專利名稱：抗-EDb纖連蛋白抗體-IL-2融合蛋白與結(jié)合至B細(xì)胞、B祖細(xì)胞和/或它們的癌性對應(yīng)物的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗-EDb纖連蛋白抗體-IL-2融合蛋白與結(jié)合至B細(xì)胞、B祖細(xì)胞和/ 或它們的癌性對應(yīng)物的分子的組合物以及它們的用途。
背景技術(shù)：
B細(xì)胞非-何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)是一類源于B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的組織病理 學(xué)和臨床上獨(dú)特的惡性腫瘤，其屬于最常見的一類血液學(xué)惡性腫瘤。因此，來自B-NHL患者 的惡性淋巴細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)如⑶20、⑶23等的特征性B細(xì)胞標(biāo)記。在美國，每年 B-NHL引起超過50000例新診斷病例并且占與癌癥有關(guān)的死亡病例的5%。利妥昔單抗(Rituxan ; R)是一種直接結(jié)合至在惡性和正常B細(xì)胞群的細(xì)胞 表面上構(gòu)成表達(dá)的CD20細(xì)胞表面表位的嵌合單克隆IgGl抗體。這樣，利妥昔單抗(a)引 起抗體_依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)，(b)通過補(bǔ)體-依賴性細(xì)胞溶解(CDC)和/或補(bǔ) 體-依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞死亡，并且(c)在通過利妥昔單抗進(jìn)行的CD20 結(jié)合之后直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，(d)利妥昔單抗可能具有經(jīng)由來自利妥昔單抗殺滅的 惡性B細(xì)胞通過抗原呈遞細(xì)胞的交叉呈遞并啟動(dòng)淋巴瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞而實(shí)施 的疫苗接種反應(yīng)(Selenko et al，2001)。A) ADCC 這種機(jī)制涉及抗體的Fc部分與在具有細(xì)胞毒性能力的免疫細(xì)胞(如單核 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和粒細(xì)胞)上表達(dá)的Fc γ受體的結(jié)合，這隨后將會(huì)導(dǎo)致結(jié)合利妥昔單 抗的B細(xì)胞通過吞噬作用或釋放免疫效應(yīng)器細(xì)胞中包含的細(xì)胞毒性粒子而被破壞。ADCC目 前被認(rèn)為是利妥昔單抗作用的主要機(jī)制。BKDC 因?yàn)槔孜魡慰沟腇c部分結(jié)合至補(bǔ)體，因此淋巴瘤細(xì)胞死亡能夠通過⑶C 實(shí)現(xiàn)。然而，最近發(fā)現(xiàn)在遺傳缺失補(bǔ)體因子的小鼠體內(nèi)仍然出現(xiàn)利妥昔單抗誘導(dǎo)的B細(xì)胞 減損，這緩和了人們最初對該作用機(jī)制的熱情。C)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)體外研究表明，通過利妥昔單抗進(jìn)行的CD20結(jié)合觸發(fā)了胞內(nèi) 信號(hào)傳遞事件和抗凋亡因子選擇性下調(diào)的級聯(lián)。這也將⑶20轉(zhuǎn)移到脂筏(lipid raft)中 并經(jīng)由增加的鈣離子活動(dòng)而活化半胱天冬酶(Janas et al，2005)。在CLL患者中，發(fā)現(xiàn)在灌 注了利妥昔單抗之后，其他潛在機(jī)制如ADCC能夠在體內(nèi)被觸發(fā)之前的很長時(shí)間，循環(huán)B細(xì) 胞就表現(xiàn)出對幾種半胱天冬酶和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的活化作用(Byrd et al, 2002)。D)免疫接種反應(yīng)/T細(xì)胞響應(yīng)臨床發(fā)現(xiàn)，采用利妥昔單抗的復(fù)治與比首次治療更 長的中值響應(yīng)持續(xù)時(shí)間有關(guān)，并且在響應(yīng)復(fù)治的那些患者中，利妥昔單抗的抗腫瘤效果在 從循環(huán)系統(tǒng)清除抗體之后會(huì)持續(xù)較長一段時(shí)間(Davis et al，2000)，這些都強(qiáng)烈地暗示了 所涉及的特異性免疫機(jī)制。用利妥昔單抗作為單藥的治療在患有幾乎每種亞型的B-細(xì)胞淋巴瘤的患者中 產(chǎn)生了顯著的響應(yīng)而不是中度的和持續(xù)時(shí)間較短的響應(yīng)。然而，當(dāng)其與誘導(dǎo)化療治療方案組合時(shí)才能觀察到其最大的受益(CoifTier，2006)。與標(biāo)準(zhǔn)的化療療法結(jié)合，尤其是與 CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、阿霉素和氫化潑尼松)結(jié)合，作為在每個(gè)化療周期第一天進(jìn)行 的90-min靜脈輸注375mg/m2劑量的利妥昔單抗甚至使患有彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL) 的患者的治愈率從單獨(dú)化療的38%提高至約52% (Coiffier 2002,GELA OS數(shù)據(jù)更新，ASH 2007)在慢性淋巴瘤中，向每一種誘導(dǎo)化療療法組合物(FCM、CVP、CHOP、FND)中添加利 妥昔單抗，已經(jīng)導(dǎo)致總體響應(yīng)和完全緩解率以及疾病發(fā)展的時(shí)間延遲的顯著提高(Marcus， 2005 ；Hiddemarm2005)。然而，向化療療法中加入利妥昔單抗并不一定會(huì)導(dǎo)致臨床效果的改 善。在患有套細(xì)胞淋巴瘤的患者中，與單獨(dú)使用CHOP療法的患者相比，用CHOP+利妥昔單 抗治療導(dǎo)致了類似的無進(jìn)展生存期和總體生存期(Lenz et al，2005)。除了作為B-NHL患者中誘導(dǎo)緩解(誘導(dǎo)療法)的治療劑的既定作用之外，利妥 昔單抗單一療法也已經(jīng)評價(jià)為一種對鞏固相應(yīng)或延長緩解時(shí)間的維持療法。在假設(shè)25mg 利妥昔單抗/mL是可接受的最低血清濃度的情況下，發(fā)現(xiàn)每3個(gè)月輸注375mg/m2利妥 昔單抗的劑量在預(yù)期的藥代動(dòng)力學(xué)研究(prospective pharmacokinetic study)中對 于利妥昔單抗維持療法而言是足夠的(GOrdan，2005)。在采用CVP (Hoechster，2005)或 CHOP (Habermann, 2006)的初始標(biāo)準(zhǔn)化療療法之后利用維持性利妥昔單抗時(shí)，盡管一些研究 表現(xiàn)出顯著的臨床受益，但是仍然不清楚利妥昔單抗維持療法是否為這些用作誘導(dǎo)化療療 法(例如，R-CH0P)的一部分的患者提供了額外的受益。遺憾的是，盡管利妥昔單抗與化療療法(例如，R-CH0P)組合毫無疑問地具有臨床 效果，但是大多數(shù)B-NHL患者實(shí)際上仍死于疾病進(jìn)展。另外，盡管在治療B-NHL時(shí)利妥昔單 抗是一種有效的治療劑，但是約有50%患有復(fù)發(fā)/頑固性CD20+濾泡淋巴瘤的患者并不響 應(yīng)于利妥昔單抗的初始治療(先天抗性；McLaughlin et all998)，而約60%的先前響應(yīng)于 利妥昔單抗的患者并不會(huì)從利妥昔單抗的復(fù)治(獲得抗性；Davis et al，2000)受益。目 前還不清楚這些形式的利妥昔單抗抗性是否是由于惡性B細(xì)胞的適應(yīng)性或受損的宿主免 疫效應(yīng)器機(jī)制所致。無論如何，利妥昔單抗抗性明顯阻礙了根據(jù)進(jìn)一步改進(jìn)的臨床成果對 B-NHL進(jìn)行的免疫療法和免疫化療。盡管已經(jīng)對利妥昔單抗/化療療法組合進(jìn)行了分析，但是對于進(jìn)一步的療法改 進(jìn)仍存在強(qiáng)烈和持續(xù)的需要。目前所追求的兩種一般性策略是a)設(shè)計(jì)新型抗-CD20 抗體，和b)構(gòu)建靶向于B細(xì)胞抗原而不是靶向于CD20的單克隆抗體。目前已經(jīng)對兩 類新型抗-CD20單克隆抗體進(jìn)行了臨床上的評價(jià)a)表現(xiàn)出比利妥昔單抗對Fc受體 FcyRIIIa(CD16)更高的親合性的抗-CD20抗體，和b)具有更低免疫原性的抗CD20抗體 (人源化；Tbl 1)。這些抗體中假設(shè)最強(qiáng)的是GA-101，其是一種具有糖工程化Fc部分和 經(jīng)修飾的肘部鉸鏈(肘形鉸鏈，elbow hinge)的人源化抗-⑶20抗體，導(dǎo)致了在針對NHL 細(xì)胞系的ADCC中10 100倍的增加。采用具有較低免疫原性的抗-CD20抗體小的I/ II期研究顯示，在復(fù)發(fā)的B-NHL患者中50%級別的響應(yīng)率(Coiffier，2006 ；Hagenbeek, 2005 ；Morschhauser, 2005)。已經(jīng)證實(shí)，靶向于B-NHL中除CD20之外的表面分子的單克隆 抗體，如 Iumilixumab (抗-CD23)、依帕珠單抗(epratuzumab)(抗-CD22)、SGN-40 和 HCD 122 (都抗-CD40) ,galiximab (抗-CD80)( 一種猴源性抗 CD80 (B7-1) IgGl 的單克隆抗體)、 apolizumab (HulDlO)(一種抗人類白細(xì)胞抗原HLA DR B鏈的人源化單克隆抗體)、KRN848、1D09C3(都抗-HLA-DR)，在早期臨床試驗(yàn)中具有前景。需要證明新型抗-CD20抗體和直接抗 非-CD20B-細(xì)胞表位的抗體具有超過利妥昔單抗的顯著有益的效力才能被認(rèn)為是成功的， 然而，使用多數(shù)這些抗體的早期臨床結(jié)果僅表現(xiàn)出增加的益處。人們已經(jīng)付出了許多努力以使利妥昔單抗與未結(jié)合的IL-2組合(Eisenbeis et al.，2004 ；Gluck et al.，2004)。然而，近來的II期試驗(yàn)的結(jié)果顯示，“利妥昔單抗+rIL-2組合療法是安全的并且 一般具有良好耐受性，但是響應(yīng)度低”(Khan et al.，2006，Clin Cancer Res 2006 ； 12 (23) 7046-7053)。而且，人們發(fā)現(xiàn)“rIL_2擴(kuò)展了體內(nèi)具有FcR的細(xì)胞亞組并增強(qiáng)了利妥昔單抗 的體外ADCC”。然而，作者得出結(jié)論認(rèn)為，這些發(fā)現(xiàn)“并未直接轉(zhuǎn)換成對患有利妥昔單抗-難 治的NHL患者有意義的臨床受益”。而且，作者推斷，“在進(jìn)行有利地調(diào)節(jié)利妥昔單抗的抗腫 瘤活性的進(jìn)一步改進(jìn)之前，可能需要更好理解利妥昔單抗作用的體內(nèi)機(jī)制”。除了癌癥指征之外，抗B-細(xì)胞抗體，尤其是利妥昔單抗正在被開發(fā)用于自身免 疫疾病，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病和自身免疫性溶血性貧血的治療(Assous et al, 2008)?？紤]到目前在臨床發(fā)展中的標(biāo)準(zhǔn)療法以及新療法選擇，仍具強(qiáng)烈的醫(yī)療需求以用 于為B-細(xì)胞淋巴瘤患者設(shè)計(jì)的更加有效的治療，這優(yōu)先導(dǎo)致完全緩解和/或用于治療利妥 昔單抗_抗性的淋巴瘤。對于提供治療自身免疫疾病，尤其是慢性自身免疫性疾病的新藥 仍具有強(qiáng)烈的醫(yī)療需求。表1:抗-CD20 抗體
抗體名稱類型ADCCCDC (補(bǔ)體依賴 性細(xì)胞毒性)直接效果參考文獻(xiàn)利妥昔單抗嵌合IgGl+++++Cragg et alOcrelizumab人源化IgGl++++/-+Vugmeyster et alPR0131921工程化 ocrelizumab+++++++Veltuzumab人源化IgGl+++++Stein et alOfatumumab人 IgGl+++++++Hagenbeck et alAME-I33人源化IgGl++++++++Weiner et alGA-101人源化IgGl+++++++++Umana et al 表2 在非_何杰金氏淋巴瘤患者的臨床試驗(yàn)中選擇的抗-B細(xì)胞抗體
權(quán)利要求
一種至少包含以下物質(zhì)的組合物(i)包含特異性識(shí)別EDb 纖連蛋白的抗體 部分和白細(xì)胞介素 2部分的融合蛋白，和(ii)結(jié)合于B細(xì)胞、B祖細(xì)胞和/或它們的癌性對應(yīng)物的分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述結(jié)合于B細(xì)胞、B祖細(xì)胞和/或它們的癌 性對應(yīng)物的分子特異性地結(jié)合于CD20、CD23、CD22、CD40、CD80、HLA-DR或HulDIO。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述特異性結(jié)合于⑶20、⑶23、⑶22、⑶40 或CD80的分子是抗體或抗體片段，或它們的融合蛋白。
4.一種至少包含以下物質(zhì)的組合物(i)包含特異性識(shí)別EDb-纖連蛋白的抗體_部分和白細(xì)胞介素_2部分的融合蛋白，和( )特異性結(jié)合于CD20的分子。
5.一種至少包含以下物質(zhì)的組合物(i)包含特異性識(shí)別EDb-纖連蛋白的抗體-部分和白細(xì)胞介素-2部分的融合蛋白，和( )特異性結(jié)合于表達(dá)CD20的細(xì)胞的分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的組合物，其中，所述分子是特異性結(jié)合于CD20的抗體或 抗體片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，(i)的所述抗體-部分識(shí)別纖連 蛋白的所述EDb-結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述融合蛋白具有連接所述抗 體_部分和所述白細(xì)胞介素_2部分的融合蛋白連接子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗體-部分特異性結(jié) 合于具有亞納摩爾或納摩爾親合性的所述EDb癌胚胎纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(EDb oncofetal fibronectin domain)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗體-部分含有所述L19 抗體的至少一個(gè)⑶R序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗體-部分包含SEQID No. 6至11的所述序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗體-部分包含至少一個(gè) SEQ ID No. 1的V重鏈或至少一個(gè)SEQID No. 2的V輕鏈。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗體-部分包含一個(gè)SEQ ID No. 1的V重鏈和一個(gè)SEQ ID No. 2的V輕鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述重鏈和所述輕鏈通過抗體 連接子連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗體連接子包含SEQID No. 3的序列、或與SEQ. ID. No. 3的所述序列具有至少90%同一性的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述白細(xì)胞介素_2部分是人 白細(xì)胞介素_2或其功能性變異體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述白細(xì)胞介素_2部分包含 SEQ. ID. No. 4 的序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，融合蛋白連接子連接所述抗體-部分和所述白細(xì)胞介素-2部分。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述融合蛋白連接子的長度為 1至30個(gè)氨基酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述融合蛋白連接子包含SEQ ID No. 5的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求3以及權(quán)利要求7至20中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗體或抗 體片段、或它們的融合蛋白特異性地結(jié)合于CD20。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中，所述抗-CD20的抗體表現(xiàn)出ADCC活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求6、21和22中的一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述抗-⑶20的抗體選自 利妥昔單抗、Ocrelizumab、PR0131921、Veltuzumab、Ofatumumab、ΑΜΕ-133 禾P GA—101。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述結(jié)合于B細(xì)胞、B祖細(xì)胞 和/或它們的癌性對應(yīng)物的分子被標(biāo)記，尤其是被放射性標(biāo)記。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中，所述結(jié)合于B細(xì)胞、B祖細(xì)胞和/或它們的 癌性對應(yīng)物的被標(biāo)記分子是放射性標(biāo)記的抗-CD20抗體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中，所述放射性標(biāo)記的抗-CD20抗體選自9°Y、 111In和131I-標(biāo)記的抗-⑶20抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中，所述放射性標(biāo)記的抗-CD20抗體選自 Υ-90-替伊莫單抗(Υ90- Zevalin )和 1-131 托西莫單抗(Bexxar )。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的組合物，用于作為藥物。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的組合物，用于作為治療腫瘤的藥物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中，所述癌癥是淋巴瘤。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中，所述淋巴瘤是B-細(xì)胞淋巴瘤，尤其是非-何 杰金氏淋巴瘤(NHL)。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，用于自身免疫疾病的治療。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其中，所述自身免疫疾病選自風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅 恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和自身免疫性溶血性貧血。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗-EDb纖連蛋白抗體-IL-2融合蛋白和結(jié)合于B細(xì)胞、B祖細(xì)胞和/或它們的癌性對應(yīng)物的分子的組合物及其用途。
文檔編號(hào)A61K38/20GK101969980SQ200880124938
公開日2011年2月9日 申請日期2008年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月17日
發(fā)明者克里斯托弗·施利曼, 安德烈亞斯·門拉德, 漢斯·迪特里?！らT森, 達(dá)里奧·內(nèi)里 申請人:菲洛根股份公司