變體，包含如SEQID NO 27所示的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求2所述人⑶NF蛋白剪接變體的V34M突變體，包含如SEQID NO 29所示的氨基酸序列。
12.純化的、分離的V38M突變的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白剪接變體(pre-(0 )pro-GDNF)，其包含如SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列。
13.截短的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白剪接變體(pre-(i3) pro-GDNF)，其缺少成熟多肽部分N末端的38個氨基酸，包含如SEQ ID NO 35所示的氨基酸序列。
14.純化的、分離的V64M突變的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白剪接變體(pre-( α )pro-GDNF)，其包含如SEQ ID NO 33所示的氨基酸序列。
15.多核苷酸，編碼權(quán)利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接變體或其部分
16.權(quán)利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO:1所示的核酸序列。
17.權(quán)利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO:5所示的核酸序列。
18.權(quán)利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO20所示的核5脧序列。
19.權(quán)利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO22所示的核5脧序列。
20.權(quán)利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO23所示的核5脧序列。
21.權(quán)利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO25所示的核5脧序列。
22.權(quán)利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNOJ8所示的核5脧序列。
23.權(quán)利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO30所示的核5脧序列。
24.權(quán)利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO32所示的核5脧序列。
25.權(quán)利要求15的多核苷酸，其包含SEQID NO 36所示的核酸序列。
26.權(quán)利要求15的多核苷酸，其包含SEQID NO :34所示的核酸序列。
27.載體，其包含與表達調(diào)控元件可操縱地連接的權(quán)利要求1516任一所述多核苷酸。
28.權(quán)利要求27所述的載體，其中所述載體是病毒或非病毒載體。
29.權(quán)利要求觀所述的載體，其中所述病毒載體是重組痘苗病毒、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺相關(guān)病毒、重組桿狀病毒、重組乳頭瘤病毒、重組慢病毒或重組禽痘病毒載體，或者是其中的基因的表達可以體內(nèi)調(diào)控的病毒載體。
30.權(quán)利要求觀所述的載體，其中所述非病毒載體是細(xì)菌、真菌、哺乳動物、昆蟲、植物或酵母載體或者脂質(zhì)體或DNA的多胺衍生物。
31.經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的、已從其天然環(huán)境分離的宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求27-30中任一項所述的載體。
32.抗體，所述抗體與GDNF蛋白剪接變體α、β或Y中任一種的前原序列中的C末端26個氨基酸部分特異結(jié)合，該部分具有如SEQ ID NO :43所示的氨基酸序列。
33.抗體，所述抗體與pre-( α ) pro-GDNF蛋白剪接變體的pro區(qū)域特異結(jié)合，該區(qū)域具有如SEQ ID NO 44所示的氨基酸序列。
34.抗體，所述抗體與pre-(a)pro-GDNF蛋白剪接變體的前原區(qū)域特異結(jié)合，該區(qū)域具有如SEQ ID NO :49所示的氨基酸序列。
35.抗體，所述抗體與pre-( β ) pro-GDNF蛋白剪接變體的pro區(qū)域特異結(jié)合，該區(qū)域具有如SEQ ID NO 45所示的氨基酸序列。
36.抗體，所述抗體與pre-(i3)pro-GDNF蛋白剪接變體的前原區(qū)域特異結(jié)合，該區(qū)域具有如SEQ ID NO 50所示的氨基酸序列。
37.抗體，所述抗體與具有如SEQID NO :2或SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的pre_( γ ) pro-GDNF蛋白剪接變體特異結(jié)合。
38.抗體，所述抗體與具有如SEQID N0:19或SEQ ID NO :21所示氨基酸序列的 pre- ( y ) pro-GDNF蛋白剪接變體的前原區(qū)特異結(jié)合。
39.用在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)退行性疾病的方法中的GDNF蛋白剪接變體或其部分，所述剪接變體或其部分選自權(quán)利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接變體和如SEQ ID N0 52所示的⑶NF蛋白剪接變體。
40.GDNF蛋白剪接變體或其部分在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，其中所述剪接變體或其部分選自權(quán)利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接變體和如SEQ ID NO 52所示的⑶NF蛋白剪接變體。
41.用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)退行性疾病的方法的多核苷酸，所述多核苷酸選自權(quán)利要求15所述的多核苷酸和如SEQ ID NO 51所示的多核苷酸。
42.多核苷酸在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，其中所述多核苷酸選自權(quán)利要求15所述的多核苷酸和如SEQ IDNO 51所示的多核苷酸。
43.權(quán)利要求40或42所述的用途，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、脊髓損傷、成癮癥、酗酒、局部缺血、癲癇、抑郁癥或中風(fēng)。
44.權(quán)利要求40或42所述的用途，其中所述神經(jīng)退行性疾病是帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病或肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)。
45.多核苷酸在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途，其中所述多核苷酸選自權(quán)利要求16-25中任一項所述的多核苷酸和如SEQ ID NO :51所示的多核苷酸，其中體內(nèi)生成的pre- ( y ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF蛋白的分泌受到神經(jīng)元和神經(jīng)物理刺激的調(diào)控。
46.治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)退行性疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的 pre-(y)pro-GDNF蛋白或pre_( β )pro_GDNF蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸給予患有這類病癥或疾病的個體。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中的pre-(Y)pro-GDNF蛋白是權(quán)利要求2、5、8和11 中任一項所述的蛋白。
48.權(quán)利要求46所述的方法，其中的pre-( β ) pro-GDNF蛋白選自權(quán)利要求12或13所述的蛋白和如SEQ ID N0:52所示的蛋白。
49.藥物組合物，其包含與藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑聯(lián)用的有效量GDNF蛋白剪接變體，其中所述蛋白剪接變體選自權(quán)利要求1-14中任一項所述的GDNF蛋白剪接變體和如SEQ ID NO :52所示的⑶NF蛋白剪接變體。
50.藥物組合物，其在載體中包含有效量的選自權(quán)利要求16-26中任一項所述的多核苷酸和如SEQ ID NO :51所示的多核苷酸中的多核苷酸，所述載體適合將所述多核苷酸導(dǎo)入患有神經(jīng)系統(tǒng)疾病或神經(jīng)退行性疾病的患者的細(xì)胞中，從而能夠體內(nèi)合成治療有效的GDNF 蛋白產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)蛋白和基因，更具體來說，涉及GDNF蛋白的新的剪接變體，該剪接變體由新的剪接變體pre-(γ)pro-GDNF編碼，其分泌受到生物學(xué)調(diào)控。
文檔編號A61K38/18GK102282165SQ200880122830
公開日2011年12月14日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日
發(fā)明者莉娜·尼瓦萊塔, 馬特·薩爾馬 申請人:莉娜·尼瓦萊塔, 馬特·薩爾馬