專利名稱：氧化劑耐受性載脂蛋白a-1及模擬肽的制作方法
氧化劑耐受性載脂蛋白A-1及模擬肽相關(guān)申請本申請要求2007年10月23日提出的美國臨時申請?zhí)?0/981，887的優(yōu)先權(quán)，其主題通過引用納入本文。
背景技術(shù)：
循環(huán)膽固醇由血漿脂蛋白攜帶。脂蛋白是在血液中轉(zhuǎn)運脂類的脂質(zhì)和蛋白顆粒。 低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)是主要的膽固醇轉(zhuǎn)運載體。據(jù)信，LDL在體內(nèi)負(fù)責(zé)將膽固醇從肝臟運送到肝外組織。術(shù)語“逆向膽固醇轉(zhuǎn)運”(RCT)描述了膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運到進(jìn)行分解代謝和清除的肝臟。據(jù)信，血漿HDL顆粒在逆向轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮主要作用，用作組織膽固醇的清除劑。RCT主要由三個步驟組成(a)膽固醇流出，即初步將膽固醇從多種外周細(xì)胞庫中除去； (b)在卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的作用下發(fā)生膽固醇酯化，防止流出的膽固醇重新進(jìn)入細(xì)胞；以及(c)將HDL膽固醇酯攝取/運送到肝臟細(xì)胞。HDL和作為主要HDL蛋白的載脂蛋白A-I (ApoAl)的水平高早已與心血管疾病風(fēng)險降低相關(guān)。ApoAl是一級氨基酸序列已知，包含243個氨基酸殘基的單鏈多肽(Brewer等， (1978)Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 :623-630)。ApoAl 通過介導(dǎo)膽固醇從細(xì)胞中流出而在逆向膽固醇轉(zhuǎn)運中擔(dān)任細(xì)胞膽固醇受體。每個HDL顆粒都包含至少一個拷貝(通常是兩到四個拷貝)的ApoAl。ApoAl在人體中以267個殘基的前載脂蛋白原形式由肝臟和小腸合成，其以蛋白原形式分泌后迅速被鈣依賴性蛋白酶切割，從而產(chǎn)生243個氨基酸殘基的成熟多肽并分泌入血漿。據(jù)推斷， ApoAl含有八個串聯(lián)重復(fù)22單體序列和兩個11單體序列，其中大多數(shù)都具有形成A類兩親性螺旋結(jié)構(gòu)的潛能(Segrest ^ (1974)FEBS Lett. 38 247-253)。A類兩親性螺旋的特征包括存在于極性-非極性界面處的帶正電荷殘基和存在于極性面處的帶負(fù)電荷殘基(Segrest 等(1974)FEBS Lett. 38 :247-253 ；Segrest 等(1990)Proteins Structure, Function, and Genetics 8:103-117)。ApoAl可以與脂類形成三類穩(wěn)定復(fù)合物稱為前β I-HDL的小分子貧脂復(fù)合物； 稱為前0 2-HDL的包含極性脂(磷脂和膽固醇)的扁平盤狀顆粒；以及稱為球狀或成熟 HDL(HDL3和HDL2)的同時包含極性和非極性脂質(zhì)的球狀顆粒。大多數(shù)循環(huán)的HDL都同時包含ApoAl和ApoAII (第二主要HDL蛋白)，稱為HDL的A1/AII-HDL組分。但是只包含 ApoAl的HDL組分(本文稱為Al-HDL組分)似乎在RCT中更有效。一些流行病學(xué)研究支持 Al-HDL組分具有抗動脈粥樣硬化作用的假設(shè)(Parra等，1992，Arterioscler. Thromb. 12 701-707 ；Decossin 等，1997，Eur. J. Clin. Invest. 27 :299-307)。有充分證據(jù)表明，血清膽固醇升高與冠心病相關(guān)。例如，動脈粥樣硬化是一種慢性進(jìn)行性疾病，特征為在動脈壁內(nèi)的膽固醇累積。在動脈粥樣硬化病變處沉積的脂質(zhì)主要來源于血漿LDL的觀點也得到了有力證據(jù)的支持；所以LDL通常視作“有害膽固醇”。與此相反，HDL的血清水平則與冠心病逆相關(guān)，因此視作負(fù)風(fēng)險因素。據(jù)推測，高水平的血清HDL不僅對冠心病具有防護(hù)作用，實際上還可誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊的消退(例如，Badimon等，1992, Circulation 86(增刊III) :86-94)。所以，HDL通常視作“有益膽固醇”。發(fā)明概述本發(fā)明涉及能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的新型ApoAl模擬物。所述新型ApoAl模擬物的氨基酸序列與包含至少一個色氨酸并能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的天然ApoAl或 ApoAl的在前模擬物的至少一部分氨基酸序列基本上相似。與天然ApoAl或ApoAl的在前模擬物不同，所述新型ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少有一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。新型ApoAl模擬物可包含，例如含有色氨酸的ApoAl片段、天然ΑροΑ1、ΑροΑ1 融合蛋白、ApoAl嵌合蛋白、截短的ApoAl蛋白或ApoAl多肽的在前模擬物的氨基酸序列，其中所述新型ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。本發(fā)明還涉及治療心血管疾病的方法，該方法給予對象包含能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的新型ApoAl模擬物的藥物制劑。所述新型ApoAl模擬物包含含有至少一個色氨酸并能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl或ApoAl的在前模擬物的至少一部分氨基酸序列。 上述新型ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少有一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。 新型ApoAl模擬物可以包含，例如含有色氨酸的ApoAl片段、天然ApoAl、ApoAl融合蛋白、 ApoAl嵌合蛋白、截短的ApoAl蛋白或ApoAl的多肽模擬物的氨基酸序列，其中所述新型 ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。本發(fā)明還涉及促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的方法。所述方法包括給予荷脂細(xì)胞生物學(xué)有效量的純化多肽。所述多肽可包含含有SEQ ID NO :1所示膽固醇流出受體部分的氨基酸序列，其中X選自由色氨酸或苯丙氨酸組成的群組，且至少一個X是苯丙氨酸。本發(fā)明還涉及減輕對象炎癥的一種或多種癥狀的方法。所述方法包括給予治療對象能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的新型ApoAl模擬物。所述新型ApoAl模擬物包含含有至少一個色氨酸并能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl或ApoAl的在前模擬物的至少一部分氨基酸序列。所述新型ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少有一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。新型ApoAl模擬物可以包含，例如含有色氨酸的ApoAl片段、天然ΑροΑ1、ΑροΑ1 融合蛋白、ApoAl嵌合蛋白、截短的ApoAl蛋白或ApoAl多肽的模擬物的氨基酸序列，其中所述新型ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。本發(fā)明的另一個方面涉及減輕包含至少一個色氨酸殘基的ApoAl、其片段或其模擬物的膽固醇流出受體功能的MPO氧化喪失的方法。所述方法包括用氧化劑耐受性氨基酸取代ApoAl、其片段或ApoAl模擬物的至少一個色氨酸殘基。附圖簡述本發(fā)明的上述和其它特征及優(yōu)點在本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員經(jīng)過參閱下列


后是顯而易見的，其中圖1 (A-F)顯示分離自人動脈粥樣化組織的ApoAl蛋白修飾的串聯(lián)質(zhì)譜。在對人粥樣斑的免疫親和純化ApoAl進(jìn)行胰蛋白酶直接或膠內(nèi)酶解后，可以獲得碰撞誘導(dǎo)解離光譜。在LC串聯(lián)質(zhì)譜實驗中檢測雙電荷離子，并斷裂成碎片。A.肽Dl-RlO (SEQ ID NO 70), 在第8個殘基處包含單羥基色氨酸。B.肽L46-K59(SEQ ID NO :71)，在第50個殘基處包含單羥基色氨酸。C.肽E62-K77，在第72個殘基處包含單羥基色氨酸(SEQ ID NO 72)。D.肽 W108-R116(SEQ ID而7；3)，在第108個殘基處包含單羥基色氨酸，在第112個殘基處包含甲硫氨酸亞砜(methionine sulfoxide) 0 Ε.肽與D中相同，但是在第108個殘基處的色氨酸變?yōu)殡p羥基色氨酸(SEQ ID N0:74)。F.肽L41_R49(SEQ ID NO :7 ，在第48個殘基處包含甲硫氨酸亞砜。圖2顯示分離自人血漿和動脈粥樣化組織的ApoAl上的賴氨酸修飾。ApoAl分別從六個健康對象的血漿和六個動脈粥樣化樣品中通過免疫親和層析分離。賴氨酸修飾終產(chǎn)物——2-氨基己二酸的水平在酸水解后通過質(zhì)譜分析定量測定，并按照ApoAl賴氨酸含量標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)顯示各樣本的雙重測定的平均值(雙尾t檢驗ρ = 0. 005)。圖3顯示還原性甲基化對賴氨酸殘基的保護(hù)無法使其免受完整MP0/H202/C1_系統(tǒng)的失活作用。采用不同HA ApoAl摩爾比，通過MPO對ApoAl (實心圓，實線)和還原性甲基化的ApoAl (空心圓，虛線)進(jìn)行修飾。然后以5 μ g/ml與經(jīng)0. 3mM 8Br_cAMP處理以誘導(dǎo)ABCAl的膽固醇標(biāo)記的7細(xì)胞溫育4小時來測定這些蛋白質(zhì)的ABCAl依賴性細(xì)胞膽固醇受體活性。數(shù)據(jù)是三重測定的士 S. D.平均值，沒有條杠時，S. D.落在符號內(nèi)。圖4的圖㈧和圖⑶顯示，纈氨酸取代為甲硫氨酸的ApoAl對MPO介導(dǎo)功能喪失的易感性增加。A.對重組人ApoAl (rh-ApoAl)、rh-ApoAl 3MV(內(nèi)部3個甲硫氨酸被取代為纈氨酸)以及經(jīng)甲酸處理去除重組蛋白中起始甲硫氨酸和6His-tag的rh-ApoAl 3MV (rh-ApoAl 3MV F. Α.)進(jìn)行H2O2 ApoAl摩爾比為15 1的高劑量MPO修飾。細(xì)胞膽固醇流出活性的測定如圖1所述。數(shù)據(jù)是雙重測定的平均值士S. D.。Β.采用不同H2A ApoAl 摩爾比，通過MPO對rh-ApoAl (實心圓，實線)和rh-ApoAl 3MV (空心圓，虛線)進(jìn)行修飾。 然后根據(jù)圖3所述方法測定這些蛋白質(zhì)的ABCAl依賴性細(xì)胞膽固醇受體活性。數(shù)據(jù)是三重測定的平均值士S. D.。*，通過雙尾t檢驗，以相同H2O2 ApoAl摩爾比與rh-ApoAl 3MV比較，ρ < 0. 01。圖5 (A-B)顯示色氨酸取代為苯丙氨酸或亮氨酸對rh-ApoAl功能的影響，以及苯丙氨酸取代對MPO的失活作用的耐受性。A.如圖3所述測定不同濃度的rh-ApoAl (實心圓， 實線)、rh-ApoAl 4WF G個色氨酸換為苯丙氨酸，空心圓，虛線)以及rh-ApoAl 4WU4個色氨酸換為亮氨酸，空心方塊，點線)的細(xì)胞膽固醇受體活性。4WF變體很大程度保留了該活性，而艦L變體喪失該活性。數(shù)據(jù)是三重測定的平均值士S. D.。B.采用不同H2A ApoAl 摩爾比，通過MPO對rh-ApoAl (實心圓，實線)和rh-ApoAl 4WF (空心圓，虛線)進(jìn)行修飾。 然后如圖3所述測定這些蛋白質(zhì)的ABCAl依賴性細(xì)胞膽固醇受體活性。數(shù)據(jù)是三重測定的平均值士S. D.。*，ρ < 0. 05 ；和**, ρ < 0. 0001，通過雙尾t檢驗，以相同H2R ApoAl摩爾比與rh-ApoAl比較。圖6顯示色氨酸取代為苯丙氨酸的ApoAl對于HOCl介導(dǎo)的功能喪失具有耐受性。 以不同HOCl ApoAl摩爾比對rh-ApoAl (實心圓，實線)和rh-ApoAl 4WF(空心圓，虛線) 進(jìn)行修飾。然后如圖3所述測定這些蛋白質(zhì)的ABCAl依賴性細(xì)胞膽固醇受體活性。數(shù)據(jù)是三重測定的平均值士S. D.。"，ρ < 0.0001，通過雙尾t檢驗，以相同HOCl ApoAl摩爾比與rh-ApoAl比較。圖7 (A-B)顯示rh-ApoAl 4WF與脂質(zhì)以及rh_ApoAl結(jié)合，其脂質(zhì)結(jié)合活性對MPO 介導(dǎo)的氧化具有耐受性。A.制備二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)乳液(125 μ g)，在不添加 (實粗線)或添加25 μ g的rh-ApoAl (實細(xì)線)或rh-ApoAl 4WF(點線)的條件下進(jìn)行溫育。M°C，隨時間讀取325nm的吸光度(每種條件下η = 3，平均值士S. D.)，通過濁度喪失來監(jiān)測脂質(zhì)結(jié)合和增溶。與野生型rh-ApoAl相比，4WF變體產(chǎn)生了相似的DMPC清澈度。B.采用不同H2O2 ApoAl摩爾比，通過MPO對rh-ApoAl(實心圓，實線)和rh-ApoA14WF (空心圓，虛線)進(jìn)行修飾。然后通過阻止磷脂酶C依賴性LDL聚集來測定這些蛋白質(zhì)的脂質(zhì)結(jié)合活性。數(shù)據(jù)根據(jù)無H2O2時處理的rh-ApoAl的脂質(zhì)結(jié)合活性作標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)是三重測定的平均值士S. D.。*，p < 0. 05 ；和**，p < 0. 001，通過雙尾t檢驗，以相同H202 ApoAl 摩爾比與rh-ApoAl 4WF比較。數(shù)據(jù)表明，在降低野生型rh_ApoAl的脂質(zhì)結(jié)合活性的MPO 修飾劑量下，rh-ApoAl 4WF并未喪失其脂質(zhì)結(jié)合活性。圖8所示的免疫印跡顯示色氨酸取代為苯丙氨酸的ApoAl對MPO產(chǎn)生的交聯(lián)作用仍然易感。采用下列H2A ApoAl摩爾比對rh-ApoAl和rh_ApoA14WF進(jìn)行MPO修飾0、1、 2、3、5和12.5(從左至右)。通過蛋白質(zhì)印跡法定量測定ApoAl交聯(lián)。分子量標(biāo)準(zhǔn)的遷移顯示在左側(cè)。圖9所示梯度凝膠顯示無脂質(zhì)rh-ApoAl的遷移。A.采用棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿 (POPC)和野生型或4WF rh-ApoAl (P0PC ApoAl摩爾比為100 1)，通過膽酸鹽透析制備 rHDL，將其在4-20%的非變性聚丙烯酰胺梯度凝膠上進(jìn)行電泳。第1泳道，分子大小標(biāo)準(zhǔn)， 直徑列于左側(cè)；第2泳道，10 μ g野生型rh-ApoAl rHDL ；第3泳道，10 μ g的4WF rh-ApoAl rHDL。兩種ApoAl變體在非變性梯度凝膠上均產(chǎn)生了約9. 8、12和17nm的圓盤。無脂質(zhì) rh-ApoAl的遷移由箭頭顯示在右側(cè)。圖10顯示在有(實心柱)或沒有(空心柱)0. 3mM 8Br_cAMP預(yù)處理產(chǎn)生的ABCAl 誘導(dǎo)作用存在下，由[咕]膽固醇標(biāo)記的7細(xì)胞得到的rHDL制品G小時溫育)的膽固醇流出活性。rh-ApoAl (10 μ g/ml)產(chǎn)生了 ABCAl依賴性膽固醇受體活性；但是野生型 (WT)和4WF ApoAl rHDL制品(10 μ g/mlApoAl)均只產(chǎn)生ABCAl依賴性膽固醇受體活性。 條柱顯示平均值士 S. D. (n = 3)。圖11顯示含色氨酸取代的合成肽的ABCAl依賴性膽固醇受體活性。合成的親本 Ii ρ 18 (Ac-DffFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2) (SEQ ID NO 76)包含或缺乏用色氨酸殘基(W)取代苯丙氨酸(P18WF)或亮氨酸(pl8WL)。通過與經(jīng)0. 3mM 8Br_cAMP預(yù)處理以誘導(dǎo)ABCAl的[3H] 膽固醇標(biāo)記的7細(xì)胞進(jìn)行4小時溫育來測定所述三種肽的膽固醇受體活性。肽濃度以μ g/ml為單位顯示在柱狀圖標(biāo)簽上。條柱顯示平均值士S. D. (n = 3)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及給予對象時能耐受氧化并能增強膽固醇流出荷脂細(xì)胞的載脂蛋白 A-I (ApoAl)多肽模擬物。在說明書和權(quán)利要求書中使用的“對氧化的耐受性”或“氧化劑耐受性”是指ApoAl模擬多肽至少部分耐受損傷或降低ApoAl多肽的膽固醇接受和脂質(zhì)結(jié)合活性的氧化作用。所述氧化作用可能與一些作用有關(guān)或由其導(dǎo)致，例如，各氧化途徑的氧化作用，包括以下至少一種髓過氧化酶(MPO)、MPO產(chǎn)生的氧化劑、MPO產(chǎn)生的活性氯化物(reactive chlorinating species)、MP0/H2&/Cr 系統(tǒng)、H0Cl/0Cr、MPO 產(chǎn)生的活性氮(reactive nitrogen species)、ΜΡ0/Η202/Ν02_系統(tǒng)、二氧化氮、過氧亞硝酸根 (peroxynitrite) (0N0CT)、亞硝基過氧碳酸根(peroxycarboxynitrite) (ONOOCO2O 以及 0N00—在有(X)2 (或緩沖液中有HCO3-)存在下起作用時形成的產(chǎn)物。據(jù)發(fā)現(xiàn)，ApoAl蛋白的色氨酸殘基很容易被氧化，例如，在髓過氧化酶(MPO)、次氯酸或其它潛在的氧化劑的作用下。ApoAl色氨酸殘基的氧化會導(dǎo)致其喪失膽固醇接受和脂質(zhì)結(jié)合活性。此外，MPO介導(dǎo)的天然ApoAl的氧化作用可能使得作為逆向膽固醇轉(zhuǎn)運一部分的細(xì)胞膽固醇的接受作用失活。本發(fā)明的ApoAl氧化劑耐受性模擬物(或氧化耐受性模擬物)的氨基酸序列與包含至少一個色氨酸并且至少一個色氨酸殘基被氧化劑耐受性殘基，例如氧化劑耐受性肽殘基取代但ApoAl脂質(zhì)結(jié)合和流出活性保留的ΑροΑ1、ΑροΑ1片段或已知的ApoAl模擬物的氨基酸序列大體相似。在一個實施例中，所述氧化劑耐受性殘基可包括芳香肽殘基，例如苯丙氨酸。在說明書和權(quán)利要求書中使用的“ApoAl的模擬物”、“ApoAl的在前模擬物”或“已知的ApoAl模擬物”指可在任何參考文獻(xiàn)鑒定或衍生自其中的具有ApoAl特性的ApoAl模擬物。這包括在美國和外國專利及出版物中鑒定的ApoAl模擬物。術(shù)語“ApoAl的模擬物”、 "ApoAl的在前模擬物”或“已知的ApoAl模擬物”與說明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語“ApoAl 模擬物”、“新型ApoAl模擬物”或“新ApoAl模擬物”不同，后者包括對氧化耐受或氧化劑耐受性的本發(fā)明ApoAl模擬物。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白，，在此可交換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語既適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物， 也適用于天然氨基酸聚合物。此處使用的“芳香氨基酸”指在支鏈上含有至少一個芳環(huán)或雜芳環(huán)的疏水氨基酸。所述芳環(huán)或雜芳環(huán)可包含一個或多個取代基，例如-0H、-SH、-CN、-F、-C 1、-Br、-I、-N02、-N0、-NH2、-NHR、-NRR、-C (O)R,-C (0) OH,-C (0) OR,-C (0)NH2、_C (0)NHR、_C (0) NRR等，其中各R獨立為(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代的(C1-C6) 烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26) 烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基、取代的5-20元雜芳基、646元烷雜芳基或取代的616元烷雜芳基。遺傳編碼的芳香氨基酸包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一特定實例中，本發(fā)明中的氧化耐受性氨基酸可以是苯丙氨酸。氧化耐受性ApoAl模擬物在促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞方面是優(yōu)秀的，可以用作治療、減輕和/或預(yù)防冠狀動脈血管疾病的療法(例如心血管疾病)，包括可以同時減少已有斑塊和抑制新斑塊形成、動脈粥樣硬化、血管炎癥、傷口愈合及高脂血癥的治療劑。故本發(fā)明包括通過給予對象治療有效量的ApoAl模擬物來治療、預(yù)防和/或減輕治療對象的冠狀動脈血管疾病、血管炎癥、傷口愈合和/或高脂血癥的方法。在本發(fā)明的一方面，ApoAl模擬物可以包括一種多肽，該多肽具有的氨基酸序列包含至少一個色氨酸和天然ApoAl的膽固醇流出受體部分。在一個實施例中，ApoAl模擬物可以具有下列氨基酸序列DEPPQSQXDR VKDLATVYVD VLKDSGRDYV SQFEGSALGKQLNLKLLDNX DSVTSTFSKL REQLGPVTQE FXDNLEKETEGLRQEMSKDL EEVKAKVQPY LDDFQKKXQE EMELYRQKVEPLRAELQEGA RQKLHELQEK LSPLGEEMRD RARAHVDALRTHLAPYSDEL RQRLAARLEA LKENGGARLA EYHAKATEHLSTLSEKAKPA LEDLRQGLLP VLESFKVSFL SALEEYTKKL NTQ(SEQ IDNO :1)，其中X是色氨酸殘基或氧化劑耐受性殘基(例如苯丙氨酸)，且四個X中至少一個是氧化劑耐受性殘基。在其它實施例中，SEQ ID NO 1的X中至少兩個是氧化劑耐受性殘基，SEQ ID NO=I的 X中至少三個是氧化劑耐受性殘基，或所有四個X都是氧化劑耐受性殘基。除了包括色氨酸取代的野生型或天然形式ApoAl外，ApoAl模擬物還可以包括本領(lǐng)域已知的色氨酸取代的ApoAl天然變體。例如，Weisgraber等證明在稱為ApoAl-Milano的突變型ApoAl中，可以將半胱氨酸取代第173位的精氨酸(Weisgraber等(1983) J.Biol. Chem. 258 :2508_2513)。所以，基于 ApoAl-Milano 的 ApoAl 模擬物可以包含 SEQ ID NO 2 的氨基酸序列。MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FXQQDEPPQS PXDRVKDLATVYVDVLKDSG RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNXDSVTSTFSKLREQLGP VTQEFXDNLE KETEGLRQEM SKDLEEVKAKVQPYLDDFQK KXQEEMELYR QKVEPLRAEL QEGARQKLHELQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALCTHLAPY SDELRQRLAARLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQGLLPVLESFK VSFLSALEEY TKKLNTQ (SEQ ID NO :2)，其中 X 是色氨酸或氧化劑耐受性殘基(例如苯丙氨酸)，且至少一個X取代氧化劑耐受性殘基。 本發(fā)明ApoAl模擬物的另一個實例是基于已知的人ApoAl肽的全長模擬物，在成熟ApoAl的第151位具有半胱氨酸(對應(yīng)于SEQ ID NO :3序列中的第175 位)。該實例的ApoAl模擬物可以包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列。MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FXQQDEPPQS PXDRVKDLATVYVDVLKDSG RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNXDSVTSTFSKLREQLGP VTQEFXDNLE KETEGLRQEM SKDLEEVKAKVQPYLDDFQK KXQEEMELYR QKVEPLRAEL QEGARQKLHELQEKLCPLGE EMRDRARAHV DALCTHLAPY SDELRQRLAARLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQGLLPVLESFK VSFLSALEEY TKKLNTQ (SEQ ID NO 3)；其中X是色氨酸或氧化劑耐受性殘基(例如苯丙氨酸)，且至少一個X取代氧化劑耐受性殘基(例如苯丙氨酸)。相應(yīng)地，本發(fā)明所涵蓋的ApoAl多肽模擬物可包括各種ApoAl形式和變體的修飾多肽，包括例如，載脂蛋白A-I (Brewer等，(1978))、載脂蛋白 A-IMilano (Weisgraber (1983)),載脂蛋白 A-lMarburg (Utermann 等，(1982) J. Biol. Chem. 257 :501-507)、載脂蛋白 A-I Paris(Bielicki 和 Oda(2002)Biochemistry 41， 2089-2096)、載脂蛋白原A-I或本領(lǐng)域已知的合成或天然的其它ApoAl突變體形式?；蛘撸景l(fā)明的ApoAl模擬物也可包括高度模仿人或小鼠ApoAl肽的A類兩親性螺旋的兩親性螺旋肽(即ApoAl的模擬物)，其中X表示的殘基可包括色氨酸殘基或氧化劑耐受性氨基酸殘基，且至少一個X是氧化劑耐受性殘基。術(shù)語“兩親性螺旋肽”指包含至少一個兩親性螺旋(兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域)的肽。本發(fā)明中的某些兩親性螺旋肽可包含兩個或更多(例如3、4、5個等)兩親性螺旋。術(shù)語“A類兩親性螺旋”指一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其形成隔開極性和非極性面的α 螺旋，其中帶正電荷的殘基位于極性_非極性界面處，而帶負(fù)電荷的殘基則位于極性面的中心(見例如，Segrest 等(1990)Proteins :Structure，F(xiàn)unction，and Genetics 8 103-117)。特別優(yōu)選的肽可以與編碼人或小鼠ApoAl的A類兩親性螺旋的外顯子編碼的多肽有大于50%的氨基酸序列相同性。所述肽可以與藥理學(xué)可接受的賦形劑(例如適合口服給予哺乳動物的賦形劑)混合。在某些實施方案中，ApoAl模擬物是ApoAl的片段或模擬物，其能促進(jìn)膽固醇流出并包含下列氨基酸序列中的一個或多個D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO 4),D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO 5),D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO 6),D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO 7),
D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :8)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :9)， D-X-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 10)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 11)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 12)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 13)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 14)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 15)，E-X-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 16)，E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 17)，E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO: 18)，E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 19)，E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO :20)，E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :21)，E-X-L K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :22)，D-X-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO :23)，D-X-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO :24)，D-X-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :25)，E-X-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO :26)，E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :27)，E-X-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO :28)，E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :29)，E-X-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :30)，E-X-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO :31)，D-F-L-K-A-X-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-X-(SEQ ID NO :32)，E-F-L-K-A X-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-X-(SEQ ID NO :33)，D-F-X-K-A-X-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-X-X-(SEQ ID NO :34)，E-F-X-K-A-X-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-X-X-(SEQ ID NO :35)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-X-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO :36)，D-K-X-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO :37)，E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-X-A-K-E-A-F-(SEQ ID NO :38)，E-K-X-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO :39)，D-X-L-K-A-F-V-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(SEQ ID NO :40)，E-K-X-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(SEQ ID NO :41)，D-X-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO :42)，E-X-L-K-A-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO :43)，D-X-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :44)，E-X-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :45)，D-X-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :46)，
E-X-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :47)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :48)，E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :49)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO :50)，E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (SEQ ID NO :51)，D-X-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :52)，E-X-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :53)，D-X-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO :54)，E-X-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO :55)，D-X-L-R-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :56)，X-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :57)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO :58)，E-X-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(SEQ ID NO :59)，D-X-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :60)，E-X-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO :61)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E -A-F(SEQ ID NO 62)，D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E -F-F(SEQ ID NO 63)，D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E -A-F(SEQ ID NO 64)，D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-X-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-X-L-K-E -A-F(SEQ ID NO 65)，D-K-X-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-X-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E -F-L(SEQ ID NO 66)，D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E -A-F(SEQ ID NO 67)，D-X-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E -F-F(SEQ ID NO :68)，禾口D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E -F-F(SEQ ID NO 69)；其中X是色氨酸或氧化劑耐受性殘基(例如苯丙氨酸)，且各序列中至少有一個X 取代氧化劑耐受性殘基。上述引用序列(SEQ ID N0:4-SEQ ID NO :69)描述于Fogelman等的美國專利號 7，144，862B2 (以下稱‘862專利)，其通過引用全文納入本文?！?62專利涉及用于減輕動脈粥樣硬化的一種或多種癥狀的肽。‘862專利所述的肽在本文標(biāo)記為X的各殘基處包含色氨酸殘基。‘862專利的合成肽設(shè)計成模擬A類兩親性螺旋基序(Segrest等(1990) Proteins Structure, Function andGenetics 8 103-117))，能與磷脂結(jié)合并表現(xiàn)出與人 ApoAl 相似的許多生物學(xué)特性。
還應(yīng)注意，該ApoAl模擬肽清單不是全部。上述序列的截短形式、上述序列的多聚體組合(例如，從二聚體到三聚體、四聚體、五聚體、八聚體或十聚體)、上述序列的保守性取代和/或包含氨基酸類似物的上述序列，根據(jù)其中的提示也涵蓋在內(nèi)。應(yīng)該理解，一般將ApoAl用作起點，可以產(chǎn)生出ApoAl模擬多肽的生物功能等同物，甚至改進(jìn)。可以對該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改變，且仍然獲得具有相似或所需特征的分子。例如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以取代其它氨基酸，同時并不造成膽固醇流出受體活性顯著喪失。同樣應(yīng)該被涵蓋的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過取代、缺失或插入至少一個氨基酸來進(jìn)一步修飾本發(fā)明的ApoAl氨基酸序列，這些進(jìn)一步的修飾產(chǎn)生氧化劑耐受性ApoAl 多肽的生物學(xué)功能等同物。這些取代不嚴(yán)重抑制修飾的ApoAl促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的能力。本文所用的“實質(zhì)性抑制”或“抑制”包括修飾的ApoAl多肽促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的能力中任何可測的可重復(fù)降低。技術(shù)人員還熟知，“生物學(xué)功能等同”蛋白質(zhì)或多肽的定義中固有的概念是，分子所限定一部分內(nèi)可以做出的改變數(shù)目有限，且仍然可以獲得具有可接受水平的等同生物學(xué)活性的分子。所以本文將生物學(xué)功能等同蛋白質(zhì)和肽定義為某些，而非多數(shù)或全部的氨基酸可被取代的蛋白質(zhì)和肽。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明不難制備和使用多種具有不同取代的不同蛋
白質(zhì)/肽。氨基酸取代一般是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如，其疏水性、親水性、電荷、大小等。對氨基酸側(cè)鏈取代基大小、形狀和類型的分析顯示，精氨酸、賴氨酸和組氨酸均為帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸均具有相似大小。所以，考慮到這些因素，本文將精氨酸、賴氨酸和組氨酸，及丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸定義為生物學(xué)功能等同物。按照Alton等的公開申請(W083/04053)中的方法，不難設(shè)計并制備編碼微生物表達(dá)多肽的基因，所述多肽的初級構(gòu)象在一個或多個殘基的相同性或位置方面與本文定義那些的不同(例如，取代、末端和中間的插入和缺失)。或者，通過熟知的定點誘變技術(shù)不難對 cDNA和基因組基因的修飾，再將其用于生成ApoAl的類似物和衍生物。這樣的產(chǎn)物與修飾的氧化劑耐受性ApoAl具有至少一項共同的生物學(xué)特性，而其它方面可以不同。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，ApoAl模擬多肽可以是全長人ApoAl肽的片段。本發(fā)明的ApoAl片段是上述ApoAl多肽在至少一個方面，包括但不限于促進(jìn)膽固醇流出和減輕炎癥狀態(tài)的一種或多種癥狀的生物學(xué)功能等同物。ApoAl片段可由約5到50個氨基酸組成， 包括至少一個色氨酸殘基，其中色氨酸殘基被氧化劑耐受性氨基酸取代。 應(yīng)該理解，與ApoAl模擬多肽相似，可以對ApoAl片段的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列作出修飾和改變，且仍然獲得具有相似或所需功能特征的分子。例如，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可取代其它氨基酸，同時膽固醇流出促進(jìn)作用不顯著喪失。本發(fā)明的ApoAl模擬多肽還可以包含與多肽氨基末端和/或羧基末端偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)。術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”指與氨基酸中的功能基團(tuán)(例如，側(cè)鏈、α氨基、α羧基等)連接時會阻斷或掩蓋該功能基團(tuán)特性的化學(xué)基團(tuán)。氨基末端保護(hù)基團(tuán)的例子包括但不限于乙酰基或氨基。在這樣的實施方案中，本文所述多肽N末端和/或C末端的前一到四個氨基酸殘基可被已知賦予α螺旋二級結(jié)構(gòu)區(qū)域穩(wěn)定性的一個或多個氨基酸殘基或一個或多個肽段(“末端帽”或“保護(hù)基團(tuán)”殘基或區(qū)段)取代。這樣的末端帽殘基和區(qū)段為本領(lǐng)域所熟知(見例如，Richardson 禾口 Richardson，1988，Science 240 1648-1652 ；Harper φ,1993, Biochemistry 32(30) 7605-7609 ；Dasgupta 禾口 Bell，1993， Int.J. Peptide Protein Res. 41 499-511 ；Seale 等，1994，Protein Science31741-1745 ;Doig 等， 1994，Biochemistry 33 :3396_3403 ；Zhou 等，1994，Proteins 18 1~7 ；Doig 禾口 Baldwin， 1995, Protein Science 4 :1325—1336；Odaert φ,1995, Biochemistry 34 12820-12829 ； Petrukhov 等，1996, Biochemistry35 :387_397 ;Doig 等，1997, Protein Science 6: 147-155)?；蛘撸疚乃龆嚯牡那耙坏剿膫€N末端和/或C末端氨基酸殘基可以被模擬末端帽殘基或區(qū)段的結(jié)構(gòu)和/或特性的擬肽部分所替換。末端帽模擬物的例子為本領(lǐng)域所熟知，描述于例如，Richardson 和 Richardson, 1988，Science 240 1648-1652 ；Harper φ,1993, Biochemistry 32(30) 7605-7609 ；Dasgupta 禾口 Bell，1993， Int.J.Peptide Protein Res. 41 499-511 ；Seale 等，1994，Protein Science3 1741-1745 ;Doig 等， 1994，Biochemistry 33 :3396_3403 ；Zhou 等，1994， Proteins 18 1~7 ；Doig 禾口 Baldwin， 1995, Protein Science 4 1325-1336 ；Odaert φ, 1995, Biochemistry 34 12820-12829 ； Petrukhov 等，1996, Biochemistry35:387_397 ;Doig 等，1997, Protein Science 6: 147-155。本發(fā)明的ApoAl模擬多肽可純化和分離。術(shù)語“純化和分離的”在本文指基本上除去了不需要的物質(zhì)，從而使該被修飾的ApoAl模擬物的多肽或其片段可用于促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞。例如，可以獲得基本上除去其它人蛋白或致病物因子的修飾重組人ApoAl模擬多肽。這些多肽的特征還在于是哺乳動物細(xì)胞的產(chǎn)物、化學(xué)合成方法的產(chǎn)物、或通過基因組或cDNA克隆或基因合成得到的外源DNA序列在原核或真核宿主表達(dá)(例如，通過細(xì)菌、 酵母菌、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng))的產(chǎn)物。產(chǎn)物在典型的酵母(例如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae))或原核(例如大腸桿菌(E.coli))宿主細(xì)胞中 的表達(dá)與任何哺乳動物蛋白質(zhì)無關(guān)聯(lián)。產(chǎn)物在脊椎動物(例如非人哺乳動物(例如，COS或CHO)和禽類)細(xì)胞中的表達(dá)與任何人蛋白質(zhì)無關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的多肽依賴于所用的宿主和其它因素， 可以被哺乳動物或其它真核糖類糖基化，也可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括起始甲硫氨酸殘基(相對多肽第一氨基酸殘基位于第-1位)。本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)進(jìn)行純化，例如反相高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析等。純化特定肽采用的實際條件部分依賴于合成策略和因素， 例如靜電荷、疏水性、親水性等，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。多聚分支肽可以通過諸如離子交換層析或分子排阻層析等方法純化。對于親和層析純化，可以采用與所述肽特異性結(jié)合的任何抗體。對于抗體生產(chǎn)，各種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等可通過注射肽進(jìn)行免疫。所述肽可以通過側(cè)鏈功能基團(tuán)或與側(cè)鏈功能基團(tuán)連接的接頭與合適的運載體相連，例如BSA?？捎酶鞣N佐劑增強免疫應(yīng)答，依賴于宿主種類，包括但不限于弗氏(完全及不完全)佐劑，諸如氫氧化鋁的礦物凝膠，諸如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇類、聚陰離子、肽類、油乳劑、匙孔槭血藍(lán)蛋白、 二硝基苯酚的表面活性物質(zhì)，以及諸如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)的可能有用的人佐劑?？梢圆捎猛ㄟ^連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)提供抗體分子生產(chǎn)的任何技術(shù)制備肽的單克隆抗體。這些包括但不限于雜交瘤技術(shù)，其最初由Kohler和Milstein，1975，Nature 256 495-497，或Kaprowski，美國專利號4，376，110所描述，通過引用納入本文 ’人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor 等，1983，Immunology Today4 -J2 ；Cote 等，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 80 2026-2030)；以及 EBV 雜交瘤技術(shù)(Cole 等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, Inc.，pp. 77-96 (1985))。此外，可采用通過將具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因連同具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因一起剪接而為生產(chǎn)“嵌合抗體”開發(fā)的技術(shù)(Morrison 等，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81 6851-6855 ；Neuberger 等，1984，Nature 312 :604_608 ；Takeda 等，1985，Nature 314 452-454，Boss，美國專利號4，816，397 ；Cabilly，美國專利號4，816，567 ；通過引用納入本文)?；蛘呖梢灾苽洹叭嗽椿笨贵w(見例如，Queen，美國專利號5，585，089，通過引用納入本文)。或者可以采用單鏈抗體生產(chǎn)所描述的技術(shù)(美國專利號4，946，778)來生產(chǎn)肽特異性單鏈抗體。包含特異性結(jié)合位點缺失的抗體片段可以由已知技術(shù)生成。例如，這樣的片段包括但不限于胃蛋白酶消化抗體分子得到的F(ab' )2片段和還原F(ab' )2片段二硫鍵得到的Fab片段?；蛘?，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，1989，Science 246 :1275_1281)，從而能快速而方便地鑒定對感興趣肽具有所需特異性的單克隆Fab片段。對所需肽具有特異性的抗體或抗體片段可以連接到，例如瓊脂糖，抗體-瓊脂糖復(fù)合物可用于免疫層析以純化本發(fā)明的肽。見Scopes，1984，Protein Purification Principles and Practice, Springer-Verlag New York, Inc. , NY, L ivingstone,1974, Methods In Enzymology ImmunoaffinityChromatography of Proteins 34 :723_7310本發(fā)明還涵蓋了包含多組氨酸標(biāo)簽的ApoAl模擬多肽。多組氨酸標(biāo)簽是蛋白質(zhì)中由至少6個組氨酸(His)殘基組成的一種氨基酸基序，經(jīng)常位于蛋白質(zhì)的N或C末端。也稱為六組氨酸標(biāo)簽、6xHis_tag，商標(biāo)名為His-tag (EMD生物科學(xué)公司(EMD Biosciences))。 多組氨酸標(biāo)簽可用于在大腸桿菌或其它原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多組氨酸標(biāo)記重組蛋白的親和純化。通過離心收獲細(xì)菌細(xì)胞，可采用物理方法、表面活性劑或酶，例如溶菌酶裂解得到的細(xì)胞沉淀物。粗裂解液在該階段包含混在其它細(xì)菌蛋白質(zhì)中的重組蛋白，與諸如NTA 瓊脂糖、HisPur樹脂或Talon樹脂等親和介質(zhì)一起溫育。這些親和介質(zhì)包含結(jié)合的金屬離子鎳或鈷，多組氨酸標(biāo)簽以微摩爾級的親和力與之結(jié)合。接著用磷酸鹽緩沖液洗滌樹脂，除去沒有與鈷或鎳離子特異性相互作用的蛋白質(zhì)。可以添加20mM咪唑來提高洗滌效率，然后通常用150-300mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)，但是也使用更高的濃度。蛋白質(zhì)的純度和含量可以通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡評價。當(dāng)重組蛋白是在原核宿主生物中表達(dá)時，使用多組氨酸標(biāo)簽的親和純化通常可以獲得較純的蛋白質(zhì)。在特定的情況下或為了達(dá)到特定的目的，例如純化蛋白復(fù)合物以研究被修飾的ApoAl多肽相互作用，從諸如酵母、昆蟲細(xì)胞或其它真核生物等更高級生物中進(jìn)行純化可能要求使用兩個標(biāo)簽的串聯(lián)親和純化以產(chǎn)生更高純度?；蛘撸褂霉潭ㄢ掚x子而不是鎳離子的一步純化方法一般可以實質(zhì)性提升純度，且洗脫組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白質(zhì)所需的咪唑濃度也更低。本發(fā)明的另一個方面涉及編碼前述的修飾ApoAl模擬多肽的核酸。本發(fā)明的核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在DNA中，ApoAl互補DNA(cDNA)(例如， Breslow 等(1982)Proc. Nat. Acad. Sci. 79 :6861_6865，分離并鑒定了人 ApoAl 的 cDNA 克隆)、基因組DNA(gDNA)、雜交序列、合成或半合成序列均可使用。此外，核酸還可以經(jīng)過化學(xué)修飾，例如，為達(dá)到增加其對核酸酶的抗性、其細(xì)胞穿透或細(xì)胞尋靶、其治療效果等。這些核酸可以來自人、動物、植物、細(xì)菌、病毒、合成等。這些核酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)獲得，特別是通過篩選文庫、化學(xué)合成或包括對篩選文庫獲得的序列進(jìn)行化學(xué)或酶修飾的混合方法。 本發(fā)明的另一個方面涉及可用于促進(jìn)包含至少一部分ApoAl模擬物的多肽或蛋白質(zhì)在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸序列。對于本發(fā)明的重組ApoAl模擬物的生產(chǎn)， 所述核酸可以整合入可以是自主復(fù)制或整合載體的病毒或質(zhì)粒載體中。接著該載體用來轉(zhuǎn)染或感染所選細(xì)胞群體。然后將收獲的轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)，分離本發(fā)明的重組ApoAl模擬物?？捎脕硗ㄟ^重組方法生產(chǎn)本發(fā)明變體的細(xì)胞宿主是真核或原核宿主。真核宿主的例子包括動物細(xì)胞、酵母或真菌。特別對于酵母，可以使用釀酒酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)或漢森酵母屬(Hansenula)。對于動物細(xì)胞，可以使用C0S、CH0、 CI27、NIH-3T3等。在真菌中，可以使用曲霉菌(Aspergillus ssp.)或木霉菌(Trichoderma ssp)。對于原核宿主，例如，可以使用下列細(xì)菌大腸桿菌、芽孢桿菌(Bacillus)或鏈霉菌 (Streptomyces)。然后可將如此分離的變體以治療作用為目的進(jìn)行包裝。所以，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供的核酸編碼一種多肽，該多肽具有能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl模擬物或其片段的修飾的氨基酸序列。所述氨基酸序列通過用氨基酸序列中至少一個色氨酸取代氧化劑耐受性氨基酸得到修飾。如果所述肽完全由基因編碼的氨基酸組成，或其一部分由此組成，所述多肽或相關(guān)部分也可以采用常規(guī)重組基因工程技術(shù)合成。對于重組生產(chǎn)，編碼所述肽的多核苷酸序列被插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即包含所插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的必要元件的載體，或在RNA 病毒載體的情況下，包含復(fù)制和翻譯的必要元件。接著表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入合適的靶細(xì)胞，表達(dá)肽。然后依據(jù)所用的表達(dá)系統(tǒng)，通過本領(lǐng)域已有的方法分離表達(dá)的肽。重組蛋白和肽的生產(chǎn)方法為本領(lǐng)域所熟知(見例如，Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，冷泉港實驗室，紐約；以及Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學(xué)方案)，格林出版伙伴和威利科學(xué)出版社(Greene Publishing Associates andffiley Interscience),紐約，各自通過弓|用全文納入本文)。為提高生產(chǎn)效率，可將多核苷酸設(shè)計為編碼由酶切位點分隔的多個肽單元——均聚物(重復(fù)的肽單元)或雜聚物(串聯(lián)在一起的不同肽)均可以照此設(shè)計。可以切割獲得的多肽(例如用適當(dāng)?shù)拿柑幚?來回收肽單元。這樣可以提高單個啟動子驅(qū)動的肽的產(chǎn)量。在一個實例中，可以設(shè)計多順反子多核苷酸以轉(zhuǎn)錄出編碼多個肽(即均聚物或雜聚物) 的單個mRNA，各編碼區(qū)域操作性連接于帽不依賴型翻譯控制序列，例如內(nèi)核糖體插入位點 (IRES)。當(dāng)用于適當(dāng)?shù)牟《颈磉_(dá)系統(tǒng)時，mRNA編碼各肽的翻譯均受轉(zhuǎn)錄物內(nèi)部的指導(dǎo)，例如通過IRES。因此，多順反子構(gòu)建物指導(dǎo)單個大多順反子mRNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而指導(dǎo)多個個體蛋白質(zhì)的翻譯。這種方式消除了多聚蛋白的產(chǎn)生和酶加工，可以顯著提高單個啟動子驅(qū)動的肽的產(chǎn)量?？衫酶鞣N宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)本文所述的肽。這些包括但不限于微生物，例如包含適當(dāng)編碼序列的重組噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；包含適當(dāng)編碼序列的重組酵母或真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母或絲狀真菌；包含適當(dāng)編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；包含適當(dāng)編碼序列的重組病毒表達(dá)載體 (例如，花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒)感染的或包含適當(dāng)編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動物細(xì)胞系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)元件的強度和特異性各有不同。依賴于所用宿主/載體系統(tǒng)， 多個轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子，都可用于表達(dá)載體。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時，可以使用誘導(dǎo)型啟動子，例如噬菌體λ的pL、plac、ptrp、 ptac (ptrp-lac雜交啟動子)等；當(dāng)在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用諸如桿狀病毒多角體啟動子等啟動子；當(dāng)在植物細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行克隆時，可以使用來自植物細(xì)胞基因組的啟動子(例如，熱休克啟動子；RUBISC0小亞基的啟動子；葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動子)或來自植物病毒的啟動子(例如，CaMV的35S RNA啟動子；TMV的外殼蛋白啟動子)；當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行克隆時，可以使用哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白) 或哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7. 5K啟動子)；當(dāng)生成包含多拷貝表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞系時，可以配合選擇標(biāo)記使用基于SV40-、BPV-和EBV-的載體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是DNA、RNA或其嵌合混合物、衍生物或修飾形式，可以是單鏈或雙鏈的。這樣的寡核苷酸可以在堿基部分、糖部分或磷酸骨架上進(jìn)行修飾，來達(dá)到例如增強分子穩(wěn)定性和雜交等。本發(fā)明的寡核苷酸還可包括其它基團(tuán)，例如肽(例如，以在體內(nèi)對宿主細(xì)胞受體進(jìn)行定位)、促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的試劑(見例如，Letsinger等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 6553-6556 ；Lemaitre 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 648-652 ；PCT公開號WO 88/09810，
公開日1988年12月15日)、雜交觸發(fā)的切割劑 (見例如，Krol 等(1988)BioTechniques 6 :958_976)或嵌入劑(見例如，Zon(1988)Pharm. Res. 5:539-549)。為此目的，所述寡核苷酸可以與另一個分子偶聯(lián)，例如，肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運試劑、雜交觸發(fā)的切割劑等。在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以使用若干基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒用作表達(dá)載體的情況下，編碼序列可連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復(fù)合物，例如，晚期啟動子和三聯(lián)先導(dǎo)序列。然后可通過體外或體內(nèi)重組將該嵌合體插入腺病毒基因組中。插入到病毒基因組的非必需區(qū)(例如El或E3區(qū))會產(chǎn)生可存活并能在感染宿主中表達(dá)肽的重組病毒(例如，見 Logan 和 Shenk，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81 :3655_3659)?；蛘?，可以使用痘苗 7. 5K 啟動子(見例如，Mackett 等，1982，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 :7415_7419 ； Mackett 等，1984，J. Virol. 49 :857_864 ；Panicali 等，1982，Proc. Natl. Acad. Sci. 79 4927-4931)。 產(chǎn)生本發(fā)明多肽的其它表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，的編碼修飾ApoAl多肽的本文所述DNA序列對于提供關(guān)于迄今未知的哺乳動物蛋白質(zhì)的氨基酸序列是非常有價值的。換言之，本發(fā)明提供的DNA序列可用于產(chǎn)生新的和有用的病毒和環(huán)狀質(zhì)粒DNA載體、新的和有用的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的原核和真核宿主細(xì)胞(包括培養(yǎng)的細(xì)菌和酵母細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞)以及培養(yǎng)生長能表達(dá)修飾的氧化劑耐受性ApoAl 多肽及其相關(guān)產(chǎn)物的宿主細(xì)胞的新的和有用的方法?；蛘?，可以不使用載體來促進(jìn)在宿主中相對穩(wěn)定地存在。例如，同源重組可促進(jìn)與宿主基因組的整合?？梢詫⒑怂嶂糜谒帉W(xué)可接受的運載體中來促進(jìn)細(xì)胞攝取，例如脂質(zhì)溶液運載體(例如荷電脂質(zhì))、脂質(zhì)體或多肽運載體(例如多賴氨酸)。一篇關(guān)于基因治療的綜述是Verma，Scientific American，1990年11月，68-84頁，通過引用納入本文)?？梢允紫葘⑺韬怂嶂糜诩?xì)胞中，并將所述細(xì)胞給予患者(例如移植組織)，或可以直接將所需核酸給予患者以供體內(nèi)攝取。可以利用影響所述細(xì)胞生長或增殖的一個或多個因子培養(yǎng)待轉(zhuǎn)移到接受者的細(xì)胞，例如SCF。本發(fā)明還可利用編碼修飾的氧化劑耐受性ApoAl模擬物偶聯(lián)，例如融合蛋白的核酸分子。這樣的核酸可通過制備引入合適宿主時表達(dá)ApoAl模擬物融合蛋白的構(gòu)建物(例如表達(dá)載體)而獲得。例如，看如下所示制備這樣的構(gòu)建物將編碼能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的修飾的氧化劑耐受性ApoAl模擬蛋白的第一多核苷酸與編碼另一蛋白質(zhì)的第二多核苷酸框內(nèi)融合，從而構(gòu)建體在合適表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)生了融合蛋白。采用分子生物學(xué)技術(shù)不難制備ApoAl模擬融合蛋白。利用本文公開的和本領(lǐng)域已知的治療試劑可設(shè)計和制備任何融合蛋白。融合蛋白技術(shù)不難適用于制備其中的兩部分通過選擇性可切割肽序列連接的融合蛋白。使用重組DNA技術(shù)來達(dá)到這樣的目的如今是本領(lǐng)域技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)做法。這些方法包括例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)重組/ 遺傳重組。此外，DNA和RNA的合成可以利用自動合成器來完成。制備這樣的融合蛋白一般需要制備第一第二兩個DNA編碼區(qū)域，并在框內(nèi)架功能性連接兩個區(qū)域，從而制 備編碼所需融合蛋白的單個編碼區(qū)。一般認(rèn)為，構(gòu)建體哪個部分制備為N末端區(qū)域或C末端區(qū)域并不是特別相關(guān)。本發(fā)明還涉及藥物組合物和/或制劑及這種組合物在治療高脂血癥、高膽固醇血癥、冠心病及動脈粥樣硬化方面的應(yīng)用。本發(fā)明的藥物組合物可以包括作為活性成分的 ApoAl模擬多肽或其片段以及適于給藥和體內(nèi)遞送的藥學(xué)上可接受的賦形劑。所述藥物組合物一般包含有效量的修飾ApoAl多肽或其片段，溶解或分散于藥學(xué)上可接受的運載體或水性介質(zhì)中。也考慮了聯(lián)合療法，同一類型的基本藥物組合物可以用于單劑和復(fù)合藥劑。短語“藥學(xué)或藥理學(xué)上可接受”是指視需要給予動物或人時，不產(chǎn)生有害、過敏或其它不良反應(yīng)的分子實體和組合物。獸醫(yī)學(xué)用途同樣包括在本發(fā)明內(nèi)，且“藥學(xué)上可接受” 制劑包括臨床和獸醫(yī)應(yīng)用的制劑。本文使用的“藥學(xué)上可接受的運載體”包括任一和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌齊U、抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑等。這些介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)方面的應(yīng)用為本領(lǐng)域所熟知。除了任一常規(guī)介質(zhì)或試劑與所述活性成分無法相容外，包括其在治療組合物中的應(yīng)用。就對人給藥來說，制劑應(yīng)該滿足FDA生物制品辦公室要求的無菌、熱原性、一般安全性和純度的標(biāo)準(zhǔn)。補充活性成分也可摻入組合物。運載體的例子包括溶劑和分散介質(zhì)包含諸如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、其混合物以及植物油。在很多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖類或氯化鈉?？梢酝ㄟ^以下方法保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?，例如使用諸如卵磷脂的包衣、在分散的情況下保持所需的顆粒大小和/或使用表面活性劑。本發(fā)明包括通過各種途徑給予所述藥物組合物。包含本發(fā)明ApoAl模擬多肽或其片段的藥物組合物可以通過保證循環(huán)中生物利用度的任何途徑給予。這些途徑可以包括但不限于口服、鼻腔給藥、直腸給藥、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮給藥、吸入給藥以及肌肉內(nèi)注射?？勺⑸渲破钒ㄋ曰蛴托暂d體配制的活性成分的無菌懸浮液、溶液或乳液。所述組合物還可包含配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。注射用制劑可以是單位劑形，例如，存在于安瓿或多劑量容器，可包含添加的防腐劑。或者，可注射制劑可以是粉末形式以便在使用前與載體進(jìn)行重建，載體包括但不限于無菌無熱原水、緩沖液、葡萄糖溶液等。為此目的，可以凍干本發(fā)明的ApoAl模擬多肽， 或可以制備共同凍干的肽-脂質(zhì)復(fù)合物。儲存的制劑可以是單位劑形，在體內(nèi)使用前進(jìn)行重建。就延長遞送來說，可以將活性成分制備為長效制劑，以便通過植入給藥，例如，皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。所以例如，活性成分可以用多聚體或疏水材料(例如，作為可接受油配制的乳液)或離子交換樹脂配制，或配制為微溶衍生物，例如，作為修飾的ApoAl多肽或其片段的微溶性鹽形式。或者，可以使用制成吸附盤或粘貼片形式的透皮給藥系統(tǒng)，其對經(jīng)皮吸收的活性成分具有緩釋作用。為此目的，可以使用滲透促進(jìn)劑來促進(jìn)活性成分的透皮滲透。將本發(fā)明的修飾的ApoAl多肽或其片段或肽-脂質(zhì)復(fù)合物摻入用于缺血性心臟病和高膽固醇血癥患者的硝酸甘油貼片內(nèi)，可以達(dá)到極佳效果。

就口服來說，可以利用藥學(xué)上可接受的賦形劑將所述藥物組合物通過常規(guī)方法制備為諸如片劑或膠囊的形式，所述賦形劑是例如，結(jié)合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)、填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)、潤滑劑 (例如，硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)、崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或羧甲基淀粉鈉)或潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉)?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域所熟知的方法為片劑包衣?？诜o予的液體制劑可以制備為諸如溶液、糖漿或懸液等形式，或可以是干燥產(chǎn)物形式以便在使用前用水或其它合適的載體構(gòu)建。這樣的液態(tài)制劑可利用藥學(xué)上可接受的添加劑，通過常規(guī)方法制備，所述添加劑是例如，懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用油脂)、乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性載體(例如，杏仁油、油質(zhì)酯類、乙醇或分餾植物油) 以及防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制品還可視需要包含緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑或甜味劑?？催m當(dāng)配制口服給予的制品以控釋活性化合物。就口腔含化給藥來說，所述組合物可以通過常規(guī)方式制備為片劑或錠劑形式。就直腸和陰道給藥途徑來說，活性成分可以制備為溶液(用于貯留灌腸劑)、栓劑或軟膏。就吸入給藥來說，可以利用推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它氣體，從加壓包或噴霧器方便地遞送氣溶膠噴霧形式的活性成分。就加壓氣溶膠來說，劑量單位可以通過提供計量閥門來確定，從而遞送計量用量。用于吸入器或吹入器的例如明膠的膠囊和藥筒可以配制為包含化合物和合適粉基，例如乳糖或淀粉的粉末混合物。如果需要，所述組合物可以存在于包裝或分配器裝置中，所述裝置可包含一個或多個含活性成分的單位劑形。例如，所述包裝可以包含金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。所述包裝或分配器裝置可以附帶給藥說明?！皢挝粍┝俊敝苿┦侵赴m應(yīng)具體定時給藥的給藥成分的劑量或亞劑量的那些制劑。例如，例示性“單位劑量”制劑是指包含日劑量或單位、日亞劑量、或周劑量或周單位、或周亞劑量等的那些制劑。在常規(guī)的儲存和使用條件下，所有這些制劑均應(yīng)包含防腐劑以防止微生物的生長。可通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如，對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等阻止微生物的作用?？赏ㄟ^使用延緩吸收的試劑組合物，例如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。 在進(jìn)行配制之前或當(dāng)時，修飾的ApoAl多肽或其片段應(yīng)經(jīng)廣泛透析以除去不需要的小分子量分子，和/或經(jīng)凍干以在適當(dāng)?shù)那闆r下更易配制到所需載體內(nèi)。將適當(dāng)溶劑中的所需量的活性劑與以上列舉的各種其它成分(視需要)相摻混，再經(jīng)過濾除來制備無菌可注射溶液。一般來說，通過將各種滅菌的活性成分摻入包含基本分散介質(zhì)和以上列舉的所需其它成分的無菌載體制備分散液。就制備無菌可注射溶液的無菌粉末來說，優(yōu)選的制備方法是真空干燥技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)，從而產(chǎn)生活性成分的粉末，外加來自其之前無菌過濾溶液的任何附加所需成分。可利用藥物的“緩釋”膠囊或“持續(xù)釋放”組合物或制劑，它們通常是適用的。緩釋制劑一般設(shè)計為能在一段延長的時間內(nèi)提供恒定藥物水平，可以用于遞送本發(fā)明的ApoAl 模擬多肽或其片段。在某些實施方案中，脂質(zhì)體和/或納米顆粒還可與ApoAl模擬多肽或其片段一起使用。脂質(zhì)體的制備和使用一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并總結(jié)如下。脂質(zhì)體由磷脂形成，磷脂分散于水性介質(zhì)中，并自發(fā)形成多層的同心雙層囊泡(也被稱為多層囊泡(MLV))。 MLV的直徑一般為25nm-4 μ m。對MLV進(jìn)行超聲處理會形成小的單層囊泡(SUV)，其直徑為 200-500人，其中心處含水性溶液。還可通過與磷脂脂質(zhì)體的自發(fā)反應(yīng)或膽酸鹽透析步驟將 ApoAl模擬多肽或其片段制備成直徑為8-20mn的磷脂盤。納米膠囊一般可以穩(wěn)定而可重復(fù)地夾帶化合物。為了避免胞內(nèi)多聚體超負(fù)荷引起的副作用，這些超微粒(約0. Ιμπι大小)的設(shè)計應(yīng)采用體內(nèi)可降解的聚合物。本發(fā)明考慮使用滿足這些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯納米顆粒，這些顆粒不能制備。另外的藥理學(xué)活性劑可以隨諸如本發(fā)明多肽等主要活性劑一起遞送。治療可以包括但不限于所涉及藥物的同時或順次給藥。在一個實施方案中，這些試劑包括但不限于降低動脈粥樣硬化和/或其并發(fā)癥風(fēng)險的試劑。這些試劑包括但不限于β阻滯劑、β阻滯劑與噻嗪類利尿劑聯(lián)合用藥、抑制素、阿司匹林、ACE抑制劑、ACE受體抑制劑(ARB)等。β阻滯劑的例子包括但不限于心選擇性β阻滯劑(選擇性β 1阻滯劑)，例如， 醋丁洛爾(Sectral)、阿替洛爾(Tenormin)、倍他洛爾(Kerlone)、比索洛爾(Zebeta)、美托洛爾(Lopressor)等。非選擇性阻滯劑(對β 1和β 2同等阻斷)的例子包括但不限于卡替洛爾(Cartrol)、納多洛爾(Corgard)、噴布洛爾(Levatol)、吲哚洛爾(Visken)、普萘洛爾(Inderal)、噻嗎洛爾(Blockadren)、拉貝洛爾(Normodyne，Trandate)等。β阻滯劑與噻嗪類利尿劑組合的例子包括但不限于美托洛爾HCT、ZIAC、阿替洛爾、納多洛爾和芐氟噻嗪片劑(Corzide)、提莫萊德(Timolide)、普萘洛爾LA 40/25、鹽酸萘心安一氫氯噻嗪制劑(Inderide)、諾莫載德(Normozide)等。抑制素的例子包括但不限于普伐他丁(普拉瓦科公司(Pravachol)/布里斯托-美時施貴寶(Bristol-Myers Squibb))、辛伐他汀(佐科公司(Zocor)/默克公司 (Merck))、洛伐他汀(默瓦克公司(Mevacor)/默克公司)、立普妥(輝瑞制藥(Pfizer))寸。ACE抑制劑的例子包括但不限于卡托普利(例如施貴寶公司的開博通 (Capoten))、貝那普利(例如諾華公司的洛汀新(Lotensin))、恩納普利(例如默克公司的瓦索泰克(Vasotec))、福辛普利(例如布里斯托-美時的蒙諾(Monopri 1))、賴諾普利(例如默克公司的普寧維(Prinivil)或A&Z公司(Astra-Zeneca)的捷賜瑞(Zestril))、喹那普利(例如P&D公司(Parke-Davis)的阿奎普利(Accupril))、雷米普利(例如H-M-R皇家 MM7A^ (Hoechst MarionRoussel,King Pharmaceuticals)(Altace))>IDKii^ 禾U、培哚普利(例如R-P-R公司(Rhone-Polenc Rorer)的阿瑟昂(Aceon))、群多普利(例如科諾制藥公司(Knoll Pharmaceutical)的瑪維克(Mavik))等。合適的ARB (ACE受體阻滯劑)包括但不限于氯沙坦(例如默克公司的科素亞(Cozaar))、依貝沙坦(例如賽諾菲公司(Sanofi)的阿瓦普羅(Avapro))、坎地沙坦(例如阿斯塔默克公司(Astra Merck)的阿特坎得(Atacand))、纈沙坦(例如諾華公司的代文(Diovan))等。本發(fā)明的另一個方面涉及治療心血管疾病的方法。此處使用的“心血管疾病”是指涉及心臟或血管(動脈和靜脈)的疾病?！靶难芗膊　边€指影響心血管系統(tǒng)的任何疾病， 可用來指與動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病(動脈疾病)。心血管疾病可以包括但不限于動脈瘤、 心絞痛、心律失常、動脈粥樣硬化、心肌病、腦血管病、先天性心臟病、充血性心力衰竭、心肌炎、瓣膜病、冠心病、擴張性心肌病、舒張功能障礙、心內(nèi)膜炎、高血壓、肥厚型心肌病、二尖瓣脫垂、心臟病發(fā)作、血管狹窄和靜脈血栓栓塞。此處使用的“動脈硬化”是指大動脈發(fā)生的任何硬化(及彈性喪失)(在希臘語中， “Arterio”意為動脈，“sclerosis”意為硬化)，小動脈硬化則是主要影響小動脈的動脈粥樣硬化。此處使用的“動脈粥樣硬化”是指特定由粥樣斑塊引起的動脈硬化。所以，動脈粥樣 硬化是動脈硬化的一種形式。動脈粥樣硬化是動脈壁中發(fā)生的一種慢性炎癥反應(yīng)，主要是由脂蛋白(攜帶膽固醇和甘油三酯的血漿蛋白)沉積引起。其通常稱為動脈的“硬化”或 “積垢”。由動脈內(nèi)多個斑塊的形成所引起。此處所述的方法包括給予對象治療有效或生物有效量的藥物組合物，其包含能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl模擬物或其片段。所述ApoAl模擬物或其片段的氨基酸序列可如上所述進(jìn)行修飾，將至少一個色氨酸取代為氧化劑耐受性氨基酸?！吧镉行Я俊被颉爸委熡行Я俊睂γ總€前述的治療方法來說指產(chǎn)生抗炎癥效果、促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出或減輕心血管疾病癥狀的至少一種修飾ApoAl多肽或其片段的有效用量。此處使用的“給藥”指提供或遞送包含至少一種ApoAl模擬多肽或其片段的組合物，提供的用量和時間長度組以產(chǎn)生抗炎癥效果、促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出或減輕心血管疾病癥狀。一般優(yōu)選蛋白質(zhì)療法的被動給藥方式，部分是因為其方便且可重復(fù)。由于本發(fā)明的多肽具有氧化耐受特性，此處所述的ApoAl模擬多肽和其片段還可用于促進(jìn)從細(xì)胞到肝臟的膽固醇流出的方法。所述方法包括給予細(xì)胞生物學(xué)有效量的純化多肽的步驟，所述多肽的氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO :1—部分，其中X選自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一個X是苯丙氨酸。本發(fā)明還涉及減輕對象炎癥狀態(tài)一種或多種癥狀的方法。術(shù)語“減輕”用于“減輕炎癥狀態(tài)一種或多種癥狀”時指減少、阻礙或消除炎癥狀態(tài)和/或相關(guān)病理狀態(tài)特征性的一個或多個癥狀。這樣的減少包括但不限于減少炎癥蛋白的生物合成、減少血漿膽固醇等。 所述方法包括給予對象包含ApoAl模擬物或其片段的藥物組合物的步驟。對慢性和急性炎癥反應(yīng)的治療均涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。 本發(fā)明還有另一方面涉及促進(jìn)傷口愈合和/或治療或減輕內(nèi)皮損傷的方法，例如在血管損傷(例如球囊血管成形術(shù))之后會發(fā)生的動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。所述方法可以包括給予對象包含ApoAl模擬物或其片段的藥物組合物的步驟。所述ApoAl模擬物或其片段的給藥量足以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和治療內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本發(fā)明的治療方法和應(yīng)用還可擴展到提供編碼至少一種包含ApoAl模擬多肽或其片段的治療劑的核酸，采用的方式可以有效引起其在靶癥狀、靶狀態(tài)或靶疾病附近表達(dá)。 任何基因治療技術(shù)均可以采用，例如，裸DNA遞送、重組基因和載體、基于細(xì)胞的遞送，包括離體操作患者細(xì)胞等。應(yīng)該理解，即使處于ApoAl多肽或其片段的劑量或聯(lián)合療法傾向于所需治療范圍低端的情況下，該治療方法在特定疾病或患者的背景下仍然可能產(chǎn)生與其它所有已知治療方法同等有效的作用，甚至更加有效。對于臨床醫(yī)生來說不幸的是，某些疾病和病癥無法在中長期內(nèi)有效治療，但這并不會否定本治療方法的實用性，特別是該治療方法與其它一般建議的方案至少同等有效。本發(fā)明治療方法的目的主要在于產(chǎn)生顯著的抗炎作用或膽固醇流出促進(jìn)作用，同時將劑量仍然保持在與不可接受的毒性相關(guān)的水平之下。除改變本身劑量之外，還可改進(jìn)給藥方法以優(yōu)化治療策略。本發(fā)明的活性劑還可用于很多情況。例如，據(jù)發(fā)現(xiàn)，心血管疾病(例如，動脈粥樣硬化、中風(fēng)等)經(jīng)常伴隨或跟隨急性期炎性反應(yīng)的發(fā)作，例如，與復(fù)發(fā)性炎性疾病相關(guān)的反應(yīng)、病毒感染(例如流感)、細(xì)菌感染、真菌感染、器官移植、受傷或其它外傷等。所以，在某些實施方案中，本發(fā)明包括將本文所述的一種或多種活性劑給予具有患急性炎性反應(yīng)風(fēng)險或已有急性炎性反應(yīng)和/或具有患動脈粥樣硬化和/或相關(guān)病理狀態(tài) (例如中風(fēng))癥狀風(fēng)險或已有動脈粥樣硬化和/或相關(guān)病理狀態(tài)癥狀的對象。所以，例如，可以在流感季節(jié)保護(hù)性地給予患冠心病或有患病風(fēng)險的人本發(fā)明的一種或多種藥物組合物?？捎帽疚乃龅囊环N或多種活性劑治療發(fā)生復(fù)發(fā)炎性病癥(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多種自身免疫性疾病等)的人(或動物)對象，以緩和或防止動脈粥樣硬化或中風(fēng)的發(fā)生?？捎帽景l(fā)明多肽治療受外傷(例如，急性損傷、組織移植等)的人 (或動物)對象，以緩解動脈粥樣硬化或中風(fēng)的發(fā)生。在另一個特定實施例中，可在心肌梗死后通過靜脈內(nèi)注射治療對象，減小斑塊大小并穩(wěn)定斑塊以防破裂和糜爛。納入下列實施例以演示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，下列實施例中公開的技術(shù)代表發(fā)明者開發(fā)的在本發(fā)明實施過程中發(fā)揮作用的技術(shù)，所以可以認(rèn)為其構(gòu)成實施發(fā)明的優(yōu)選方式。但是根據(jù)本說明書內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，可以對公開的特定實施方案作很多改動，且仍然可以獲得同樣或相似的結(jié)果而并不背離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。
實施例在下列實施例中，我們設(shè)法確定修飾ApoAl中的MPO敏感殘基，賴氨酸、甲硫氨酸和色氨酸所產(chǎn)生的效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)將四個ApoAl色氨酸殘基替換為亮氨酸后會導(dǎo)致功能喪失， 而將色氨酸替換為苯丙氨酸則不僅保留ApoAl的功能，還可以使其耐受獲得MPO的氧化失活作用。方法質(zhì)譜法通過前述的免疫親和層析法分離人粥樣斑衍生的ApoAl。在甘氨酸緩沖液 (pH2. 5)中洗脫ApoAl，然后直接進(jìn)行胰蛋白酶酶解，或先經(jīng)SDS-PAGE分離，再進(jìn)行胰蛋白酶膠內(nèi)酶解。如前所述，進(jìn)行質(zhì)譜測定，并獲得碰撞誘導(dǎo)解離(CID)光譜。如前所述，在酸水解后，利用重同位素內(nèi)標(biāo)，采用由免疫親和層析分離的人粥樣斑或健康志愿者血漿的ApoAl 的雙重測定分析氯酪氨酸和2-氨基己二酸。定點誘變和重組ApoAl生產(chǎn)利用斯特拉塔基因公司的快變誘變試劑盒(QuickChange MutagenesisKit, Stratagene)對色氨酸(8、50、72、108)和甲硫氨酸(86、112、148)殘基進(jìn)行點突變，通過 DNA測序確認(rèn)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE-3) pLysS InJ菌株，如前所述進(jìn)行ApoAl的表達(dá)和純化。以PBS或MPO反應(yīng)緩沖液(60mmol/L磷酸鈉，IOOmmol/L氯化鈉，100 μ mol/ L 二乙烯三胺五乙酸，ρΗ7. 0)對rh-ApoAl進(jìn)行廣泛透析，以 除去微量的咪唑，經(jīng)SDS-PAGE 分析，發(fā)現(xiàn)純度> 95%。由于色氨酸和甲硫氨酸取代改變了蛋白質(zhì)的OD28tl值和對BCA或 Lowry蛋白質(zhì)檢測的反應(yīng)性，所以如前所述，基于游離胺基，采用鄰苯二甲醛(OPA)試驗、以人血漿衍生的ΑροΑ1(生物設(shè)計公司(Biodesign))標(biāo)準(zhǔn)品確定蛋白質(zhì)濃度。通過甲酸處理切割rh-ApoAl的起始甲硫氨酸和His-tag，然后通過快速蛋白液相層析(FPLC)純化。ApoAl賴氨酸修飾用PBS透析人血漿衍生的ApoAl并稀釋到0. 5mg/mL。如前所述進(jìn)行賴氨酸的還原性甲基化。賴氨酸修飾的程度由OPA檢測確定。然后用MPO反應(yīng)緩沖液透析ApoAl，賴氨酸被修飾的ApoAl的蛋白濃度利用BCA試劑確定。ApoA 1MP0和次氯酸修飾如前所述制備終濃度為57nmol/L的ΜΡ0，將其加入經(jīng)MPO反應(yīng)緩沖液廣泛透析的 ΙΟΟμ g/mL(3. 5ymol/L)的ApoAl中。通過在37°C下每隔15分鐘加入與ApoAl不同摩爾比的4等分過氧化氫來啟動反應(yīng)，溫育持續(xù)90分鐘后，加入2mmol/L的L-甲硫氨酸終止反應(yīng)。 就ApoAl的化學(xué)修飾來說，在37°C下，每隔15分鐘將不同濃度的4等分次氯酸鈉(NaOCl) 加入溶于MPO緩沖液的100 μ g/mL ApoAl中。經(jīng)過60分鐘的總溫育時間后，加入2mmol/L 的L-甲硫氨酸終止反應(yīng)。ABCAl-依賴性膽固醇流出檢測如前所述，用[3H]膽固醇標(biāo)記RAW264. 7小鼠巨噬細(xì)胞，并用0. 3mmol/L的 8Br-cAMP處理以誘導(dǎo)ABCAl活性。洗滌細(xì)胞，有0. 3mmol/L 8Br-cAMP存在和有或沒有各種ApoAl制備物存在的條件下，對其在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行4小時的追蹤。短暫離心沉淀碎片后測定追蹤介質(zhì)中的放射性。在計數(shù)前蒸發(fā)閃爍計數(shù)瓶內(nèi)的溶劑，利用己烷異丙醇 (3 2)進(jìn)行萃取來確定細(xì)胞的放射性。膽固醇流出百分比以100X(介質(zhì)dpm)/(介質(zhì)dpm+ 細(xì)胞dpm)計算。脂質(zhì)結(jié)合活性檢測
如前所述，通過抑制磷脂酶C(PLC)介導(dǎo)的人低密度脂蛋白聚集來測定ApoAl的脂質(zhì)結(jié)合活性。我們早已證明，這種檢測方法得到的結(jié)果與DMPC分散清除檢測觀察到的相似，但是靈敏度更高且所需ApoAl更少。該檢測中使用的ApoAl的終濃度是12. 5 μ g/mL，足以將起始的LDL聚集率降低約75%。ApoAl交聯(lián)檢測在SDS樣品緩沖液中對每條泳道上的250ngApoAl進(jìn)行變性處理，再將其置于10% 的氨基丁三醇_甘氨酸凝膠上在SDS存在下進(jìn)行電泳，然后將所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。依次用山羊抗人ApoAl第一抗體(1 1000稀釋，DiaSorin)和兔抗山羊 HRP偶聯(lián)抗體(1 1000稀釋)探測所述膜，利用增強的化學(xué)發(fā)光底物對ApoAl進(jìn)行顯像。結(jié)果人粥樣斑中的AdoAI修飾我們測定了分離自人動脈粥樣硬化細(xì)胞的ApoAl是否包含修飾的色氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸殘基。通過串聯(lián)質(zhì)譜法，我們在所有四個色氨酸位點，第8、50、72、108位均能檢測到單羥基色氨酸殘基，在ApoAl內(nèi)的第108位檢測到雙羥基色氨酸(圖1A-F)。我們之前曾在體外MPO修飾的ApoAl中的W72殘基處檢測到單-和雙-羥基色氨酸(Peng，D. Q.， Wu, Ζ. , Brubaker, G. , Zheng, L. , Settle, Μ. , Gross, Ε. , Kinter, Μ. , Hazen, S. L.禾口 Smith, J.D. (2005) J Biol Chem 280，33775-33784)。此外，我們還在第48個和第112個殘基處檢測到甲硫氨酸亞砜(圖1D、E)。為了尋找MPO產(chǎn)生的HOCl進(jìn)行的賴氨酸修飾，我們聯(lián)用穩(wěn)定同位素稀釋HPLC和在線串聯(lián)質(zhì)譜分析來定量測定2-氨基己二酸，其是MPO產(chǎn)生的氧化劑氧化賴氨酸的終產(chǎn)物。分離自六個健康志愿者血漿的ApoAl中的2-氨基己二酸水平較低但是還可以檢測到，而分離自六個人動脈粥樣硬化樣本的ApoAl中的平均水平則突出地上升約16倍(圖2，雙尾t檢驗ρ = 0. 005)。所以，在生理學(xué)上，ApoAl的色氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸氧化發(fā)生在人粥樣斑中。所以我們設(shè)法確定這些修飾中的哪一個負(fù)責(zé)產(chǎn)生接受細(xì)胞膽固醇能力降低的功能異常性ApoAl修飾。ApoAl的賴氨酸修飾在ApoAl的兩親性結(jié)構(gòu)中，21個賴氨酸殘基大多位于疏水面兩側(cè)和附近。MPO引起的賴氨酸修飾是負(fù)責(zé)MPO誘導(dǎo)的ApoAl功能喪失的一個有吸引力的候選因素，如我們之前證明的那樣，MPO修飾ApoAl的賴氨酸殘基，ApoAl賴氨酸殘基廣泛的化學(xué)修飾改變其正電荷，導(dǎo)致ApoAl膽固醇受體活性的喪失。但是我們還發(fā)現(xiàn)，還原性甲基化引起的賴氨酸修飾可以保持賴氨酸的正電荷，僅造成ApoAl功能適度降低。ApoAl經(jīng)還原性甲基化作用， 從而引起92%的賴氨酸修飾，或經(jīng)控制溫育并以MPO反應(yīng)緩沖液進(jìn)行廣泛透析。利用催化劑量的MPO和摩爾比升高的H2O2 ApoAl進(jìn)行修飾反應(yīng)。利用經(jīng)cAMP類似物預(yù)處理以誘導(dǎo)ABCAl的膽固醇標(biāo)記的RAW264巨噬細(xì)胞檢測對反應(yīng)產(chǎn)物的膽固醇受體活性。修飾反應(yīng)中沒有H2O2時，甲基化和非甲基化對照ApoAl具有強而等同的ABCAl依賴性膽固醇受體活性。隨著H2O2的劑量不斷增加，甲基化和對照ApoAl樣品的膽固醇受體活性以相似模式下降(圖3)。此外，通過⑶對這些制備物的α螺旋含量進(jìn)行估計，甲基化和對照ApoAl制品類似地對α螺旋含量的ΜΡ0/Η202劑量依賴性降低敏感。雖然賴氨酸伯胺基經(jīng)還原性甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槭灏坊髸档推浠瘜W(xué)反應(yīng)活性，但是不會對ApoAl功能產(chǎn)生保護(hù)作用，所以MPO 引起的ApoAl賴氨酸修飾不大可能導(dǎo)致ApoAl功能喪失。
mmmmm^ MPO i秀導(dǎo)的ApoAI功能喪失不呆護(hù)作用然后我們將注意力轉(zhuǎn)向之前涉及MPO誘導(dǎo)的ApoAl功能喪失的三個ApoAl甲硫氨酸殘基。為了將所有三個甲硫氨酸取代為纈氨酸，我們使用在N末端添加有另外的甲硫氨酸起始密碼子和6His-tag的重組人ApoAl (rh-ApoAl)。我們之前曾證明，rh-ApoAl與血漿衍生的ApoAl在膽固醇受體活性、脂質(zhì)結(jié)合活性以及對MPO介導(dǎo)功能喪失的易感性方面具有相似特性。我們采用定點誘變產(chǎn)生了 ApoAl表達(dá)構(gòu)建物，其編碼三個內(nèi)部甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸的蛋白質(zhì)，我們將其稱為rh-ApoAl 3MV(3個甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸)。起始甲硫氨酸不能取代。但是如前所述(Ryan, R. 0.，F(xiàn)orte, Τ. Μ.和Oda，M.N. (2003) Protein Expr. Purif. 27，98-10 ，由于第2位的谷氨酸取代為天冬氨酸后在His-tag附近產(chǎn)生獨特的甲酸敏感性天冬氨酸-脯氨酸二肽，可以通過甲酸溫育化學(xué)切割該甲硫氨酸和His-tag。 我們已確定，無論起始甲硫氨酸和His-tag保持完整或被除去，與野生型rh-ApoAl相比， rh-ApoAl 3MV具有相似的ABCAl依賴性膽固醇受體活性。此外，無論是否具有N末端甲硫氨酸，rh-ApoAl 3MV和野生型rh-ApoAl對高劑量( ApoAl = 15 1)MP0介導(dǎo)的膽固醇受體活性喪失具有等同的易感性(圖4A)。rh-ApoAl和3MV變體的MPO修飾在不同和適度的H2A ApoAl摩爾比下進(jìn)行，低摩爾比下，3MV變體對膽固醇受體活性喪失更為敏感 (圖4B)。例如，H2O2 ApoAl摩爾比為1. 4時，野生型ApoAl膽固醇受體活性的喪失可以忽略不計，而3MV變體則喪失掉大約一半的膽固醇受體活性。所以我們發(fā)現(xiàn)，ApoAl中的三個甲硫氨酸實際上通過無害地吸收氧化劑而發(fā)揮保護(hù)作用，而并沒有在ApoAl功能的氧化損傷中起作用。ApoAl的餼氨酸殘基在ApoAl功能中發(fā)揮作用接著我們通過將四個色氨酸殘基各自改為亮氨酸(rh-ApoAl 4WL)或苯丙氨酸 (rh-ApoAl 4WF)來檢測ApoAl色氨酸殘基的作用。由于在針對寬范圍ApoAl劑量進(jìn)行的膽固醇流出研究中4WL變體喪失了大部分的膽固醇受體活性，而4WF變體則保持了該活性 (圖5A)，色氨酸殘基的芳香性似乎對ApoAl的膽固醇受體活性是關(guān)鍵的。我們采用K2d算法，通過CD檢測了這些蛋白質(zhì)的預(yù)計α螺旋含量，發(fā)現(xiàn)野生型蛋白質(zhì)含有57%的α螺旋， 而4WL和4WF變體的α螺旋含量則分別上升為79%和77%。所以4WL變體流出和脂質(zhì)結(jié)合活性的喪失不能歸因于螺旋含量的損失。rh-ApoAl和4WF變體在H2A劑量不斷增加時均易受MP0/C1_/H2A氧化系統(tǒng)的影響。圖5B顯示代表4個不同實驗的研究結(jié)果，每個實驗使用各蛋白質(zhì)的兩種獨立制備物。 如之前所觀察到的，野生型ApoAl的ABCAl依賴性膽固醇受體活性被不斷增加的MPO誘導(dǎo)氧化作用所抑制；但是4WF變體甚至在H2A ApoAl比為15時仍然保持了該活性。MP0/C17H202氧化系統(tǒng)可以生成HOCl (漂白活性劑)，我們和其他人在之前已證明，HOCl處理ApoAl會導(dǎo)致膽固醇受體和脂質(zhì)結(jié)合活性喪失。所以我們將野生型ApoAl和 4WF變體置于劑量不斷增加的HOCl之下。與關(guān)于MPO修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)相似，4WF變體的膽固醇受體活性耐受該處理，而野生型rh-ApoAl的流出活性則受到劑量不斷增加的HOCl的損傷(圖6)。通過DMPC乳化液清除法檢測rh-ApoAl和4WF變體的脂質(zhì)結(jié)合活性，兩種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出等同的活性(圖7A)。與rh-ApoAl (圖4B)相比，采用PLC介導(dǎo)的LDL凝聚試驗(圖 7B)，rh-ApoAl 4WF的無細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合活性也耐受MPO介導(dǎo)的抑制作用。
ApoAl的MPO修飾導(dǎo)致廣泛交聯(lián)，從而產(chǎn)生二聚體、多聚體以及可能的分子內(nèi)交聯(lián)。我們之前已證明，在所有7個色氨酸均轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼岬淖凅w內(nèi)，MPO介導(dǎo)的ApoAl交聯(lián)模式并未改變。當(dāng)在H2O2劑量不斷增加時，將rh-ApoAl和4WF變體置于MP0/C1_/H202氧化作用(使用與圖5B中流出實驗相同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)下時，我們發(fā)現(xiàn)變性凝膠中兩種蛋白質(zhì)遷移的改變與分子間交聯(lián)一致。但是遷移模式不同，4WF變體在70kD處有一條清晰的主要條帶，而野生型蛋白質(zhì)則在55到65kD之間產(chǎn)生了一個清晰度較低的主要條帶區(qū)域(圖 8)。兩種蛋白質(zhì)單體的遷移均發(fā)生了改變，可能表明分子內(nèi)交聯(lián)或氨基酸修飾。雖然4WF 變體耐受MPO介導(dǎo)的膽固醇受體活性喪失，但是該變體對MPO誘導(dǎo)的交聯(lián)作用卻更為敏感， 特別是在低劑量的H2O2下。我們還通過⑶分析了這些修飾蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)均對α螺旋含量損失易感，而4WF變體的易感起始值更高些。我們還利用POCP和野生型或4WF ApoAl通過膽酸鹽透析制備了 rHDL。通過約 9. 8、12和17nm處非變性凝膠，估計二者產(chǎn)生相似模式的rHDL圓盤，且沒有任何剩余的無脂質(zhì)ApoAl (圖9)。我們對野生型和4WF rHDL進(jìn)行了測試，二者對于介導(dǎo)RAW264. 7細(xì)胞的非 ABCAl依賴性膽固醇流出的等同能力(圖10)，而不具有ABCAl依賴性受體活性，如完全脂質(zhì)化ApoAl所預(yù)期。我們合成了之前所述的螺旋兩親性肽pl8，其在第2位含有色氨酸殘基。我們還合成了將色氨酸替換為苯丙氨酸(P18WF)或亮氨酸(P18LF)的類似物。我們證明該無色氨酸肽具有劑量依賴性ABCAl介導(dǎo)的膽固醇受體活性(圖11)。根據(jù)以上對本發(fā)明的描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識到改進(jìn)、改動和修改。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的改進(jìn)、改動和修改確應(yīng)為隨附的權(quán)利要求書所涵蓋。本發(fā)明引用的所有參考文獻(xiàn)、出版物和專利通過引用全文納入本文。
權(quán)利要求
1.一種純化多肽，其包含能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl模擬物，所述ApoAl模擬物具有的氨基酸序列包含含有至少一個色氨酸的ApoAl或ApoAl的模擬物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少一個來自所述ApoAl或ApoAl的模擬物的色氨酸被氧化耐受性氨基酸所取代。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述ApoAl模擬物耐受以下氧化作用的至少一種MP0引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的氧化劑、MPO產(chǎn)生的活性氯化物引起的氧化作用、與 MP0/H202/C1_系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、H0C1/0C1_引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的活性氮引起的氧化作用、與mpo/H2O2/NO2-系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、過氧亞硝酸根 (0N00-)引起的氧化作用、亞硝基過氧碳酸根(ONOOCO2-)引起的氧化作用或0N00—在有CO2 或緩沖液中有HC03_存在下起作用時生成產(chǎn)物引起的氧化作用。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述氧化劑耐受性氨基酸是苯丙氨酸。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQID NO :1的至少一部分， 其中X選自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一個X是苯丙氨酸。
5.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述ApoAl模擬物基本由約天然ApoAl的5 到50個氨基酸組成，其包含至少一個色氨酸，且所述至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
6.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述ApoAl模擬物包含的氨基酸序列選自 SEQ ID NO :2-69組成的組，其中X是色氨酸或氧化劑耐受性氨基酸，且至少一個X用于取代氧化劑耐受性殘基。
7.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一個“D”氨基酸殘基。
8.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所有或大多數(shù)對映體氨基酸是“D”氨基酸。
9.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽還包含保護(hù)基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽還包含多組氨酸標(biāo)簽。
11.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽在給予對象時耐受對髓過氧化酶 (MPO)失活作用引起的氧化失活作用。
12.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是融合蛋白。
13.—種純化載脂蛋白多肽，其包含天然載脂蛋白的氨基酸序列，所述氨基酸序列通過將天然氨基酸序列的一個或多個色氨酸殘基取代為氧化劑耐受性氨基酸而得到修飾。
14.一種包含如權(quán)利要求1所述多肽和藥學(xué)可接受的賦形劑的藥物組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物配制成通過以下途徑給予對象口服、鼻部給藥、直腸給藥、腹膜內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮給藥、吸入給藥和肌肉內(nèi)注射。
16.一種治療心血管疾病的方法，包括以下步驟給予對象能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl模擬物，所述ApoAl模擬物具有的氨基酸序列包含含有至少一個色氨酸的ApoAl或ApoAl的模擬物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少一個來自ApoAl或ApoAl的模擬物的色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物耐受以下氧化作用的至少一種MP0引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的氧化劑、MPO產(chǎn)生的活性氯化物引起的氧化作用、與MP0/H2A/Cr系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、H0C1/0C1_引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的活性氮引起的氧化作用、與mpo/H2O2/NO2-系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、過氧亞硝酸根 (0N00-)引起的氧化作用、亞硝基過氧碳酸根(ONOOCO2-)引起的氧化作用或0N00—在有CO2 或緩沖液中有HC03_存在下起作用時生成產(chǎn)物引起的氧化作用。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述氧化劑耐受性氨基酸是苯丙氨酸。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，包含SEQID NO 1的至少一部分，其中X 選自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一個X是苯丙氨酸。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物基本由天然ApoAl的約5到50個氨基酸組成，其包含至少一個色氨酸，且所述至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO 2-69組成的組，其中X是色氨酸或氧化劑耐受性氨基酸，且至少一個X用于取代氧化劑耐受性殘基。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述多肽在給予對象時耐受髓過氧化酶 (MPO)失活作用引起的氧化失活作用。
23.一種促進(jìn)膽固醇流出細(xì)胞的方法，包括以下步驟給予所述細(xì)胞生物學(xué)有效劑量的能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl模擬物，所述 ApoAl模擬物具有的氨基酸序列包含含有至少一個色氨酸的ApoAl或ApoAl的模擬物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少一個來自ApoAl或ApoAl的模擬物的色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述多肽不實質(zhì)性抑制載脂蛋白脂質(zhì)結(jié)合和膽固醇流出。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物耐受以下氧化作用的至少一種MP0引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的氧化劑、MPO產(chǎn)生的活性氯化物引起的氧化作用、 與MP0/H2A/Cr系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、H0C1/0C1_引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的活性氮引起的氧化作用、與mpo/H2O2/NO2-系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、過氧亞硝酸根 (0N00-)引起的氧化作用、亞硝基過氧碳酸根(ONOOCO2-)引起的氧化作用或0N00—在有CO2 或緩沖液中有HC03_存在下起作用時生成產(chǎn)物引起的氧化作用。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述氧化劑耐受性氨基酸是苯丙氨酸。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，包含SEQID NO 1的至少一部分，其中X 選自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一個X是苯丙氨酸。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物基本由天然ApoAl的約5到50個氨基酸組成，其包含至少一個色氨酸，且所述至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO :2-69組成的組，其中X是色氨酸或氧化劑耐受性氨基酸，且至少一個X用于取代氧化劑耐受性殘基。
30.一種減輕對象中炎性病癥的一種或多種癥狀的方法，包括給予對象能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl模擬物，所述ApoAl模擬物具有的氨基酸序列包含含有至少一個色氨酸的ApoAl或ApoAl的模擬物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoAl模擬物的氨基酸序列中至少一個來自ApoAl或ApoAl的模擬物的色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述炎性病癥包括動脈粥樣硬化。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述炎性病癥包括狹窄。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，還包括給予所述對象抑制素的步驟。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物耐受以下氧化作用的至少一種MP0引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的氧化劑、MPO產(chǎn)生的活性氯化物引起的氧化作用、 與MP0/H2A/Cr系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、H0C1/0C1_引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的活性氮引起的氧化作用、與mpo/H2O2/NO2-系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、過氧亞硝酸根 (0N00-)引起的氧化作用、亞硝基過氧碳酸根(ONOOCO2-)引起的氧化作用或0N00—在有CO2 或緩沖液中有HC03_存在下起作用時生成產(chǎn)物引起的氧化作用。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述氧化劑耐受性氨基酸是苯丙氨酸。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，包含SEQID NO 1的至少一部分，其中X 選自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一個X是苯丙氨酸。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物基本由天然ApoAl的約5到50個氨基酸組成，其包含至少一個色氨酸，且所述至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
38.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO :2-69組成的組，其中X是色氨酸或氧化劑耐受性氨基酸，且至少一個X用于取代氧化劑耐受性殘基。
39.一種緩和MPO氧化劑導(dǎo)致的ApoAl、其包含色氨酸的片段或其模擬物的膽固醇流出功能喪失的方法，包括將所述ApoAl、其片段或其模擬物的至少一個色氨酸殘基用于取代氧化劑耐受性氨基酸，所述方法包括用還原劑耐受性氨基酸取代所述ApoAl、其片段或其模擬物的至少一個色氨酸殘基。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述氧化劑耐受性氨基酸是苯丙氨酸。
41.一種治療對象的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的方法，所述方法包括給予對象能促進(jìn)膽固醇流出荷脂細(xì)胞的ApoAl模擬物，所述ApoAl模擬物具有的氨基酸序列包含含有至少一個色氨酸的ApoAl或ApoAl的模擬物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoAl模擬肽的氨基酸序列中至少一個來自ApoAl或ApoAl的模擬物的色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生在血管損傷之后。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述ApoAl的給予量組以促進(jìn)對象中的內(nèi)皮細(xì)胞遷移。
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物耐受以下氧化作用的至少一種MP0引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的氧化劑、MPO產(chǎn)生的活性氯化物引起的氧化作用、 與MP0/H2A/Cr系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、H0C1/0C1_引起的氧化作用、MPO產(chǎn)生的活性氮引起的氧化作用、與mpo/H2O2/NO2-系統(tǒng)相關(guān)的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、過氧亞硝酸根 (0N00-)引起的氧化作用、亞硝基過氧碳酸根(ONOOCO2-)引起的氧化作用或0N00—在有CO2或緩沖液中有HC03_存在下起作用時生成產(chǎn)物引起的氧化作用。
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述氧化劑耐受性氨基酸是苯丙氨酸。
46.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，包含SEQID NO 1的至少一部分，其中X 選自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一個X是苯丙氨酸。
47.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，ApoAl模擬物基本由天然ApoAl的約5到 50個氨基酸組成，其包含至少一個色氨酸，且所述至少一個色氨酸被氧化劑耐受性氨基酸所取代。
48.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述ApoAl模擬物包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO :2-69組成的組，其中X是色氨酸或氧化劑耐受性氨基酸，且至少一個X用于取代氧化劑耐受性殘基。
全文摘要
一種包含耐受氧化的ApoA1模擬物或其片段的純化多肽。
文檔編號A61K38/17GK102177176SQ200880123053
公開日2011年9月7日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日
發(fā)明者J·D·史密斯, S·L·哈澤恩 申請人:克里夫蘭臨床基金會