專(zhuān)利名稱(chēng)：具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的納米顆粒的制作方法
具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的納米顆粒本發(fā)明旨在提出具有低水溶解度的(甚至疏水的)治療性活性物質(zhì)的水分散性納 米顆粒制劑。一般地，當(dāng)活性物質(zhì)在環(huán)境溫度即大約25°C的溫度下，具有低于100μ g/ml的在 純水中的溶解度時(shí)，那么該活性物質(zhì)則被稱(chēng)為是低水溶性的。因此，如下面所描述的，許多治療性活性物質(zhì)和/或治療性候選物表現(xiàn)為是低水 溶性的，甚至是完全疏水的，這在它們的治療制劑方面造成顯著的困難。尤其是，經(jīng)證實(shí)，以 與通過(guò)全身途徑進(jìn)行施用相容的形式來(lái)配制它們是非常困難的。當(dāng)然，對(duì)于它們中的某些而言可以獲得它們?cè)谒越橘|(zhì)中的溶解，只要以有機(jī)或 無(wú)機(jī)鹽的形式來(lái)配制它們。然而，這些鹽或者衍生物在大多數(shù)情況下就合成而言是不容易得到的，和此外并 不總是所希望的。這是因?yàn)椋苽渌鼈兛赡軐?duì)活性分子的穩(wěn)定性造成損害。作為這些差水溶性的治療性活性物質(zhì)的舉例說(shuō)明，尤其可以提及環(huán)孢菌素類(lèi)、紫 杉烷類(lèi)化合物(taxo'ides )、紫杉燒類(lèi)(taxanes)和肽類(lèi)分子例如胰島素。環(huán)孢菌素類(lèi)是抗真菌化合物，通常具有免疫抑制活性。這些環(huán)孢菌素類(lèi)往往表現(xiàn) 出不超過(guò)25μ g/ml的水溶解度，即比對(duì)于機(jī)體進(jìn)行規(guī)則吸收而言所需的值低大約一百倍 的值。為了獲得環(huán)孢菌素類(lèi)的可接受的生物利用率，常規(guī)的制劑一般采用聯(lián)合了親水相、疏 水相和表面活性劑的分散體系。至于它們，因其抗腫瘤特性而知名的紫杉烷類(lèi)化合物或紫杉烷類(lèi)是二萜類(lèi)物質(zhì)。 紫杉醇(其是天然的紫杉烷類(lèi)化合物)和其半合成的衍生物多西他賽被廣泛地用于腫瘤的 治療。一般地，紫杉烷衍生物具有甚至比環(huán)孢菌素類(lèi)還低的水溶解度。因此，該非常低的水 溶解度要求制定特殊的制劑。例如，由BRISTOL MEYERS SQUIBB以名稱(chēng)TAX0L 進(jìn)行銷(xiāo)售并 用于通過(guò)全身途徑進(jìn)行施用的紫杉醇制劑，是以包含30mg無(wú)水多西他賽的單劑量形式可 得的非熱原性的無(wú)菌配方。除了活性物質(zhì)之外，每一劑量還包含聚氧乙烯二醇的三蓖麻油 酸酯、CrSmophore EL 和乙醇。最后，該類(lèi)型的制劑在施用前需要在無(wú)菌、無(wú)熱原和等滲的
灌注溶液(0.9%氯化鈉，5%葡萄糖等)中進(jìn)行稀釋。然而，對(duì)于掩蓋紫杉醇溶解度的缺陷而言所需的CrSmophore EL 和乙醇的存在， 卻不幸地是引起不希望的效應(yīng)的性質(zhì)。因此，為了防止任何出現(xiàn)繼發(fā)性超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)， 通常在化學(xué)療法開(kāi)始前三天，用地塞米松通過(guò)口服途徑對(duì)待治療的受試者進(jìn)行前驅(qū)用藥 (premedication)。紫杉醇制劑的另一個(gè)備選方案使用與白蛋白相連接的紫杉醇。該特殊制劑以名稱(chēng) Abraxane 進(jìn)行銷(xiāo)售。由于顯而易見(jiàn)的原因，就其通過(guò)白蛋白分子與紫杉醇分子的共價(jià)鍵合 而強(qiáng)制導(dǎo)致形成該衍生物而言，該備選方案也不是令人滿(mǎn)意的。此外，不能完全排除該偶聯(lián) 對(duì)于紫杉醇的治療活性具有影響。最后，清楚的是，當(dāng)將活性物質(zhì)用于通過(guò)口服途徑(這是對(duì)于施用治療性活性物 質(zhì)來(lái)說(shuō)特別受歡迎的另一途徑)進(jìn)行施用時(shí)，低水溶性活性物質(zhì)的生物利用率的該缺陷變 成了加劇的障礙。
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確切地說(shuō)，本發(fā)明旨在用于制備低水溶性的治療性活性物質(zhì)的制劑的新型方式， 其使得能夠彌補(bǔ)此類(lèi)活性物質(zhì)的常規(guī)制劑的缺點(diǎn)。更特別地，本發(fā)明產(chǎn)生于發(fā)明者的下列觀(guān)察結(jié)果經(jīng)證實(shí)，以懸浮在水性介質(zhì)中且 具有減小的尺寸(尤其是對(duì)于通過(guò)可注射途徑進(jìn)行施用而言是相容的)的納米顆粒的形式 來(lái)配制這些低水溶性的(甚至疏水的)治療性活性物質(zhì)是可能的，條件是，將這些活性物質(zhì) 與角鯊烯衍生物或類(lèi)似物相聯(lián)合。因此，根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的水分散 性衍生物，其由與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物或類(lèi)似物的分子共價(jià)偶聯(lián)的至少一 個(gè)所述活性物質(zhì)的分子形成。更確切地，本發(fā)明涉及前述的水分散性衍生物，其中所使用的治療性活性物質(zhì)具 有在環(huán)境溫度下所測(cè)量的低于100μ g/ml，特別地低于25μ g/ml，尤其是低于20μ g/ml，甚 至低于10 μ g/ml，和更特別地低于5 μ g/ml的在純水中的溶解度。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這樣的衍生物也可以稱(chēng)為“綴合物”。更特別地，根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及至少一種具有低水溶解度的治療性活性 物質(zhì)的水分散性納米顆粒，其中所述活性物質(zhì)在這之中以與至少一種具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴 化合物或類(lèi)似物相聯(lián)合的形式存在。在文獻(xiàn)PCT/FR2005/050488中，發(fā)明者已經(jīng)提及了，當(dāng)其被共價(jià)偶聯(lián)至吉西他濱 (一種親水的且極性的分子)時(shí)，角鯊烯在水性介質(zhì)中自發(fā)形成具有百來(lái)個(gè)納米的納米顆 粒的能力。尤其，通過(guò)如此合成的衍生物的兩親性行為(角鯊烯部分代表了疏水部分，而吉 西他濱部分代表了親水部分)來(lái)解釋在此之中的該能力。然而，與所有預(yù)期相反，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，將具有低水溶解度的(甚至疏水的)治療 性活性物質(zhì)的衍生物(產(chǎn)生自至少一個(gè)所述治療性活性物質(zhì)的分子與至少一個(gè)具有角鯊 烯骨架的烴化合物的分子的共價(jià)偶聯(lián))與極性溶劑例如水放在一起，也導(dǎo)致自發(fā)形成具有 幾十至幾百納米的顆粒，其因此有利地與通過(guò)全身途徑進(jìn)行施用相容，并且仍然具有所考 慮的活性物質(zhì)的治療功效。因此，對(duì)于已經(jīng)存在的制劑而言，采用根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的形式的這些疏水 的治療性活性物質(zhì)的制劑是有利的備選方案。具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴衍牛物在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“角鯊烯結(jié)構(gòu)”意指由異戊二烯單元，更特別是6個(gè)異戊二烯單 位形成的線(xiàn)性的烴結(jié)構(gòu)，例如角鯊烯，其式如下 作為這些烴化合物的舉例說(shuō)明，更特別地，可以提及角鯊烯酸及其衍生物。如本發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的，該角鯊烯結(jié)構(gòu)在本發(fā)明的背景下是特別重要的，因?yàn)楫?dāng)將 其與極性介質(zhì)(更特別地，水)放在一起時(shí)，它自發(fā)表現(xiàn)出緊密的構(gòu)象。出人意料地，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將這樣的衍生物與另一也具有疏水性質(zhì)的化學(xué)實(shí) 體相聯(lián)合(尤其是共價(jià)連接)時(shí)，該能力仍然保留。由此導(dǎo)致產(chǎn)生以納米顆粒形式的緊密構(gòu)造，其中所述兩個(gè)化學(xué)實(shí)體彼此緊密交錯(cuò)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，類(lèi)似物是指這樣的烴化合物，一方面，當(dāng)將其與極性介質(zhì)放在 一起時(shí)，能夠重現(xiàn)角鯊烯衍生物的行為，和另一方面，當(dāng)將其與具有低水溶解度的治療性活 性物質(zhì)的分子相連接時(shí)，能夠重現(xiàn)該能力。在該定義之下尤其涵蓋了角鯊烯衍生物的取代 形式，特別是角鯊烯酸及其衍生物，尤其是具有取代的那些。這樣的衍生物可以例如為1，1'，2-三-去甲角鯊烯酸、角鯊烯酰基乙酸、1，1'， 2-三-去甲角鯊烯胺、1，1'，2-三-去甲角鯊烯醇、1，1'，2-三-去甲角鯊烯硫醇、角鯊烯 乙酸、角鯊烯基乙醇、角鯊烯基乙硫醇或角鯊烯基乙胺。一般地，將至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴分子共價(jià)連接至具有低水溶解度的治療 性活性物質(zhì)的分子。當(dāng)然，可與治療性活性物質(zhì)的分子相互作用的烴衍生物分子的數(shù)目可 以大于1。根據(jù)本發(fā)明的衍生物可以包含至少兩個(gè)相同或不同的具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。一般地，該烴化合物攜帶可與存在于所考慮的活性物質(zhì)的分子上的官能團(tuán)反應(yīng)的 官能團(tuán)，以便在所述兩個(gè)實(shí)體之間建立共價(jià)連接，例如酯、醚、硫醚、二硫化物、磷酸酯或酰 胺類(lèi)型的。有利地，其為羧基官能團(tuán)。在這種情況下，具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴衍生物為角鯊烯 酸或其衍生物，例如角鯊烯酰基N-羥基琥珀酰亞胺酯。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案變化形式，存在于所述兩種類(lèi)型的分子之間的共價(jià)連接可以表 現(xiàn)為“連接體”或者連接臂。當(dāng)分別存在于具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的化合物和具有低溶解度的治 療性活性物質(zhì)上的官能團(tuán)相互不具有反應(yīng)親和性并因此不能形成所希望的共價(jià)連接時(shí)，這 樣的臂可以尤其顯得是有用的。這樣的臂確切地使得能夠通過(guò)其骨架的兩個(gè)末端中的每一 個(gè)引入適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)，即分別具有所希望的反應(yīng)親和性的官能團(tuán)，其中一個(gè)用于存在于具 有角鯊烯結(jié)構(gòu)的衍生物上的官能團(tuán)，和另一個(gè)用于存在于所考慮的活性物質(zhì)上的官能團(tuán)。還可以設(shè)想，該連接臂此外還在其骨架水平上具有不穩(wěn)定的官能團(tuán)，其以后適合 于將具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的化合物與治療性活性物質(zhì)相分開(kāi)。其可以例如為由酶可識(shí)別的肽基兀。連接臂類(lèi)型的基元是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且它們的使用明顯地在本領(lǐng)域 技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。作為根據(jù)本發(fā)明可以考慮的連接臂的代表，尤其可以提及(聚)氨基酸基元、多元 醇、糖類(lèi)和具有低分子量的聚乙二醇(聚醚氧化物)，特別是多元醇、糖類(lèi)和具有低分子量 的聚乙二醇(聚醚氧化物)。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“共價(jià)連接”優(yōu)選地表示共價(jià)鍵(尤其是如上面所描述 的)，但也涵蓋了表現(xiàn)為如前面所定義的連接臂的共價(jià)連接。具有低溶解度的治療性活性物質(zhì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)，具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)為這樣的化合物，其具有 在環(huán)境溫度(即大約25°C )下所測(cè)量的低于100 μ g/ml，尤其是低于25 μ g/ml，特別地低于 20 μ g/ml，尤其是低于15 μ g/ml，甚至低于10 μ g/ml，和更特別地低于5 μ g/ml的在純水中 的溶解度。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，純水是PH接近中性(在pH5和pH8之間)并且沒(méi)有任何其 他化合物例如有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽的水。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，更特別地考慮的治療性活性物質(zhì)可以選自生物藥物分類(lèi)的第 2組和第4組的物質(zhì)。
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作為這些具有低水溶解度的物質(zhì)的代表，尤其可以提及免疫抑制劑；化學(xué)治療 劑，尤其是抗腫瘤化學(xué)治療劑，例如紫杉烷類(lèi)化合物、多柔比星(也稱(chēng)為阿霉素)和其異 構(gòu)體表柔比星；抗血管發(fā)生劑；抗病毒劑；抗菌劑；抗生素；和抗寄生蟲(chóng)劑；作用于糖代謝 的物質(zhì)；肽；脂質(zhì)；作用于鈣通道的試劑；非類(lèi)固醇抗炎劑；以及肽類(lèi)化合物(compoMs ρ印tidiques)，例如胰島素。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明的背景下，所考慮的僅是前述活性物質(zhì)的疏水的或者具有非 常低的溶解度的形式。在本發(fā)明的背景下，可在水性介質(zhì)中溶解的其離子形式或其他形式 并不令人關(guān)注，因?yàn)閷?duì)于它們來(lái)說(shuō)，彌補(bǔ)水溶解度的缺陷顯得并不是必需的。因此，在本發(fā)明的情況下，與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的分子相偶聯(lián)的活性物質(zhì) 的形式通常是中性的形式，即非離子或非成鹽的形式，除非其本身表現(xiàn)出具有低水溶性。免疫抑制劑是疏水性化合物，并且包括N-甲基化的環(huán)狀十一肽。在該活性物質(zhì)家 族中，更特別地考慮環(huán)孢菌素類(lèi)。其尤其為環(huán)孢菌素A和G。然而，根據(jù)本發(fā)明，也可以考慮 其他大環(huán)內(nèi)酯。還可以涉及諸如脫氧精胍菌素、雷帕霉素或子囊霉素的免疫抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的變化形式，具有低溶解度的治療性活性物質(zhì)更特別地為 紫杉烷類(lèi)和紫杉烷類(lèi)化合物。此類(lèi)化合物尤其描述在申請(qǐng)WO 2005/013968中。更優(yōu)選地，其為多西他賽、紫杉
醇或其衍生物。如前面所描述的，這些物質(zhì)用至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物或類(lèi)似物的分 子進(jìn)行官能化。因此，根據(jù)本發(fā)明所考慮的治療性活性物質(zhì)可以包含兩個(gè)衍生化、三個(gè)衍生 化、或者更多，這些衍生化可以是相同的或不同的。對(duì)于在具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的分子和至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的 烴衍生物或類(lèi)似物的分子之間建立至少一個(gè)共價(jià)鍵而言所必需的反應(yīng)可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件 來(lái)進(jìn)行，并因此其實(shí)施明顯地在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。一般地，在至少一種具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的化合物存在和過(guò)量(相對(duì)于所考慮的低水 溶性的活性物質(zhì))下，例如按照兩個(gè)當(dāng)量，根據(jù)對(duì)于使所述分子中的每個(gè)分子所攜帶的兩 個(gè)特定官能團(tuán)相互作用所要求的標(biāo)準(zhǔn)條件，在溶液中進(jìn)行該反應(yīng)。作為根據(jù)本發(fā)明的水分散性衍生物的非限制性舉例說(shuō)明，非常特別地可以提及下 述的紫杉烷類(lèi)化合物衍生物 它們是由分別用一個(gè)和兩個(gè)角鯊烯酸分子對(duì)紫杉醇分子進(jìn)行官能化而產(chǎn)生的兩 種化合物。根據(jù)本發(fā)明的其他水分散性衍生物為-具有如下的式的角鯊烯?；鵢胰島素
“具有如下的式的角鯊烯酰基_表柔比] -和具有如下的式的角鯊烯?；鵢脫氧精胍菌素
分散體■

一般地，以水分散體的形式獲得這些化合物。 因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及至少-
4中如前所定義的衍生物的水
根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒
如前面所明確指出的，治療性活性物質(zhì)與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物的 分子的共價(jià)偶聯(lián)可以賦予用至少一個(gè)角鯊烯?；绱斯倌芑幕钚晕镔|(zhì)以這樣的能力，即 在極性溶劑介質(zhì)中組織成緊密形式，從而導(dǎo)致納米顆粒的形成。一般地，如此獲得的納米顆粒具有30至650nm，特別地30至500nm，和特別地50 至 250nm，甚至 100 至 200nm 的平均尺寸，其借助于 Coulter N4MD nanosizer, Coulter Electronics, Hialeah，USA通過(guò)光的漫射來(lái)測(cè)量。因此，根據(jù)本發(fā)明所考慮的低水溶性的治療性活性物質(zhì)與根據(jù)本發(fā)明的烴衍生物 (更特別地，與角鯊烯酸或其衍生物，例如角鯊烯?；鵑-羥基琥珀酰亞胺酯)的相互作用
11賦予所述治療性物質(zhì)以這樣的物理化學(xué)特性，所述物理化學(xué)特性足以賦予其形成顆粒的能 力，所述顆粒的尺寸表現(xiàn)為對(duì)于腸胃外施用，尤其是通過(guò)靜脈內(nèi)途徑進(jìn)行施用來(lái)說(shuō)是相容 的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備這些納米顆粒的方法，其特征在于，所 述方法包括-將根據(jù)本發(fā)明的衍生物(即預(yù)先通過(guò)將至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物或 類(lèi)似物的分子偶聯(lián)至具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的分子而形成的衍生物)溶解在 至少一種有機(jī)溶劑(例如，醇例如乙醇)中，其濃度足以當(dāng)在攪拌下和通常逐滴地向水相中 添加所得的混合物時(shí)，獲得以在所述水相中的懸浮液形式的所述衍生物的納米顆粒的瞬時(shí) 形成，和-需要時(shí)，分離所述納米顆粒。一般地，可以在環(huán)境溫度下進(jìn)行反應(yīng)。無(wú)論其為何，反應(yīng)溫度不應(yīng)影響所考慮的活 性物質(zhì)的活性。根據(jù)本發(fā)明的制備納米顆粒的方法是特別有利的，因?yàn)樗恍枰砻婊钚?劑的存在。如前面所明確指出的，在具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴衍生物和活性物質(zhì)分子之間的偶聯(lián) 可以是直接的或者通過(guò)連接臂。此外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用于納米沉淀(nanopMcipitation)的治療性活性 物質(zhì)的量，可以控制這些顆粒的尺寸。這是因?yàn)椋悸?lián)產(chǎn)物濃度的增加通常導(dǎo)致尺寸的增 加，反之亦然。根據(jù)一個(gè)有利的實(shí)施方案，以水分散體的形式配制根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒，以便 將其通常通過(guò)全身途徑進(jìn)行施用。根據(jù)一個(gè)有利的實(shí)施方案，該水分散體包含少于5重量％，甚至少于2重量％的C2 至C4醇，例如乙醇。根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，該水分散體包含少于5重量％，甚至少于2重量％的 表面活性劑或類(lèi)似物，和更特別地沒(méi)有表面活性劑或類(lèi)似物，所述表面活性劑或類(lèi)似物例 如為聚乙二醇、聚甘油或其衍生物例如酯。根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，該水分散體包含少于5重量％，甚至少于2重量％的 聚氧乙基化蓖麻油，和更特別地沒(méi)有聚氧乙基化蓖麻油，所述聚氧乙基化蓖麻油例如為以 名稱(chēng)Cr6mophore EL 進(jìn)行銷(xiāo)售的那些。根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，該水分散體內(nèi)在地具有與通過(guò)靜脈內(nèi)途徑進(jìn)行施用 相容的粘度。因此，借助于角鯊烯酸以水分散性納米顆粒的形式在水性介質(zhì)中配制紫杉烷類(lèi)化 合物例如Paclitaxel ，有利地使得能夠獲得納米顆粒的懸浮液，其中除了對(duì)于獲得可注 射懸浮液的等滲性而言所必需的5%右旋糖之外無(wú)其他添加劑。因此，看來(lái)可能的是(i) 擺脫有毒的CMmophore的使用；(ii)提供可直接注射的水性制劑；和(iii)施用更大濃度 (直至4mg/ml)的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及這些衍生物和納米顆粒在藥物組合物中 的用途。此外，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含作為具有活性的物質(zhì)的至少一種根據(jù)本
12發(fā)明的衍生物，所述衍生物尤其以納米顆粒的形式。根據(jù)本發(fā)明的衍生物還可以通過(guò)所有常規(guī)的途徑進(jìn)行施用。然而，如前面所明確 指出的，考慮到其顆粒的小尺寸，它們可以以水懸浮液的形式通過(guò)靜脈內(nèi)途徑進(jìn)行施用，并 因此與血管微循環(huán)相容。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及藥物組合物，其至少包含作為具有活性的物質(zhì)的 根據(jù)本發(fā)明的化合物，所述化合物尤其以納米顆粒的形式。根據(jù)本發(fā)明的衍生物在這之中 可以與至少一種藥學(xué)上可接受的載體相聯(lián)合。作為與根據(jù)本發(fā)明的組合物相容的藥物制劑的例子，尤其可以提及-靜脈內(nèi)注射液或靜脈內(nèi)灌注液；_鹽水溶液或純化水的溶液；_用于吸入的組合物；-膠囊、糖衣丸劑(dragSe)和扁囊劑，它們尤其摻入有作為載體的水、磷酸鈣、糖 (例如乳糖、右旋糖或甘露醇)、滑石、硬脂酸、淀粉、碳酸氫鈉和/或明膠。當(dāng)所述化合物以在水溶液中的分散體形式進(jìn)行使用時(shí)，它們可以與螯合性試劑或 螯合劑、抗氧化劑、PH調(diào)節(jié)劑和/或緩沖劑類(lèi)型的賦形劑相聯(lián)合。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明的納米顆?？梢栽诒砻嫔蠑y帶許多反應(yīng)性官能團(tuán)，例如羥基或 胺官能團(tuán)。因此，可以設(shè)想，向這些官能團(tuán)附著各種各樣的分子，尤其是通過(guò)共價(jià)鍵。作為可與納米顆粒相聯(lián)合的該類(lèi)型分子的非限制性舉例說(shuō)明，尤其可以提及標(biāo)記 物類(lèi)型的分子，可確保靶向功能的化合物，以及能夠賦予其以特定的藥物動(dòng)力學(xué)特性的任 何化合物。關(guān)于該最后一個(gè)方面，因此可以設(shè)想在這些納米顆粒的表面上附著聚乙二醇的 親脂性衍生物，例如聚乙二醇膽固醇或聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺，或者更好地，聚乙二醇角 鯊烯。這是因?yàn)?，基于此?lèi)化合物的表面包衣對(duì)于賦予由于肝巨噬細(xì)胞對(duì)于納米顆粒的捕 獲顯著減少而增加的血管暫留來(lái)說(shuō)是有利的。除了前述化合物，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以包含防腐劑、潤(rùn)濕劑、增溶劑和 著色劑類(lèi)型的試劑。由于顯而易見(jiàn)的原因，可使用的根據(jù)本發(fā)明的衍生物的量可以根據(jù)使用方式和為 其施用所考慮的途徑而顯著地變化。例如，關(guān)于對(duì)成年患者用紫杉烷類(lèi)化合物通過(guò)全身途徑進(jìn)行治療，可以設(shè)想以大 約0. 1至150mg/kg體重/天，和更特別地1至40mg/kg/天的劑量施用根據(jù)本發(fā)明的衍生 物。相反地，對(duì)于局部施用，可以設(shè)想按照相對(duì)于所考慮的藥物制劑的總重量而言0. 1 至40重量％，甚至更多來(lái)配制至少一種根據(jù)本發(fā)明的衍生物。還可能的是，將至少一種根據(jù)本發(fā)明的衍生物與至少一種可以同樣也有益于所考 慮的病理學(xué)狀態(tài)的其他具有活性的物質(zhì)進(jìn)行共施用。作為這些可與根據(jù)本發(fā)明的衍生物相組合的具有活性的物質(zhì)的代表，尤其可以提 及其他抗癌的或抑制細(xì)胞的分子或大分子(例如鉬鹽、蒽環(huán)類(lèi)抗生素、有絲分裂紡錘體的 毒素、拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制劑、激酶的抑制劑或金屬蛋白酶的抑制劑)、皮質(zhì)激素(例如地塞 米松)或非皮質(zhì)激素類(lèi)型的抗炎劑或者具有免疫佐劑活性的分子(例如具有抗癌活性的抗 體)?？梢栽O(shè)想與在某些化學(xué)療法中所使用的高熱相聯(lián)合。根據(jù)本發(fā)明的衍生物還可以與
13手術(shù)療法和/或輻射(用于治療癌癥)相組合。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及治療性治療的方法，其包括給患者施用 有效量的至少一種根據(jù)本發(fā)明的衍生物和/或納米顆粒，任選地，與其他具有活性的物質(zhì) 和/或治療手段(高熱、輻射)和/或手術(shù)療法(如上面所定義的)相聯(lián)合。下面所給出的實(shí)施例和附圖作為本發(fā)明領(lǐng)域的非限制性舉例說(shuō)明而呈現(xiàn)。

圖1 相對(duì)于未處理的KB細(xì)胞(IA)而言，在將KB細(xì)胞與角鯊烯?；仙即嫉募{ 米顆粒溫育(IB)后微管蛋白的積累。圖2 根據(jù)實(shí)施例11所獲得的角鯊烯?；蚀减；鵢紫杉醇衍生物的納米顆粒 的體內(nèi)抗癌活性的評(píng)價(jià)，其通過(guò)表征作為時(shí)間(在植入腫瘤后的天數(shù))的函數(shù)的植入到小 鼠中的腫瘤的體積(mm3)來(lái)進(jìn)行。圖3:作為時(shí)間(在靜脈內(nèi)注射L1210白血病細(xì)胞后的天數(shù))的函數(shù)的攜帶L1210 白血病(通過(guò)轉(zhuǎn)移而誘導(dǎo)的)的小鼠的重量變化的評(píng)價(jià)，所述小鼠用角鯊烯?；?多柔比 星的納米顆粒進(jìn)行處理或不處理。圖4:作為時(shí)間(在靜脈內(nèi)注射L1210白血病細(xì)胞后的天數(shù))的函數(shù)的攜帶L1210 白血病的小鼠的存活率的評(píng)價(jià)，所述小鼠用角鯊烯?；?多柔比星的納米顆粒進(jìn)行處理或 不處理。實(shí)施例1單角鯊烯?；仙即嫉暮铣稍诃h(huán)境溫度下，使在二氯甲烷(DCM)中的450mg紫杉醇(0. 526mmol)與1-乙 基-3-(3- 二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDCA，2. 5摩爾當(dāng)量，相對(duì)于紫杉醇而言)、二甲基 氨基吡啶(DMAP，0.5摩爾當(dāng)量，相對(duì)于紫杉醇而言)和角鯊烯酸(2摩爾當(dāng)量，相對(duì)于紫杉 醇而言)(事先溶解在DCM中)進(jìn)行反應(yīng)。在1小時(shí)后，反應(yīng)結(jié)束并用pH 5的水來(lái)終止， 并且用氯化鈉(NaCl)水溶液進(jìn)行萃取。然后，水相用DCM進(jìn)行洗滌。通過(guò)用DCM/乙酸 乙酯混合物進(jìn)行洗脫的Si02(2.5X40cm)快速色譜法來(lái)進(jìn)行所獲得的混合物的純化。收 集級(jí)分62-80，并將如此獲得的單角鯊烯酰基紫杉醇通過(guò)1H NMR(Bruker 300Mhz)、質(zhì)譜法 (Micromass Waters ESI)和 RP-HPLC 來(lái)進(jìn)行表征?；瘜W(xué)式=C74H93NO15；分子量1236. 53實(shí)施例2二角鯊烯酰基紫杉醇的合成在環(huán)境溫度下，使在二氯甲烷(DCM)中的450mg紫杉醇(0. 526mmol)與1-乙 基-3-(3- 二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDCA，2. 5摩爾當(dāng)量，相對(duì)于紫杉醇而言)、二甲基 氨基吡啶(DMAP，0.5摩爾當(dāng)量，相對(duì)于紫杉醇而言)和角鯊烯酸(2摩爾當(dāng)量，相對(duì)于紫杉 醇而言)(事先溶解在DCM中)進(jìn)行反應(yīng)。在1小時(shí)后，反應(yīng)結(jié)束并用pH 5的水來(lái)終止， 并且用氯化鈉(NaCl)水溶液進(jìn)行萃取。然后，水相用DCM進(jìn)行洗滌。通過(guò)用DCM/乙酸 乙酯混合物進(jìn)行洗脫的SiO2快速色譜法(2.5X40cm)來(lái)進(jìn)行所獲得的混合物的純化。收 集級(jí)分21-32，并將如此獲得的二角鯊烯?；仙即纪ㄟ^(guò)1H NMR (Bruker 300Mhz)、質(zhì)譜法 (Micromass Waters ESI)和 RP-HPLC 來(lái)進(jìn)行表征?；瘜W(xué)式=C101H135NO16；分子量=1619. 15實(shí)施例3
角鯊烯?；仙即嫉募~將4mg角鯊烯?；仙即既芙庠?.5ml乙醇中(2. 5mg/ml)，并且在連續(xù)攪拌(速 度500rpm)下逐滴添加到Iml含有5%右旋糖的水溶液中。角鯊烯酰基紫杉醇自裝配成尺 寸為100至200nm的納米顆粒的形式。然后，借助于rotavapor 在減壓下完全蒸發(fā)掉乙醇， 從而獲得終濃度為4mg/ml的角鯊烯?；仙即嫉募{米顆粒懸浮液。實(shí)施例4角鯊烯?；仙即嫉钠渌{米顆粒的制備將變化量(在下面的表1中明確指出)的角鯊烯?；仙即既芙庠?.25ml四 氫呋喃(THF)中。在連續(xù)攪拌(速度500rpm)下，將所獲得的溶液逐滴添加到0. 25ml水 中。角鯊烯?；仙即家猿叽鐬?00至200nm的納米顆粒的形式沉淀出來(lái)。然后，借助于 rotavapor 在減壓下完全蒸發(fā)掉THF，從而獲得其尺寸依照濃度而變化的角鯊烯?；仙?醇的納米顆粒懸浮液(參見(jiàn)下表)。表1 實(shí)施例5M、·身寸傭碰·匕纏_細(xì)粒抽T(mén)AXOLi··以4X50mg/kg(紫杉醇當(dāng)量)的劑量，將在實(shí)施例3中所制備的角鯊烯酰基紫杉 醇的納米顆粒懸浮液(4mg/ml)通過(guò)靜脈內(nèi)途徑直徑注射給小鼠(C57BL6)；注射在第0、5、 9和14天進(jìn)行。注射是容易的，并且動(dòng)物沒(méi)有顯示出任何毒性征候。沒(méi)有記錄到任何死亡 (在至少一個(gè)月的時(shí)間段內(nèi))。直接靜脈內(nèi)注射TAXOL溶液(沒(méi)有在0. 9% NaCl中進(jìn)行稀 釋)導(dǎo)致100%的經(jīng)處理的小鼠立即死亡。當(dāng)將TAXOL溶液事先在0. 9% NaCl中進(jìn)行稀釋 時(shí)，可以注射的最大劑量為20mg/kg。實(shí)施例6該活性的表征根據(jù)下列實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)免疫熒光法來(lái)進(jìn)行第1天將源自人宮頸癌的KB 3. 1細(xì)胞和相應(yīng)于人結(jié)腸癌細(xì)胞系的HT-29細(xì)胞， 以20000個(gè)細(xì)胞/孔的密度置于6孔平板中(終體積為2ml RPMI+FCS)。將細(xì)胞在37°C的 溫度和5% CO2下進(jìn)行溫育。第2天漂洗細(xì)胞，并向其添加根據(jù)實(shí)施例3中描述的實(shí)驗(yàn)方案所制備的角鯊烯酰 基紫杉醇的納米顆粒(濃度為5 μ M)。第3天在14-16小時(shí)后，用PBS漂洗兩次，隨后添加提取溶液(Triton X-100+0. 5% PEM-PIPES IOOmM, EGTA 2mM, MgCl2 2mM pH 6.8)。在 4 分鐘后，進(jìn)行漂洗，
15隨后添加2ml的在PEM中的3%甲醛溶液。40分鐘之后，進(jìn)行漂洗，隨后在30分鐘期間添 加20%的在PBS中的FCS。然后，再添加鼠類(lèi)抗α-微管蛋白-FITC單克隆抗體(稀釋至 1 200)，并且讓其溫育1小時(shí)。最后，用PBS進(jìn)行漂洗，并且通過(guò)共焦熒光顯微術(shù)(Leica TCS SP2)進(jìn)行分析。如通過(guò)圖IB所圖解說(shuō)明的，在熒光顯微術(shù)中微管蛋白團(tuán)的形成是清晰可見(jiàn)的，這 表明了角鯊烯酰基紫杉醇的納米顆粒作為紡錘體的毒素的活性。未處理的KB細(xì)胞作為對(duì) 照而呈現(xiàn)(圖1Α)。實(shí)施例7角鯊烯?；鵢胰島素的納米顆粒的制備a)角鯊烯?；鵑-羥基琥珀酰亞胺的獲得與胰島素的反應(yīng)需要預(yù)先制備和分離反應(yīng)中間體角鯊烯酰基N-羥基琥珀酰亞胺 酯。在實(shí)踐中，使溶解在2ml 二氯甲烷(DCM)中的300mg(0. 75mmol)角鯊烯酸與72. 5mg N-羥基琥珀酰亞胺(2.0摩爾過(guò)量)和309mg 二環(huán)己基碳二亞胺(DCXD) (2X)(溶解在二氯 甲烷中)進(jìn)行反應(yīng)，并在攪拌下維持2小時(shí)。然后，除去沉淀出的脲，隨后將混合物溶解在 乙酸乙酯中，將其進(jìn)行過(guò)濾，并保存于-20°C的溫度下。通過(guò)NMR和質(zhì)譜法來(lái)表征角鯊烯酰 基N-羥基琥珀酰亞胺酯(Sq-CO-NHS)。b)角鯊烯?；?胰島素綴合物的獲得將50mg胰島素(源自牛胰腺并且符合USP測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn))溶解在5ml無(wú)水二甲亞 砜(> 99%的純度)中，并且添加至30 μ 1的處于包含13. 2mg Sq-CO-NHS (以3 1的摩 爾過(guò)量)的燒瓶中的N，N-二異丙基乙胺中。反應(yīng)在環(huán)境溫度下進(jìn)行2小時(shí)，并且將溶液徹 底地進(jìn)行透析以便除去有機(jī)溶劑和小分子雜質(zhì)，隨后進(jìn)行凍干。然后，將固體用DCM進(jìn)行洗 滌，隨后進(jìn)行過(guò)濾。獲得46mg的白色粉末。綴合反應(yīng)通過(guò)分析型HPLC來(lái)進(jìn)行檢查，其中使用Waters RP C18柱(150. 9mm， 5μπι,300 Α)和作為洗脫溶劑的甲醇/水(梯度+0.1%TFA)。胰島素的角鯊烯綴合物的表征通過(guò)MALDI-T0F和Orbi-Trap MS分析來(lái)進(jìn)行。該
化合物符合下面的結(jié)構(gòu)式 c)角鯊烯酰基-胰島素的納米顆粒的制備
將4mg經(jīng)純化的胰島素的角鯊烯綴合物溶解在無(wú)水二甲亞砜(DMSO) (Iml)中，并 用蒸餾水徹底地進(jìn)行透析。在透析過(guò)程期間形成納米顆粒。通過(guò)聚乙二醇(PEG) IOkDa固 體濃縮將終體積減小至1ml。實(shí)施例8角鯊烯酰基_表柔比星的納米顆粒的制備a)角鯊烯?；鵢表柔比星3’酰氨基衍生物的獲得將IOOmg表柔比星快速溶解在2ml無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)中，并與事先溶解在 無(wú)水DMF中的ISOmg角鯊烯?；鵑-羥基琥珀酰亞胺酯(摩爾過(guò)量2. 0)的溶液相混合，并 且添加20 μ 1 N, N- 二異丙基乙胺。在25 °C的溫度下混合2小時(shí)后，用DCM將溶液進(jìn)行稀 釋?zhuān)⒂谜麴s水進(jìn)行洗滌。借助于用DCM-乙醇混合物進(jìn)行洗脫的在SiO2 (2. 5 X 25cm)上的 快速色譜法來(lái)進(jìn)行純化。收集級(jí)分60-67，并且獲得IOOmg角鯊烯?；?表柔比星3’酰氨 基綴合物，并通過(guò)NMR和質(zhì)譜法進(jìn)行表征。該化合物符合下面的結(jié)構(gòu)式 b)角鯊烯酰基_表柔比星的納米顆粒的制備在劇烈攪拌下，將200μ 1體積的溶解在丙酮中的角鯊烯酰基-3-表柔比星(IOmg/ ml)逐滴添加到5ml蒸餾水中。立即獲得了紅色的微懸浮液。借助于rotavapor 在減壓 下蒸發(fā)掉丙酮之后，獲得了穩(wěn)定的納米顆粒懸浮液。實(shí)施例9傭碰;S -隨劁瓜麵_細(xì)■狐a)角鯊烯?；鵢脫氧精胍菌素的獲得首先通過(guò)純化名稱(chēng)為Gusperimus (Spanidine)的商業(yè)產(chǎn)品來(lái)制備脫氧精胍菌素。 在兩次色譜法過(guò)程(離子交換和凝膠過(guò)濾)后，使堿形式的脫氧精胍菌素(在水中低可溶 性的)與角鯊烯酰基N-羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行反應(yīng)。為此，將24mg脫氧精胍菌素快速溶 解在Iml無(wú)水DMF中，并添加到預(yù)先溶解在相同溶劑中的29mg角鯊烯酰基N-羥基琥珀酰 亞胺酯(摩爾過(guò)量1. 3)中。然后，添加10μ1 N，N-二異丙基乙胺。在25°C的溫度下混合2小時(shí)后，用DCM將溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)⒂谜麴s水進(jìn)行洗滌。通過(guò)用DCM/乙醇+1 %三乙胺 (TEA)進(jìn)行洗脫的在Si02(1.5 X 28cm)上的快速色譜法進(jìn)行純化。然后，收集在坂口試驗(yàn) (Sakaguchi test)(胍基)中顯示為陽(yáng)性的級(jí)分。獲得15mg角鯊烯酰基-脫氧精胍菌素綴 合物，隨后通過(guò)NMR和質(zhì)譜法進(jìn)行表征。該角鯊烯?；鵢脫氧精胍菌素綴合物具有下面的 結(jié)構(gòu)式 b)角鯊烯酰基_脫氧精胍菌素的納米顆粒的制備在強(qiáng)烈攪拌下，將100μ 1的溶解在乙醇中的角鯊烯?；?脫氧精胍菌素(4mg/ ml)逐滴添加到2ml蒸餾水中。借助于rotavapor 在減壓下蒸發(fā)掉乙醇之后，獲得尺寸為 162nm的納米顆粒的懸浮液(多分散性指數(shù)為0. 12，其通過(guò)27. 38+/_2. 60mV的表面電勢(shì)來(lái) 表征)。實(shí)施例10角鯊烯?；牾；?紫杉醇的合成步驟1將紫杉醇溶解在4-二甲基氨基吡啶(0. 1當(dāng)量)和琥珀酸酐(2當(dāng)量)中，并在真 空下干燥2小時(shí)。在添加無(wú)水吡啶后，將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌3小時(shí)。在除去溶 劑后，將粗混合物溶解在二氯甲烷(DCM)中并用鹽水進(jìn)行漂洗。不需要任何額外的純化紫 杉醇-2’ -琥珀酸酯的步驟。用于檢測(cè)2’ OH的不存在、2’ C-H的轉(zhuǎn)化(在5. 51處)以及 在正常位置(4.48)處7C-H的定量存在的NMR分析表明，起始材料完全轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁狨パ?生物。步驟2在DCM中，從二苯基磷酰氯、N-羥基琥珀酰亞胺和三乙胺(TEA)開(kāi)始來(lái)制備N(xiāo)-羥 基琥珀酰亞胺基-二苯基磷酸酯(SDPP)。將粗SDPP在醚中進(jìn)行研磨，溶解在乙酸乙酯中， 用水進(jìn)行漂洗，干燥，并在真空下濃縮，以便獲得SDPP。通過(guò)質(zhì)譜法(MS)進(jìn)行的表征確認(rèn)了 在348處的分子峰。向紫杉醇-2’-琥珀酸酯的溶液中添加在具有TEA(4當(dāng)量)的乙腈中的SDPP(1. 5 當(dāng)量)。將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌6小時(shí)，隨后在真空下進(jìn)行濃縮。將粗反應(yīng)溶解 在乙酸乙酯中，并用鹽水進(jìn)行萃取。如上面所描述的，通過(guò)TLC和HPLC分析來(lái)檢查紫杉 醇_2’ -琥珀?；?NHS的形成，這不需要額外的純化步驟。
步驟3 使溶解在無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)中的紫杉醇_2’ -琥珀?；?NHS與角鯊烯胺 (1當(dāng)量)在三乙胺(1當(dāng)量)存在下進(jìn)行反應(yīng)。在環(huán)境溫度下8小時(shí)和在5°C下過(guò)夜后， 將混合物用鹽水進(jìn)行萃取，并在SiO2凝膠上進(jìn)行純化，其中用DCM-乙酸乙酯進(jìn)行洗脫。用 30-50%乙酸乙酯洗脫下主要產(chǎn)物(角鯊烯?；牾；?紫杉醇)，并且通過(guò)在RP-18柱 上的HPLC分析來(lái)檢查其純度。1H-NMR (CDC13) :d 8. 13(d,2h, OC (0) o-ArH), 7. 75(d,2H, NC (0) o-ArH), 7. 62 (t, 1H, OC (0) p-ArH), 7. 53士7· 49 (帶，3Η)，7· 43士7· 35 (帶，7Η)，6· 91 (t，1Η，NH), 6. 35 (s, 1H, C(IO)-H)，6· 27 (t, 1H, C (13)-H) ,5. 99 (t, 1H, C (3，)_H)，5· 69 (d, 1H, C (2) -H), 5. 30 (dd, 1Η, C (7) -H), 5. 44 (dd, 1Η，C (2，_Η)，5· 20 (s, 5Η, C (sq-H), 4. 97 (d, 1Η，C (5)-H)，4· 39 士 4· 25(帶， 3Η)，4· 24士4· 10(帶，7Η)，3· 96 (d, 1Η)，3· 85 (dd, 1Η)，3· 75 (m, 1Η)，3· 42(t，2H，sq CH2-NH)， 2·61(ρ，1Η，C (6)-HfPm 4Η 琥珀?；?CH2)，2. 46 (d，3Η，C (4)-OAc)，2. 41 (m，1H，C (14)-H)， 2. 29 和 2. 20 (s，4H，CH2 sq.酸)，2. 23 (m，1H，C (14)-H)，2. 14(d，3H，C (10)-OAc)，2. 01 (s， 3H, C(12)-CH3) ,2. 00 (m, 16H, CH2 sq)，1. 97 (m，1H，C (6)-H)，1. 81 (s，3H，C(8)_CH3)， 1. 71(m，18H，C (sq)-CH3)，1. 41(d，3H)，l. 21(s，3H，C (15)-CH3)，1. 16(s，3H，C(15)_CH3)。實(shí)施例11步驟1在攪拌下，在環(huán)境溫度下，使角鯊烯(以醇的形式)與二甘醇酸酐(2.5當(dāng)量)在 無(wú)水吡啶中混合過(guò)夜。除去溶劑，并將殘留物用稀鹽酸和鹽水(具有DCM)進(jìn)行萃取。所希 望的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化通過(guò)TLC來(lái)進(jìn)行檢查。將如此獲得的產(chǎn)物在真空下進(jìn)行干燥，并且無(wú)需額 外的純化步驟即可使用該酸。步驟2
XJ i角鯊烯醜基-^vrix 二甘醇?；?紫杉醇將步驟1中所描述的角鯊烯二甘醇酸(2當(dāng)量)溶解在DCM中，隨后添加事先溶 解在DCM中的紫杉醇(1當(dāng)量)和4-N，N- 二甲基氨基吡啶(3當(dāng)量)。在10分鐘后，添加 EDCI (1.3當(dāng)量)并在環(huán)境溫度下攪拌溶液2小時(shí)。在除去溶劑后，使粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱(其 中使用DCM/乙醇梯度)，以便獲得經(jīng)純化的產(chǎn)物，其純度通過(guò)在RP-18柱上的HPLC分析來(lái) 進(jìn)行檢查。1H-NMR(CDCIs) :d 8. 13(d，2H，OC (0) o-ArH), 7. 75(d,2H, NC (0) o-ArH), 7. 62 (t, 1H, OC (0) p-ArH), 7. 53士7· 49 (帶，3Η)，7· 43士7· 35 (帶，7Η)，6· 91 (t，1Η，NH), 6. 35 (s, 1H, C(IO)-H)，6· 27 (t, 1H, C (13)-H) ,5. 99 (t, 1H, C (3，)_H)，5· 69 (d, 1H, C (2) -H), 5. 30 (dd, 1Η, C (7) -H), 5. 44 (dd, 1Η，C (2，_Η)，5· 20 (s, 5Η, C (sq-H), 4. 97 (d, 1Η，C (5)-H)，4· 39 士 4· 25(帶， 3Η)，4· 33(111，4!1二甘醇?；?12)，4· 24士4· 10(帶，7Η)，4· 12(m，2H C(I)角鯊烯)，3.96 (d， 1Η)，3· 85 (dd, 1Η)，3· 75 (m, 1Η)，2· 61 (ρ, 1Η, C (6)-H) ,2. 46 (d, 3Η, C (4)-OAc)，2. 41 (m, 1Η, C (14) -H)，2. 29 禾口 2. 35 (s,4H, CH2 sq.酸)，2. 23 (m, 1H, C (14)-H) , 2. 14 (d, 3H, C (IO)-OAc), 2. 01 (s,3H, C (12)-CH3)，2· 00 (m，16H，CH2 sq), 1. 97 (m, 1H, C (6)-H)，1. 81 (s， 3H, C (8) -CH3), 1. 71 (m, 18Η, C (sq) -CH3)，1. 41 (d, 3H)，1· 21 (s，3H, C (15) -CH3)，1. 16 (s, 3H, C(15)-CH3)。實(shí)施例12角鯊烯?；牾；?PEG340-紫杉醇的合成步驟1將紫杉醇琥珀酰基-NHS (參見(jiàn)實(shí)施例10，步驟3)溶解在DCM中，并在攪拌下向前 面的溶液中添加tBoc-NH-PEG3-NH2 (1當(dāng)量)在DCM中所形成的溶液。在4°C的溫度下，添加 三乙胺(0.5當(dāng)量)，并將反應(yīng)在20°C的溫度下維持5小時(shí)。將粗反應(yīng)混合物用0. IN HCl, 隨后用鹽水進(jìn)行萃取。將如此獲得的產(chǎn)物用于下面的步驟，而無(wú)需額外的純化。步驟2
角鯊烯酰基-琥珀?；?PEG340-紫杉醇將紫杉醇-琥珀酰基-PEG3-NH-tBoc溶解在無(wú)水DCM中，并于20°C在攪拌下添加 三氟乙酸(TFA)。在2小時(shí)后，反應(yīng)結(jié)束，并且用乙酸鈉溶液，隨后用鹽水對(duì)混合物進(jìn)行萃取 直至中性。將事先通過(guò)在EDCI存在下使角鯊烯酸和NHS反應(yīng)而制備的角鯊烯N-羥基琥珀酰 亞胺酯(1.2當(dāng)量)添加至紫杉醇-琥珀?；?PEG3-胺(1當(dāng)量)。添加三乙胺(0.3當(dāng)量) 并在環(huán)境溫度下攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)。在除去溶劑后，將粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱(其中使用 DCM/乙醇梯度)進(jìn)行純化，以便獲得經(jīng)純化的產(chǎn)物，其純度通過(guò)在RP-18柱上的HPLC分析 來(lái)進(jìn)行檢查。1H-NMR(CDCIs) :d 8. 13(d，2H，OC (0) o-ArH), 7. 75(d,2H, NC (0) o-ArH), 7. 62 (t, 1H, OC (0) p-ArH), 7. 53士7· 49 (帶，3Η)，7· 43士7· 35 (帶，7Η)，6· 91 (t，1Η，NH), 6. 35 (s, 1H, C(IO)-H)，6· 27 (t, 1H, C (13)-H) ,5. 99 (t, 1H, C (3，)_Η，5· 69 (d, 1Η, C (2) -H), 5. 30 (dd, 1Η, C (7) -H), 5. 44 (dd, 1Η，C (2，_Η)，5· 20 (s, 5Η, C (sq-H), 4. 97 (d, 1Η，C (5)-H)，4· 39 士 4· 25(帶， 3Η)，4· 24士4· 10(帶，7Η)，3· 96 (d, 1Η)，3· 85 (dd, 1Η)，3· 75 (m, 1Η)，3· 42(t，2H，sq CH2-NH)， 3. 54(m,6Η, CH2-0)，3. 37 (m,4Η, 0—CH2)，3. 13(m,4H, CH2—N)，2. 61 (p，1H，C(6) -H 禾口 m 4H 琥拍?；?CH2)，2. 46 (d，3H，C (4)-OAc)，2. 41 (m，1H，C (14) -H), 2. 29 禾Π 2. 20(s，4H，CH2 sq.酸)，2· 23(m，1H，C (14)-H)，2. 14(d，3H，C (10)-OAc)，2. 01 (s，3H，C (12)-CH3)，2. 00 (m， 16H, CH2 sq)，1. 97 (m, 1H, C (6) -H)，1. 81 (s，3H，C(8)_CH3)，1. 71 (m, 18H, C(sq) -CH3)， 1. 41 (d, 3H)，1. 21 (s，3H, C (15) -CH3)，1. 16 (s, 3H, C (15) -CH3)。實(shí)施例13 角鯊烯?；鵆22-紫杉醇的合成
向角鯊烯酸-C22在無(wú)水DMF中所形成的溶液之中添加EDCA (1. 5當(dāng)量)、DMAP (0. 5當(dāng)量)和紫杉醇(1. 6當(dāng)量)(在DMF中)。在5小時(shí)后，用pH等于5. 0的水中止反應(yīng)，并用 鹽水進(jìn)行萃取。將粗混合物通過(guò)在SiO2上的色譜法進(jìn)行純化，其中使用經(jīng)優(yōu)化的梯度以DCM/乙 酸乙酯進(jìn)行洗脫。用10%乙酸乙酯洗脫出含有所希望的產(chǎn)物的級(jí)分。收集純的角鯊烯?；?C22-紫杉醇級(jí)分，并且通過(guò)在具有反相極性的RP-18柱上的HPLC分析來(lái)檢查純度，其中用 乙腈/水混合物進(jìn)行洗脫。1H-NMR(CDCIs) :d 8. 13(d，2H，OC (0) o-ArH), 7. 75(d,2H, NC (0) o-ArH), 7. 62 (t, 1H, OC (0) p-ArH), 7. 53士7· 49 (帶，3Η)，7· 43士7· 35 (帶，7Η)，6· 91 (t，1Η，NH), 6. 35 (s, 1H, C(IO)-H)，6· 27 (t, 1H, C (13)-H) ,5. 99 (t, 1H, C (3，)_H)，5· 69 (d, 1H, C (2) -H), 5. 30 (dd, 1Η, C (7) -H), 5. 44 (dd, 1Η，C (2，_Η)，5· 20 (s，5Η，C (sq-Η)，4，97 (d，1Η，C (5)-H)，4· 39 士 4· 25(帶， 3Η)，4· 24士4· 10 (帶，7Η)，3· 96 (d, 1Η)，3· 85 (dd, 1Η)，3· 75 (m, 1Η)，2· 61 (ρ, 1Η, C(6)-H)， 2. 46 (d, 3Η, C (4) -OAc)，2. 41 (m, 1Η, C (14) -H)，2. 29 和 2. 35 (s,4H, CH2 sq.酸)，2. 23 (m, 1H, C(14-H)，2. 14(d，3H，C (10)-OAc)，2· 01 (s，3H，C (12)-CH3)，2· 00 (m，16Η，CH2 sq), 1. 97 (m, 1H, C (6)-H)，1. 81 (s，3H，C (8) -CH3)，1. 71 (m, 15H, C(sq) -CH3)，1. 41 (d, 3H)，1. 21 (s，3H， C(15)-CH3)，1. 16(s，3H，C(15)_CH3)。實(shí)施例1414-角鯊烯?；鵢多柔比星的合成
角鯊烯酰基-多柔比星在溴和原甲酸三甲酯存在下，柔紅霉素形成柔紅霉素的14-溴-13- 二甲基縮醛， 其在用丙酮進(jìn)行攪拌下提供出14-溴柔紅霉素。使溶解在無(wú)水丙酮中的該溴代柔紅霉素與 角鯊烯酸(3當(dāng)量)在碳酸鉀存在下進(jìn)行反應(yīng)。在20小時(shí)后，將反應(yīng)過(guò)濾，蒸發(fā)掉溶劑，并 將粗產(chǎn)物通過(guò)在SiO2柱上的色譜法(4 LDCM-甲醇)進(jìn)行純化，以便獲得14-角鯊烯酰
— $^5匕匕^·。1H-NMR(CDCIs) 8. 02 (d, 1H, H-3)，7. 87 (d, 1H, H-1)，7· 70 (t, 1H, H-2)，5. 46 (s, 1H, H-10)，5. 3-5. 25 (m, 2H, H_14a，H-14b)和 5. 20(s,5H, C(sq-H)，5. 19 (s,1H, H-7)，4. 15 (q, 1H, H-50)，4. 01(s，3H，0CH3)，3. 74(m,2H, H—30，H—40)，3. 24(d,1H, H—10)，3. 00(d,1H, H-10)，2. 43 (m, 1H, H-8)，2. 29 和 2. 35 (s,4H, CH2sq.酸)，2· 13 (m, 1H, H-8)，2. 03 (m, 16H, CH2 sq)，1. 97 (m, 1H, H-20)，1. 82 (m, 1H, H-20)，1. 71 (m, 18H, C (sq) -CH3)，1. 29 (d, 3H, CH3)。實(shí)施例15tg^trMM ο ^ 14 ^w^.mm^mmm^mm^.通過(guò)納米沉淀來(lái)制備各種不同活性物質(zhì)的納米顆粒。在紫杉醇的情況下，在攪拌
O OH ..
ι j ι
CyJIyX 實(shí) y^
？
一廣O
Η
OH
tS
O
C
22(500rpm)下，在5%右旋糖水溶液中逐滴添加含有角鯊烯?；?紫杉醇綴合物的乙醇制溶 液(基液，5-10mg/mL)。自動(dòng)發(fā)生納米顆粒的沉淀。借助于Rotavapor 完全蒸發(fā)掉有機(jī)溶 劑，以便獲得純的納米顆粒的水懸浮液。至于角鯊烯?；?聚乙二醇(以1 0.5的比率)，將其混合在乙醇制溶液中，并 根據(jù)前面所描述的方法來(lái)制備納米顆粒。為了制備角鯊烯?；?多柔比星的納米顆粒，使用二氯甲烷和乙醇的混合物代替 純乙醇，但該過(guò)程的其余部分與上面所描述的那些相似。將從前面在實(shí)施例10至14中所描述的綴合物開(kāi)始而形成的納米顆粒的組合物顯
示在下表中
實(shí)施例編號(hào)成分量10角鯊烯?；牾；?紫杉醇5. 0 mg角鯊烯?；?聚乙二醇(MM = 2369 )2. 5 mg右旋糖0. 05 g注射用水對(duì)于1 mL而言足量11角鯊烯酰基二甘醇?；?紫杉醇5. 0 mg右旋糖0. 05 g注射用水對(duì)于1 mL而言足量12角鯊烯?；牾；?PEG340-紫杉醇3 mg右旋糖0.05 g注射用水對(duì)于1 mL而言足量13角鯊烯酰基C22-紫杉醇2. 5 mg右旋糖0. 05 g注射用水對(duì)于1 mL而言足量14角鯊烯?；?多柔比星2 mg右旋糖0. 05 g注射用水對(duì)于1 mL而言足量在20°C的溫度下，用zetasizer (Malvern Instruments,UK)通過(guò)光的漫射來(lái)測(cè)定 納米顆粒的平均尺寸和納米顆粒的多分散性指數(shù)。在MilliQ 水中稀釋納米顆粒的懸浮液 之后進(jìn)行測(cè)量。將紫杉醇和多柔比星的角鯊烯酰基衍生物的納米顆粒的尺寸及其多分散性指數(shù)
列于下表中 實(shí)施例16角鯊烯?；Y合物的體外抗癌活件的評(píng)價(jià)以納米顆粒形式的角鯊烯?；?紫杉醇類(lèi)型的綴合物的體外抗癌活性在鼠肺腫 瘤細(xì)胞系Madison，s 109(M109)上來(lái)實(shí)現(xiàn)。將M109細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清、50U .ι Γ1 青霉素和50 μ g · ml—1鏈霉素以及2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)使用 溴化3-[4，5_ 二甲基噻唑-2-基]-3，5-二苯基四唑鐺(MTT)測(cè)試，經(jīng)測(cè)量線(xiàn)粒體脫氫酶活 性來(lái)進(jìn)行該分析。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在96-孔平板上，并在潮濕的氣氛(具有 在空氣中的5% CO2)中于37°C預(yù)溫育24小時(shí)。將各種不同稀釋度的紫杉醇的納米顆粒添 加至處于培養(yǎng)基中的細(xì)胞。每個(gè)稀釋度測(cè)試三次。在37°C下72小時(shí)后，在每個(gè)孔中添加 200 μ L的在細(xì)胞培養(yǎng)基中的MTT溶液(0. 5mg/ml)。在37°C下溫育2小時(shí)30分鐘后，除去 培養(yǎng)基并將所獲得的甲 晶體溶解在200 μ L提取溶液(二甲亞砜)中。通過(guò)使用微量培 養(yǎng)板閱讀器(Metertech Σ 960, Fisher Bioblock，Illkirch，F(xiàn)rance)，在 570nm 處測(cè)量轉(zhuǎn) 化的染料的吸收能力，其與活細(xì)胞的數(shù)目成正比。存活細(xì)胞的百分比通過(guò)測(cè)定經(jīng)處理的細(xì) 胞和未處理的細(xì)胞之間吸收能力的比率來(lái)計(jì)算。角鯊烯?；?多柔比星的納米顆粒的體外抗癌活性在鼠白血病細(xì)胞系L1210 WT 上進(jìn)行評(píng)價(jià)。將細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清、50U · ml—1青霉素和50μ g · ml—1鏈霉素以及 2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中進(jìn)行培養(yǎng)。該評(píng)價(jià)根據(jù)上面所描述的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)進(jìn)行。將各種不同的角鯊烯?；?紫杉醇和角鯊烯?；?多柔比星類(lèi)型的綴合物的納米 顆粒的50%抑制濃度(IC5tl)列于下表中 實(shí)施例17根據(jù)實(shí)施例11所獲得的角鯊烯?；蚀减；?紫杉醇衍牛物的納米顆粒的體 內(nèi)抗癌活件的評(píng)價(jià)將重約15-18g的⑶2F1小鼠(4_5周齡)用于該研究。用用于小鼠的標(biāo)準(zhǔn)膳食和 水(任意獲取)喂養(yǎng)所述小鼠。通過(guò)在小鼠下腹部中皮下注射懸浮的處于指數(shù)生長(zhǎng)的M109 細(xì)胞(IX IO6個(gè)細(xì)胞)來(lái)建立M109皮下腫瘤模型(鼠肺腫瘤)。讓可觸知的腫瘤(大約 50-100mm3)在注射位點(diǎn)處進(jìn)行生長(zhǎng)。將攜帶腫瘤的小鼠分成2個(gè)組(具有5_6只)，即未 處理的組和用160mg · kg"1角鯊烯酰基二甘醇?；?紫杉醇納米顆粒進(jìn)行處理(在連續(xù)的 5天期間進(jìn)行靜脈內(nèi)注射)的組。定期檢查小鼠以查驗(yàn)?zāi)[瘤體積的差異，并由此評(píng)價(jià)抗癌效 力。角鯊烯?；蚀减；?紫杉醇的納米顆粒通過(guò)控制經(jīng)皮下植入小鼠中的M109 腫瘤的進(jìn)展而顯示出抗癌活性。這些結(jié)果顯示在圖2中。實(shí)施例18根據(jù)實(shí)施例14所獲得的角鯊烯?；鵢多柔比星衍牛物的納米顆粒的體內(nèi)抗癌活 件的評(píng)價(jià)將重約15-18g的DBAA小鼠(4_5周齡)用于該研究。如關(guān)于實(shí)施例17那樣，使 用用于小鼠的標(biāo)準(zhǔn)膳食和水(任意獲取)喂養(yǎng)所述小鼠。通過(guò)在小鼠中經(jīng)靜脈內(nèi)途徑注射 懸浮的處于指數(shù)生長(zhǎng)的L1210細(xì)胞(0. IX IO6個(gè)細(xì)胞)來(lái)建立L1210侵襲性轉(zhuǎn)移性白血病 (鼠白血病)模型。將攜帶腫瘤的小鼠分成2個(gè)組(具有5-6只)，即未處理的組和用角鯊 烯?；鵢多柔比星納米顆粒(13mg · kg—1，在注射腫瘤細(xì)胞后第1、7和14天通過(guò)靜脈內(nèi)途 徑進(jìn)行注射)進(jìn)行處理的組。在處理后，定期檢查小鼠以查驗(yàn)重量和存活率(使得能夠評(píng) 價(jià)抗癌活性效力的參數(shù))的差異。在代表癌癥的侵襲性轉(zhuǎn)移性形式的該模型中，角鯊烯酰基-多柔比星的納米顆粒 顯示出有效的抗癌活性(圖3)以及經(jīng)改善的攜帶白血病的小鼠的存活率(圖4)。
權(quán)利要求
具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的水分散性衍生物，其由與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物或類(lèi)似物的分子共價(jià)偶聯(lián)的至少一個(gè)所述活性物質(zhì)的分子形成，所述活性物質(zhì)具有在環(huán)境溫度下所測(cè)量的低于100μg/ml的在純水中的溶解度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的衍生物，其包含至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的衍生物，其包含至少兩個(gè)相同或不同的具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述活性物質(zhì)具有在環(huán)境溫度下所測(cè) 量的低于25 μ g/ml，特別地低于20 μ g/ml，甚至低于10 μ g/ml，和更特別地低于5 μ g/ml的 在純水中的溶解度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述活性物質(zhì)選自免疫抑制劑、抗腫 瘤化學(xué)治療劑、抗血管發(fā)生劑、抗病毒劑、抗菌劑、抗生素和抗寄生蟲(chóng)劑、作用于糖代謝的物 質(zhì)、肽、脂質(zhì)、作用于鈣通道的試劑、非類(lèi)固醇抗炎劑、以及肽類(lèi)化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述活性物質(zhì)為選自紫杉烷類(lèi)化合物、 多柔比星和表柔比星的抗腫瘤化學(xué)治療劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述活性物質(zhì)選自紫杉烷類(lèi)或紫杉烷 類(lèi)化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述活性物質(zhì)選自多西他賽、紫杉醇和 其衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的衍生物，其中所述活性物質(zhì)為胰島素。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的衍生物，其中存在于具有低水溶解度的所述治療性 活性物質(zhì)和具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物或類(lèi)似物的分子之間的共價(jià)連接表現(xiàn)為連接臂。
11.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的衍生物，其中所述連接臂選自(聚)氨基酸基元、多元醇、糖 類(lèi)和具有低分子量的聚乙二醇(聚醚氧化物)。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的衍生物，其選自 來(lái)自級(jí)分21-32
13.至少一種具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的水分散性納米顆粒，其中所述活性 物質(zhì)在這之中以與至少一種具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物或類(lèi)似物相聯(lián)合的形式存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的納米顆粒，其由根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的衍生物來(lái)形成。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的納米顆粒，其具有30至650nm，特別地30nm至500歷，和 特別地50至250nm，甚至100至200nm的平均尺寸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的納米顆粒的水分散體。
17.制備根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的納米顆粒的方法，其特征在于，所述方法至 少包括-將根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的衍生物溶解在至少一種有機(jī)溶劑中，其濃度足以 當(dāng)在攪拌下向水相中添加相應(yīng)的混合物時(shí)，獲得以在所述水相中的懸浮液形式的納米顆粒 的瞬時(shí)形成，和-需要時(shí)，分離所述納米顆粒。
18.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述有機(jī)溶劑為醇。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其特征在于，所述方法不使用表面活性劑。
20.藥物組合物，其包含作為具有活性的物質(zhì)的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一 項(xiàng)的衍生物或者根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的納米顆粒，以及與之相聯(lián)合的至少一種 藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有低水溶解度的治療性活性物質(zhì)的水分散性衍生物，其由與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴衍生物或類(lèi)似物的分子共價(jià)偶聯(lián)的至少一個(gè)所述活性物質(zhì)的分子形成。此外，本發(fā)明還涉及相應(yīng)的納米顆粒。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101925365SQ200880125358
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者B·斯特拉, F·多斯奧, H·R·拉克爾雷蒂, L·卡特爾, P·庫(kù)沃里爾 申請(qǐng)人:國(guó)家科研中心;巴黎第十一大學(xué)